IDENTIFICAZIONEIDENTIFICAZIONE BIOCHIMICABIOCHIMICA

Calsystem

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

La determinazione del profilo biochimico di un microrganismo è il metodo più comunemente utilizzato per l’identificazione microbiologicautilizzato per l identificazione microbiologica.

Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzanoSi tratta di test di facile esecuzione che utilizzano le tecniche della microbiologia classica e non prevedono l’impiego di particolari attrezzatureprevedono l impiego di particolari attrezzature.

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

Il microrganismo da identificare viene coltivato su substrati diversi costituiti da fonti di carbonio specifici verificando la capacità del microrganismospecifici, verificando la capacità del microrganismo di utilizzarli e trasformarli.

L’insieme di queste informazioni traccia un profilo biochimico tipico di quell’organismo che vienebiochimico tipico di quell organismo che viene confrontato con i profili noti arrivando così alla sua identificazione.

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI

Principio– Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per laProduzione di acidi e/o gas durante la crescita per la

fermentazione degli zuccheri

Procedura– Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di

pH (rosso fenolo)

FinalitàFinalità– Differenziare gli enterobatteri

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

UTILIZZAZIONE DEL CITRATO

Principio– La utilizzazione del citrato come unica fonte diLa utilizzazione del citrato come unica fonte di carbonio determina una alcalinizzazione del terreno

Procedura– Terreno liquido con l’aggiunta di citrato e un indicatore di pH (blu di bromotimolo)

FinalitàFinalità– Differenziare Klebsiella o Enterobacter da Escherichia o Salmonella

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

DECARBOSSILASI

Principio– La decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammineLa decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammine

Procedura– Terreno arricchito di amminoacidi (lisina, ornitina, ( , ,arginina) con l’indicatore Porpora di bromocresolo che vira al violetto se l’enzima è attivo

FinalitàFinalità– Determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

B-galattosidasi (ONPG)

Principio– La B-galattosidasi idrolizza l’ONPG (o-nitrofenil-b-La B galattosidasi idrolizza l ONPG (o nitrofenil bgalattoside a nitrofenolo di colore giallo

Procedura– Terreno contenente ONPG. Se l’enzima è presente il pozzetto vira al colore giallo

FinalitàFinalità– Differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella (-). Identificazione di alcune shigelle e Pseudomonas( ) g

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

LIQUEFAZIONE DELLA GELATINA

Principio– Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano laMolti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la gelatina

Procedura– Al brodo nutritivo si aggiunge gelatina al 12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche dopo raffreddamento.dopo raffreddamento.

Finalità– Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

PRODUZIONE DI H2S

Principio– L’idrogeno solforato viene prodotto in seguito aL idrogeno solforato viene prodotto in seguito a degradazione di amminoacidi contenenti gruppi solforici o dalla riduzione del tiosolfato

P dProcedura– Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H2S.solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H2S.

Finalità– Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

INDOLO

Principio– Il triptofano presente nelle proteine è convertito adIl triptofano presente nelle proteine è convertito ad indolo

Procedura– La presenza di indolo è evidenziata dall’aggiunta al terreno di dimetilaminobenzaldeide

FinalitàFinalità– Permette di differenziare Escherichia (+) da Klebsiella /enterobacter /

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

ROSSO METILE

Principio– Batteri fermentanti che producono una miscela di acidiBatteri fermentanti che producono una miscela di acidi sufficiente ad abbassare il pH al di sotto di 4.3

Procedura– Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione l’indicatore Rosso Metile

FinalitàFinalità– Permette di differenziare Escherichia (rossa) da Klebsiella /enterobacter (gialle)/ (g )

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

RIDUZIONE DEL NITRATO

Principio– Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione anaerobia) riducendosi a nitrito o azotoanaerobia) riducendosi a nitrito o azoto

Procedura– Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di i i i è id i d ll’ i di f il i / idnitriti è evidenziata dall’aggiunta di a-naftilammina/acido

solfanilico che produce un colore rosso in presenza di nitriti

Finalità– Aiuta a differenziare molti batteri enterici di solito positivi

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

FENILALANINA DEAMINASI

Principio– La deaminazione produce acido piruvico.La deaminazione produce acido piruvico.

Procedura– Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo la crescita pl’aggiunta di cloruro ferrico determina una colorazione verde

FinalitàFinalità– Caratterizza il genere Proteus e il gruppo Providencia

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

IDROLISI DELL’AMIDO

Principio– La soluzione Iodio/iodurata (LUGOL) dà un colore bl i di idblu in presenza di amido.

Procedura– I batteri sono fatti crescere in un terrenoI batteri sono fatti crescere in un terreno agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale zona di chiarificazione intorno alle coloniee e tua e o a d c a ca o e to o a e co o e

Finalità– Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare l’ id d i B illl’amido ad esempio Bacillus

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

UREASI

Principio– L’urea viene scissa in ammoniaca e CO2L urea viene scissa in ammoniaca e CO2

Procedura– Terreno contenente urea al 2% e fenolo come indicatore di pH

Finalità– Permette di distinguere Klebsiella(+) da Escherichia (-)

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

VOGES-PROSKAUER (VP)

Principio– L’acetoina viene prodotta dalla fermentazioneL acetoina viene prodotta dalla fermentazione dello zucchero

Procedura– Aggiunta del reattivo a-naftolo dopo incubazione. In caso di positività si sviluppa un colore rosso

FinalitàFinalità– Permette di distinguere Klebsiella(+) e Enterobacter (+) da Escherichia (-). Caratterizza i ( ) ( )ceppi di Bacillus

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

Questi metodi si sono evoluti nel tempo fino ad arrivare a sistemi semi-automatici, addirittura automatici che permettono di effettuareautomatici, che permettono di effettuare contemporaneamente un elevato numero di prove biochimiche e confrontarle con database moltobiochimiche e confrontarle con database molto ampi, mediante codici numerici.

IDENTIFICAZIONEBIOCHIMICABIOCHIMICA

L’identificazione di ogni e qualsiasi batterio richiederebbe un elevato numero di test biochimici di faticosa esecuzione e di difficile interpretazionedi faticosa esecuzione e di difficile interpretazione.

I pannelli (o gallerie) vengono organizzati aI pannelli (o gallerie) vengono organizzati a seconda dei gruppi batterici o lieviti da ricercare in funzione intanto dell’origine del campione e infunzione, intanto, dell origine del campione e in funzione di prove preliminari di orientamento.

Frequenza dei patogeni i iurinari

Escherichia coli 75% Gram –P t 10% GProteus 10% Gram –Klebsiella Gram – 90%

% GEnterobacter 5% Gram –Serratia Gram –Staphylococcus 5% Gram +Streptococcus 3% Gram +Pseudomonas 2% Gram –

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICABIOCHIMICA

Un pannello di identificazione per batteri urinari conterrà le prove biochimiche adatte a discriminare le specie elencate nella tabella precedente.

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICABIOCHIMICA

Questa procedura richiede, però, un pannello per ogni tipologia di campione per la probabilitàogni tipologia di campione per la probabilità diversa della presenza di una determinata specie.

L’orientamento attuale è di disporre di soli due pannelli con un numero più significativo dipannelli con un numero più significativo di prove biochimiche (e non solo), uno per Gram-e uno per i Gram+.

Un terzo pannello da dedicare esclusivamente ai lieviti ed ai funghi.

Prove preliminari di orientamento

1. Colorazione di Gram• Discrimina i batteri in Gram+ e Gram-

2 T t KOH2. Test KOH• E’ alternativa alla colorazione di Gram. I lipidi presenti nella parete dei

Gram- vengono disciolti dal KOH dando luogo ad una sostanza mucosa filante all’ansa. I Gram+ non mostrano alcun cambiamento.

3. Catalasi• La catalasi è un enzima capace di scindere l’acqua ossigenata in acqua

ed ossigeno. Per distinguere Staphylococcus (+) da Streptococcus (-)4 Ossidasi4. Ossidasi

• La ricerca dell’enzima citocromo-ossidasi si esegue aggiungendo una goccia di tetrametil-p-fenilendiammina sulla colonia o su una colonia trasferita su una striscia di carta. Si sviluppa un colore rosa>viola

• Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas• Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas5. Emolisi

• Per distinguere gli alfa dai beta-emolitici

L’evoluzione dei sistemiL evoluzione dei sistemi

ENTEROTUBE

L’evoluzione dei sistemiL evoluzione dei sistemi

ENTEROTUBE

L’evoluzione dei sistemiL evoluzione dei sistemi

ENTEROTUBE