BQ30

BASES MOLECULARES DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES

BQ29. Dra Cervera

Las distrofias musculares son una serie de enfermedades genticas con unas caractersticas comunes:

1.- Elevacin plasmtica de las enzimas musculares (CPK, ...): en el caso de la Distrofia muscular de Duchenne el aumento de CPK es de 60 veces y en portadoras de 3-4 veces.

2.- Debilidad muscular progresiva con desaparicin de tejido muscular y aumento de tejido conectivo. Casi siempre comienza con msculo esqueltico aunque finalmente tb haya afecc. cardiaca.

Dentro de las distrofias musculares se incluyen las distrofinopatas (alteraciones en el gen de la distrofina ) y las sarcoglicanopatas (en las que se produce la alteracin de otros mienbros del complejo distrofina glicoprotena ). Antiguamente estas enfermedades se clasificaban ms bien de una forma clnica:

1.- Distrofia muscular de Duchenne (DMD: Herencia LX. Muy grave. Inicio 4-5. Muerte por alt cardiacas)2.- Distrofia muscular de Becker (DMB: HLX. Ms leve. Inicio adolescencia. Clnica muy variada)3.- Distrofia muscular de las cinturas escapulares y pelvianas: cuadro muy heterogneo de herencia autosmica dominante o recesiva

4.- Distrofia muscular congnita: Ambas HAR. Dos variantes con clnica similar:

Clsica Fukuyama (Japn): incluye alteracin SNC5.- Distrofia muscular de Emery Dreyfuss (HLX)

6.- Distrofia miotnicaHoy se tiende a la clasificacin segn el defecto molecular:

1. Distrofinopatas- sarcoglicanopatas: incluira a las 4 primeras clnicas.2. Calpainopatas: alterac. Del gen de la calpana 3 (proteasa del musc. Esqueltico).3. Distrofias miotnicas: por alteral. del gen de la kinasa miotnica por expansin de tripletes.1.- DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

Se trata de una distrofia muscular progresiva de la musculatura proximal por

degeneracin de las fibras musculares y sustitucin por infiltracin grasa y tejido conectivo.

En un 10 15 % de casos existe afectacin aadida de msculo cardaco y retraso mental.

Suele debutar a los 3 aos y a los 7 9 ya necesitan silla de ruedas, falleciendo a los 18 20 aos.

Este mismo patrn es el que se presenta en la distrofia de Becker, slo que de forma ms leve que la de Duchenne, alcanzando incluso supervivencias de unos 60 aos.

CARACTERSTICAS MOLECULARES: La distrofina es una protena muscular que se encarga de dar estabilidad a la clula durante la contraccin relajacin, para que pueda soportar los cambios de longitud durante las mismas.

La distrofina no trabaja sola, sino que existe todo un complejo de protenas transmembrana que interactuan con ella, contribuyendo as tambin en la estabilizacin de la clula muscular.

Estas protenas se llaman sarcogliconoprotenas y su alteracin dar lugar a las sarcogliconopatas.

Este complejo se asocia por ltimo a la merosina o laminina 2, que se une a su vez con las protenas que forman la matriz extracelular. La falta de merosina tambin produce otras enfermedades (sobre todo la distrofia muscular congnita). El complejo distrofina-glicoproteina esta localizado en la membrana de la clula muscular.HISTORIA DE IDENTIFICACIN DEL GEN DE LA DISTROFINA:

Supuso un hito en la historia de la biologa molecular, ya que fue el primer gen que se logr identificar por clonacin posicional (1987). Se encuentra en el cromosoma X, en la regin Xp21. En 5 aos se logr clonar este gen que es enorme. Se consigui por los siguientes motivos:

una mejora en la metodologa

inversiones de la Sociedad de Distrofia Muscular ( de los Amish americanos, ya que en ellos es muy frecuente )

porque este gen posea caractersticas que facilitaban su clonaje:

por su forma de herencia ya se saba que estaba ligado al X, por lo que slo haba que buscar en este cromosoma

sus mutaciones son grandes delecciones, fciles de encontrar.

Las estrategias para el clonaje que se emplearon fueron tres:

1.- al analizar a las pocas niAs afectadas de DMD todas tenan como mutacin responsable una traslocacin entre un cromosoma (variable) y el cr X, y esa traslocacin siempre ocurra en p21 del cr X: as la mutacin se localiz en Xp21

2.- los niOs tienen en ese cr X delecciones tan grandes que era posible verlas en el cariotipo al microscopio!!! se vea que esas delecciones eliminaban toda la banda 21

3.- estrategia clsica: anlisis de ligamiento para identificar marcadores

Lo ms importante para localizar un gen cuando no se sabe cal es fabricar sonadas especficas para buscarlo; aqu se usaron por primera vez las sondas especficas de deleccin ( fragmento de DNA sano que se utiliza como sonda; si no hibrida con el DNA del paciente tenemos el diagnstico )

se coge DNA de un enfermo y se corta con enzimas de restriccin

se coge DNA de una persona sana y se corta con enzimas de restriccin

En el DNA sano aparecen fragmentos no presentes en el DNA enfermo, que los tiene deleccionados (esto se ve al hacer la electroforesis de ambos): se coge el fragmento del sano que no tiene el enfermo y se usa como sonda: si se rastrea el DNA de una persona con esa sonda y la sonda no hibrida querr decir que ese fragmento est deleccionado: diagnstico.

Otra estrategia para la bsqueda de sondas especficas, aparte de las sondas especficas de deleccin fue el uso del DNA de las nias con la traslocacin t(Xp21), que se saba que era rRNA.

Y gracias a estas sondas se logr clonar el gen, que era:

enorme: 1% del cromosoma X. Es el 2 gen ms grande despus del de la neurofibromatosis. 2,3 millones de nucletidos.

Tiene muchsimas secuencias intrnicas: el gen se organiza en 79 exones, que slo constituyen 14 Kb de mRNA: gran diferencia entre el tamao del gen y del mRNA, slo 1/200 nucletidos estn en los exones. No se sabe por qu esto es as.

Una vez que tuvieron el gen sacaron de l la protena que codifica, y se hicieron Ac monoclonales marcados contra ella, que se utilizaron para buscar su ubicacin en los tejidos: se localiz en el sarcolema de las clulas musculares (en su membrana plasmtica).

Evidentemente en los enfermos de Duchenne no se detectaba y en los de Becker exista de forma discontnua (hay distrofina pero ms pequea y los anticuerpos hibridan peor con ella). As pues la cantidad de distrofina se relacionaba con la gravedad del cuadro.

Morfologa de msculos DMD. Tincin con anti-distrofina: Ver diferencias entre 1(IF+) y 2a (IF-) para Ac frente a Antidistrofina; b son los controless.

Morfologa de un msculo BMD: hay patrn IF pero no es continuo ni intenso.

Inmunotincin de un msculo de paciente con una sarcoglicanopata: A es enfermo de 13 a sin tincin especfica y tej conectivo; B es control.

Inmunotincin de un msculo de un paciente con una Distrofia muscular congnita (CMD): Tej conectivo con IF especfica -.DISTROFINA: es una protena de 427.000 D (muy grande) fundamental para la contraccin en registro al unsono- de todas las fibras musculares; est formada por cuatro dominios:

1.- Dominio amino terminal: Es el dominio de unin a la actina.

2.- Parte central: 24 dominios formados por la repeticin sistemtica de 109 aminocidos. Estas unidades son parecidas a las de la espectrina (que se encuentra en la parte interna de los glbulos rojos y les da cierta flexibilidad ).

3.- Tercer dominio: dominio rico en cistena: es similar al de la alfa actinina, con dos regiones de unin al calcio: implicado en la homeostasis del calcio.

4.- Dominio carboxi terminal: unida al complejo de glicoprotenas (complejo de distroglicanos y sarcoglicanos), interacciona mediante la Laminina (merosina) con la matriz EC. El tercer y el cuarto dominio son las dos regiones ms importantes en la funcin de la distrofina.Las isoformas de la distrofina: este gen tiene una regulacin a nivel transcripcional muy compleja y esto hace que existan muchas isoformas de la distrofina. El gen est regualdo por 5 promotores distintos que darn lugar a 5 isoformas, que son las de msculo esqueltico, msculo liso y cardaco y cerebro. Existen tres promotores para el gen de msculo (sobre todo) y cerebro ( P1, P2 y P3 ). Cada una tiene un exn distinto. De P4 y P5 no se conoce su funcionalidad.

En la clase del ao pasado vara un poco la informacin a este respecto; os lo pongo tambin por si lo preguntaran de otra forma:

C M P

S G

5

3

C, M y P: estos promotores generan una distrofina de pm 427.000 D, es decir, la normal.

S y G: promotores internos del gen que dan isoformas mucho ms pequeas (S distrofina y G clutrofina ). La ausencia de estas isoformas explican el retraso mental, ya que son las del cerebro. La distrofina es un dmero dispuesto de forma antiparalela

Este dmero interacciona directamente con un complejo glicoproteico que se encuentra en la membrana celular muscular (sarcolema); est formado por una serie de subunidades: distroglicanos y sarcoglicanos. En los apuntes del CD lo llamaban complejo DAP o DAG; este ao no dijo nombre concreto. Este complejo a su vez interacciona con laminina 2 o merosina, que sirve de unin con las protenas de la lmina basal.

Esta disposicin de la distrofina y el complejo hace que se conecte el interior con el exterior de la fibra muscular, realizando una funcin estabilizadora de la clula muscular, contribuyendo a su correcta contraccin y relajacin; cuando desaparece la distrofina se altera esta funcin de anclaje y la contraccin es defectuosa: en principio la fibra muscular intenta compensar este defecto hipertrofindose, pero acaba fracasando y la fibra muscular degenera y es sustituida por tejido conectivo y grasa.

El conocimiento definitivo de todas las protenas implicadas en este mecanismo ha permitido identificar la alteracin molecular responsable de otras distrofias asociadas.

Distrofina: Duchenne y Becker

Sarcoglicanos: Distrofia muscular de cintura escapular y pelviana

Laminina 2 o merosina: distrofia muscular congnita clsica (la de la Fukuyama se llama fukutina y no se conoce su funcin, aunque se sabe que su dficit produce disminucin de laminina 2 ).

Caveolina: cinturas. Gen 1C (1 por HAD y C por el gen afecto: caveolina).

RELACIN GENOTIPO FENOTIPO

Se realiz un anlisis de mutacin en 130 pacientes con DMD, para estudiar las alteraciones producidas en el gen de la distrofina. Se sacaron las siguientes conclusiones:

1.- Naturaleza de la mutacin delecciones: el 60% de los casos de DMD y DMB estn producidos por una mutacin, que adems es grande. Existen hot spots o puntos calientes que son las zonas donde ms frecuentemente se produce la deleccin (normalmente alrededor del exn 45 al 50).

Traslocaciones: nias. 25%

Mutaciones puntuales ( raro )

Duplicaciones2.- Relacin entre el tamao de la deleccin y la severidad del cuadro: que la deleccin sea de mayor tamao no conlleva que la clnica sea ms grave. Existen enfermos de Becker que tienen grandes delecciones y sin embargo tienen poca patologa y enfermos de Duchenne con pequeas delecciones y un cuadro muy florido.

3.-Relacin entre la gravedad del cuadro y que se produzca una rotura en la fase de lectura del gen por la deleccin: s que existe relacin entre estas dos variables

si se rompe la fase de lectura: NO hay protena: DMD

si no se rompe: SI hay distrofina, pero ms pequea: DMB

Por tanto lo que es importante es dnde se produzca la deleccin, no el tamao de la misma. Esto implica que una distrofina pequea es suficiente para mantener una funcin aceptable y esto tiene importancia en futuros tratamientos de terapia gnica: es ms fcil introducir minigenes que genes grandes. Recordad que las regiones carboxi terminal y rica en cisteina son las ms importantes para la funcin de la distrofina.

Despus de todos estos estudios se decidi reclasificar las distrofias musculares en funcin de la causa molecular que la produzca:

DMD y DMB: distrofinopatias

Distrofia muscular de cinturas: grupo heterogneo asociado a la alteracin de sarcoglicanos

Distrofia muscular congnita: alteracin de merosina

Cardiomiopata dilatada ligada al cromosoma X: producida por la falta especfica de la distrofina del corazn.

Existen 12 tipos distrofias del tipo de cinturas: 1 (de la A a la C) y 2 (de la A a la H) por alteracin de las protenas siguientes: caveolina, calpana, sarcoglicanos y dysferlina. 1 es HAD y 2 es HAR.

PROTOCOLO DE IDENTIFICACIN

FENOTIPO

BIOPSIA MUSCULAR

TINCIN DISTROFINA

DISMINUIDA

NORMAL

= DMC

WESTERN BLOT

TINCIN SG (para medir protenas)

Normal NO Disminuida o truncada

TINCIN LAMININA

Y MEROSINA 2

DMD

DMB

Deficiente N

DMC: de cinturas

DMCo: congnita

DMCo Otras

2.- DISTROFIA MIOTNICA (DM)

- Enfermedad neuromuscular en adultos

- Incidencia : 1/8.500. Es la enfermedad neuromuscular ms frecuente en adultos- Enfermedad multisistmica con miotona, debilidad progresiva con miotona y prdida de masa muscula y aumento del tejido conectivo.- El fenotipo es muy variable, existiendo 3 formas: leve, clsica y grave:

leve: 50 60 aos: cataratas y debilidad leve; muchas veces pasa desapercibido

clsica: adultos jvenes. Forma tpica

grave o congnita: infancia: mortal muchas veces.

- Herencia AD El gen alterado recibe el nombre de DM y se encuentra en el cromosoma 19q13.3

- La mutacin consiste en la expansin de un trinucletido repetido (CTG ) presente en la regin 3 no traducida ( zona que no da protena ) del gen DM, que codifica para una proteinkinasa. Es una mutacin dinmica.

IDENTIFICACIN DEL GEN DE DM: CLONAJE POSICIONAL

Tard mucho tiempo en conseguirse porque aqu hubo que identificar primero en qu cromosoma estaba (fue por tanto difcil encontrar la sonda ); pero cuando se conoci por anlisis de ligamiento, la identificacin del gen fue mucho ms rpida.

La identificacin de los marcadores D19S63 y D19S95 que presentan con DM un fuerte desequilibrio de ligamiento fue fundamental para la clonacin de este gen.

Cuando se cortaba el DNA con enzimas de restriccin ( y se haca Southern ) se vea que en todos los individuos enfermos apareca una banda de DNA de mayor tamao de la que apareca en individuos sanos de 9Kb, y la de 9Kb apareca muy disminuida: esto refleja la amplificacin del triplete en cada enfermo en mayor o menor medida. La aparicin de una nueva banda corresponde a la regin del gen no traducida y que aqu s aparece al existir una expansin de CTGs.

Una vez conocido el gen se sintetiz la protena, que result ser una sern treonn kinasa; todava no se conoce el sustrato de esta enzima, pero s se sabe que en la zona no traducida su gen (zona 3UTR) tiene un triplete que es el responsable de la enfermedad.

Poblacin normal: 5 37 tripletes

Poblacin enferma: 40 180 : clnica leve

200 1000 : clnica clsica

1000 5000 : congnita

FENMENO DE ANTICIPACIN

Adems esta enfermedad presenta el fenmeno de anticipacin: en estudios con familias encontramos una relacin entre el nmero de tripletes y la gravedad de la enfermedad, as como con la precocidad de la aparicin del cuadro.

Con PCR se vio que la gravedad era mayor en generaciones sucesivas (iban apareciendo ms tripletes) y la enfermedad debutaba antes; el fenmeno de anticipacin aparece slo cuando quien transmite la enfermedad es la MADRE.Hiptesis de por qu aparece la enfermedad por una alteracin en una zona que no se traduce del gen:

Se ha visto que:

esta alteracin permite que se exprese la protena del gen

no tiene nada que ver con que esta alteracin provoque que se sintetice menos mRNA

Hiptesis:

1.- Este gen, el anterior y el siguiente estn muy juntos en el cromosoma; una expansin en los tripletes de esta zona del gen DM puede alterar la estructura de la cromatina, en concreto su activacin (para activarse requiere una correcta expansin desde su nucleosoma).

En los genes existe una regin de hipersensibilidad a la DNAsa 1, que aparece cuando la cromatina est menos compactada (el genoma est as ms activo, sintetiza protenas); justo en 3 al lugar donde se produce la expansin de tripletes del gen DM se encuentra un gen de estos hipersensible a DNAsa 1. Este gen es un factor de transcripcin: por lo que se producir una alteracin en la sntesis de protenas de muchos tipos a nivel sistmico: explica la clnica sistmica. Es decir, si se altera la expresin de los genes vecinos, habr un fenotipo asociado al dficit de esas protenas vecinas.2.- hay protenas que se asocian el DNA en secuencias repetidas CUG, las cuales regulan el DNA (por tanto son muy importantes): si existe un mRNA alterado con repeticiones muy grandes de CUG se tendrn que secuestrar muchas de estas protenas (CUGBP ) y ya no pueden usarse para regular el resto del DNA, por lo que se producirn alteraciones en la sntesis de distintas protenas y por tanto la clnica sistmica ( se alteran protenas que se requieren en rganos distintos ).