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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Búsqueda del gen mutado en la región caliente de
la mutante nhr1 de Arabidopsis thaliana por
análisis fenotípico inverso usando líneas T-DNA
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
JESÚS QUIROZ CHÁVEZ
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO OCTUBRE DE 2013
II
CARTA CESIÓN DE DERECHOS
III
SIP-13-bis
IV
Sip-14-bis
V
RECONOCIMIENTOS
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Fitomejoramiento Molecular
perteneciente al Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario
de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del
Instituto Politécnico Nacional (IPN) y parcialmente financiado por el programa
Secretaría de Investigación y Posgrado del cual el Dr. Francisco Roberto Quiroz
Figueroa fue Director. Así también, la beca PIFI-IPN y la otorgada por CONACYT No.
419903 a Jesús Quiroz Chávez. El autor reconoce la contribución de la M. en C.
María Eugenia Campos (IBT-UNAM) y la Dra. Gladys Cassab (IBT-UNAM) al
proporcionar las líneas mutantes nhr1, así también al M. en C. Eusebio Nava Pérez
por el apoyo en los análisis estadísticos.
Dirección
Francisco Roberto Quiroz Figueroa, Dr.
Laboratorio de Fitomejoramiento Molecular
Depto. de Biotecnología Agrícola
CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa
Blvd. Juan de Dios Bátiz Paredes #250
Guasave, Sinaloa, C.P. 81101
Tel. (55) 57 29 60 00 ext. 87659
Tel. (687) 872 9625 o 26 ext. 87659
VI
DEDICATORIA
A mi madre María Petra Chávez Gómez
Por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, valores, motivación y sus
enseñanzas que me han permitido ser una persona de bien.
A mi padre Rigoberto Quiroz Domínguez
Por guiarme en la vida con ejemplos de perseverancia, constancia, respeto hacia los
demás y gran bondad. Por el valor mostrado para salir adelante.
A mi familia
A mi hermana Mony por ser la hermana mayor y ser el ejemplo y con la cual compartí
momentos de infancia, de felicidad y momentos difíciles; a mi hermano Everardo y a
mi hermano menor Ernesto, a mis tíos y primos que participaron de forma directa o
indirecta en la elaboración de esta tesis. A María José Guillen Espinoza, por haber
compartido una relación sentimental durante toda esta etapa de mi vida.
A mis maestros
Por su gran apoyo y por impulsar el desarrollo de mi formación y motivarme a
culminar mis estudios y elaboración de esta tesis.
A mis amigos
A mis amigos de Maestría que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación
profesional.
VII
AGRADECIMIENTOS
Esta tesis es el fruto de un largo proceso tanto profesional como humano que ha sido
posible gracias a mucha gente.
En primer lugar quiero agradecer a mi familia, a mí madre María Petra Chávez
Gómez, mi padre Rigoberto Quiroz Domínguez, mi hermana mayor Petra Ramona
Quiroz Chávez, mi hermano Everardo Quiroz Chávez y mi hermano menor Ernesto
Rigoberto Quiroz Chávez, porque gracias a ellos he logrado lo que ahora soy. A mis
padres, por creer siempre en mí, por apoyarme en todos mis proyectos. A mis
hermanos por estar siempre cuando los necesito, por preocuparse y cuidarme. A mi
hermano menor de seis años y a mis sobrinos que me recuerdan cada día las cosas
verdaderamente importantes de la vida y me dan fuerza para seguir adelante.
Quisiera agradecer las enseñanzas, orientaciones y conducción científica de mi
director de Tesis, Dr. Francisco Roberto Quiroz-Figueroa, que han hecho posible la
realización de este trabajo.
Agradezco la orientación a la M. en C. Luz María García Pérez por su apoyo técnico
en el laboratorio así como el asesoramiento en la escritura y por resolver mis dudas.
Quiero agradecer a los integrantes de mi comité tutorial: la M.C. Ana Elsi Ulloa
Pérez, Dra. Claudia Castro Martínez, Dr. Carlos L. Calderón Vázquez y al Dr. Ignacio
Eduardo Maldonado Mendoza por el apoyo, sugerencias y correcciones durante mis
Tutoriales y Seminarios. Finalmente quiero agradecer al Dr. Antonio Luna González,
quien recientemente se incorporó a mí comité tutorial, por las sugerencias y
correcciones durante la revisión de esta Tesis.
A mis compañeros de Maestría de la generación 2011 que siempre estuvieron ahí al
inicio y durante este proceso. Al grupo de amigos de la universidad que el destino
dispersó por el mundo, a esos amigos de la infancia que siempre han estado los
momentos más importantes, que me llenan de ánimos a seguir adelante.
A mis compañeros de laboratorio, a los que quedan y a los que han tomado otros
rumbos. A todos los que han estado dispuestos a resolver mis dudas y a darme
consejos.
VIII
ÍNDICE
Página
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE CUADROS
GLOSARIO
ABREVIATURAS
X
XI
XII
XV
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES
2.1. Estrés abiótico
2.2. Estrés por sequía
2.3. Estrés salino
2.4. ABA
2.5. Arabidopsis thaliana
2.6. Genética reversa empleando mutantes T-DNA pérdida de función
2.7. La mutante nhr1
2.8. Descripción del locus NHR1
4
4
4
6
7
8
9
11
14
3. JUSTIFICACIÓN
4. HIPÓTESIS
21
22
5. OBJETIVO GENERAL
5.1. Objetivos particulares
23
23
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Material vegetal
6.2. Preparación del medio de cultivo para germinar y crecer A.
thaliana in vitro
6.3. Estratificación de semillas de A. thaliana
6.4. Preparación de sustrato para el crecimiento de A. thaliana en
macetas
6.5. Obtención de líneas T-DNA homocigotas de los genes
pertenecientes al locus NHR1
6.6. Secuenciación de los genes sin líneas T-DNA
24
24
24
24
25
25
26
27
IX
6.7. Ciclo de vida de las mutantes T-DNA pertenecientes al locus
NHR1
6.8. Estrés salino (NaCl)
6.9. Análisis de ABA exógeno
6.1.1. Ensayo de pérdida de agua
6.1.2. Selección y secuenciación de genes candidatos para albergar
la mutación nhr1
6.1.3. Verificación del truncamiento del ARNm del gen candidato
L7TR por RT-PCR
27
28
28
29
29
30
7. RESULTADOS
7.1. Obtención de líneas homocigotas T-DNA
7.2. Secuenciación de genes de la región caliente nhr1 con las que
no se cuenta con líneas mutadas con T-DNA
7.3. Ciclo de vida de las mutantes T-DNA en los genes de la región
caliente nhr1
7.4. Estrés abiótico
7.4.1. Ensayo ABA exógeno
7.4.2. Estrés salino
7.4.3. Ensayo de pérdida de agua
7.5. Secuenciación de genes candidatos a albergar la mutación nhr1
7.6. Verificación de los niveles de transcritos de genes candidato L7TR por RT-PCR
31
31
34
36
39
39
46
51
53
56
8. DISCUSIÓN 58
9. CONCLUSIONES 64
10. BIBLIOGRAFÍA 66
11. ANEXOS 74
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Región del locus NHR1. 14
Figura 2 Esquema representativo del comportamiento esperado de líneas T-
DNA bajo condiciones de estés salino (NaCl).
22
Figura 3 Esquema representativo para determinar homocigosis en líneas T-
DNA.
32
Figura 4 La mutante ank es homocigota para el inserto T-DNA. 34
Figura 5 El gen ARNt-CGA (At3g09585) sin línea T-DNA no presenta
mutaciones en la nhr1.
35
Figura 6 La pérdida de función por T-DNA en los genes l7tr y a-ox afecta la
germinación y establecimiento.
38
Figura 7 La pérdida de función en las mutantes T-DNA pertenecientes al
locus NHR1 no afecta el tiempo emisión de escapo.
39
Figura 8 Dosis letal media de ABA en Col-0. 40
Figura 9
Figura 10
La pérdida de función en la mutante ank genera sensibilidad a ABA.
La pérdida de función en la mutante l7tr genera sensibilidad a ABA.
42
44
Figura 11 La pérdida de función en la mutante r60s ocasiona sensibilidad a
ABA.
46
Figura 12 La pérdida de función en los genes pl, ank, lip y l7tr no afecta el
comportamiento de plántulas en condiciones salinas.
48
Figura 13 La pérdida de función en los genes a-ox, myb, y mcm no afecta el
comportamiento de plántulas en condiciones salinas.
49
Figura 14 La pérdida de función en los genes ppr, apx2, r60s y pwwp no afecta
el comportamiento de plántulas en condiciones salinas.
51
Figura 15 La mutación por T-DNA cusa una menor transpiración en ank. 52
Figura 16 La región promotora del gen L7TR en la mutante nhr1 alberga dos
mutaciones.
55
Figura 17 La expresión del gen L7TR está regulada de forma negativa en la
mutante nhr1.
57
XI
Figura 18 Modelo esquemático de la proteína L7TR como posible receptor de
ABA.
63
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1 Listado de mutantes de pérdida de función de los genes
pertenecientes al locus NHR1 por inserción de T-DNA
24
Cuadro 2
Cuadro 3
Listado de oligonucleótidos de líneas SALK para obtener mutantes
T-DNA homocigotas de los genes del locus NHR1
Selección de genes candidatos a albergar la mutación nhr1
33
54
XII
GLOSARIO
Ácido abscísico: Fitoregulador involucrado en procesos de inhibición del
crecimiento, inducción de la dormancia y en respuesta a estrés abiótico. Debe su
nombre a la función a la que se pensaba participaba durante su descubierto, la
abscisión.
Ácido desoxirribonucleico (ADN): Es un polímero de nucleótidos, cada
nucleótido está formado por una molécula de desoxirribosa, una base nitrogenada
y un grupo fosfato. Es responsable de la transmisión hereditaria, en donde la
secuencia de la cadena de nucleótidos codifica la información genética de cada
individuo.
Ácido jasmónico: Es un derivado del ácido linoléico, su principal función es la de
regular la respuesta ante condiciones de estrés biótico y abiótico en las plantas
así como el crecimiento y desarrollo. Tiene un papel importante en respuesta a
daños por heridas, este compuesto es sintetizado por las plantas ante ataques
por insectos.
Ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc): ADN de doble cadena
sintetizado a partir de un ARN mensajero maduro, por esta razón carece de
intrones. La enzima transcriptasa reversa es la encargada de sintetizarlo.
Ácido salicílico: Es un fitoregulador de composición química fenólica, participa
en procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas, fotosíntesis, transpiración
y la absorción y transporte de iones. También se involucra en la señalización
celular ante el ataque por patógenos induciendo la producción de proteínas
relacionadas a patogénesis y juega un papel en el sistema de defensa adquirido.
ADN de transferencia (T-DNA): ADN transferido del plásmido Ti (inducción del
tumor) de algunas especies de bacterias como Agrobacterium tumefaciens. El
nombre deriva de la transferencia de un fragmento del plásmido hacía el genoma
de la planta hospedera.
ARN de transferencia (ARNt): Es un tipo de ARN encargado de transportar
aminoácidos a los ribosomas, poseen un anticodón que sirve para unirse al ARN
mensajero, existe un ARN de transferencia para cada aminoácido.
XIII
Elementos con acción en cis: Elemento regulador transcripcional contiguo al
gen que se regula. Normalmente estas secuencias se localizan en la región
promotora del gen, hacia la zona 5’.
Elementos de respuesta a ABA (ABRE): Regiones de secuencias cortas
localizadas en el promotor de genes específicos, a los que se unen factores de
transcripción en respuesta a ABA.
Emisión de escapo: Transición de la etapa vegetativa a la reproductiva
(crecimiento del órgano floral) en Arabidopsis thaliana.
Especies reactivas de oxígeno (ROS): son generalmente moléculas muy
pequeñas, como por ejemplo: iones de oxígeno, radicales libres y peróxidos,
altamente reactivas debido a la presencia de una capa de electrones de valencia
no apareada. Se forman de manera natural como subproducto del metabolismo
del oxígeno. Pueden funcionar como moléculas señal o generar el estrés
oxidativo.
Estrés abiótico: Alteración en el metabolismo celular inducido por factores
abióticos con efectos sobre la fisiología y desarrollo de un organismo.
Etil metano sulfonato (EMS): Es un mutagénico teratogénico, compuesto
orgánico que produce mutaciones azarosas en el material genético, generalmente
un cambio puntual de base, principalmente por la alquilación de la guanina. El
grupo etilo de este compuesto reacciona con la guanina dando lugar a la base
anormal O-6-etilguanina que durante la replicación esta es complementaria con la
timina, de esta forma un par de G:C tras dos replicas termina por convertirse en
A:T. Esto altera la información genética.
Factor transcripcional (FT): Proteína que participa en la regulación de la
transcripción del ADN, estos pueden actuar uniéndose directamente a la
secuencia de ADN o a otros factores de transcripción, o incluso a la ARN
polimerasa. Estos pueden ser activados o desactivados por otras proteínas o
estímulos ambientales.
Fragmentos derivados de transcritos (FDT): Son fragmentos de ADN
complementarios obtenidos a partir de ARN mensajeros parciales, que a su vez
son productos de genes que por lo general se desconoce su secuencia completa.
XIV
Guanina (G): Base nitrogenada púrica, es una de las cuatro bases que forman
parte del ADN, se representa con una G.
Hidrotropismo: Crecimiento direccional de las raíces de las plantas hacía las
zonas con mayor potencial hídrico.
Hipersensibilidad Salina (HS): Sensibilidad mayor de lo normal de las plantas al
estrés salino (NaCl).
Oligonucleótido: Secuencia corta de ADN o ARN formada por la unión de dos o
más nucleótidos, se utilizan como cebadores, sondas de hibridación y bloqueos
específicos de ARN mensajero.
Peróxido de hidrogeno: Compuesto químico altamente polar y fuertemente
enlazado con el hidrógeno, es un poderoso oxidante. En las plantas es producido
como metabolito secundario que funciona como molécula señal en la célula.
Tetratricopéptido: Motivo estructural compuesto por un par de α-hélices anti
paralelas, consiste en una secuencia compuesta por 34 aminoácidos
degenerados, son mediadores de la interacción proteína-proteína.
Trifosfato de adenosina: Nucleótido involucrado en la obtención de energía en
la célula. Está compuesto de una molécula de adenina, un azúcar de cinco
carbonos, la ribosa y tres grupos fosfato.
XV
ABREVIATURAS
%
[Ca2+]cyt
Por ciento
Calcio en el citosol
°C Grado centígrado o Celsius
μL Micro litros
μM Micro molar
ABA Ácido abscísico
Abi Insensible a ABA
ABRE Elementos de respuesta a ABA
ADN
JA
ANK
Ácido desoxirribonucleico
Ácido jasmónico
Ankirina
A-OX Amino oxidasa
APX
ATP
Ascorbato peroxidasa
Trifosfato de adenosina
Ca2+ Ion calcio
Cat Catálogo
ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario
Cis Elementos con acción en cis
Col-0
DAG
DEAD
Columbia-0
D-1, 2-Diacilglicerol
Motivo Asp-Glu-Ala-Asp
DS Después de la siembra
EMS
ET
et al.
Etil metano sulfonato
Etileno
Colaboradores
FCA Proteína putativa de unión al ARN
FLC Locus de la floración C
FT Factor transcripcional
FY Locus de la floración Y
G Guanina
XVI
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HS
HTH
Hipersensibilidad Salina
Dominio hélice-vuelta-hélice
ITN1 Gen involucrado en la tolerancia a NaCl
L7TR
LBb1
Gen homólogo en A. thaliana a un receptor de siete dominios de
pulmón en H. sapiens.
Oligonucleótido en el borde izquierdo del T-DNA 1
LEA Late Embryogenesis Abundant (abundante en embriogénesis tardía)
Lip Lipina
Lp
Mb
Oligonucleótido izquierdo
Megabases
MCM Gen denominado “Mantenimiento de mini cromosoma”
mM Mili molar
MS Sales de Murashige y Skoog
MYB
Na+
NA+/H+
Factor transcripcional MYB por referirse a Mieloblastosis
Ión sodio
Proteína intercambiadora del ión sodio e hidrógeno
NaCl Cloruro de sodio
NADPH+ Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato Reducido
NaOCl
NASC
Hipoclorito de sodio
Nottingham Arabidopsis Stock Centre
NCED3
NO
9-cis-epoxycarotenoide dioxygenasa-3
Óxido nítrico
NHR1 Sin respuesta hidrotrópica 1
nM Nano molar
NM
PA
PAH1
PAP
Medio normal
Ácido fosfatídico
Fosfatidato fosfohidrolasa 1
Fosfatasa ácido fosfatídico
Pb Pares de bases
XVII
PCD Muerte celular programada
PCR
PL
Reacción en cadena de la polimerasa
Pectato liasa
PPR Pentatricopéptido
PRP
p/v
Proteína relacionada a patogénesis
Peso sobre volumen
PWWP
r60S
Tetrapéptido (Pro-Trp-Trp-Pro)
Proteína ribosomal 60s
ARN
ROS
Rp
Ácido ribonucleico
Especies reactivas de oxígeno
Oligonucleótido derecho
RT-PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa en Transcripción Reversa
SA Ácido salicílico
SOS
SOD
Salt-Overly-Sensitive(demasiado sensible a sal)
Superóxido dismutasa
TAIR Información sobre los recursos de Arabidopsis thaliana
T-DNA
TDF
TPR
ADN de transferencia
Fragmentos derivados de transcritos
Tetratricopéptido
t-ARN ARN de transferencia
UV
Vir
Luz ultravioleta
Genes de virulencia
Zn2+ Ión zinc
XVIII
RESUMEN
El estrés abiótico como la sequía y la salinidad son condiciones ambientales que
tienen efectos adversos en el crecimiento y productividad de las plantas. En los
últimos años la sequía y la salinidad han afectado severamente los cultivos agrícolas
en los estados del norte y centro de México por lo que es necesario generar
conocimiento básico sobre este tipo de estrés. Por otro lado Arabidopsis thaliana es
una planta modelo utilizada para generar conocimiento básico y extrapolarlo a
plantas de interés económico. La mutante sin respuesta hidrotrópica 1 (nhr1) de A.
thaliana presenta sensibilidad a ácido abscísico (ABA), Hipersensibilidad Salina (HS),
tolerancia a sequía y mayor longevidad. Debido a la posible aplicación que el gen
nhr1 puede tener en cultivos de tipo oARNmental y de interés comercial para estrés
por sequía y salinidad, es necesario determinar donde se localiza la mutación nhr1.
Por lo que, el objetivo de este proyecto es encontrar genes candidatos para albergar
la mutación nhr1 mediante la evaluación de mutantes de pérdida de función para los
genes pertenecientes al locus NHR1 bajo condiciones estresantes (salinidad, ABA y
deshidratación) así como el ciclo de vida. Inicialmente se obtuvieron líneas con T-
DNA homocigotas de los genes pertenecientes a la región caliente nhr1 y se
secuenciaron los genes de esta región carentes de línea T-DNA en la mutante nhr1,
el análisis de las secuencias no mostró cambios de base. Resultados en el ciclo de
vida (emisión de escapo) de las mutantes T-DNA, no mostraron comportamientos
opuestos a la nhr1. Se seleccionaron como candidatos a los genes ANK, L7TR y A-
OX. La selección se realizó de acuerdo al mayor número de procesos fisiológicos
afectados. La mutante ank presentó germinación y establecimiento retardado en
presencia de ABA, así como una menor transpiración. La mutante l7tr presentó
germinación, establecimiento retardada bajo condiciones normales y germinación y
establecimiento retardado en presencia de ABA. La mutante a-ox presentó
germinación y establecimiento retardado bajo condiciones normales y menor
sensibilidad en presencia de ABA durante el establecimiento. Se han secuenciado
los genes L7TR y A-OX. Los genes ANK y A-OX no albergan mutaciones por lo que
quedan descartados como candidatos. El gen L7TR presenta dos mutaciones en la
XIX
región promotora, además, su expresión está regulada de manera negativa en la
mutante nhr1. Se sugiere a este gen como el posible responsable del fenotipo nhr1.
ABSTRACT
Abiotic stress such as drought and salinity are environmental conditions with adverse
effects on plant growth and productivity. Recently drought and salinity has been
affecting drastically the crops in the north and center of México, due to this, is
necessary to generate basic knowledge about this type of stress. By the other hand,
A. thaliana is a model plant used to generate basic knowledge and extrapolate it to
crop plants. The mutant no hydrotropic response 1 (nhr1) of A. thaliana, is ABA
sensitivity, hypersensitivity to salt, drought tolerance and more longevity. Due to the
possible application of NHR1 gene on oARNmental and other commercial crops to
alleviate abiotic stress, it results necessary to determine which the mutated gene in
NHR1 is. Therefore, the aim of this project was to identify candidate genes housing
nhr1 mutations by assessing the phenotype in mutated genes from the locus NHR1
under stressful conditions (salinity, ABA and dehydration) and their life cycle as well.
Initially homozygous lines were obtained and genes lacking T-DNA mutations have
been sequenced. No changes were found in these sequences. When analyzing life
cycle (bolting) in T-DNA mutants, any antagonistic behavior to nhr1 mutant was
observed. It has been selected as candidates to host the nhr1 mutant the genes ANK,
L7TR and A-OX.The selection was performed according to the number of
physiological processes affected. ank mutant has a delayed germination and
establishment of seedlings and less transpiration rates. The l7tr mutant exhibited
delayed germination and establishment under normal conditions and delayed
germination in the presence of ABA. The a-ox mutant presented delayed germination
and establishment under normal conditions, as well as less ABA sensitivity during its
establishment. ANK, A-OX and L7TR genes were then sequenced. No mutations
were located in ANK or A-OX gene, therefore; these were discarded as candidates.
By the other hand, the L7TR presented two mutations in its promoter region and
XX
mARN expression resulted down regulated in nhr1 mutant genotype. Taking together
it is postulated that this gene could be involved of the nhr1 phenotype.
1
1- INTRODUCCIÓN
El estrés abiótico es uno de los principales factores que afectan el crecimiento y la
productividad agrícola a nivel mundial (Gao et al., 2007). En la planta modelo, A.
thaliana, se conocen un gran número de genes involucrados en respuesta a estos
tipos de estrés. Algunos de éstos han sido utilizados y manipulados para mejorar
genéticamente cultivos de interés comercial. A. thaliana es considerada un
organismo modelo para el estudio de la fisiología y la genética en plantas. Gran parte
de la información obtenida en ella puede ser extrapolable a otras plantas de interés
comercial (Nelson et al., 2007). Además, la facilidad en la transformación mediante
Agrobacterium tumefaciens, permite crear mutantes que sirven para evaluar la
función de genes específicos, estas son conocidas como mutantes pérdida de
función T-DNA. La aplicación de esta técnica se le conoce como genética reversa
(Tax y Vernon, 2001). De forma opuesta al truncamiento y pérdida de función de un
gen, una mutación ganancia de función, es aquella en donde ya sea de forma
inducida o por condiciones que se presentan de forma natural, un gen específico es
inducido y su expresión y actividad son potenciados. Considerando lo descrito
anteriormente, se podría esperar que dos organismos con mutaciones opuestas en
un mismo locus, presenten un fenotipo contrario. En 2003 (Eapen et al.) se reportó la
mutante ganancia de función nhr1, para el fenotipo de raíz larga en A. thaliana. Sin
embargo, aún se desconoce el gen y sitio exactos que albergan la mutación. Hasta la
fecha, se conoce el locus NHR1 o “región caliente”, en esta zona se localizan 15
genes con funciones específicas cada uno (Campos et al., datos sin publicar). En
años posteriores a su descubrimiento, esta mutación se ha ido caracterizando.
Primero, la mutación debe su nombre a la capacidad de desarrollar el sistema
radicular en un medio con bajo potencial hídrico, es decir, presenta hidrotropismo
negativo (Eapen et al., 2003). Años más tarde, Quiroz-Figueroa et al (2010), reportó
que la mutación tiene afectada la germinación y establecimiento, presentando un
retraso. Se sabe que los procesos fisiológicos como la dormancia y germinación de
semillas son regulados por ABA (Koornneef et al., 2002), este fitoregulador actúa de
forma positiva potenciando la dormancia. La mutante nhr1 presenta altos niveles de
ABA endógeno, lo que probablemente esté inhibiendo la germinación. Una
2
posibilidad sería que una mutación opuesta a la mutante nhr1 presentara niveles
inferiores de ABA y como consecuencia germinación prematura. Pues se sabe que
mutantes de biosíntesis de ABA (aba), presentan bajos niveles de ABA y germinan
de forma prematura (Koornneef et al., 1982, 1984). Además, se ha reportado que el
tiempo de la floración está afectado en la mutante nhr1, siendo este más prolongado.
Durante la floración, el Flowering Locus (FLC) funciona como un regulador negativo,
en donde un incremento en la expresión causa una floración retardada (Sung et al.,
2006), y la disminución en su expresión trae como consecuencia una floración
prematura (Zhao et al., 2005). Adicionalmente, se conoce que el gen FCA (flowering
time control protein A) induce la floración, por lo que plantas que sobre-expresan
FCA presentan floración en un menor tiempo (Macknight et al., 1997). La inhibición
del complejo FCA-FY por ABA induce la actividad del FLC y consecuentemente
retarda la floración (Finkelstein, 2006). La exposición de la mutante nhr1 a ABA
exógeno, prolonga el tiempo de la floración (Quiroz-Figueroa et al., 2010). Por lo que
probablemente el alto nivel de ABA en la mutante es el causante del incremento en el
tiempo de la floración. Por otro lado, se ha visto que algunas mutantes con una
mayor tolerancia a diferentes tipos de estrés abiótico, presentan un crecimiento y
desarrollo más lento (Seo et al., 2008). La mutante nhr1 tiene un crecimiento
retardado y su ciclo de vida se ve prolongado (Quiroz-Figueroa et al., 2010). Este
fenotipo, viene acompañado con la tolerancia a estrés por sequía, sin embargo, la
mutación también causa una sensibilidad a estrés salino (NaCl). Se estima que la
tolerancia a sequía podría deberse a la regulación positiva del cierre de estomas
ocasionado por los altos niveles de ABA, ya que la mutante nhr1 retiene mayor agua
en comparación de plantas silvestres. Debido a que algunas características como la
tolerancia a sequía, y mayor longevidad en la mutante nhr1 podrían ser utilizadas en
el mejoramiento genético de plantas con valor comercial, es importante determinar
cuál es el gen y el sitio donde se localiza la mutación. Para conocer esto, en el
presente trabajo se estudió el comportamiento de 11 mutantes pérdida de función por
inserción de T-DNA en los genes pertenecientes a la región caliente nhr1, con la
finalidad de detectar características contrarias u opuestas al fenotipo observado en la
mutante nhr1. De acuerdo a lo que se conoce sobre la mutante nhr1 ganancia de
3
función, se esperaría que una mutante pérdida de función por T-DNA en el locus
NHR1 presentara un comportamiento opuesto, es decir, tiempo de germinación,
establecimiento de plántulas y tiempo de emisión de escapo prematuro, así como
una tolerancia a salinidad, excesiva pérdida de agua y menor sensibilidad a ABA
exógeno. Para comprobar lo predicho, se ha evaluado el comportamiento de las
mutantes de T-DNA durante su ciclo de vida, en donde los procesos fisiológicos
analizados fueron, germinación, establecimiento y tiempo de emisión de escapo en
condiciones normales de crecimiento, germinación y establecimiento bajo
condiciones de salinidad, ABA y un ensayo de pérdida de peso por transpiración.
Con base a los resultados de los análisis fisiológicos se han seleccionado genes
candidatos para albergar la mutación nhr1 de acuerdo a los fenotipos observados.
Estos genes se secuenciaron para saber si alguno albergaba alguna mutación. Los
resultados obtenidos muestran que la mutante ank presenta una menor pérdida de
peso por transpiración, y su germinación y establecimiento se ven afectados cuando
plántulas son evaluadas en presencia de ABA exógeno. Sin embargo, este gen no
está modificado en la mutante nhr1 por lo tanto no es el causante del fenotipo nhr1.
En segundo lugar, la mutante a-ox presenta germinación y establecimiento retardado
en condiciones normales, sin embargo, el alineamiento y análisis de su secuencia en
la mutante nhr1 no muestra algún cambio, por lo que este gen ha sido descartado
como candidato para albergar la mutación nhr1, esto sugiere que el fenotipo
observado es un comportamiento independiente al locus NHR1. Por otro lado, la
mutante l7tr que codifica para un receptor transmembranal de siete dominicos,
presenta un fenotipo de germinación y establecimiento retardado, esto al ser
evaluada bajo condiciones normales de crecimiento y desarrollo, este fenotipo es
similar al de la mutante nhr1. Además, este efecto se ve potenciado durante la
germinación cuando plántulas son sometidas a la presencia de ABA exógeno.
Adicionalmente, el análisis de su secuencia en la mutante nhr1, muestra que el gen
L7TR tiene dos mutaciones en la región promotora, la primera mutación en dirección
5’ 3’, es un cambio de base de una guanina (G) por una adenina (A) [transición], y
la segunda mutación es una deleción de una adenina. Posiblemente alguno de estos
cambios es o son los responsables del fenotipo en la mutante nhr1. Un posible
4
mecanismo está en discusión. Adicionalmente, la expresión del gen L7TR está
regulada de forma negativa en la mutante nhr1.
2- ANTECEDENTES
2.1. Estrés abiótico
El estrés abiótico es uno de los principales factores que afectan el crecimiento y la
productividad agrícola a nivel mundial (Gao et al., 2007). Éste se ha definido como
cualquier impacto negativo causado por factores no vivos hacia un organismo vivo en
un ambiente específico. Cualquier cambio en el medio circundante puede alterar la
homeostasis, esta alteración tanto a nivel celular como a nivel molecular se puede
definir como estrés biológico (Hopkins y Hiiner 2009). Las plantas como organismos
sésiles, han desarrollado una flexibilidad para responder a diversos tipos de estrés,
que les permitan enfrentar o evitar al medio ambiente y sus efectos negativos
durante su crecimiento y desarrollo o en su estado de latencia, algunos ejemplos de
estos mecanismos son la dormancia, la regulación de la apertura y cierre de estomas
para evitar la salida excesiva de agua, la inhibición en el crecimiento de raíces
laterales e inhibición de órganos reproductores (Boyko y Kobalchuk, 2011). A nivel
bioquímico, se sabe que diferentes tipos de estrés pueden activar las mismas rutas
de señalización, estos factores están siempre interrelacionados (Chinnusamy et al.,
2004), sin embargo, algunos actúan de forma específica. Tales condiciones de
manera individual o en combinación inducen el daño celular (Boyer et al., 1982;
Bohnert et al., 1995; Barkla et al., 2007). Entre los tipos de estrés abiótico destacan
la sequía, salinidad y bajas temperaturas debido a que son uno de los principales
problemas durante la producción en los cultivos comerciales, ya que estos factores
adversos limitan que las plantas puedan desarrollar al máximo el potencial genético.
2.2. Estrés por sequía
Es uno de los tipos de estrés abiótico más común (Boyer, 1982). La respuesta de las
plantas a esta condición depende de la severidad y su duración (Chaves et al.,
5
2003). Esta limita el crecimiento debido al decline fotosintético, limitaciones por
estrés osmótico y la interferencia de la disponibilidad de los nutrientes en suelos
secos (Chinnusamy et al., 2004). El estrés osmótico causado por la sequía depende
en minimizar la pérdida de agua por estomas y por la cutícula y maximizar la
absorción a través del crecimiento de la raíz. Las plantas vasculares poseen
características morfológicas tales como los tejidos conductores (xilema y floema),
cutícula y estomas, que les permite retener agua. Mientras que a nivel semilla,
algunas especies de plantas presentan embriones dormantes altamente tolerantes a
desecación, sin embargo, estos pierden la tolerancia durante la germinación, es por
esto que la mortalidad de plántulas por desecación es un problema común en áreas
propensas a sequías o cuando las temperaturas del suelo son excesivas (Jhonson y
Asay 1998). Algunos mecanismos utilizados por las plantas para evitar la desecación
son la regulación de la apertura y cierre de estomas, senescencia parcial de tejidos,
reducción en el crecimiento de las hojas, el desarrollo de órganos de
almacenamiento de agua y el incremento en el sistema radicular (Scott, 2000;
Bernacchia y Furini 2004). A nivel molecular, se sabe, existen una gran cantidad de
genes que responden bajo estas condiciones (Umezawa et al., 2006). Un ejemplo de
estos productos génicos son las proteínas LEA (Late Embryogenesis Abundant),
estas actúan como protectores de estructuras citoplasmáticas durante la
deshidratación y se acumulan en embriones maduros durante el comienzo de la
desecación (Galau et al., 1986). Otro mecanismo es el incremento en la
concentración de azúcares, estos son comúnmente encontrados en altas cantidades
en semillas durante la desecación (Leprince et al., 1993) así como en tejidos
vegetativos (Bianchi et al., 1991), en donde funcionan como un regulador osmótico
durante la pérdida de agua (Williams y Leopold, 1989), un ejemplo de estos es la
sacarosa, que tiene la función de preservar la integridad de la bicapa lipídica durante
la deshidratación (Hoekstra et al., 1997). Por otro lado, es bien sabido que el
contenido de ABA en los periodos de estrés hídrico y durante la desecación de
semillas se incrementa considerablemente, esto induce y también reprime la
expresión de genes en respuesta a estrés como un mecanismo de adaptación.
6
Existen reportes de mutantes con deficiencia de ABA en A. thaliana que presentan
sensibilidad a desecación y carecen de dormancia en semillas (Ooms et al., 1993).
2.3. Estrés salino (NaCl)
La salinidad causa daños severos en el desarrollo y crecimiento de las plantas, las
altas concentraciones en el suelo puede resultar en tres tipos de estrés, estos son
iónico, oxidativo y osmótico (Zhu, 2002). El estrés iónico genera un desbalance en la
homeostasis de iones, en el caso de estrés salino por NaCl, el Na+ compite con K+
resultando en una deficiencia de K+ en el citosol. El estrés osmótico causado por las
altas concentraciones de solutos en el medio acuoso genera una deficiencia en la
absorción de agua. En respuesta, las plantas sintetizan solutos como la prolina para
equilibrar el potencial osmótico dentro de la célula. Otro mecanismo de respuesta es
la acumulación pasajera de Ca2+ en el citosol y la consecuente activación de
proteínas de respuesta a Ca+ (Knight et al., 1997). Recientemente se identificó la ruta
SOS (Salt-Overly-Sensitive) en A. thaliana. Los componentes principales de la ruta
son: SOS1, SOS2 y SOS3. Este último es una proteína de unión al Ca2+ la cual
detecta los niveles de Ca2+ en el citosol (Liu y Zhu, 1998). Una mutante pérdida de
función conocida como sos3-1 presenta hipersensibilidad salina (Ishitani et al., 2000)
al igual que la mutante sos2. En presencia de Ca2+ SOS3 activa a SOS2 una
proteína cinasa (Halfter et al., 2000). SOS2 presenta un motivo regulatorio conocido
como FISL, el cual sirve para interaccionar con SOS3 (Guo et al., 2001). El blanco de
la ruta SOS3-SOS2 es SOS1. De igual forma la mutante sos1 presenta
hipersensibilidad salina, SOS1 es una proteína intercambiadora Na+/H+, localizada en
la membrana plasmática (Shi et al., 2000). Así pues, SOS1 como blanco en la ruta
regulatoria por SOS3-SOS2 es directamente fosforilada y su actividad
intercambiadora se ve modificada (Quintero et al., 2002). La reconstrucción de la ruta
SOS demuestra que la señal de Ca2+, que se genera durante el estrés salino, es
traducida por SOS3-SOS2 y SOS1, en donde esta última probablemente funciona en
la recuperación Na+ del xilema previniendo de esta forma la acumulación de NA+ en
el tallo (Shi et al., 2002a, 2003b).
7
Por último, el estrés oxidativo causado por la salinidad genera especies reactivas de
oxigeno (ROS). Algunos antioxidantes como la enzima superóxido dismutasa (SOD),
ascorbato peroxidasa (APX) o las catalasas, se involucran en la detoxificación de
ROS para evitar el daño celular durante el estrés salino (Sekmen y Takio 2007). La
muerte celular programada (PCD) es considerado un mecanismo de adaptación de
las plantas durante el estrés oxidativo causado por salinidad (Huh et al., 2002;
Affenzeller et al., 2009).
2.4. ABA
Algunos fitoreguladores también juegan un papel clave en las plantas y la habilidad
de éstas para adaptarse a los cambios constantes del ambiente. ABA es un
fitoregulador sesquiterpénico que controla la dormancia, la germinación y la
respuesta adaptativa a diferentes tipos de estreses ambientales (Zeevaart y
Creelman, 1988). Este fitoregulador debe su nombre a la función atribuida durante su
descubrimiento, esta función fue la de abscisión. También juega un papel importante
en la señalización ante estímulos ambientales, principalmente de tipo abiótico. ABA
es sintetizado en las yemas terminales de las hojas, así como en la raíz en respuesta
al decremento en el potencial hídrico. También, inhibe la germinación en semillas.
Mutantes con deficiencia de ABA presentan una dormancia reducida (McCarty, 1995)
así como la sobre expresión de algunos genes de respuesta a ABA resultan en una
germinación retardada. El incremento de ABA en el embrión se da durante el
desarrollo y maduración de las semillas, y en la planta, bajo condiciones de estrés
hídrico. En contraste, los niveles de ABA decaen durante la germinación o en
presencia de giberelinas, así también cuando una planta se ha recuperado de algún
tipo de estrés. Durante el estrés abiótico, ABA regula la apertura y cierre de estomas
y la inhibición del crecimiento de raíces laterales (Seo et al., 2009). Una de sus
principales funciones es regular el balance de agua y la tolerancia a estrés osmótico
(Zhu et al., 2002). La acumulación de ABA se da por dos mecanismos, ya sea por la
activación de su biosíntesis o la inhibición de su degradación. Hasta la fecha se han
descrito los genes involucrados en la biosíntesis y degradación de ABA (Nambara y
8
Marion, 2005). Diversos genes que se sobre-expresan bajo condiciones de sequía,
salinidad o frío, son inducidos por ABA (Zhu et al., 2002). Además, recientemente
otro tipo de fitoreguladores como las citocininas, auxinas y brasinosteroides han
tomado importancia en el tema, incluso, varias de éstas se encuentran involucradas
en múltiples procesos, compartiendo rutas de señalización resultando en un sistema
sinérgico o de interacción antagónica, todas estas interacciones juegan un papel
crucial en las plantas bajo condiciones de estrés abiótico (Seo et al., 2009; Peleg y
Blumwald, 2011).
2.5. Arabidopsis thaliana
A. thaliana es una planta modelo considerada una herramienta potente para el
estudio de fisiología y genética en plantas, pertenece a la familia de las brasicáceas,
a la cual pertenecen la mostaza y algunas especies cultivables como el repollo y
rábano (Koornneef y Scheres, 2001). Esta planta, aunque no posee valor económico,
presenta ventajas muy importantes para la investigación básica como:
a. Genoma diploide pequeño (125 Mb), distribuido en sólo cinco cromosomas, el cual
fue secuenciado en su totalidad en el año 2000 (The Arabidopsis Genome Iniative,
2000).
b. Mapa genético de sus cinco cromosomas (Koornneef y Scheres, 2001).
c. Ciclo de vida “corto”: alrededor de seis semanas entre la germinación y la
aparición de semillas maduras.
d. Fácil y abundante (miles) producción de semillas y fácil cultivo en condiciones de
laboratorio.
e. Autopolinizable.
f. Transformación eficiente con Agrobacterium tumefaciens por inmersión floral
(Clough y Bente, 1998).
9
g. Miles de líneas mutantes disponibles -The Arabidopsis Information Resource-
(TAIR, www.arabidopsis.org).
h. Información obtenida que puede ser extrapolable a otras plantas de interés (Neson
et al., 2007).
Un ejemplo claro de este tipo es reportado en 2007 por Nelson et al. en donde
inicialmente se identificó un factor transcripcional de la familia de los factores
nucleares Y (NF-Y) conocido como AtNF-YB1 el cual confiere un mayor desempeño
a plántulas de A. thaliana bajo condiciones de estrés por sequía. La búsqueda y
sobre-expresión de su gen ortólogo ZmNFYB2 en maíz (Zea mayz) resultó en un
incremento en la tolerancia a estrés hídrico. Estas adaptaciones a las condiciones de
estrés contribuyen de forma importante en la producción y rendimiento en ambientes
limitantes de agua. Es por eso que la aplicación de esta tecnología tiene el potencial
para impactar de manera significativa en los sistemas de producción de cultivos
comerciales que enfrentan sequías.
2.6. Genética en reversa por mutantes T-DNA pérdida de función
Como se mencionó anteriormente una de las principales características que hacen
de A. thaliana un organismo modelo se debe a su eficiente transformación genética
con A. tumefaciens, lo que permite evaluar la función de los genes de interés. A.
tumefaciens es una bacteria patógena, causante de la enfermedad conocida como
agalla de la corona, un tumor o callo que se forma en plantas dicotiledóneas y
algunas monocotiledóneas. La capacidad de inducción del tumor por parte de la
bacteria, se debe a la presencia de un plásmido denominado Ti -tumor inducción-
(Chilton et al., 1980; Okker et al., 1984), el cual induce la formación de un tumor
(crecimiento celular continuo desorganizado) mediante la transferencia de una parte
del plásmido de cadena simple denomina ADN de transferencia (T-DNA). Para que
se produzca la inducción en la formación del tumor, primero la bacteria detecta
señales químicas por parte de la planta como cuando sufre de una herida. Después
del daño la planta secreta compuestos (acetosiringonas), estos sirven como señales
que son reconocidas por A. tumefaciens. Una vez que la bacteria infecta la planta
estos mismos compuestos químicos activan un grupo de genes localizados en el
10
plásmido de la bacteria llamados genes Vir (de virulencia) e inducen el proceso de
formación del tumor. Durante la infección el T-DNA es trasferido a la célula de la
planta hospedadora a través de una serie de procesos en donde al final el fragmento
de T-DNA se integra de manera azarosa al genoma nuclear de la planta, una vez ahí
este controla la expresión de algunos genes de la célula encargados de sintetizar
compuestos específicos como, auxinas, citocininas, que promueven la división
celular y formación del callo, y opinas, que la bacteria utilizará como fuente de
alimento (McCullen y Binns., 2006). Debido a la capacidad de A. tumefaciens para
transformar las células en las que se hospeda, ha sido ampliamente utilizada en el
campo de la biología, genómica funcional y biotecnología de plantas (Tax y Vernon,
2001). Este mecanismo ha sido empleado para causar un “knockout” de genes
específicos o generar mutantes con pérdida de función de un gen, en donde el T-
DNA que es transferido contiene una secuencia “en blanco” (secuencia de
nucleótidos que no codifica para algún producto génico), el cual solo tiene la función
de causar el truncamiento del gen en donde se inserta en la célula hospedante. A la
aplicación de esta tecnología se le conoce como genética en reversa por T-DNA (Tax
y Vernon, 2001). La mayoría de las mutaciones por T-DNA ocasionan pérdida de
función en el gen en que se inserta, también llamadas mutaciones nulas, estas han
sido de gran importancia debido a que permiten monitorear el desarrollo del
organismo y detectar el efecto directo ocasionado por la pérdida de función de algún
gen de interés (Krysan et al., 1999). Actualmente existen bancos de poblaciones de
líneas T-DNA disponibles en diversos centros de investigación, como por ejemplo en
The Arabidopsis Information Resource (TAIR)
[http://www.arabidopsis.org/servlets/Search?action=new_search&type=germplasm,
en www.arabidopsis.org, Nov, 2013], el cual cuenta con un banco de semillas T-DNA
en A. thaliana, o el NASC (NASC European Arabidopsis Stock Centre). Reportes con
mutantes pérdida de función muestran fenotipos antagonistas a los que sobre-
expresan el mismo gen, un ejemplo claro es la mutante myb96-1 la cual cuenta con
una inserción y truncado del gen MYB96 (At5g62470) por T-DNA, esta mutante es
más susceptible a sequía y deshidratación, en comparación de plantas silvestres. De
manera opuesta, la sobre expresión de este gen, causa tolerancia a sequía en la
11
mutante myb96-ox (Seo et al., 2009). Otro ejemplo reportado por Sakamoto et al.,
(2008) para ANKIRINA, una proteína transmembranal involucrada en procesos de
señalización celular codificada por el gen ITN1 (At3g12360), indicó que la pérdida de
función y silenciamiento en la mutante itn1 causa un incremento en la tolerancia
salinidad. Además plantas silvestres sometidas a estrés por salinidad resultan en un
incremento en la expresión del gen ITN1. Lo anterior pone en evidencia la factibilidad
para detectar funciones génicas mediante el análisis fenotípico con mutantes pérdida
de función, por lo que esta técnica es una herramienta valiosa y factible para la
búsqueda de genes mutados a través del análisis directo de fenotipos inverso.
2.7. La mutante nhr1
Eapen et al., (2003) desarrollaron un sistema que les permitió aislar una mutante con
una aberración en la respuesta de la raíz a gradientes de potencial hídrico
(hidrotropismo), conocida como mutante sin respuesta hidrotrópica 1 (nhr1), la cual
tiene la capacidad de desarrollar el sistema radical en un medio de cultivo con baja
disponibilidad de agua.
Características de la mutante (Quiroz-Figueroa et al., 2010) merecen ser resaltadas,
primero que la mutación afecta el crecimiento y desarrollo de forma pleiotrópica, y
también presenta mayor tolerancia a la deshidratación y sequía (Salazar, 2008).
Varios grupos de investigación han reportado que la expresión de genes regulados
por estrés, ya sea por la sobre-expresión de genes blanco o por la de factores
transcripcionales relacionados con las rutas de señalización durante el estrés
abiótico, dependiente e independiente de ABA, resulta en un incremento en la
tolerancia a sequía y otros tipos de estrés, sin embargo la sobre-expresión de estos
genes está asociada con un retraso en el crecimiento de la planta (Kasuga et al.,
1999; Seo et al.,2009).
La mutación nhr1 fue producida con un agente químico: el etil metano sulfonato
(EMS), que ocasiona casi exclusivamente un cambio puntual de base (Eapen et al.,
2003). Resultados obtenidos señalan que la mutación en el gene nhr1 es una
ganancia de función (Campos et al., Datos sin publicar) siendo el equivalente a una
12
sobre-expresión, esto se concluyó porque el fenotipo de raíz larga se mantuvo en
segregantes de la cruza entre la mutante nhr1 con líneas tetraploides (líneas con
cuatro alelos, 4n). El fenotipo con lento crecimiento y de aparente tolerancia a
sequía, se acompaña también de una transición de la fase vegetativa a la
reproductiva (emisión del escapo) retardada y por lo tanto un ciclo de vida más largo
(Quiroz-Figueroa et al., 2010). Se sabe que el control de la emisión del escapo y por
consecuencia de la floración, está inhibido por la actividad represora de FLC (Razem
et al., 2006; Schroeder et al., 2006). Para que se promueva la emisión del escapo es
necesario que se forme un complejo proteico conocido como factor regulador “ARN 3′
End-Processing-binding-ARN binding protein” (FY-FCA) el cual reprime la actividad
inhibitoria de FLC. Se ha observado la correlación entre los altos niveles de ABA y el
efecto inhibitorio de la emisión del escapo; sin embargo, se descartó que FY o FCA,
sean receptores de la fitohormona (Risk et al., 2008; 2009), se desconoce el
mecanismo de inhibición que involucra a ABA. Análisis in silico de la región
promotora del gen FLC, presentó elementos de respuesta a ABA conocidos como
ABRE (ABA-Responsive Element), por lo que probablemente algún factor
transcripcional activado en presencia de ABA, está promoviendo la expresión de FLC
bajo condiciones de estrés en donde hay niveles altos de ABA (Quiroz-Figueroa et
al., Datos sin publicar). Un efecto contrario es observado en la mutante de biosíntesis
de ABA; aba1, la cual no sintetiza ABA, la mutante aba1 presentó una floración
prematura (Razem et al., 2006). En la mutante nhr1 se observó un retraso en la
emisión del escapo en comparación con plantas silvestres, este comportamiento es
potenciado cuando las hojas de roseta son asperjadas con ABA (Quiroz-Figueroa et
al., 2010), el efecto inhibitorio también es observado en ensayos de emisión del
escapo in vitro (Acosta-Rodríguez y Quiroz-Figueroa et al., Datos sin publicar). La
mutante nhr1 presentó un mayor contenido de ABA en comparación con las plantas
silvestres (Quiroz-Figueroa et al., 2010) lo que podría estar ocasionando el
alargamiento del ciclo de vida.
Estudios de análisis de la expresión génica por medio de la técnica de Transcripción
Reversa por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR del inglés Reverse
transcription polymerase chain reaction) indican una mayor expresión del ARNm del
13
gen 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase-3 (NCED3) en la mutante nhr1 en
comparación con la silvestre bajo condiciones de estrés hídrico. Por el contrario, bajo
condiciones normales de crecimiento las plantas silvestres presentaron mayor nivel
de expresión (Quiroz-Figueroa et al., 2010). Sin embargo, los niveles endógenos de
ABA en la mutante fueron superiores al 70 %, en comparación con las plantas
silvestres. Lo anterior se podría explicar si un homólogo de NCED3 es activado en la
mutante nhr1 bajo condiciones de crecimiento normal ocasionando un incremento en
la biosíntesis de ABA, o hay una inhibición en la degradación de ABA o debido a las
altas concentraciones de ABA en la mutante hay una inhibición en la expresión de
NCED3 (retroalimentación). Hay que resaltar que la mutante nhr1 fue aislada a partir
de un medio con baja disponibilidad de agua (estrés hídrico). Todas estas
observaciones sugieren que el gen NHR1 en las plantas, está regulando el
crecimiento, desarrollo y la tolerancia a sequía, probablemente por la regulación
positiva en la biosíntesis de ABA o inhibiendo su degradación. Un análisis in silico de
la región promotora de los genes localizados en el locus NHR1 muestra la existencia
de más de un gen que presenta elementos con acción en cis en respuesta a ABA y
estrés abiótico, es posible que alguno de estos genes pudiera estar directa y/o
indirectamente relacionado con la mutación que ocasiona el fenotipo nhr1 (Quiroz-
Chávez, Datos sin publicar).
Asumiendo que aquellas plantas que toleran algún tipo de estrés abiótico, como por
ejemplo, la sequía, también presentarían tolerancia a algún otro tipo de estrés como
el salino o el causado por frío. Se hipotetizó que la mutante nhr1 tolerante a sequía y
deshidratación, fuera también más resistente a la salinidad. Sin embargo, resultados
obtenidos mostraron comportamientos totalmente opuestos a los esperados, ya que
la mutante nhr1 resultó tener una HS (Quiroz-Chávez, 2011). Estos resultados
sugieren que posiblemente la mutante nhr1 alberga dos tipos de mutaciones, en
donde una mutación es la responsable de la tolerancia a sequía y alguna otra
pudiera ser la causa de la HS (Quiroz-Chávez y Quiroz-Figueroa., Datos sin
publicar), sin embargo ambas mutaciones podrían estar ligadas.
14
2.8- Descripción del locus NHR1
La mutación nhr1 se localiza en el cromosoma tres en el brazo inferior,
aproximadamente a 3 millones de pares de bases, la región caliente cuenta con un
tamaño aproximado de 38.9 kb (Campos et al., datos sin publicar). Dentro del locus
NHR1 se localizan 15 genes (Figura 2), los cuales codifican para diferentes
productos génicos con funciones particulares.
Figura 1. Región del locus NHR1. La barra superior representa el cromosoma 3, con un tamaño de
23 millones de pares de bases (23M), el triángulo en negro indica la región donde se localiza el locus
NHR1 o región caliente a tres millones de pares de bases (3M). La barra intermedia es una
amplificación del locus NHR1 con una longitud aproximada de 38.9kb. Las flechas representan a los
genes localizados en la región y la dirección en que se transcriben. Las flechas rellenas en blanco
representan los genes de los cuales no se dispone línea T-DNA. La flecha con rayas indica el gen con
línea T-DNA heterocigota con mutación letal (ppr) para el homocigoto y las flechas rellenas en gris
representan a los genes con líneas de T-DNA homocigotas.
A continuación se dará una breve descripción de cada uno de los productos génicos
de los genes pertenecientes a la región caliente nhr1. La descripción se dará en el
orden en que se localizan en el locus NHR1 en dirección 5’ 3’.
CROMOSOMA 3
5’ 3’
0M 23M
LOCUS NHR1(3M)
PL
ANK
LIP L7TR
AO
PRP
MYB
HELICASA r60s
APX2
MCM
PWWPPPR
tRNA’s
38.9kb
15
PECTATO LIASA (PL) [At3g09540]: EC 4.2.2.2., cataliza el corte de la pectina
desesterificada, uno de los componentes principales de la pared celular de plantas
(Carpita y Gibeaut, 1993). El corte es dependiente de Ca+ y genera
oligonucleótidosacáridos con residuos insaturados de galacturonosil en su terminal
no reductor. La acción de PL de patógenos estimula el sistema de defensa de las
plantas, estas liberan oligogalacturónidos que funcionan como inductores en un
mecanismo de defensa (De Lorenzo et al., 2001). En A. thaliana se localizan 27
genes PL, algunos se han reportado en polen (Wing et al., 1989), semillas, flores y
frutos (Marín et al., 2002). A la fecha no se encontraron reportes de la participación
de PL en respuesta a estrés abiótico.
ANKIRINA (ANK) [At3g09550]: Las proteínas con dominios ANK son muy comunes,
se involucran en la interacción proteína-proteína (Sedgwick y Semerdon, 1999), este
dominio se compone de 24 repeticiones de 33 aminoácidos. Una de sus funciones
es mantener la integridad, anclar canales intercambiadores y transportadores de
iones a la membrana plasmática (Lux et al., 1990). En metazoarios, estas proteínas
contienen cuatro dominios funcionales: 1) 24 repeticiones de ANK en tándem en la
región N-terminal de unión a la membrana, 2) un dominio de unión a la espectrina, 3)
un domino DEATH y 4) un dominio regulatorio en la región C-terminal (Bennett y
Baines, 2001). En A. thaliana se han reportado 37 genes ANK (Becerra et al., 2004).
Existen evidencias de la participación de este tipo de proteínas en respuesta a estrés
abiótico y ABA (AbuQamar et al., 2006; Sakamoto et al., 2008).
LIPINA (LIP) [At3g09560]: También conocida como fosfatidato fosfohidrolasa (PAH1)
EC 3.1.3.4: cataliza la defosforilación de 1,2-diacilglicerol-3-fosfato dependiente de
Mg2+. Se reporta como de respuesta celular a la carencia de fosfato. Participa en la
ruta de biosíntesis de galactolípidos y remodelación de la membrana lípidica
(Nakamura et al., 2009)). La mutación en dos genes (PAH1 y PAH2) que codifican
para la enzima fosfatasa ácido fosfatídico (PAP) inhibe la biosíntesis de fosfolípidos
del retículo endoplasmático en A. thaliana (Eastmond et al., 2011). La enzima PAP,
cataliza la conversión de ácido fosfatídico (PA) a diacilglicerol y juega un papel
crucial en el metabolismo de lípidos suministrando sustratos para mantener la
16
estructura de la membrana y almacenamiento de lípidos (Carman y Han, 2009). En
plantas, la biosíntesis de ácidos grasos ocurre en cloroplastos y retículo
endoplásmico en donde PAP es requerida (Nakamura et al., 2009). Hasta la fecha,
no se ha reportado la participación de esta enzima en procesos de estrés abiótico.
Lung seven transmembranal receptor (L7TR) [At3g09570]: Su nombre deriva de la
similitud de su secuencia con la proteína reportada en humanos (Homo sapiens). En
plantas, se localiza en el sistema endomembranoso (Dimmer et al., 2012). Posee
siete regiones que atraviesan la membrana celular, conocidas como hélices
transmembranales. Su principal función es la de receptor y transductor de señales
localizada en la superficie celular. Muchas de estas proteínas han sido
caracterizadas como receptores GPCR (G-proteín-couple-receptors) debido a que
transducen las señales extracelulares en procesos de respuesta celular a través de
proteínas G (Pierce et al., 2002). Los reportes respecto a la función de genes
homólogos a L7TR en plantas es muy escasa, recientemente en 2009 se reportó la
presencia de dos FDT (Fragmentos Derivados de Transcritos) conocidos como
HaDR6 y HaDR7 en Haloxylon ammodendron los cuales son regulados de forma
negativa en su expresión cuando las plantas son sometidas a estrés por sequía (Shi
et al., 2009).
AMINO OXIDASA (A-OX) [At3g09580]: Existen dos tipos de A-OX, las diamino
oxidasas que contienen cobre (CuAO; EC 1.4.3.6), estas catalizan la oxidación de la
putrescina (Put) y cadaverina (Cad) en el primer grupo amino (Cona et al., 2006) y
las poliamino oxidasas que contienen FAD (PAO; EC 1.5.3.3), que catalizan la
oxidación de la espermina (Spm) y la espermidina (Spd) en el segundo grupo amino
(Cona et al., 2006). La función fisiológica de AO se debe a los subproductos de las
reacciones que catalizan. En este caso, ambos tipos de enzimas generan peróxido
de hidrogeno (H2O2) como sub productos, y se conoce que el H2O2 y la activación de
los canales de Ca2+ en la membrana plasmática, son mecanismos importantes en la
inducción del cierre de estomas regulados por ABA en plantas, (An et al., 2008; Pei
et al., 2012) posiblemente la función de este tipo de enzimas se debe a este
metabolito secundario. El ABA en las plantas, sirve como señal clave en los procesos
17
de respuesta al estrés, como sequía, salinidad y frío (Grill y Chistmann, 2007). Sin
embargo, no se encontró un reporte directo de la participación de este gen en
respuesta al estrés hídrico.
ARNt-ser (anticodón; CGA, At3g09585): Es una molécula que funciona como
adaptador y acarreador de aminoácidos hacia los ribosomas, direccionados por una
secuencia de tres nucleótidos (anticodón) en el ARN mensajero (Crick, 1968). Este
tipo de moléculas, tienen por lo general una longitud aproximada de 73 a 94
nucleótidos. Sirven como enlace entre las secuencias de nucleótidos de ARN y los
aminoácidos que forman las proteínas. Se involucran en procesos de elongación en
la traducción. Aebi et al., (1990) reportaron una mutante en levadura
(Saccharomyces cerevisiae) afectada específicamente en la biosíntesis del ARNt,
esta mutante presentó un fenotipo de sensibilidad a temperatura elevadas. No
existen reportes de la posible participación de ARNt’s en los procesos de estrés
hídrico en plantas.
PROTEÍNA RELACIONADA A PATOGÉNESIS 1 (PRP-1) [At3g09590]: La
producción de PRP es inducida por el ataque de patógenos (Loon, 1985). Este
mecanismo forma parte de la resistencia sistemática adquirida (SAR). Se ha
reportado que el ácido salicílico (SA) induce la producción de PRP en plantas (Van et
al., 1986), así como también el etileno (ET) [ Jin y Kook, 2000]. La actividad de PRP
se debe principalmente a factores bióticos o heridas, sin embargo, se ha sugerido
que genes inducidos por estrés biótico o abiótico comparten las mismas rutas de
señalización (Liu y Ekramoddoullah, 2006), por lo que probablemente algún
componente clave en estas rutas, podría estar participando en respuesta ante ambos
tipos de estrés. Sin embargo, la evidencia aún no es clara.
ARNt-ser (anticodón; TGA, At3g09595): Involucrado en procesos de elongación en
la traducción (Crick, 1968).
Myeloblastosis (MYB) [At3g09600]: Tiene actividad de factor transcripcional. El
dominio MYB es altamente conservado el cual consta de cuatro secuencias
imperfectas repetidas de 52 aminoácidos (R), cada una formando tres α-hélices. La
18
segunda y tercera hélice de cada repetición forma un dominio hélice-vuelta-hélice
(HTH, hélix-turn-helix), espaciados por tres triptófanos y formando un núcleo
hidrofóbico (Ogata et al., 1996). La tercer hélice de cada repetición, es llamada
“hélice de reconocimiento”, la cual interactúa directamente con el ADN (Jia et al.,
2004). En plantas, la familia MYB R2R3 es la más extensa con más de 100
miembros en A. thaliana (Jin y Martin, 1999). Los miembros de esta familia presentan
una estructura modular, con un dominio MYB (de unión al ADN) en su extremo N-
terminal, y un dominio activador o represor localizado en la región C-terminal, el resto
de las regiones son altamente variables. Este tipo de FT se han visto involucrados
ampliamente en la respuesta a estrés hídrico, como, sequía y salinidad, así como
ante la presencia de ABA (Jung et al., 2008; Seo et al., 2009).
HELICASA (HLC) [At3g09620]: Cataliza el desenrollamiento del ADN y ARN
dependientes de ATP (de la Cruz et al., 1999), comparte una región central
altamente conservada de 400 amino ácidos llamada DEAD-box (Schmid y Linder,
1992), en esta región se encuentran los motivos: A/GXXGXGKT, DEAD (Asp-Glu-
Ala-Asp), SAT y HRIGRXXR, responsables de la unión al ATP, hidrólisis de ATP,
desenrollamiento de ADN o ARN y la unión a ADN o ARN, respectivamente (Tuteja
2003; Tuteja y Tuteja, 2004; Cordin et al., 2006; Jankowsky y Fairman, 2007). En A.
thaliana han sido reportadas más de 50 cajas DEAD (Gong et al., 2005), éstas se
han involucrado en respuesta a diversos tipos de estrés, como por ejemplo:
salinidad, calor y frio entre diferentes organismos (Yu y Owttrim, 2000; Westermarck
et al., 2002).
PROTEÍNA RIBOSOMAL 60S (r60S) [At3g09630]: pertenece a la familia de
proteínas ribosomales L4/L1, y es un constituyente estructural de los ribosomas, se
encuentra involucrada en procesos de metilación del ARN, modificación y
organización de la pared celular (Heyndrickx y Vandepoele, 2012)). Forma parte de
la subunidad 60S de los ribosomas, la gran mayoría interactúa con elementos de
ARN siempre con diferentes dominios, en algunos casos por contacto a través de
fuerzas de Van der Waals. Además, tambien, muchas de las proteínas ribosomales
tienen funciones fuera de los ribosomas (Salyal y Liljas, 2000; Maguire y
19
Zimmermann, 2001) como la traducción vía interacción con factores de elongación
(Szick et al., 1998). En levaduras las proteínas L4 se han visto que se unen al ARNr
(Yeh y Lee, 1998), estas proteínas contiene 246 amino ácidos en plantas (Maguire y
Zimmermann, 2001). Su respuesta a estrés abiótico no se ha evidenciado.
ASCORBATO PEROXIDASA 2 (APX2) [At3g09640]: Son encargadas de remover el
H2O2 de los cloroplastos y el citosol en plantas. En A. thaliana se han descrito ocho
tipos de APX: tres localizadas en el citosol (APX1, APX2 y APX6), dos en
cloroplastos (estroma -sAPX-, tilacoides -tAPX-) y tres microsomales (APX3, APX4 y
APX5) (Dimmer et al., 2012). La enzima APX utiliza ácido ascórbico (vitamina C)
como sustrato para catalizar la reacción de óxido/reducción del H2O2 para utilizarlo a
este como receptor de electrones, el cual es reducido a H2O y la enzima es oxidada
(Patterson y Poulos, 1995; Rossel et al., 2006). Se ha reportado la rápida respuesta
de genes APX en respuesta al estrés hídrico (Rossel et al., 2006).
PENTATRICOPÉPTIDO (PPR) [At3g09650]: Se involucra en el procesamiento de
transcritos de cloroplastos. Forman repeticiones en tándem de motivos degenerados
de 35 amino ácidos (Small y Peeters, 2000) y carecen de intrones en sus genes. En
A. thaliana son los responsables de la biogénesis de organelos (Lurin et al., 2004) y
procesos post-transcripcionales. Presentan secuencias específicas de unión al ARN
(Meierhoff et al., 2003; Delannoy et al., 2007; Kotera et al., 2005). Su estructura
consiste en motivos de hélice-vuelta-hélice (helix-turn-helix) similar a las repeticiones
de la familia tetratricopéptido (TPR) [Small y Peeters, 2000]. Aproximadamente 450
proteínas PPR han sido identificadas en A. thaliana (O’Toole et al., 2008). Sin
embargo, no hay evidencia hasta el momento de su participación en procesos de
estrés hídrico.
MINICROMOSOMA MAINTENANCE (MCM) [At3g09660]. Se involucra en la
reparación, iniciación y replicación del ADN dependiente de ATP, formando y
elongando la horquilla de la replicación (Lee y Hurwitz, 2001). Regulan la replicación
precisa del ADN, funcionando como factor facilitador. Es un componente del
complejo de pre-replicación (Cortez et al., 2004). Su estructura forma un hexámero
de seis polipéptidos en forma de anillo. Consiste en una estructura dodecámera
20
dividida en dos hexámeros, cada monómero contiene tres dominios: C- terminal, N-
terminal y el dominio central en donde se localizan los átomos de Zn formando la
parte central del doble hexámero, estos como enlaces en la interacción hexámero-
hexámero unidos por puentes de hidrógeno en un canal central cargado
positivamente por medio del cual penetra el ADN (Fletcher et al., 2003; Sánchez et
al., 2012). En plantas, fuera del proceso de replicación, también se han visto
involucradas en respuesta a estrés salino y por frío (Dang et al., 2011).
PWWP (At3g09670): Su nombre se debe al motivo conservado Pro-Trp-Trp-Pro, este
motivo es característico en proteínas de origen nuclear. Se estima que el dominio
PWWP se involucra en la interacción proteína-proteína (Stec et al., 2000). Algunas
proteínas con actividad de metil-transferasa poseen el dominio PWWP, el cual sirve
como mediador en la interacción con el ADN (Qiu et al., 2002).. En A. thaliana al
menos ocho proteínas cuentan con el dominio PWWP (Stec et al., 2000) algunas son
factores transcripcionales (Chen y Meyerowitz, 1999) involucradas en la metilación,
reparación y transcripción del ADN. Su función exacta no ha sido reportada y su
participación en respuesta a estrés hídrico no ha sido evidente.
21
3- JUSTIFICACIÓN
Datos importantes con la mutante nhr1 generan una serie de preguntas
fundamentales para el entendimiento de cómo la mutación nhr1 podría estar
involucrada en el efecto pleiotrópico. Se sabe que la mutante nhr1 es una ganancia
de función, y que éste impacta a diversos procesos fisiológicos, sin embargo se
desconoce cuál es el gen mutado que otorga el fenotipo nhr1. Además algunos
fenotipos como: la tolerancia a sequía, y un ciclo de vida mucho más largo, son de
importancia en los cultivos económicos, ya que podrían utilizarse en el mejoramiento
genético de plantas de interés económico, las plantas de oARNto, al tener cultivos
con flores en plantas longevas o algunos tipos de forrajes que requieran menor riego.
Por otra parte, la hipersensibilidad salina característica de la mutante nhr1, pudiera
utilizarse con una estrategia opuesta al de la mutación nhr1 como por ejemplo la
búsqueda y silenciamiento de genes ortólogos al gen NHR1, de acuerdo a nuestra
hipótesis, resultaría en plantas con una mayor tolerancia a salinidad, las que podrían
utilizarse como cultivos en zonas donde la salinidad del suelo y agua es el principal
limitante en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Además en el ámbito científico
ayudará para entender los mecanismos de acción que juega el gen NHR1 bajo
condiciones de estrés que involucran ABA y las redes de señalización de expresión
con otros genes de respuesta a estrés. Todas estas características de interés
resaltan la utilidad de identificar a la mutación responsable del fenotipo nhr1 en
algunos cultivos y en la investigación básica, sin embargo, como primer paso para la
utilización del gen NHR1 en cualquiera de sus posibles aplicaciones, es crucial
determinar cuál es el gen mutado y el sitio en donde se encuentra la mutación, ya
que solamente conociendo esto se puede avanzar en su investigación de forma más
precisa.
22
4- HIPÓTESIS
Considerando que la mutación nhr1 es una ganancia de función, con una sensibilidad
a ABA, menor deshidratación, hipersensibilidad salina y una longevidad mayor, se
esperaría que una mutante pérdida de función en el gen NHR1 presente un fenotipo
contrario.
Figura 2. Esquema representativo del comportamiento opuesto a la mutante nhr1 esperado en las
líneas de pérdida de función por T-DNA que correspondan al gen causante del fenotipo nhr1 bajo
condiciones de estés salino (NaCl).
T-D
NA
nh
r1
Pérdida de función
Ganancia de funciónSalinidad
Na+
23
5- OBJETIVO GENERAL
Determinar por análisis fenotípico en mutantes T-DNA, cuál es el gen mutado en la
“región caliente” de la nhr1.
5.1.- Objetivos particulares
1) Determinar la homocigosis y generar líneas homocigotas de las mutantes de
pérdida de función por T-DNA de los genes localizados en la región caliente
nhr1.
2) Determinar si los genes pertenecientes a la región caliente nhr1 carentes de
línea T-DNA están mutados en la mutante nhr1.
3) Conocer el ciclo de vida (germinación, establecimiento y emisión de escapo)
de las mutantes T-DNA en los genes pertenecientes a la región caliente nhr1.
4) Conocer la respuesta a estrés (salinidad, deshidratación y ABA) de las
mutantes T-DNA en los genes pertenecientes a la región caliente nhr1.
5) Proponer genes candidatos para albergar la mutación nhr1 y conocer si
algunos de estos está mutado en la mutante nhr1.
6) Determinar si la expresión del ARNm del gen candidato a albergar la mutación
nhr1 se encuentra reprimida en la mutante T-DNA perteneciente a la región
nhr1.
24
6- MATERIALES Y MÉTODOS
6.1.- Material vegetal
Se utilizaron semillas de A. thaliana ecotipo Columbia-0 (silvestre, col-0), línea
mutante nhr1, obtenida de la cruza entre la nhr1 y Col-0, líneas mutantes por T-DNA
(pectato liasa, ankirina, lipina, amino oxidasa, l7tr, r60s, myb-1, myb-3, apx2-p, apx2-
5, apx2-5h, ppr, mcm y pwwp), obtenidas del banco de germoplasma en TAIR o
NASC (Cuadro 1).
Cuadro 1. Listado de mutantes pérdida de función por inserción de T-DNA.
6.2.- Preparación del medio de cultivo para germinar y crecer A. thaliana in vitro
Se utilizó como medio de cultivo las sales de Murashige y Skoog (1962) (Cat. M5524-
10L; SigmaAldrich), adicionado con 0.5 % de sacarosa, pH 5.8 y como agente
pl At3g09540 PECTATO LIASA SALK_011123C 1er exón Homocigoto
ank At3g09550 ANKIRINA SALK_080164 Intrón Homocigoto
lip At3g09560 LIPINA SALK_042850 1er exón Homocigoto
l7tr At3g09570 L7TR SALK_085932C Promotor Homocigoto
a-ox At3g09580 AMINO OXIDASA SALK_058610 Único exón Homocigoto
At3g09585 tRNA-CGA N.D.
At3g09590 PRP N.D.
At3g09595 tRNA-TGA N.D.
myb-1 At3g09600 MYB SALK_016333 1er exón Homocigoto
myb-3 At3g09600 MYB SALK_053482 3er exón Homocigoto
At3g09620 HELICASA N.D.
r60s At3g09630 PROTEÍNA r60s SALK_130595C 1er exón Homocigoto
apx2-p At3g09640 APX2 SALK_057686 Promotor Homocigoto
apx2-5 At3g09640 APX2 SALK_067939 5to exón Homocigoto
apx2-5u At3g09640 APX2 SALK_018106C 5' UTR Homocigoto
ppr1 At3g09650 PENTATRICOPÉPTIDO SALK_010258 Único exón Heterocigoto
ppr2 At3g09650 PENTATRICOPÉPTIDO SALK_010264 Único exón Heterocigoto
mcm At3g09660 MCM SALK_102821 Promotor Homocigoto
pwwp At3g09670 PWWP SALK_027045C Promotor Homocigoto
No disponible = N.D.
Carga génicaNombre Locus Gen Salk Sitio de insercción
25
gelificante se utilizó PhytagelTM (Cat. P8169-500G; Sigma-Aldrich) al 0.5%. Como
medio estresante en condiciones salinas, se utilizó medio MS adicionado con cloruro
de sodio (100 mM de NaCl) [Cat. 7647-14-5, Faga Lab®], y medio estresante en
presencia de ABA, se utilizó medio MS adicionado con ABA exógeno (Cat. A1049-
250MG; Sigma-Aldrich®) a las dosis requeridas (50, 100, 250 y 400 nM de ABA).
Una vez elaborado el medio de cultivo, se esterilizó por calor húmedo en autoclave y
se vació en cajas Petri (60 x 100 mm) u otro recipiente a utilizar. El proceso se
realizó en campana de flujo laminar.
6.3.- Estratificación de semillas de A. thaliana
Las semillas se colocaron en tubos tipo Eppendorf de 1.5 mL estériles y se agregó
0.5 µL de detergente tritón X-100 (No. Cat. T8787; Sigma-Aldrich) al 100%, 0.5 mL
de hipoclorito de sodio (NaOCl) [Cloralex® al 1.25% (v/v)], se agitó en vórtex
(Scientific Industries, Vortex Genie 2) durante 4 min, se centrifugó 30 s y se descartó
el medio líquido por decantación, posteriormente se enjuagó con 1 mL de agua
destilada estéril repitiendo este paso durante cinco veces o hasta eliminar las
burbujas, el cual es un indicador que el tritón X-100 ha sido eliminado. Al final se
agregaron 100 µL de agar estéril al 0.1% (w/v) [Agar, Powder Micropropagation -
Type I; No. Cat. A038-2.5KG] y se almacenaron a 4°C en oscuridad durante tres
días. Posteriormente, se realizó la siembra de las semillas en medio de cultivo sólido
(en campana de flujo laminar) y colocadas en cámara de crecimiento (BINDER®,
KBWF) en placas horizontales donde permanecieron a 16 h luz y 8 h de obscuridad a
una temperatura de 24 + 2 °C.
6.4.- Preparación de sustrato para el crecimiento de A. thaliana en macetas
Inicialmente se germinaron las semillas en medio de cultivo MS in vitro, a los 14 días
después de la siembra (DS), las plántulas establecidas se trasplantaron a sustrato
(SUNSHINE®, Professional Growing mix) estéril en macetas cuadradas (6 cm lado
por lado) con un volumen se sustrato al máximo del tamaño de las macetas
26
enriquecido con una solución nutritiva Peters (Peters Professional 10+30+20+2MgO,
ScottosMR). Durante el trasplante, las plántulas fueron extraídas del medio de cultivo
in vitro y se sumergieron en una solución de Peters durante 30 s aproximadamente.
Finalmente las macetas fueron colocadas en charolas de plástico con cubierta
transparente, una semana después del trasplante se retiró la cubierta.
Permanecieron en invernadero a condiciones controladas de temperatura 24°C +
2°C.
6.5.- Obtención de líneas T-DNA homocigotas de los genes pertenecientes al locus
NHR1
Para el diseño de oligonucleótidos se utilizó la herramienta T-DNA Primer Design del
Laboratorio de Análisis Genómico del Instituto Salk (The Salk Institute Genomic
Analysis Laboratoy). En todos los casos el diseño se realizó con los parámetros
predeterminados únicamente adicionando el nombre correspondiente a la línea Salk.
Para la extracción de ADN se utilizó el método del CTAB (Murray y Thompson 1980)
al 3%. Se utilizó tejido proveniente de cada una de las plántulas T-DNA de la región
caliente nhr1 y Col-0 (control) de cuatro semanas de edad y crecidas en maceta, el
ADN extraído se cuantificó por absorbancia en espectrofotómetro (NanoDrop 2000,
Thermo Scientific) a 260 nm, la calidad del ADN se verificó por electroforesis en gel
de agarosa al 0.8% (p/v) con amortiguador TBE al 0.5X. Para los análisis de PCR,
primero se realizó la estandarización de tiempo y temperatura para el alineamiento
de oligonucleótidos correspondientes a cada gen. Las condiciones del PCR fueron:
94°C por 5 min, 94°C por 45 s, un rango de temperaturas de alineamientos de 50 a
60°C por 30 s, 72°C durante 1 min15 s para elongación y 72°C de elongación final
por 5 min, se realizaron 35 ciclos. En la visualización de ADNg y de productos de
PCR en gel de agarosa, se empleó la tinción durante 15 a 20 minutos por inmersión
en el reactivo Gelred™ (No. Cat. 41003, BIOTIUM,) a una concentración de 1X y se
observó por medio de luz UV utilizando un equipo de BioRad UV CCD. Se detectó
una planta de inserto T-DNA homocigota cuando únicamente hubo una amplificación
de un fragmento con el par de oligonucleótidos Lp y LBb1 (diseñado dentro del T-
27
DNA). Se conservó la progenie e estas plantas y se evaluó nuevamente para
corroborar, Finalmente se utilizaron estas semillas para evaluar los procesos
fisiológicos (ciclo de vida y estrés abiótico).
6.6.- Secuenciación de los genes sin líneas T-DNA
Para la extracción de ADN se utilizó tejido de la mutante nhr1 y se realizó la
extracción por el método de columna (DNeasy Plant Mini Kit, Cat. no. 69104), se
cuantificó por absorbancia en espectrofotómetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific)
y se verificó la calidad del ADN por electroforesis en agarosa al 0.8%. Se realizó la
secuenciación en Macrogen Inc., Seoul, Korea, mediante la técnica primer walking
(Kieleczawa et al., 1992). Una vez obtenida las secuencias, primero se verificó la
calidad del electroferograma y se realizó el alineamiento de las secuencias
pertenecientes a la mutante nhr1 y las secuencias silvestres obtenidas del banco de
datos en TAIR. Para el alineamiento se utilizó el programa ClustalX 2.1 (Larkin et al.,
1997) y el programa GeneDoc (Nicholas et al., 1997).
6.7.- Ciclo de vida de las mutantes T-DNA pertenecientes al locus NHR1
Se utilizaron semillas de 3 meses de edad a partir de su recolección. Se estratificaron
las semillas de los genotipos T-DNA, silvestre y nhr1. Estas se sembraron en medio
MS y permanecieron bajo condiciones controladas de crecimiento. Se cuantificó
germinación cada 12 h hasta las 96 h, para facilitar la cuantificación se utilizó un
estereoscopio de luz, se consideró una semilla germinada aquella que su radícula
haya emergido y alcanza el 50% del tamaño de la semilla. El establecimiento se
evaluó cada 12 h, siendo el punto de referencia aquella planta que presentó los
cotiledones verdes y en un ángulo de 180° o mayor.
La transición de la fase vegetativa a la reproductiva (emisión de escapo), se evaluó a
nivel maceta (metodología de siembra y establecimiento de plántulas antes descrita),
se cuantificó a partir del día 15 cada 24 h y se consideró un escapo emitido cuando
este alcanzó una altura mayor a 0.5 cm. Se realizaron cuatro experimentos
28
independientes, tres réplicas en cada experimento y seis plantas por genotipo (n = 6).
Los datos fueron analizados con el paquete estadístico SAS 9.0. Se realizó un
análisis de varianza (ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5
y se graficó en el programa Origin 6.1.
6.8.- Estrés salino (NaCl)
Se estratificó y desinfectó a las semillas, éstas se sembraron en cajas Petri con
medio de cultivo MS adicionado con 100 mM de cloruro de sodio. Las semillas
permanecieron en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas de
crecimiento y desarrollo. Se evaluó germinación y establecimiento cada 12 h y
supervivencia a los 14 días DS, se consideró una planta viable cuando ésta conservó
su coloración verde intenso. Se evaluaron plántulas T-DNA homocigotas (inserto T-
DNA en ambos cromosomas), la mutante nhr1 y como control plantas silvestres Col-
0. Se realizaron tres experimentos con tres repeticiones cada uno y un total de 20
semillas por genotipo (n = 20). Los datos fueron analizados con el paquete
estadístico SAS 9.0. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una comparación
de medias de Tukey con un α = 0.5 y se graficó en el programa Origin 6.1.
6.9.- Análisis de ABA exógeno
Se utilizó medio MS adicionado con ABA. Inicialmente se determinó la dosis
respuesta, es decir, la concentración adecuada en la cual plantas Col-0 responden
viéndose afectadas en el porcentaje de su germinación y establecimiento de
plántulas en presencia del fitoregulador, las concentraciones evaluadas fueron: 0, 50,
100, 250 y 400 nM. Los genotipos utilizados fueron Col-0 y nhr1 y se realizaron tres
experimentos con tres repeticiones cada uno con un total de 30 semillas por genotipo
(n = 30). Finalmente, después de realizar estos experimento, se seleccionó 400 nM
como la concentración adecuada para evaluar a las mutantes de T-DNA en
presencia de ABA. Se cuantificó germinación y establecimiento cada 12 h con las
consideraciones antes mencionadas. En este caso se realizaron tres experimentos
29
con tres repeticiones cada uno y un total de 20 semillas por genotipo (n = 20). Los
datos fueron analizados con el paquete estadístico SAS 9.0. Se realizó un análisis de
varianza (ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5 y se
graficó en el programa Origin 6.1.
6.1.1.- Ensayo de pérdida de agua.
Se utilizaron plantas con cinco semanas de edad DS de cada una de las líneas T-
DNA, nhr1 y Col-0. Se tomaron hojas de roseta y se colocaron en platos para pesar,
y se pesaron en una balanza analítica (ADAM®, PW 254), se cuantificó peso fresco
cada 10 min con ayuda del programa ADAM DU durante 150 min. La cuantificación
se realizó a temperatura ambiente (24 + 1°C). Se tomaron siete hojas de roseta por
genotipo y como mínimo tres réplicas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y
una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5 y se graficó en el programa
Origin 6.1.
6.1.2.- Selección y secuenciación de genes candidatos para albergar la mutación
nhr1.
Se diseñaron oligonucleótidos específicos para los genes candidatos. Se realizaron
extracciones de ADN de plantas nhr1 de 4 semanas de edad por el método por
columna y se verificó la eficacia de la extracción mediante cuantificación
absorbancia en espectrofotómetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific). El ADNg se
visualizó en un gel de agarosa al 0.8%. Una vez que se determinó la calidad del
ADN, se realizó la amplificación del gen mediante PCR convencional. El diseño de
oligonucleótidos para la amplificación del gen, se realizó con la herramienta
bioinformática Primer3 (V. 0.4.0) en la página http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0. Para
amplificar el gen completo, se fraccionó el gen en fragmentos que van desde 500 a
700 pb, esto debido al tamaño del gen y a la herramienta utilizada para su
secuenciación. Posterior a la amplificación del gen por PCR, se purificaron los
productos con el Kit de purificación QIAquick PCR Purification Kit (No. Cat. 28104) y
30
los productos purificados fueron cuantificados nuevamente por espectrofotometría en
NanoDrop, finalmente se liofilizó una cantidad de 500 ng/µL y se mandó secuenciar,
adicionalmente también se incluyó 20 µL de oligonucleótido para cada fragmento del
gen correspondiente, a una concentración de 10 µM. Las secuencias pertenecientes
a la mutante nhr1 se alinearon con las obtenidas de Col-0, y con las secuencias
bajadas del banco de datos en TAIR, para determinar si existía una mutación.
6.1.3.- Verificación del truncamiento del ARNm del gen candidato L7TR por RT-PCR.
Se realizó la extracción de ARN con el reactivo TRIzoL® (No. Cat. 15596-026; Life
technologies™) siguiendo las indicaciones y recomendaciones del protocolo
establecido. Se utilizó el tejido de plántulas completas con dos semanas de edad DS
crecidas in vitro. Se cuantificó el ARN por absorbancia en espectrofotómetro
(NanoDrop 2000, Thermo Scientific) y se verificó la calidad por electroforesis en
agarosa al 1.2%. Se utilizaron los oligonucleótidos para amplificar un fragmento del
transcrito del gen L7TR, los cuales fueron diseñados en regiones no conservadas.
Inicialmente se realizó un gradiente de temperaturas para determinar la temperatura
adecuada de alineamiento. La temperatura establecida como óptima fue 56.3°C.
Como control interno de carga se utilizó el gen del ADNr 18S. Se realizó
electroforesis con los productos de RT-PCR en gel de agarosa al 2%. Para su
visualización se empleó la tinción durante 15 a 20 min por inmersión en el reactivo
Gelred™ (No. Cat. 41003, BIOTIUM,) a una concentración de 1X y se observó por
medio de luz UV utilizando un equipo de BioRad UV CCD.
31
7- RESULTADOS
7.1.- Obtención de líneas homocigotas T-DNA
La mutagénesis inducida por T-DNA causa la ruptura de un gen vía inserción de una
secuencia de nucleótidos, este método es muy utilizado para detectar funciones
génicas en A. thaliana (Krysan et al., 1999). Las líneas con inserción T-DNA de 11
genes de la región caliente nhr1 fueron adquiridas y manejadas en el laboratorio de
fitomejoramiento molecular (IPN, CIIDIR Unidad Sinaloa). Inicialmente antes de
realizar los análisis fisiológicos con las mutantes, fue necesario verificar sí estas
líneas son homocigotas en la inserción T-DNA. Esto es de suma importancia debido
a que la presencia de un alelo silvestre en una mutante T-DNA pudiera enmascarar
el fenotipo esperado por la pérdida de función del gen. Para cumplir con este
objetivo, se empleó la técnica de PCR convencional (Figura 3). El sitio de inserción
del T-DNA en cada una de las mutantes, se obtuvo de la base de datos en TAIR
(Cuadro 1). La homocigosis fue verificada para cada una de las líneas con
mutaciones por T-DNA (Anexo 1). Sin embargo, para resumir a continuación se
describe un solo caso; el de la mutante ank (At3g09550). Para esta línea,
inicialmente se evaluaron ocho muestras provenientes de plantas independientes y
dos muestras de Col-0 utilizadas como control. Se observó que al emplear los
oligonucleótidos Lp y Rp se amplificó una banda de aproximadamente 1219 pb en las
muestras 6, 7 y 8 de ank, esta misma banda estuvo presente en ambas muestras de
Col-0 (Figura 4A, panel superior). La ausencia del bandeo en las muestras 1-5 de
ank, indica que son muestras homocigotas. Para confirmar esto, se utilizaron los
oligonucleótidos LBb1 y Rp con las mismas muestras. En esta ocasión se detectó
una banda de 1140 pb aproximadamente en todas las muestras ank y la ausencia del
fragmento en ambas muestras Col-0 (Figura 4A, panel inferior). Esto sugiere que las
muestras 6, 7 y 8 son heterocigotas debido a que presentaron una amplificación con
ambos pares de oligonucleótidos, nótese que en esta ocasión las muestras 1-5 de
ank si presentaron una amplificación, lo que indica que sus dos alelos contienen el
inserto T-DNA, y confirmamos que son plantas homocigotas. Una vez que se detectó
cuales muestras presentaban mutación homocigota, se conservó semillas de su
32
descendencia en F3 para corroborar su homocigosis (Figura 4B). En esta ocasión, se
evaluaron cuatro muestras de plantas ank y una de Col-0 como control. Se observó
la ausencia de un bandeo en todas las muestras de ank al utilizar los
oligonucleótidos Lp y Rp mientras que se observó la amplificación de un fragmento
aproximado de 1219pb en la muestra de Col-0. Finalmente, al utilizar los
oligonucleótidos LBb1 y Rp, una banda de aproximadamente 1140 pb se detectó en
todas las muestras de ank y la ausencia de este fragmento en Col-0 (Figura 4B). Con
este análisis se confirmó que la descendencia en F3 resultó ser completamente
homocigota. De esta manera se pudieron detectar plantas conteniendo una mutación
homocigota para todas las líneas T-DNA, de las cuales al finalizar el análisis,
aquellas plantas que resultaron ser homocigotas se conservó su progenie para la
propagación de semillas frescas.
Las mutantes homocigotas: lip, a-ox, l7tr, myb-1, myb-3, apx2-p, mcm pwwp, se
obtuvieron en colaboración con la M.C. María Eugenia Campos (IBT-UNAM),
adicionalmente se generaron líneas homocigotas de las mutantes pl y ank. Es
importante mencionar que la mutante ppr resultó ser de mutación letal para el
genotipo homocigoto, las cuales morían por etiolación a los siete días posteriores a
su germinación, el análisis fisiológico con esta mutante se realizó con plantas
heterocigotas.
Figura 3. Esquema representativo para determinar homocigosis en líneas T-DNA. A) Representa
la localización del diseño de los oligonucleótidos en el genoma y dentro de la región del inserto T-
DNA. La barra en gris representa el gen silvestre y su dirección en el genoma (5’ y 3’), la barra en
negro representa el T-DNA y el sitio donde se inserta dentro del gen. Lp (oligonucleótido izquierdo),
T-DNA
Lp Rp
LBb1mWT mHE mHO
WT
T-DNA5’ 3’
A B
33
Rp (oligonucleótido derecho), LBb1 (oligonucleótido dentro del T-DNA). Para amplificar un fragmento
de un gen silvestre –WT–, se utilizaron: Lp y Rp. Para detectar el inserto T-DNA se utilizaron: LBb1 y
Rp. B) se esquematiza el patrón de bandeo esperado en un gel por electroforesis. WT (fragmento del
gen silvestre), T-DNA (fragmento T-DNA) mWT (muestra silvestre), mHE (muestra heterocigota), mHO
(muestra homocigota). Nota: el fragmento del gen silvestre siempre es de mayor tamaño que el
fragmento del T-DNA. Basado en http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html.
Cuadro 2. Listado de oligonucleótidos de líneas SALK
At3g09540 Pectato liasa SALK_026973 TTTTTGGGTTGCCTTTTCTTC TCCAACAAATGGTTAATTTGC 1226 602-902
SALK_011123C TGCAAGCAAAATTCAGAATCC GTGTGTTGGGCTTCATTAAGG 1042 519-819
At3g09550 Ankyrina SALK_080164 GAATGAGTGAGTCCTTCAGCG AGGAACTGGAACCAGGTATGG 1219 558-858
At3g09560 Lipin SALK_042850 TAATTTTGGCTTGTTGTTGGG GTTTTGGTCAGCTCTGACTGC 1070 459-759
At3g09570 Expressed protein SALK_085932C CGAGAAGGGTCTCTCTTCGAC GAAGAACCCTAACCTCGATGG 1260 606-906
At3g09580 Amine oxidase SALK_058610 TACTCGAGGCTTCTTCAGGTG GAATCGGAGAAATCTCGAACC 1174 547-847
At3g09585 tRNA-Ser N.D.
At3g09590 PRP N.D.
At3g09595 tRNA-Ser N.D.
At3g09600 Myb SALK_053482 TTCAGCAAAATCAGGAACACC AGAGCTGGACAGAGGAAGAGC 1158 577-877
Myb SALK_016333 TGAAACGTCCTTTGATGGAAC GCCATGTGGACTTTTCTTTTTC 1105 521-821
At3g09620 Helicase N.D.
At3g09630 60S ribosomal protein SALK_130595C ACTTCACCAAATGACTCGGTG TCTTGGTTGGAGCGAACATAC 983 438-738
SALK_063782 GGCCCACTAGTTCGTTAAAGG GGAAGCACATACCCCTTCTTC 1110 469-769
At3g09640 APX2 SALK_067939 ACCTGCAAAGGACATGATGAC TGTTGAGATCACTGGAGGACC 1080 441-741
APX2 SALK_018106C ACCCGCTCATTTTTGACAAC TACCGGAGGGGTTAATGAAAC 1193 580-880
APX2 SALK_057686 ATGAATCAAGCCCTTAAAGCC TCAACCCTAACGTTTTTGTGC 1205 542-842
At3g09650 Pentatricopeptide SALK_010258 CCGCATCTTCAGTCATCTCTC TTCAATCCACTCATCTCCCTG 1239 583-883
SALK_010264 CCGCATCTTCAGTCATCTCTC ATCAATCCAAACCCGAGAGTC 1179 553-853
At3g09660 MCM SALK_102821 TCCCATTATCACCAGCTGAAG TCTTCATTCACCTGGCTCAAG 1117 565-865
At3g09670 PWWP SALK_027045 TTCACATCACTGAGATCAGCG ATTTGATGATGGCCAAGTGAG 1100 431-731
LBb1 GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC
LBa1 TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
No disponible = N.D.
Locus Gen Salk Oligo Rp LP+RP (pb) BP+RP (pb)Oligos Lp
PECTATO LIASA
ANKIRINA
LIPINA
L7TR
AMINO OXIDASA
tRNA-CGA
PRP
tRNA-TGA
MYB
MYB
HELICASA
PROTEÍNA r60s
APX2
APX2
APX2
PENTATRICOPÉPTIDO
PENTATRICOPÉPTIDO
MCM
PWWP
PECTATO LIASA
ANKIRINA
LIPINA
L7TR
AMINO OXIDASA
tRNA-CGA
PRP
tRNA-TGA
MYB
MYB
HELICASA
PROTEÍNA r60s
APX2
APX2
APX2
PENTATRICOPÉPTIDO
PENTATRICOPÉPTIDO
MCM
PWWP
PECTATO LIASA
ANKIRINA
LIPINA
L7TR
AMINO OXIDASA
tRNA-CGA
PRP
tRNA-TGA
MYB
MYB
HELICASA
PROTEÍNA r60s
APX2
APX2
APX2
PENTATRICOPÉPTIDO
PENTATRICOPÉPTIDO
MCM
PWWP
PECTATO LIASA
ANKIRINA
LIPINA
L7TR
AMINO OXIDASA
tRNA-CGA
PRP
tRNA-TGA
MYB
MYB
HELICASA
PROTEÍNA r60s
APX2
APX2
APX2
PENTATRICOPÉPTIDO
PENTATRICOPÉPTIDO
MCM
PWWP
PECTATO LIASA
ANKIRINA
LIPINA
L7TR
AMINO OXIDASA
tRNA-CGA
PRP
tRNA-TGA
MYB
MYB
HELICASA
PROTEÍNA r60s
APX2
APX2
APX2
PENTATRICOPÉPTIDO
PENTATRICOPÉPTIDO
MCM
PWWP
34
Figura 4. La mutante ank es homocigota para el inserto T-DNA. A) 1-8 muestras de ank, Col1 y
Col2 (silvestres), en el gel superior se utilizaron los oligonucleótidos Lp y Rp para amplificar el
fragmento del gen ANK silvestre (WT) [fragmento aproximado de 1219 pb], en el gel inferior se
utilizaron los oligonucleótidos LBb1 y Rp para amplificar parte del T-DNA (fragmento aproximado de
1140 pb), las muestras que amplifican únicamente el fragmento de 1219 pb son silvestres. Las
muestras que amplifican únicamente el fragmento de 1140 pb, son homocigotas. Las muestras que
amplifican ambos fragmentos son heterocigotas. B) 1-4 son muestras de ank provenientes de plantas
que resultaron ser homocigotas en F2 (A), propagadas y evaluadas en F3, Col (control), Lp + Rp
(utilización de oligonucleótidos izquierdo y derecho), Rp+LBb1 (utilización de oligonucleótido derecho
y oligonucleótido posicionado dentro del T-DNA). El bandeo muestra un fragmento silvestre (1219pb)
o un fragmento del T-DNA (1140pb). M, carril con marcador de peso molecular en pares de bases
(pb). El bandeo son los productos de PCR en un gel de agarosa al 1.2%.
7.2.- Secuenciación de genes de la región caliente nhr1 con las que no se cuenta con
líneas mutadas con T-DNA
En la región que abarca el locus NHR1 se localizan 15 genes, algunos de estos
genes no cuentan con líneas mutantes T-DNA disponibles, estos genes son; ARNt-
ser anticodón CGA (At3g09585), PRP (At3g09590), ARNt-ser anticodón TGA
1000
750
2000
1500
M 1 2 3 4 Col 1 2 3 4 Col M (pb)ank ank
Lp + Rp Rp + LBb1
WT (1219pb)T-DNA (1140pb)
M Col1 Col2 1 2 3 4 5 6 7 8 M
1500
12001031
900
1500
12001031
900
(pb)ank
WT (1219pb)
T-DNA(1140pb)
A
B
35
(At3g09595) y HELICASA (At3g09620). Para determinar si alguno de estos genes
albergaba alguna mutación fue necesaria su secuenciación, para ello se usó el ADN
genómico de la mutante nhr1. Las secuencias se analizaron mediante un
alineamiento con secuencias silvestres obtenidas en el banco de datos en TAIR
(ensamble TAIR10). El análisis y comparación de las secuencias obtenidas,
mostraron un alineamiento perfecto de las secuencias del gen ARNt-ser-CGA
anticodón CGA (At3g09585) [Figura 5], estos resultados descartan a este gen como
posible candidato para albergar la mutación, lo cual confirma que no es el gen
causante del fenotipo nhr1. De igual manera, los genes PRP (At3g09590), ARNt-ser-
TGA (At3g09595) y HLC (At3g09620) no mostraron ningún cambio a nivel
nucleotídico (Anexo 2) por lo que concluimos que estos genes no son los
responsables del fenotipo nhr1.
Figura 5. El gen ARNt-CGA (At3g09585) sin línea T-DNA no presenta mutaciones en la nhr1.
Comparación de las secuencias del gen ARNt-CGA provenientes de la mutante nhr1. La secuencia
Col-0 pertenece a la silvestre reportada en TAIR, la secuencia nhr1 corresponde a la mutante en
estudio. Las cajas en negro muestran el alineamiento perfecto de ambas secuencias, la flecha indica
el sitio de inicio de la transcripción, la región río arriba a partir de la flecha corresponde al promotor. La
secuencia completa tiene un tamaño de 615 nucleótidos.
ARNt-CGA
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
36
7.3.- Ciclo de vida de las mutantes T-DNA en los genes de la región caliente nhr1
La mutante nhr1 de A. thaliana presenta un ciclo de vida más lento en comparación
de plantas silvestres, en donde el tiempo de germinación, establecimiento y emisión
de escapo son retardados debido al alto contenido de ABA endógeno (Quiroz-
Figueroa et al., 2010). Una mutación opuesta en el gen nhr1, de acuerdo a nuestra
hipótesis, resultaría en un fenotipo opuesto, esto nos indicaría algún gen candidato
para albergar la mutación nhr1. Para lo anterior, se analizó el comportamiento
fisiológico de cada una de las mutantes T-DNA pertenecientes al locus NHR1
siguiendo los fenotipos de tiempo de germinación, establecimiento y emisión de
escapo. El análisis se realizó para todas las mutantes T-DNA pertenecientes a la
región caliente nhr1 (pl, ank, lip, l7tr, a-ox, myb-1, myb-3, r60s, apx2-p, ppr, mcm y
pwwp) sin embargo, a continuación sólo se describen aquellas que presentaron
fenotipos diferentes a plantas silvestres.
Se observó que la mutante l7tr presentó una germinación retardada en comparación
con las plantas silvestres. A las 24 h DS tuvieron un 6% de germinación en
comparación al 25% que presentaron las plantas silvestres, además, este retraso fue
similar al de la nhr1 sin diferencias significativas (Figura 6A). Pudimos observar que a
partir de las 36 h DS la mutante l7tr presentó un comportamiento similar a plantas
silvestres con una germinación muy cercana al 100%, sin embargo, la mutante nhr1
alcanzó hasta las 96 h DS el 100% de germinación. También, la mutante l7tr se
retardó en la etapa de establecimiento, lo cual era de esperarse, pues la etapa de
germinación y establecimiento están muy ligadas. La mutante l7tr a las 72 h DS
había alcanzado apenas un 50% de establecimiento en comparación al 80% que
presentaron las plantas silvestres. En el mismo periodo de tiempo la mutante nhr1
presentó un 44% de establecimiento (Figura 6B). No fue hasta las 96 h DS cuando la
mutante l7tr había alcanzado un 100% de establecimiento, en contraste con la
mutante nhr1, la cual solo pudo alcanzar este comportamiento después de 120 h DS.
Los resultados obtenidos en este análisis indican que la presencia del T-DNA en el
gen L7TR en A. thaliana causa un ciclo de vida retardado en etapas tempranas de la
planta.
37
En la evaluación para a-ox, el comportamiento fuer muy similar al de la mutante nhr1
durante las etapas de germinación y establecimiento (Figura 6). Se observó que
plántulas a-ox mostraron un 10% de germinación a las 24 h DS, siendo este
comportamiento muy similar en la mutante nhr1, en contraste con las plantas
silvestres que alcanzaron un 42% de germinación. A las 48 h DS ambas mutantes
alcanzaron un porcentaje de germinación similar, mientras que la mutante nhr1 aún
presentó un bajo porcentaje de germinación alrededor del 80% (Figura 6C). Durante
el establecimiento se observaron comportamientos muy similares, en donde la
mutante a-ox y la mutante nhr1 presentaron un 34% de establecimiento a las 84 h
DS, mientras que plantas silvestres mostraron un 76%. En esta ocasión las dos
mutantes alcanzaron cerca del 100% de establecimiento sin diferencias significativas
a plantas silvestres a las 108 h DS (Figura 6D). Los datos sugieren que la inserción
del T-DNA en la mutante a-ox está ocasionando una germinación y establecimiento
retardado, comportamientos similares a la mutante nhr1.
En la mutante nhr1 la floración está reprimida, lo que resulta en plantas con un
tiempo de emisión de escapo retardado y como consecuencia un ciclo de vida mucho
más largo. Además este fenotipo se ve potenciado cuando plantas nhr1 son
asperjadas con ABA (Quiroz-Figueroa et al., 2010). En el presente estudio, el tiempo
de emisión de escapo de plantas silvestres fue alrededor de los 21 días DS y de
forma similar todas las mutantes T-DNA. Mientras que en la mutante nhr1 el tiempo
de emisión de escapo fue alrededor de los 28 días DS (Figura 7). Es importante
mencionar que ha habido casos en donde las plantas nhr1 presentan un tiempo de
emisión de escapo incluso hasta los 12 meses DS (Datos sin publicar). Los
resultados obtenidos indican que las mutaciones por T-DNA en los genes del locus
NHR1 no causa un fenotipo de emisión de escapo contrario al de nhr1. Los análisis
de ciclo de vida no muestran el comportamiento esperado, opuesto a la mutante nhr1
de ciclo de vida prematuro en ninguna de las mutantes T-DNA.
38
Figura 6. La pérdida de función por T-DNA en los genes l7tr y a-ox afecta la germinación y
establecimiento. A) Germinación y B) establecimiento de la mutante l7tr en comparación con nhr1 y
Col-0, C) germinación y D) establecimiento de la mutante a-ox en comparación con la mutante nhr1 y
Col-0 bajo condiciones normales. Los cuadrados rellenos corresponden a Col-0, los círculos
corresponden a nhr1 y los cuadrados sin relleno corresponden a la mutante l7tr en A y B, y a la
mutante a-ox en C y D. Se evaluó germinación cada 12 h hasta las 96 h, y cada 12 h hasta las 120 h
DS para establecimiento. La germinación y establecimiento fueron promediados y graficados como el
porcentaje total de semillas germinadas o establecidas. Los gráficos son la representación de dos
experimentos individuales con tres repeticiones y 20 semillas por genotipo (n=20). Se realizó un
análisis de varianza (ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5. Las letras
iguales indican que no hay diferencias estadísticas.
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
A
C
B
D
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
Tiempo (h) Tiempo (h)
Tiempo (h) Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
a
bb
a
ba
b
a
a
b
a
a
a
a
a
a
aa
a
a
aa
aaa
a
b
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
aa
a
a
bb
a
b
b
a
a b
b
aa
a
a
a a
a
a a
aa
a
a
b b
b
b
aa
bb
b
b
aa
aa
a
aa
39
Figura 7. La pérdida de función en las mutantes T-DNA pertenecientes al locus NHR1 no afecta
el tiempo emisión de escapo. El gráfico muestra en el eje Y el tiempo de emisión de escapo
evaluado en días. En el eje X Col-0, nhr1 y las mutantes T-DNA. Se consideró una planta con escapo
cuando este alcanzó 0.5 cm de longitud. El inicio de la evaluación se realizó a partir de los 15 días DS
cada 24 h hasta obtener el total de escapos emitidos. Las plantas fueron germinadas in vitro y
trasplantadas a maceta a los 14 días DS en donde permanecieron bajo condiciones controladas de
temperatura. Se realizaron dos experimentos con tres repeticiones cada uno con seis plántulas por
genotipo (n=6). Las barras son el promedio y el error estándar. Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA) y una comparación de medias Tukey con un α = 0.5. Las barras con la misma letra no son
significativamente diferentes.
7.4.- Estrés abiótico
7.4.1- Ensayo ABA exógeno
Inicialmente se determinó la ID50, dosis a la cual el 50% de las plantas control o
silvestres (Col-0) estuvieran afectadas por ABA. En estos experimentos también se
Emis
ión
de
esca
po
(d
ías)
Col-0
nhr1 pl
ank lip l7
tra-
ox
myb
-1r6
0s
apx-
p
apx-
5
apx-
5h ppr
mcm
pwwp
0
5
10
15
20
25
30
a a a a a a
a
a aa
a aa
a
b
40
incluyó a la mutante nhr1, y se evaluaron concentraciones en un rango de 0 a 400
nM de ABA. Se cuantificó cada 12 h tanto para germinación como para
establecimiento.
Los datos obtenidos mostraron que la germinación y el establecimiento se afectaron
de acuerdo a la dosis, observándose claramente la sensibilidad de la mutante nhr1 a
ABA.
En 400 nM de ABA a las 48 h DS la mutante nhr1 presentó una germinación del 10%
en comparación del 49% en plantas silvestres (Figura 8A). Durante el
establecimiento, en 400 nM de ABA y a los siete días DS la mutante nhr1 alcanzó un
9%, mientras que las plantas silvestres presentaron un 49% (Figura 8B). Se observó
que a concentraciones de 50 y 100 nM de ABA, las plantas control presentaron
porcentajes de germinación y establecimiento mayores al 70%. Estos valores fueron
de alrededor del 90% a las 48 h DS durante la germinación y de alrededor de 95% a
los siete días DS en el establecimiento. En presencia de 250 nM de ABA, las plantas
silvestres mostraron un 65% de germinación a las 48 h DS, y un 80% de
establecimiento a los siete días DS. En todas las concentraciones de ABA exógeno
los porcentajes de germinación y establecimiento en la nhr1 fueron inferiores a los
valores alcanzados con plantas silvestres. A la concentración de 400 nM se obtuvo
un ID cercano al 50% en Col-0.
Ger
min
ació
n (
%)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 50 100 250 400 0 50 100 250 400
ABA (nM) ABA (nM)
A B
0
20
40
60
80
100 Col-0
nhr1
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
41
Figura 8. Dosis letal media de ABA exógeno en Col-0. A) Germinación a las 48 h y B)
establecimiento a los siete días en presencia de 0, 50, 100, 250 y 400 nM de ABA en la mutante nhr1
y Col-0. Los cuadrados corresponden a Col-0 y los círculos a nhr1. La germinación y el
establecimiento fueron medidos y graficados en porcentajes del total de número de semillas
germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el
establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 156 h. Se realizaron tres experimentos con tres
repeticiones cada uno y 30 semillas por genotipo por cada repetición. Los gráficos muestran el
promedio y la desviación estándar.
Una vez determinada la ID50 (400 nM de ABA) se procedió a retar a las mutantes T-
DNA y evaluar la germinación y establecimiento. En cada experimento se incluyeron
a las mutantes T-DNA, la mutante nhr1 y Col-0. A continuación se describirán solo
aquellas mutantes T-DNA cuyo comportamiento fue diferente al de las plantas
silvestres.
Los resultados obtenidos muestran que la mutante ank presentó sensibilidad a ABA
durante la germinación y establecimiento en comparación a las plantas silvestres
(Figura 9). Sin embargo, esta sensibilidad fue en promedio menor que la
hipersensibilidad mostrada por la mutante nhr1. A las 48 h y 400 nM de ABA, la
germinación de ank fue alrededor del 22%, cercano a la mutante nhr1 la cual
presentó un 17% mientras que las plantas control presentaron un 58%. A las 72 h DS
la mutante ank presentó un 90% de germinación cercano a la Col-0, por el contrario
la mutante nhr1 tuvo un porcentaje inferior (70%), finalmente al cabo de 96 h los tres
genotipos alcanzaron un 100% de germinación (Figura 9C).
Durante el establecimiento la mutante ank mostró sensibilidad a ABA. A las 120 h DS
la mutante ank apenas alcanzó en promedio un 8% de establecimiento en
comparación con las plantas silvestres que presentaron en promedio alrededor del
50%, mientras que el establecimiento para la nhr1 fue casi nulo. Después de 168 h la
mutante ank mostró un 65% en comparación al 80% de plantas control y un 15%
para la mutante nhr1. El fenotipo de sensibilidad fue más notable para la mutante ank
en presencia de ABA, a las 144 h DS esta presentó un 30% en comparación de un
65% de Col-0 y un 10% de la mutante nhr1 (Figura 9D). Bajo condiciones normales
de crecimiento la mutante ank presentó un comportamiento similar a plantas control
42
(Figura 9A y B). De esta manera, los datos obtenidos nos sugieren que la ausencia
del gen ANK causa la sensibilidad a ABA en etapas tempranas de desarrollo en
plantas de A. thaliana. Posiblemente el gen ANK esté involucrado en procesos de
señalización de respuesta a ABA durante la germinación y establecimiento.
Figura 9. La pérdida de función en la mutante ank genera sensibilidad a ABA. A) germinación y
C) establecimiento bajo condiciones normales (0 nM ABA). B) germinación y D) establecimiento en
presencia de 400 nM de ABA de la mutante ank en comparación con Col-0 y nhr1. Los cuadrados
rellenos corresponden a Col-0, los círculos a nhr1 y los cuadrados vacíos a ank. La germinación y el
establecimiento fueron promediados y graficados en porcentaje en base al total de número de semillas
germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el
establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 156 h. Se realizaron dos experimentos con tres
repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n=20). Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5.
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
A
C
B
D
Ger
min
ació
n (
%)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120 132 144 168
Tiempo (h)
Tiempo (h)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
AB
A (
0 n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
0 60 72 84 96 108 120 132 144 168
AB
A (
40
0 n
M)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ank
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ank
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ank
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ank
a
a
b
a
a b
b
a
a
abb
a
b
b
b
b
a
b
a
a
a b
a
a
b
a
b
c
a
b
c
aa
b
b
a
aa
a
b
b
43
En presencia de ABA la mutante l7tr también presento un comportamiento retardado
en etapas iniciales de desarrollo. Anteriormente se determinó que la mutante l7tr
tiene una germinación y establecimiento retardado bajo condiciones normales de
crecimiento (Figura 6A y B; Figura 10 A y B). Además, en presencia de 400 nM de
ABA ésta mutante el fenotipo de germinación retardada se potenció, en donde a las
48 h DS mostró un 25% de germinación, mientras que plantas silvestres alcanzaron
un 55% de germinación a este mismo tiempo, y fue hasta las 72 h DS cuando mostró
una germinación similar a plantas silvestres, sin embargo, a este mismo tiempo en la
mutante nhr1 aún se podía observar la germinación afectada con un 65% en
comparación del 90% que mostraron Col-0 y la mutante l7tr (Figura 10C). Durante el
establecimiento de plántulas en presencia de ABA, la mutante l7tr obtuvo un 20% a
las 96 h DS en comparación del 52% que mostraron plantas silvestres y el
establecimiento fue nulo para la mutante nhr1, sin embargo, a las 108 h DS la
mutante l7tr se comportó de manera similar a Col-0, con un 50% de establecimiento
para la mutante l7tr y un 60% en Col-0, pero sin diferencias significativas, además,
se puede observar como la mutante nhr1 es muy sensible a ABA que la final del
experimento (240 h) solamente presenta un 30% de establecimiento en comparación
del 90% que muestran Col-0 y la mutante l7tr (Figura 10D). Estos resultados
sugieren que la mutante l7tr es sensible a ABA en etapas tempranas de desarrollo.
44
Figura 10. La pérdida de función en la mutante l7tr genera sensibilidad a ABA. A) germinación y
C) establecimiento bajo condiciones normales (0 nM ABA). B) germinación y D) establecimiento en
presencia de 400 nM de ABA de la mutante l7tr en comparación con Col-0 y nhr1. Los cuadrados
rellenos corresponden a Col-0, los círculos a nhr1 y los cuadrados vacíos a la mutante l7tr. La
germinación y el establecimiento fueron promediados y graficados en porcentaje en base al total de
número de semillas germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h
DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 156 h. Se realizaron dos experimentos con
tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5.
Por otro lado, como su nombre lo indica, las proteínas r60s forman parte de los
ribosomas, en donde su principal función es estructural y de interacción con el ARN.
En este estudio una mutante por T-DNA en el gen r60S perteneciente al locus NHR1,
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
A B
Esta
ble
cim
ien
to (%
)
Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
C D
Esta
ble
cim
ien
to (%
)
Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
l7tr
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
AB
A (
0nM
)A
BA
(40
0nM
)
a
b
bb
a
a
a
b
a
a
bb
a
ab
b
a
a
b
a
a
a
b
b
b
b
bb
c
a
a
a
aa
a
b bb
bb
45
resultó ser sensible a ABA en etapas de germinación y establecimiento. Primero, en
presencia de 400 nM de ABA exógeno la mutante r60S presentó un 12% de
germinación a las 48 h DS en comparación a un 50% en plantas silvestres, mientras
que para la mutante nhr1 la germinación fue casi nula (Figura 11C). Sin embargo,
este fenotipo solamente se observó en las primeras horas, sin embargo a las 72 h
DS la mutante presentó alrededor del 92% de germinación, de forma similar a
plantas silvestres, mientras que la nhr1 mostró alrededor de un 55%. Al final del
experimento, a las 96 h los tres genotipos presentaron un 100% de germinación.
Durante el establecimiento la mutante r60s mostró estar más afectada, a las 168 h
DS el establecimiento fue alrededor del 10% por el contrario a las plantas silvestres
con un 80%, sin embargo la mutante nhr1 presentó un porcentaje cercano a cero. Al
cabo de 240 h, la mutante r60S solamente alcanzó un 30% en comparación de un
84% para el genotipo Col-0 y un 12% para la mutante nhr1 (Figura 11D). Bajo
condiciones normales de crecimiento el comportamiento de la mutante r60S fue
similar a plantas silvestres, en donde a las 36 h DS ambos genotipos mostraron un
85%, mientras que la nhr1 alcanzó solamente un 58% a este mismo tiempo. En el
establecimiento a las 72 h DS bajo condiciones normales de crecimiento, la mutante
r60S y las plantas control presentaron un 63% en comparación de un 20% de la
mutante nhr1 (Figura 11A y B). Estos resultados muestran que la pérdida de función
en el gen r60s causa una sensibilidad al ABA.
46
Figura 11. La pérdida de función en la mutante r60s ocasiona sensibilidad a ABA. A)
germinación y C) establecimiento bajo condiciones normales (0 nM ABA). B) germinación y D)
establecimiento en presencia de 400 nM de ABA de la mutante r60s, Col-0 y nhr1. Los cuadrados
rellenos corresponden a Col-0 y los círculos a nhr1 y los cuadrados vacíos a r60s. La germinación y el
establecimiento fueron promediados y graficados en porcentajes del total de número de semillas
germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el
establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 156 h. Se realizaron dos experimentos con tres
repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los gráficos son el promedio y
desviación estándar.
7.4.2.- Estrés salino (NaCl)
Una elevada salinidad puede resultar catastrófica para las plantas, reduciendo la
disponibilidad de agua para las plantas. Análisis recientes demostraron que la
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
A
C
B
D
Ger
min
ació
n (
%)
Esta
ble
cim
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%)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
AB
A (
0 n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
AB
A (
40
0 n
M)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
a
b
aa
b
a
b
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
b
b b b b
b
a
aa
a a
b b b b b
47
mutante nhr1 presenta hipersensibilidad salina (NaCl) (Quiroz-Chavez 2011,
Magnolia 2013). En este estudio se utilizaron las mutantes por T-DNA de los genes
del locus NHR1 en búsqueda de alguna que pudiera presentar comportamientos
contrarios a la mutante nhr1. Para esto se evaluaron a las mutantes T-DNA en
estrés salino (NaCl) bajo condiciones in vitro. Se evaluó la germinación,
establecimiento y supervivencia de plántulas. En este análisis, durante la
germinación y establecimiento, no se encontraron diferencias en el comportamiento
de las mutantes T-DNA en comparación con las plantas silvestres (Anexo 9, 10 y 11).
Durante la supervivencia tampoco se observaron cambios en el fenotipo. Se evaluó
la supervivencia a los 14 días DS dividiéndose a las mutantes T-DNA en tres grupos.
El primero se integró por pl, ank, lip, l7tr, nhr1 y Col-0. Los resultados obtenidos
muestran una ligera sensibilidad de la mutante ank a NaCl en esta etapa, sin
embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas respecto a plantas
silvestres. Pudimos observar que a los 14 días ank presentó una supervivencia del
30% y un 45% de plantas silvestres y alrededor de un 7% en la mutante nhr1 (Figura
12). El análisis cualitativo mostró que las mutantes pl, lip y l7tr presentan
comportamientos similares a las plantas silvestres, sin diferencias significativas. Este
se pudo observar en el análisis cualitativo (Figura 12). De acuerdo a nuestra
hipótesis, alguna de las mutantes debería de presentar comportamientos contrarios a
la nhr1, sin embargo, no se logró detectar dicho comportamiento. Por lo tanto, se
concluye que la pérdida de función en las mutantes T-DNA pertenecientes al locus
NHR1 no afecta el comportamiento bajo condiciones de estrés salino.
48
Figura 12. La pérdida de función en los genes PL, ANK, LIP y L7TR no afecta el
comportamiento de plántulas en condiciones salinas. A) mutantes pl, ank, lip, l7tr, nhr1 y Col-0.
En la imagen A en la parte superior se muestra el análisis cualitativo en condiciones normales (0 mM
de NaCl), en la imagen inferior el fenotipo de las mutantes en un medio salino (100 mM de NaCl). B)
El gráfico muestra el análisis cuantitativo de la supervivencia. Se cuantificó supervivencia y se
tomaron las fotografías a los 14 días DS. Se consideró una planta viable cuando presentaba una
coloración verde intenso. Se realizaron tres experimentos con tres réplicas obteniendo resultados
similares. Se sembraron 20 plantas por genotipo (n = 20). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA)
y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5. Las barras con la misma letra no son
significativamente diferentes.
En el segundo grupo observamos comportamientos similares entre las mutantes T-
DNA y las plantas silvestres. En este se incluyeron las mutantes a-ox, myb-1, myb-3,
mcm, nhr1 y Col-0. Se observó que a los 14 días las plantas silvestres mostraron un
nhr1
pl
anklip
l7tr
Col-0
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
l7tr
0 100
Salin
idad
(N
aCl)
No
rmal
NaCl (mM)
nhr1
pl
anklip
l7tr
Col-0
A
B
b
c
a a a a a a
b
bc
bb
Sup
erv
ive
nci
a (%
)
49
65% de supervivencia, la mutante a-ox un 52%, myb-1 un 58%, myb-3 un 62% y por
último un 70% en mcm, sin embargo ninguna de las mutantes T-DNA presentó
diferencias significativas respecto a las plantas silvestres, mientras que la mutante
nhr1 solamente alcanzó un 10% de supervivencia (Figura 13B). En el análisis
cualitativo se puede apreciar un comportamiento similar en todos los genotipos T-
DNA. Por lo tanto, estos resultados muestran que la pérdida de función en los genes
evaluados no afecta el comportamiento de las plántulas bajo condiciones estresantes
de salinidad. Sin embargo, esto no descarta la posibilidad de que alguno de estos
genes albergue la mutación nhr1, ya que existe la posibilidad de que algún gen
homólogo pudiera estar reemplazando su función.
Figura 13. La pérdida de función en los genes A-OX, MYB, y MCM no afecta el comportamiento
de plántulas en condiciones salinas. A) mutantes a-ox, myb-1, myb-3 mcm, nhr1 y Col-0. En la
imagen A en la parte superior se muestra el análisis cualitativo en condiciones normales (0 mM de
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
Col-0
Salin
idad
(N
aCl)
No
rmal
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
Col-0
0 100
NaCl (mM)
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
a-ox
myb1
myb-3
mcm
A
B
b
c
a a a a a a
bb
bb
Sup
erv
ive
nci
a (%
)
50
NaCl), en la imagen inferior el fenotipo de las mutantes en un medio salino (100 mM de NaCl). B) El
gráfico muestra el análisis cuantitativo de la supervivencia. Se cuantificó supervivencia y se tomaron
las fotografías a los 14 días DS. Se consideró una planta viva cuando presentaba una coloración
verde intenso. Los datos se promediaron y se graficaron, las barras indican la desviación estándar. Se
realizaron tres experimentos con tres réplicas obteniendo resultados similares. Se sembraron 20
plantas por genotipo (n = 20). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una comparación de
medias de Tukey con un α = 0.5. Las barras con la misma letra no son significativamente diferentes.
Finalmente, en el tercer grupo se incluyó a las mutantes ppr, apx2-p, r60S, pwwp,
nhr1 y Col-0. En esta ocasión, las mutantes T-DNA también mostraron
comportamientos similares a las plantas silvestres. A los 14 días DS las plantas
control presentaron un 52% de supervivencia, la mutante ppr un 55%, apx-p un 62%,
r60s un 60% y pwwp un 50%, sin embargo, estas diferencias no fueron significativas
respecto a plantas silvestres. La mutante nhr1 presentó un 3% de supervivencia
(Figura 14B). En el análisis cualitativo se puede observar claramente un
comportamiento homogéneo entre las mutantes T-DNA y Col-0, sin embargo, se
visualiza el deterioro de plántulas de nhr1 (Figura 14A). De esta manera, los
resultados obtenidos indican que la pérdida de función de los genes evaluados no
tienen efecto en el comportamiento de las plántulas bajo condiciones de estrés
salino, por lo que posiblemente estos genes no están involucrados en este tipo de
procesos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, existe la posibilidad que
algún gen homólogo pudiera estar sustituyendo su ausencia.
51
Figura 14. La pérdida de función en los genes PPR, APX2, r60s y PWWP no afecta el
comportamiento de plántulas en condiciones salinas. A) mutantes ppr, apx2-p, r60s, pwwp, nhr1
y Col-0. En la imagen A en la parte superior se muestra el análisis cualitativo en condiciones normales
(0 mM de NaCl), en la imagen inferior el fenotipo de las mutantes en un medio salino (100 mM de
NaCl). B) El gráfico muestra el análisis cuantitativo de la supervivencia. Se cuantificó supervivencia y
se tomaron las fotografías a los 14 días DS. Se consideró una planta viva cuando presentaba una
coloración verde intenso. Los datos se promediaron y se graficaron, las barras indican la desviación
estándar. Se realizaron tres experimentos con tres réplicas obteniendo resultados similares. Se
sembraron 20 plantas por genotipo (n = 20). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una
comparación de medias de Tukey con un α = 0.5. Las barras con la misma letra no son
significativamente diferentes.
7.4.3.- Ensayo de pérdida de agua
nhr1
ppr
apx-p
r60s
pwwp
Col-0Sa
linid
ad (
NaC
l)
N
orm
al
0 100
NaCl (mM)
nhr1
ppr
apx2-p
r60s
pwwp
Col-0
A
B
b
c
a aa
a a a
b
b
b
b
Sup
erv
ive
nci
a (%
)
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
ppr
apx2-p
r60s
pwwp
52
La capacidad de regular la tasa de transpiración es un mecanismo de adaptación de
las plantas durante el estrés hídrico. Un ejemplo es la regulación de la apertura y
cierre de estomas mediante ABA. La mutante nhr1 con altos niveles de ABA tiene
una menor pérdida de agua por transpiración que plantas silvestres (Quiroz-Figueroa
et al., 2010). Se hipotetizó que una mutación opuesta en el gen nhr1 con bajos
niveles de ABA, pudiera presentar una excesiva pérdida de agua. Para conocer si
esto sucede, se evaluó la pérdida de peso por transpiración a diferentes periodos de
tiempo de cada una de las mutantes T-DNA. Sin embargo, solamente se describen
los resultados de la única mutante que presentó comportamientos diferentes a las
plantas silvestres.
En este análisis, la transpiración de la mutante ank resultó ser menor que en las
plantas silvestres. Al final del experimento ank presentó un porcentaje de pérdida de
peso por transpiración del 18%, mientras que las plantas silvestres mostraron un
21%, y la mutante nhr1 presentó un 16% a los 14 min (Figura 15A). Los resultados
obtenidos indican que la pérdida de función en el gen ANK no solo causa una
sensibilidad a ABA (Figura 9), sino que también causa una menor transpiración. Es
muy probable que los comportamientos observados estén ligados, y sugieren que
posiblemente ABA esté jugando un papel crucial.
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
ank
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
Tiempo (min)
53
Figura 15. La mutación por T-DNA cusa una menor transpiración en ank. A) Pérdida de peso por
transpiración de la mutante ank en comparación con la mutante nhr1 y Col-0. La transpiración se
graficó en porcentajes calculando el peso inicial menos el peso final en cada conteo. El conteo se
realizó cada 10 min y se utilizaron tres muestras por genotipo, cada muestra consistió en siete hojas
de la roseta cortadas y colocadas en platos para pesar inmediatamente al iniciar el experimento. Las
hojas utilizadas fueron de plántulas crecidas en invernadero por 5 semanas DS. Los gráficos son el
promedio y la desviación estándar. La cuantificación se realizó a temperatura ambiente (24 °C). Se
utilizó una balanza analítica para cuantificar el peso fresco. Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA) y una comparación de medias de Tukey con un α= 0.5.
7.5.- Secuenciación de genes candidatos a albergar la mutación nhr1
Durante el análisis de ciclo de vida pudimos observar que la mutante l7tr presenta
germinación y establecimiento retardado (Figura 6A y B), sin embargo, este retardo
en estos procesos no fue mayor al de la mutante nhr1. En este análisis, la mutante a-
ox también presentó un comportamiento de germinación y establecimiento retardado
similar a la mutante nhr1 (Figura 6C y D). Mientras tanto al evaluar a las mutantes T-
DNA en presencia de ABA, las mutantes ank, l7tr y r60S presentaron mayor
sensibilidad al fitoregulador durante su germinación y establecimiento (Figura 9C y D,
Figura 10C y D, Figura 11C, D, respectivamente). Mientras que la mutante a-ox
presentó menor sensibilidad durante el establecimiento (Anexo 6D). Por otro lado, un
ensayo de pérdida de peso por transpiración mostró que la mutante ank presenta
menor deshidratación en comparación de plantas silvestres (Figura 15A). Con base
en los análisis fisiológicos, se seleccionaron genes candidato que pudieran albergar
la mutación nhr1, para ser secuenciados, con la finalidad de saber si alguno de ellos
esta mutado. Como se pudo observar, diversas mutantes se vieron afectadas en
diferentes procesos fisiológicos, por lo tanto el criterio que se siguió para la selección
fue elegir aquellos genes en los cuales un mayor número de procesos fisiológicos se
vieron afectados. Es importante mencionar que no hubo el fenotipo opuesto a la
mutante al de la mutante nhr1, por excepción del comportamiento de la mutante a-ox
bajo condiciones de ABA durante el establecimiento de plántulas, este fue de menor
54
sensibilidad. Por lo tanto, se seleccionaron como candidatos para albergar la
mutación a los genes: ank, l7tr y a-ox (Cuadro 3).
Cuadro 3. Selección de genes candidato (los recuadros en gris indican el proceso fisiológico
afectado en las mutantes de T-DNA y su comparación con la mutante nhr1).
Proceso fisiológico
analizado
nhr1 ANK
(At3g09550)
L7TR
(At3g09570)
A-OX
(At3g09580)
Germinación Retardada Normal Retardada Retardada
Establecimiento Retardado Normal Retardado Retardado
Emisión de escapo Retardado Normal Normal Normal
Germinación + ABA
Retardado Retardado Retardado Normal
Establecimiento + ABA
Retardado Retardado Retardado Prematuro
Germinación + NaCl
Retardado Retardado Normal Normal
Establecimiento + NaCl
Retardado Retardado Normal Normal
Transpiración Menor Menor Normal Normal
El primer gen secuenciado en la mutante nhr1 fue L7TR. Debido a que se observó
que la mutante l7tr se ve afectada en la germinación y establecimiento bajo
condiciones normales y en presencia de ABA. El comportamiento de la mutante l7tr
no indica de forma definitiva que sea este gen quien alberga la mutación nhr1. Ya
que estos comportamientos podrían ser independientes en ambas mutantes (l7tr y
nhr1). Por lo tanto, fue necesario conocer si este gen está mutado en la mutante
nhr1. Para saber esto, se secuenció el gen L7TR en la mutante nhr1. La
secuenciación se realizó por medio de la técnica primer walking y se analizaron las
secuencias con ayuda de herramientas bioinformáticas. La comparación de las
secuencias del gen L7TR mostró dos cambios de bases. La primera se situó a 125
pb en el extremo 5’ en la región promotora a partir del inicio del promotor, esta
mutación fue un cambio de base de una guanina por una adenina. Una segunda
mutación se localizó a 500 pb a partir del extremo 5’ también en la región promotora.
En esta ocasión la mutación generó una deleción de una adenina (Figura 16). Para
55
conocer si los cambios en estas regiones afectaban algún elemento con acción en
cis, se analizó la región promotora con ayuda de la herramienta bioinformática
PlantCare (Lescot et al., 2002). En este análisis, no se localizó ningún elemento
regulatorio conocido en los sitios donde se albergan las mutaciones. Sin embargo,
existe la posibilidad que la posición en donde se localizan las mutaciones pudiera
estar alterando la estructura del ADN dentro del núcleo, impidiendo o permitiendo la
llegada de algún factor transcripcional importante en esta región. Los resultados
fenotípicos indican que posiblemente alguna de estas mutaciones o ambas pudieran
ser las causantes del fenotipo nhr1. Para conocer esto es necesario realizar análisis
posteriores, como por ejemplo, de sobre-expresión con un promotor constitutivo, o de
silenciamiento en la mutante nhr1 con la finalidad de restaurar el fenotipo silvestre.
Otra de las mutantes con cambios en los fenotipo evaluados fue la línea a-ox con
germinación, establecimiento retardado bajo condiciones normales de crecimiento y
menor sensibilidad a ABA durante el establecimiento. Estos fenotipos sugirieron
como candidato el gen A-OX por lo que éste se secuenció. El proceso de
secuenciación fue similar al del gen L7TR. El alineamiento de las secuencias nhr1 y
secuencias silvestres mostraron una complementariedad perfecta entre ellas, es
decir no se localizó mutación alguna (Anexo 13). Por lo tanto, los resultados indican
que el gen A-OX no es el causante del fenotipo nhr1 y sugieren que el
comportamiento de la mutante a-ox es independiente al fenotipo nhr1.
*
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
*
56
Figura 16. La región promotora del gen L7TR en la mutante nhr1 alberga dos mutaciones.
Alineamiento de las secuencias del gen L7TR. Se secuenció el gen completo L7TR en la mutante nhr1
por la técnica primer walking. Se utilizó ADN genómico de plantas nhr1 con 10 meses de edad. Para
analizar las secuencias, se realizó un alineamiento con el programa Clustal X2 y un consenso de las
secuencias con GenDoc. La flecha indica el sitio de inicio de la transcripción, a partir de la flecha rio
arriba se localiza la región promotora. Los asteriscos muestran la presencia de un cambio en la
secuencia. La secuencia de referencia (silvestre, Col-0) fue la obtenida de la base de datos en TAIR.
La secuencia de nhr1 corresponde a la mutante de estudio. Los números al final de la secuencia
indican la longitud en nucleótidos.
7.6.- Verificación de los niveles de transcritos de genes candidato L7TR por RT-PCR
En base al análisis fisiológico de las mutantes T-DNA, finalmente se seleccionaron
las mutante ank, l7tr y a-ox con potencial para albergar la mutación nhr1, posterior a
su elección estos genes debían ser secuenciados para saber si estaban mutados en
la mutante nhr1. Inicialmente se secuenciaron los genes L7TR y A-OX. El análisis y
comparación de sus secuencias mostró que el gen L7TR presenta dos mutaciones
en la región promotora. El fenotipo de la mutante l7tr resultó ser diferente al de
plantas silvestres, por lo tanto es necesario determinar si la mutación por T-DNA
causó una disminución en los niveles del transcrito para este gen. Para conocer esto,
se realizaron pruebas mediante RT-PCR semi-cuantitativo. Se utilizaron muestras de
plantas silvestres, nhr1 y de la mutante l7tr. Se realizó extracción de ARN total. Las
muestras para obtener tejido fueron crecidas in vitro. El diseño de los
oligonucleótidos se realizó hacia la región 3’, posterior al sitio de inserción del T-
DNA. Es importante mencionar que la inserción del T-DNA para esta línea mutante,
se localiza en la región promotora. Los resultados obtenidos indican la presencia del
transcrito L7TR en la mutante l7tr, a niveles similares que en plantas silvestres. Se
esperaba que el transcrito L7TR estuviera ausente o su expresión se estuviera
afectada de forma negativa, sin embargo no se observaron cambios en comparación
con plantas silvestres (Figura 17). Para comprobar el fenotipo l7tr es necesario
evaluar otras líneas de T-DNA con inserto en diferentes regiones del gen, o incluso
silenciar el gen con ARN de interferencia y conocer si presentan comportamientos
57
similares a los observados en el presente estudio. Adicionalmente de forma
inesperada, el análisis de la expresión del gen l7TR en la mutante nhr1 mostró un
decremento en su expresión en comparación de plantas silvestres. Estos resultados
hacen sugerir que posiblemente algún mecanismo en la mutante nhr1 está regulando
la expresión del gen. Este mecanismo podría participar en la tolerancia a estrés por
sequía en la mutante nhr1 y probablemente de todo el fenotipo.
Figura 17. La expresión del gen L7TR está regulada de forma negativa en la mutante nhr1. A)
Localización del inserto de T-DNA dentro del gen L7TR en la mutante l7tr, el insertó se localiza a 196
pb río arriba del inicio de la transcripción, Chr3, indica las coordenadas del gen L7TR en el genoma.
B) Productos de RT-PCR en un gel de Agarosa al 1.2%. Se utilizaron oligonucleótidos específicos
para amplificar un fragmento del gen L7TR en estudio. Se utilizó el gen r18s como control interno. Se
usaron las muestras de las mutantes l7tr, nhr1 y Col-0. El bandeo muestra la amplificación del
fragmento del gen L7TR (superior) y el gen r18s (inferior). C) Representación cuantitativa de la
expresión (en veces) del gen L7TR respecto a la normalización con el gen control interno (r18s). Se
L7TR
r18s
Col-0 nhr1 l7tr
B
Col-0 nhr1 l7tr
Exp
resi
ón
(ve
ces)
a a
b
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0 L7TR
C
Salk_085932C
5’ 3’
Chr3:2940446-2942109
A
58
realizaron tres repeticiones con muestras independientes. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA)
y una comparación de medias de Tukey con un α = 0.5. Las barras con letras diferentes indican
diferencias estadísticas.
8- DISCUSIÓN
La búsqueda de funciones génicas por mutantes pérdida de función por inserción de
T-DNA ha sido una herramienta muy utilizada ya que presenta grandes ventajas en
comparación a otras técnicas reportadas, una de ellas es que permiten monitorear el
desarrollo del organismo y detectar el efecto directo ocasionado por la ausencia de
algún gen de interés (Krysan et al., 1999). Esto es una ventaja, ya que en algunos
casos el modificar la expresión de un gen o producto génico ya sea de forma positiva
o negativa, no siempre resulta en un cambio de fenotipo a nivel fisiológico. Esto
resulta lógico, puesto que en algunos casos, solo es necesaria la presencia de una
pequeña cantidad de un transcrito o proteína para llevar a cabo una función
fisiológica. De forma contraria, el incremento en la expresión de un gen no siempre
resulta en la modificación de un fenotipo, pues existen mecanismos celulares que se
encargan de degradar proteínas que no son necesarias para el organismo. En el
presente estudio se han utilizado 11 líneas mutantes de T-DNA pertenecientes al
locus NHR1 con la finalidad de detectar fenotipos contrarios a la mutante nhr1.
También se han secuenciado los genes que se localizan en la región caliente nhr1
que carecen de línea T-DNA en la mutante nhr1 ya que es la estrategia más precisa
para saber si existe una mutación en una secuencia específica. Con base en estos
análisis se demostró que los genes sin línea T-DNA (ARNt-CGA, PRP, ARNt-TGA y
HELICASA) no están mutados en la nhr1. Hasta el momento no hay reportes que
involucren a los genes de ARNt en procesos de estrés hídrico en plantas. En este
estudio los genes ARNt-CGA y ARNt-TGA, resultaron no estar modificados en la
nhr1 por lo tanto no son los causantes del fenotipo y quedaron descartados como
candidatos. En segundo lugar, se conoce que las proteínas PRP se encuentran
ampliamente involucradas en respuesta a estrés biótico, y poco se sabe acerca de su
participación en respuesta a estrés hídrico. En este trabajo el gen PRP localizado en
59
la “región caliente” nhr1 no está mutado, por lo tanto no está involucrado en el
fenotipo, de tal forma que ha quedado descartado. Finalmente, un último gen sin
línea de T-DNA disponible es la HELICASA, la función de estas proteínas es el des
enrollamiento de la doble hélice de ADN, además, existen reportes en donde se
encuentran involucradas en procesos a nivel fisiológico como de respuesta a estrés
abiótico en A. thaliana. Por ejemplo, los genes DEAD-Box ARN Helicasas: AtRH9 y
AtRH25 son regulados de forma positiva en respuesta a estrés por frío, mientras que
estos mismos transcritos son regulados de manera negativa en respuesta a estrés
salino y sequía. También la sobre-expresión de estos genes resulta en plántulas con
una germinación retardada bajo condiciones de salinidad (Kim et al., 2008). En el
presente estudio, la comparación de las secuencias del gen HELICASA del locus
NHR1 no mostró ningún cambio en su secuencia. Por lo tanto, este gen ha quedado
descartado para albergar la mutación nhr1.
A pesar de ser la secuenciación un método muy rápido y confiable para localizar una
mutación, existen razones para no secuenciar el locus NHR1. el secuenciar el locus
no asegura que alguna mutación localizada sea la causante del fenotipo nhr1 por lo
que hay que evaluar adicionalmente procesos fisiológicos en una mutación opuesta o
sobre expresar el gen, entre otras técnicas que se pueden seguir para confirmar que
dicha mutación es causante del fenotipo nhr1. El utilizar la estrategia de genética
reversa en mutantes T-DNA nos permite detectar primero fenotipos directos y
secuenciar solamente aquel o aquellos genes con cambios fenotípicos, esto hace
que la técnica sea más dirigida. Al utilizar esta estrategia, se continúa con la
caracterización y posibles funciones del gen. Adicionalmente, el evaluar diversas
mutantes a la vez nos podría permitir detectar nuevas funciones génicas en otros
genes diferentes al nhr1. En este trabajo, el fenotipo de mutantes T-DNA indica que
los genes ANK, L7TR y A-OX son candidatos para albergar la mutación en nhr1 esto
debido a que se ven afectados en diversos procesos fisiológicos. A continuación, se
discuten los resultados de los genes con cambios en el fenotipo de las mutantes T-
DNA, sin embargo hay que recordar que los análisis fisiológicos se realizaron para
todas las mutantes T-DNA.
60
Es bien sabido que la dormancia y germinación de las semillas es regulado por ABA
(Koornneef et al., 2002), en donde el ABA actúa como un inductor inhibiendo la
germinación. Existen diversos reportes acerca de la participación de ABA en este tipo
de procesos fisiológicos. Como por ejemplo, las mutantes de biosíntesis de ABA
(aba) e insensibles a ABA (abi). Este tipo de mutaciones afectan la germinación de
tal manera que las plantas presentan una dormancia reducida y menor sensibilidad a
ABA (Koornneef et al., 1982, 1984). Otro ejemplo con comportamientos opuestos son
las mutantes era (enhanced response to ABA) que presentan sensibilidad a ABA
durante la germinación con una tolerancia a sequía (Cutler et al., 1996). Similar a
esta mutación es el comportamiento en la mutante nhr1 que presenta germinación y
establecimiento retardado y también es tolerante a estrés por sequía (Quiroz-
Figueroa et al., 2010). De acuerdo a nuestra hipótesis una mutación opuesta a la
nhr1 presentaría germinación y establecimiento prematuro. En el presente estudio no
se logró detectar una mutación con este fenotipo. En contraste, la mutante ank
presenta sensibilidad a ABA durante su germinación (Figura 9C) y establecimiento de
plántulas (Figura 9D). Además, la transpiración es menor en la mutante ank en
comparación a las plantas silvestres (Figura 15). El mecanismo podría explicarse si
ANK estuviera reprimiendo de manera directa o indirecta un receptor de ABA, en
donde la pérdida de función en la mutante ank libera la represión y por consecuencia
la sensibilidad a ABA y la regulación positiva del cierre de estomas por la
fitohormona, lo que estaría inhibiendo la transpiración. Otra posibilidad es que el gen
ANK esté participando en la degradación de ABA y la ausencia del gen resultara en
altos niveles de ABA. Sin embargo, este mecanismo no concuerda con el fenotipo de
sobre expresión de la mutante nhr1 a menos que ambas fueran mutaciones
similares, es decir pérdida de función en estos fenotipos. También existe la
posibilidad que ambas mutaciones podrían estar en distintos locus. Otra posibilidad
sería que ANK presentara una función similar a las proteínas PP2C como de
regulador negativo de ABA (Gosti et al., 1999).
Por otro lado, un segundo candidato para albergar la mutación es L7TR. La
identificación de genes por expresión diferencial en arroz ha permitido la detección
de dos genes (dd Os317 y dd Os32) de respuesta a frío en hojas de arroz con
61
homología a la proteína humana L7TR (lung seven transmembranal receptor 1;
AAK57695). Actualmente, el papel que juega esta proteína en plantas no es claro. El
gen ddOs32 es idéntico a OsLti6b, este codifica para una proteína hidrofóbica
transmembranal (Nylander et al., 2001). OsLti6b es inducido por frío, salinidad,
sequía o ABA (Kim et al., 2007). También, en Haloxylon ammodendron se han
reportado dos TDF (Fragmentos derivados de transcritos, por sus siglas en inglés)
conocidos como HaDR6 y HaDR7, los cuales presentan una alta similitud a L7TR, en
donde un análisis semi-cuantitativo por RT-PCR resultó en la expresión negativa de
HaDR6 bajo condiciones de estrés por sequía (Shi et al., 2009). Se estima que
posiblemente ambos FDT podrían ser componentes necesarios en la transducción de
señales en respuesta a estrés en H. ammodendron. La mutante l7tr perteneciente al
locus NHR1 de A. thaliana resultó afectada durante su germinación y establecimiento
bajo condiciones normales (figura 6A y B), siendo su fenotipo más retardado en
comparación de plantas silvestres, también durante su germinación y establecimiento
en presencia de ABA esta mutante presentó sensibilidad (Figura 10C y D).
Adicionalmente, en nuestro estudio un análisis semi-cuantitativo por RT-PCR, resultó
en la expresión negativa del gen L7TR en la mutante nhr1 (Figura 17), hay que
recordar que la mutante nhr1 presenta tolerancia a sequía y contiene altos niveles de
ABA. Posiblemente L7TR se encuentra reprimido en la mutante nhr1 como un
mecanismo de adaptación para tolerar el estrés hídrico en donde al parecer ABA
está involucrado. Este mecanismo en la mutante nhr1 y la mutante l7tr repercuten de
forma directa o indirecta durante la germinación y establecimiento de plántulas de A.
thaliana. Se han reportado que las proteínas transmembranales con siete dominios
podrían ser receptores de ABA en donde funcionan como transductores de señales
en la célula (Liu et al., 2007). Así también, se sugiere que este tipo de proteínas
están involucradas en la expresión de genes de estrés oxidativo de respuesta a ABA
(Dabrowska 2010). En este estudio, se observó que la proteína L7TR del locus NHR1
contiene siete dominios transmembranales y la mutante l7tr y nhr1 son sensibles a
ABA. Un modelo del probable mecanismo se discute en la Figura 17. Por otro lado,
el análisis de la expresión del gen L7TR en la mutante l7tr presentó niveles de
expresión similares a plantas silvestres. Se esperaba que en la mutante pérdida de
62
función del gen L7TR no se llevara a cabo la transcripción del gen, o que los niveles
del transcrito disminuyeran, hipótesis que no se cumplió, el mecanismo se
desconoce, y no hay una posible explicación al momento. Una alternativa para
comprobar que el fenotipo l7tr es causado por la disminución en los niveles del
transcrito, es silenciar el gen por medio de ARN de interferencia, o mediante el
análisis de diferentes líneas de T-DNA en el mismo gen pero con inserción en
diferente sitio, el sitio recomendable sería en la región codificante, ya que la inserción
en del T-DNA en la región promotora no asegura que la transcripción se bloquee.
Por otro lado, se sabe que las enzimas AO catalizan la des aminación de poliaminas,
los cuales son componentes esenciales del crecimiento y proliferación celular
(Bouchereau et al., 1999). La función fisiológica de diversas AO se debe a los
productos derivados de las reacciones que catalizan, como por ejemplo, en plantas,
la producción de H2O2 derivado de la oxidación de poliaminas se relaciona con la
maduración y lignificación de la pared y muerte celular, mientras que otras moléculas
derivadas funcionan en la síntesis de metabolitos secundarios y tolerancia a estrés
(Cona et al., 2006). La producción de H2O2 generado por la enzima amino oxidasa
induce el cierre de estomas mediante ABA en Vicia faba (An et al., 2007). Además, la
actividad de AO es inducida por ABA exógeno, ésta a su vez promueve la
producción de H2O2 y Ca2+ en el citosol en células guarda, en donde la putrescina
sirve como sustrato (An et al., 2007). En A. thaliana la interacción entre ABA, H2O2
endógeno y NO (óxido nítrico) también inducen el cierre de estomas (Bright et al.,
2006). Sin embargo, no hay reportes en A. thaliana sobre una posible función de AO
en respuesta a estrés abiótico. En el presente estudio, un análisis fisiológico durante
la germinación y establecimiento con la mutante pérdida de función a-ox muestran
que la mutante tiene germinación y establecimiento retardado bajo condiciones
normales de crecimiento (Figura 6 C y D), sorpresivamente, en presencia de ABA, la
mutante presenta un mayor porcentaje de establecimiento (Anexo 6). Esto sugiere
que A-OX podría estar involucrado en procesos de germinación y establecimiento en
A. thaliana, sin embargo, el mecanismo de acción se desconoce. Por otro lado,
durante el establecimiento en presencia de ABA, el comportamiento podría
explicarse ya que el ABA induce la actividad de AO’s lo que a su vez genera H2O2
63
como consecuencia de su actividad. Al estar ausente A-OX en la mutante a-ox causa
una disminución en los niveles de H2O2 por lo que la señal en la ruta de ABA se ve
afectada lo que podría estar causando la insensibilidad en la mutante, repercutiendo
en un establecimiento prematuro en presencia de ABA. Sin embargo, esto no
explicaría la germinación y establecimiento retardado bajo condiciones normales por
lo que se requieren análisis posteriores.
Figura 17. Modelo esquemático de la proteína L7TR como posible receptor de ABA. De acuerdo
a lo que se conoce en la literatura y a los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha propuesto
el siguiente modelo: A) la proteína L7TR, contiene siete dominios transmembranales y se localiza en
la membrana plasmática formando el complejo Gαβγ. La unión de ABA a L7TR resulta en la
disociación del complejo en Gα y Gβγ lo que resulta en la activación de los efectores de ABA (?,
desconocidos) los que a su vez inducen la expresión de genes en respuesta a estrés oxidativo en la
célula, estos mantienen niveles bajos de ROS y permiten un desarrollo adecuado de la planta durante
la germinación y establecimiento, así como la respuesta ante ABA. B) El truncamiento de L7TR, ya
sea por T-DNA o por la mutación nhr1, genera la disminución en la síntesis de transcritos de este gen
y por ende niveles bajos de la proteína, lo que inhibe el mecanismo de señalización por ABA, de tal
L7TR
?
GENES DE ESTRÉS
OXIDATIVO
Respuesta a ABA
ROS
Germinación y Establecimiento
ABA
L7TR
?
GENES DE ESTRÉS
OXIDATIVO
Sensibilidad a ABA
ROS
MenorGerminación y
Establecimiento
ABA
T-DNAnhr1
A B
64
manera que la expresión de los genes en respuesta a estrés oxidativo decae y los niveles de ROS se
incrementan, esto podría estar afectando la germinación y el establecimiento y la respuesta a ABA en
las plántulas de A. thaliana. GDP, difosfato de guanosina; GTP, 5’ trifosfato de guanosina (Liu et al.,
2007; Shi et al., 2009; Dabrowska 2010).
9.- CONCLUSIONES
1- Determinar la homocigosis y generar líneas homocigotas de las mutantes de
pérdida de función por T-DNA de los genes localizados en la región caliente
nhr1.Las líneas T-DNA: pl, ank y ppr resultaron ser heterocigotas de las cuales se
logró obtener líneas homocigotas para pl y ank, sin embargo, la mutante ppr resultó
ser de mutación letal en plantas homocigotas, por lo que no se logró obtener una
línea homocigota solamente para esta mutante. Finalmente las mutantes lip, l7tr, a-
ox, myb-1, myb-3, apx2-p, apx2-5, mcm y pwwp son heterocigotas y se obtuvieron
líneas homocigotas de las mismas. La línea SALK_130595C r60S es de mutación
homocigota (TAIR, 2013).
2- Determinar si los genes pertenecientes a la región caliente nhr1 carentes de
línea T-DNA están mutados en la mutante nhr1. Los genes ARNt-ser-CGA
(At3g09585), PRP (At3g09590), ARNt-ser-TGA (At3g09595) y HELICASA
(At3g09620), pertenecientes a la “región caliente” nhr1 no están modificados, por lo
tanto se concluye que no son los causantes del fenotipo nhr1.
3- Conocer el ciclo de vida (germinación, establecimiento y emisión de escapo)
de las mutantes T-DNA en los genes pertenecientes a la región caliente nhr1.
La pérdida de función en los genes L7TR y A-OX, causa un efecto retardo en la
germinación y el establecimiento bajo condiciones normales de crecimiento en A.
thaliana. Adicionalmente, la inserción por T-DNA en el gen ANK genera un
establecimiento de plántulas retardado.
4- Conocer la respuesta a estrés (salinidad, deshidratación y ABA) de las
mutantes T-DNA en los genes pertenecientes a la región caliente nhr1. La
pérdida de función en los genes ANK y r60S genera sensibilidad a ABA durante la
65
germinación y establecimiento en A. thaliana y durante la germinación por la
mutación en el gen L7TR. La pérdida de función en los genes MCM y A-OX ocasiona
una menor sensibilidad durante el establecimiento de plántulas de A. thaliana. La
mutación por T-DNA en el gen ANK también causa una sensibilidad a estrés salino
durante el establecimiento y supervivencia de plántulas, así como menor
transpiración.
5- Proponer genes candidatos para albergar la mutación nhr1 y conocer si
algunos de estos está mutado en la mutante nhr1.Los genes candidatos para
albergar la mutación nhr1 son ANK, L7TR y A-OX debido al mayor número de
procesos fisiológicos afectados. De los genes candidatos secuenciados hasta el
momento el gen L7TR alberga dos mutaciones y el gen A-OX no alberga mutación
alguna. La secuenciación del gen ANK está en proceso.
6- Determinar si la expresión del ARNm del gen candidato a albergar la
mutación nhr1 se encuentra reprimida en la mutante T-DNA perteneciente a la
región nhr1.El gen candidato L7TR no está inhibido a nivel de acumulación de
transcritos en la mutante l7tr.
7- Determinar por análisis fenotípico en mutantes T-DNA, cuál es el gen mutado
en la “región caliente” de la nhr1. Ninguna de las mutantes T-DNA pertenecientes
al locus NHR1 presenta comportamientos contrarios a la mutante nhr1 excepto por la
mutante a-ox y mcm durante el establecimiento en presencia de ABA. Sin embargo
los análisis fisiológicos indican que los genes ANK y L7TR podrían ser portadores de
la mutación en la nhr1 por verse afectados en un mayor número de procesos
fisiológicos. De estos genes, L7TR está mutado en dos sitios y además la expresión
esta reprimida en la nhr1 por lo que posiblemente las mutaciones en este gen sean
las causantes del fenotipo nhr1. Es necesario realizar análisis posteriores para
comprobar si es este gen el causante del fenotipo nhr1. Estos análisis podrían incluir
la sobreexpresión y el silenciamiento del gen L7TR en plantas silvestres, así como la
sobreexpresión del gen en la nhr1 y esperar a que se restaure el fenotipo silvestre.
66
La hipótesis propuesta en el presente estudio se rechaza, debido a que ninguna de
las mutantes presentó un comportamiento opuesto a la nhr1. Esto podría deberse a
redundancia génica, en donde algún gen homólogo pudiera estar reemplazando la
función del gen truncado.
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10- ANEXOS
1000
1500
(pb)
500
700
M 1 2 3 4 Col 1 2 3 4 Col M
l7tr l7tr
Lp + Rp Rp + LBb1
WT (1260pb)
T-DNA (690pb)
M 1 2 3 4 Col 1 2 3 4 Col M
a-ox a-ox
1031
WT (983pb)
(pb)
900800700600500
400
300
T-DNA (450pb)
Lp + Rp Rp + LBb1
M 1 2 3 Col 4 1 2 3 Col 4 M
750
1000
1500
500
WT (1226pb)
T-DNA (758pb)
pl
Lp + Rp Rp + LBb1
pl(pb)
plplA
B
C
75
Anexo 1. Homocigosis de las mutantes T-DNA. A) 1-4 muestras de la mutante pl y Col (silvestre).
oligonucleótidos Lp (primer izquierdo) y Rp (primer derecho) para amplificar el fragmento del gen PL
silvestre -WT- (1216pb), los oligonucleótidos LBb1 (primer diseñado en la región T-DNA) y Rp para
amplificar el fragmento del T-DNA (758pb). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de
1216pb es silvestre (Col). Las muestras 1 y 3 amplifican únicamente el fragmento de 758pb, son
homocigotas. Las muestras 2 y 4 amplifican ambos fragmentos, por lo tanto son heterocigotas. B) 1-4
muestras de la mutante l7tr. Oligonucleótidos Lp y Rp para amplificar el fragmento del gen L7TR
silvestre -WT- (1260pb), los oligonucleótidos LBb1 y Rp para amplificar el fragmento del T-DNA
1000
1500
(pb)
500
700
M 1 2 3 4 Col 1 2 3 4 Col M
apx2-p apx2-p
Lp + Rp Rp + LBb1
WT (1200pb)
T-DNA (800pb)
1000
1500
(pb)
500
700
M 1 2 3 Col 1 2 3 4 Col M
apx2-5
Lp + Rp Rp + LBb1
250
WT (1080pb)
T-DNA (500pb)
apx2-5
D
E
1000750
1500
M 1 2 3 4 Col 1 2 3 4 Col M (pb)
pwwp pwwp
Lp + Rp Rp + LBb1
T-DNA (560)500
250
WT (1179)
M Col1 Col2 1 2 3 4 Col1 Col4 1 2 3 4 M
mcm mcm
Rp + LBb1 r18s
T-DNA (700)
r18s(387pb)
F
H
750
500
250
Lp + Rp
20001500
500
1000
750
M Col - 1 2 3 4 M
1000
Rp+LBb1
WT (1239)
T-DNA (883)
(pb)ppr
M Col - 1 2 3 4 M (pb)ppr
G
76
(690pb). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de 1260pb es silvestre. Las muestras 1- 4
amplifican únicamente el fragmento de 690pb, son homocigotas. No hay muestras heterocigotas en
este caso. C) 1-4 muestras de la mutante a-ox. Oligonucleótidos Lp y Rp para amplificar el fragmento
del gen A-OX silvestre -WT- (983pb), los oligonucleótidos LBb1 y Rp para amplificar el fragmento del
T-DNA (450pb). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de 983pb es silvestre. Las
muestras 1- 4 amplifican únicamente el fragmento de 450pb, son homocigotas. No hay muestras
heterocigotas en este caso. D) 1-4 muestras de la mutante apx2-p. Oligonucleótidos Lp y Rp para
amplificar el fragmento del gen APX2-P silvestre -WT- (1200pb), los oligonucleótidos LBb1 y Rp para
amplificar el fragmento del T-DNA (800pb). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de
1200pb silvestre. Las muestras 1- 4 amplifican únicamente el fragmento de 800pb, son homocigotas.
No hay muestras heterocigotas en este caso. E) 1-4 muestras de la mutante apx2-5. Oligonucleótidos
Lp y Rp para amplificar el fragmento del gen APX2-5 silvestre -WT- (1080pb), los oligonucleótidos
LBb1 y Rp para amplificar el fragmento del T-DNA (500pb). La muestra que amplifica únicamente el
fragmento de 1080pb es silvestre. Las muestras 1- 4 amplifican únicamente el fragmento de 500pb,
son homocigotas. No hay muestras heterocigotas en este caso. F) 1-4 muestras de la mutante mcm.
Oligonucleótidos LBb1 y Rp para amplificar el fragmento del T-DNA (700pb). r18s, se utilizó como
control para verificar la viabilidad del ADN, el fragmento amplificado fue de 387pb. En este caso
solamente se verifico la presencia del inserto T-DNA, ya que las muestras provienen de líneas
homocigotas anteriormente verificadas. G) 1-4 muestras de la mutante ppr. Oligonucleótidos Lp y Rp
para amplificar el fragmento del gen PPR silvestre -WT- (1239pb), los oligonucleótidos LBb1 y Rp para
amplificar el fragmento del T-DNA (883pb). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de
1239pb es silvestre. Las muestras 1 y 2 amplifican únicamente el fragmento de 883pb, son
homocigotas. Las muestras 3 y 4 amplifican ambos fragmentos, por lo tanto son heterocigotas. Es
importante mencionar que las plantas homocigotas para esta mutante presentaron muerte por
etiolamiento a los siete días DS. H) 1-4 muestras de la mutante pwwp. Oligonucleótidos Lp y Rp para
amplificar el fragmento del gen PWWP silvestre -WT- (1179pb), los oligonucleótidos LBb1 y Rp para
amplificar el fragmento del T-DNA (560). La muestra que amplifica únicamente el fragmento de
1179pb es silvestre. Las muestras 1- 4 amplifican únicamente el fragmento de 560pb, son
homocigotas. No hay muestras heterocigotas en este caso. En todos los casos, se utilizó Col-0 (Col)
como control silvestre. M pertenece al carril con marcador de peso molecular en número de pares de
bases (pb). El bandeo son los productos de PCR en un gel de Agarosa al 1.2%.
77
PROTEÍNA RELACIONADA A PATOGENICIDAD (PRP)
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
A
tRNA-TGA
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
B
78
Anexo 2. Los genes PRP, ARNt-TGA y HELICASA sin línea T-DNA, no albergan la mutación
nhr1. A) Comparación de las secuencia de los genes PRP (con una longitud de 820pb, B) ARNt-TGA
(con una longitud de 709pb) y C) HELICASA (con una longitud de 1024pb). En todos los casos se
secuenció el gen correspondiente en la mutante nhr1. La flecha indica el sitio de inicio de la
transcripción, a partir de la flecha rio arriba pertenece a la región promotora. La secuencia de
referencia (silvestre, Col-0) fue la obtenida de la base de datos en TAIR. Las secuencia nhr1
corresponde a la mutante de estudio. Las cajas en negro indican el alineamiento perfecto de las
secuencias sin cambios. Los números al final de la secuencia indican la longitud de nucleótidos. Se
utilizó ADN genómico de plantas nhr1. Para analizar las secuencias, se realizó un alineamiento con el
programa Clustal X2 y un consenso de las secuencias con GenDoc. Para la secuenciación se utilizó la
técnica Primer Walking.
HELICASA
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
C
79
Anexo 3. La pérdida de función en los genes PL, ANK, LIP MYB, MCM, r60s PPR y APX2
pertenecientes al locus NHR1 no afecta la germinación bajo condiciones normales de
crecimiento. Tiempo de germinación de las mutantes T-DNA y hnr1 vs Col-0. A) Tiempo de
germinación de las mutantes pl (triángulos), ank (cuadrados vacíos), lip (círculos vacíos), nhr1
(círculos rellenos) y Col-0 (cuadrados rellenos). B) Tiempo de germinación de las mutantes myb-1
(triángulos), myb-3(cuadrados vacíos), mcm (círculos vacíos), nhr1 (círculos rellenos) y Col-0
(cuadrados rellenos). C) Tiempo de germinación de las mutantes r60s (triángulos), ppr1 (cuadrados
vacíos), ppr2 (círculos vacíos), nhr1 (círculos rellenos) y Col-0 (cuadrados rellenos). D) Tiempo de
germinación de las mutantes apx2-p (triángulos), apx2-5h (cuadrados vacíos), nhr1 (círculos rellenos)
y Col-0 (cuadrados rellenos). En todos los casos las mutantes T-DNA presentó comportamientos
similares a Col-0 y se puede observar la germinación retardada de la mutante nhr1. La germinación
fue medida y graficada en porcentajes del total de número de semillas germinadas. Se cuantificó cada
12 h hasta las 96 h DS. Las semillas fueron germinadas in vitro en medio MS en cajas Petri. Se
realizaron dos experimentos con tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los
Ger
min
ació
n (
%)
Ger
min
ació
n (
%)
Ger
min
ació
n (
%)
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96 0 24 36 48 60 72 84 96
0 24 36 48 60 72 84 96 0 24 36 48 60 72 84 96
A
C
B
D
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
ppr1
ppr2
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
myb-1
myb-3
mcm
80
gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación
de medias Tukey con un α= 0.5.
Anexo 4. La pérdida de función en los genes PL, ANK, LIP MYB, MCM, r60s PPR y APX2
pertenecientes al locus NHR1 no afecta el establecimiento bajo condiciones normales de
crecimiento. Tiempo de establecimiento de las mutantes T-DNA y hnr1 vs Col-0. A) Tiempo de
establecimiento de las mutantes pl (triangulo), ank (cuadrado vacío), lip (circulo vacío), nhr1 (circulo
relleno) y Col-0 (cuadrado relleno). B) Tiempo de establecimiento de las mutantes myb-1 (triangulo),
myb-3(cuadrado vacío), mcm lip (circulo vacío), nhr1 (circulo relleno) y Col-0 (cuadrado relleno). C)
Tiempo de establecimiento de las mutantes r60s (triangulo), ppr1 (cuadrado vacío), ppr2 (circulo
vacío), nhr1 (circulo relleno) y Col-0 (cuadrado relleno). D) Tiempo de establecimiento de las mutantes
apx2-p (triangulo), apx2-5h (cuadrado vacío), nhr1 (circulo relleno) y Col-0 (cuadrado relleno). En
todos los casos las mutantes T-DNA presentó comportamientos similares a Col-0 y se puede observar
el establecimiento retardado de la mutante nhr1. El establecimiento fue medido y graficada en
porcentajes del total de número de plántulas establecidas. Se cuantificó cada 12 h hasta las 120 h DS.
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
A
C
B
D
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
r60s
ppr1
ppr2
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 120
Tiempo (h)
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
myb-1
myb-3
mcm
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
81
Las plántulas fueron crecidas in vitro en medio MS en cajas Petri. Se realizaron dos experimentos con
tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los gráficos son el promedio y
desviación estándar. Los gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un análisis de
varianza y una comparación de medias Tukey con un α= 0.5.
Anexo 5. La mutación por T-DNA en los genes PL y LIP no afecta la respuesta a ABA durante la
germinación y el establecimiento de plántulas de A. thaliana. A), germinación bajo condiciones
normales (0 nM ABA) de las mutantes pl, lip, Col-0 y nhr1. Se observa un comportamiento de pl y lip
similar a Col-0, mientras que la mutante nhr1 presenta germinación retardada. B), establecimiento
bajo condiciones normales (0 nM ABA) de las mutantes pl, lip, Col-0 y nhr1, se observa un
comportamiento de pl y lip similar a Col-0, mientras que la mutante nhr1 presenta un establecimiento
retardado. C), germinación en presencia de 400 nM de ABA de las mutantes pl, lip, Col-0 y nhr1, se
observa un comportamiento de pl y lip similar a Col-0, mientras que se puede observar la sensibilidad
a ABA con germinación retardada en la mutante nhr1. D), establecimiento en presencia de 400 nM de
ABA de las mutantes pl, lip, Col-0 y nhr1. Se observa un comportamiento similar a Col-0 en la mutante
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
A
C D
AB
A (
0 n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
B
AB
A (
40
0 n
M)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
lip
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
lip
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
lip
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
pl
lip
82
lip y pl, además se observa claramente el comportamiento de sensibilidad de nhr1. La germinación y
el establecimiento fueron medidos y graficados en porcentajes del total de número de semillas
germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el
establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 240 h DS. Los cuadrados rellenos corresponden a
Col-0, los círculos a nhr1, los triángulos a pl, los cuadrados vacíos a lip. Las semillas fueron
germinadas in vitro en medio MS sin (A y B) y con 400 nM (C y D) de ABA. Se realizaron dos
experimentos con tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los gráficos son el
promedio y desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias
Tukey con un α= 0.5.
Anexo 6. La mutación en el gen A-OX, causa menor sensibilidad a ABA durante el
establecimiento en A. thaliana. Efecto de ABA en la mutante a-ox, myb-1 y myb-3. A), germinación
bajo condiciones normales (0 nM ABA) de las mutantes a-ox, myb-1, myb-3, Col-0 y nhr1. Se observa
un comportamiento de myb-1 y myb-3 similar a Col-0, mientras que la mutante a-ox y nhr1 presentan
un comportamiento retardado. B), establecimiento bajo condiciones normales (0 nM ABA) de las
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
A
C D
AB
A (
0 n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
B
AB
A (
40
0 n
M)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
83
mutantes a-ox, myb-1, myb-3, Col-0 y nhr1, se observa un comportamiento de myb-1 y myb-3 similar a
Col-0, mientras que la mutante a-ox y nhr1 presentan un comportamiento retardado. C), germinación
en presencia de 400 nM de ABA de las mutantes a-ox, myb-1, myb-3, Col-0 y nhr1, se observa un
comportamiento de a-ox, myb-1 y myb-3 similar a Col-0, mientras que se puede observar la
sensibilidad a ABA de la mutante nhr1 con un comportamiento retardado. D), establecimiento en
presencia de 400 nM de ABA de las mutantes a-ox, myb-1, myb-3, Col-0, se observa un
comportamiento de myb-1 y myb-3 similar a Col-0, sin embargo, la mutante a-ox presenta menor
sensibilidad a ABA en comparación de Col-0, además se observa claramente el comportamiento de
sensibilidad de nhr1 con un establecimiento casi nulo. La germinación y el establecimiento fueron
medidos y graficados en porcentajes del total de número de semillas germinadas o establecidas. La
germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h
hasta las 240 h DS. Los cuadrados rellenos corresponden a Col-0, los círculos a nhr1, los triángulos a
a-ox, los cuadrados vacíos a myb-1 y los círculos vacíos a myb-3. Las semillas fueron germinadas in
vitro en medio MS sin (A y B) y con 400 nM (C y D) de ABA. Se realizaron dos experimentos con tres
repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). . Los gráficos son el promedio y
desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias Tukey con un
α= 0.5.
84
Anexo 7. La mutación en el gen PPR no afecta la respuesta a ABA en A. thaliana. Efecto de ABA
en la mutante ppr1 y ppr2. A), germinación y B), establecimiento bajo condiciones normales (0 nM
ABA). C), germinación y D), establecimiento en presencia de 400 nM de ABA de la mutante ppr1,
ppr2, Col-0 y nhr1. Se puede observar el efecto retardado ocasionado por ABA durante la germinación
y el establecimiento, sin embargo el fenotipo de las mutantes ppr1 y ppr2 presentan un
comportamiento similar a Col-0, mientras que se observa claramente el fenotipo de sensibilidad de la
mutante nhr1. La germinación y el establecimiento fueron medidos y graficados en porcentajes del
total de número de semillas germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta
las 96 h DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 240 h DS. Los cuadrados rellenos
corresponden a Col-0, los círculos a nhr1, los triángulos a ppr1 y los cuadrados vacíos a ppr2. Las
semillas fueron germinadas in vitro en medio MS sin (A y B) y con 400 nM (C y D) de ABA. Se
realizaron dos experimentos con tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). ).
Los gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una
comparación de medias Tukey con un α= 0.5.
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
A
C D
AB
A (
0 n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
BA
BA
(4
00
nM
)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr1
ppr2
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr1
ppr2
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr1
ppr2
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr1
ppr2
85
.
Anexo 8. La mutación en el gen APX2 no afecta la respuesta a ABA en A. thaliana. Efecto de
ABA en la mutante apx2-p y apx2-5h. A), germinación y B), establecimiento bajo condiciones
normales (0 nM ABA). C), germinación y D), establecimiento en presencia de 400 nM de ABA de la
mutante apx2-p, apx2-5h, Col-0 y nhr1. La germinación y el establecimiento fueron medidos y
graficados en porcentajes del total de número de semillas germinadas o establecidas. La germinación
se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 240 h
DS. Los cuadrados rellenos corresponden a Col-0, los círculos a nhr1, los triángulos a apx2-p y los
cuadrados vacíos a apx2-5h. Se realizaron dos experimentos con tres repeticiones cada uno con 20
semillas por genotipo (n = 20). ). Los gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un
análisis de varianza y una comparación de medias Tukey con un α= 0.5.
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Ger
min
ació
n (
%)
0 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo (h)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
Tiempo (h)
A
C D
AB
A (
0n
M)
Esta
ble
cim
ien
to (
%)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
Tiempo (h)
BA
BA
(4
00
nM
)
0 60 72 84 96 108 168 192 216 240
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
apx-p
apx-5h
86
Anexo 9. La mutación por T-DNA no afecta la respuesta a salinidad de las mutantes pl, ank,
lip y l7tr. Efecto de NaCl en la mutantes pl, lip ,l7tr, nhr1 y Col-0. Los cuadrados rellenos
corresponden a Col-0, los círculos rellenos a nhr1, los triángulos rellenos a pl, los triángulos vacíos a
lip y los círculos vacíos a l7tr. A), germinación bajo condiciones normales (0 mM NaCl). Se observa un
comportamiento de pl y lip similar a Col-0, mientras que la mutante l7tr y nhr1 presentan un
comportamiento retardado. B), establecimiento bajo condiciones normales, se observa un
comportamiento de pl y lip similar a Col-0, mientras que la mutante l7tr y nhr1 presentan un
comportamiento retardado. C), germinación en presencia de 100 mM de NaCl de las mutantes pl, lip,
l7tr, nhr1 y Col-0, se observa un comportamiento de pl, lip, y l7tr similar a Col-0, mientras que se
puede observar la sensibilidad con un comportamiento retardado en la mutante nhr1. D),
establecimiento en presencia de 100 mM de NaCl de las mutantes pl, lip, l7tr, nhr1 y Col-0. Se
observa un comportamiento similar a Col-0 en la mutante pl, lip, l7tr, y se observa claramente el
comportamiento de sensibilidad de nhr1. La germinación y el establecimiento fueron medidos y
graficados en porcentajes del total de número de semillas germinadas o establecidas. La germinación
se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 336 h
DS. Las semillas fueron germinadas in vitro en medio MS sin (A y B) y con 100 mM (C y D) de NaCl.
Se realizaron dos experimentos con tres repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20).
0 24 36 48 60 72 84 96 0 48 60 72 96 120 144 168 336
Ger
min
ació
n %
Esta
ble
cim
ien
to %
Esta
ble
cim
ien
to %
horas horas
Ger
min
ació
n %
0 24 36 48 60 72 84 96 0 48 60 72 96 120 144 168 336
A
C
B
D
NaC
l(0
nM
)N
aCl(
10
0 n
M)
horas horas
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
l7tr
0
20
40
60
80
100 Col-0
nhr1
pl
lip
l7tr
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
l7tr
0
20
40
60
80
100
Col-0
nhr1
pl
ank
lip
l7tr
87
Los gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una
comparación de medias Tukey con un α= 0.5.
Anexo 10. La mutación por T-DNA no afecta la respuesta a salinidad de las mutantes a-ox,
myb-1, myb3 mientras que la mutante mcm presenta una ligera insensibilidad. Efecto de NaCl en
la mutantes a-ox, myb-1, Myb-3, mcm, nhr1 y Col-0. Los cuadrados rellenos corresponden a Col-0,
los círculos rellenos a nhr1, los triángulos rellenos a a-ox, los cuadrados vacíos a myb-1, los
triángulos vacíos a myb-3 y los círculos vacíos a mcm. A), germinación bajo condiciones normales (0
mM de NaCl). Se observa un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA, excepto a-
ox y la mutante nhr1 presentando un comportamiento retardado. B), establecimiento bajo condiciones
normales, Se observa un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA, excepto a-ox y
la mutante nhr1 presentando un comportamiento retardado. C), germinación en presencia de 100 mM
de NaCl , Se observa un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA, mientras que se
puede observar la sensibilidad con un comportamiento retardado en la mutante nhr1. D),
establecimiento en presencia de 100 mM de NaCl, Se observa un comportamiento similar a Col-0 en
todas las mutante T-DNA, mientras que se observa claramente el comportamiento de sensibilidad de
0 24 36 48 60 72 84 120 0 48 60 72 96 120 144 168 336
Ger
min
ació
n %
Esta
ble
cim
ien
to %
Esta
ble
cim
ien
to %
horas horas
Ger
min
ació
n %
0 24 36 48 60 72 84 120 0 48 60 72 96 120 144 168 336
A
C
B
D
NaC
l(0
nM
)N
aCl(
40
0n
M)
horas horas
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
a-ox
myb-1
myb-3
mcm
88
nhr1. La germinación y el establecimiento fueron medidos y graficados en porcentajes del total de
número de semillas germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h
DS, el establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 336 h DS. Las semillas fueron germinadas in
vitro en medio MS sin (A y B) y con 100 mM (C y D) de NaCl. Se realizaron dos experimentos con tres
repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los gráficos son el promedio y
desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias Tukey con un
α= 0.5.
Anexo 11. La mutación por T-DNA no afecta la respuesta a salinidad de las mutantes ppr,
apx-p, r60s, pwwp. Efecto de NaCl en la mutantes ppr, apx-p, r60s, pwwp, nhr1 y Col-0. Los
cuadrados rellenos corresponden a Col-0, los círculos rellenos a nhr1, los triángulos rellenos a ppr,
los cuadrados vacíos a apx-p, los triángulos vacíos a r60s y los círculos vacíos a pwwp. A),
germinación bajo condiciones normales (0 mM de NaCl). Se observa un comportamiento similar a Col-
0 en todas las mutante T-DNA, mientras que la nhr1 se ve retardad. B), establecimiento bajo
condiciones normales, Se observa un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA,
mientras que la nhr1 se ve retardad. C), germinación en presencia de 100 mM de NaCl , Se observa
un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA, mientras que se puede observar la
sensibilidad con un comportamiento retardado en la mutante nhr1. D), establecimiento en presencia
0 24 36 48 60 72 84 120 0 48 60 72 96 120 144 168 336
Ger
min
ació
n %
Esta
ble
cim
ien
to %
Esta
ble
cim
ien
to %
horas horas
Ger
min
ació
n %
0 24 36 48 60 72 84 120 0 48 60 72 96 120 144 168 336
A
C
B
D
NaC
l(0
nM
)N
aCl(
40
0n
M)
horas horas
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr
apx-p
60s
pwwp
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr
apx-p
60s
pwwp
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr
apx-p
60s
pwwp
0
20
40
60
80
100
120
Col-0
nhr1
ppr
apx-p
60s
pwwp
89
de 100 mM de NaCl, Se observa un comportamiento similar a Col-0 en todas las mutante T-DNA,
mientras que se observa claramente el comportamiento de sensibilidad de nhr1. La germinación y el
establecimiento fueron medidos y graficados en porcentajes del total de número de semillas
germinadas o establecidas. La germinación se cuantificó cada 12 h hasta las 96 h DS, el
establecimiento se cuantificó cada 12 h hasta las 336 h DS. Las semillas fueron germinadas in vitro en
medio MS sin (A y B) y con 100 mM (C y D) de NaCl. Se realizaron dos experimentos con tres
repeticiones cada uno con 20 semillas por genotipo (n = 20). Los gráficos son el promedio y
desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias Tukey con un
α= 0.5.
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
l7tr
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
a-ox
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
Tran
spir
ació
n (%
)
Tran
spir
ació
n (%
)
Tran
spir
ació
n (%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min)
Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min)
A B C
D E F
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
lip
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
pl
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
apx2-p
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
r60s
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
pwwp
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Tran
spir
ació
n (%
)
Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min)
G H I
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
mcm
0
5
10
15
20
25
30
Col-0
nhr1
ppr1
90
Anexo 12. Mutantes T-DNA sin cambios en la transpiración. Ensayo pérdida de agua en las líneas
T-DNA. A) La mutante pl, presentó un 20% de transpiración a los 140 minutos, B) la mutante lip un
19.5%, C) la mutante l7tr un 19.4%, D) la mutante a-ox un 20.8%, E) la mutante r60s un 20.1%, F) la
mutante apx2-p un 22%, G) la mutante ppr un 21.3%, H) la mutante mcm un 20.2% y I) la mutante
pwwp un 21.4%. Plantas control (Col-0) presentaron un 20.5% y la mutante nhr1 con menor
transpiración, un 15%. Todas las líneas T-DNA presentaron comportamientos similares a plantas
silvestres. La transpiración se graficó en porcentajes calculando el peso fresco inicial menos el peso
fresco en cada cuantificación. ). Los gráficos son el promedio y desviación estándar. Se realizó un
análisis de varianza y una comparación de medias Tukey con un α= 0.5.
Anexo 13. El gen A-OX no es el causante del fenotipo nhr1. Comparación de las secuencias del
gen A-OX, la secuencia tiene un tamaño de 1998pb. Se secuenció el gen A-OX en la mutante nhr1 La
flecha indica el sitio de inicio de la transcripción, a partir de la flecha rio arriba pertenece a la región
promotora. La secuencia de referencia (silvestre, Col-0) fue la obtenida de la base de datos en TAIR.
Las secuencia nhr1 corresponde a la mutante de estudio. Las cajas en negro indican el alineamiento
perfecto de las secuencias sin cambios. Los números al final de la secuencia indican la longitud en
AMINO OXIDASA
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
Col-0
nhr1
91
nucleótidos. Se utilizó ADN genómico de plantas nhr1 con 10 meses de edad. Para la secuenciación
se utilizó la técnica Primer Walking. Para analizar las secuencias, se realizó un alineamiento con el
programa Clustal X2 y un consenso de las secuencias con GenDoc. No se encontró cambio en la
secuencia de la mutante.
