Vai troø vaø yù nghóa cuûa caùc xeùt nghieäm sinh hoïc phaân töû trong chaån ñoaùn vaø theo doõi ñieàu trò beänh vieâm gan sieâu

vi B vaø C BS. TS. Phạm Hùng Vân(1)

(1) Giaûng vieân Boä Moân Vi Sinh, Khoa Y, ÑHYD TP. HCMChuû nhieäm toå Boä Moân Vi Sinh, Khoa ÑDKTYHPhoù phoøng thí nghieäm trung taâm ÑHYDThaønh vieân chính cuûa ANSORP vaø ARFIDCoá vaán khoa hoïc Coâng Ty NAM KHOA

WHO 2001

Nhieãm vieâm gan sieâu vi B (HBV)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B

PCR phát hiện HBV-DNA

qPCR định lượng HBV-DNA

qPCR định lượng HBV-DNA

HBsAg [+]

HBVDNA [+]

qHBVDNA

105

ALT

ALT ALT Normal

Biopsieor Fibroscan

AFP

Bất thường

Điều trị

qHBVDNA/3th

LamR, AdfR105

Phát hiện đột biến precore

Phát hiện đột biến kháng thuốc

Schering-Plough

Nhieãm vieâm gan sieâu vi C (HCV)

Nhiễm HCV (100)(Phase cấp)

Mạn tính85% (85)

Xơ gan20% (17)

Ung thư ganXơ gan tiến triển

25% (4.5)

Khỏi

15% (15)

Ổn định80% (68)

Diễn tiến chậm75% (13)

Dieãn tieán nhieãm HCV

Genotype - 1Điều trị 48 tuần

Genotype non-1Điều trị 24 tuần

Định lượngHCV genotype

<2 log10

>2 log10 hay âm tínhHCV-RNA

Cuối điều trịHCV-RNA

Tuần 12Định lượng

Cân nhắc ngưng điều trị

Theo dõi sau 6 thángHCV-RNA

HCV RNA (+)Không đáp ứng

HCV RNA (+)Tái phát

HCV RNA (-)Đáp ứng

(2002 NIH Consensus Conference)

Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C

RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA

Ñònh genotype HCV

RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA

RT-PCR phaùt hieän HCV-RNA

Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà y học phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nhất là PCR và real-time PCR vào chẩn đoán và hổ trợ cho theo dõi điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi tại Việt Nam

PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ

Nguyên tắc PCR

1

2

3

4

n

2n

DNA đích

1 Biến tính (94oC )

2 Bắt cặp (55-65o C)

3 Kéo dài (72o C)

5’ 3’

3’ 5’

MồiTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2

PCR MIX

DNA đích (Template)

30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min

Phát hiện qua kích thước (điện di) hay qua trình tự (lai)

Ct curve

Standard curve

Melt curve

Real-time PCRchạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

Laser or UV

Camera

Thiết bị Real-time PCR

PrimersTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2

Real-time PCR MIX

Target DNA (Template)

Real-time PCR mix

Chất phát huỳnh quang

Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc

kieåu gen

Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen

Nuoâi caáy

PCR

PCR có đặc hiệu không?

PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy

Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật

Mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử

Tách chiết nucleic acid

Chạy PCR

Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Xác định Genotype HCV

Phương pháp real-time

Phương pháp InoLIPA

Phương pháp giải trình tự

HCV – cDNA5’NC

Real-time TQ PCR

HCV2 HCV1

HCV3

PCR sequencing

Ethanol precipitation

PCR product# 240bp

Kết hợp định lượng và định genotype HCV (bằng giải trình tự)

Xaùc ñònh genotype HCVso saùnh giaûi trình töï vaø InoLIPA (234

maãu)

Định genotype HCV hữu dụng lâm sàngchỉ có phương pháp giải trình tự 5’-NC

Phaân boá genotype HCVkeát quaû 918 maãu (21/9/2006-

29/12/2007)

1b56.96%

2c0.22%

1c0.76%

2a10.98%

2b1.09%

3a0.22%

4a0.11%

6a21.63%

6h0.22%

6b0.11%

1a7.70%

Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV

Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp real-time

Phương pháp giải trình tự

PCR product# 550bp

HBV – DNA264F 827R

PCR sequencing

827R

567bp

DTCS (Becman Coulter)

PCR95oC/5min94oC/30sec55oC/30sec72oC/1min72oC/10min

40X

Ethanol precipitation

CEQ 8000

Định genotype HBV và phát hiện đột biến kháng thuốc

Kỹ thuật giải trình tự vùng rt gene (Nam Khoa)

Phát hiện kháng Lamivudine, adefovirgiải trình tựgene PreS

Vừa phát hiện nhiều vị trí đột biến (kể cả heterozygote)

Vừa cho kết quả genotype

Xác định genotype HBV Tìm đột biến kháng thuốc của HBV

BS nên cho chỉ định tìm đột biến kháng thuốc và genotype HBV khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị lamuvidine

Kết quả xác định genotype HBVC

31%

B69%

Kết quả genotype của 455 mẫu huyết thanh bệnh nhân HBV-DNA [+]

Tyû leä % ñoät bieán YMDD455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]

29.89

8.796.59

0.45

54.28

0

10

20

30

40

50

60

204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB

Ñoät bieán YMDD 455 mẫu huyết thanh bn HBV-

DNA [+] Phaân bố theo lượng virus

Promoter1762, 1764

Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen HBV precore dài khoảng 250 bp

A B

Kết quả

• Có 37 mẫu huyết thanh HBeAg (-)• Đột biến precore

• Đột biến promoter

G1896A (+) Heterozygote G1896A (-)

18 5 14

A1762T/G1764A (+)

Heterozygote A1762T/G1764A(-)

18 5 14

Tri thức sẽ chẳng bao giờ đủNếu không đem trãi nghiệm với đời

Ước vọng cũng trở thành vô nghĩaNếu cứ ngồi ôm mộng giữa chơi vơi

“Knowing is not enough, we must applyWilling is not enough, we must do”

Goethe

Phan Kim Ngọc và Phạm Hùng Vân