Candidatus Liberibacter asiaticus:

ONCE AÑOS DE DIAGNOSTICO

MOLECULAR EN CUBA.

Maritza Luis Pantoja1, Camilo Paredes1, Inés Peña1, Lochy Batista1, Lester Hernández-

Rodríguez1, Daylé López2, Victoria Zamora1 y Cyrelys Collazo Cordero1.

1-Departamento de fitopatología, Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Email:

bacteriologia@iift.cu

2-Empresa Agroindustrial Ceballos. Ciego de Ávila. Cuba.

IINSTITUTO DE INVESTIGACIONES

EN FRUTICULTURA TROPICAL

2006 áreas urbanas de La Habana

Vector HLB D. Citri: presente en Cuba 1999

Candidatus Liberibacter asiaticus: ONCE AÑOS DE DIAGNOSTICO

MOLECULAR EN CUBA.

Huanglongbing: bacterias fastidiosas del Floema

Candidatus Liberibacter asiaticus, africanus y americanus y Candidatus Phytoplasma

grupo 16Sr I, 16SrII-A y 16SrIX

Diagnóstico molecular (diferentes variantes de PCR y secuenciación)

Cuba

Extracción de ADN

Colecta de hojas sintomáticas de todo el

país y de todas las sp cítricas cultivadas.

Colecta de D. citri (ninfas

y adultos)

PCR convencional y digestión

PCR dúplex

PCR anidada

Clonaje y secuenciación

Diagnostico e identificación

1160 pb

M 1 2 3 4 5 6 7

PCR convencional con los cebadores OI1/OA1/OI2c

(Jagoueix, et al., 1996).

Candidatus Liberibacter asiaticus y africanus

(Jagoueix, et al., 1996).

Enzima Xba I a

partir del producto

de 1160pb

Ca. L. af Ca. L. as

640pb y 520 pb520 pb, 506 pb y 130 pb

M C+ C+ 1 2 3 4

520 pb

640 pb

130 pb

506 pb

520 pb

Digestión enzimática Xba I

2006-2007: 293 muestras 166+ Ca. L. as

Prospección por todo el país menos incidencia en región oriental

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1027pb

703pb

PCR convencional con los cebadores rplA2/rplJ5 (Hocquellet

et al., 1999)

Candidatus Liberibacter asiaticus y africanus

2007-2013: 931 muestras 580 + Ca. L. as

PCR convencional dúplex con los cebadores rplA2/rplJ5

(Hocquellet et al., 1999) y GB1/GB3 (Teixeira et al.,2005).

Candidatus Liberibacter asiaticus, africanus y americanus

M H2O C- C+ am C+ af C+as 1 2 3 4 5 6 M

703pb669pb

1127pb

2009-2015: (pesquisa por todo el país buscando las tres sp de Ca L.

631 muestras 528 + Ca. L. asValidación: eficiencia, sensibilidad y especificidad diag. 98%

PCR Anidada para

Candidatus

Phytoplasmas con

los cebadores

(P1/P7 (Smart et

al., 1996) - fU5/rU3

(Lorenz et al., 1995) )

: 104 muestras

negativas

Ca.L.as/Guangdong/China/DQ432005

Ca.L.as/Cuba/CH1140/FJ544941

Ca.L.as/Belize/GU061003

Ca.L.as/USA/Florida/EU130554

Ca.L.as/Bahamas/Nassau/EU130553

Ca.L.as/USA/DQ471900

Ca.L.as/Brazil/DQ471901.1

Ca.L.as/Indonesia/West Timor/AB480091

Ca.L.am/Brazil/EU999028

19

9

18

0.005

• Porcentajes de identidad: 99 y 100% con aislados de Ca. L. asiaticus de Florida y Brasil

• Homogeneidad genética entre aislamientos de Ca. L. asiaticus de diferentes provincias

Caracterización molecular del agente causal del HLB

mediante clonaje y secuenciación

• Porcentajes de identidad: 99 y 100% con aislados de Ca. L. asiaticus de

Florida, Bahamas, Belize, Brasil, China e Indonesia.

• Homogeneidad genética entre aislamientos de Ca. L. asiaticus de las

tres regiones del país analizadas.

2008: 3 muestras de La Habana y

Artemisa.

2009: análisis de 8 muestras de La

región occidental central y oriental de

Cuba de 3 regiones del genoma:

ADNr 16S, región intergénica

16S/23S y operón rplKAJL

Primera reacción: Cebadores FD1/RP1 (Weisburg, et al.,1991)

PCR Anidada para Candidatus Liberibacter asiaticus

Segunda reacción: OI1/OI2C (Jagoueix, et al., 1996).

1160 pb

M H2O C- C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2010-2017 ( 989 muestras 517+ Ca. L. as)Estandarizó: limite de detección 0,1ng/ul=110 bact/g de tejido.

Implementado para viveros, banco de germoplasma y lugares con baja

incidencia de la enfermedad , diagnostico en ninfas y adultos de D.Citri

PCR en tiempo real : utilizando un termociclador Rotor-Gene Q

de Quiagen

Cycle

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Flu

ore

scence

35

30

25

20

15

10

5

Sistema SYBR Green: Cebadores: Clas 16S F/Clas 16S R

2017: 14 muestras + Ca. L. as

Muestras analizadas de diferentes tipos de síntomas

utilizando las diferentes técnicas de PCR

2954 muestras

Porcentajes de coincidencia del MA/PCR+ con las diferentes

técnicas de PCR

Importancia del diagnostico y caracterización molecular de HLB en Cuba

Ca L asiaticus asociado a HLB. homogeneidad genética de aislados.

Ca L asiaticus en estadio ninfal 3 de D. citri .

Síntomas con valor diagnóstico.

Plantas saneadas por microinjerto de ápices caulinares.

Empresas cobren el seguro de sus plantaciones afectadas.

Certificar sistema nac. de produc. de material de propagación

Manejo de

Huanglongbing

1-Plantar material sano

Mantener el primer puntos del manejo de la enfermedad

Muchas Gracias

Equipo de trabajo y colaboradores