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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
IGOR RAPP FERREIRA SILVA
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DAS ATIVIDADES DE UMA
PROTEÍNA RICA EM CISTEÍNA (CRISP) ISOLADA DA PEÇONHA DE BOTHROPS
JARARACA
CAMPINAS
2017
IGOR RAPP FERREIRA DA SILVA
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DAS ATIVIDADES DE UMA
PROTEÍNA RICA EM CISTEÍNA (CRISP) DA PEÇONHA DE BOTHROPS JARARACA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Doutor em Farmacologia
ORIENTADOR: STEPHEN HYSLOP
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO IGOR RAPP FERREIRA DA SILVA, E ORIENTADA PELO
PROF. DR. STEPHEN HYSLOP.
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
IGOR RAPP FERREIRA DA SILVA
ORIENTADOR: STEPHEN HYSLOP
MEMBROS:
1. PROF. DR. STEPHEN HYSLOP
2. PROF. DR. ANDRÉ LISBOA RENNÓ
3. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ
4. PROFª. DRª. ANNA LAURA BECHARA JACOB FERREIRA
5. PROFª. DRª. JULIANA MINARDI NASCIMENTO
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 31/07/2017
DEDICATÓRIA
Não foi fácil (e talvez nem devesse ter sido) produzir esse trabalho. Algumas
noites viradas, outros tantos finais de semana sem descanso. Centenas de páginas
lidas (algumas sem total compreensão até hoje). Ao que parece contraditório, embora o
trabalho se apresentasse solitário, o esforço era conjunto. Embora distante, impaciente,
por vezes arrogante e egocêntrico, vocês estiveram ao meu lado. Nesses anos de pós-
graduação, distanciei-me de boa parte dos meus vínculos familiares perseguindo meus
ideais de maneira solitária, mas, sobretudo, egoísta. Não importava o que acontecia ao
meu redor, só conseguia pensar em projetos, dissertações e teses. E mesmo assim,
vocês suportaram, permanecendo ao meu lado. Dessa forma, seria injusto colocar essa
peça como obra individual, uma vez que foi construída com esforços conjuntos. Dito
isso, dedico esse trabalho às pessoas que me deram suporte nessa longa e tortuosa
jornada mesmo não recebendo nenhuma compensação afetiva em resposta. Obrigado,
Maria Cristina Rapp da Silva, Leonardo Ferreira da Silva, Gabriela Rapp Ferreira
da Silva, Leonardo Rapp Ferreira da Silva e Simone Garcia Silva. Embora eu não
tenha sido, vocês foram a melhor família.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Stephen Hyslop por ter me aceitado no Laboratório de Farmacologia
Bioquímica, pela orientação e principalmente pelo auxílio e pela paciência nos
momentos de real necessidade.
A Todos do Laboratório de Farmacologia Bioquímica que com certeza pelos momentos
de conversa e risos que muito me auxiliaram no meu percurso.
Ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de
Campinas, bem como os coordenadores Profs. Drs. Edson Antunes, Gabriel Forato
Anhê e Fabíola Taufic Mónica Iglesias, pelas condições oferecidas para a realização
deste trabalho.
Aos Profs.Drs. Solange M. T. Serrano e André Zelanis do CAT-CEPID/Butantã e ao
CPNEM pelo auxílio na realização dos experimentos em espectrometria de massas.
À CAPES pela bolsa que tornou possível a realização desta tese e a conquista desta
vitória.
AGRADEÇO ESPECIALMENTE,
De um modo geral me sinto grato e honrado por ter feito parte de uma equipe do
Departamento de Farmacologia da Unicamp. Pessoas com talentos diversos e diversos
pontos de vista me impulsionaram à mudança e dessa forma me fortaleceram. Por isso
agradeço. Dentre todas, essas abaixo são as que mais contribuíram para a construção
do ser humano que sou hoje.
Agradeço aos amigos Mariana Leite Tamascia e Frank Denis Huaco Torres, por
sempre estarem dispostos a discutir. Graças a vocês, aprendi muito nessa jornada e,
embora não concordemos em quase nada, vocês são a minha imagem de cientista.
Agradeço aos técnicos José Ilton dos Santos e Patrícia Costa Panunto pelo suporte.
Zé e Pati, sem vocês a parte experimental desse trabalhado não teria saído do papel.
A amiga Erika Ferraresso dos Anjos. Poucas pessoas possuem seus talentos. Tive a
felicidade e a sorte de estar ao seu lado na bancada. Aprendi muito com você,
organizada, detalhista e com uma execução impecável, continuamente me deixava
envergonhado da minha “organização”.
A amiga Raquel Lorenzetti. A outra pessoa que sempre me deixava envergonhado da
minha “organização”. Tive a felicidade de trabalhar com você, uma das pessoas que me
manteve no doutorado, com certeza. Ajudou-me dentro do laboratório, dando-me
compreensão do que deveria ser feito, e fora do laboratório sendo uma das pessoas
mais compreensivas que eu conheço, quase nunca perdendo sua costumeira calma.
A minha família, que sempre esteve ao meu lado nessa jornada. Se nunca esmoreci
ou olhei para trás é por que tive pessoas me impulsionando.
À minha companheira Simone Garcia Silva. Nada do que eu escreva aqui pode
traduzir o quanto sou grato a você. Sempre acreditou em mim e nunca me deixou
desistir. Uma lanterna contra a escuridão, uma rocha contra as tormentas, me orientou,
me deu suporte. A isso só posso escrever: Conseguimos, vencemos mais essa!
EPÍGRAFE “O Universo: algumas informações para ajuda-lo a viver nele... População: nenhuma. É
fato conhecido que há um número infinito de mundos, simplesmente por que há um
espaço infinito para que esses mundos existam. Todavia, nem todos são habitados.
Assim, deve haver um número finito de mundos habitados. Qualquer número finito
dividido por infinito é tão perto de zero que não faz diferença, de forma que a população
de todos os planetas do Universo pode ser considerada igual a zero.”
Douglas Adams – “O Restaurante no Fim do Universo”
“... Same old song Just a drop of water in an endless sea
All we do Crumbles to the ground though we refuse to see...
Nothing lasts forever, but the earth and sky It slips away
And all your money won't another minute buy Dust in the wind
All we are is dust in the Wind...”
Kansas – Dust in the Wind
“A Terra é um palco muito pequeno em uma imensa arena cósmica. Pensem nos rios de sangue derramados por todos os generais e imperadores para que, na glória do
triunfo, pudessem ser os senhores momentâneos de uma fração desse ponto. Pensem nas crueldades infinitas cometidas pelos habitantes de um canto desse pixel contra os
habitantes mal distinguíveis de algum outro canto, em seus frequentes conflitos, em sua ânsia de recíproca destruição, em seus ódios ardentes.
Nossas atitudes, nossa pretensa importância, a ilusão de que temos uma posição privilegiada no Universo, tudo é posto em dúvida por esse ponto de luz pálida. O nosso
planeta é um pontinho solitário na grande escuridão cósmica circundante. Em nossa obscuridade, em meio a toda essa imensidão, não há nenhum indício de que, de algum
outro mundo, virá socorro que nos salve de nós mesmos.”
Carl Sagan (escrevendo sobre a última foto – que mostra a Terra como um ponto – da sonda Voyager II) – em “O Pálido ponto Azul”
RESUMO
As proteínas secretórias ricas em cisteína (CRISPs) são amplamente
distribuídas em vertebrados e ocorrem em peçonhas ofídicas, embora seu papel no
envenenamento ainda seja mal compreendido. Neste trabalho, isolamos e
caracterizamos parcialmente as atividades de uma CRISP da peçonha da serpente
Bothrops jararaca, a Sv-CRISP-Bj (snake venom CRISP). Essa proteína foi purificada
utilizando uma combinação de gel filtração e cromatografia de troca aniônica. SDS-
PAGE na ausência e presença de ditiotreitol ou -mercaptetanol indicou que a Sv-
CRISP-Bj era um polipeptídeo de cadeia simples com uma massa molecular de 29,8
kDa. A espectrometria de massa dos fragmentos de digestão de tripsina e
endopeptidase SV8 combinada com buscas em banco de dados revelou homologia e
alta identidade com outras Sv-CRISPs. Sv-CRISP-Bj mostrou uma única banda
imunorreativa em imunoblotting contra antiveneno botrópico. Sv-CRISP-Bj não
apresentou atividade caseinolítica e esterase, mas possuiu atividade - e -
fibrinogenolítica que foi inibida por EDTA e 1,10-fenantrolina, mas não por PMSF. Em
ensaio de recalcificação, a Sv-CRISP-Bj não afetou a velocidade de coagulação mas
atenuou o máximo de coagulação alcançada; não coagulou fibrinogênio bovino ou
plasma citratado de rato, mas agregou plaquetas lavadas de rato. Em pele dorsal de
rato, a Sv-CRISP-Bj não foi hemorrágica, mas causou edema. No músculo
gastrocnêmio de camundongo, a Sv-CRISP-Bj não foi hemorrágica ou mionecrotica,
mas estimulou a migração de células inflamatórias. Concluimos que a Sv-CRISP-Bj é
uma proteína não hemorrágica, não mionecrótica e não coagulante que pode contribuir
para o edema e inflamação locais associados ao envenenamento por B. jararaca.
Palavras-chaves: Bothrops jararaca, coagulação, CRISP, edema, mionecrose,
purificação
ABSTRACT
Cysteine-rich secretory proteins (CRISPs) are widely distributed in
vertebrates and occur in snake venoms, although their role in envenomation is still
poorly understood. In this work, we isolated and partially characterized a CRISP from
Bothrops jararaca snake venom, denominated Sv-CRISP-Bj (snake venom-CRISP).
This protein was purified using a combination of gel filtration and anion-exchange
chromatography. SDS-PAGE in the absence and presence of dithiothreitol or -
mercaptethanol indicated that Sv-CRISP-Bj was a single-chain polypeptide with a
molecular mass of 29.8 kDa. Mass spectrometry of trypsin and endoprotease SV8
digestion fragments combined with database searches revealed high sequence
homology and identity with other Sv-CRISPs. Sv-CRISP-Bj showed a single
immunoreactive band in immunoblotting against bothropic antivenom. Sv-CRISP-Bj was
devoid of caseinolytic and esterase activity but had - and -fibrinogenolytic activity that
was inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline but not by PMSF. Sv-CRISP-Bj
attenuated coagulation after plasma recalcification but did not clot fibrinogen or rat
citrated plasma. Sv-CRISP-Bj aggregated rat washed platelets. In rat dorsal skin, Sv-
CRISP-Bj was not hemorrhagic compared to venom but caused edema, as did the
venom. In mouse gastrocnemius muscle, Sv-CRISP-Bj (40 g) was not hemorrhagic or
myonecrotic but stimulated the migration of inflammatory cells, in contrast to venom that
was hemorrhagic and myonecrotic but caused less infiltration of inflammatory cells.
These results indicate that Sv-CRISP-Bj is a non-hemorrhagic, non-myonecrotic, non-
coagulant protein that may contribute to local edema and inflammation associated with
envenoming by B. jararaca.
Keywords: Bothrops jararaca, coagulation, CRISP, edema, mionecrosys, purification
LISTA DE FIGURAS
Figura Legenda Página
1 Esquema representativo dos domínios das CRISPs..................... 18
2 Modelo computacional da estrutura da natrina, de Naja atra........ 25
3 Esquema que mostra os efeitos das Sv-CRISPs.......................... 29
4 Processo de purificação da Sv-CRISP-Bj..................................... 43
5 Immunoblotting da peçonha e Sv-CRISP-Bj................................. 44
6 Alinhamento da sequencia da Sv-CRISP-Bj................................. 47
7 Atividade fibrinogenolítica da Sv-CRISP-Bj em SDS-PAGE......... 49
8 Recalcificação em plasma de ratos............................................... 50
9 Agregação plaquetária causada por Sv-CRISP-Bj........................ 51
10 Atividade mionecrótica da Sv-CRISP-Bj........................................ 53
LISTA DE TABELAS
Tabela Legenda Página
1 Distribuição das CRISPs em vertebrados e possíveis implicações...... 20
2 Abundância de Sv-CRISPs em algumas peçonhas ofídicas.................. 23
3 Peptídeos obtidos após digestão da Sv-CRISP-Bj por tripsina e SV8.. 45
4 Atividades enzimáticas e biológicas da Sv-CRISP-Bj........................... 48
5 Tabela resumo das atividades de Sv-CRISPs...................................... 55
SIGLAS E ABREVIATURAS
AEG Glicoproteína ácida epididimal
Ag-5 Antígeno 5
BAPNA Nα-Benzoil-L-arginina p-nitroanilida
Boc-Ala-Np n-t-Boc-L-alanina p-nitrofenil
CAP Superfamília das CRISP, Ag5, PR-1
CRISP Proteína secretória rica em cisteína
DHM Dose hemorrágica mínima
DMSO Dimetil sulfóxido
DRC Domínio rico em cisteína
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ER Receptor de estrogênio
GAPR-1 PR-1 associada ao Golgi
HUVEC Células endoteliais humanas de cordão umbilical
ICAM Molécula de adesão intercelular
ICR Regulador de canais iônicos
MAP Proteína ativada por mitógeno
MAPK11 Proteína ativada por mitógeno quinase 11
NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa de cadeia leve indutor de ativação de células B
Oct-2 Fator de transcrição octamêro-2
PLA2 Fosfolipase A2
PMSF Fluoreto de fenilmetanosulfonil
PPP Plasma pobre em plaqueta
PR-1 Pathogenesis-related-1
PRP Plasma rico em plaqueta
PVDF Fluoreto de polivinilideno
QToF Quadrupólo-tempo de voô
SBTI Inibidor de tripsina de soja
SDS Dodecil-sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de acrilamida com SDS
SGP Proteína específica de granulócito
SV8 Glutamil endopeptidase de Staphylococcus aureus V8
Sv-CRISP CRISP de peçonha ofídica
SVMPs Metaloproteases de peçonha ofídica
SVSPs Serinoproteases de peçonha ofídica
TAME Nα-p-tosil-L-arginina metil éster
Tpx-1 Proteína x-1 de testículo
VCAM Molécula de adesão de células vasculares
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 17
1.1. CLASSIFICAÇÃO, DISTRIBUIÇÃO E ESTRUTURA DAS CRISPS............................ 17
1.1.1. Classificação e distribuição e características gerais das CRISPs.... 17
1.1.2. Estrutura........................................................................................... 17
1.2. O PAPEL DAS CRISPS EM PROCESSOS FISIOLÓGICOS EM VERTEBRADOS......... 19
1.2.1. CRISPs na fertilidade........................................................................ 19
1.2.2. CRISPs na imunidade....................................................................... 21
1.3. CRISPS NAS PEÇONHAS OFÍDICAS................................................................. 22
1.3.1. Distribuição e estrutura...................................................................... 22
1.3.2. Atividades biológicas......................................................................... 24
1.4. POR QUE ESTUDAR SV-CRISPS?................................................................... 28
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 30
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 31
3.1. REAGENTES E PEÇONHA................................................................................ 31
3.2. PURIFICAÇÃO DA SV-CRISP-BJ.................................................................... 31
3.2.1. Gel filtração em Superdex 75........................................................... 31
3.2.2. Cromatografia por troca aniônica em coluna HiTrap Q-Sepharose.. 32
3.2.3. Determinação de pureza por HPLC.................................................. 32
3.3. ELETROFORESE (SDS-PAGE)...................................................................... 32
3.4. CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA....................................................................... 33
3.5. IMUNOBLOT DA PROTEÍNA FRENTE AO ANTISSORO BOTRÓPICO......................... 33
3.6. IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS..................... 33
3.7. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS.............................................................................. 34
3.7.1. Atividade caseinolítica...................................................................... 34
3.7.2. Atividade fibrinogenolítica................................................................. 35
3.7.3. Atividade fibrinolítica......................................................................... 35
3.7.4. Atividade elastásica.......................................................................... 36
3.7.5. Atividade esterásica.......................................................................... 36
3.7.6 Atividade amidolítica.......................................................................... 36
Página
3.8. ATIVIDADES BIOLÓGICAS................................................................................ 37
3.8.1. Animais.............................................................................................. 37
3.8.2. Atividade trombina-símile................................................................... 37
3.8.3. Tempo de coagulação....................................................................... 37
3.8.4. Tempo de recalcificação.................................................................... 38
3.8.5. Agregação plaquetária....................................................................... 38
3.8.6. Atividade hemorrágica....................................................................... 39
3.8.7. Permeabilidade vascular.................................................................... 39
3.8.8. Miotoxicidade..................................................................................... 40
3.8.9. Análise histológica............................................................................. 40
3.9. ANÁLISE ESTÁTISTICA.................................................................................... 41
4. RESULTADOS................................................................................................... 42
4.1. PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA SV-CRISP-BJ........................................... 42
4.2. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA E BIOLÓGICA PARCIAL DA SV-CRISP-BJ.......... 48
5. DISCUSSÃO...................................................................................................... 56
5.1. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E ESTRUTURAIS DA SV-CRISP-BJ................. 56
5.2. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA SV-CRISP-BJ .................................................. 58
5.3. ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA SV-CRISP-BJ.................................................... 59
5.4. COMPARAÇÃO ENTRE A SV-CRISP-BJ E A BJ-CRP........................................ 62
6. CONCLUSÃO.................................................................................................... 64
7. REFERÊNCIAS.................................................................................................. 65
8. ANEXO............................................................................................................... 79
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. CLASSIFICAÇÃO, DISTRIBUIÇÃO E ESTRUTURA DAS CRISPS
1.1.1. Classificação, distribuição e características gerais das CRISPs
As CRISPs (cysteine-rich secretory proteins) são proteínas amplamente
distribuídas entre os vertebrados, mas foram inicialmente isoladas e caracterizadas do
trato reprodutor de mamíferos (1-3). As CRISPs pertencem à superfamília CAP
(Cysteine-rich secretory proteins (CRISPs), Antigen 5 (Ag5) and Pathogenesis-Related
1 (Pr-1)). Nesta superfamília, as proteínas Ag5 são o maior grupo, estando presentes
em saliva de carrapato e mosquitos entre outros invertebrados (1,4,5) e são tidas como
o mais abundante componente de peçonhas de vespas (1) e responsável por promover
forte resposta alergênica, podendo levar à infertilidade de origem imunológica em
vertebrados (1,6). As PR-1 (Pathogenesis-Related-1) possuem a função de defesa em
plantas, protegendo-as contra a ação de bactérias, fungos e vírus (1,7). A liberação
dessas proteínas está vinculada ao aumento de substâncias, como os ácidos siálicos e
jasmônicos e o gás etileno, liberados pelos vegetais em situações de estresse e sob
ataques de predadores (1,8). Embora tais proteínas possuam homologia com CRISPs,
às classes Ag5 e PR-1 faltam o domínio rico em cisteína (1).
Em mamíferos, as CRISPs estão relacionadas a vários processos
fisiológicos, tais como a espermatogênese, motilidade e capacitação de
espermatozoides, e a resposta imune (1,9). Além disso, algumas CRISPs parecem ter
papel central no desenvolvimento de alguns tumores, pincipalmente tumores ligados ao
trato reprodutor, devido à sua capacidade de modular proteínas relacionadas à
proliferação celular (1,10,11). Embora as primeiras CRISPs tenham sido identificadas
no trato reprodutor de roedores, testículos, epidídimo e canais deferentes, atualmente
sabe-se que essas proteínas também são encontradas em espermatozoides, glândulas
salivares e tecidos linfoides (12,13). Entretanto, os mecanismos pelos quais as CRISPs
agem ainda não estão bem delineados.
1.1.2. Estrutura
Embora as CRISPs possam ser divididas em quatro grupos segundo a
homologia de suas sequências de aminoácidos (grupos de 1-4) (1), essas proteínas
18
Figura 1. Representação esquemática mostrando os domínios das CRISPs. Fonte: (15).
possuem características estruturais comuns: i) massa molecular entre 20 e 30 kDa, ii)
16 resíduos de cisteína como sua característica distintiva, e iii) três domínios distintos
(PR-1, articulação e DRC) (1,2). O domínio PR-1, presente na região N-terminal em
todas as proteínas dessa superfamília, nas CRISPs, possui tamanho relativo estimado
em 21 kDa e é implicado na interação dessas proteínas com as membranas
plasmáticas das células-alvo além da possível função de proteólise dessas proteínas
(1,14). O domínio rico em cisteína (DRC; ou CRD em inglês - cysteine-rich domain, ~6
kDa), localizado na região C-terminal, é responsável pela interação das CRISPs com os
canais iônicos. Além disso, há entre estes dois domínios uma região de articulação
(hinge) (Fig. 1) (15).
Charest et al. (16), utilizando-se da construção de cDNA com RNAm extraído
de epidídimo de ratos, evidenciaram uma das características idiossincráticas dessas
proteínas: 16 cisteínas na região carboxi-terminal. Além disso, estes autores mostraram
que as sequencias de aminoácidos teriam um alto teor de aminoácidos negativos e
hidrofóbicos (16). Entretanto, a relevância da localização e possíveis reflexos destas
características para a geometria molecular só seriam delineados em experimentos de
ressonância magnética ou cristalografia com proteínas da superfamília CAP.
Szyperski et al. (17) verificaram a estrutura da GliPR, uma proteína CAP de
220 aminoácidos expressa em gliomas humanos. A GliPR possui identidade com a
P14a, uma PR-1 encontrada em plantas. Baseado nesta semelhança, a P14a foi usada
como molde para estudos de ressonância magnética, o que permitiu a predição das
Articulação Domínio PR-1
- Interação com membranas - Atividade proteolítica - S1 e S2 – Sítios de ligação com
ovócitos
Modulação de
canais iônicos
N-Terminal
S1 S2
Domínio RC
Figura 1. Representação esquemática mostrando os domínios das CRISPs. Fonte: [15].
19
estruturas secundária e terciária da proteína. A estrutura primária da GliPR mostra
alguns aminoácidos altamente conservados (His22, Asp23, Arg26, Val29, Pro31, entre
outros) em relação a outras PR-1 (17). Sua estrutura secundária é composta por quatro
-hélices e cinco folhas-. Além disso, a estrutura terciária é formada por um núcleo
hidrofóbico contendo folhas- circundadas por -hélices. Contudo, não foi encontrado
qualquer indício de sítio catalítico ou dimerização nessa proteína. Por outro lado,
Serrano et al. (18), em estudo de cristalografia e posterior difração de raio-x,
evidenciaram a existência de dimerização in vitro da GAPR-1, uma PR-1 associada ao
complexo de Golgi humano, e encontraram indícios estruturais da formação de uma
tríade catalítica entre His54, Ser71 e His103, embora não haja evidência experimental de
atividade catalítica nessa proteína.
1.2. O PAPEL DAS CRISPS EM ALGUNS PROCESSOS FISIOLÓGICOS EM VERTEBRADOS
1.2.1. CRISPs na fertilidade
O crescente interesse na fertilidade humana nas últimas décadas levou ao
isolamento de inúmeros fatores implicados na maturação e capacitação de
espermatozoides bem como na interação destes com os ovócitos. Cameo e Blaquier
(19) encontraram, em homogenatos de epidídimo murinho, cinco proteínas (nomeadas
de A-E) que apresentavam características específicas quanto à concentração e massas
moleculares, contudo com liberação dependente de testosterona. Tais proteínas foram
denominadas AEG (do inglês: acidic epididymal glycoprotein) e subsequentemente
foram sequenciadas e isoladas (11,20). Contudo, a identificação dessas proteínas como
CRISP só foi confirmada a partir de 1989 quando Kasahara et al. (21) construíram
bibliotecas de cDNA com RNA extraído de testículos de camundongos BALB/c e
CRO437. Alguns clones mostravam sequências de bases que, uma vez traduzidas em
sequência de aminoácidos, mostravam identidade com proteínas das classes Ag5 e
PR-1.
Apesar da distribuição diferencial pelos vários órgãos (ver Tabela 1), as
quatro classes dessas proteínas são encontradas no trato reprodutor e gametas de
vertebrados (3,12,22,23). Mais especificamente, em humanos, as CRISPs-2 e CRISPs-
3 são expressas principalmente no trato reprodutor masculino (próstata, epidídimo e
20
testículos) (22,24), embora as CRISPs-3 também sejam encontradas em útero (25). Em
outras espécies de vertebrados, as CRISPs podem ainda ser encontradas em óvulos e
células do sistema imune associadas ao trato reprodutor de fêmeas (25,26).
Devido sua distribuição no trato reprodutor, vários estudos têm relacionado
as CRISPs ao desenvolvimento, motilidade e capacitação dos espermatozóides, o que
sugere que elas podem estar relacionadas à fertilidade masculina. O mecanismo de
ação dessas proteínas ainda é incerto, porém algumas investigações trazem luz sobre
esse aspecto.
Tabela 1. Distribuição das CRISPs em vertebrados e possíveis papeis fisiológicos.
Classes Distribuição Espécie Possíveis papeis fisiológicos Ref.
CRISP-1 Epidídimo
Testículos
Rato
Camundongo Maturação e capacitação de
espermatozoides
(19)
(12)
Epidídimo Humanos
CRISP-2 Testículo
Epidídimo
Espermatozóide
Camundongo
Humano
Rato
Interação entre células
espermatogênicas e células de
Sertollli
Reação acrossômica
(12)
(9)
(22)
(10) Ovário Humano Não determinado
CRISP-3 Útero
Leucócitos
Glândula salivar
Próstata
Humano Gravidez ectópica
Imunidade inata
Formação tumoral
(25)
(13)
(12)
Útero Cavalo EPIA* (26)
Útero Anfíbio Quimiotaxia (27)
CRISP-4 Epidídimo Ratos Não determinado (28)
*Endometrite persistente induzida por acasalamento
Maeda et al. (9) avaliaram a capacidade de células Jurkat com diferentes
trechos de DNA de células espermatogênicas se ligarem a células de Sertoli e
21
mostraram que o único clone celular capaz de fazer essa ligação era o que expressava
a Tpx-1, uma CRISP-2 cujo gene já tinha sido clonado. Concluíram então que esta
proteína é importante para a interação entre células espermatogênicas e as células de
Sertoli, auxiliando na maturação dos espermatócitos. Posteriormente, Busso et al. (22)
demonstraram que a Tpx-1 é incorporada ao acrossomo, uma vez que aparece nessa
organela e pode estar relacionada à reação acrossômica, pois em condições
ambientais que favorecem esse processo há uma migração dessa proteína para o
segmento equatorial de espermatozoides humanos.
As CRISPs podem estar relacionadas a vias de liberação de citocinas, ora
sendo ativadas por MAP (Mitogen-Activated Protein) cinases (10), ora ativando
proteínas responsáveis pela maturação acrossômica (29) através da interação dessas
proteínas com a região DRC da CRISP. Por outro lado, há estudos demonstrando o
envolvimento dessas proteínas com a capacitação e aumento de motilidade de
espermatozoide, bem como a quimiotaxia e a fusão entre óvulos e espermatozoides.
Alurina, um membro CAP destituído do DRC e expresso em ovos de Xenopus laevis,
possui capacidade quimioatrativa in vitro sobre espermatozoides de camundongos CD-
1 (27,30). Quando sequenciada, a alurina mostra uma sequência homóloga a CRISPs
da classe 3 (27,30), cuja localização no trato genital de fêmeas de mamíferos é
conhecida (26,31). Evans et al. (31) mostraram, por imunohistoquímica, uma dinâmica
de expressão através do ciclo estral em ratas. Nesse estudo, os autores demonstraram
a expressão de CRISP-3 em endométrio, glândulas acessórias, epitélio luminal,
estroma e leucócitos, sendo diferencialmente expressa em cada um desses tecidos ao
longo do ciclo estral. O maior nível de expressão ocorreria em leucócitos associados ao
útero na fase pró-estral, fase que ocorre a ovulação (32).
1.2.2. CRISPs na imunidade
Em mamíferos, alguns estudos trazem evidências de da ação de CRISPs na
imunidade inata, Gibbs et al. (33). Uma proteína homóloga a Tpx-1, a SGP-28 (specific
granulocyte protein 28) foi isolada de material degranulado de neutrófilos humanos
ativados por acetato de forbol-miristato, e também foi isolada de grânulos de eosinófilos
Ubdy et al. (13). Esta proteína possui cadeia única com tamanho molecular relativo de
22
28 kDa. Sua sequência de aminoácidos é bastante similar às de outras CRISPs e, em
condições redutoras, apresenta uma diminuição de sua mobilidade eletroforética, um
reflexo da abundância de pontes dissulfeto e de resíduos de cisteína (13,34).
Corroborando com a ideia de que as CRISPs participam da imunidade
humana, Pfisterer et al. (35) detectaram uma CRISP da classe 3 em linfócitos B
deficientes no fator de transcrição Oct-2; este fator é importante para a diferenciação
dessas células quando transfectadas com a fusão de genes Oct-2/ER (receptor de
estrógeno) e em presença do estradiol. Além disso, a CRISP-2 interage com a MAPK
11, proteína que pode ativar a via do fator de transcrição NF-κB e levar à liberação de
citocinas (10).
1.3. CRISPS NAS PEÇONHAS OFÍDICAS
1.3.1. Distribuição e estrutura
Várias CRISPs, também conhecidas como CRVPs (cysteine-rich venom
proteins) (36-38) ou Sv-CRISPs (snake venom-CRISPs), já foram isoladas de peçonhas
de répteis e, na classificação geral das CRISPs, pertencem ao subgrupo CRISP-3,
como mostram achados de reatividade cruzada em western blotting por Lecht et al.
(39).
A avaliação da distribuição de Sv-CRISPs tem sido facilitada nos últimos
anos por diversos estudos transcriptômicos e proteômicos em peçonhas ofídicas.
Análises transcriptômicas da glândula de veneno de espécies do gênero Bothrops
indicam uma abundância de 0,4% a 1,6% para as Sv-CRISPs (40-42). No caso de B.
jararaca, a proporção relativa de Sv-CRISPs em bibliotecas de espécimes juvenis é de
2,7% comparado a 0,4-0,9% em adultos (42), indicando uma possível variação
ontogenética desta proteína durante a maturação desta espécie. De modo geral, os
estudos proteômicos tem corroborado a baixa abundância de Sv-CRISPs em peçonhas,
exceto em algumas espécies de elapídeos asiáticos (Tabela 2). A maioria destes
estudos indicam que as Sv-CRISPs correspondem a <5% da composição de peçonhas
ofídicas.
23
Tabela 2. Abundância de Sv-CRISPs em algumas peçonhas ofídicas.
*Em análise de spots de eletroforese 2D, Peichoto et al. (44) também detectaram Sv-CRISPs nas
peçonhas de Philodryas baroni, Philodryas olfersii olfersii e Philodryas patagoniensis (colubrídeos sul-
americanos), e Hypsiglena torquata texana e Trimorphodon biscutatus lambda (colubrídeos norte-
americanos).
**Zelanis et al. (55) detectaram Sv-CRISPs na peçonha de Bothrops jararaca sem, porém, estimar a
proporção delas na peçonha.
Do ponto de vista estrutural, Guo et al. (56) determinaram a sequência e a
formação dos domínios da stericrisp da peçonha da serpente asiática Trimeresurus
stejnegeri. A stericrisp é formada por nove -hélices e dez folhas- intercaladas com
trechos sem estrutura secundária. A modelagem computacional mostrou que esta
estrutura era conservada em outras proteínas da superfamília CAP, salvo algumas
alterações em aminoácidos específicos, principalmente no domínio PR-1 (56). Wang et
al. (57) mostraram, em estudo por difração de raio-x, que a natrina, isolada da peçonha
Família Espécie Abundância (%) Referência
Colubridae* Thamnodynastes strigatus 1,2 43
Crotalidae** Bothrops asper 0,1 52
Bothrops atrox 3,8 54
Bothrops colombiensis 0,1 53
Crotalus durissus cascavella 0,9 51
Crotalus durissus terrificus 1,8 51
Elapidae Bungarus caeruleus 5,0 50
Micrurus dumerilli 0,0 45
Micrurus tschudii tschudii 0,0 46
Naja atra 2,0 47
Naja naja 7,0 50
Ophiophagus hannah 8,7 49
Pseudechis papuanus 2,3 48
24
de Naja atra, possui uma superfície carregada positivamente. Além disso, mostraram
que a natrina pode dimerizar-se espontaneamente in vitro, através do domínio PR-1.
Contudo, nenhuma Sv-CRISP de outras fontes foi testada quanto à capacidade de
dimerização. Ainda não se sabe se a dimerização ocorreria in vivo e qual seria a
relevância deste fenômeno nas funções desempenhadas por estas proteínas no
envenenamento.
O domínio PR-1 da natrina apresenta a mesma estrutura terciária relatada
para a GliPR (17) e para a GAPR-1 (18): um núcleo hidrofóbico constituído por folha-
intermediárias a dois conjuntos de -hélices. Entretanto, diferentemente ao que ocorre
nessas proteínas, na natrina, His60 e His115, juntamente com a Ser76, localizadas no
domínio PR-1, formariam uma tríade capaz de imobilizar um íon de Zn2+ e esse
tetraedro coordenaria uma molécula de água num processo análogo ao que ocorre com
metaloproteases (17,18), como indicado na Figura 2. Entretanto, embora haja
evidências estruturais que suportam uma atividade proteolítica putativa dessas
proteínas (14,17,18), tal atividade somente foi encontrada em Text31 uma PR-1 isolada
do molusco marinho Conus textile (14).
1.3.2. Atividades biológicas
Apesar de vários relatos na literatura descrevendo a purificação e
caracterização de Sv-CRISPs, ainda pouco se sabe das suas atividades biológicas e
seu papel no envenenamento ofídico. Entretanto, pelo menos três atividades já foram
descritas para estas proteínas: (1) neurotoxicidade e bloqueio de canais iônicos, (2)
ação sobre células inflamatórias e (3) mionecrose.
25
Figura 2. Representação da estrutura da natrina. A) Domínio e as estruturas secundárias – o domínio
Hinge é formado por sequências sem estrutura secundária. B) Distribuição das cargas eletrostáticas na
superfície da proteína (em vermelho as regiões negativas e em azul as regiões positivas). A flecha indica
a possível tríade catalítica (His60
, Ser76
e His115
), mostrado em detalhes no painel C. DRC – domínio rico
em cisteína. Figuras retiradas de (56) e (57).
O primeiro estudo de uma CRISP em peçonha de réptil foi relatado por
Mochca-Morales et al. (58) que, em investigação de toxinas letais em camundongos da
peçonha de monstro de Gila (Heloderma horridum horridum), isolaram a helotermina,
uma proteína não enzimática de cadeia única com massa molecular de 25 kDa e pI de
6,8. A peçonha H. h. horridum mostrou LD50 aproximada de 60 µg em camundongos
enquanto a toxina foi letal na dose de 30 µg. Essa mesma dose causou sintomas
neurológicos variados: letargia, paralisia parcial de membros traseiros, diminuição de
temperatura e distensão intestinal. A toxina (20 µg) não mostrou efeito sobre o fluxo de
Ca2+, Na+ ou K+ em preparados de gânglio dorsal de ave, neurônios de lula ou ainda
coração de neonatos de ratos. A confirmação de similaridades sequenciais entre
CRISPs e a helotermina veio em estudo posterior quando Morissete et al. (59)
mostraram que a helotermina foi a primeira CRISP isolada de peçonhas de répteis.
Esse mesmo estudo ainda mostrou que 1 µg de toxin foi capaz de bloquear a ligação
entre rianodina e canais de Ca2+ em preparações de retículo sarcoplasmático
reduzindo, assim, a corrente de Ca2+ e efluxo de íons nesta organela.
Outros estudos também tem sugerido uma ação neurotóxica in vivo para Sv-
CRISPs. Estrella et al. (15) isolaram a helicopsina, da peçonha de Helicops angulatus
A B C
26
(colubrídeo sul-americano) que apresentou cadeia única de 20 kDa e LD50 106 µg/kg.
Quando injetada intraperitonealmente, a helicopsina (16 µg) causou manifestações
neurológicas diversas em camundongos, tais como hiperexcitabilidade, taquipnéia,
paralisia flácida e convulsão, entre outros. Contudo, não foram realizados ensaios
eletrofisiológicos para confirmar bloqueio de canais iônicos.
Em alguns casos, evidências estruturais e eletrofisiológicas sugerem uma
atividade bloqueadora em canais iônicos para algumas Sv-CRISPs. Guo et al. (56)
mostraram que a stericrisp da peçonha de T. stejnegeri (crotalídeo asiático) possui uma
conformação similar a bloqueadores de canais de K+, contudo nenhum ensaio
eletrofisiológico foi feito para comprovar esta atividade. Por outro lado, vários trabalhos
da década passada apresentaram dados eletrofisiológicos comprovando a atividade
bloqueadora dessas proteínas. Wang et al. (60) mostraram que a natrina (100 nM)
isolada de N. atra (cobra chinesa) pode bloquear canais de K+ dependentes de Ca2+ em
musculatura vascular de camundongo. Já a ablomina (1 µM), de Agkistrodon blomhoffi,
diminuiu a força de contração induzida por 60 mM de K+ em artérias caudais de rato
desprovidos de endotélio (61). Esta redução foi revertida por lavagem, indicando uma
ligação reversível entre a ablomina e os canais, e por incubação com cafeína 20 mM,
este último mostrando que o bloqueio não envolveu os canais rianodínicos do retículo
sarcoplasmático (61). Os autores concluíram que possivelmente a ablomina esteja
bloqueando os canais de Ca2+ do tipo L. Por sua vez, Brown et al. (62) mostraram que
500 nM de pseudechetoxina bloqueou até 90% da corrente de K+ em oócitos de
Xenopus laevis transfectados com canais de K+ dependentes de nucleotídeos. Mais
recentemente, Ludovicho et al. (63) mostraram que a Bj-CRP (1 µM), isolada de B.
jararaca, não bloqueia canais de K+ dependentes de voltagem. As divergências na
capacidade de Sv-CRISPs de atuar em canais iônicos provavelmente refletem
diferenças na afinidade destas proteínas para os diferentes tipos de canais.
Com relação à ação local e sobre células inflamatórias, Wang et al. (60)
mostraram que a natrina (100 nM) de N. atra aumentou a expressão de moléculas de
adesão, tais como ICAM, VCAM e E-selectinas, em cultura de HUVECs após 6 h de
incubação. Essa expressão é dependente da fosforilação da MAPK que, por sua vez,
ativa o fator de transcrição NF-κB. Esta ação da natrina sugere um papel importante
27
não somente na adesão e diapedese de leucócitos, mas também na quimiotaxia dos
mesmos. Já a Bj-CRP (5 µg/camundongo), quando injetada intraperitonealmente,
estimulou o recrutamento de leucócitos após 1 h, além de clivar os componentes C3,
C4 e C5 in vitro, após 1 h de incubação a 37 ºC (63). Peichoto et al. (64) relataram que
a patagonina, uma Sv-CRISP (~25 kDa) de Philodryas patagoniensis (colubrídeo sul-
americano), causa mionecrose e infiltração leucocitária polimorfonuclear em músculo
gastrocnêmio de camundongos. Porém, ao contrário de outras Sv-CRISPs, a
patagonina não afeta a musculatura lisa de anéis aórticos, sugerindo que essa toxina
não possui ação bloqueadora em canais iônicos. De modo geral, mais estudos são
necessários para determinar a relevância dos achados destes estudos para os
fenômenos que ocorrem in vivo nos envenenamentos.
Uma característica comum às Sv-CRISPs estudadas até o momento é a
ausência de atividades enzimáticas. No entanto, esta ausência reflete mais a natureza
incompleta da maioria dos estudos que focaram primordialmente em atividades
biológicas em detrimento às atividades enzimáticas do que à ausência de atividade
enzimática de fato. Em um dos poucos estudos a investigar esta questão, Milne et al.
(14) isolaram uma proteína com ação proteolítica, denominada Text 31, da peçonha do
gastrópode C. textile e que apresentava identidade com Sv-CRVPs. Esta proteína
mostrou atividade proteolítica sobre substratos sintéticos e era inibida por SBTI (soy
bean trypsin inhibitor), um importante inibidor de tripsina.
Além das atividades indicadas acima, as sv-CRISPs possuem outras
propriedades não relacionadas com o envenenamento. A crovirina, isolada da peçonha
de Crotalus viridis viridis (cascavel da pradaria da América do Norte) mostrou atividade
anti-parasitária sobre Leishmania amazonenses, Trypanosoma brucei rhodesiense e
Tryapanosoma cruzi: quando co-incubada por 72 h com esses parasitas, a covirina
(0,05-0,2 µM) invabilizou até 60% das células (65). Por vias bastante similares às
elucidadas por Wang et al. (60), mas com resultado diverso, Lecht et al. (39) mostraram
que a ES-CRISP, de Echis carinatus sochureki, inibiu a formação de novos vasos em
células HUVEC em Matrigel (na concentração de 2 µM) em até 75% e também atenuou
a angiogênese em membrana corio-alantóide de embrião de galinha (na dose de 20
28
µg). Esta ação parece estar relacionada à inibição da fosforilação de MAPK por ES-
CRISP.
1.4. POR QUE ESTUDAR SV-CRISPS?
Conforme indicado acima, as Sv-CRISPs possuem algumas atividades
biológicas que podem contribuir para o quadro de envenenamento. Entretanto, a
grande dificuldade no estudo destas toxinas é que, apesar de várias delas já terem sido
purificadas e caracterizadas, há poucas investigações sistemáticas das suas atividades
enzimáticas e biológicas, sendo que a maioria dos estudos tem focado a ação sobre
canais iônicos. Uma das principais causas disso é a quantidade diminuta encontrada
nas peçonhas e o relativo baixo rendimento durante a purificação, o que inviabiliza
estudos muito extensos. De qualquer forma, os estudos realizados até o momento
mostram que as Sv-CRISPs possuem atividades interessantes. Por exemplo, a indução
de processos inflamatórios locais pela patagonina (64) e natrina (60) indica a
necessidade de mais estudos sobre o possível papel das Sv-CRISPs no
envenenamento, especialmente no caso de peçonhas como as botrópicas, que são
conhecidas por suas manifestações locais (dor, edema, inflamação, hemorragia e
mionecrose) marcantes. Além disso, as Sv-CRISPs podem ser úteis como ferramentas
para elucidar os mecanismos fisiológicos envolvidos na fertilidade, na imunidade e na
biologia tumoral (66). A Fig. 3 resume algumas das atividades já descritas para Sv-
CRISPs.
29
Figura 3. Algumas atividades biológicas já descritas para Sv-CRISPs. (Fontes: Refs.15, 57-65)
30
2. OBJETIVOS
Considerando que há poucos estudos sobre as Sv-CRISPs de peçonhas
botrópicas, o objetivo principal desta investigação foi purificar e caracterizar bioquímica
e biologicamente uma Sv-CRISP da peçonha de Bothrops jararaca.
Os objetivos específicos foram:
1. Purificar e identificar a proteína baseada na sua estrutura primária.
2. Investigar as atividades enzimáticas da proteína purificada e sua
imunoreatividade contra o antissoro botrópico.
3. Avaliar algumas atividades biológicas da proteína purificada para entender
sua participação nos efeitos do envenenamento.
31
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. REAGENTES E PEÇONHA
O anticorpo de coelho anti-IgG de cavalo conjugado com peroxidase, N-
benzoil-L-arginina p-nitroanilida (BAPNA), azocaseína, caseína, 4-cloro-1-naftol, 1,10-
fenantrolina, fibrinogênio livre de plasminogênio, n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil éster, p-
nitrofenil, tosil-L-arginina metil éster (TAME), trombina bovina e vermelho Congo-
elastina foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). A resina
Superdex 75 e HiTrap Q-Sepharose, bem como os reagentes para eletroforese, os
marcadores moleculares e as membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) para
imunoblot foram adquiridos da GE Lifesciences (Piscataway, NJ, EUA). Agarose e
EDTA foram adquiridos da USB (Cleveland, OH, EUA) e fenilmetanosulfonilfluoreto
(PMSF) foi adquirido da Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Os anestésicos isofluorano
e tiopental foram adquiridos da Cristália Indústria Farmacêutica (Itapira, SP, Brasil). Os
sais e tampões utilizados para soluções foram obtidos da J.T. Baker/Mallinckrodt
(Cidade do México, México) e Merck Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ,
Brasil). Tubos Amicon® foram obtidos da Merck-Millipore (Billerica, MA, EUA).
A peçonha liofilizada, extraída de exemplares adultas de B. jararaca, foi obtida do
Centro de Estudos de Toxinas Animais (CETA, Morungaba, SP) e estocada a -20 ºC.
3.2. PURIFICAÇÃO DA SV-CRISP-BJ
3.2.1. Gel filtração em Superdex 75
A cromatografia da peçonha por gel filtração e troca iônica foi realizada
essencialmente conforme descrita anteriormente (67). Para a gel filtração, a peçonha
liofilizada (100 mg) foi solubilizada em 2 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, contendo CaCl2
10 mM e NaCl 150 mM. A solução foi clarificada por centrifugação (12.000 x g, 5 min, 4
ºC) e o sobrenadante foi aplicado em coluna (16 x 60 cm) preenchida com Superdex 75
equilibrada com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas usando um fluxo de 0,5
ml/min e o perfil de eluição foi monitorado a 280 nm. Frações de 1 ml foram coletadas
usando um cromatógrafo ÄKTAprime (GE Lifesciences) e foram testadas quanto à sua
atividade caseinolítica. O segundo pico do perfil de eluição que apresentou essa
atividade foi concentrado por centrifugação (3.000 x g, 30 min, 4 ºC) em filtro Amicon
32
(10 kDa) usando tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, contendo CaCl2 10 mM. O conteúdo
proteico foi dosado pelo método de Lowry (seção 3.4) e o volume foi corrigido para uma
concentração de 2 mg/ml antes de estocar o pico a 4 ºC.
3.2.2. Cromatografia por troca aniônica em coluna HiTrap Q-Sepharose
O material concentrado da etapa anterior foi aplicado em coluna HiTrap Q-
Sepharose de 5 ml equilibrada com Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, contendo CaCl2 10 mM.
Um mililitro desse concentrado foi injetado na coluna seguido por eluição a um fluxo de
0,5 ml/min usando um gradiente linear de sal (0-0,5 M). O perfil de eluição foi
monitorado em 280 nm e frações de 0,5 ml foram coletadas e testados quanto à sua
atividade caseinolítica.
3.2.3. Determinação de pureza por HPLC
A proteína obtida na etapa anterior foi concentrada e a pureza foi verificada
aplicando-se 100 μg em sistema de HPLC Shimadzu constituído de bombas LC-10AD-
VP e leitor de UV-VIS SPD-10AD-VP (Shimadzu Co., Tóquio, Japão) com coluna
Júpiter C18 (5 m 300 Å; Phenomenex) acoplada ao sistema e equilibrada com ácido
trifluoroacético 0,1% (tampão A). A proteína foi eluída usando um gradiente de 0 a
100% de acetonitrila (90% em água; tampão B) em ácido trifluoroacético 0,1% a um
fluxo de 1 ml/min, sendo que o perfil de eluição foi monitorado em 280 nm.
3.3. ELETROFORESE (SDS-PAGE)
A eletroforese foi realizada em sistema descontínuo (SDS-PAGE) usando gel
de empacotamento de 4% preparado em Tris HCl 0,5 M, pH 6,8, contendo 0,4% de
SDS e gel de migração de 15% preparado em Tris HCl 1,5 M, pH 8,8 contendo 0,4% de
SDS conforme descrito por Laemmli (68). Vinte microlitros de amostra (contendo 20 μg
de peçonha, frações ou proteína purificada) foram completados com 20 μl de tampão de
amostra (4% (p/v) de azul de bromofenol, SDS 2%, glicerol 10%, Tris HCl 0,5 M, pH
6,8) e então as amostras foram fervidas por 5 min e aplicadas no gel de
empacotamento. Em alguns casos, para redução das proteínas envolvendo quebra das
pontes dissulfeto, as amostras foram incubadas com 0,1% de DTT ou -mercaptoetanol
33
antes da eletroforese. Para os ensaios de immunoblotting foram utilizadas as doses de
25 e 50 µg de peçonha e 40 µg de Sv-CRISP-Bj. Os géis (10 x 12,5 cm) foram fixados
em cuba vertical mini-SE 260 (GE Lifesciences) acoplada à fonte elétrica EPS 600 (GE
Lifesciences), imersos em tampão Tris HCl 0,625 M-glicina 1,2 M, pH 6,8, contendo
SDS 10%, e então submetidos a 100 V constantes com corrente elétrica de 25 mA.
Após a corrida, os géis foram corados por prata. Foram incluídas em cada corrida
proteínas marcadoras de massa molecular e a massa molecular da proteína purificada
foi determinada conforme recomendado pelo fabricante.
3.4. CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA
A concentração de proteínas nas amostras foi determinada pelo método de
Lowry et al. (69), usando albumina bovina como padrão.
3.5. IMUNOBLOT DA PROTEÍNA FRENTE AO ANTISSORO BOTRÓPICO
Após a eletroforese (vide supra), as proteínas foram transferidas para
membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (70,71) em uma câmara de
transferência Mighty Small TE22 (Hoefer-Pharmacia, Suécia). Após a transferência, os
sítios de ligações inespecíficas nas membranas foram bloqueados por incubação de 2 h
com Tween 20 a 0,05% (pH 7,6) contendo 5% de leite desnatado. Subsequente a seis
lavagens com tampão de TBS-T (Tris HCl 0,01 M, NaCl 0,17 M e Tween 20 a 0,02%),
as membranas foram incubadas com antissoro botrópico (Fundação Ezequiel Dias -
FUNED, Belo Horizonte, MG) diluída a 1:1000 em TBS-T durante a noite à temperatura
ambiente. Após mais seis lavagens, as membranas foram incubadas com um anticorpo
de coelho anti-IgG de cavalo conjugado com peroxidase diluído a 1:1500 em TBS-T. Ao
fim de 2 h, as membranas foram lavadas e as bandas imunorreactivas foram detectadas
com uma solução de 4-cloro-1-naftol mais H2O2 após incubação durante 10-30 min à
temperatura ambiente e, em seguida, documentada.
3.6. IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Amostras eluídas em RP-HPLC de proteína purificada foram submetidas a
digestão por proteases tripsina e endopeptidase SV8 para posterior sequenciamento e
34
identificação. As amostras (30µg) de proteína liofilizadas foram ressuspendidas em 50
mM NH4HCO3 pH 8,0 e a suspensão foi adicionado 4 mM de DTT (concentração final) e
então incubada por 30 minutos a 60ºC. Após isso, as amostras foram submetidas a
alquilação pela adição de 14 mM de iodocetamida e incubação por 15 minutos a
temperatura ambiente e total escuridão. O bloqueio da alquilação foi feita por adição de
5 mM de DTT. Dez microlitros (10µg) da proteína foram incubados a 37ºC por 16 horas
na presença de tripsina ou SV8 endopeptidase (proporção 50:1, amostra:enzima).
Dessas amostras, um volume de 4,5µL foi aplicado em esquema LC/MS MS utilizando
coluna C18 RP-nanoUPLC (100 X 6100 mm) e espetometro de massas ESI Q-Tof
Premier (Waters, MA, EUA). A identificação dos fragmentos foi obtida por busca em
banco de dados (snake databases) usando o sistema MASCOT (Matrix Science, UK)
foram feitas essencialmente conforme descrito anteriormente (72).
Uma vez identificadas, as sequencias foram submetidas a alinhamento in
silico. Foram utilizados os softwares EditSeq e MegAlign (DNAStar Inc., Madison, WI,
EUA) versão 5.01. Resumidamente, as sequencias foram transferidas uma a uma em
software EditSeq para a produção de arquivos com extensões compatíveis com o
MegAlign. Baseado em instruções do fabricante, todos os arquivos foram transferidos
para software MegAlign com o qual o alinhamento das sequencias foi obtido utilizando o
método CLUSTAL V contra as sequencias das CRISPs das espécies Sorex araneus
(mamífero), Crotalus viridis (serpente) e Deinagkistrodon acutus (serpente). Uma vez
que a sequencia da Sv-CRISP foi obtida, essa foi comparada e alinhada a outras sv-
CRISPs utilizando o mesmo software, contudo utilizando o método CLUSTAL W no
modo default.
3.7. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
3.7.1. Atividade caseinolítica
A atividade sobre caseína foi analisada pelo método de Kunitz (73). Para o
ensaio, 1,9 ml de solução de caseína (1% em Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8) foram incubados
com 0,1 ml de amostra por 20 min, a 37 ºC. Após esse tempo, a reação foi interrompida
adicionando-se 2 ml de solução de ácido tricloroacético 5% e mantida em gelo por 30
min. Terminada a incubação, as amostras foram centrifugadas (2.500 x g, 15 min,
35
temperatura ambiente). A absorbância do sobrenadante foi determinada em 280 nm em
espectrofotômetro Beckman DU800. Uma unidade de atividade foi definida como o
aumento de 0,001 unidades na absorbância (A280 nm)/min.
3.7.3. Atividade fibrinogenolítica
Foi utilizada uma solução de fibrinogênio (5 mg/ml) livre de plasminogênio
solubilizado em Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,1 M. Para o ensaio, 100 μl (10
μg) de amostra foram incubados com 100 μl da solução de fibrinogênio a 37 ºC e 20 μl
dessa mistura foram transferidos para tubos tipo Eppendorf contendo 20 μl de uma
solução contendo -mercaptoetanol 2% e SDS 2% nos tempos 0 min, 5 min, 10 min, 30
min, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h. As amostras foram corridas por SDS-PAGE (68) em géis de
12,5% de acrilamida. Para os ensaios de inibição, utilizamos três inibidores, nas
concentrações finais indicadas: 1,10 fenantrolina 5 mM (inibidor de metaloproteases),
EDTA 5 mM (inibidor de metaloproteases) e PMSF 10 mM (inibidor de serinoproteases).
A Sv-CRISP-Bj (10 µg/90 µl) foi pré-incubada com 10 µl de inibidor na concentração
indicada por 10 min, e após isso foram adicionados à mistura 100 µl de substrato,
seguindo o ensaio como descrito acima.
3.7.4. Atividade fibrinolítica
A atividade fibrinolítica foi determinada conforme descrito por Maruyama et
al. (74), com algumas modificações. A atividade foi medida utilizando-se placas de Petri
contendo solução de 1% de agarose e fibrinogênio livre de plasminogênio (0,5%)
incubado com 30 μl de trombina (1000 unidades/ml) preparada em Tris-HCl 0,1 M, pH
7,5, contendo NaCl 0,1 M. Para o ensaio, foram usadas 30 μg de peçonha e 30 g de
proteína purificada. Amostra (peçonha ou proteína purificada) e tampão sozinho
(branco) foram adicionados à placa, seguido por incubação por 18 h a 37 ºC. Após esta
incubação, os halos de lise foram medidos. Uma unidade de atividade fibrinolítica (U)
correspondia a um halo de lise de um centímetro de diâmetro e a „atividade específica‟
correspondia à atividade fibrinolítica presente em 1 mg de proteína (U/mg).
36
3.7.5. Atividade elastásica
A atividade elastásica foi determinada usando dois substratos: elastina
acoplada ao corante vermelho do Congo e o substrato sintético n-t-boc-L-alanina p-
nitrofenil éster. Para o ensaio com elastina-vermelho do Congo, o substrato foi
suspendido (1 mg/ml) em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2 e então 100 μl dessa
suspensão foram incubados com 100 μl (40 μg) de amostra (ou tampão, no caso do
branco) por 18 h a 37 ºC. Após esse período, as amostras foram centrifugadas (10.000
x g, 15 min, 8 ºC) e a absorbância do sobrenadante foi lida em 490 nm. Uma unidade
de atividade corresponde ao aumento de 0,001 na absorbância por hora de incubação
(75). O ensaio com n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil éster foi feito segundo Visser e Blout
(76). O substrato foi dissolvido em tampão fosfato 50 mM, pH 7,2. O ensaio foi realizado
em placas de 96 poços, sendo que 150 μl de substrato (0,2 mM) foram colocados em
cada poço juntamente com 50 μl de amostra (40 μg) ou tampão (branco). A placa foi
incubada a 37 ºC por 30 min e a absorbância foi lida a 348 nm. Construiu-se então uma
curva de calibração com p-nitrofenol vs. A348nm onde uma unidade de atividade
correspondia à liberação de 1 µmol de p-nitrofenol/min. A comparação entre as
amostras foi feita com base nas atividades específicas (µmol/min/mg).
3.7.6. Atividade esterásica
A atividade esterásica foi investigada usando o substrato N-p-tosil-L-
arginina éster (TAME), segundo o método de Schwert e Takenaka (77). Uma solução
mãe de TAME (1 mM) foi preparada em Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8. A um volume de 0,47
ml de substrato foi adicionado 0,5 ml de tampão e 0,03 ml de amostra (40 μg de
peçonha ou proteína purificada). A mistura foi incubada por 10 min a temperatura
ambiente e o aumento na absorbância das amostras foi monitorado continuamente a
253 nm. Uma unidade de atividade foi definida como um aumento de 0,001 na
absorbância A253nm/min.
3.7.7. Atividade amidolítica
O substrato Nα-benzoil-L-arginina p-nitroanilida (BAPNA) é usado para
detectar principalmente atividade serinoprotease (78). Esse teste foi feito conforme
37
descrito por Torres-Huaco et al. (79). Uma solução-estoque de BAPNA (100 mM) foi
preparada em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e a solução foi diluída em Tris-HCl 10 mM,
pH 8,0, CaCl2 1 mM para obter uma solução de trabalho (1 mM). Duzentos microlitros
de substrato (1 mM) foram, então, incubados, com 20 µl de amosta (1-300 µg de
peçonha ou 40 µg de proteína purificada) por 30 minutos a 37 ºC. A atividade da curva
foi expressa em nmol/min e a atividade específica em nmol/min/mg. Para os cálculos foi
utilizanda a lei de Beer-Lambert admitindo 30 min de reação, coeficiente de extinção
molar de 8800 para p-nitroanilida e caminho óptico de 1 cm.
3.8. ATIVIDADES BIOLÓGICAS
3.8.1. Animais
Camundongos Swiss machos (25-30 g) e ratos Wistar machos (300-350 g)
foram obtidos do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB/UNICAMP) e
foram mantidos no Biotério do Departamento de Farmacologia da FCM/UNICAMP. Os
animais foram alojados 5 (ratos) ou 10 (camundongos) por gaiola a 23 oC sob ciclo de
luz/escuro de 12 h, com livro acesso à água e ração. Os protocolos experimentais
usando animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da
UNICAMP (CEUA/UNICAMP, protocolo no. 2253-1).
3.8.2. Atividade trombina-símile
Uma solução de 5 mM de fibrinogênio bovino livre de plasminogênio foi
preparada em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 contendo 0,1 M de NaCl. Cento e oitenta
microlitros dessa solução foram incubadas por 10 min em 37 °C e então 20 μl de
amostra (10 μg e 40 μg de peçonha ou proteína purificada) no mesmo tampão foram
adicionados a solução e o tempo de coagulação foi tomado. A atividade trombina-símile
das amostras foi comparada baseada em uma curva-padrão construída com diferentes
concentrações de trombina bovina.
3.8.3. Tempo de coagulação
Ratos Wistar machos foram anestesiados com isoflurano e exsanguinados
via artéria aorta com escalpes (19G) citratados (3,8%). O sangue foi coletado em tubos
38
de polipropileno contendo citrato 3,8% e centrifugado (2000 x g, 12 min, temperatura
ambiente) para obtenção do PPP. Cento e oitenta microlitros de PPP foram adicionados
a 20 μl de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 contendo 10 μg e 40 μg de peçonha e
proteína purificada, respectivamente, e o tempo decorrido para a formação das
primeiras fibras do coágulo foi tomado.
3.8.4. Tempo de recalcificação
O tempo de recalcificação de plasma citratado foi avaliado conforme descrito
por Berger et al. (80). Ratos foram anestesiados com isoflurano e o ramo descendente
da aorta foi exposto para coleta de sangue em tubos de polipropileno contendo 1 ml de
citrato de sódio 3,8%. Em seguida, o sangue foi centrifugado (2000 x g, 12 min,
temperatura ambiente) para a obtenção do plasma pobre em plaqueta (PPP). O PPP foi
transferido para uma placa de 96 poços (50 µl/poço) e incubado com 10 µl de amostra
(controle: Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; amostra: 10 ou 40 µg de proteína isolada) por 5 min
a 37 ºC. Após esse tempo, 10 µl de CaCl2 250 mM foi adicionado a cada poço e o
aumento de absorbância em 650 nm foi monitorado por 30 min a intervalos de 1 min. O
resultado foi expresso em aumento de absorbância.
3.8.5. Agregação plaquetária
A agregação plaquetária foi realizada por ensaio turbidimétrico (81) com um
agregômetro (Chrono-log Lumi-Aggregometer modelo 560-Ca; Havertown, PA, EUA). O
sangue arterial de rato foi recolhido em tubos de polipropileno contendo um décimo do
volume final de citrato de sódio a 3,8% (1:9, v/v). O plasma rico em plaquetas (PRP) foi
obtido por centrifugação de sangue total (400 x g, 15 min, temperatura ambiente) e
lavado numa solução tampão (composição em mM: citrato de sódio 12, NaCl 140, KCl
5, glucose 10 e sacarose 12, pH 6) numa proporção de 5:7 (v/v) de PRP:solução
tampão e centrifugado (800 x g, 13 min, 20 °C). O precipitado de plaquetas foi
suavemente ressuspenso numa solução de Krebs-Ringer desprovida de Ca2+ (NaCl 118
mM, NaHCO3 35 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4.7H2O 1,17 mM, glicose 5,6
mM) e as plaquetas foram contadas em câmara de Neubauer. A suspensão plaquetária
final foi ajustada para 1,2 x 108 plaquetas/ml. Os ensaios de agregação foram
39
realizados utilizando 400 μl da solução de plaquetas lavadas em uma cubeta e
incubadas a 37 ºC com agitação constante. Os resultados foram expressos em % de
absorbância.
3.8.6. Atividade hemorrágica
A atividade hemorrágica foi avaliada conforme descrito por Theakston e Reid
(82). Ratos Wistar machos foram anestesiados com tiopental (30 mg/kg, i.p.) e, após
tricotomia do dorso, foram injetados intradermicamente (i.d., 100 µl) com 4,5, 13,5 e
45,0 μg de peçonha ou 30 μg de proteína purificada diluídas em tampão Tris-HCl 10
mM, pH 8,0, contendo CaCl2 10 mM. O tampão sozinho foi usado como controle. Após
24 h, os ratos foram sacrificados com isoflurano e a pele dorsal foi removida e o
diâmetro do halo hemorrágico da face interna foi medida. A dose hemorrágica mínima
(DHM), definida como a quantidade de proteína suficiente para causar um halo de 1 cm
de diâmetro, foi determinada por interpolação a partir de uma curva das doses de
proteína vs. o halo hemorrágico produzido com cada dose indicada acima, usando a
opção „Fit spline/LOWESS‟ no software Prism v.5.0 (GraphPad, La Jolla, CA, EUA).
3.8.7. Permeabilidade vascular
O ensaio para a quantificação de plasma extravasamento em local de
inoculação da toxina foi feito conforme Brain e Williams (83). Dessa forma, ratos Wistar
machos foram anestesiados com tiopental sódico (30 mg/kg, i.p.) e doses de
manutenção foram administradas quando necessário. O extravasamento de proteínas
plasmáticas em resposta à injeção intradérmica de peçonha (3-40 μg/sítio), proteína
purificada (10 e 30 μg/sítio) ou solução de Tyrode (composição, em mM: NaCl, 137;
KCl, 2,7; MgCl2, 0,5; NaH2PO4, 0,4; NaHCO3, 11,9 e glicose, 5,6; 100 μl; controle) foi
avaliado em pele dorsal depilada dos ratos. O extravasamento de proteínas plasmáticas
foi medido pelo acúmulo de 125I-albumina sérica humana (2,5 μCi/rato, i.v.); o corante
azul de Evans (20 mg/kg, i.v.) foi usado como marcador visual para identificar os sítios
de injeção. Trinta minutos após a injeção das substâncias teste, uma amostra de
sangue (1 ml) foi coletada por punção cardíaca e transferida para tubos de polipropileno
contendo 100 μl de heparina antes de ser centrifugado (8.000 x g, 10 min, temperatura
40
ambiente) para obtenção do plasma. Em seguida, os ratos foram eutanasiados por
overdose de isoflurano e a pele dorsal removida. Os sítios injetados foram recortados e
a radioatividade mensurada, juntamente com as amostras de plasma, em um contador
gama. O extravasamento de plasma foi expresso como o volume (μl) de plasma
acumulado em cada local da pele em comparação com a contagem total em 1 ml de
plasma.
3.8.8. Miotoxicidade
Para determinação da miotoxicidade, camundongos Swiss machos foram
injetados (volume de 100 µl) no músculo gastrocnêmio direito com proteína purificada
(40 µg) ou Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (controle). Após 6 h, os animais foram anestesiados
com isoflurano e amostras de sangue retiradas, por punção cardíaca, para a
quantificação da atividade plasmática de creatina quinase (CK), e em seguida os
animais foram mortos com overdose de anestésico. O sangue transferido para tubos
Eppendorf e centrifugado (1000 x g) em temperatura ambiente por 10 min a fim de
obter-se o plasma. A quantificação de CK foi realizada utilizando kits comerciais
(LaborLab, Guarulhos, SP, Brasil). O músculo injetado foi removido nesse mesmo
tempo e processado para análise histológica.
3.8.9. Análise histológica
O músculo gastrocnêmio dissecado foi imediatamente lavado em PBS e
transferido para cassetes de plástico e fixados em solução paraformaldeído 10%
(Synth) preparado em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 durante 12 h. Uma vez fixado, o
material passou por diafanização com xilol e inclusão em parafina (Histotec, Merk). Os
blocos de parafina foram seccionados em micrótomo (Leica RM 2245, Alemanha) em
cortes de 5 µm de espessura. Essas secções foram coradas com hematoxilina-eosina e
analisadas em microscopia de luz utilizando um microscópio Leica DM 5000 B (Leica,
Alemanha). As imagens foram capturadas e analisadas usando camêra CCD Leica
CTR5000 e software Qwim Plus versão 3.2.0.
41
3.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. As comparações
estatísticas foram feitas usando o test t de Student ou ANOVA seguida pelo teste de
múltiplas comparações de Bonferroni. Valores de p<0,05 indicaram significância.
42
4. RESULTADOS
4.1. PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA SV-CRISP-BJ
A cromatografia da peçonha por gel filtração resultou em dois picos que
apresentaram atividade caseinolítica (picos numerados em 1 e 2) (fig. 4A) dois quais o
pico 2 foi utilizado para a caracterização da BJ-P12, uma metaloprotease (SVMP) da
classe P-I (67). Quando este pico foi concentrado e submetido à cromatografia de troca
iônica, foi obtido o perfil mostrado na Fig. 4B abaixo. O pico contendo a Sv-CRISP
correspondeu ao segundo pico não retido na coluna (eluido antes do gradiente e
indicado pela seta vermelha). A eletroforese deste pico por SDS-PAGE resultou em
uma única banda com massa molecular estimada em 29,8±0,3 (n=3) kDa (Fig. 4C). A
pureza da proteína foi confirmada por RP-HPLC que revelou um único pico principal
(Fig. 4D). A eletroforese por SDS-PAGE realizada em condições redutoras indicou que
a proteína consistiu de uma única cadeia proteica (Fig. 4E).
A Sv-CRISP-Bj foi reconhecida pelo antissoro botrópico, mostrando que a
proteína é imunogênica (Fig. 5). A comparação da localização desta banda com o perfil
de imunorreatividade da peçonha indica a detecção da presença de uma banda
bastante fraca apenas quando usada a quantidade de 50 g de peçonha, o que reflete
o baixo conteúdo da Sv-CRISP-Bj na peçonha. De fato, na purificação, o
rendimento proteico médio foi de 0,25%, ou seja, a cada 100 mg de peçonha
inicialmente aplicada em gel filtração, recuperamos 250 µg de proteína purificada após
a segunda etapa. Aplicando-se tal rendimento às amostras de imunoblot, a quantidade
de Sv-CRISP-Bj em 50 g de peçonha seria 0,125 µg, o que provavelmente teria pouca
reatividade no ensaio (embora esta questão não tenha sido investigada). Por outro lado,
o uso de 40 µg da Sv-CRISP-Bj resultou em reação bastante forte.
43
Figura 4. Purificação da Sv-CRISP-Bj de B. jararaca. A. Perfil de eluição da gel filtração segundo da Silva et al. (67). A linha tracejada representa o perfil de eluição das proteínas com atividade caseinolítica. Os números indicam os picos de atividade. B. A segunda etapa (troca iônica em coluna de HiTrap Q-Sepharose) da purificação da BJ-PI2 (67), mostrando o pico (seta) correspondente à Sv-CRISP-Bj. Note que este segundo pico de troca iônica não possui atividade caseinolítica. ( ) A280 nm, ( ) atividade caseinolítica. C. SDS-PAGE da Sv-CRISP-Bj. Gel de poliacrilamida a 15%, coloração com prata. Faixa 1 - marcadores de massa molecular, Faixa 2 – Sv-CRISP-Bj. D. RP-HPLC da Sv-CRISP-Bj. E. A massa molecular da Sv-CRISP-Bj determinada por SDS-PAGE em condições não redutoras e redutoras. Faixa 1 – Marcadores de massa molecular, Faixa 2 – condições não redutoras, Faixa 3 – ditiotreitol 0,1 M (DTT) e Faixa 4 – β-mercaptoetanol 0,1% (w/v). Gel corado com azul de Coomassie.
1 2 3 4 kDa
97
66 45
30
20,1
14,4
D
1 2 kDa
97
66
45
30
20,1
14,4
B C
A
E
44
Figura 5. Detecção da Sv-CRISP-Bj por imunoblot. Peçonha (50 e 25 g, pista 1 e 2, respectivamente) e
Sv-CRISP-Bj (40 g, pista 3) foram aplicadas em gel de poliacrilamida a 12,5% e corridas por SDS-PAGE
em sistema mini-VE 206E. Após a corrida, as amostras foram transferidas para uma membrana de PVDF
em câmara de transferência Mighty Small TE22. Após bloqueio dos sítios inespecíficos, a membrana foi
incubada com antissoro botrópico e posteriormente as bandas foram detectadas com uma solução de 4-
cloro-1-naftol mais H2O2 após incubação por 10 min em temperatura ambiente. Note a pequena banda
(seta, pistas 1 e 2) na mesma altura que a Sv-CRISP-Bj (pista 3), provavelmente correspondente à
proteína purificada.
A análise por espectrometria de massa dos fragmentos obtidos em digestão
por tripsina e endopeptidase SV8 mostrou identidade com fragmentos de três CRISPs
(Tabela 3). Nenhum dos fragmentos mostrou homologia com proteínas de outras
classes de toxinas, tais como SVMPs ou SVSPs. Este mesmo resultado (identificação
de fragmentos com homologia com Sv-CRISPs, mas não com outras proteínas de
peçonha ofídica) foi obtido em análises realizadas em três locais e aparelhos diferentes
(Instituto de Química-UNICAMP, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais-
CPNEM, e Instituto Butantan). Para obtenção das sequências, o espectro de cada um
dos fragmentos foi comparado com os dados de massa de fragmentos em banco de
kDa
202
116
80
38
30
15
1 2 3
45
dados para identificar peptídeos com massas iguais, o que permitiu então a
identificação dos aminoácidos contidos nos fragmentos da amostra.
Uma vez efetuado o alinhamento destes fragmentos com sequências de
outras Sv-CRISPs obtidas de bancos de dados observou-se identidade superior a ~85%
com proteínas de outros crotalídeos e entre ~60% e 65% com proteínas de elapídeos
(Fig. 6). Baseado nestes resultados, concluímos que se tratava de uma Sv-CRISP que
denominamos Sv-CRISP-Bj. Considerando que o comprimento médio das Sv-CRISPs é
de 220 aminoácidos, conseguimos determinar ~33% da sequência total da Sv-CRISP-
Bj. A Fig. 6 mostra que identificamos três resíduos de cisteína (tachados em amarelo) e
que sequenciamos boa parte do domínio PR-1 (flecha vermelha), características estas
baseadas no trabalho de Guo et al. (56).
Sequência Massa
Espécie
Observada Calculada
SVDFDSESPR 1137,4825 1137,4925 D. acutus
SVNPTASNMLK 1160,5566 1160,5859 D. acutus
WTEIIHAWHGEYK 1668,7842 1668,8049 D. acutus
KPEIQNEIVDLHNSLR 1903,9845 1904,0115 D. acutus
YYFVCQYCPAGNLR 1809,7845 1809,7967 S. araneus
IIHAWHGE 961,4784 961,4770 C. viridis
RWAYRCIE 1152,5302 1152,5498 C. viridis
SVDFDSESPRKPE 1491,6419 1491,6841 C. viridis
Tabela 3. Peptídeos obtidos a partir da digestão da proteína Sv-CRISP-Bj com tripsina
(fragmentos em vermelho) e com endopeptidase SV8 (fragmentos em negrito). A
identificação dos fragmentos foi obtida a partir do confronto das massas obtidas
(observadas) com o respectivo banco de dados (massas calculadas). Espécies de origem
do banco de dados: D. acutus: Deinagkistrodon acutus; S. araneus: Sorex araneus; C
viridis: Crotalus viridis.
46
Enquanto esse estudo era finalizado, foi descrita a purificação de uma Sv-
CRISP de B. jararaca (Bj-CRP), com a sequência parcialmente deduzida por
espectrometria de massas (63). A sequência da Bj-CRP está incluída na Fig. 6 para
comparação e mostra que houve 100% de identidade com a Sv-CRISP-Bj
(desconsiderando os aminoácidos que foram sequenciados em apenas uma ou outra
das duas proteínas).
47
Figura 6. Sequência de aminoácidos da Sv-CRISP-Bj, alinhamento e comparação com sequências de Sv-CRISPs isoladas de outras peçonhas
ofídicas. As sequências utilizadas foram obtidas do banco de dados BLAST (Pubmed-Medline). Bj-CRP de Bothrops jararaca (63), Da-CRPb de
Deinagkistrodon acutus (GI:190195339) (National Center for Biotechnology Information em GenBank nº ACE73576.1, 84), piscivorina de
Agkistrodon piscivorus piscivorus (GI:28972957) (85), CV-CRP de Crotalus viridis (GI:190195319) (National Center for Biotechnology Information
em GenBank nº ACE73566.1, 84), triflina de Protobothrops flavoviridis (GI:21305553) (61), catrina de Crotalus atrox (GI:48428839) (85), ophanina
de Ophiophagus hannah (GI:28972961) (85), kaouthina de Naja kaouthia (GI:485956112) (86), natrina de Naja atra (GI:32492059) (57) e
pseudechetoxina de Pseudechis australis (GI:23264042) (87). Os espaços com traços e os quadros em branco correspondem a aminoácidos não
sequenciados e a sequências idênticas, respectivamente. As setas vermelhas indicam o domínio PR-1. Os três pontes dissulfeto formados pelos
resíduos de cisteína identificados (tachados em amarelo) também estão indicados. Baseado em Guo et al. (56).
48
4.2. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA E BIOLÓGICA PARCIAL DA SV-CRISP-BJ
A Tabela 4 apresenta algumas atividades enzimáticas e biológicas da Sv-
CRISP-Bj. A proteína não mostrou atividade proteolítica sobre caseína, porém mostrou
alguma atividade proteolítica inespecífica sobre a elastina-vermelho do Congo, contudo
não houve degradação observável contra o substrato sintético, e específico para
elastase, n-t-boc-L-alanina-p-nitrofenol éster, portanto sendo classificada como
atividade pseudoelastase. A Sv-CRISP-Bj não mostrou atividade fibrinolítica ou
hemorrágica comparada com a peçonha, mas aumentou a permeabilidade vascular em
pele dorsal de ratos, embora em grau menor que a peçonha.
Tabela 4. Atividades enzimáticas e biológicas da Sv-CRISP-Bj.
A quantidade de peçonha e de Sv-CRISP-Bj usada para as atividades esterase, amidase e elastase foi
de 40 µg. Para os ensaios de fibrinólise, hemorragia e permeabilidade vascular foram usados 30 µg de
Sv-CRISP-Bj e de peçonha. Para os testes de tempo de coagulação em fibrinogênio e em PPP foram
utilizados 10 µg de peçonha e 40 µg de Sv-CRISP-Bj. Os valores para 10 U de trombina usada como
controle positivo em fibrinogênio: 16,6 ± 0,6 s (n=3) e PPP: 8,8 ± 2,1 s (n=4). Os resultados são
apresentados como média ± DP (n=3-8). DHM – dose hemorrágica mínima; n.d. – não detectada. *Os
valores para peçonha foram obtidos da Ref. (67).
Atividades Peçonha* Sv-CRISP-Bj
Esterase - TAME (U/mg) 282,0± 22,63 n.d.
Amidase – BAPNA (nmol/min) 0,91±0,02 n.d.
Elastase
n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil (µmol/min/mg) 131,5±27,7 7,1±0,9
Elastina-vermelho de Congo (U/mg) 413,7±34,0 162±52
Atividade fibrinolítica (U/mg) 6,3±0,9 n.d.
Coagulação em fibrinogênio (s) 149,3±22,4 n.d
Coagulação em PPP (s) 45,2±9,7 n.d
Atividade hemorrágica (DHM, μg) 20,7 n.d
Permeabilidade vascular (μl) 141,2±0,63 62,6±12,1
49
Para avaliar a capacidade da Sv-CRISP-Bj em degradar fibrinogênio, foi
incubada uma solução de fibrinogênio (5 mg/ml) com 40 μg de Sv-CRISP-Bj por tempos
variados e também na presença de inibidores de proteases (EDTA, fenantrolina e
PMSF). A Fig. 7A mostra que a Sv-CRISP-Bj degradou as cadeias e do
fibrinogênio (principalmente a cadeia e em grau menor, a ), sem afetar a cadeia . A
atividade fibrinogenolítica foi inibida quando a proteína foi pré-incubada com
fenantrolina 5 mM ou EDTA 1 mM, mas não foi afetada pelo PMSF 5 mM (Fig. 7B).
Estes resultados indicam que a atividade sobre fibrinogênio é dependente de cátions
bivalentes.
Figura 7. Atividade fibrinogenolítica da Sv-CRISP-Bj. A. Cinética da atividade fibrinogenolítica da Sv-
CRISP-Bj. A degradação das cadeias de fibrinogênio foi verificada pela incubação da mistura
fibrinogênio- Sv-CRISP-Bj a 37 °C e posterior análise em SDS-PAGE nos tempos indicados no eixo X. A
Sv-CRISP-Bj (40 g) clivou a cadeia Aα primeiramente, seguida pela cadeia Bβ; a cadeia mostrou-se
relativamente resistente à degradação. B. Inibição da atividade fibrinogenolítica da Sv-CRISP-Bj (40 g)
após pré-incubação, por 10 min a 37ºC, com inibidores de proteases. As concentrações de inibidores
usadas foram: EDTA – 1 mM, 1,10-fenantrolina (Fen) – 5 mM e PMSF – 5 mM. O tempo de incubação do
fibrinogênio com a proteína Sv-CRISP-Bj nestes experimentos foi de 360 min. Em ambas as figuras as
amostras foram aplicadas em géis de poliacrilamida de 12,5% e as proteínas foram separadas por SDS-
PAGE. Os géis foram corados com azul de Coomassie. Fib – fibrinogênio. M – marcadores de massa
molecular (em kDa).
50
Quando à possível atividade coagulante sobre uma solução de 5% de
fibrinogênio ou sobre plasma murino pobre em plaquetas, a Sv-CRISP-Bj não
apresentou nenhuma atividade. Tendo em vista a degradação de fibrinogênio mostrado
na Fig. 7 e a ausência de coagulação, avaliamos o efeito da Sv-CRISP-BJ no tempo de
recalcificação de plasma, in vitro. A Fig. 8 mostra que não houve alteração na fase
inicial da coagulação (ou seja, sem efeito na velocidade da resposta), porém houve
atenuação da magnitude da resposta final, o que corrobora com a degradação de
fibrinogênio visto em SDS-PAGE.
Figura 8. Recalcificação de plasma de rato. Sv-CRVP-Bj (40 µg) ( ) ou Tris-HCl (controle, ) foram
incubados com PPP por 5 min a 37 ºC. Após esse tempo, 10 µl de CaCl2 250 mM foram transferidos para
cada poço e incubados por mais 30 min a 37 ºC. A absorbância foi monitorada em intervalos de 1 min. Os
pontos representam a média ± DP (n=4).
Na agregação plaquetária, a Sv-CRISP-Bj (10 µg e 40 µg) desencadeou, em
plaquetas lavadas, uma resposta com intensidade similar àquela desencadeada pela
trombina, um agonista conhecido deste fenômeno (Fig. 9).
51
Figura 9. Agregação de plaquetas lavadas pela Sv-CRISP-Bj. Quatrocentos microlitros de suspensão,
contendo 1,2 x 108 plaquetas/ml, foram incubados com trombina (200 mU/ml) ou Sv-CRISP-Bj (10 e 40
µg) por 10 min a 37 ºC sob agitação constante. A agregação foi medida em porcentagem de
transmitância de luz. Painel superior: Histograma mostrando a agregação plaquetária em presença nas
duas quantidades de Sv-CRISP-Bj testadas. A linha tracejada representa a agregação em presença de
trombina. As colunas mostram a média ± DP (n = 5). Painel inferior: Curvas típicas de agregação para
cada tratamento.
Peichoto et al. (64) demonstraram que a patagonina provoca mionecrose
quando injetada em gastrocnêmio de camundongo. Dessa forma, avaliamos a
capacidade da Sv-CRISP-Bj de também causar mionecrose. A Fig. 10 mostra que a Sv-
CRISP-Bj (40 µg) não causou aumento significante em níveis plasmáticos de CK e
52
também não resultou no aparecimento de fibras mionecróticas em músculo
gastrocnêmio de camundongo. Contudo, a proteína causou forte migração de células
inflamatórias para o tecido muscular.
53
Figura 10. Miotoxicidade em músculo gastrocnêmio de camundongo. Sv-CRISP-Bj (40 µg) ou salina
0,9% (controle, volume de 100 µl) foi injetado em músculo de camundongo, e após 6 h, os animais foram
eutanasiados e o sangue e o músculo foram retirados para análise. A. Níveis plasmáticos de CK. Não
houve diferença significante entre o controle e a Sv-CRISP-Bj. As colunas representam a média ± DP
(n=5). B. Análise histológica dos músuculos em aumento de 20X. Painéis histológicos A e C: cortes
longitudinais de músculos tratados com salina e Sv-CRISP-Bj, respectivamente. Painéis histológicos B
e D: cortes transversais dos mesmos tratamentos. Em comparação ao controle, a Sv-CRISP-Bj não
causou mionecrose mas estimulou o acúmulo de células inflamatórias (flechas). Coloração: HE. Barra de
escala: 30 m. Painel histológico E: Mionecrose provocada por 40 µg de peçonha de B. jararaca. Setas
mostram infiltrado inflamatório, H, hemorragia e M, mionecrose. Fonte: (67).
A
B
M
E
M
M
H
54
A Tabela 5 compara os resultados obtidos neste estudo com os dados
fornecidos em outros trabalhos que descrevem a caracterização de Sv-CRISP-Bj. Vale
ressaltar que os dados relativos a massa molecular das várias Sv-CRISPs aqui
compilados foram obtidos a partir de diversos métodos. Para ablomina, triflina,
helocopsina, ophanina, catrina e para a Sv-CRISP-Bj, a estimativa foi feita a partir de
ensaio de eletroforese em SDS-PAGE, enquanto para a Bj-CRP e patagonina, houve a
confirmação das respectivas massas a partir de dados de espectrometria de massas.
Os rendimentos apresentados aqui foram estimados baseados na quantidade usada na
primeira etapa cromatográfica de cada método de separação. Contudo, em alguns
trabalhos não há menção à quantidade de proteína pura obtida, e.g., helicopsina. Esta
tabela mostra claramente que há considerável variação nas atividades biológicas
avaliadas para Sv-CRISPs, o que dificulta generalizações sobre estas proteínas. Das
atividades investigadas, a única que consistentemente é negativa nas Sv-CRISPs é a
hemorragia; as outras atividades tem sido investigadas em número muito reduzido de
espécies para permitir conclusões definitivas.
55
Tabela 5. Comparação das atividades encontradas em Sv-CRISP-Bj com outras Sv-CRISPs.
*Não determinado. #Artigo não traz informação.
Espécie Proteína Fibrinólise Fibrinogenólise Hemorragia Edema Mionecrose Rendimento
(%)
Massa
(kDa)
Referência
B. jararaca Sv-CRISP-Bj Não Sim
(cadeias e ) Não Sim Não 0,25 29,8 Esse estudo
B. jararaca Bj-CRP Não Não Não * * 0,1 24,6 (63)
H. angulatus Helicopsina * * Não * * # 20,0 (15)
G. blomhoffi
brevicaudus Ablomina * * * * * 0,70 26,0 (61)
P. flavoviridis Triflina * * * * * * 30,0 (61)
C. atrox Catrina * * * * * * 24,1 (85)
P. patagoniensis Patagonina * * Não Não Sim * 27,4 (64)
O. hannah Ophanina * * * * * * 28,6 (85)
56
5. DISCUSSÃO
5.1. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E ESTRUTURAIS DA SV-CRISP-BJ
Os resultados do presente estudo mostram que purificamos uma Sv-CRISP
da peçonha de B. jararaca em apenas duas cromatográficas, diferentemente ao
processo de três etapas descrito por Ludovicho et al. (63). Esta proteína de massa
molecular de ~29 kDa é monomérica, conforme mostrada por SDS-PAGE em condições
redutoras. O aumento na massa molecular da proteína na presença de DTT ou -
mercaptoetanol provavelmente seja reflexo da abertura da cadeia polipeptídica
subsequente à ruptura das ligações dissulfetos, levando à uma conformação mais
aberta e filamentosa (menos compacta e globular), dificultando assim sua migração em
SDS-PAGE e dando a impressão de uma massa molecular maior. Em relação à massa
molecular, embora seja de 29 kDa, a mais alta entre as Sv-CRISPs, ainda é bastante
semelhante aos achados de outros estudos, conforme indicado na Tabela 5.
Adicionalmente, em relação a outra Sv-CRISP isolada de B. jararaca (Bj-CRP), temos
uma discrepância entre as massas observadas 29,8 kDa (Sv-CRISP-Bj) vs. 24 kDa
(aproximadamente para BJ-CRP) em SDS-PAGE. Essa discrepância pode ser devida à
existência de glicosilações na Sv-CRISP-Bj. Embora não existam estudos em Sv-
CRISPs que apoiem esta afirmação, a SGP-28, uma CRISP-3 encontrada em
leucócitos humanos, possui uma massa de 28 kDa que, após tratamento da proteína
com deglicosilases, sofre uma redução de 3 kDa, (34,35). Em relação ao aumento de
massa apresentado pela Sv-CRISP-Bj em presença de agentes redutores, resultados
similares foram encontrados para a SGP-28 (13) e Bj-CRP (63).
Embora não haja trabalhos mostrando a imurreatividade de Sv-CRISPs em
imunoblot, Calvete et al. (54) e Gay et al. (88) mostraram que os antissoros botrópicos
fornecidos pelo Instituto Butantan e pelo Instituto Vital Brazil formam imunocomplexos
com Sv-CRISPs de B. atrox e B. diporus, respectivamente. Outros estudos de
antivenômica mostram que Sv-CRISPs de elapídeos podem ser reconhecidos pelos
antivenenos específicos para as serpentes de origem (89). Apesar destes estudos
mostrando a imunorreatividade de Sv-CRISPs com antivenenos, ainda será necessário
mostrar a inibição das atividades biológicas destas proteínas pelos antivenenos.
57
Como mencionado acima, o rendimento de Sv-CRISP-Bj após a purificação
foi de 0,25%, valor semelhante àquele relatado para outras Sv-CRISPs (Tabela 5). É
importante notar a diferença de rendimento entre nosso trabalho e o de Ludovicho et al
(63). Nesse último, houve o rendimento de 0,1% no processo de isolamento de Bj-CRP,
sendo que essa diferença pode ser devida à etapa adicional usado por estes autores.
De qualquer forma, em ambos os estudos o rendimento está abaixo da abundância de
Sv-CRISPs verificada por análises proteômicas e transcriptomas, sugerindo
discrepância entre a expressão gênica e a abundância protéica; pode também refletir
uma perda de material durante a purificação. Cidade et al. (50) mostraram que os
transcritos para Sv-CRISP correspondiam a 1,6% do total de transcritos de toxinas em
transcriptoma de B. jararaca. Posteriormente, Zelanis et al. (52) mostraram diferenças
no conteúdo de Sv-CRISPs nos transcriptomas de indivíduos juvenis (2,7%) e adultos
(1,5%) de B. jararaca. Estudos proteômicos com outras espécies botrópicas (52,54) e
com Crotalus durissus ssp. (90) mostraram números similares a esses.
A digestão enzimática com tripsina e endopetidades SV8 resultou em
fragmentos que, quando analisados por espectrometria de massas, permitiram a
identificação da proteína como uma Sv-CRISP baseado em buscas em banco de dados
e alinhamento de sequências. Considerando que as CRISPs possuem um tamanho
médio de 220 aminoácidos (1,61) (Fig. 6), sequenciamos ~33% da proteína (72
aminoácidos). Os fragmentos identificados mostraram homologia e alta identidade com
outras Sv-CRISPs, inclusive com fragmentos de Sv-CRISP identificados em estudo
proteômico de B. jararaca. Ludovicho et al. (63) sequenciaram 100 aminoácidos da Bj-
CRP. Diferenças no tempo de incubação com as enzimas de digestão podem ter
afetado o rendimento de fragmento para o sequenciamento. Em nosso trabalho,
utilizamos um tempo de digestão de 16 h enquanto Ludovicho et al. (63) utilizaram um
tempo de 24 h, o que pode ter resultado em maior digestão das amostras. O
alinhamento das sequências da Sv-CRISP-Bj e da Bj-CRP (Fig. 6) revelou altíssima
homologia entre as duas proteínas, sugerindo que são a mesma proteína.
Segundo Guo et al. (56) e Wang et al. (57), as Sv-CRISPs possuem algumas
características estruturais bem conservadas. Em todas elas, o N-terminal tem início em
um resíduo aparagina ou serina (ambos aminoácidos neutros). O domínio PR-1 se
58
estende desse aminoácido até o aminoácido 160 que, na maioria das sequencias
estudadas, é ocupada por uma prolina. As sequencias obtidas em nossa análise
cobrem 45% do domínio PR-1. Esse domínio é o mais bem conservado da superfamília
CAP (56), o que também explicaria a identidade de parte da sequência da Sv-CRISP-Bj
com a sequência de uma CRISP-3 de mamífero (Sorex araneus) (Tabela 3).
Adicionalmente, as Sv-CRISPs são formadas por nove -hélices e dez -
folhas (57). As porções sequenciadas da Sv-CRISP-Bj cobrem totalmente a 1 (Arg10 –
Val29) e parcialmente 1 (Asp30 – Lis37), 2 (Arg51 – Glu58), 4 (Trp86 – Lis98) e 8 (Tir141
– Arg154). Dentro dessa estrutura, há alguns sítios bem conservados e que
possivelmente mantém a integridade da proteína. O loop iniciado na Pro31 e que se
estende ao AA38 (esse variando entre lisina, arginina ou glutamina) forma um vale para
a interação com a porção Hinge. Além disso, a Trp98 é importante para a manutenção
da estrutura da molécula por interações não-covalentes envolvendo a sua cadeia lateral
(56). Identificamos também três das 16 cisteínas conservadas nessas proteínas
(Cis56,145,148). Em modelo computacional proposto por Guo et al. (56), utilizando a
stericrisp como modelo, esses resíduos de cisteína formam três pontes dissulfeto que
teriam como papel a estabilização da estrutura em “sanduíche” (como mencionado na
seção 1.1.2 da Introdução). Nesse modelo, a Cis56 liga-se por ponte dissulfeto a Cis134,
Cis145 liga-se à Cis129 e a Cis148 formaria a ponte com a Cis73. O rompimento deste alto
conteúdo de pontes dissulfeto explica o comportamento eletroforético da Sv-CRISP-Bj
(aumento aparente na massa molecular) em presença dos agentes redutores DTT e -
mercaptoetanol.
5.2. ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA SV-CRISP-BJ
Poucos estudos têm investigado a possível atividade enzimática das Sv-
CRISPs, mas aqueles que avaliaram este aspecto mostram que essas toxinas não
possuem atividade catalítica. Guo et al. (56) estudaram a atividade catalítica da
stericrisp, incubando substratos peptídicos sintéticos com 5 µg de toxina purificada em
diversas condições de pH e não observaram nenhum indício de atividade sobre esses
substratos. Peichoto et al. (64) testaram a capacidade da patagonina de degradar
fibrina, fibrinogênio ou azocaseína e em nenhum dos casos a toxina (20 µg) foi capaz
59
de degradar os substratos. Estrella et al. (15) não observaram atividade gelatinase com
a helicopsina. Por outro lado, Ludovicho et al. (63) mostraram que a Bj-CRP (2 µg),
quando co-incubada com fatores do sistema complemento por 1 h a 37 ºC, foi capaz de
degradar os fatores C3 e C4. Conforme mostrado aqui, a Sv-CRISP-Bj não possui
atividade proteolítica sobre caseína, ao contrário da peçonha. Este achado está de
acordo com o fato de que, em peçonhas botrópicas, a atividade caseinolítica é
geralmente associada às SVMPs. Para avaliar a possível atividade esterásica
utilizamos dois substratos sintéticos para serinoproteases: (i) N-p-tosil-L-arginina metil
ester (TAME) e (ii) N-benzoil-L-arginina p-nitroanilida (BAPNA). Enquanto substrato (i)
é clivado em uma ligação éster, o substrato (ii) libera uma molécula de p-nitroanilina,
quando clivado em ligação amida. A Sv-CRISP-Bj foi incapaz de degradar qualquer um
dos dois substratos, indicando ausência de atividade esterásica.
As elastases são uma classe de serinoproteases encontradas em neutrófilos
e pâncreas de mamíferos (91,92) e apresentam certa especificidade para a proteína
elastina presente em no tecido conjuntivo associado a artérias elásticas e que
desempenha papel importante na integridade da parede arterial (93). A elastina pode
ser degradada por leucócitos no processo de remodelamento do tecido conectivo
(92,94). Sendo as peçonhas botrópicas fontes de enzimas que podem romper a
integridade de vasos sanguíneos (95-97), testou-se a atividade da Sv-CRISP-Bj sobre
dois substratos para elastases: o sintético n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil e o substrato
nativo elastina-vermelho de Congo. A Sv-CRISP-Bj mostrou atividade moderada sobre
elastina-vermelho de Congo, contudo baixa atividade em n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil,
quando comparado à peçonha. Segundo Bieth et al. (93), o substrato n-t-boc-L-alanine
p-nitrofenil pode ser atacado também por tripsina e quimotripsina, o que pode explicar
parte da atividade da peçonha sobre estes substratos. Isso sugere que as proteases da
peçonha clivam a elastina em sítios diferentes das elastases. A Sv-CRISP-Bj mostrou
um perfil semelhante ao da peçonha, porém com atividade mais baixa.
5.3. ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA SV-CRISP-BJ
Peçonhas botrópicas são fontes ricas de proteases que podem interferir nas
proteases da cascata de coagulação, levando à ativação ou degradação das mesmas
60
(74). O fibrinogênio, um dos alvos destas proteases de peçonhas, é composta de
cadeias , e , sendo que as cadeias e devem ser clivadas em ponto específico
de suas sequências pela trombina, liberando os fibrinopeptideos A e B (98). Esse ponto
de clivagem está localizado no N-terminal de cada uma das cadeias entre um resíduo
de arginina e outro de glicina (99). A clivagem das cadeias e do fibrinogênio leva à
formação de uma rede de fibrina que, em vasos sanguíneos lesionados, impede o
extravasamento de sangue. Conforme mostrado aqui, a Sv-CRISP-Bj degradou as
cadeias e , com preferência pela , sem, porém, levar à formação de um coágulo ou
de coagular plasma citratado (ao contrário da trombina); também não mostrou atividade
fibrinolítica. A inibição da atividade fibrinogenolítica por 1,10-fenantrolina e EDTA, mas
não por PMSF, indicou que se tratava de uma atividade dependente de cátions
bivalentes como Zn2+ e Ca2+. Wang et al. (60) mostraram por experimentos de SPR
(surface plasmon ressonance) que a propriedade da natrina de ligar-se a fatores da
matriz extracelular (principalmente heparina) é dependente de íons Zn2+. Além disso, os
autores observaram que quando em presença de Zn2+, há um aumento (dependente da
concentração) na expressão de ICAM, VCAM e E-selectina induzida por natrina.
Por outro lado, o sítio catalítico da Sv-CRISP-Bj parece não possuir uma serina ativa,
uma vez que o PMSF, um inibidor não reversível de SVSPs por ligar-se à serina do sítio
catalítico dessas enzimas, não afetou a ação da proteína. Esta insensibilidade à
inibição por PMSF é coerente com a ausência de atividade sobre TAME e BAPNA; a
atividade da Sv-CRISP-Bj sobre nt-Boc-L-Ala-pNA foi bem baixa em relação à peçonha
(7,1±0,9 U/mg vs. 131,5±27,7 U/mg para a peçonha).
O perfil de degradação de fibrinogênio foi semelhante àquele encontrado em
metaloproteases da classe P-I tais como a BJPI-2 de B. jararaca (67), atroxlisina-I de B.
atrox (100) e a BthMP de B. moojeni (101). Esta semelhança na atividade
fibrinogenolítica entre Sv-CRISP-Bj e SVMPs da classe P-I inicialmente levantou
suspeito de contaminação da Sv-CRISP-Bj por BJPI-2, já que as duas proteínas eluem
muito próximas uma da outra na segunda etapa cromatográfica. Porém, o fato da Sv-
CRISP-Bj mostrar apenas uma banda em SDS-PAGE e no imunoblot, um pico no RP-
HPLC, e não ter revelado nenhum fragmento semelhante a SVMPs na análise por
61
espectrometria de massas indicam que não houve contaminação desta proteína com a
BJPI-2.
A coagulopatia é a manifestação mais comum do envenenamento botrópico
e é frequentemente acompanhada por trombocitopenia (102). A interferência na
agregação plaquetária é um fator importante na hemorragia ocasionada por SVMPs
(103,104). De fato, várias proteínas capazes de interferir na agregação plaquetária já
foram identificadas em peçonhas botrópicas (104,105). Embora boa parte da
interferência na agregação plaquetária por peçonhas botrópicas tenha sido atribuída à
atuação de SVMPs, SVSPs e PLA2, outros componentes menos abundantes, e.g., L-
aminoácido oxidases, lectinas do tipo C, etc., também podem contribuir para este
fenômeno (105-107). Conforme mostrado aqui, a Sv-CRISP-Bj foi capaz de agregar
plaquetas lavadas in vitro, porém sem diferença significativa entre as duas quantidades
testadas (10 e 40 µg). O mecanismo envolvido nesta agregação ainda é desconhecido.
A hemorragia é uma manifestação local importante no envenenamento
botrópico e é mediada principalmente por SVMPs (95,97,108) que podem representar
até 50% da composição de algumas peçonhas (55). Outros componentes destas
peçonhas, como L-aminoácido oxidases (106) também podem contribuir para o
desencadeamento de hemorragia. Em vista disso, investigamos a atividade
hemorrágica da Sv-CRISP-Bj e observamos que ela não causa hemorragia, mesmo
quando testada em uma dose bastante acima da dose hemorrágica mínima da
peçonha. Peichoto et al. (64) e Ludovicho et al. (63) demonstraram que a patagonina e
a Bj-CRP, respectivamente, também não apresentam atividade hemorrágica.
O edema, resultante de aumento na permeabilidade vascular, e a inflamação
também são efeitos locais característicos do envenenamento botrópico (108,109). Estas
respostas são mediadas em grande parte por PLA2 destas peçonhas (110,111), mas
também pode haver o envolvimento de SVMPs (111,112). As PLA2 podem levar à
formação de mediadores inflamatórios lipídicos a partir da liberação de ácido
araquidônico de fosfolipídios da membrana celular. Já as SVMPs podem contribuir para
este quadro liberando citocinas pró-inflamatórias e fatores do sistema complemento
(112,114). Além destes grupos principais, outras toxinas menos abundantes nestas
peçonhas, tais como lectinas com afinidade para carboidratos (106,115) e L-aminoácido
62
oxidases (116) podem contribuir para o edema e a inflamação causados por estas
peçonhas. Conforme mostrado aqui, a Sv-CRISP-Bj pode ser mais um componente da
peçonha de B. jararaca a contribuir para o edema já que ela aumentou a
permeabilidade vascular em pele dorsal de ratos. Entretanto, os mecanismos
envolvidos nesta resposta ainda precisam ser esclarecidos. Peichoto et al. (64)
observaram que a injeção de patagonina em músculo gastrocnêmio de camundongo
causou afastamento das fibras musculares, sugerindo a ocorrência de edema tecidual.
Semelhantemente, Ludovicho et al. (63) demonstraram que a Bj-CRP (10 µg) estimulou
a migração leucocitária 4 h após a injeção em peritônio de camundongo. Esses
achados indicam que as Sv-CRISPs podem contribuir para o quadro de inflamação
local característico do envenenamento botrópico.
5.4. COMPARAÇÃO ENTRE A SV-CRISP-BJ E A BJ-CRP
Durante a realização deste trabalho, foi descrita a purificação e
caracterização de uma Sv-CRISP de B. jararaca por outro grupo de pesquisadores (63).
A comparação das propriedades bioquímicas e atividades biológicas das moléculas
descritas nestes dois estudos indica que se trata da mesma proteína. Contudo, algumas
diferenças estruturais e de atividades foram encontradas. Ludovicho et al. (63)
estimaram , por SDS-PAGE, a massa molecular em 24 kDa, aproximadamente, sendo
esse resultado corroborado por dados de espectrometria de massas feito no mesmo
estudo (24,6kDa). Por outro lado, a massa molecular da Sv-CRISP-Bj foi estimada em
29,3 kDa após SDS-PAGE. Essa discrepância entre as massas seria explicada pela
existência, na Sv-CRISP-Bj, de resíduos glicosilados, semelhante àquilo que foi
observado para a SGP-28, uma CRISP-3 de leucócitos humanos (13,34,63). Porém, até
o momento, nenhuma Sv-CRISP apresentou glicosilações.
Em relação aos achados enzimáticos para as duas proteínas, nenhuma
delas apresentou atividade sobre caseína ou fibrina. Contudo, houve divergência na
atividade sobre fibrinogênio, sendo que a Sv-CRISP-Bj, na dose de 40 µg, foi capaz de
degradar as cadeias em 10 min enquanto os primeiros sinais de degradação da
cadeia ocorrem somente aos 30 min. Em contrapartida, Ludovicho et al. (63)
relataram que na dose de 5 µg, a Bj-CRP não mostrou qualquer degradação apreciável
63
de cadeia ou após 1 h de incubação. Além disso, no nosso protocolo, utilizamos
uma solução de fibrinogênio mais concentrada que os outros autores (5 mg/ml vs. 2
mg/ml). A Sv-CRISP-Bj não mostrou atividade esterásica sobre TAME e BAPNA
(substratos para SVSPs) e teve baixa atividade sobre Boc-Ala-Np para elastases. Estas
atividades não foram avaliadas para Bj-CRP, mas essa proteína foi ativa sobre o
sistema complemento (zimografia), degradando (ativando) alguns componentes do
mesmo.
Em relação às atividades biológicas, nenhuma das duas proteínas
apresentou atividade coagulante ou hemorrágica. Por outro lado, a Sv-CRISP-Bj
causou agregação plaquetária, atividade esta que não foi investigada por Ludovicho et
al. (63). As duas proteínas foram capazes de desencadear um processo inflamatório
local. Em nosso trabalho, a Sv-CRISP-Bj (40 µg), quando injetada em dorso de rato,
causou edema moderado quando comparada com a peçonha. Além disso, a Sv-CRISP-
Bj pode levar ao acúmulo de infiltrado inflamatório 6 h após injeção em músculo
gastrocnêmio de camundongo (dados não mostrados). Por outro lado, Ludovicho et al.
(63) mostraram que a Bj-CRP (5 µg) estimulou a migração de células
polimorfonucleares ao peritônio de camundongo 4 h após injeção, acompanhado por
aumento da citocina IL-6.
Ludovicho et al. (63) investigaram a capacidade da Bj-CRP de modular
canais de K+ dependentes de voltagem em oócitos de Xenopus laevis transfectados. A
toxina (1 µM) não foi capaz de alterar o fluxo de K+ em ensaio de voltage-clamp. De
modo semelhante, em experimentos não relatados aqui, observamos que a Sv-CRISP-
Bj (1 µM) na causou alteração marcante na contratilidade (sensibilidade) de artérias
mesentéricas isoladas de camundongos frente à hiperpolarização com 60 mM de K+.
64
6. CONCLUSÃO
Os resultados deste trabalho incidam que isolamos uma Sv-CRISP-Bj (~30
kDa) da peçonha de B. jararaca. Esta proteína degrada fibrinogênio sem, porém,
coagular fibrinogênio ou plasma citratado; não possui atividade fibrinolítica. Além disso,
não apresenta atividade anticoagulante in vitro. A Sv-CRISP-Bj agregou plaquetas in
vitro, aumentou a permeabilidade vascular e estimulou a migração de células
inflamatórias, porém, sem causar hemorragia ou mionecrose. Estas atividades sugerem
que a Sv-CRISP-Bj é mais um componente da peçonha de B. jararaca que pode
contribuir para o processo inflamatório (aumento de permeabilidade vascular e
migração de células inflamatórias) associado ao envenenamento, porém sem contribuir
para a hemorragia e mionecrose.
65
7. REFERÊNCIAS
1. Gibbs GM, Roelants K, O'Bryan MK (2008). The CAP superfamily: cysteine-rich
secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 proteins – roles in
reproduction, cancer, and immune defense. Endocrine Rev. 29(7):865-97.
2. Koppers AJ, Reddy T, O'Bryan MK (2011). The role of cysteine-rich secretory
proteins in male fertility. Asian J Androl. 13(1):111-7.
3. Garberi JC, Kohane AC, Cameo MS, Blaquier JA (1978). Isolation and
characterization of specific rat epididymal proteins. Mol Cell Endocrinol. 13(1):73-
82.
4. Mans BJ, Andersen JF, Francischetti IM, Valenzuela JG, Schwan TG, Pham VM,
Garfield MK, Hammer CH, Ribeiro JM (2008). Comparative sialomics between
hard and soft ticks: implications for the evolution of blood-feeding behavior. Insect
Biochem Mol Biol. 38(1):42-58.
5. Charlab R, Valenzuela JG, Rowton ED, Ribeiro JM (1999). Toward an
understanding of the biochemical and pharmacological complexity of the saliva of a
hematophagous sand fly Lutzomyia longipalpis. Proc Natl Acad Sci USA.
96(26):15155-60.
6. Brunner-Agten S, Pavlovic R, Müller L, Horn MP, Huber AR, Stadler BM, Vogel M
(2011). Increased level of antibodies cross-reacting with Ves v 5 and CRISP-2 in
MAR-positive patients. Int Arch Allergy Immunol. 160(1):47-55.
7. Darwiche R, Mène-Saffrané L, Gfeller D, Asojo OA, Schneiter R (2016). The
pathogen-related yeast protein Pry1, a member of the CAP protein superfamily, is
a fatty acid-binding protein. J Biol Chem. 292(20):8304-14.
8. van Loon LC, Rep M, Pieterse CM (2006). Significance of inducible defense-
related proteins in infected plants. Annu Rev Phytopathol. 44:135-62.
9. Maeda T, Sakashita M, Ohba Y, Nakanishi Y (1998). Molecular cloning of the rat
Tpx-1 responsible for the interaction between spermatogenic and Sertoli cells.
Biochem Biophys Res Commun. 248(1):140-6.
66
10. Gibbs GM, Bianco DM, Jamsai D, Herlihy A, Ristevski S, Aitken RJ, Kretser DM,
O'Bryan MK (2007). Cysteine-rich secretory protein 2 binds to mitogen-activated
protein kinase kinase kinase 11 in mouse sperm. Biol Reprod. 77(1):108-14.
11. Bjartell A, Johansson R, Björk T, Gadaleanu V, Lundwall A, Lilja H, Kjeldsen L,
Udby L (2006). Immunohistochemical detection of cysteine-rich secretory protein 3
in tissue and in serum from men with cancer or benign enlargement of the prostate
gland. Prostate. 66(6):591-603.
12. Krätzschmar J, Haendler B, Eberspaecher U, Roosterman D, Donner P,
Schleuning WD (1996). The human cysteine-rich secretory protein (CRISP) family.
Primary structure and tissue distribution of CRISP-1, CRISP-2 and CRISP-3. Eur J
Biochem. 236(3):827-36.
13. Udby L, Cowland JB, Johnsen AH, Sørensen OE, Borregaard N, Kjeldsen L
(2002). An ELISA for SGP28/CRISP-3, a cysteine-rich secretory protein in human
neutrophils, plasma, and exocrine secretions. J Immunol Methods 263(1-2):43-55.
14. Milne TJ, Abbenante G, Tyndall JD, Halliday J, Lewis RJ (2003). Isolation and
characterization of a cone snail protease with homology to CRISP proteins of the
pathogenesis-related protein superfamily. J Biol Chem. 278(33):31105-10.
15. Estrella A, Sánchez EE, Galán JA, Tao WA, Guerrero B, Navarrete LF, Rodríguez-
Acosta A (2010). Characterization of toxins from the broad-banded water snake
Helicops angulatus (Linnaeus, 1758): isolation of a cysteine-rich secretory protein,
helicopsin. Arch Toxicol. 85(4):305-13.
16. Charest NJ, Joseph DR, Wilson EM, French FS (1988). Molecular cloning of
complementary deoxyribonucleic acid for an androgen-regulated epididymal
protein: sequence homology with metalloproteins. Mol Endocrinol. 2(10):999-1004.
17. Szyperski T, Fernández C, Mumenthaler C, Wüthrich K (1998). Structure
comparison of human glioma pathogenesis-related protein GliPR and the plant
pathogenesis-related protein P14a indicates a functional link between the human
immune system and a plant defense system. Proc Natl Acad Sci USA. 95(5):2262-
6.
67
18. Serrano RL, Kuhn A, Hendricks A, Helms JB, Sinning I, Groves MR (2004).
Structural analysis of the human Golgi-associated plant pathogenesis related
protein GAPR-1 implicates dimerization as a regulatory mechanism. J Mol Biol.
339(1):173-83.
19. Cameo MS, Blaquier JA (1976). Androgen-controlled specific proteins in rat
epididymis. J Endocrinol. 69(1):47-55.
20. Kasahara M, Figueroa F, Klein J (1987). Random cloning of genes from mouse
chromosome 17. Proc Natl Acad Sci USA. 84(10):3325-8.
21. Kasahara M, Gutknecht J, Brew K, Spurr N, Goodfellow PN (1989). Cloning and
mapping of a testis-specific gene with sequence similarity to a sperm-coating
glycoprotein gene. Genomics. 5(3):527-34.
22. Busso D, Cohen DJ, Hayashi M, Kasahara M, Cuasnicú PS (2005). Human
testicular protein TPX1/CRISP-2: localization in spermatozoa, fate after
capacitation and relevance for gamete interaction. Mol Hum Reprod. 11(4):299-
305.
23. Da Ros VG, Muñoz MW, Battistone MA, Brukman NG, Carvajal G, Curci L,
Gómez-ElIas MD, Cohen DB, Cuasnicú PS (2015). From the epididymis to the
egg: participation of CRISP proteins in mammalian fertilization. Asian J Androl.
17(5):711-5.
24. Udby L, Bjartell A, Malm J, Egesten A, Lundwall A, Cowland JB, Borregaard N,
Kjeldsen L (2005). Characterization and localization of cysteine-rich secretory
protein 3 (CRISP-3) in the human male reproductive tract. J Androl. 26(3):333-42.
25. Horne AW, Duncan WC, King AE, Burgess S, Lourenço PC, Cornes P, Ghazal P,
Williams AR, Udby L, Critchley HO (2009). Endometrial cysteine-rich secretory
protein 3 is inhibited by human chorionic gonadotrophin, and is increased in the
decidua of tubal ectopic pregnancy. Mol Hum Reprod. 15(5):287-94.
26. Fedorka CE, Scoggin KE, Woodward EM, Squires EL, Ball BA, Troedsson M
(2016). The effect of select seminal plasma proteins on endometrial mRNA
cytokine expression in mares susceptible to persistent mating-induced
endometritis. Reprod Domest Anim. 52(1):89-96.
68
27. Burnett LA, Anderson DM, Rawls A, Bieber AL, Chandler DE (2011). Mouse sperm
exhibit chemotaxis to allurin, a truncated member of the cysteine-rich secretory
protein family. Dev Biol. 360(2):318-28.
28. Jalkanen J, Huhtaniemi I, Poutanen M (2005). Mouse cysteine-rich secretory
protein 4 (CRISP4): a member of the Crisp family exclusively expressed in the
epididymis in an androgen-dependent manner. Biol Reprod. 72(5):1268-74.
29. Jamsai D, Bianco DM, Smith SJ, Merriner DJ, Ly-Huynh JD, Herlihy A, Niranjan B,
Gibbs GM, O'Bryan MK (2008). Characterization of gametogenetin 1 (GGN1) and
its potential role in male fertility through the interaction with the ion channel
regulator, cysteine-rich secretory protein 2 (CRISP2) in the sperm tail.
Reproduction 135(6):751-9.
30. Burnett LA, Washburn CA, Sugiyama H, Xiang X, Olson JH, Al-Anzi B, Bieber AL,
Chandler DE (2012). Allurin, an amphibian sperm chemoattractant having
implications for mammalian sperm physiology. Int Rev Cell Mol Biol. 295:1-61.
31. Evans J, D'Sylva R, Volpert M, Jamsai D, Merriner DJ, Nie G, Salamonsen LA,
O'Bryan MK (2015). Endometrial CRISP3 is regulated throughout the mouse
estrous and human menstrual cycle and facilitates adhesion and proliferation of
endometrial epithelial cells. Biol Reprod. 92(4):99.
32. Marcondes FK, Bianchi FJ, Tanno AP (2002). Determination of the estrous cycle
phases of rats: some helpful considerations. Braz J Biol. 62(4A):609-14.
33. Gibbs GM, Scanlon MJ, Swarbrick J, Curtis S, Gallant E, Dulhunty AF, O'Bryan MK
(2006). The cysteine-rich secretory protein domain of Tpx-1 is related to ion
channel toxins and regulates ryanodine receptor Ca2+ signaling. J Biol Chem.
281(7):4156-63.
34. Kjeldsen L, Cowland JB, Johnsen AH, Borregaard N (1996). SGP28, a novel
matrix glycoprotein in specific granules of human neutrophils with similarity to a
human testis-specific gene product and a rodent sperm-coating glycoprotein. FEBS
Lett. 380(3):246-50.
69
35. Pfisterer P, König H, Hess J, Lipowsky G, Haendler B, Schleuning WD, Wirth T
(1996). CRISP-3, a protein with homology to plant defense proteins, is expressed
in mouse B cells under the control of Oct2. Mol Cell Biol. 16(11):6160-8.
36. Chang TY, Mao SH, Guo YW (1997). Cloning and expression of a cysteine-rich
venom protein from Trimeresurus mucrosquamatus (Taiwan habu). Toxicon
35(6):879-88.
37. Jin Y, Lu Q, Zhou X, Zhu S, Li R, Wang W, Xiong Y (2003). Purification and cloning
of cysteine-rich proteins from Trimeresurus jerdonii and Naja atra venoms. Toxicon
42(5):539-47.
38. Osipov AV, Levashov MY, Tsetlin VI, Utkin YN (2005). Cobra venom contains a
pool of cysteine-rich secretory proteins. Biochem Biophys Res Commun.
328(1):177-82.
39. Lecht S, Chiaverelli RA, Gerstenhaber J, Calvete JJ, Lazarovici P, Casewell NR,
Harrison R, Lelkes PI, Marcinkiewicz C (2015). Anti-angiogenic activities of snake
venom CRISP isolated from Echis carinatus sochureki. Biochim Biophys Acta.
1850(6):1169-79.
40. Cidade DA, Simão TA, Dávila AM, Wagner G, Junqueira-de-Azevedo IL, Ho PL,
Bon C, Zingali RB, Albano RM (2006). Bothrops jararaca venom gland
transcriptome: analysis of the gene expression pattern. Toxicon 48(4):437-61.
41. Cardoso KC, Da Silva MJ, Costa GG, Torres TT, Del Bem LE, Vidal RO, Menossi
M, Hyslop S (2010). A transcriptomic analysis of gene expression in the venom
gland of the snake Bothrops alternatus (urutu). BMC Genomics 11:605-27.
42. Zelanis A, Andrade-Silva D, Rocha MM, Furtado MF, Serrano SM, Junqueira-de-
Azevedo IL, Ho PL (2012). A transcriptomic view of the proteome variability of
newborn and adult Bothrops jararaca snake venoms. PLoS Negl Trop Dis.
6(3):e1554.
43. Ching AT, Paes Leme AF, Zelanis A, Rocha MM, Furtado MF, Silva DA, Trugilho
MR, da Rocha SL, Perales J, Ho PL, Serrano SM, Junqueira-de-Azevedo IL
(2012). Venomics profiling of Thamnodynastes strigatus unveils matrix
70
metalloproteinases and other novel proteins recruited to the toxin arsenal of rear-
fanged snakes. J Proteome Res. 11(2):1152-62.
44. Peichoto ME, Tavares FL, Santoro ML, Mackessy SP (2012). Venom proteomes of
South and North American opisthoglyphous (Colubridae and Dipsadidae) snake
species: a preliminary approach to understanding their biological roles. Comp
Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics 7(4):361-9.
45. Rey-Suárez P, Núñez V, Fernández J, Lomonte B (2016). Integrative
characterization of the venom of the coral snake Micrurus dumerilii (Elapidae) from
Colombia: proteome, toxicity, and cross-neutralization by antivenom. J Proteomics
136:262-73.
46. Sanz L, Pla D, Pérez A, Rodríguez Y, Zavaleta A, Salas M, Lomonte B, Calvete JJ
(2016). Venomic analysis of the poorly studied desert coral snake, Micrurus
tschudii tschudii, supports the 3FTx/PLA₂ dichotomy across Micrurus venoms.
Toxins (Basel) 8(6):E178.
47. Huang HW, Liu BS, Chien KY, Chiang LC, Huang SY, Sung WC, Wu WG (2015).
Cobra venom proteome and glycome determined from individual snakes of Naja
atra reveal medically important dynamic range and systematic geographic
variation. J Proteomics 128(14):92-104.
48. Pla D, Bande BW, Welton RE, Paiva OK, Sanz L, Segura Á, Wright CE, Calvete
JJ, Gutiérrez JM, Williams DJ (2017). Proteomics and antivenomics of Papuan
black snake (Pseudechis papuanus) venom with analysis of its toxicological profile
and the preclinical efficacy of Australian antivenoms. J Proteomics 150(6):201-215.
49. Tan CH, Tan KY, Fung SY, Tan NH (2015). Venom-gland transcriptome and
venom proteome of the Malaysian king cobra (Ophiophagus hannah). BMC
Genomics 16:687-98.
50. Choudhury M, McCleary RJR, Kesherwani M, Kini RM, Velmurugan D (2017).
Comparison of proteomic profiles of the venoms of two of the 'Big Four' snakes of
India, the Indian cobra (Naja naja) and the common krait (Bungarus caeruleus),
and analyses of their toxins. Toxicon 135(1): 33-42.
71
51. Boldrini-França J, Corrêa-Netto C, Silva MM, Rodrigues RS, De La Torre P, Pérez
A, Soares AM, Zingali RB, Nogueira RA, Rodrigues VM, Sanz L, Calvete JJ
(2010). Snake venomics and antivenomics of Crotalus durissus subspecies from
Brazil: assessment of geographic variation and its implication on snakebite
management. J Proteomics 73(9):1758-76.
52. Alape-Girón A, Sanz L, Escolano J, Flores-Díaz M, Madrigal M, Sasa M, Calvete
JJ (2008). Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic,
individual, and ontogenetic variations. J Proteome Res. 7(8):3556-71.
53. Calvete JJ, Borges A, Segura A, Flores-Díaz M, Alape-Girón A, Gutiérrez JM, Diez
N, De Sousa L, Kiriakos D, Sánchez E, Faks JG, Escolano J, Sanz L (2009).
Snake venomics and antivenomics of Bothrops colombiensis, a medically
important pitviper of the Bothrops atrox-asper complex endemic to Venezuela:
contributing to its taxonomy and snakebite management. J Proteomics 72(2):227-
40.
54. Calvete JJ, Sanz L, Pérez A, Borges A, Vargas AM, Lomonte B, Angulo Y,
Gutiérrez JM, Chalkidis HM, Mourão RH, Furtado MF, Moura-da-Silva AM (2011).
Snake population venomics and antivenomics of Bothrops atrox: paedomorphism
along its transamazonian dispersal and implications of geographic venom
variability on snakebite management. J Proteomics 74(4):510-27.
55. Zelanis A, Tashima AK, Pinto AF, Paes Leme AF, Stuginski DR, Furtado MF,
Sherman NE, Ho PL, Fox JW, Serrano SM (2011). Bothrops jararaca venom
proteome rearrangement upon neonate to adult transition. Proteomics
11(21):4218-28.
56. Guo M, Teng M, Niu L, Liu Q, Huang Q, Hao Q (2005). Crystal structure of the
cysteine-rich secretory protein stericrisp reveals that the cysteine-rich domain has
a K+ channel inhibitor-like fold. J Biol Chem. 280(13):12405-12.
57. Wang F, Li H, Liu MN, Song H, Han HM, Wang QL, Yin CC, Zhou YC, Qi Z, Shu
YY, Lin ZJ, Jiang T (2006). Structural and functional analysis of natrin, a venom
protein that targets various ion channels. Biochem Biophys Res Commun.
351(2):443-8.
72
58. Mochca-Morales J, Martin BM, Possani LD (1990). Isolation and characterization of
helothermine, a novel toxin from Heloderma horridum horridum (Mexican beaded
lizard) venom. Toxicon 28(3):299-309.
59. Morrissette J, Krätzschmar J, Haendler B, el-Hayek R, Mochca-Morales J, Martin
BM, Patel JR, Moss RL, Schleuning WD, Coronado R (1995). Primary structure
and properties of helothermine, a peptide toxin that blocks ryanodine receptors.
Biophys J. 68(6):2280-8.
60. Wang YL, Kuo JH, Lee SC, Liu JS, Hsieh YC, Shih YT, Chen CJ, Chiu JJ, Wu WG
(2010). Cobra CRISP functions as an inflammatory modulator via a novel Zn2+- and
heparan sulfate-dependent transcriptional regulation of endothelial cell adhesion
molecules. J Biol Chem. 85(48):37872-83.
61. Yamazaki Y, Koike H, Sugiyama Y, Motoyoshi K, Wada T, Hishinuma S, Mita M,
Morita T (2002). Cloning and characterization of novel snake venom proteins that
block smooth muscle contraction. Eur J Biochem. 269(11):2708-15.
62. Brown RL, Lynch LL, Haley TL, Arsanjani R (2003). Pseudechetoxin binds to the
pore turret of cyclic nucleotide-gated ion channels. J Gen Physiol. 122(6):749-60.
63. Lodovicho ME, Costa TR, Bernardes CP, Menaldo DL, Zoccal KF, Carone SE,
Rosa JC, Pucca MB, Cerni FA, Arantes EC, Tytgat J, Faccioli LH, Pereira-Crott LS,
Sampaio SV (2017). Investigating possible biological targets of Bj-CRP, the first
cysteine-rich secretory protein (CRISP) isolated from Bothrops jararaca snake
venom. Toxicol Lett. 265(4):156-169.
64. Peichoto ME, Mackessy SP, Teibler P, Tavares FL, Burckhardt PL, Breno MC,
Acosta O, Santoro ML (2009). Purification and characterization of a cysteine-rich
secretory protein from Philodryas patagoniensis snake venom. Comp Biochem
Physiol C Toxicol Pharmacol. 150(1):79-84.
65. Adade CM, Carvalho AL, Tomaz MA, Costa TF, Godinho JL, Melo PA, Lima AP,
Rodrigues JC, Zingali RB, Souto-Padrón T (2014). Crovirin, a snake venom
cysteine-rich secretory protein (CRISP) with promising activity against
trypanosomes and Leishmania. PLoS Negl Trop Dis. 8(10):e3252.
73
66. Bjartell A, Johansson R, Björk T, Gadaleanu V, Lundwall A, Lilja H, Kjeldsen L,
Udby L (2006). Immunohistochemical detection of cysteine-rich secretory protein 3
in tissue and in serum from men with cancer or benign enlargement of the prostate
gland. Prostate 66(6):591-603.
67. da Silva IR, Lorenzetti R, Rennó AL, Baldissera L Jr, Zelanis A, Serrano SM,
Hyslop S (2012). BJ-PI2, a non-hemorrhagic metalloproteinase from Bothrops
jararaca snake venom. Biochim Biophys Acta. 1820(11):1809-21.
68. Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature 227(5259):680-5.
69. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951). Protein measurement with
the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1):265-75.
70. Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979). Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4350-4.
71. Valério AA, Corradini AC, Panunto, PC, Mello, SM, Hyslop S (2002). Purification
and characterization of a phosphodiesterase from Bothrops alternatus snake
venom. J Protein Chem. 21(8):495-503.
72. Damico DC, Vassequi-Silva T, Torres-Huaco FD, Nery-Diez AC, de Souza RC, Da
Silva SL, Vicente CP, Mendes CB, Antunes E, Werneck CC, Marangoni S (2012).
LmrTX, a basic PLA₂ (D49) purified from Lachesis muta rhombeata snake venom
with enzymatic-related antithrombotic and anticoagulant activity. Toxicon
60(5):773-81.
73. Kunitz M (1946). Crystalline soybean trypsin inhibitor. J Gen Physiol. 29:149-54.
74. Maruyama M, Sugiki M, Yoshida E, Mihara H, Nakajima N (1992). Purification and
characterization of two fibrinolytic enzymes from Bothrops jararaca (jararaca)
venom. Toxicon 30(8):853-64.
75. Naughton MA, Sanger F (1961). Purification and specificity of pancreatic elastase.
Biochem J. 78(1):156-63.
76. Visser L, Blout ER. The use of p-nitrophenyl N-tert-butyloxycarbonyl-L-alaninate as
substrate for elastase. Biochim Biophys Acta 268(1):257-60.
74
77. Schwert GW, Takenaka YA (1955). A spectrophotometric determination of trypsin
and chymotrypsin. Biochim Biophys Acta 16(4):570-5.
78. Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W (1961). The preparation and properties of two
new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95(1):271-8.
79. Torres-Huaco FD, Werneck CC, Vicente CP, Vassequi-Silva T, Nery-Diez AC,
Mendes CB, Antunes E, Marangoni S, Damico DC (2013). Rapid purification and
procoagulant and platelet aggregating activities of rhombeobin: a thrombin-
like/gyroxin-like enzyme from Lachesis muta rhombeata snake venom. Biomed
Res Int. 2013:903292.
80. Berger M, Pinto AF, Guimarães JA (2008). Purification and functional
characterization of bothrojaractivase, a prothrombin-activating metalloproteinase
isolated from Bothrops jararaca snake venom. Toxicon 51(4):488-501.
81. Born GV (1965). Platelets in thrombogenesis: mechanism and inhibition of platelet
aggregation. Nature 205:678-80.
82. Theakston RD, Reid HA (1983). Development of simple standard assay
procedures for the characterization of snake venom. Bull World Health Organ.
61(6):949-56.
83. Brain SD, Williams TJ (1985). Inflammatory oedema induced by synergism
between calcitonin gene-related peptide (CGRP) and mediators of increased
vascular permeability. Br J Pharmacol. 86(4):855-60.
84. National Center for Biotechnology Information (NCBI/NML). GenBank acesso em
28/09/2017. Disponível em https://www.ncbi.nlm.nih.gov.
85. Yamazaki Y, Hyodo F, Morita T (2003). Wide distribution of cysteine-rich secretory
proteins in snake venoms: isolation and cloning of novel snake venom cysteine-
rich secretory proteins. Arch Biochem Biophys. 412(1):133-41.
86. Matsunaga Y, Yamazaki Y, Hyodo F, Sugiyama Y, Nozaki M, Morita T (2009).
Structural divergence of cysteine-rich secretory proteins in snake venoms. J
Biochem. 145(3):365-75.
75
87. Yamazaki Y, Brown RL, Morita T (2002). Purification and cloning of toxins from
elapid venoms that target cyclic nucleotide-gated ion channels. Biochemistry
41(38):11331-7.
88. Gay C, Sanz L, Calvete JJ, Pla D (2016). Snake venomics and antivenomics of
Bothrops diporus, a medically important pitviper in northeastern Argentina. Toxins
(Basel). 8(1):E9.
89. Xu N, Zhao HY, Yin Y, Shen SS, Shan LL, Chen CX, Zhang YX, Gao JF, Ji X
(2017). Combined venomics, antivenomics and venom gland transcriptome
analysis of the monocoled cobra (Naja kaouthia) from China. J Proteomics.
159(21):19-31.
90. Calvete JJ, Sanz L, Cid P, de la Torre P, Flores-Díaz M, Dos Santos MC, Borges
A, Bremo A, Angulo Y, Lomonte B, Alape-Girón A, Gutiérrez JM (2010). Snake
venomics of the Central American rattlesnake Crotalus simus and the South
American Crotalus durissus complex points to neurotoxicity as an adaptive
paedomorphic trend along Crotalus dispersal in South America. J Proteome Res.
9(1):528-44.
91. Berlov MN, Lodygin PA, Andreeva YV, Kokryakov VN (2001). Isolation and some
physical and chemical properties of elastase and cathepsin G from dog
neutrophils. Biochemistry. 66(9):1008-13.
92. Kristensen JH, Karsdal MA, Sand JM, Willumsen N, Diefenbach C, Svensson B,
Hägglund P, Oersnes-Leeming DJ (2015). Serological assessment of neutrophil
elastase activity on elastin during lung ECM remodeling. BMC Pulm Med. 15:53.
93. Bieth J, Spiess B, Wermuth CG (1974). The synthesis and analytical use of a
highly sensitive and convenient substrate of elastase. Biochem Med. 11(4):350-7.
94. Masood A, Yi M, Belcastro R, Li J, Lopez L, Kantores C, Jankov RP, Tanswell AK
(2015). Neutrophil elastase-induced elastin degradation mediates macrophage
influx and lung injury in 60% O2-exposed neonatal rats. Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. 309(1):L53-62.
95. Gutiérrez JM, Rucavado A (2000). Snake venom metalloproteinases: their role in
the pathogenesis of local tissue damage. Biochimie 82(9-10):841-50.
76
96. Escalante T, Shannon J, Moura-da-Silva AM, Gutiérrez JM, Fox JW (2006). Novel
insights into capillary vessel basement membrane damage by snake venom
hemorrhagic metalloproteinases: a biochemical and immunohistochemical study.
Arch Biochem Biophys. 455(2):144-53.
97. Escalante T, Ortiz N, Rucavado A, Sanchez EF, Richardson M, Fox JW, Gutiérrez
JM (2011). Role of collagens and perlecan in microvascular stability: exploring the
mechanism of capillary vessel damage by snake venom metalloproteinases. PLoS
One 6(12):e28017.
98. Henschen A, Lottspeich F, Kehl M, Southan C (1983). Covalent structure of
fibrinogen. Ann N Y Acad Sci. 408:28-43.
99. Blombäck B, Blombäck M (1972). The molecular structure of fibrinogen. Ann N Y
Acad Sci. 202:77-97.
100. Sanchez EF, Schneider FS, Yarleque A, Borges MH, Richardson M, Figueiredo
SG, Evangelista KS, Eble JA (2010). The novel metalloproteinase atroxlysin-I from
Peruvian Bothrops atrox (Jergón) snake venom acts both on blood vessel ECM
and platelets. Arch Biochem Biophys. 496(1):9-20.
101. Gomes MS, Mendes MM, de Oliveira F, de Andrade RM, Bernardes CP,
Hamaguchi A, de Alcântara TM, Soares AM, Rodrigues VM, Homsi-Brandeburgo
MI (2009). BthMP: a new weakly hemorrhagic metalloproteinase from Bothrops
moojeni snake venom. Toxicon 53(1):24-32.
102. Kamiguti AS, Cardoso JL, Theakston RD, Sano-Martins IS, Hutton RA, Rugman
FP, Warrell DA, Hay CR (1991). Coagulopathy and haemorrhage in human victims
of Bothrops jararaca envenoming in Brazil. Toxicon 29(8):961-72.
103. Gutiérrez JM, Rucavado A, Escalante T, Díaz C (2005). Hemorrhage induced by
snake venom metalloproteinases: biochemical and biophysical mechanisms
involved in microvessel damage. Toxicon 45(8):997-1011.
104. Serrano SM, Wang D, Shannon JD, Pinto AF, Polanowska-Grabowska RK, Fox
JW (2007). Interaction of the cysteine-rich domain of snake venom
metalloproteinases with the A1 domain of von Willebrand factor promotes site-
77
specific proteolysis of von Willebrand factor and inhibition of von Willebrand factor-
mediated platelet aggregation. FEBS J. 274(14):3611-21.
105. Santoro ML, Vaquero TS, Paes Leme AF, Serrano SM (2009). NPP-BJ, a
nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase from Bothrops jararaca snake
venom, inhibits platelet aggregation. Toxicon 54(4):499-512.
106. Panunto PC, da Silva MA, Linardi A, Buzin MP, Melo SE, Mello SM, Prado-
Franceschi J, Hyslop S (2006). Biological activities of a lectin from Bothrops
jararacussu snake venom. Toxicon 47(1):21-31.
107. Takatsuka H, Sakurai Y, Yoshioka A, Kokubo T, Usami Y, Suzuki M, Matsui T,
Titani K, Yagi H, Matsumoto M, Fujimura Y (2001). Molecular characterization of L-
amino acid oxidase from Agkistrodon halys blomhoffii with special reference to
platelet aggregation. Biochim Biophys Acta 1544(1-2):267-77.
108. Escalante T, Rucavado A, Fox JW, Gutiérrez JM (2011). Key events in
microvascular damage induced by snake venom hemorrhagic metalloproteinases.
J Proteomics. 74(9):1781-94.
109. Warrell DA (2004). Snakebites in Central and South America: epidemiology,
clinical features and clinical management. In: Campbell JA, Lamar WW (eds.),
Venomous Reptiles of the Western Hemisphere, vol. 2. Comstock Publishing
Associates/Cornell University Press, Ithaca; pp. 709-761.
110. França FOS, Málaque CMS (2009). Acidente botrópico. In: Cardoso JLC, França
FOS, Wen FH, Málaque CMS, Haddad Jr., V (eds.), Animais Peçonhentos no
Brasil: Biologia, Clínica e Terapêutica dos Acidentes. Sarvier/FAPESP, São Paulo;
pp. 81-95.
111. Teixeira CF, Landucci EC, Antunes E, Chacur M, Cury Y (2003). Inflammatory
effects of snake venom myotoxic phospholipases A2. Toxicon 42(8):947-62.
112. Teixeira C, Cury Y, Moreira V, Picolo G, Chaves F (2009). Inflammation induced by
Bothrops asper venom. Toxicon 54(7):67-76.
113. Moura-da-Silva AM, Laing GD, Paine MJ, Dennison JM, Politi V, Crampton JM,
Theakston RD (1996). Processing of pro-tumor necrosis factor-alpha by venom
78
metalloproteinases: a hypothesis explaining local tissue damage following snake
bite. Eur J Immunol. 26(9):2000-5.
114. Pidde-Queiroz G, Magnoli FC, Portaro FC, Serrano SM, Lopes AS, Paes Leme AF,
van den Berg CW, Tambourgi DV (2013). P-I snake venom metalloproteinase is
able to activate the complement system by direct cleavage of central components
of the cascade. PLoS Negl Trop Dis. 7(10):e2519.
115. Sartim MA, Riul TB, Del Cistia-Andrade C, Stowell SR, Arthur CM, Sorgi CA,
Faccioli LH, Cummings RD, Dias-Baruffi M, Sampaio SV (2014). Galatrox is a C-
type lectin in Bothrops atrox snake venom that selectively binds LacNAc-
terminated glycans and can induce acute inflammation. Glycobiology 24(11):1010-
21.
116. Wei JF, Yang HW, Wei XL, Qiao LY, Wang WY, He SH (2009). Purification,
characterization and biological activities of the L-amino acid oxidase from
Bungarus fasciatus snake venom. Toxicon 54(3):262-71.
79
ANEXOS
