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1
CanAg ProGRP EIA 220-10REF
Use By/ /Pouiteln do/Holdbar til/Verwendbar bis/
/Fecha de caducidad/Klblik kuni/
Utiliser jusque/Rok valjanosti/
Felhasznlhat/Utilizzare entro/
Sunaudoti iki/Izlietot ldz/Houdbaar tot/Brukes innen/Uy
przed/
Prazo de validade/Expir la/ /Anvnd fre/Pouiten do/ Uporabno
do/
Upotrebljivo do/Son Kullanma Tarihi
Batch code/ /slo are/Lotnummer/Chargenbezeichnung/ /Cdigo de
lote/Partii kood/Code du lot/Kod serije/
Sarzsszm/Codice del lotto/
Partijos kodas/Partijas kods/Lot nummer/Partikode/Kod
partii/
Cdigo do lote/Numr de lot/ /Lotnummer/slo are/tevilka serije/Kod
partije/
Parti Kodu
EN EXPLANATION OF SYMBOLS
BG CS VZNAM SYMBOLDA SYMBOLFORKLARING
DE ERKLRUNG DER SYMBOLE
EL
ES SIGNIFICADO DE LOS SMBOLOS
ET SMBOLITE SELGITUS
FR EXPLICATION DES SYMBOLES
HR OBJANJENJE SIMBOLA
HU JELMAGYARZAT
IT SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI
LT SimboLi PaaIkINImaI
LV SIMBOLU SKAIDROJUMS
NL VERKLARING DER SYMBOLEN
NO SYMBOLFORKLARING
PL OBJaNIENIE SYmBOLI
PT EXPLICAO DOS SMBOLOS
RO SEmNIFICaIa SImBOLURILOR
RU
SE SYMBOLFRKLARING
SK VZNAM SYMBOLOV
SL RAZLAGA SIMBOLOV
SR OBJANJENJE SIMBOLA
TR SEmBOLLERN aIkLamaLaRI
IVD
Instructions for use. 2011-09
ES
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32
Contains sufficient for tests/ /Lze pouit pro test/Indeholder
tilsttrkkeligt/Inhalt ausreichend fr
Prfungen/ 96 /Contenido suficiente para ensayos/Kogusest piisab
testi
lbiviimiseks/Contenu suffisant pour 96
tests/Sadri dovoljno za testova/A
doboz tartalma vizsglat elvgzshez
elegend/Contenuto sufficiente per 96 saggi/Turinys skirtas
atlikti tyrimus/Saturs pietiekams testiem/Inhoud voldoende voor 96
testen/til 96 test/
Tilstrekkelig innhold for prver/
Wystarczy na wykonanie testw/
Contedo suficiente para 96 ensaios/
Coninut suficient pentru 96 de teste/ 96 /Innehller tillrckligt
till 96 antal tester/Obsah postauje na tento poet testov: /Vsebina
zadostuje za testov/Sadrina dovoljna za
testova/ testleri iin yeterlilik ierir
Temperature limitation/
/Teplotn omezen/Temperaturbegrnsning/
Temperaturbegrenzung/
/Lmites de temperatura/
Temperatuuri piirang/
Limite de temprature/
Temperaturno ogranienje/Hmrskletre vonatkoz korltozs/Limiti di
temperatura/
Temperatriniai apribojimai/Temperatras
ierobeojums/Temperatuurbeperking/
Temperaturbegrensninger/
Temperatury graniczne/Limite de temperatura/
Limite de temperatur/ /Temperaturbegrnsning/
Teplotn obmedzenie
Omejitev temperature/
Temperaturno ogranienje/Scaklk snrlamas/
2oC
8oC
In Vitro Diagnostic Medical Device/
/Diagnostick zdravotnick prostedek in vitro/Medicinsk udstyr til
in vitro-diagnostik/In-vitro-Diagnostikum/
In Vitro/Dispositivo mdico para diagnstico in vitro/In vitro
diagnostiline
meditsiiniseade/Dispositif mdical de
diagnostic in vitro/Diagnostiki medicinski ureaj In Vitro/In
vitro orvosdiagnosztikai eszkz/Dispositivo medico per test
diagnostici in vitro/In Vitro Diagnostin medicinos
Priemon/medicniska ierce in vitro diagnostikai/In
vitro-diagnostisch medisch instrument/In vitro diagnostisk
medisinsk utstyr/Wyrb medyczny do diagnostyki in
vitro/Dispositivo Mdico de Diagnstico In Vitro/Dispozitiv
medical
pentru diagnostic in vitro/ In Vitro/Endast fr in
vitro-diagnostik/ Zdravotncka pomcka na
diagnostiku in vitro/In vitro diagnostini pripomoek/Diagnostiki
medicinski ureaj In Vitro/ testleri iin yeterlilik ierir
IVD
Catalogue number/ /katalogov slo/Katalognummer/Bestellnummer/
/Nmero de catlogo/Kataloogi number/
Numro de catalogue/Kataloki broj/
Katalgusszm/Numero di catalogo/
Katalogo numeris/Numurs
katalog/Catalogusnummer/Katalognummer/
Numer katalogowy/Nmero do catlogo/
Numr de catalog/ /Produktnummer/katalgov slo/Kataloka
tevilka/Kataloki broj/
Katalog numaras
REF
Date of manufacture/ /Datum
vroby/Produktionsdato/Herstellungsdatum/
/Fecha de fabricacin/Valmistamise kuupev/
Date de fabrication/Datum proizvodnje/
Gyrtsi id/Data di produzione/Pagaminimo data/Raoanas datums/
Productiedatum/Fremstillingsdato/
Data produkcji/Data de fabrico/Data fabricaiei/
/Tillverkningsdatum/Dtum vroby/Datum
izdelave/Datum proizvodnje/retim tarihi
Manufacturer//Vrobce/Producent/Hersteller/K/Fabricante/Tootja/Fabricant/Proizvoa/Gyrt/Fabbricante/Gamintojas/
Raotjs/Fabrikant/Produsent/Producent/Fabricante/Productor//Tillverkare/
Vrobca/Izdelovalec/Proizvoa/retici
Consult Instructions for Use/
/konzultujte s nvodem k pouit/Se brugsanvisning/Siehe
Gebrauchsanweisung/ /Consulte las instrucciones de uso/
Vt kasutusjuhendit/Consulter le mode
demploi/Proitajte upute za uporabu/Olvassa el a hasznlati
utastst/
Consultare le istruzioni per luso/Dl naudojimo irkite
instrukcijas/Izlasiet lietoanas instrukciju/Raadpleeg de
instructies voor gebruik/Les instruksene
fr bruk/Sprawdzi w instrukcji uycia/Consulte as Instrues de
Utilizao/
Consultai instruciunile de utilizare/ /Se
bruksanvisning/Pretajte si nvod na pouvanie/Proitajte uputstvo za
upotrebu/Kullanm Talimatlarna Baknz
Biological risks/ /Biologick rizika/Biologisk fare/Biologische
Gefahren/ /Riesgos biolgicos/Bioloogilised ohud/Risques
biologiques/Biolokli rizici/Biolgiai kockzatok/Rischi
biologici/Biologinis pavojus/Bioloiskais risks/Biologische
risicos/Biologiske risikoer/Zagroenie biologiczne/Riscos biolgicos/
Biologisk risk/Pericole
biologice/ /Biologicky rizikov/Biologick rizik/
Biolokli rizici/Biyolojik riskler
Contents of kit/ /Obsah soupravy/Kittets indhold/Inhalt
des Kits/ /Contenido del kit/Komplekt sisaldab/Contenu du
kit/Sadraj opreme/A kszlet tartalma/
Contenuto del kit/Rinkinio turinys/
Komplekta saturs/Inhoud van de set/
Settets innhold/Zawarto zestawu/ Contedo do kit/Coninutul
setului/ /Kit innehll/Obsah spravy/Vsebina kompleta/Sadraj
opreme/Kitin iindekiler
From mouse/ /my/Fra mus/Maus/ /De ratn/Hiirtelt/De souris/Miijeg
porjekla/
Egrbl/Murino/Pels kilms/No peles/Van muizen/Fra mus/Mysia/Do
rato/De la oareci/ /Frn mus/Myie/Mijega izvora/Miijeg
porekla/Fareden
CONT
ORIG MOU
Human/ /Lidsk/Humant/Human/
/Humano/Inimpritolu/Humaine/Ljudskog
porjekla/Humn/Origine Umana/
mogaus kilms/Cilvku izcelsmes/Human/Menneske/Ludzka/Humano/
Origine uman/ /Human/udsk/Humanega izvora/Ljudskog
porekla/nsan
ORIG HUM
Reconstitute with/ /Rozete pomoc/Rekonstitueres
med/Rekonstituieren mit/ /Reconstituir
con/Lahjendamine/Reconstituer avec/Rekonstituirajte s/
Feloldshoz/Ricostituire con/atkurti, itirpdant su/ataidt
ar/Reconstitutie met/Rekonstitueres med/Odtworzy za
pomoc/Reconstituir com/a se reconstitui cu/ /Rekonstituera
med/Rozriete pomocou/Rekonstituirajte z/s/Ponovno formiranje
sa/Yeniden oluturulur
From goat/ / koz/
Serumherkomst: Ged/Herkunft: Ziege/ /De cabra/kitsedelt/ partir
de chvres/Porijeklo: koza/kecskbl/ Da capra/I okos/No kazas/Van
geiten/Fra geit/Z koza/De cabra/De la capr//Frn get/kozie/kozjega
izvora/
Od koze/menei: kei/
ORIG GT
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54
Instrucciones de uso Kit de ensayo inmunomtrico enzimtico
Para 96 determinaciones
USO PREVISTO
El kit de EIA CanAg ProGRP es un inmunoanlisis para la
determinacin cuantitativa de pro-GRP en suero. El ensayo CanAg
ProGRP debe utilizarse como ayuda en el diagnstico diferencial y en
el seguimiento de la progresin de la enfermedad durante el curso y
el tratamiento del carcinoma microctico de pulmn.
Los valores analticos del ensayo ProGRP de los pacientes deben
usarse en combinacin con otros mtodos clnicos empleados en el
tratamiento de pacientes con carcinoma microctico de pulmn.
RESUMEN Y EXPLICACIN DEL ENSAYO
El GRP (pptido liberador de gastrina) es una hormona segregada
por las clulas del carcinoma microctico de pulmn (SCLC). Aunque se
esperaba que la deteccin del GRP en suero fuera til para el
diagnstico del SCLC, la determinacin del GRP en suero no ha sido
viable debido a su inestabilidad en sangre (1, 2). En cambio, el
precursor propptido liberador de gastrina (pro-GRP) es ms estable y
puede utilizarse como marcador serolgico del GRP (3). El kit de EIA
CanAg ProGRP mide el nivel de pro-GRP (31-98), una regin
carboxiloterminal que es comn a las variantes de empalme (splicing)
humanas del pro-GRP.
El pro-GRP se expresa en tejidos y tumores de origen
neuroendocrino, incluidos los carcinomas microcticos de pulmn, el
carcinoma macroctico no diferenciado de pulmn con caractersticas
neuroendrocrinas, el carcinoma medular de tiroides y otras
neoplasias malignas neuroendocrinas. Se ha demostrado que los
niveles de pro-GRP en suero son elevados en una gran proporcin de
los pacientes diagnosticados de SCLC, mientras que en los pacientes
con tumor benigno dichos niveles son normales (4-10).
Gracias a su alta sensibilidad y especificidad por el SCLC, el
ensayo ProGRP posee utilidad clnica en el diagnstico diferencial
del cncer pulmonar. Si adems del pro-GRP se determina la NSE, se
obtiene informacin complementaria para el diagnstico del SCLC
(8,10,11,14). El ensayo ProGRP tambin resulta til para supervisar
la respuesta a la terapia y detectar recurrencias (11-13).
Pueden detectarse niveles elevados de pro-GRP en fases tempranas
del carcinoma microctico de pulmn (9). Sin embargo, dado que la
incidencia del SCLC en la poblacin general es baja, el ensayo
ProGRP no debe emplearse como prueba de cribado.
EIA CanAg ProGRPES
PRINCIPIO DE LA PRUEBAEl EIA CanAg ProGRP es un inmunoanlisis no
competitivo en fase slida de un solo paso que usa anticuerpos
especficos para diferentes eptopos expresados especficamente en el
pro-GRP. Los calibradores, los controles o las muestras de los
pacientes se incuban junto con anticuerpo policlonal anti-pro-GRP
biotinilado purificado por afinidad y anticuerpo monoclonal
anti-pro-GRP E146 marcado con peroxidasa de rbano (HRP) en
microtiras revestidas con estreptavidina. Despus del lavado, se
aade reactivo tamponado sustrato/cromgeno (perxido de hidrgeno y
3,3,5,5-tetrametilbencidina) a cada pocillo y se deja que se
produzca la reaccin enzimtica. Si hay antgeno, durante la reaccin
enzimtica se desarrollar un color azul. La intensidad del color es
proporcional a la cantidad de pro-GRP presente en las muestras.
Dicha intensidad se determina en un espectrofotmetro de
micro-placas a 450 nm tras la adicin de solucin de parada. Se
construyen curvas de calibracin para cada ensayo representando el
valor de la absorbancia con respecto a la concentracin de cada
calibrador. Finalmente, se leen las concentraciones de pro-GRP de
las muestras de los pacientes a partir de la curva de
calibracin.
REACTIVOS
Cada kit de EIA CanAg ProGRP contiene reactivos para 96
determinaciones. La fecha de caducidad del kit viene indicada en la
etiqueta de la parte exterior
de la caja del kit. No use el kit despus de la fecha de
caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes de kits.
Conserve el kit a una temperatura de 2 C a 8 C. La reactivos
abiertos se mantienen estables segn los plazos indicados en
la tabla siguiente siempre que no estn contaminados, se
almacenen en los recipientes originales nuevamente cerrados y se
manipulen debidamente. Devul-valos a una temperatura de 2 C a 8 C
inmediatamente despus de utilizarlos.
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76
Componente Cantidad Almacenamiento y estabilidad tras el primer
uso
Microplaca 1 placa 2-8 C hasta la fecha de caducidad indicada en
la placa
12 x 8 pocillos separables recubiertos con estreptavidina. Tras
la apertura, devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la
bolsa de aluminio, que contiene desecante. Cirrela de nuevo para
mantener las tiras secas.
Calibradores ProGRP A-F 6 viales, Estabilidad tras la
liofilizados reconstitucin 3 das a 2-8 C 3 meses a -20 C o a una
temperatura inferior
ACAL ProGRP 1 x 1 mL
BCAL ProGRP 1 x 1 mL
CCAL ProGRP 1 x 1 mL
DCAL ProGRP 1 x 1 mL
ECAL ProGRP 1 x 1 mL
FCAL ProGRP 1 x 1 mL
Los calibradores liofilizados contienen pro-GRP obtenido de
lneas celulares humanas en una matriz proteica con colorante
amarillo inerte y conservante sin azida. Deben reconstituirse con 1
mL de agua destilada o desionizada antes de utilizarse. NOTA: La
concentracin exacta de pro-GRP es especfica de cada lote y se
indica en la etiqueta de cada vial.
Componente Cantidad Almacenamiento y estabilidad tras el primer
uso
Controles ProGRP 2 viales, Estabilidad tras la liofilizados
reconstitucin 3 das a 2-8 C 3 meses a -20 C o a una temperatura
inferior
1CONTROL ProGRP 1 x 1 mL
2CONTROL ProGRP 1 x 1 mL
Los controles liofilizados contienen pro-GRP obtenido de lneas
celulares humanas en una matriz proteica con conservante sin azida.
Deben reconstituirse con agua destilada o desionizada antes de
utilizarse. NOTA: El rango de concentracin espe-rado de pro-GRP es
especfico de cada lote y se indica en la etiqueta de cada vial.
Anti-ProGRPBIOTIN
Anti-pro-GRP con biotina 1 x 15 mL 4 meses a 2-8 C
Anticuerpo policlonal anti-pro-GRP de cabra purificado por
afinidad y marcado con biotina; aproximadamente, 4 g/mL. Contiene
solucin salina tamponada con fosfato (pH 7,2), albmina srica
bovina, agentes bloqueantes, detergente, colorante azul inerte y
conservante sin azida. Listo para su uso.
Anti-ProGRPCONJ
Marcador, anti-pro-GRP con HRP 1 x 0,75 mL 4 meses a 2-8 C
Solucin de reserva de anticuerpo monoclonal anti-pro-GRP de
ratn, marcado con HRP; aproximadamente, 21 g/mL. Contiene
conservantes sin azida. Debe mezclarse con anti-pro-GRP con biotina
antes de utilizarse.
DIL SPE
Diluyente de muestras 1 x 8 mL 4 meses a 2-8 C
Contiene cloruro sdico 0,15 M y conservante sin azida en una
matriz no proteica. Listo para su uso.
MICROPLA
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98
Componente Cantidad Almacenamiento y estabilidad tras el primer
uso
TMBSUBS Sustrato de TMB-HRP 1 x 12 mL 2-8 C hasta la fecha
de
caducidad indicada en el vial
Contiene perxido de hidrgeno tamponado y
3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). Listo para su uso.
STOP Solucin de parada 1 x 15 mL 2-8 C hasta la fecha de
caducidad indicada en el vial
Contiene cido clorhdrico 0,12 M. Listo para su uso.
WASHBUF 25X Concentrado de lavado 1 x 50 mL 2-8 C hasta la fecha
de cadu-
cidad indicada en el frasco
Solucin salina tamponada con Tris-HCl y estabilizada con Tween
20. Contiene Germall II como conservante. Debe diluirse 25 veces
con agua destilada o desio-nizada antes de utilizarse.
Indicaciones de inestabilidad
El sustrato de TMB-HRP debe ser incoloro o ligeramente azulado.
Un color azul indica que el reactivo se ha contaminado y por tanto
debe desecharse.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para uso diagnstico in vitro:
Sigalasinstruccionesquefiguranenelprospecto.Lafiabilidaddelosresultados
del ensayo no puede garantizarse si no se siguen fielmente
dichas instrucciones. Trate todas lasmuestras de los pacientes como
si fueran potencialmente
infecciosas. Se recomienda que el reactivo original humano y las
muestras humanas se manipulen de acuerdo con el estndar de la OSHA
sobre patgenos transmitidos por la sangre (15). Debe aplicarse el
nivel de bioseguridad 1 (16), o bien otras prcticas de bioseguridad
adecuadas, al manipular materiales que contengan o se sospeche que
contengan agentes infecciosos.
Evite el contacto con reactivos que contengan perxido de
hidrgeno o cido clorhdrico. En caso de entrar en contacto con uno
de estos reactivos, lave a fondo la zona afectada con agua.
Sigalasdirectriceslocalesparalaeliminacindetodoslosmaterialesdedesecho.
RECOGIDA Y MANIPULACIN DE MUESTRAS
El kit de EIA CanAg ProGRP est destinado a utilizarse con suero.
Recoja la sangre mediante venopuncin y separe el suero segn los
procedimientos habituales. El plasma y otros lquidos corporales no
se han validado para su uso con el EIA CanAg ProGRP. No deben
utilizarse tubos de recogida de suero que contengan un agente
acelerador de la coagulacin a base de trombina, ya que dicho agente
puede degradar el pro-GRP. Las muestras de suero han de procesarse
inmediatamente siguiendo un mtodo de coagulacin adecuado o bien
almacenarse a 2-8 C. No use muestras de suero que hayan estado a
temperatura ambiente (hasta 25 C) durante ms de 3 horas, incluido
el tiempo de coagulacin. El suero puede almacenarse entre 2 C y 8 C
durante 24 horas antes de ser analizado. Las muestras de suero
deben analizarse inmediatamente cuando pierdan su temperatura de
almacenamiento de 2-8 C. Para periodos ms largos, guarde las
muestras a -40 C o a una temperatura inferior. Descongele las
muestras congeladas y mzclelas completamente girndolas en espiral o
invirtindolas 10 veces antes de analizarlas. Para obtener
resultados precisos, las muestras no deben contener fibrina,
eritrocitos ni ningn otro tipo de partcula. Es posible que las
muestras de suero de los pacientes sometidos a tratamiento con
anticoagulan-tes o trombolticos contengan fibrina debido a una
formacin incompleta del cogulo.
PROCEDIMIENTO
Materiales necesarios no suministrados con el kit
1. Agitador de microplacasLa agitacin debe ser entre moderada y
vigorosa, aproximadamente a 700-1.100 oscilaciones por minuto.
2. Lavador de microplacasPara obtener el mejor resultado, se
recomienda un lavador de placas automtico que pueda realizar de 1 a
6 ciclos de lavado y aplique un volumen de llenado mnimo de 800
L/pocillo/ciclo usando el modo de lavado por desbordamiento. Se
recomienda emplear una pipeta de 8 canales con puntas de plstico
des-echables para administrar 350 l (es decir, para llenar
totalmente los pocillos), si no se utiliza un lavador de
microplacas automtico.
3. Espectrofotmetro de microplacasDebe tener una longitud de
onda de 450 nm y un rango de absorbancia de 0 a 3,0.
4. Pipetas de precisinDeben usarse puntas de plstico desechables
que permitan administrar volmenes
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1110
5. La solucin de sustrato de TMB-HRP es muy sensible a la
contaminacin. Para conseguir la estabilidad ptima de la solucin de
sustrato de TMB-HRP, vierta la cantidad necesaria del vial a un
recipiente limpiado a fondo o, preferiblemente, a una bandeja de
plstico desechable, para evitar la contaminacin del reactivo.
Utilice siempre puntas de pipeta de plstico desechables limpias (o
puntas de pipeta dispensadora).
6. Utilice siempre puntas de pipeta de plstico desechables
limpias, as como una tcnica de pipeteado adecuada, al manipular
muestras y reactivos. Evite que la punta de la pipeta toque la
superficie del lquido del pocillo para que no se produzca
transferencia de lquido.
Emplear una tcnica de pipeteado apropiada es especialmente
importante al manipular las muestras y la solucin de sustrato de
TMB-HRP.
Preparacin de los reactivos Estabilidad del reactivo
preparado
Calibradores ProGRP 3 das a 2-8 C 3 meses a -20 C o a una
temperatura inferior
Aada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada
vial. Deje reposar como mnimo 15 minutos para reconstituir y mezcle
completamente antes del uso. NOTA: La concentracin de los
calibradores viene indicada en las etiquetas y debe usarse para
calcular los resultados.
Controles ProGRP 3 das a 2-8 C 3 meses a -20 C o a una
temperatura inferior
Aada exactamente 1,0 mL de agua destilada o desionizada a cada
vial. Deje reposar como mnimo 15 minutos para reconstituir y mezcle
completamente antes del uso. NOTA: Los rangos esperados para los
valores de los controles estn indicados en las etiquetas.
Solucin de lavado 2 semanas a 2-25 C en un recipiente
hermtico
Vierta los 50 mL del concentrado de lavado en un recipiente
limpio y diluya 25 veces aadiendo 1.200 mL de agua destilada o
desionizada para conseguir una solucin de lavado tamponada.
Solucin de anticuerpo 12 horas a 2-8 C
Prepare la cantidad necesaria de solucin de anticuerpo mezclando
50 L de marcador (anti-pro-GRP con HRP) con 1 mL de anti-pro-GRP
con biotina por tira (vase la tabla siguiente y la hoja de
protocolo).
en microlitros. Se recomienda utilizar una pipeta de 8 canales o
una pipeta dispensa-dora con puntas de plstico desechables para la
administracin de 100 L, aunque no es absolutamente necesario.
Pipetas para administrar volmenes de mililitros.
5. Agua destilada o desionizadaSe usa para reconstituir los
calibradores ProGRP y los controles ProGRP y para preparar la
solucin de lavado diluida.
Notas de procedimiento
1. Es necesario comprender perfectamente las instrucciones de
este prospecto para garantizar un uso adecuado del kit de EIA CanAg
ProGRP. Los reactivos suministrados con el kit estn destinados a
utilizarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de kits
que tengan nmeros de lote diferentes. No use los reactivos del kit
despus de la fecha de caducidad impresa en la parte exterior de la
caja del kit.
2. Debe dejarse que los reactivos alcancen la temperatura
ambiente (20-30 C) antes de utilizarlos. Las muestras congeladas
deben mezclarse completamente tras descongelarlas. Consulte, ms
arriba, el apartado sobre recogida y mani-pulacin de muestras.
3. Antes de comenzar a pipetear los calibradores y las muestras
de los pacientes, es aconsejable marcar las tiras para poder
identificar claramente las muestras durante y despus del
ensayo.
4. El requisito de efectuar un lavado eficaz y exhaustivo para
separar el antgeno unido y el antgeno no unido y los reactivos de
los complejos anticuerpo-antgeno unidos a la fase slida es uno de
los pasos ms importantes en un EIA. A fin de garantizar un lavado
eficaz, compruebe que todos los pocillos estn totalmente llenos con
solucin de lavado hasta el borde superior durante cada ciclo de
lavado, que la solucin de lavado se administre con una velocidad de
dispen-sacin adecuada, que la aspiracin de los pocillos entre y
despus de los ciclos de lavado sea completa y que los pocillos estn
vacos. Si queda lquido en los pocillos, invierta la placa y golpela
con cuidado contra papel absorbente.
- Lavador automtico de tiras: Siga las instrucciones del
fabricante para efectuar una limpieza y un mantenimiento apropiados
y realice el nmero necesario de ciclos de lavado antes y despus de
cada paso de la incuba-cin. Es muy recomendable usar el modo de
lavado por desbordamiento con un volumen de dispensacin de 800
L.
Nota: Una velocidad de aspiracin muy rpida, si adems no hay
tiempo de remojo, puede reducir la precisin del ensayo. El
dispositivo de aspiracin/lavado no debe dejarse de pie con la
solucin de lavado durante perodos prolongados, ya que las agujas
podran obstruirse y esto provocara una mala dispensacin y aspiracin
de lquido.
-
1312
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PLA
MIC
RO
PLA
-
1514
Nmero de tiras Marcador, anti-pro-GRP con HRP Anti-pro-GRP con
biotina (L) (mL)
1 50 1 2 100 2 3 150 3 4 200 4 5 250 5 6 300 6 7 350 7 8 400 8 9
450 910 500 1011 550 1112 600 12
Asegrese de utilizar un tubo limpio de plstico o vidrio para
preparar la solucin
de anticuerpo. NOTA: No prepare ms solucin de anticuerpo que la
que vaya a
utilizar en un da.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Realice cada determinacin por duplicado para los calibradores,
los controles y las muestras a analizar. Debe elaborarse una curva
de calibracin en cada ensayo. Todos los reactivos y muestras deben
llevarse a temperatura ambiente (20-30 C) antes de
utilizarse.Consulte, ms arriba, el apartado sobre recogida y
manipulacin de muestras.1. Comience a preparar los calibradores
ProGRP, los controles 1 y 2, la solucin
de lavado y la solucin de anticuerpo. Es importante usar
recipientes limpios. Siga las instrucciones cuidadosamente.
2. Transfiera la cantidad necesaria de tiras de microplacas a un
soporte de tiras. (Devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas
a la bolsa de aluminio con desecante y vuelva a cerrarla
cuidadosamente.) Lave cada tira una vez con la solucin de lavado.
No lave ms tiras de las que puedan procesarse en 30 minutos. NOTA:
El prelavado es fundamental; compruebe que los pocillos estn vacos
y comience a aadir las muestras tan pronto como sea posible despus
del lavado.
3. Pipetee 50 L de los calibradores ProGRP (CAL A, B, C, D, E y
F), de los controles 1 y 2 y de las muestras a analizar
(desconocidas o desc.) en los pocillos de las tiras de acuerdo con
el esquema siguiente:
1 2 3 4 5 6 7 etc. A Cal Cal 1. A E desc. B Cal Cal 1. A E desc.
C Cal Cal 2. B F desc. D Cal Cal 2. B F desc. E Cal C1 C F Cal C1 C
G Cal C2 D H Cal C2 D
4. Aada 100 L de solucin de anticuerpo a cada pocillo, usando
una pipeta de precisin de 100 L de 8 canales (o una pipeta de
precisin de 100 L). Evite que la punta de la pipeta toque la
superficie del lquido para que no se produzca transporte de
lquido.
5. Incube el soporte con las tiras durante 2 horas ( 10 min) a
temperatura ambiente (20-30 C) agitando constantemente la placa
mediante un agitador de microplacas.
6. Lave cada tira 6 veces aplicando el procedimiento de lavado
descrito en el anterior apartado sobre notas de procedimiento
(apartado 4).
7. Aada 100 L de sustrato de TMB-HRP a cada pocillo usando el
mismo procedimiento que en el anterior apartado 4. El sustrato de
TMB-HRP debe aadirse a los pocillos con la mayor rapidez posible, y
el tiempo entre la adicin al primer pocillo y la adicin al ltimo
debe ser inferior a 5 minutos.
8. Incube durante 30 min ( 5 min) a temperatura ambiente
(20-30C), agitando constantemente. Evite la exposicin a la luz
solar directa.
9. Aada 100 L de solucin de parada a cada pocillo. Mezcle usando
un agitador de microplacas y lea la absorbancia a 450 nm en un
espectrofotmetro de microplacas dentro de los 15 minutos
posteriores a la adicin de la solucin de parada.
-
1716
Rango de medicinEl rango de calibracin del EIA CanAg ProGRP es
0-2.000 ng/L. Si se espera obtener concentraciones de pro-GRP
superiores al rango de medicin, es reco-mendable diluir las
muestras con diluyente de muestras antes del anlisis (vase Clculo
de resultados con muestras diluidas).
Control de calidad
Para validar las series del ensayo deben utilizarse los
controles ProGRP 1 y 2. Los rangos de los resultados esperados estn
indicados en las etiquetas de los viales. Si se obtienen valores
situados fuera del rango especificado, debern revisarse
completamente los reactivos, la precisin de las pipetas, el lavador
de placas y el funcionamiento del lector, y a continuacin deber
repetirse el anlisis. Cada laboratorio puede asimismo preparar sus
propios grupos de suero con diferentes niveles, que pueden
utilizarse como controles internos para garantizar la precisin del
ensayo.
Material de referencia
Dado que no se dispone de ningn material de referencia comn para
el antgeno pro-GRP, los valores del calibrador del EIA CanAg ProGRP
estn asignados con respecto a un conjunto de estndares de
referencia internos.
CLCULO DE LOS RESULTADOS
Si se utiliza un espectrofotmetro de microplacas con programa de
clculo incor-porado, consulte el manual del espectrofotmetro y cree
un programa usando la concentracin indicada en la etiqueta de cada
uno de los calibradores ProGRP. Para calcular automticamente los
resultados del ensayo ProGRP, se recomienda usar uno de los dos
mtodos siguientes:
Ajustedecurvamediantesplinecbica.ElcalibradorAdebeestarincluido
en la curva con el valor 0 ng/L.
Interpolacinconevaluacinpuntoapunto.ElcalibradorAdebeestar
incluido en la curva con el valor 0 ng/L.NOTA: No deben usarse
mtodos de evaluacin por regresin lineal ni paramtricos de grado
4.
Para realizar una evaluacin manual, se construye una curva de
calibracin represen-tando los valores de absorbancia (A) obtenidos
para cada calibrador ProGRP frente a la correspondiente
concentracin de pro-GRP (en ng/L). Las concentraciones de pro-GRP
desconocidas pueden leerse entonces en la curva de calibracin
usando el valor medio de absorbancia de cada muestra de
paciente.
NOTA: El mtodo de evaluacin para calcular los resultados del
pro-GRP debe emplearse de forma consistente durante la supervisin
de cada uno de los pacientes.
Si las muestras, en un anlisis inicial, dan niveles de pro-GRP
superiores a los del calibrador F, deben diluirse a 1/10 con
diluyente de muestras ProGRP para obtener la concentracin de
pro-GRP precisa de las muestras. Antes del anlisis, prepare
diluciones frescas. No diluya ms all de 1/10. Dilucin a 1/10 = 50 L
de muestra + 450 L de diluyente de muestras ProGRP. La concentracin
de pro-GRP de la muestra no diluida se calcula entonces de la
manera siguiente: Dilucin a 1/10: 10 x valor medidoLas muestras que
superen al calibrador F tras ser diluidas a 1/10 deben consignarse
del modo siguiente: superior a 10 veces el valor del calibrador F;
es decir, si el valor del calibrador F es 2.000, el valor obtenido
se indicar como sigue: superior a 20.000 ng/L.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLos pacientes con cncer confirmado
pueden presentar valores de pro-GRP situa-dos en el mismo rango que
las personas sanas. Asimismo, es posible encontrar niveles elevados
de pro-GRP en personas con enfermedades no malignas, por ejemplo en
casos de fallo renal (9). Por tanto, el nivel de pro-GRP no puede
usarse como prueba absoluta de la presencia o ausencia de
enfermedad maligna, con lo que el EIA ProGRP no debe utilizarse
para el cribado del cncer. Los resultados de esta prueba deben
interpretarse siempre junto a los de otras investigaciones y
procedimientos para el diagnstico de la enfermedad, y el ensayo
ProGRP no debe sustituir a ninguna exploracin clnica
establecida.
Los pares de observaciones en los que ambos valores estn
comprendidos dentro del rango de referencia normal no deben
utilizarse para evaluar la progresin de la enfermedad.
Los anticuerpos anti-reactivo (anticuerpos humanos anti-ratn
(HAMA) o anti-cuerpos heterfilos) que existan en la muestra del
paciente pueden interferir ocasio-nalmente con el ensayo, aunque se
incluyan agentes bloqueantes especficos en el tampn. El factor
reumatoide que haya en la muestra del paciente puede interferir con
el ensayo y generar valores de pro-GRP falsamente bajos.
VALORES ESPERADOSEn un estudio con 626 individuos aparentemente
sanos, el 99% presentaron concentraciones de pro-GRP de 60 ng/L o
inferiores, y el 95% obtuvieron un valor igual o inferior a 43
ng/L. La mediana de los valores sricos fue 17,4 ng/L.
Es recomendable que cada laboratorio establezca su propio rango
de referencia esperado, de acuerdo con la poblacin y con los
procedimientos de recogida de muestras que utilice el
laboratorio.
-
1918
CARACTERSTICAS DE RENDIMIENTO
Precisin
La precisin total se ha determinado segn la directriz EP5-A2
(17) del NCCLS utilizando seis niveles de suero humano agrupado y
congelado que contena pro-GRP aadido. Cada muestra se ha pipeteado
aleatoriamente por duplicado y se ha analizado dos veces cada da
durante 20 das, es decir, se han realizado 40 pruebas con 40
plantillas diferentes por parte de dos tcnicos y se han repetido
usando dos lotes distintos del kit de EIA ProGRP. Los datos de
dicho estudio se resumen a continuacin.
Mues-tra
Lote de reactivos
N Conc. media DE intraensayo CV intraensayo DE total CV total
(ng/L) (ng/L) (%) (ng/L) (%)
1 1 80 33 2,3 6,9 3,0 9,2 2 80 33 1,4 4,2 1,5 8,92 1 80 72 1,6
2,2 4,1 5,7 2 80 74 1,4 1,9 2,3 6,33 1 80 97 3,7 3,8 7,0 7,3 2 80
96 3,6 3,7 3,1 6,54 1 80 333 7,2 2,2 12,9 3,9 2 80 326 4,3 1,3 8,3
5,15 1 80 781 12,8 1,6 35,6 4,6 2 80 759 11,8 1,6 16,2 4,36 1 80
1449 33,8 2,3 59,2 4,1 2 80 1495 28,8 1,9 36,4 4,9
Lmite de deteccinEl lmite de deteccin (LD) corresponde al lmite
superior del intervalo de confianza del 95% y representa la mnima
concentracin de antgeno pro-GRP que puede distinguirse de cero. Se
ha aplicado la directriz EP5-A2 (18) del NCCLS para disear los
experimentos de determinacin del lmite de deteccin. Se ha llevado a
cabo un estudio en el que el calibrador B del EIA ProGRP se ha
diluido en calibrador A hasta 10 ng/L. A continuacin, el calibrador
A (cero) y la dilucin de calibrador B (10 ng/L) se han analizado en
rplicas de 30 por anlisis, en cuatro determinaciones efectuadas en
dos das distintos. El lmite de deteccin del EIA ProGRP ha resultado
ser < 10 ng/L.
Sensibilidad funcional
La sensibilidad funcional se expresa como la concentracin de un
analito en la que el CV total es del 20%. Se ha realizado un
estudio en el que un grupo de sensibilidad de cinco miembros ha
sido analizado en rplicas de dos, en dos anlisis efectuados en 20
das diferentes y con dos lotes de reactivos. La sensibilidad
funcional del EIA ProGRP se ha determinado que es < 20 ng/L.
Recuperacin
Se ha realizado un estudio en el que se han aadido diluciones de
una solucin de antgeno con concentraciones conocidas de pro-GRP a
diluyente de muestra del EIA ProGRP. La concentracin de pro-GRP se
ha determinado utilizando el EIA ProGRP, y el porcentaje de
recuperacin resultante se ha calculado a partir de la proporcin
Concentracin de Pro-GRP Observada / Concentracin de Pro-GRP
Esperada, calculada a su vez a partir de la cantidad de pro-GRP
aadida. La tabla siguiente muestra datos representativos de este
estudio:*
Muestra Antgeno pro-GRP Valor observado Porcentaje de aadido
(ng/L) del ensayo (ng/L) recuperacin (%)**
1 80 94 117 139 164 118 742 821 111 1464 1653 113
2 68 70 103 128 135 106 730 701 96 1453 1518 104
3 79 83 105 138 150 109 741 790 107 1463 1487 102
4 100 108 108 157 178 114 762 807 106 1481 1590 107
5 108 116 108 164 186 114 770 829 108 1489 1609 108
* Datos representativos; los resultados de laboratorios
especficos pueden diferir de los aqu presentados.
** Recuperacin (%) = Concentracin de Pro-GRP Observada (ng/L) /
Pro-GRP Aadido (ng/L)
La recuperacin media en cada una de las concentraciones
enriquecidas indica-das en la tabla anterior fue del 108%.
-
2120
Efecto de gancho por dosis alta
No se ha observado efecto de gancho por dosis alta en muestras
que contenan hasta> 1.500.000 ng/L de antgeno pro-GRP.
Linealidad de dilucin
La linealidad de dilucin media del EIA ProGRP es del 100% 20%.
Se ha rea-lizado un estudio para el EIA ProGRP diseado segn la
directriz EP6-A (19) del NCCLS/CLSI. Las muestras de suero con
valores de pro-GRP elevados se han diluido mediante el diluyente de
muestras del EIA ProGRP. Se ha determinado la concentracin de
pro-GRP para cada dilucin y se ha calculado el porcentaje (%) de
recuperacin. La tabla siguiente muestra los datos de una muestra
represen-tativa de este estudio:*
Muestra Factor de Valor obtenido Valor esperado Porcentaje de
dilucin final (ng/L) (ng/L) recuperacin (%)**
A Sin diluir 1526 1526 100 1:1.11 1344 1373 98 1:1.25 1242 1221
102 1:1.67 901 915 98 1:2.5 636 610 104 1:5 342 304 112 1:10 147
152 97
La tabla siguiente muestra los datos de un estudio de linealidad
que ha utilizado las diluciones recomendadas de 1:10:*
Muestra Factor de Valor obtenido Valor esperado Porcentaje de
dilucin final (ng/L) (ng/L) recuperacin (%)**
A Sin diluir 1025 1025 100 1:10 103 103 101
B Sin diluir 434 434 100 1:10 48 43 111
C Sin diluir 1156 1156 100 1:10 115 115 99 * Datos
representativos; los resultados de laboratorios especficos pueden
diferir de los aqu presentados.
** Recuperacin (%) = Concentracin de Pro-GRP Obtenida x Factor
de Dilucin / Concentracin de Pro-GRP Sin Diluir.
La recuperacin media entre las tres muestras diluidas ha sido
del 103,6%.
Especificidad analtica
La especificidad de anlisis media del EIA ProGRP es del 100%
15%. Se han realizado estudios de recuperacin para comparar los
sueros que contienen los compuestos siguientes (en las
concentraciones indicadas) con sueros de control. Se ha empleado la
directriz EP7-A (20) del NCCLS para disear los experimentos sobre
interferencias. Se han estudiado las siguientes sustancias y
concentraciones y se ha observado que no interfieren con la
prueba.
Interferencias sricas endgenas Concentracin del anlisis
Triglicridos 30 mg/mLBilirrubina 0,2 mg/mLHemoglobina 4,5
mg/mL*Protena total 120 mg/mL
* En muestras con concentraciones de hemoglobina superiores a
4,5 mg/mL existe el riesgo de obtener un resultado elevado con el
EIA ProGRP.
Interferencias con medicamentos quimioteraputicos Concentracin
del anlisis
Carboplatino 500 g/mLCisplatino 165 g/mLDexametasona 10
g/mLDoxorubicina 1,16 g/mLLeucovorina 2,68 g/mLMetotrexato 45
g/mLPaclitaxel 3,5 ng/mL
Enfermedades clnicas que pueden interferir
El EIA ProGRP se ha evaluado utilizando muestras con HAMA y
factor reuma-toide (FR) para evaluar adicionalmente la
especificidad del ensayo. Se han eva-luado los porcentajes de
recuperacin de seis muestras positivas para el HAMA y de cinco
muestras positivas para el FR, con la adicin de antgeno pro-GRP a
cada muestra en concentraciones bajas y altas.HAMA: La recuperacin
media general del Pro-GRP en presencia de HAMA ha sido del 101%, y
las recuperaciones individuales han oscilado entre el 93% y el
111%.FR: La recuperacin media general ha sido del 79% en las
muestras positivas para el factor reumatoide. As pues, es posible
que en los pacientes con niveles atpicos de factor reumatoide se
hayan subestimado los valores de pro-GRP.
-
2322
GARANTACualquier cambio o modificacin del procedimiento no
recomendado por Fuji-rebio Diagnostics puede afectar a los
resultados, en cuyo caso Fujirebio Diag-nostics rechaza todas las
garantas expresas, implcitas u obligatorias, incluida la garanta
implcita de comerciabilidad e idoneidad para el uso.
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-
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