Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y … · 2016. 6. 6. · Publicada por | Published by: Cooperación Latinoamericana y Caribeña en Plantas Medicinales

Publicada por | Published by: Cooperación Latinoamericana y Caribeña en Plantas Medicinales y Aromáticas

Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ISSN 0717 7917

Pylaisia polyantha (Schreb.) Bruch et Schimp. Volumen 8, Número 3, Mayo de 2009 Nota Editorial

− Martínez. En el séptimo aniversario de BLACPMA. Editorial

− Taylor et al. Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA, Chillán 2009. Revisiones

− Diniz et al. (Brasil) Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review. Artículos

− Hernández et al. (Chile) Heliopsis longipes anti-inflammatory effects in vitro. − Gutiérrez & Londoño (Colombia) Plaguicidas en tomates de mercados de cadena colombianos. − Oliveira et al. (Brasil) Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum. − Machín et al. (Cuba) Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas en ratas. − Martínez et al. (Argentina) Trypanocidal activity of Castela coccinea Griseb. extracts. − Barni et al. (Argentina) Eficacia antibiótica de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en ratones. − Cariddi et al. (Argentina) Immunomodulatory effects of Minthostachys verticillata essential oil.

Comunicaciones − Chopa et al. (Argentina) Actividad repelente de los extractos hexánicos y etanólicos de frutos de Solanum eleagnifolium sobre adultos de Blattella germanica. − Gutiérrez et al. (Argentina) Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora sobre adultos de Pediculus humanus capitis. − Pino Benítez y Ramírez (Colombia) Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mágico-religiosos en comunidades del Pacífico colombiano norte. − Marinoff et al. (Argentina) Precauciones en el empleo de plantas medicinales.

Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List , Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

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BLACPMA ISSN 0717 7917

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Comité Editorial | Editorial Board

Fundadores José L. Martínez (Chile) - Jorge Rodríguez (Cuba)

Editores José L. Martínez

Escuela de Kinesiología, Universidad Santo Tomas, Talca, Chile.

José M. Prieto School of Pharmacy, London University, Reino Unido.

Gabino Garrido Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte,

Antofagasta, Chile.

Editores Ejecutivos Damaris Silveira

Facultade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasil.

Peter Taylor Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de

Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. Carla Delporte

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.

Editores de Eventos María Inés Isla

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Tucumán, Argentina.

Marcelo Wagner Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos

Aires, Argentina.

Co - Editores Bárbara Arias

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

Marco Dehesa Laboratorio RENASE, Quito, Ecuador.

Jeannette Gavillan Instituto de Investigaciones Interdisciplinarias, Universidad

de Puerto Rico. Harold Gómez

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Colombia.

Vicente Martínez Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos,

Guatemala.

Edgar Pastene Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Chile.

Janet Piloto Ferrer Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

La Habana, Cuba, Edgar Puente

Centro de Toxicología y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba,

Gabriela Ricciardi Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura,

Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina, Gloria Saavedra

Centro de Tecnología Agroindustrial, Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia,

Editores Asesores Arnaldo Bandoni

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Armando Cáceres Universidad de San Carlos, Guatemala,

Norman Farnsworth College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago,

Estados Unidos. Michael Heinrich

The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido.

Peter Houghton Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College,

London, Reino Unido. Leonora Mendoza

Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile.

Francisco Morón Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Médicas de

La Habana, Cuba. Patrick Moyna

Facultad de Química, Universidad La República, Montevideo, Uruguay. Pulok K. Mukherjee

School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata, India.

Lionel Robineau Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de

las Antillas y Guyana (UAG), Pointe à Pitre, Guadalupe.

Elisabeth Williamson School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido.

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Consejo Editorial Talal Aburjai, Faculty of Pharmacy, University of Jordan, Amman, Jordan Christian Agyare, College of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcón, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad del Bio Bio, Chillán, Chile. Rocío Alarcón, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociación de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia. Elizabeth Barrera, Sección Botánica, Museo Nacional de Historia Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, IndiaSalvador Cañigueral, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, España. Sergio Castro, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos. Rene Delgado, Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clínicos, La Habana, Cuba. Saikat Dewanjee, Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Químico Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia. Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnología Farmacéutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorología, Holguín, Cuba. Mildred García, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. Área de Biología Vegetal, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana González, Universidad Católica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers University, New Jersey, Estados Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecología, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile.

Suzana Leitao, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Católica del Perú. Victor López, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, España. Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia. Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas e Biológicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabián Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Miguel Morales, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. John A.O. Ojewole, Faculty of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Sudáfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana, Iquitos, Perú. José Luís Ríos, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, España. Alicia Rodríguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia. Aurelio San Martín, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. Guillermo Schinella, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia. Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Tromsø, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panamá. René Torres, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Angélica Urbina, Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-Notre-Dame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia Saudita.

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia “Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional” (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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Nota Editorial

En el séptimo aniversario de BLACPMA [In the seventh anniversary of BLACPMA]

José L. MARTÍNEZ

Editor de BLACPMA

Contacto: e-mail: [email protected] Han transcurrido 7 años desde aquel día a

principios del mes de Mayo de 2002 en Buenos Aires, Argentina, en que se lanzara la idea ya concretizada por entonces junto a Jorge Rodríguez – Chanfreau (Cuba) de editar un Boletín noticioso sobre el quehacer en torno a las plantas medicinales de las Américas. Han sido 7 años en los que hemos crecido día a día, nacimos bajo el alero de la Sociedad Latinoamericana de Fitoquimica y en la actualidad, a partir de nuestra Tercera Reunión Editorial realizada en enero de este año en la ciudad de Chillán (Chile), bajo nuestro propia organización denominada Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas (CLACPMA) cuyo primer Presidente para el periodo Chillán (Chile) 2009 – Albacete (España) 2010 es el Dr. José María Prieto, de la Universidad de Londres quien podríamos decir que es el padre de CLACPMA y el brazo derecho de este Boletín.

En el transcurso de estos años, este Boletín ya ha dejado de ser nuestro y es de todos ustedes. Antes solo llegaban dos o tres artículos al mes, hoy llegan como promedio 13 artículos mensualmente. La información incluida en BLACPMA se ha extendido por todo el mundo y esto ha hecho posible que en este año hayan llegado manuscritos de India, Arabia Saudita, Sudán, y con artículos excelentes. Artículos publicados en BLACPMA son citados por autores de otras latitudes y no solo por autocitas. La revista se encuentra en un nivel muy alto y esperamos posicionarla mucho mas arriba.

Con la entrada de la revista en ISI la atención de autores de otras latitudes ha sido sorprendente. Sin embargo no olvidamos nuestras raíces y las puertas están abiertas para publicar como Comunicaciones las presentaciones a Congresos que sean auspiciados por BLACPMA.

Uno de los objetivos que me propuse como fundador de BLACPMA fue la idea de que investigadores de diferentes latitudes se pudieran reunir y trabajar en torno a esta Revista y eso ocurrió

en Chillán, donde se encontraron 15 personas de diferentes latitudes y todos, a pesar del idioma, hablaron de la misma temática, desde Abdul Manan Mat Jais de Malasia hasta mis compañeros de Chile que poco a poco han ido tomando conciencia de la presencia de una Revista especializada en plantas medicinales y aromáticas nacida en Chile.

Ya aquella propuesta ofrecida por Lionel Robineau (Guadalupe) de tener nuestras propias reuniones, cuestión que propuso un día allá en Río de Janeiro, esta tomando vuelo y en 2011 en Ecuador tendremos una Reunión – Congreso solo de BLACPMA que será encabezada por Marco Dehesa, uno de mis amigos de muchos años y aventuras en torno a esta temática.

En el momento de los agradecimientos, que siempre son buenos, no debemos dejar de olvidar a aquellos que hacen posible este enorme trabajo. Trataré de ser ordenado, a mi hermano chico y grande a la vez José María Prieto (Reino Unido), sin su esfuerzo allá en Londres esto no sería una revista científica. A Damaris Silveira (Brasil), la reina de BLACPMA elegida en Chillán, cuyo esfuerzo por indexar BLACPMA en ISI y en otros índices internacionales ha sido tan fructífero como todo aquello que ella emprende ¡gracias Damaris! A Gabino Garrido (Chile) que en este momento edita los artículos con pautas y políticas estándares de revistas internacionales para que estos queden uniformes como usted los lee, sin su profesionalismo y su espíritu crítico no estaríamos ascendiendo cada día más alto. A Peter Taylor (Venezuela) y Carla Delporte (Chile) quienes junto a Leonora Mendoza (Chile) son verdaderos bibliotecólogos intentando establecer que los artículos sean inéditos.

A mis cuatro amigos de muchos años que ayudaron a que este Boletín naciera Arnaldo Bandoni (Argentina), Francisco Morón (Cuba), Lionel Robineau (Guadalupe) y Patrick Moyna (Uruguay) sin olvidar a Jorge Rodríguez – Chanfreu que dio su

mailto:[email protected]

Martínez Nota Editorial. El séptimo aniversario de BLACPMA

apoyo inicial como fundador. Además, al espíritu joven de Bárbara Arias (Argentina) y la experiencia de María Inés Isla (Argentina) que han permitido en sus respectivas áreas tomar un lugar de muy buena reputación. A Jeannette Gavillán (Puerto Rico), un hallazgo de Lionel Robineau, por ser un muy buen soporte en el Caribe para BLACPMA. A mi amigo José Vicente Martínez (Guatemala), quien desde el punto de vista agronómico aporta su experiencia en establecer estándares buenísimos en los artículos que coordina en esa área. No debemos dejar de mencionar la experiencia de dos personas que se han entregado por completo a BLACPMA, me refiero a Michael Heinrich (Inglaterra) y Geoffrey Cordell (USA), sus aportes son las mejores herramientas para seguir con elevado rigor el trabajo editorial.

Siempre lo destaco pues hay alguien que es como mi hermano mayor en este tipo de cosas, que siempre me guió cuando estaba solo en BLACPMA y alguna vez también nos ha dado su granito de arena en tiempos recientes, de una mente desarrolladísima y muy visionario en cuestiones de edición y publicación, me refiero a Guillermo Padrón (Cuba) y

que hoy trabaja en Querétaro (México) para un organismo internacional.

A Claudio Laurido (Chile) y Aurelio San Martín (Chile) que siempre como mis buenos amigos personales por más de 25 años, me han apoyado en todo lo que emprendo.

Hay rostros que solo conocemos por fotos hasta el día de hoy, Talal Zari (Arabia Saudita), Christian Agyare (Ghana), Talal Aburjai (Jordania), Mahendra Rai (India), Chaiyong Rujjanawate (Tailandia) así como la sabia joven de nuestros recientes miembros Victor López (España), Edgar Puente (Cuba), Edgar Pastene (Chile), Janet Piloto (Cuba), Gabriela Ricciardi (Argentina), Gloria Saavedra (Bolivia), Harold Gómez (Colombia), Brenda Modak (Chile) entre otros nos llevan a tener confianza de que BLACPMA subirá en los próximos años a un sitial inigualable y envidiable dentro del ámbito científico internacional.

Gracias a todos, gracias a quienes confían por publicar en las páginas de BLACPMA sus trabajos, gracias a aquellos que nos leen, gracias a aquellos que nos citan, gracias a aquellos que nos dan su apoyo, gracias a todos.

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (3) 2009 | 238



Editorial

Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA, Chillán 2009 [Third Editorial Meeting of BLACPMA, Chillán 2009]

Peter TAYLOR1,2, Gabino GARRIDO1,3, Damaris SILVEIRA1,4, José M. PRIETO1,5 & José L. MARTÍNEZ1,6*

1Editor de BLACPMA; 2Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas; Caracas, Venezuela; 3Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile; 4Universidad de Brasilia; Brasilia, Brasil; 5University of London, Londres, Reino Unido; 6Universidad Santo Tomás,

Talca, Chile

*Contacto: e-mail: [email protected] Entre el 6 y 9 de enero se realizó en la Facultad de

Agronomía, Universidad de Concepción, sede Chillan, el Primer Congreso Internacional de Farmacobotánica de Chile y junto a él la Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA.

A dicha reunión asistieron José L. Martínez (Chile), José M. Prieto (Reino Unido), Gabino Garrido (Chile), Dâmaris Silveira (Brasil), María Inés Isla (Argentina), Julio Alarcón (Chile), Manan Mat Jais (Malasia), Patricia Arenas (Argentina), Janet Piloto (Cuba), Carlos Céspedes (Chile), Edgar Pastene (Chile), Vicente Martínez (Guatemala) y Peter Taylor (Venezuela). Estuvieron ausentes, por razones de salud o familiares, Marcelo Wagner (Argentina), Geoffrey Cordell (Estados Unidos), Bruce Cassels (Chile), Elsa Rengifo (Perú), Ana Ladio (Argentina) y Marta Ana Gattuso (Argentina). En la relación de invitados se encontraban Angélica Urbina (Chile), Claudia Jamal (Brasil), Marie Christine Ruiz (Venezuela), Fabián Michelangeli (Venezuela) y Héctor Rodríguez (Colombia).

José Luís Martínez, como Editor Jefe de BLACPMA, asumió la coordinación de la reunión con unas breves palabras de bienvenida. En ellas se agradeció a la Dra. Angélica Urbina –que representaba al comité organizador del Primer Congreso Internacional de Farmacobotánica de Chile - la oportunidad de colaborar con el desarrollo del evento y se anunció que las actas de este serán motivo de un suplemento de la revista que se publicará durante este 2009.

Se evaluó la situación actual de la revista como altamente satisfactoria, ya que su evolución sigue los objetivos marcados en FAPRONATURA 2006 (Varadero, Cuba) e incluso se han sobrepasado ampliamente en algunos aspectos. La prospectiva es que BLACPMA se situara como referente científico de Latinoamérica en un plazo mas corto del anticipado.

Tras esto se procedió a tratar la serie de temas que llenaban la agenda de la reunión.

Proclamación de CLACPMA (Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas) como la entidad sustentadora de BLACPMA y la elección de su Junta Directiva

CLACPMA es el organismo que actuará como órgano editor de BLACPMA. CLACPMA se constituye como una red de profesionales que desearían generar redes de conocimiento, intercambio de información y/o grupos de trabajo gracias a las oportunidades que BLACPMA proporciona para comunicarse con otros profesionales de Latinoamérica y el resto del Mundo.

La primera elección de los directivos de CLACPMA quedó integrada de la manera siguiente:

Presidente: José María Prieto (Reino Unido) Vicepresidente: José Luís Martínez (Chile) Secretario: Peter Taylor (Venezuela) Tesorero: Marcelo Wagner (Argentina) Primer Director: Gabino Garrido (Chile) Segundo Director: Edgar Pastene (Chile) La declaración de principios de CLACPMA es

pública en www.blacpma.org/clacpma.htm

Situación financiera de BLACPMA BLACPMA sigue -y seguirá siendo- una

publicación gratis y que funciona gracias al trabajo desinteresado de sus miembros. Sin embargo, existen unos ciertos costes mínimos que toda publicación electrónica debe proveer y que hasta ahora se cubren por las aportaciones mínimas de un grupo muy reducido de miembros. El comité reconoció que la tendencia actual de las publicaciones Open Access es pedir a los autores una aportación que pueda asegurar la existencia a largo plazo de su trabajo en Internet.


http://www.blacpma.org/clacpma.htm

Taylor et al. Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA, Chillán 2009

Este dinero sirve para costear la WEB, el alquiler del dominio y la adquisición de un d.o.i. que es vital para una publicación electrónica. El remanente costearía pequeños gastos de correo postal y material de oficina necesario para el desarrollo de la actividad editorial.

Participantes en la Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA. I D: Marie Christine Ruiz (Venezuela), Manan Mat Jais (Malasia), Carlos Céspedes (Chile), Peter Taylor (Venezuela), Patricia Arenas (Argentina), José L. Martínez (Chile), Janet Piloto (Cuba), Gabino Garrido (Chile), María Inés Isla (Argentina), Vicente Martínez (Guatemala), Dâmaris Silveira (Brasil), Julio Alarcón (Chile), Edgar Pastene (Chile) y José M. Prieto (Reino Unido).


Se habló de las diferentes maneras de efectuar los

posibles pagos, que idealmente estaría integrado en el sistema online. El sistema PayPal® resultó particularmente interesante porque salvaguarda los datos sensibles del autor y de BLACPMA, además de ser una referencia internacional. Se formó una comisión integrada por Dâmaris Silveira (Brasil), Julio Alarcón (Chile), María Inés Isla (Argentina) y Marcelo Wagner (Argentina) para tomar decisiones sobre estos asuntos financieros e informar a la comunidad de sus recomendaciones antes de mayo 1 de 2009.

Evaluaciones y pautas de revisión de manuscritos José L. Martínez hizo un análisis del flujo de las

evaluaciones de manuscritos y entregó un documento con el estado actual de los manuscritos en proceso de evaluación. Se dio la bienvenida a Angélica Urbina y Fabián Michelangeli como nuevos evaluadores.

Se creó una comisión para renovar el formato de evaluación a ser usado en el futuro por BLACPMA además de establecer un nuevo proceso interno de

evaluación. Se sugirió, por ejemplo, que el coordinador de la evaluación de un manuscrito debe evaluar su originalidad, que sea un tema apropiado para BLACPMA y que conforme al formato de presentación, mientras que los revisores harán hincapié en el contenido científico. Se formó una comisión para establecer las “Pautas de revisión” conformada por Carlos Céspedes (Coordinador), Julio Alarcón (Química) y Gabino Garrido (Farmacología). Mayoritariamente se sugirió mantener la pauta de aceptar envíos en los tres idiomas más importantes de América Latina y el Caribe: español, inglés y portugués.

Los Editores de BLACPMA José M. Prieto (I) y José L. Martínez (D) recién elegidos Presidente y Vicepresidente de CLACPMA, respectivamente.

Próximas Reuniones Editoriales y Congresos Se estableció el probable cronograma de

reuniones editoriales. Se acordó realizar en los años pares la Reunión del Comité Editorial junto a un congreso y en los años impares de forma autónoma (CLACPMA). De esta forma se propuso realizar la Cuarta Reunión del Comité Editorial de BLACPMA (o BLACPMA 4) junto al Congreso de la International Society of Ethnopharmacology en Albacete (España) en septiembre de 2010 al cual hemos sido invitados por su presidente. Existen al menos tres pre-acuerdos y/o invitaciones para las Reuniones Editoriales BLACPMA 5-6-7 o Congresos CLACPMA 1-2 en Quito (Ecuador) en 2011, ofrecida por el Dr. Marco Dehesa y un pre-acuerdo sostenido por José L. Martínez y el Dr. Héctor Rodríguez para realizar BLACPMA 6 junto al Congreso de Plantas Medicinales de Colombia en

Taylor et al. Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA, Chillán 2009


Asuntos varios Palmira o Cali en 2012 y se invitó al Dr. Vicente Martínez (Guatemala) la organización de BLACPMA 7 junto a CLACPMA 2 en Antigua (Guatemala) en 2013.

El Prof. Manan Mat Jais informó de la posibilidad de invitar a BLACPMA a participar en un acuerdo sur-sur con BIOASIA. Esto abriría posibilidades de colaboración entre ambas regiones a través de BLACPMA.

Vista de la celebración de la Tercera Reunión del Comité Editorial de BLACPMA.

Los presentes felicitaron a todos los que han trabajado arduamente en BLACPMA y CLACPMA y muy especialmente a José Luís Martínez y a José María Prieto.

Tras la Reunión Editorial se celebró una Cena de Hermandad BLACPMA, la primera en su género, a la que acudieron tanto miembros del comité como amigos.



Revisión | Review

Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review

[Recientes avances del uso del Panax ginseng como analgésico: una revisión sistemática]

Alessandra de Sousa BRAZ, Margareth de Fátima F. Melo DINIZ, Reinaldo Nóbrega de ALMEIDA*

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba.Caixa Postal 5009, CEP 58051-970, João Pessoa, Paraíba, Brazil.

Abstract

Ginseng is a widespread herbal medicine that has been used in China, Korea and Japan for thousands of years. Ginsenosides or ginseng saponins are the active principles of Panax ginseng. Ginseng is widely used as a general tonic and adaptogen; however, experimental and clinical studies have shown it to have beneficial effects on a wide range of pathological conditions including cardiovascular diseases, cancer, immune deficiency and neurodegenerative disorders. Recent studies have also suggested that some of the active ingredients of ginseng may exert a beneficial effect on nociception. This review focuses on the recent scientific evidence of the reported medicinal effects of ginseng with particular emphasis on its analgesic-like effects.

Keywords: Ginseng extract; Ginsenoside; Antinociception; Analgesia.

Resumen

El ginseng es una hierba medicinal que está difundida en todo el mundo. Países como China, Corea y Japón la han utilizado por muchos siglos. Los ginsenósidos o saponinas de ginseng son los principios activos del Panax ginseng. Este es ampliamente utilizado como un tónico y adaptógeno; sin embargo, algunos estudios experimentales y clínicos han demostrado efectos beneficiosos en gran variedad de condiciones patológicas como enfermedades cardiovasculares, cáncer, deficiencia inmune y desórdenes neurodegenerativos. Recientes estudios sugieren que algunos de los componentes activos del ginseng pueden ejercer un efecto beneficioso en la nocicepción. Esta revisión se centra en la evidencia científica mas reciente de los efectos medicinales anteriormente citados del ginseng, con especial énfasis en sus efectos analgésicos.

Palabras Clave: Extracto de ginseng, Ginsenosides, Antinocicepción, Analgesia.

Recibido | Received: February 2, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: April 10, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 13, 2009. Declaración de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiación | Funding: none stated. This article must be cited as: Alessandra de Sousa Braz, Margareth de Fátima F. Melo Diniz, Reinaldo Nóbrega de Almeida. 2009. Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):188 – 194. {EPub April 13, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: [email protected]

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http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/�





Braz et al. Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review.


INTRODUCTION

For hundreds of years, traditional Chinese, Korean and Japanese medicine has used medicinal herbs such as ginseng as an essential therapy for weakness and fatigue. Ginseng is derived from the roots of several species of plants (Kiefer and Pantuso, 2003). The types of ginseng most frequently used are Asian or Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer), American ginseng (Panax quinquefolius C.A. Meyer) and Japanese ginseng (Panax japonicus C.A. Meyer) (Yuan and Dey, 2001; Coleman et al., 2003). The genus Panax (Araliaceae) is comprised of around 11 slow-growing species (perennial plants with strong roots) that grow in the northern hemisphere, typically in the cold climates of eastern Asia, particularly northern Korea and eastern Siberia and Russia. The Table 1 summarizes the scientific classification of the Panax genus (Winston and Maimes, 2007).

Ginseng is used in several ethnomedical systems as an adaptogen. However, other species endowed with similar adaptogenic effects are popularly also known as gingseng. These include -among others- Eleutherococcus senticosus (Siberian ginseng), Pseudostellaria heterophylla (Prince ginseng), Withania somnifera (Indian ginseng) and Pfaffia paniculata (Brazilian ginseng) (Davydov and Krikorian, 2000; Radad et al., 2006).

The chemical composition of the different Panax species is relatively similar; however, in general each species exerts a specific effect on the body (Vuksan et al., 2000; Radad et al., 2006). The principal active components of ginseng are the ginsenosides or ginseng triterpenoid saponins. Approximately 38 types of ginsenosides have been identified (Rhim et al., 2002; Leung et al., 2007; Choi et al., 2008), which account for the pharmacological effects of these plants in the modulation of angiogenesis, for their popular adaptogenic properties and their effects on the central nervous system (CNS). The concentration of each ginsenoside varies depending on the species of Panax, the time of the year, the time it takes to be collected, the part of the plant and the methods of preservation or extraction used. Some studies have indicated steroid hormone receptors as possible molecular targets of ginseng, which may explain the diverse cellular and physiologic effects of this plant (Rege et al., 1999; Yuan and Dey, 2001; Coleman et al., 2003; Leung et al., 2007).

According to Attele et al. (1999), some of the pharmacological effects of ginsenosides may be

explained by their capacity to target multiple receptors at the plasma membrane as well as by their ability to cross the membrane freely and induce effects by acting directly on the nucleus. However, in many cases, the mechanisms of action of the ginsenosides remain unknown. Table 1. Scientific classification of the Panax genus.

Kingdom Division Class Order Family Subfamily Genus Main species

Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Apiales Araliaceae Aralioideae Panax Panax notoginseng (San Qi) Panax bipinnatifidus (Seem.) Panax ginseng (C.A. Meyer) Panax japonicus (C.A. Meyer) Panax quinquefolium (C.A. Meyer) Panax vietnamensis (Ha eand Grushv) Panax wangianum (Suu) Panax zingiberensis (Wu and Feng.) Panax pseudoginseng (Wall) Panax stipuleanatus (Tsai and Feng.) Panax trifolium L.

The basic chemical structure of all ginsenosides is similar, consisting of a gonane steroid nucleus with 17 carbon atoms arranged in four rings. The characteristic biological responses for each ginsenoside are attributed to the differences in the type, position, and number of sugar moieties attached by the glycoside bond at C-3 and C-6. Based on their structural differences, they can be classified into three categories: the panaxadiol group (Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Rs1), the panaxatriol group (Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1), and the oleanolic acid group (Ro) (Radad et al., 2006).

This review focuses on the recently reported medicinal effects of ginseng and summarizes the current body of evidence supporting the use of ginseng particularly with respect to its antinociceptive / analgesic properties.

General use of Panax ginseng Based on experimental studies, an effect of some

types of ginseng on the central nervous system (CNS) has been suggested, particularly in neurodegenerative disorders such as senile dementia and Parkinson’s disease. Following the rapid exposure of cortical cell culture to glutamate, an excitatory neurohormone of



the CNS, significant neuronal death occurred. This damage was significantly reduced when the cell cultures were pretreated with the Rb1 and Rg3 ginsenosides, resulting in inhibition of the overproduction of nitric oxide, which is routinely followed by neurotoxicity. In glutamate-treated cells, these ginsenosides inhibited the formation of malondialdehyde and reduced calcium influx, suggesting a significant neuroprotective effect (Kim et al., 1998).

It has been suggested that Rg3 ginsenoside inhibits both N-methyl-D-aspartate (NMDA) and non-NMDA glutamate receptors, which contribute significantly to many neurological disorders particularly brain ischemia, trauma, stroke, and seizures (Radad et al., 2006).

The neuroprotective effect of the Rb1 and Rg1 ginsenosides (extracted from ginseng roots) has been demonstrated in vitro in spinal cord neurons. These ginsenosides were found to protect the spinal neurons from the excitotoxicity induced by glutamate and kainic acid, as well as from the oxidative stress induced by H2O2, in a dose-dependent manner (20-40 micro M), thereby reinforcing the need for more studies on its therapeutic use in spinal cord injuries (Liao et al., 2002).

It has also been shown to have an effect on the immune system by enhancing phagocytosis, the activity of natural killer cells and interferon production (Kiefer and Pantuso, 2003), and has beneficial effects as an antioxidant (Hofseth and Wargovich, 2007). Kim et al., 2007, found that transgenic P. ginseng inhibited the production of tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-6, IL-8, and the expression of cyclooxygenase-2 in phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) plus calcium ionophore A23187 (PMACI)-stimulated human mast cells (HMC-1). Additionally, they have shown that transgenic P. ginseng suppressed the intracellular calcium level induced by PMACI. These results provide new insights into the pharmacological actions of transgenic P. ginseng as a potential molecule for use in therapy in mast cell-mediated inflammatory diseases (Kim et al., 2007).

Studies carried out in vivo have shown the beneficial effects of P. ginseng in a wide range of pathological conditions such as diabetes mellitus (Suzuki and Hikino, 1989), cardiovascular diseases (Buettner et al., 2006) cancer (Panwar, 2005; Mannaa et al., 2006), inflammatory processes (Li and Chu, 1997; Park et al., 2005; Raddad et al., 2006) and in animal models of behavioral disorders (Einat, 2007).

Clinical use of Panax ginseng In clinical studies, ginseng led to an improvement

in climacteric symptoms, particularly fatigue, insomnia and depression, in postmenopausal women (Tode et al., 1999). In addition, a positive effect has been shown on the immune system (Kaneko and Nakanishi, 2004) in the control of arterial hypertension and on cardiovascular function (Zhou et al., 2004), in the treatment of psychological abnormalities and in conditions associated with diabetes mellitus (Buettner et al., 2006). It has also been found to reduce the occurrence of viral respiratory infections in the elderly when compared to a placebo group (McElhaney et al., 2004).

Nevertheless, controversial results have been published in the literature with respect to the use of ginseng for the treatment of psychological abnormalities and only a modest effect has been reported with respect to its hypoglycemic activity (Kiefer and Pantuso, 2003). Ginseng has been reported to have a positive effect in the treatment of herpes simplex virus type II infection, the common cold, ethanol-induced gastric lesions and aspirin-induced gastric ulcers (Kaneko and Nakanishi, 2004).

Used primarily as a general tonic and to restore homeostasis, and despite reports of improvements in psychomotor performance in healthy volunteers (D'Angelo et al., 1986), there are contradictory reports in the literature (Coleman et al., 2003; Kiefer and Pantuso, 2003).

The use of ginseng was found to result in an improvement in the quality of life of patients with chronic renal failure and an improvement in mental and psychosocial health following four weeks of treatment; however, these effects tended to attenuate with prolonged use (Ellis and Reddy, 2002). In 2003, Coleman et al. analyzed studies carried out on the effects of this plant on quality of life and found that, although the majority of studies failed to find any significant differences associated with the use of ginseng in the final scores, the possibility that an improvement in some of the parameters of quality of life was indeed related to its use could not be discarded.

The efficacy of ginseng as a therapeutic option for the treatment of male erectile dysfunction (Hong et al., 2002), and the improvement in the survival of patients with advanced stomach cancer during postoperative chemotherapy (Suh et al., 2002) have been demonstrated in double-blind clinical trials.



Panax ginseng and analgesia: possible molecular mechanisms

Several studies have demonstrated the antinociceptive effects of ginseng extract in experimental models in vitro (Nah and Mccleskey, 1994; Hahn et al., 2000; Sampson et al., 2000) and in vivo (Ramarao and Bhargava, 1990; Mogil et al., 1998; Yoon et al., 1998; Shin et al., 1999; Nah et al., 2000; Suh et al., 2000; Choi et al., 2003; Nemmani and Ramarao, 2003).

Studies using the whole-cell and inside-out configurations of the patch-clamp technique showed that the total saponins of ginseng (ginsenosides), when applied at the dose of 100 µg/mL concomitantly with capsaicin (1 µg/mL), directly blocked the capsaicin-activated calcium channels, resulting in attenuation of the currents of these ions in sensorial neurons of rats (Hahn et al., 2000).

The Rg3 ginsenoside was also able to inhibit calcium channels in the rat dorsal root ganglion neurons. Studies using the patch-clamp technique found that the application of the entire extract of ginseng suppressed calcium channel currents in a dose-dependent manner. The experimental use of selective blockers showed that the ginseng saponins are able to modulate the currents in the L, N and P calcium channels, suggesting that part of the pharmacological basis of the antinociceptive effect of ginseng, particularly the Rg3 ginsenoside, involves modulation of the calcium channels (Rhim et al., 2002).

Voltage-gated Na+ channels in primary sensory neurons play important roles in pain perception. The effects of a polyacetylenic compound, (9R,10S)-epoxyheptadecan-4,6-diyn-3-one (EHD), isolated from ginseng extract, were investigated in tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) and tetrodotoxin-resistant (TTX-R) Na+ currents in acutely dissociated rat dorsal root ganglion neurons. In this study, EHD inhibited both Na+ currents in a concentration-dependent manner, accelerated the inactivation of both Na+ currents and produced a hyperpolarizing shift of the steady-state inactivation curve. In addition, EHD suppressed the maximal Na+ current at negative holding potentials at which the channels are relieved from inactivation. Thus, EHD appears to bind both resting and inactivated channels. According to these authors, EHD, a polyacetylene derived from ginseng, by inhibiting Na+ currents in primary sensory neurons, may contribute to the analgesic effect of ginseng (Choi et al., 2008).

In vivo studies, the effects of the administration of ginseng extract on nociception and colonic temperature in Sprague-Dawley rats, and the possible involvement of opioid receptors in its pharmacological activities were evaluated by Ramarao and Bhargava in 1990. Following intraperitoneal administration of the extract at doses of 25, 50, 100 and 200 mg/kg, either alone or in combination with morphine (8 mg/kg), ginseng was found to induce analgesia and hypothermia at high doses (100 and 200 mg/kg) through a non-opioid mechanism, since these effects were not antagonized by naloxone. Since ginseng was able to induce analgesia, its interaction with morphine was investigated and results showed that when the extract was administered together with morphine, the acute pharmacological effects evoked by morphine in rats, such as analgesia and hyperthermia at a dose of 8 mg/kg, and catalepsy at a dose of 50 mg/kg were antagonized by ginseng in a dose-dependent manner. In other words, to antagonize the analgesic effect of morphine, only intermediate doses (25 to 50 mg/kg) were effective.

Next, it was found that, like opioid analgesics, the Rf ginsenoside inhibited calcium channels in primary sensorial neurons using an unidentified receptor bound to the G protein, unlike the alpha-2 adrenergic receptors, gamma-amino butyric acid type B (GABAB), muscarinic or opioid receptors (Nah and Mccleskey, 1994).

Since inhibition of the calcium channels in sensorial neurons contributes towards antinociception by the opioids, Mogil et al. (1998) tested the analgesic effects of the Rf ginsenoside in experimental models of acute and chronic pain, and reported a dose-dependent, antinociceptive effect in the models used to evaluate chronic pain. This effect was accompanied by inhibition of the calcium channels in the large nociceptors. Additionally, the authors reported an antinociceptive effect with the use of the raw, unprocessed extract of ginseng, suggesting that Rf was not the only component of the extract that participated actively in the antinociceptive effect.

The effects of ginsenosides on the nociceptive response to intrathecally-administered substance P (SP) were also investigated in mice. Using this route of administration, both pretreatment and concomitant treatment with ginsenosides inhibited the SP-induced nociceptive responses (scratching, biting or licking the distal portion of the paw) in a dose-dependent manner. In this study, Yoon et al. (1998) reported that ginsenosides showed antinociceptive activity in the



formalin test and that this effect was due to substance P-mediated blockade of the postsynaptic nociceptive information at spinal level. Choi et al. (2003) obtained similar results with Rb2, Rc, Rd and R2 ginsenosides injected supraspinally and Rb1, Rb2, Rd and Rf ginsenosides administered into the spinal cord.

Following confirmation that ginsenosides were effective in inhibiting SP-induced nociceptive responses, Nah et al. (2000) demonstrated their central activity following inhibition of the pain induced experimentally by an injection of capsaicin into the hind paw of the animal. These investigators reported that the plant inhibited pain in a dose-dependent manner only when administrated intrathecally or intracerebroventricularly, while this effect was not found when the ginsenoside was applied subcutaneously to the plantar surface prior to the injection of capsaicin. As in the study carried out by Shin et al. (1999) with Rc, Rd and Re ginsenosides in models of chronic pain in which significant responses related to the noxious chemical stimulus were obtained, pretreatment with naloxone failed to block the antinociceptive effect of the intrathecal administration of the ginsenoside, suggesting that the latter exerts central antinociceptive effects in the spine and/or supraspinal region but not in peripheral nociceptors. Moreover, these investigators found that their effects were not mediated by the opioid receptors (Shin et al., 1999; Nah et al., 2000).

Rb1, Rb2, Rc, Rd and Rg1 ginsenosides blocked the antinociceptive effect induced by a kappa-opioid agonist (U50,488H) when administered into the spinal cord and in the supraspinal region of mice, and the same response was obtained by Rb2 and Re ginsenosides administered into the supraspinal region (Suh et al., 2000).

Interference by the Rf ginsenoside in the analgesic effect induced by the opioid agonist U50,488 H was reported by Nemmani and Ramarao in 2003 using the tail-flick test in mice. Intraperitoneal administration of 40 mg/kg of the agonist produced analgesia, and the inhibition of tolerance of the agonist to analgesia by Rf remained unaffected by flumazenil (0.1 mg/kg), a benzodiazepine receptor antagonist, and by picrotoxin (1 mg/kg), a chloride channel blocker in the GABAA receptor. The results showed that Rf potentiated U-50, 488H-induced analgesia and inhibited its tolerance to analgesia, suggesting that the effect of Rf on U50,488H, in mice occurs through a non-opioid path insensitive to the calcium channels, sensitive to dihydropyridine and not GABAergic.

Clinical studies with analgesic activities of P. ginseng on literature are insufficient. Others saponins were studied. To evaluate the therapeutic effect and possible mechanism of total Panax notoginseng saponins (PNS) for treatment of rheumatoid arthritis (RA), and to observe its safety and influence on RA immune related inner environment, 84 patients were randomly assigned to two groups. All were treated with the routine therapy with diclofenac sodium, Leflunomide and prednisone, but for the 43 patients in the treatment group PNS was given additionally. Significant improvement of clinical symptoms and change of indexes including platelet counts, immnuoglobulins (IgG, IgA, IgM), complement (C3), rheumatoid factor (RF), C-reactive protein (CRP), ceruloplasmin (CER), haptoglobin (HPT), and alpha1-acid glycoprotein (AAG) were observed in both groups after treatment, and the effect in the treatment group was better (P<0.05 or P<0.01). PNS can significantly improve the condition of patients enhance the therapeutic effect in treating RA, through regulating the disordered immunity and improving the effect of anti-inflammatory and analgesia (Zhang et al, 2007).

CONCLUSION

In experimental models, the antinociceptive/anal-gesic effects of ginseng extract, particularly the effect of ginsenosides on inhibition of substance P-induced nociceptive response and the inhibition of calcium channels in the sensorial spinal and or supraspinal neurons of rats, suggest that ginseng has a potential analgesic effect and a central antinociceptive effect; rather than on the peripheral nociceptors. Clinical studies with analgesic activities of P. ginseng on literature are scarce. Therefore, in view of the positive findings of clinical trials performed with appropriate methodology, the medicinal and analgesic effects of ginseng extract may represent an option for the treatment of acute and/or chronic pain, particularly since the costs involved in marketing this substance appear to be accessible.

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Artículo Original | Original Article

Anti-inflammatory effect of an ethanolic root extract of Heliopsis longipes in vitro

[Efecto anti-inflamatorio in vitro del extracto etanólico de la raíz de Heliopsis longipes] Ivones HERNÁNDEZ1, Yeny LEMUS1, Sylvia PRIETO1, Jorge MOLINA-TORRES2, Gabino GARRIDO1,3*

1Laboratorio de Farmacología, Centro de Química Farmacéutica, La Habana, Cuba. 2Departamento de Biotecnología y Bioquímica, CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato, México.

3Departamento de Química y Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile.

Abstract

Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) is a species broadly used in Mexican Traditional Medicine. The present study illustrates the effects of the root ethanolic extract from this species on the production of tumor necrosis factor alpha (TNFα) and nitric oxide (NO) by activated RAW264.7 macrophage. The extract showed an inhibitory activity on TNFα (IC50= 223.0 μg/mL) and NO (IC50 = 136.9 μg/mL). These results represent a contribution to the elucidation of the mechanism involved in the analgesic and anti-inflammatory effects reported for the H. longipes extract.

Keywords: Heliopsis longipes; inflammation; tumor necrosis factor alpha; nitric oxide; macrophages.

Resumen

Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) es una especie ampliamente utilizada en la Medicina Tradicional Mexicana. El presente estudio ilustra los efectos del extracto etanólico de la raíz de esta especie sobre la producción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y el óxido nítrico (NO) en macrófagos RAW264.7 activados. El extracto mostró una actividad inhibitoria sobre TNFα (IC50= 223.0 μg/mL) y NO (IC50 = 136.9 μg/mL). Estos resultados representan una contribución a la elucidación del mecanismo involucrado en los efectos analgésico y anti-inflamatorio publicado para el extracto de H. longipes.

Palabras Clave: Heliopsis longipes; inflamación; factor de necrosis tumoral alfa; óxido nítrico; macrófagos.

Recibido | Received: February 3, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 4, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was partially supported by the Ministry of Public Health, Republic of Cuba (Project MINSAP/Cuba 0008001) and Integral Project CONACYT/México E120,941/2002. This article must be cited as: Ivones Hernández, Yeny Lemus, Sylvia Prieto, Jorge Molina-Torres, Gabino Garrido. 2009. In vitro anti-inflammatory effect of Heliopsis longipes roots ethanolic extract. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):160 – 164. {EPub April 10, 2009}.

*Contactos | Contacts: Prof. Gabino Garrido Garrido. Departamento de Química y Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile. E-mail: [email protected]; [email protected]








Hernández et al. Heliopsis longipes anti-inflammatory effects in vitro


INTRODUCTION

Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) is a species broadly used in Mexican Traditional Medicine for the treatment of dental pain (Gutierrez-Lugo et al., 1996) and is also used by indigenous and rural peoples of Central and South America for its analgesic, anti-inflammatory and anti-ulcerative properties (Colvard et al., 2006). Studies carried out with extracts obtained of this plant have demonstrated its capacity to inhibit the constrictions induced by intraperitoneal administration of acetic acid in a murine model of pain (Ogura et al., 1982).

It is relevant to note the presence of affinin in the extract obtained from H. longipes roots (Molina-Torres and García-Chávez, 2001). Also, the alkamides has been studied in vitro for their inhibitory action on the enzymes cyclooxygenase and 5-lipoxygenase (Müller-Jakic, 1994).

Taking in to account these reports, we have proposed to determine the anti-inflammatory effects of the ethanolic extract of of H. longipes roots. In this paper, we have evaluated the in vitro effects on tumor necrosis factor (TNFα) and nitric oxide (NO) production by activated macrophages.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material H. longipes (Gray) Blake (Asteraceae) specimens,

as authenticated by Dr J. Rzedowski, Instituto de Ecología, Pátzcuaro, Michoacan, Mexico, were collected in Sierra Gorda in the state of Guanajuato, Mexico at an altitude of between 2000 and 2500 meters above sea level. Voucher specimens (H. longipes JMT, IED) were deposited at the above mentioned institution.

Preparation of the extracts Dry roots were ground and extracted with absolute

ethanol in a continuous extraction system (Tecator, Soxtec System HT 1043 Extraction Unit) for 2 h at 80°C. The ethanolic extract was then freed from solvent in a rotary evaporator at 60 °C under reduced pressure (Molina-Torres et al., 1999). Dry extract was maintain at –20 oC until its use when it was dissolved in DMEM for in vitro pharmacological studies.

Chemical characterization of the extract The chemical characterization of this ethanolic

extract was reported by Molina-Torres et al. (1996; 2004). It contains affinin, as the major alkamide, along with N-isobutyl-2E-decenamide, and N-isobutyl-decanamide. Interestingly, sesquiterpene lactones -bioactive secondary metabolites commonly present in Asteraceae- were not found in the extract.

Reagents Dexamethasone, lipopolysaccharide (LPS, from

Escherichia coli Serotype: 055:B5), recombinant murine gamma interferon (IFNγ), tumor necrosis factor (recombinant murine TNFα, specific activity: 107 U/mg), actinomycin D were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Nω-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) was from Cayman Chemical, Ann Arbor, MI.

Cell lines Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM,

GIBCO-BRL, Pisley, UK) and RPMI 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) were supplemented with 10% FBS, 1% de L-glutamine and 0.5% penicillin-streptomycin solution.

The murine macrophage RAW264.7 cell line and murine fibrosarcoma L929 cell line were cultured in DMEM medium and RPMI 1640, respectively, and incubated at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO2.

Cytotoxicity assays The H. longipes extract was not cytotoxic (≤ 500

μg/mL) according to previous studies of cytotoxicity. This was assessed by dimethyl-diphenyl-tetrazolium (MTT) incorporation for each experimental condition. The viability was consistently > 97% (Delgado et al., 1998). Dexamethasone and L-NMMA were used as positive control for TNFα and NO inhibition, respectively. Tests were repeated in at least three independent experiments and the assays were performed in triplicate.

Pro-inflammatory challenge (RAW264.7 activation)

RAW264.7 cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with trypsin-EDTA, without calcium or magnesium, for 3 min at 37 oC to detach the cells from the culture flask. Cells were resuspended in DMEM and incubated in



24-well tissue-culture plates at a concentration of 105 cells/mL for 24 h in a humidified incubator at 37 oC, with 5% CO2. Growth medium was removed and cell monolayers were stimulated with 10 ng/mL LPS and 2 U/mL recombinant murine IFNγ. To test the effects of the H. longipes extract, concentrations (1-200 μg/mL) were dissolved in DMEM medium and added to wells 10 min before treatment with LPS + IFNγ. Cell-free supernatants were harvested after 1 h incubation and kept at -70 oC until use to assay TNFα and NO2 levels.

Cytokines (TNFα) determination TNFα production by macrophages was determined

by the L929 cell lysing assay as described Gomez-Flores et al. (1997) in supernatants of cell cultures in the presence of actinomycin D 1 μg/mL. Recombinant TNFα was used as standard (specific activity, 107 U/mg).

Nitrite determination NO is rapidly oxidized to nitrite in culture medium,

and nitrite (NO2−) concentration is an indicator of NO

production. Cell-free culture supernatants were mixed with equal amounts of Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylenediamide in 2.5% phosphoric acid) in 96-well ELISA plates. Samples were incubated at room temperature for 10 min and the absorbance was measured at 540 nm with the use of a microplate reader. Nitrite concentrations were calculated using a sodium nitrite standard curve (Jun et al., 1994).

Statistical analysis Effects of H. longipes extract on TNFα and NO

production represent the means ± SEM of three determinations. Analysis of variance followed by Dunnet’s test for specific comparisons were performed. Probability values less than 0.05 (p<0.05) were considered significant. Regression analysis was used to calculate the effective inhibitory concentration 50 (IC50), defined as the concentration necessary to produce a 50% of inhibition on TNFα and NO on in vitro endotoxic shock.

RESULTS AND DISCUSSION

Few studies have demonstrated the pharmaco-logical activity of ethanolic extracts of H. longipes. In this paper, when macrophages RAW 264.7 were stimulated with LPS and IFNγ, the production of TNFα and NO was triggered. However, Fig. 1 shows

the inhibition of TNFα production by the extract in this cell line with an IC50 of 223.0 μg/mL. This activity is very important for the anti-inflammatory actions of this extract. The action is in correspondence with the effects of other natural inhibitors on this cytokine in the inflammatory process (Manthey et al., 1999). The NO production (equivalent to levels of NO2) was also reduced when stimulated cells were pre-incubated with the H. longipes extract (IC50= 136.9 μg/mL) as shown in Fig. 2.

The inhibitory effects of the H. longipes ethanolic root extract may be explained, at least in part, by the presence of alkamides (mainly affinin) in the root extract. This family of chemical compounds has been studied as cytokine and NO inhibitors in in vitro models of activated macrophages (Murakami et al., 2000). Experiments using extracts from Echinacea angustifolia and alkylamide derivatives have reported anti-inflammatory (Tragni et al., 1985; Tubaro et al., 1987; Raso et al., 2002) or immunosuppression (Matthias et al., 2007) activities including the inhibition of TNFα and NO in macrophages.

Macrophages are important cells of the immune defense system because they participate in the processing and presentation of antigens to T cells, the phagocytosis of foreign particles, and killing of microorganisms. During these process, high levels of NO and reactive oxygen intermediates are generated contributing to intracellular destructive mechanisms, and can be activated some metabolic pathway to production of cytokines such as TNFα and IL-1β, eicosanoids like prostaglandins, leukotrienes, and other mediators of inflammatory response (Macmicking et al., 1997).

On the other hand, activated macrophages produce mediators of cytotoxicity (such as NO and TNFα), which protect the host against the infections development. One important mediator of the inflammatory process is NO of which excessive or inappropriate production can lead to tissue damage through peroxynitrites formation in a reaction that takes place between NO and the superoxide anions. It is of interest to note that the inhibitory action observed in macrophages activated with LPS and IFNγ, is directly related to the effect on the induction of the enzyme inducible NO synthase in these cells (Paul-Clark et al., 2001).

However, TNFα is one the pro-inflammatory cytokines that are primarily released by activated monocytes and macrophages (Vilcek and Lee, 1991). The results shown in this study would also explain at


Figure 1. Effect of an ethanolic root extract of H. longipes on tumor necrosis factor (TNFα) production in activated murine macrophages.

0

100

200

300

400

500

600

Con

trol

Hl-5

00

Hl-2

50 L+ I

L+ I

+ Hl

-1

I +

Hl-1

0

+ H

l-100

+ H

l-250

+ H

l-500

L+ I

+ D

exa

TNF

(pg/

mL)

*

L+ L+ I

L+ I

L+ I

**

RAW264.7 cells (105 cells/mL) were activated with LPS (L, 10 ng/mL) and IFNγ (I, 2 U/mL) and treated with H. longipes (Hl) 1, 10, 100, 250, 500 μg/mL. Dexamethasone (DEXA, 1mM) was used as the reference drug. Each group represents the mean ± S.E.M of three independent experiments. *p< 0.05 statistical significance compared with the group treated only with LPS plus IFNγ.

Figure 2. Effect of an ethanolic root extract of H. longipes on nitric oxide (NO) production in activated murine macrophages.

-5

0

Con

trol

Hl-1

0

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100

HL-

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L+I

L+I+

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*

**

*

RAW264.7 cells (105 cells/mL) were activated with LPS (L, 10 ng/mL) and IFNγ (I, 2 U/mL) and treated with H. longipes (Hl) 1, 10, 100, 250, 500 μg/mL. L-NMMA 1 mM was used as the reference drug. Each group represents the mean ± S.E.M of three independent experiments. *p< 0.05 statistical significance compared with the group treated only with LPS plus IFNγ.

least partially, the analgesic effect reported for H. longipes, which inhibits the abdominal writhing induced by the intraperitoneal administration of acetic acid in mice (Ogura et al., 1982) where these pro-inflammatory mediators play an important role.

CONCLUSION

The ethanolic extract of H. longipes shows anti-nociceptive and anti-inflammatory activities in vitro.

We report that here they may be mediated, at least in part, by the inhibition of pro-inflammatory cytokines (such as TNFα) and free radicals (such as NO). These results represent the first contribution towards the full elucidation of the pharmacological activities exhibited by H. longipes extracts, which are rich in alkamides.



ACKNOWLEDGEMENTS

Specially thanks to Prof. Enrique Ramírez, CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato, México.

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Determinación de plaguicidas organoclorados y organofosforados en tomates de mercados de cadena en las ciudades de Pereira y Armenia,

Colombia [Organophosphorus and organochlorine pesticide’s determination in tomatoes from Armenia and Pereira cities`

local market: Colombia]

Jorge A. GUTIÉRREZ*, Alfonso LONDOÑO

Facultad de Ciencias de la Salud, Grupo de Investigación Plaguicidas y Salud, Universidad del Quindío, Colombia (CP057).

Abstract

Tomatoes from Armenia and Pereira cities` local market were analyzed. Using Liquid – liquid extraction method (LLE) have been found: 3 organophosphorus and 5 organochlorine by gas chromatography; from a standard organophosphorus and organochlorine pesticides mix, used in its calibration curve. This analysis showed the highest concentration for Sulfotep and Forato organophosphorus pesticides. In spite of, any of these pesticides detected by this method overcame the maximum limits allowed by legislation. In other way we have been found higher concentrations in organics tomatoes were it wasn´t expected

Keywords: Pesticides; Organochlorine; Organophosphorous; Tomato; Gas chromatography; Liquid-liquid extraction.

Resumen

Se analizaron tomates obtenidos en mercados de cadena en las ciudades de Armenia y Pereira y se determinó por medio de la extracción liquido-liquido por lotes un total de 3 plaguicidas organofosforados y 5 organoclorados, donde el Sulfotep y el Forato fueron los que presentaron mayores concentraciones, a pesar de ello ninguno de los analitos superaron los límites máximos permitidos por legislación, además se encontró inesperadamente altas concentraciones en tomates orgánicos donde se esperaba ausencia de este tipo de compuestos.

Palabras Clave: Plaguicidas, Organoclorados, Organofosforados, Tomate, Cromatografía gaseosa; Extracción líquido-líquido.

List of Abbreviations

LLE: liquid – liquid extraction method; BHC: hexaclorociclohexano; DDE: diclorodifeniletano; DDT: diclorodifeniltricloroetano; DDD: diclorodifenildicloroetano; Dimetoato: ditiofosfato de O,O-dimetilo y de metilcarbamoilmetilo. Recibido | Received: April 21, 2008. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 30, 2009 Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009 Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by Universidad del Quindio. This article must be cited as: Jorge A. Gutiérrez, Alfonso Londoño. 2009. Determinación de plaguicidas organoclorados y organofosforados en tomates de mercados de cadena en las ciudades de Pereira y Armenia, Colombia. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):165 – 171.{EPub 10 April 2009}.

*Contactos | Contacts: [email protected] ; [email protected]; Tel (+57)6-7460100.








Gutiérrez y Londoño Plaguicidas en tomates de mercados de cadena colombianos


INTRODUCCIÓN

El uso de plaguicidas es una de las prácticas que más ha contribuido al incremento de la producción agrícola en las últimas décadas, y que junto al empleo de fertilizantes sintéticos, sistemas de riego, compuestos orgánico-sintéticos, son en la actualidad indispensables para satisfacer la creciente demanda de alimentos de la producción mundial (Ministerio de la Protección Social, 2003). Con el uso de plaguicidas, la producción de alimentos ha aumentado en un 50%, pero infortunadamente forjando riesgos que se manifiestan en nuevas patologías, resultantes de la exposición a estos tóxicos (Idrovo, 1999).

En Colombia existe una alta dependencia hacia los plaguicidas por ser un país principalmente agrícola, ya que estos favorecen el rendimiento de las cosechas, pero su uso desmesurado ha generado consecuencias que no solo afectan los ecosistemas sino también a agricultores y consumidores; esto gracias a su residualidad en los alimentos; como en el tomate, uno de vegetales en el cual se almacenan más contaminantes junto con las papas, espinacas y lechugas (Castro et al., 2005).

La presencia de plaguicidas organofosforados en diferentes tipos de alimentos es indiscutible y ha sido demostrada previamente en muestras de frutas y hortalizas (Barberá, 1989). El tomate, objeto de este estudio, es tradicionalmente uno de los cultivos con mayor control químico de plagas.

Teniendo en cuenta la estricta normatividad existente, que limita el contenido de plaguicidas en los alimentos (Tabla 1), se han venido desarrollando tecnologías como la cromatografía de gases para el análisis cualitativo y cuantitativo de este tipo de analitos; ésta representa un método eficaz de separación, identificación y control de estos tóxicos en diferentes matices de estudio (Núñez, 1986, Cabras et al., 1998).

La presente investigación se basa en la determinación de residuos de plaguicidas organofosforados y organoclorados en tomates obtenidos de mercados de cadena de la ciudad de Armenia “Larga vida” contrastados con tomates de la ciudad de Pereira comercializados como “orgánicos”.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Vegetal Frutos de Licopersicon sculentum L. (tomate),

familia Solanaceae, procedentes de mercados de cadena de las ciudades Armenia y Pereira. Para este estudio se seleccionaron dos variedades: la “larga vida” de mercados de cadena en la ciudad de Armenia (Colombia) y consisten en una variedad hibrida de alto consumo. Las muestras de tomates “orgánicos” se obtuvieron de mercados de cadena en la ciudad de Pereira (Colombia). Se obtuvieron 10 kg de tomates en estado de madurez comercial de consumo (madurez intermedia) en cada uno de los cuatro mercados seleccionados.

Caracterización de la materia prima Se realizo un análisis fisicoquímico (peso, pH,

grados brix (ºBx), actividad de agua (aw), % humedad, color) de las muestras.

Reactivos Los estándares de plaguicidas organoclorados y

organofosforados: Sulfotep (ditiopirofosfato de O,O,O′,O′-tetraetilo ácido tiodifosfórico); Forato (ditiofosfato de o,o-dietilo y etiltiometilo); α-BHC, γ-BHC, β-BHC, δ-BHC (isómeros de hexaclorociclohexano); Dimetoato (ditiofosfato de O,O-dimetilo y de metilcarbamoilmetilo); heptacloro (1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metanoindeno); heptacloro epóxido (1,4,5,6,7,8,8a-heptacloro-2,3epoxi-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metano-indeno); Disulfoton (O,O-dietil S-2-etiltioetil fosforoditioato); Aldrin (1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-exo-1,4-endo-5,8-dimetano-naftaleno); Endosulfan I, Endosulfan II, Endosulfan sulfato (isómeros de: 6,7,8,9,10,10-hexacloro-1,5,5a,6,9,9a-hexahidro-6,9-metano-2,4,3-benzodioxa-tiopeno-3-oxido); 4,4`-DDE (diclorodifeniletano); 4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano); 4,4`-DDD (diclorodifenildicloroetano); Endrin (3,4,5,6,9,9,-hexacloro-1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahidro 2,7:3,6-di-metanonaft[2,3-b]oxireno); Endrin aldehído (3,4,5,6,9,9-hexachloro-1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahydro-2,7:3,6-dimethanonaphth[2,3b]-oxirene, aldehído) fueron adquiridos a Supelco (Bogota, Colombia).

Tolueno, hexano y diclorometano grado HPLC (Fisher Scientific), acetato de etilo grado analítico (Carlo Erba reagents), florisil (Sigma-Aldrich), sulfato de sódio anhidro (Carlo Erba reagents).


Preparación de las muestras Procedimiento de extracción: El proceso de

extracción utilizado es una modificación del descrito por Murcia (2001). La homogenización de las muestras se realizó en Ultraturrax™ digital modelo IKA T25 y vortex IKA JK MS1. La evaporación del solvente se llevó a cabo en Rotavapor Heidolph Laborota 4003.


El fruto se separó en dos matrices: “piel” (epicarpo) y “pulpa” (mesocarpo, endocarpo, placenta y semillas) realizando dos cortes transversales con cuchillo convencional y posterior pelado del fruto; el procedimiento completo se muestra en el esquema siguiente: Figura 1: Procedimiento de extracción e identificación de plaguicidas en tomate.

Proceso de Limpieza (Clean up): Teniendo en

cuenta las características de la matriz y de los analitos a determinar, la limpieza para este tipo de compuestos organoclorados y organofosforados, se realizó mediante una columna empacada con sulfato de sodio anhidro para reducir el porcentaje de humedad y florisil para eliminar interferentes de alto peso

molecular que contienen las matrices en estudio, como son clorofilas, pigmentos, ceras, proteínas y carotenos, entre otros.

Cromatografía de Gases-µECD La determinación de los plaguicidas se realizó

en un cromatógrafo de gases HP 6890 N dotado con un detector de microcaptura de electrones µ-ECD, un inyector split/splitless, las temperaturas del inyector y del detector permanecieron a 250 y 300 °C respectivamente, columna Supelco Equity-5 (0,25 mm I.D x 0,25 µm film x 30 m) 95% polidimetilsiloxano, 5% polidifenilsiloxano. Rampa de temperatura: 110 ºC (2 min) hasta 163 ºC (1 min) a 7 ºC/min, después a 1 ºC/min, hasta 180 ºC (1 min), sube a 5 ºC/min, hasta 209 ºC (1 min), luego hasta 225 ºC(0 min) a 2 ºC/min. Y por último sube a 7 ºC/min, hasta 280 ºC (4 min), como gas de arrastre (fase móvil) se utilizó nitrógeno grado UAP con un flujo de 1,7 mL/min.

Para la curva de calibración se utilizó el método del estándar externo, utilizando soluciones de trabajo de 1,5 partes por billón (ppb); 15; 25,5; 35,5 y 45 ppb. La sensibilidad se determinó evaluando el límite de detección (LD) y de cuantificación (LC) para cada plaguicida (Tabla 1).

Estadísticas Se hicieron ensayos por triplicado para cada

muestra. Se realizó un análisis de varianza utilizando el programa Statgraphics plus versión 5.1 estudiando cada uno de los plaguicidas (variables dependientes), respecto a las variables independientes (Matriz trabajada y Tipo de cultivo). Se realizó un diseño factorial con dos factores 2 * 2 con un nivel de significación de 0,05. La prueba de comparación utilizada fue el método de la mínima diferencia significativa (LSD).

Factores: A: Matriz trabajada: 1. Piel, 2. Pulpa. B: Tipo de cultivo: 1. Cultivo orgánico (Pereira), 2. Cultivo larga vida (Armenia). Modelo matemático Yijk = µ + ti + βj + (tβ)ij + Eijk (Ec. 1)



Tabla1: Resultados de los LD y LC determinados por cromatografía de gases y límites legales de acuerdo a la normativa establecida por el Codex Alimentarius (1996) para tomate.

Plaguicida Límites legales Límites Analíticos

(mg/kg) LD (mg/kg) LC (mg/kg)

Aldrin 0,01 0,00072 0,00079

α-BHC 0,01 0,00079 0,00081 β-BHC - 0,00010 0,00011 δ-BHC - 0,00063 0,00063 Dimetoato - 0,00248 0,00264

Disulfoton 0,02 0,00048 0,00050 4,4`-DDD - 0,00058 0,00059 4,4`-DDE - 0,00082 0,00084 4,4`-DDT 0,05 0,00085 0,00022 Endosulfan I - 0,00127 0,00128 Endosulfan II - 0,00067 0,00067 Endosulfan sulfato - 0,00042 0,0005 Endrin - 0,00103 0,00104 Endrin aldehido - 0,00068 0,00068 Forato 0,05 0,00070 0,00091

γ-BHC - 0,00113 0,00116

Heptacloro 0,01 2,00000 0,00203 Heptacloro epoxido - 0,00093 0,00094

Sulfotep 0,20 0,00773 0,00809

Tabla 2: Resultados de los análisis por cromatografía de gases de muestras de tomates “Larga Vida” (valores en ng/mL expresados como Media ± SEM/SD)

Matrices Tomates “Larga Vida” Piel Pulpa

Aldrin 4,9230 ± 0,0010 2,3560 ± 0,0030 α-BHC 0,6230 ± 0,0002 0,2280 ± 0,0002 δ-BHC 0,5570 ± 0,0001 - Disulfoton 3,0610 ± 0,0010 2,3140 ± 0,0004 Forato 20,040 ± 0,0005 18,9200 ± 0,0040 γ-BHC 1,0030 ± 0,0002 - Heptacloro 1,1350 ± 0,0009 0,8700 ± 0,0030 Sulfotep 3,1850 ± 0,0010 5,2640 ± 0,0170

Tabla 3: Resultados de los análisis de cromatografía de gases de muestras de tomates “Orgánicos” (valores en ng/mL Media ± SEM/SD).

Matrices Tomates “Orgánicos” Piel Pulpa

Aldrin 3,7450 ± 0,0005 3,1580 ± 0,0003 α-BHC 0,6950 ± 0,0003 0,3780 ± 0,0009 δ-BHC 0,2290 ± 0,0004 - Disulfoton 3,5710 ± 0,0006 3,1780 ± 0,0008 Forato 33,9300 ± 0,0010 33,7700 ± 0,006 γ-BHC 0,3390 ± 0,0001 0,3000 ± 0,0002 Heptacloro 3,3360 ± 0,0005 3,3130 ± 0,0003 Sulfotep 38,1700 ± 0,0150 43,510 ± 0,0240


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El método de extracción líquido-líquido por lotes resultó ser una técnica muy eficiente para plaguicidas en alimentos, siendo más favorecida en matrices como pieles y cuenta con el aval de la EPA (EPA / USEPA, 1970) y la AOAC. (AOAC, 1990, 1997).

Comparación de de la presencia de plaguicidas en tomates “larga vida” vs “orgánicos”

Al estudiar la residualidad de plaguicidas en tomate, se esperaban altas concentraciones en los comercializados como “Larga Vida”. Inesperadamente, se encontraron altas concentraciones también en el fruto “orgánico” donde se esperaba ausencia de residuos debido a que es un alimento certificado, por ello se evaluaron las diferentes matrices en los dos tipos de cultivos.

Los tomates “orgánicos” son productos comercializados en mercados de cadena a un alto costo donde el consumidor espera obtener un vegetal limpio y libre de plaguicidas y a cambio de ello está consumiendo altas concentraciones de fitosanitarios que van a ser retenidos fácilmente en todo el tejido adiposo gracias a su liposolubilidad, pasando por alto y violando todo tipo de legislación y normatividad.

Comparación de la presencia de plaguicidas en piel y pulpa

Al evaluar las muestras de piel y pulpa de los dos tipos de cultivos, se observó que para la mayoría de los casos existe más residualidad en la piel, por lo que se realizó la comparación entre las matrices (Piel) de los dos tipos de cultivos (Fig. 2).

El análisis estadístico determinó una diferencia significativa en la concentración de Aldrin (p=0,0323; para el análisis de las matrices donde la mayor concentración se encontró en la piel). Con respecto al tipo de cultivo, se halló diferencia significativa en Sulfotep (p= 0,0350; mayor concentración en cultivo orgánico) y Aldrin (p=0,009; mayor concentración en cultivo Larga vida), en todos los casos para un nivel de significancia de 0,05.

En piel los plaguicidas Sulfotep y Forato (compuestos organofosforados) son los más representativos, de igual manera se encontró la presencia de plaguicidas organoclorados de alta toxicidad prohibidos por la legislación actualmente vigente, como el Heptacloro y Aldrin, que generan

grandes desequilibrios ecológicos bioacumulandose y biomagnificandose. Figura 2: Comparación de plaguicidas encontrados en la piel de tomates Orgánicos y Larga Vida obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Armenia y Pereira (ELL extracción líquido-líquido).

En las Figs. 3 y 4 se puede observar que para

cada tipo de cultivo la concentración de plaguicidas no difiere mucho entre piel y pulpa, pero a excepción del Sulfotep están todos en mayor concentración en la piel, debido a la poca disponibilidad de agua en ella, lo que evita las emulsiones formadas por diferencias de polaridades entre el agua del fruto y los solventes orgánicos gracias a la agitación donde se pierde solvente y algunos analitos. Además de ello, la piel funciona como un escudo de protección que retiene los fitosanitarios antes de llegar a la pulpa del fruto; a pesar de ello se notan concentraciones muy altas de Forato en ambos cultivos, evidenciando que este plaguicida es aplicado de forma indiscriminada en los tipos de cultivos estudiados.

Comparando las pieles evaluadas entre los dos cultivos, del cultivo orgánico del cual esperaríamos los mejores resultados (ausencia de plaguicidas), según el “Reglamento de Productos Agropecuarios Ecológicos” del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de la República de Colombia (2006), se obtuvieron concentraciones por encima de 0,035 ppm indicando una alta residualidad de plaguicidas organofosforados.

Se detectaron más residuos de plaguicidas, un total de 8, entre los cuales se hallan: Sulfotep, Forato, alfa-BHC, gamma-BHC, Heptacloro, Disulfoton, sigma-BHC y Aldrin. De estos, el Aldrin y el Heptacloro son plaguicidas organoclorados prohibidos en la Legislación (ICA, 1987; 1988) y Presidencia de la República (1988), teniendo en cuenta que todos son de categorías toxicológicas I y II.

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.8 (3) 2009 | 169


Figura 3: Tomates Larga Vida obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Armenia.

Figura 4: Tomates Orgánicos obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Pereira.

En los tomates Larga Vida la mayor concentración fue de Forato con 0,02 ppm junto con el Sulfotep y Aldrin por encima de 0,0045 ppm, estas son concentraciones altas teniendo en cuenta que son plaguicidas de alta toxicidad y son muchos los riesgos que se corren al ingerir este tipo de compuestos.

CONCLUSIONES

Se identificaron y cuantificaron un total de 8 plaguicidas entre organoclorados y organofosforados, unos a nivel de trazas y otros con altas concentraciones tanto en piel como en pulpa, tanto para los tomates Larga Vida, como para los “Orgánicos”.

El tomate, es un alimento básico consumido por la población en la dieta alimentaría diaria. Nuestros resultados no solo demuestran la presencia de altas concentraciones de plaguicidas permitidos como Forato, y Sulfotep (indicando que los cultivos se están fumigando de manera desmesurada), sino también la

presencia cuantificable de plaguicidas ilegales como Aldrin y Heptacloro, lo que genera un riesgo toxicológico real en la población tanto adulta como infantil.

Más alarmante es la elevada cantidad de plaguicidas en las variedades vendidas como “orgánicas” donde el Forato y el Sulfotep son los más representativos, con concentraciones por encima de 0,035 y 0,03 ppm y algunos prohibidos como Aldrin y Heptacloro. Esto constituye una práctica ilegal, pasando por alto cualquier tipo de normativa y engañando irresponsablemente a la población en general.

Ante estos resultados se impone la gran urgencia de implementar más programas de vigilancia y monitoreo de residuos de plaguicidas en alimentos en Colombia.

AGRADECIMIENTOS

Al Laboratorio Plaguicidas y Salud, la Química Diana Blach Vargas y al Laboratorio de Investigaciones en Postcosecha (LIP).

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Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum leaf essential oil

[Tamizaje fitoquímico y propiedad anticonvulsivante del aceite esencial de hojas de Ocimum basilicum] Juliana S OLIVEIRAa,1, Lívia A. PORTOa,1, Charles S. ESTEVAMa, Rosana S. SIQUEIRAa, Péricles B. ALVESb, Edenilson S.

NICULAUb, Arie F. BLANKc, Reinaldo N. ALMEIDAd, Murilo MARCHIOROa, Lucindo J. QUINTANS-JÚNIORa* aDepartamento de Fisiologia, bDepartamento de Química, cDepartamento de Agronomia. Universidade Federal de Sergipe.

Campus Universitário “Prof. Aloísio de Campos” CEP: 49100-000, São Cristóvão, SE, Brazil. dLaboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB), Cx. Postal 5009, CEP: 58051-970, Paraíba, PB,

Brazil. 1These authors contributed equally to the present work.

Abstract

Ocimum basilicum (Lamiaceae) and other species of the same genus are used as medicines for the treatment of central nervous system (CNS) diseases. In this report, we have investigated the possible CNS depressant and anticonvulsant effects of Ocimum basilicum (access “Maria Bonita”) leaf essential oil (EO) in different experimental models. GC-MS and GC-FID analysis of the essential oil resulted in the identification of 7 compounds constituting 98.8% of the total oil. 1.8-cineole, linalool, and geraniol were the principal components, comprising 92.9% of the oil. EO, at all doses, showed depressant CNS activity as revealed in the general pharmacological screening: decrease of spontaneous activity, ptosis, ataxia, and sedation. Additionally, all doses of EO induced a significant increase of sleeping time (p < 0.05) and decrease in the latency to sleep (p<0.01). EO also increased the latency for development of convulsions in pentylenetetrazol (PTZ) and picrotoxin tests (p < 0.05). For PTZ, the effects of EO were reversed by flumazenil. EO did not interfere with the convulsions induced by strychnine (p>0.05). Our data suggests that EO possesses CNS depressant and anticonvulsant properties which could be mediated by an interaction with central GABAergic receptors.

Keywords: Ocimum basilicum; CNS depressant; Anticonvulsant; Pentylenetetrazole; Picrotoxin.

Resumen

Ocimum basilicum (Lamiaceae) y otras especies del mismo género son usadas como medicamentos en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC). En este reporte, hemos investigado los posibles efectos anticonvulsivantes y depresivos del SNC del aceite esencial (EO) de las hojas de Ocimum basilicum (conocida como “Maria Bonita”) en diferentes modelos experimentales. Los análisis por GC-MS y GC-FID del aceite esencial permitieron la identificación de 7 compuestos constituyendo el 98.8% del aceite total. Los principales componentes fueron 1.8-cineol, linalol y geraniol que comprendieron el 92.9% del aceite. EO, a todas las dosis, mostró actividad depresora del SNC revelado en el tamizaje farmacológico general: decrecimiento de la actividad espontánea, ptosis, ataxia y sedación. Además, todas las dosis de EO indujeron un incremento significativo del tiempo de sueño (p<0.05) y disminuyeron la latencia de sueño (p<0.01). EO también incrementó la latencia para el desarrollo de convulsiones en las pruebas de pentilenetetrazol (PTZ) y picrotoxina (p<0.05). Para PTZ, los efectos de EO fueron revertidos por flumazenil. EO no interfirió con las convulsiones inducidas por estricnina (p>0.05). Nuestros datos sugieren que EO posee propiedades anticonvulsivantes y depresoras del SNC lo que podría estar mediado por una interacción con los receptores GABAérgicos centrales.

Palabras Clave: Ocimum basilicum; Depresores del SNC; Anticonvulsivante; Pentilenetetrazol; Picrotoxina.

Recibido | Received: February 3, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: April 25, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 29, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was supported by National Council of Technological and Scientific Development (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Brazil) and the Research Supporting Foundation of State of Sergipe (Fundação de Amparo à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe/FAPITEC-SE). Juliana Santos de Oliveira and Lívia Amorim Porto have scholarships from CNPq-UFS and Murilo Marchioro has a research scholarship from CNPq. This article must be cited as: Juliana S Oliveira, Lívia A. Porto, Charles S. Estevam, Rosana S. Siqueira, Péricles B. Alves, Edenilson S. Niculau, Arie F. Blank, Reinaldo N. Almeida, Murilo Marchioro, Lucindo J. Quintans-Júnior. 2009. Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum leaf essential oil. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):195 – 202. {EPub April 29, 2009}.

*Contactos | Contacts: L.J. Quintans-Júnior, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, 49.000-000, São Cristóvão-SE, Brazil, Tel/Fax: 55-79-2105-6645; +55-79-2105-6474; E-mail address: [email protected], [email protected]








Oliveira et al. Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum


INTRODUCTION

Epilepsy continues to be a neurological disorder awaiting safer drugs with improved anticonvulsant and anti-epileptogenic effectiveness, as currently available drugs fail to provide adequate control of epileptic seizures in about one-third of patients and do not prevent progressive epileptogenic changes (Jeub et al., 2002). Traditional systems of medicine are popular in developing countries, and up to 80% of the population relies on traditional medicines or folk remedies for primary health care needs (Akerele, 1988). A great number of scientists and organizations turn their attention to traditional therapies in order to find and conserve important resources (Akerele, 1990). However, medicinal plants have been an important source of new drugs with biological activity (Almeida et al., 2005; Quintans-Júnior et al., 2008).

Several Ocimum species (Lamiaceae) are used to treat central nervous system (CNS) disorders in various parts of the world and its antidepressive activity is frequently reported (Corrêa, 1984). Leaves from Ocimum species release a pleasing odor when squashed between the fingers and could be used as a culinary condiment (Mäkinen and Paakkonen, 1999) and for insect control (Holm, 1999). Brazilian Tropical Atlantic Forest inhabitants use a decoction of Ocimum gratissimum L. roots as a sedative for children (Di Stasi et al., 2002). Sedative and anticonvulsant activities were experimentally detected in Ocimum tenuiflorum (Ocimum sanctum) (Pérez de Alejo et al., 1996).

The genus Ocimum is included in the Lamiaceae family and is distributed worldwide from the tropical and subtropical regions of Asia, Africa, and Central and South America (Suppakul, et al., 2003). This genus is characterized by a great variability in its morphology and chemotypes (Lawrence, 1988). The ease of its cross-pollination contributes to a myriad of subspecies, varieties, and forms (Guenther, 1975). The reason for this complexity stems from the fact that botanists have assigned several designations to the same varieties and, in some instances, have confused some varieties with forms of other species. Different chemotypes have been reported for Ocimum basilicum (Grayer et al., 1996), Ocimum canum, and Ocimum gratissimum (Martins et al., 1999). Two morphological varieties of Ocimum gratissimum (gratissimum var. and macrophyllum var.) were found to have their volatile oil constituents based into six groups, which were aggregated into three chemotypes (eugenol,

thymol, and geraniol) according to genetic markers and volatile oil constituents (Vieira et al., 2001). According to Mazutti et al. (2006), the volatile oil constituents of O. basilicum were: δ-cadinol (10.2%), estragole (22.6%), and linalool (47.3%).

The aim of this work was to perform phytochemical screening of the essential oil of Ocimum basilicum (access “Maria Bonita”) and to investigate its possible anticonvulsant effects in mice.


Animals Male Swiss mice (30-35 g), with 2-3 months of

age, were used throughout this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 25±2 oC on a 12 h light/dark cycle (lights on 06:00-18:00) with free access to food (Purina) and water. They were used in groups of 10 animals each. All experiments were carried out between 9.00 h and 16.00 h in a quiet room. Experimental protocols and procedures were approved by the Universidade Federal de Sergipe Animal Care and Use Committee (CEPA/UFS Nº010/07).

Plant material and essential oil (EO) extraction Leaves were collected from the cultivation of the

O. basilicum access “Maria Bonita” obtained at the Research Station "Campus Rural da UFS" of the Universidade Federal de Sergipe, Brazil. O. basilicum access “Maria Bonita” was derived from the accession PI 197442 of the Germplasm Bank “North Central Regional PI Station”, USA. It's a basil cultivar with a rounded canopy, rose petals and purple sepals and is indicated for brazilian northeast region (Blank et al., 2008). The leaves of O. basilicum were dried in an oven with air renewal and circulation (model MA-037/18) at 40 ºC until complete dehydration has been achieved. The essential oil was obtained by hydrodistillation in a Clevenger-type apparatus using 100 g of dried leaves. The oil obtained was dried over anhydrous sodium sulphate, producing yields of 2.34% (v/w).

Gas Chromatography – Mass Spectrometry Oil sample analysis was performed on a Shimadzu

QP5050A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) system comprising a AOC -20i autosampler and gas chromatograph interfaced to a mass spectrometer (GC-MS) instrument employing the following conditions: column J&W Scientific DB-5MS fused silica capillary



column (30 cm x 0.25 mm i.d, 0.25 μm coating thick-ness, composed of 5% phenylmethylpolysiloxane), operating in electron impact mode at 70 eV; helium (99.99%) was used as carrier gas at a constant flow of 1.2 mL/min and an injection volume of 0.5 μL was employed (split ratio of 1:83) injector temperature 250 °C; ion-source temperature 280 °C. The oven tempe-rature was programmed from 50 °C (isothermal for 2 min), with an increase of 4 °C/min., to 200 °C, then 10 °C/min to 300 °C, ending with a 10 min iso-thermal at 300 °C. Mass spectra were taken at 70 eV; a scan interval of 0.5 s and fragments from 40 to 550 Da.

Gas – Chromatography (GC-FID) Quantitative analysis of the chemical constituents

was performed by flame ionization gas chromato-graphy (FID), using a Shimadzu GC-17A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) equipment, under the following operational conditions: capillary ZB-5MS column (5% dimethylpolysiloxane) fused silica capillary column (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 μm coating thickness) from Phenomenex (Torrance, CA, USA), under the same conditions GC-MS. Quanti-fication of each constituent was estimated by area normalization (%). Compounds concentrations were calculated from the GC peak areas and they were arranged in order of GC elution.

Identification of essential oil constituents Identification of individual components of the

essential oil was performed by computerized matching of the acquired mass spectra with those stored in NIST21 and NIST107 mass spectral library of the GC-MS data system. Retention indices (RI) for all compounds were determined according to the Van den Dool and Kratz (1963) for each constituent as previously described (Adams, 2007).

Drugs Diazepam (DZP), Pentylenetetrazole (PTZ),

picrotoxin (PIC), phenytoin (PHE), Strychnine (STR), polyoxyethylene-sorbitan monolated (Tween 80) and cremophor was purchased from Sigma (USA), Diazepam (DZP), Flumazenil (FLU) from Roche (Brazil) and sodium thiopental from Cristália (Brasil). Agents were injected intraperitoneally (ip) at a dose volume of 0.1 mL/10 g.

Behavioural effects The behavioural screening of the mice was per-

formed following the parameters described in Almeida

et al. (1999) and animals were observed at 0.5, 1, and 2 h after administration of EO (100, 200 and 400 mg/kg, ip).

Thiopental-induced hypnosis Sodium thiopental at a hypnotic dose of 50 mg/kg

i.p. was injected into four groups (n= 8) of mice 30 min after pretreatment with saline/tween-80 (vehicle), EO (10, 50, 100 and 200 mg/kg, ip) and DZP (3 mg/kg, ip). The latency (the interval between the injection of sodium thiopental and the loss of the righting reflex) and the duration of sleeping (the interval between loss and recovery of the righting reflex) was recorded (Elisabetsky et al., 1995).

PTZ- and PIC-induced convulsion A modified method from Vellucci and Webster

(1984) was used to assess the anticonvulsant effect of the EO. Mice were kept individually in transparent mice cages (25 cm × 15cm × 15cm) for 30 min to acclimatize to their new environment before the beggining of the experiments. Seizures were induced with PTZ (60 mg/kg, ip) or PIC (8 mg/kg, ip) and the animals were observed for a period of 15 or 20 min., respectively (Oliveira et al., 2001; Ngo Bum et al., 2001). The onset of tonic-clonic convulsion and the number of animals convulsing or not convulsing within the observation period were recorded. Experiments were repeated following the pretreatment of animals with either (EO 100, 200 or 400 mg/kg), DZP (3 mg/kg, ip) or control vehicle thirty minutes prior to the administration of one of the convulsant agents. The ability of the EO to prevent or delay the onset of tonic and tonic-clonic convulsions was taken as an indication of anticonvulsant activity.

STR-induced convulsion This method has been described previously

(Lehmann et al., 1988). In brief, strychnine (STR) seizures followed by death were induced in male mice by the ip injection of 3 mg/kg of the STR nitrate. The treatment of the EO was similar to those used in the PTZ- and PIC-tests. A protective effect of the EO (100, 200 or 400 mg/kg) given (ip) 0.5 h prior to STR (3 mg/kg, ip) was recorded and compared to the one of 30 mg/kg PHE and with the control group (vehicle). The number of animals, which survived more than 10 min served as criterion of protection. The time to onset of death was recorded in non-protected mice.



Thiopental-induced hypnosis Statistical analysis One way ANOVA revealed differences between

the experimental groups for the onset of sleeping (p<0.001) and sleeping duration (p<0.001). EO, at the doses of 10, 50, 100, or 200 mg/kg consistently decreased the latency for the onset of sleeping (p<0.01; p<0.001) (Fig. 1A) and, at the same doses, increased the sleeping time induced by sodium thiopental (10, 50, 100, and 200 mg/kg; p<0.001) (Fig. 1B). The reference drug, diazepam, produced similar results for the onset of sleeping (p<0.001) and sleeping duration (p<0.001).

The data on the thiopental-induced hypnosis and on the convulsion experiments (PTZ, PIC and STR) were expressed as the mean ± S.EM. The differences of the means among the groups were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Tukey multiple comparison test (thiopental-induced hypnosis) or the Dunnett’s t test (for the convulsion experiments). The incidence (%) of clonic or tonic-clonic seizures as well as the mortality were evaluated by the Fisher`s Exact Test. Differences were considered to be statistically significant when p<0.05.

RESULTS Table 1. Chemical composition of the essential oil of Ocimum

basilicum Phytochemical screening

TR (min)

Compound (%) RRIa RRIb

8.458 sabinene 0.89 974 975

10.358 1,8-Cineole 7.90 1030 1031

12.908 linalool 72.14 1099 1096

16.383 unknown 0.68 1192 -

18.382 geraniol 12.95 1248 1252

22.900 linalool isobutanoate 2.30 1375 1375

24.750 α- trans- bergamotene 1.21 1430 1434

31.358 epi-α-cadinol 0.80 1638 1640

Total 98.87

GC-MS and GC-FID analysis of the essential oil resulted in the identification of 7 compounds, constituting 98.8% of the total oil. 1,8-cineole, linalool, and geraniol were the principal components, comprising 92.9% of the oil (Table 1). This result is similarl to Lee et al. (2005).

Behavioral effects Animals treated with EO, at all doses, showed signs

of CNS depressant activity. They decreased in spontaneous activity and to the response to touch; they also showed palpebral ptosis, ataxia, and sedation. These effects were observed from thirty minutes to two hours after the treatment. RT Retention time; RRI relative retention indices

aExperimental (Van Den Dool and Kratz 1963) bAs compared with those reported by Adams (2007)

Figure 1. Effect of EO on thiopental-induced hypnosis in mice. The parameters evaluated were the onset of sleeping (A) and duration of sleeping (B).

A B

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

**

*** *** *** ***

Vehicle 50 100 200 400 DZP

EO (mg/kg)

Ons

et o

f sle

epin

g(m

in)

3 mg/kg

0

50

100

150

****** *** ***

***

Dur

atio

n of

sle

epin

g(m

in)

Vehicle 50 100 200 400 DZP

EO (mg/kg) 3 mg/kg

Values are mean ± SEM of 8 mice, ** p < 0.01, *** p < 0.001, as compared to vehicle (control), one-way ANOVA followed by Tukey’s test.



Effect of EO on PTZ- and PIC-induced convulsion One way ANOVA revealed differences between

the experimental groups for the onset of convulsions induced by pentilenotetrazole (p<0.0001) (Table 2) and picrotoxin (p<0.0001) (Table 3). Diazepam (p<0.01) and EO, at the doses of 200 and 400 mg/kg (p<0.01), increased the latencies for the onset of the tonic-clonic convulsions induced by PTZ. The per-centage of animals that convulsed was decreased by diazepam (p< 0.01) and by EO at the doses of 200 (p<0.05) and 400 mg/kg (p<0.01). The number of animal deaths was also decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the three doses tested (100 mg/kg and 200 mg/kg, p<0.05; 400 mg/kg, p<0.01). The effects of diazepam and EO (200 and 400 mg/kg), for the three parameters, were reversed by flumazenil 10 mg/kg (Table 2).

Diazepam (p<0.01) and EO, at the doses of 200 (p<0.01) and 400 mg/kg (p<0.01) increased the latencies for the onset of the tonic-clonic convulsions induced by PIC. The percentage of animals that convulsed was decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the doses of 200 (p< 0.05) and 400 mg/kg (p<0.01). And finally, the number of animal deaths was also decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the doses of 200 and 400 mg/kg (p<0.01).

Effect of EO on STR-induced convulsion One way ANOVA revealed differences between

the experimental groups for the onset of convulsions induced by strychnine (p<0.0001). Phenytoin increased the latency for the onset of convulsions (p<0.01), and decreased the percentage of animals that convulsed (p < 0.01) and the number of animal deaths (p<0.05). These parameters were not changed by EO in any of the doses tested (p>0.05) (Table 4).

Table 2. Effect of EO on convulsions induced by PTZ.

Treatment Dose (mg/kg)

Latency (s)a

% Convulsion

% Death

Control - 212.0 ± 41.5 100 100

DZP 3 835.1 ± 12.9c 10e 0e

EO 100 369.0 ± 209.3 90 70d

EO 200 421.2 ± 132.8c 70d 50d

EO 400 459.1 ± 149.7b 60e 40e

DZP + FLU 3 + 10 341.3 ± 112.8 100 90

EO + FLU 200 + 10 310.5 ± 87.9 100 90

EO + FLU 400 + 10 285.4 ± 94.1 100 100 n = 10

a Values represent mean ± S.E.M. b P < 0.05 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control d P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. e P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.

Table 3. Effect of EO on the convulsions induced by PIC


Latency (s)a

% Convulsion

% Death

Control - 534.0 ± 121.3 100 90

DZP 3 1200.0 ± 0.0c 0e 0e

EO 100 454.0 ± 94.2 100 90

EO 200 781.2 ± 93.4b 70d 30e

EO 400 1045.3 ± 109.6c 30e 20e

n = 10

a Values represent mean ± S.E.M. b P < 0.05 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control d P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. e P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.



Table 4. Effect of EO on the convulsions induced by STR


Latency (s)a

% Convulsion

% Death

Control - 121.3 ± 12.6 100 100

PHE 30 532.1 ± 23.7b 20d 60c

EO 100 164.2 ± 41.4 100 100

EO 200 203.4 ± 82.9 100 100

EO 400 189.3 ± 78.2 100 100

n = 10

a Values represent mean ± S.E.M. b P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. d P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.

DISCUSSION

Major volatiles detected in this study (Table 1) were different with those of previously published studies in which volatile components were isolated by various organic solvent extractions (Lee et al., 2005; Zhang et al., 2009). However, in our study of essential oil produced from O. basilicum, access “Maria Bonita”, linalool (72.14% of total quantified volatile compounds), geraniol (12.95%), and 1,8-cineole (7.9%) were also determined as major constituents (Hasegawa et al., 1997). This result showed that essential oil produced from O. basilicum, access “Maria Bonita”, is very rich in linalool.

In the present study, the CNS depressant and anticonvulsant activities of Ocimum basilicum leaf essential oil (EO) were investigated in different animal models. Additionally, the chemical composition of the oil was evaluated. Our results demonstrate that the acute administration of EO (200 and 400 mg/kg, i.p.) increases the hypnosis induced by sodium thiopental and prevents the convulsions induced by -PTZ and -PIC, but not by STR. 1,8-cineole, linalool, and geraniol were the main components of the essential oil.

Mice treated with EO (100, 200, and 400 mg/kg, i.p.) presented behavioral alterations, such as: reduction of spontaneous activity, decrease of response to touch, palpebral ptosis, ataxia, and sedation. These behaviors suggest that the effects of EO are similar to those of known CNS depressant natural products (De Sousa et al., 2006; 2007). The

general depressant activity of EO was confirmed by the decrease in the latency to sleep and its tendency to increase thiopental-induced sleeping (De Sousa et al., 2006).

The PTZ test represents a valid model for human generalized myoclonic convulsions (Malawska, 2003). PTZ induces convulsions in rodents by blocking the Cl- channel of GABAA receptors. It has been reported that GABAergic neurotransmission plays an important role in stress, anxiety (Zwanzger and Rupprecht, 2005), pain (Rode et al., 2005), and epilepsy (Perucca, 2005). In fact, drugs that inhibit convulsions or increase the latency of PTZ-induced convulsions are suggested as having anticonvulsant activity (Haruna, 2000). Benzodiazepines and many barbiturates potentiate the inhibitory action of GABAA receptors, reducing neuronal excitability and increasing the threshold for convulsions (Löscher and Schmidt, 2006).

According to Nicoll (2001), picrotoxin, a GABAA-receptor antagonist, produces seizures by blocking the chloride-ion channels linked to GABAA-receptors, thus preventing the entry of chloride ions into the brain and, consequently, inhibitory transmission in the brain (Löscher and Schmidt, 1988). The findings of the present study, therefore, suggest that EO might have inhibited and/or attenuated the PIC-induced convulsions of mice by interfering with GABAergic neurotransmission. In addition, the antagonism of PTZ and its reversion by flumazenil (Table 2), an agonist of GABAA receptors, further supports the hypothesis of an interaction of EO with these receptors.

Strychnine causes convulsions by antagonizing the activity of glycine receptors and increasing postsynaptic excitability and ongoing activity in the brain stem and spinal cord (Webb and Lynch, 2007). Since EO did not prevent the convulsions induced by strychnine, an interaction of the extract with glycine receptors is unlikely.

According to Quintans-Júnior et al. (2005), linalool, the major monoterpene found in Ocimum basilicum leaf essential oil (Table 1), possesses anticonvulsant properties and Elisabetsky et al. (1995) showed sedative effects. However, Re et al. (2000) showed that linalool had inhibitory properties in acetylcholine (ACh) release and induces a reduction of the ACh-evoked release. Nevertheless, autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE), characterized by partial seizures that occur predominantly during sleep, has been



associated in some families with mutations involving either the α or β subunit in α4β2 nicotinic acetylcholine receptors (Meldrum and Rogawski, 2007). Carbamazepine is a noncompetitive inhibitor of nicotinic receptors that blocks acetylcholine-evoked currents at concentrations in the therapeutic range (Picard et al., 1999). On the other hand, linalool is a competitive antagonist of NMDA receptors (Elisabetsky et al., 1999; Silva Brum et al., 2001) and blockade of the NMDA subtype of glutamate receptor has been reported to contribute to the antiepileptic effects of felbamate (Deckers et al., 2003).

CONCLUSION

All together, the data presented in this study suggests that EO extracted from the leaves of Ocimum basilicum, access “Maria Bonita”, possesses CNS depressant properties and anticonvulsant effects in mice. However, the precise mechanisms involved in these properties are not clear, although our evidence points to an involvement of EO with GABAergic neurotransmission. Nevertheless, further studies will be required for elucidation of the mechanisms involved. Patch-clamping experiments would be highly recommendable.

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Efecto de la administración oral continuada de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas en ratas

[Effect of the continuing oral administration of Boldoa purpurascens Cav. on different physiological variables in rats]

Maykel PÉREZ MACHÍN1*, María BOFFIL CÁRDENAS2, Dulce M. GONZÁLEZ MOSQUERA3, Emilo E. MONTEAGUDO JIMÉNEZ2, Rayza MÉNDEZ TRIANA1, Luis E. DÍAS COSTA2, Freiman BLANCO MACHADO2, Nieve IGLESIAS

RODRÍGUEZ1, Belkis VERDECIA MACHADO2

1Instituto Superior de Ciencias Médicas “Dr. Serafín Ruiz de Zárate Ruiz”. Vicerrectorado de Investigaciones. Carretera a Acueducto y Circunvalación. Santa Clara. Cuba

2Unidad de Toxicología Experimental. Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara, Cuba. 3Departamento de Farmacia. Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas. Santa Clara, Cuba.

Abstract

A study was conducted to verify the diuretic effect of the aqueous extract of Boldoa purpurascens Cav. And evaluate the different physiological variables upon continued implementation (14 days). 5 rats were used S / D to check the diuretic effect of the raw material and 40 rats in the same line for the continuous dose evaluation. There was a great diuretic activity of the plant at a dose of 400 mg / kg. During clinical evaluations no abnormalities were observed in the behavior of the animals studied. There were statistical differences in the values of hemoglobin, hematocrit, glucose, sodium and potassium, being highly significant in the three last parameters. The administration of the plant presents diuretic effect to the dose studied, its continued administration decreases significantly Hb values and hematocrit, affecting mostly potassium homeostasis and decreases the glucose at 14 days.

Keywords: Boldoa purpurascens; Diuretics; Herbal medicine; Sprague Dawley rats.

Resumen

Se realizó un estudio para comprobar el efecto diurético del extracto acuoso de Boldoa purpurascens Cav. y evaluar las diferentes variables fisiológicas tras su aplicación continuada (14 días). Se utilizaron 5 ratas S/D para comprobar el efecto diurético de la materia prima y 40 ratas de la misma línea para la evaluación a dosis continuada. Se observó una gran actividad diurética de la planta a la dosis de 400 mg/Kg. Durante las evaluaciones clínicas no se evidenciaron anormalidades en el comportamiento de los animales estudiados. Se encontraron diferencias estadísticas en los valores de hemoglobina, hematocrito, glicemia, sodio y potasio, siendo muy altamente significativos los tres últimos parámetros. La administración de la planta presenta efecto diurético a la dosis estudiada, su administración continuada disminuye significativamente los valores de Hb y Hto, afecta fundamentalmente la homeostasis del potasio y disminuye la glicemia a los 14 días.

Palabras Clave: Boldoa purpurascens; Diuréticos; Medicina herbolaria, Ratas Sprague Dawley.

Recibido | Received: October 22, 2008. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: April 25, 2009. Publicado en Línea | Published Online: May 4, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was supported by Cuban Ministery of Public Health. This article must be cited as: Maykel Pérez Machín, María Boffil Cárdenas, Dulce M. González Mosquera, Emilo E. Monteagudo Jiménez, Rayza Méndez Triana, Luis E. Días Costa, Freiman Blanco Machado, Nieve Iglesias Rodríguez, Belkis VerdecIa Machado. 2009. Efecto de la administración oral continuada de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas en ratas. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):203 – 210. {EPub May 4, 2009}.

*Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]







Pérez Machín et al. Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas en ratas

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, a pesar de los nuevos fármacos disponibles, el uso de los diuréticos todavía representa una excelente alternativa de tratamiento anti-hipertensivo en diversos grupos de pacientes y constituyen una de las clases más valiosas de medicamentos a elegir como terapia inicial en la Hipertensión Arterial Esencial.


Existen muchas plantas medicinales, que son

utilizadas tradicionalmente por la población cubana, a las cuales se les atribuyen propiedades diuréticas. Boldoa purpurascens Cav. conocida comúnmente como nitro blanco, ha sido utilizada tradicionalmente por gran parte de la población cubana atendiendo a su poderosa acción diurética (Hernández et al., 2006; Rojas et al., 2004; González y Carvajal, 1998). Esta planta fue descubierta por Cavanilles en América, depositada en el jardín botánico de Madrid en 1816 por Lagasca, un discípulo de Cavanilles e introducida en Cuba en 1842 (Hernández et al., 2006; Rojas et al., 2004). Pertenece a la familia de las Nyctagináceas y se le conoce también como: Boldoa ovatifolia Lag, Cryptocarpus globosus H.B.K, Salpianthus purpurascens Hook & Arm. Es la última especie de su género y en Cuba también recibe el nombre vulgar de tostón. Es una yerba de un metro o poco más de altura, con tallo erecto, ramoso y las ramas delgadas, angulosas, lampiñas. Hojas alternas, pecioladas, anchamente ovales, agudas, enteras, con base subtruncada y decurrente en el pecíolo; lampiñas de color verde claro; flores verdosas, pequeñas, sésiles, conglomerado racemosas. El cáliz es fructífero, pubescente, cuadridentado en el ápice. Presenta cuatro estambres, con hipoginos libres, anteras biloculares, dídimas. Los ovarios son ovoideos, sésiles. Los estilos son simples, adelgazándose insensiblemente hasta terminar en el estigma aleznado, agudo. Aquenio comprimido, apeciolado. Embrión subanular, endospermo carnoso-farináceo (Roig, 1998). Las hojas de la planta y los aspectos taxonómicos más importantes pueden apreciarse en la Fig. 1.

La medicina popular refiere la utilización de una taza de cocimiento de sus hojas, incluso la recomienda varias veces al día (González y Carvajal, 1998; Roig, 1998). Sin embargo, no se han desarrollado estudios farmacológicos con una administración continuada que justifiquen esta forma de uso.

La actividad diurética de Boldoa purpurascens Cav. tras su administración oral única ha sido

comprobada en estudios preclínicos (Rojas et al., 2004; González y Carvajal, 1998).

Los diuréticos se utilizan fundamentalmente por largos periodos de tiempo para tratar enfermedades crónicas, por lo que resulta de gran interés conocer la influencia del uso continuado de la planta sobre diferentes parámetros fisiológicos.

Figura 1. Hojas de Boldoa purpurascens Cav. y clasificación taxonómica.

El objetivo de este estudio consistió en evaluar el

efecto de la administración oral continuada de un extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas en ratas.


Se realizó un estudio preclínico en la Unidad de Toxicología Experimental (UTEX) del Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara “Dr. Serafín Ruiz de Zárate Ruiz”, abarcando un período de cuatro meses desde enero hasta mayo de 2007. Este se llevó a cabo mediante dos fases experimentales: una primera de comprobación del efecto diurético de la materia prima a utilizar (extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascens Cav.) y una segunda de evaluación del efecto de la administración oral continuada de la planta sobre diferentes variables fisiológicas.

La planta fue recolectada en marzo de 2006, en el semillero del Huerto las Antillas de la Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas (UCLV) en horas de la mañana, procedente de un suelo carbonatado. La identificación de la misma fue realizada por una especialista de dicha estación experimental y una



muestra de ella se conservó en el herbario del Jardín Botánico de la propia UCLV con el número de Vaucher 3012.

Las hojas se dividieron en partes pequeñas y se extendieron sobre bandejas metálicas realizándose un secado mediante calor artificial en estufa, a una temperatura de 40 0C durante 72 h. Luego se molió el material vegetal seco empleando un molino de cuchillas Resteh alcanzándose un tamaño de partícula de 0.75 mm. A partir del material vegetal seco y pulverizado se procedió a la elaboración de un extracto a mediana escala y su posterior liofilización en el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).

Se elaboró un extracto acuoso al 10% mediante el uso de 2 kg de la droga seca depositada en un reactor con capacidad para 20 L y con agitación. Se procedió a la filtración de este a través de varios filtros de membrana y posteriormente se concentró hasta obtener una concentración de sólidos totales de 10 mg/mL. A continuación se sometió el extracto a un proceso de liofilización, empleando una liofilizadora Edward modelo L-40, procedente del Reino Unido, pasando por las tres etapas que rigen este ciclo (congelación, secados primario y secundario).

Comprobación del efecto diurético de la materia prima a utilizar

Esta etapa preliminar persiguió comprobar si el producto de estudio después de 6 meses de elaborado mantenía actividad diurética, pues no se disponía de referencias sobre su estabilidad. Para ello se utilizaron cinco ratas Sprague Dawley, sanas, con un peso comprendido entre 180-220 g, procedentes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), que fueron recibidas con el correspondiente Certificado de Calidad Genético e Higiénico Sanitario. Los animales fueron sometidos a un período de cuarentena de cinco días para lograr su aclimatación a las condiciones experimentales (temperatura 20 ± 2 ºC), con una humedad relativa de 30-70% y ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h). Se alojaron en una caja T-4 con fondo de rejilla, privados del alimento desde las 3:00 pm del día anterior y se les suprimió el agua a las 7:00 am del siguiente día.

A partir de estudios previos donde se evaluaron varios niveles de dosis, se seleccionó una dosis oral única de 400 mg/kg por resultar la de mayor actividad diurética de la planta (Rojas et al., 2004). El producto de ensayo se reconstituyó en agua destilada, preparán-dolo diariamente a una concentración de 10 mg/mL,

administrando una dosis de 400 mg/kg considerando una hidratación a razón de 4 mL por cada 100 g de peso corporal.

La administración del extracto se realizó mediante una cánula intragástrica 18 G a las 8:00 am. Las ratas fueron colocadas en jaulas metabólicas y se registró el volumen de orina acumulado a las 1, 2, 4, 6 y 24 h post-administración según aparece descrito en las guías y en varios estudios publicados en la literatura sobre plantas con actividad diurética atribuida (Jiménez et al., 2004; Boffill et al., 2006). Una vez concluido el experimento los animales fueron sacrificados mediante anestesia con éter.

Para efectuar la comparación del extracto acuoso liofilizado de la planta se utilizaron dos controles históricos, un control negativo administrado con cloruro de sodio 0,9% y uno positivo tratado con furosemida 20 mg/kg. Ambos controles se tomaron de un estudio anterior realizado en la misma institución (UTEX), donde se trabajó bajo iguales condiciones experimentales e hidratación de los animales a razón de 4 mL por cada 100 g de peso corporal, lo que permitió la comparabilidad de los grupos y justificó el empleo de este tipo de control (Boffill et al., 2006).

Evaluación del efecto de la administración oral continuada de Boldoa purpurascens Cav

La sustancia de estudio se administró diariamente durante 14 días, realizándose un análisis a los 7 y 14 días respectivamente. Se utilizaron 40 ratas de la línea Sprague Dawley procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con un rango de peso comprendido entre 200-220 g, una edad de 40-60 días de nacidas y de ambos sexos. El producto de ensayo (extracto acuoso liofilizado) se reconstituyó con NaCl, preparando diariamente a una concentración de 10 mg/mL para garantizar su estabilidad. Se administró una dosis diaria por vía oral de 400 mg/kg mediante una cánula intragástrica 18 G con una hidratación de 4 mL/100 g de peso para el grupo tratado con la planta y el control negativo (NaCl) y no se utilizó control positivo, pues no era objeto de la investigación medir la actividad diurética, sino evaluar el efecto de la administración continuada sobre diferentes variables bioquímicas. La dosis propuesta en nuestro ensayo (400 mg/kg) es la recomendada en la literatura como la dosis adecuada a emplear en la evaluación de plantas con actividad diurética atribuida (Jiménez et al., 2004; Boffill et al., 2006). Se tomaron para la evaluación variables informativas, de control y de respuesta.


Todos los datos obtenidos durante el estudio fueron tabulados y almacenados en una base de datos confeccionada en SPSS versión 11.0 para Windows. En el procesamiento estadístico se determinó la media y la desviación estándar de cada uno de los grupos. Para establecer si las diferencias entre ambos grupos (tratado y control) fueron estadísticamente significativas se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney (M-W). Se consideraron los niveles de significación: p<0,05 (significativo); p<0,01 (altamente significativo) y p<0,001 (muy altamente significativo).

RESULTADOS

Comprobación del efecto diurético de la materia prima

Al comparar los controles históricos que aparecen publicados en la literatura con los valores medios de diuresis obtenidos del estudio preliminar, se comprobó que en el grupo control negativo (NaCl), la diuresis comenzó dos horas después del inicio del experimento y se obtuvieron bajos volúmenes de orina excretada hasta completar 62,56 mL/kg al ser medidos a las 24 h. Por el contrario, en el grupo tratado con furosemida, el inicio de la acción diurética comenzó durante la primera hora, alcanzándose finalmente un volumen de 80,19 ± 12,49 mL/kg. El extracto acuoso del nitro blanco logró superar el efecto de la furosemida a partir de las 6 h, alcanzando un volumen final de 130 ± 10,12 mL/kg. No fue necesario determinar las concentraciones urinarias de Na+ y K+ por encontrase disponible varias referencias en la literatura sobre la eliminación de estos iones tras las aplicación de la planta en estudio, considerándose como una expoliadora de iones potasio (González, 2006; Cabrera, 1997). Esta fase permitió dar continuidad al segundo estudio al comprobarse actividad diurética de la materia prima.


Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiológicas

Durante las evaluaciones preclínicas no se evidenciaron anormalidades en el comportamiento de ninguno de los animales estudiados. Siempre se registró una conducta normal en los animales, con reflejo postural normal, hábitos de aseo y respuesta habitual a los estímulos nociceptivos, así como el consumo de alimentos y agua como corresponde a esta especie (González et al., 2006). El análisis de signos clínicos manifestó buen estado general de los animales

y apariencia normal, caracterizada por pelos brillantes, ojos claros y brillantes, mucosas normocoloreadas. Los signos vitales fueron normales, no existiendo alteraciones en las frecuencias cardíacas y respiratorias. En cuanto al análisis de la conducta se determinó un comportamiento normal exploratorio. La respuesta a los estímulos fue normal y estuvo caracterizada por una uniformidad en la movilidad del total de los animales ante el toque y fuera de sus jaulas. El resultado del peso corporal evidencia un incremento progresivo de esta variable en ambos grupos: tratado (B. purpurascens) y control (NaCl). Al concluir los 14 días de experimentación cada uno de los grupos mostró una ganancia de peso por encima de los 15 g y no se presentaron diferencias estadísticas entre grupos y sexos.

Comportamiento hematológico y bioquímico El análisis intermedio de los 7 días (Fig. 2) mostró

diferencias estadísticas significativas en la hemo-globina y hematocrito y se evidenciaron diferencias altamente significativas en el comportamiento bio-químico del ión potasio. En el análisis final por grupo del día 14 (Tabla 1) se observaron diferencias significativas en algunos de los índices hematológicos. Figura 2. Variación de la hemoglobina en ambos grupos.

020406080

100120140160180200

7 14

Días

C(g

/L)

Grupo tratadoGrupo control

**

020406080

100120140160180200

7 14

Días

C(g

/L)

Grupo tratadoGrupo control

**

Significación estadística: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test

Mann-Whitney La hemoglobina disminuyó tanto al séptimo como

al día 14 en relación con el grupo control, mostrando en esta última evaluación diferencias que resultaron ser estadísticamente significativas. (Fig. 2). A pesar de las diferencias encontradas los niveles de Hb siempre se encontraron dentro del rango de valores normales establecidos para esta línea, no obstante, debemos prestarle un interés especial a este hallazgo, pues solamente se administró el producto durante 14 días.



En el Conteo Diferencial de Leucocitos se observa una disminución de los eosinófilos en el grupo tratado que no llega a ser estadísticamente significativa (p=0,057). En el análisis de M-W no se presentaron diferencias estadísticas para ninguno de los grupos en cuanto al sexo y los valores más bajos se encontraron en el grupo tratado y correspondieron a las ratas machos. Los valores obtenidos para el grupo tratado indican que la administración del producto de ensayo no produce eosinofilia, la cual muchas veces aparece por causas farmacológicas (Pérez et al., 2004). No obstante, se encontraron diferencias estadísticas entre ambos sexos para esté índice a los 14 días, pero no entre el grupo tratado y control, lo que demuestra que el extracto de la planta no tuvo influencia sobre los eosinófilos.

Los efectos de los medicamentos sobre los eosinófilos son múltiples y presumiblemente se incrementarán a medida que se incorporen nuevos principios activos al arsenal terapéutico. Por ello, es esencial conocer la relación la relación que guarda la administración de un fármaco con los niveles de

eosinófilos, ya que algunos medicamentos (incluso aquellos de empleo muy común) pueden ser los responsables de esta alteración analítica.

El resto de las células del diferencial no mostró ninguna diferencia entre grupos y sexos y se apreció un predominio de linfocitos sobre el resto de las células, situación similar a la reportada en la literatura para los valores normales de estos índices hematológicos (González et al., 2006).

La Tabla 2 refleja el comportamiento de los indicadores medios de química sanguínea. Todos los indicadores evaluados se encontraron dentro de los límites normales establecidos para la especie menos el potasio y la glicemia, esta última se encontró en ambos grupos experimentales por debajo de su valor normal. Al analizar las diferencias estadísticas entre grupos para esta variable se apreciaron diferencias estadísticas significativas (p=0,030), encontrándose sus valores más bajos en el grupo tratado con la planta. Al aplicar la prueba de M-W no se evidenciaron diferencias entre sexos para ninguno de los grupos estudiados.

Tabla 1. Valores medios de los índices hematológicos de ratas Sprague Dawley de ambos grupos (media aritmética ± desviación estándar, n=40)

Grupo Hb (g/L)

Hto (%)

Leuc (x109 /L)

P L M E

Tratado 142,16 ± 12,88** 42,74 ± 2,94*** 7,81 ± 0,77 0,14 ± 0,05 0,85 ± 0,49 0,004 ± 0,006 0,0005 ± 0,002

Control 154,02 ± 10,39 48,70 ± 2,41 8,15 ± 0,92 0,15 ± 0,07 0,83 ± 0,07 0,003 ± 0,005 0,007 ± 0,010

Leyenda: Hb: hemoglobina, Hto: hematocrito, Leuc: leucocitos, P: polimorfos, L: linfocitos, M: monocitos, E: eosinófilos

Significación estadística: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney

Tabla 2. Valores medios de los índices hematológicos de ratas Sprague Dawley de ambos grupos (media aritmética ± desviación estándar, n=40)

Grupo Crea μmol/L

Gluc mmol/L

ASAT U/L

ALAT U/L Alb g/L

Chol-T Mmol/L

Na+ mEq/L

K+ mEq/L

Tratado 47,3±8,96 3,19±1,08* 69,76±22,6 35,29±5,19 39,68±2,93 1,52±1,21 133,15±13,06* 9,09±1,19***

Control 82,60±5,38 3,85±0,88* 82,93±11,54 35,73±4,85 39,52±3,15 1,75±0,24 142,63±4,47 3,30±0,54

Leyenda: Crea: creatinina, Gluc: glucosa, ASAT: Aspartato aminotrasnferasa ALAT: Alanino aminotrasnferasa Alb: albúmina, Chol-T: colesterol, Na+: sodio, K+: potasio



El análisis estadístico pone de manifiesto la existencia de otras diferencias para los niveles plasmáticos de iones sodio y potasio. Las más acentuadas se encontraron en el potasio llegando a ser muy altamente significativas (p=0,000).

Es válido destacar que el potasio se incrementó de manera muy significativa tanto al séptimo como al decimocuarto día (Tabla 2), apreciándose en este último mucho más las diferencias con respecto al grupo control, sobrepasando el rango de valores normales (Fig. 3), y según estos resultados se demuestra un incremento considerable de potasio tras la administración continuada de 400 mg/kg de peso.

Figura 3. Variación de potasio en ambos grupos.

0

2

4

6

8

10

12

7 14

Días

C(m

Eq/L

)

Grupo TratadoGrupo Control

***

**

0

2

4

6

8

10

12

7 14

Días

C(m

Eq/L

)

Grupo TratadoGrupo Control

***

**


DISCUSIÓN

En Cuba existen varias plantas medicinales de uso tradicional a las cuales se les atribuyen propiedades diuréticas. Solo en algunas de ellas se ha comprobado experimentalmente gran efectividad diurética: Costus cylindricus, Biden alba, Xanthium strumarium y Boldoa purpurascens (Jiménez et al., 2004; Boffill et al., 2006).

Las administraciones de Costus cylindricus y Bidens alba, administradas a una misma dosis (400 mg/kg) y volumen (4 mL/100g), han mostrado menor actividad diurética que la propia Boldoa prupurascens. Los valores medios de volumen de orina reportados a las 24 h tras la aplicación de la Bidens alba fueron aproximadamente de 89 mL/kg (Jiménez et al., 2004; González, 2006) y para Costus cylindricus fue de 78,04 ± 10,69 mL/kg. Comparando estos resultados con los obtenidos en nuestro estudio

corroboramos la marcada diuresis atribuida a Boldoa purpurascens Cav.

Los estudios etnomédicos y de toxicidad disponibles de la planta no han mostrado evidencia de anemia. El presente estudio emplea por primera vez un esquema de administración oral continuada de la planta que permitió observar los efectos de esta sobre los índices hematológicos.

La evidente tendencia a la disminución de la hemoglobina (Hb) y el hematocrito (Hto) en el grupo tratado con la planta nos hace pensar que esta pudiera estar afectando la síntesis de la Hb. Los taninos, metabolitos secundarios presentes en la planta, pudieran guardar relación con estos efectos perjudiciales, ya que se conoce que bloquean la absorción del hierro (Hernández et al., 2006).

La literatura refiere varias clases de diuréticos que afectan las concentraciones de glicemia. Para las tiazidas se ha reportado hiperglicemia por inhibición de la liberación pancreática de insulina y bloqueo de la activación periférica de glucosa; pero este mecanismo no está del todo demostrado (Mudge, 1994; Centro para el Desarrollo de la Farmaco-epidemiología, 2001).

Por otra parte, en los diuréticos de alto techo como la furosemida se han reportado algunos casos de tolerancia a los hidratos de carbono, pero en un menor grado que las tiazidas. La hipoglicemia aguda de origen desconocido se ha observado como manifestación de sobredosis (Mudge, 1994; Centro para el Desarrollo de la Farmacoepidemiología, 2001).

Aparecen referidos en la literatura varios estudios sobre el efecto hipoglicemiante de algunos flavonoides; sin embrago, hasta la fecha no se ha encontrado ningún estudio que muestre el efecto hipoglicemiante de la planta, a pesar de tener un elevado contenido de estos metabolitos. Se ha planteado la existencia de flavonas que aumentan la liberación de insulina de los islotes de Langerhans de una forma dependiente a su concentración.

El aspecto más importante a considerar desde el punto de vista terapéutico para la Boldoa purpurascens es su aporte considerable de iones potasio al organismo, teniéndose en cuenta que el principal inconveniente de los diuréticos es la depleción electrolítica, especialmente el de este ión.

De acuerdo a los resultados obtenidos la planta se comporta como un diurético aportador de potasio capaz de inducir hiperpotasemia, que para esta línea




de ratas (SD) se reporta como valor umbral 8.5 mEq/L (Iffa Credo, 1998; Wolford et al., 1986).

No se conoce en la terapéutica ningún diurético que no sea capaz de provocar alteraciones en la homeostasis del potasio y el nitro blanco tampoco es la excepción. Existe un número considerable de fármacos diuréticos disponibles en el mercado y dentro de ellos un grupo muy reducido denominado ahorradores de potasio, entre los que se encuentran amiloride, triantereno y espironolactona (Jackson, 1998).

En Cuba solamente se encuentra dentro del cuadro básico de medicamentos la espironolactona como diurético ahorrador de potasio, este se utiliza en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva que no mejora a pesar del tratamiento con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAs) más diurético y digoxina. La asociación de espironolactona con los IECAs no produce hiperpotasemia y para el caso de la digoxina mejora la carditoxicidad. Estas asociaciones han mostrado un grado de evidencia A o categoría I, basada en los datos procedentes de ensayos clínicos controlados y aleatorizados, metaanálisis y revisiones sistemáticas (Centro para el Desarrollo de la Farmaco-epidemiología, 2001).

Existen dos posibilidades de reducir el riesgo de hipopotasemia (hipokalemia): dar aportes de potasio o añadir al tratamiento un diurético, un ahorrador de potasio. La mayor parte de los autores se inclinan por intentar prevenir suplementos de potasio, pues el cumplimiento de la prescripción puede ser un problema en este último caso, pues no todos los enfermos tienen problemas de hipokalemia (Club de Atención Farmacéutica, 2006; Cohn et al., 2000; Genneri, 1998).

Disponer en la terapéutica de un medicamento natural que posea gran eficacia como diurético y a la vez sea un aportador de potasio resulta muy alentador para la farmacología de la insuficiencia cardíaca.

CONCLUSIONES

1. Se comprobó el efecto diurético del extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurasces Cav. a la dosis de 400 mg/kg.

2. No se presentaron signos clínicos asociados a la administración de la sustancia en ensayo.

3. La administración continuada del extracto acuoso liofilizado disminuyó significativamente los niveles de Hb y Hto, a pesar de encontrarse

ambos parámetros en el rango establecido de valores normales para la línea de estudio.

4. Se presentó una disminución significativa de la glicemia en el grupo tratado con relación al control.

5. Las concentraciones de sodio disminuyeron significativamente en el grupo tratado, mientras que el potasio mostró diferencias muy altamente significativas y sobrepasó los límites normales de laboratorio clínico a los 14 días de administra-ción.

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Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb. extracts [Actividad tripanocida de extractos de Castela coccinea Griseb.]

María L. MARTÍNEZa*, María NOEL CAMPAGNAa, María S. RATTIa, Isabel NOCITOb, Esteban SERRAb, Susana GATTUSOa and Martha A. GATTUSOa*

aFarmacobotánica. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario, Argentina. bParasitología. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario, Argentina.

Abstract

Castela coccinea Griseb is a small tree that belongs to Simaroubaceae family. This work shows that this plant extracts present in vitro a strong activity against Trypanosoma cruzi epimastigotes. Particularly, wood dichloromethane extract displayed the most intensive trypanocide effect. A fraction of this extract, purified by column chromatography over Silica-gel, was enriched in coumarins, phenolic acids and alkaloids. This fraction was even more effective with an IC50 of 15 µg/mL. Our results suggest that alkaloids could be the responsible compounds for this activity. The 8-amino-6-methoxyquinoline group was detected by GC-MS, even though the whole molecule could not be identified yet. On the other hand, all extracts have exhibited cytotoxicity against the human cell line K-562, at high concentrations. However, the selectivity index of wood dichloromethane extract has been 7.5.

Keywords: Castela; Simaroubaceae; Trypanocide activity; Cytotoxicity.

Resumen

Castela coccinea Griseb es un árbol de pequeño porte que pertenece a la familia Simaroubaceae. En el presente trabajo los extractos de esta planta muestran una fuerte actividad in vitro contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi. El extracto diclorometánico de madera es el que presenta mayor efecto tripanocida. Una fracción de este extracto, purificada por cromatografía en columna, está enriquecida en cumarinas, ácidos fenólicos y alcaloides. Esta fracción es aún más activa con una CI50 =15 µg/mL. Nuestros resultados sugieren que los alcaloides son los responsables de esta actividad. Más aún, se ha detectado la presencia del grupo 8-amino-6-metoxiquinolina por cromatografía gaseosa acoplada a un espectrómetro de masa, pero todavía la molécula entera no ha sido identificada. Por otro lado, todos los extractos mostraron actividad citotóxica contra la línea celular humana K-562, a altas concentraciones. Sin embargo, el índice de selectividad para el extracto diclorometánico de la madera es de 7.5.

Palabras Clave: Castela; Simaroubaceae; Actividad tripanocida; Citotoxicidad.

Recibido | Received: March 5, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: April 30, 2009. Publicado en Línea | Published Online: May 10, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: None declared. This article must be cited as: María L. Martínez, María Noel Campagna, María S. Ratti, Isabel Nocito, Esteban Serra, Susana Gattuso and Martha A. Gattuso. 2009. Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb. extracts. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):211 – 218. {EPub May 10, 2009}.

*Contactos | Contacts: Facultad Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. Suipacha 531 – S2002LRK – Rosario, Argentina. E-mails: [email protected]; [email protected]








Martínez et al. Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb


INTRODUCTION

Castela coccinea Griseb. mainly grows in South America and belongs to the Simaroubaceae family. This family has played a prominent role in folk medicine because of its anthelmintic and antiamoebic properties (Polonsky, 1973). Chemical examination of these plants has been carried out by several groups resulting in the isolation of quassinoids (Ogura et al.,1977; Grieco et al., 1999; Jiwajinda et al., 2001; Jacobs et al., 2007), alkaloids (Sanchez and Comin, 1971; Ogura et al., 1978; Ouyang et al., 1995; Readel et al., 2003) and terpenoids (Sherman et al., 1980). In recent years, attention has been focused on quassinoids, bitter principles of the family, as several of them have shown promising antitumor, antiviral, antimalarial, antileukemic and antifeedant properties (Polonsky, 1985).

Bourdy et al. has demonstrated that leaf extracts of Castela coccinea Griseb display strong activity against Plasmodium falciparum, which is the etiological agent of the most severe form of malaria (Bourdy et al., 2004). Malaria has low incidence in South America. On the other hand, South America is the endemic zone for Chagas, another parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi. Although the incidence of Chagas has declined over the past 20 years mainly due to the efforts made towards the control and elimination of the vector, American trypanosomiasis remains a sickness difficult to eradicate (Moncayo, 2003). Current therapy is based on two drugs, nifurtimox and benznidazole, which have been proved effective against the acute phase of the disease. Otherwise, their effectiveness in the chronic stage is controversial. Additionally, serious side effects have been reported in about 50 % of treated patients (Castro et al., 2006). Therefore, it still remains a compelling need to develop safer and more efficient drugs, as well as new approaches to overcome the drawbacks of this chemotherapy strategy.

The aim of this work is to examine anti-trypanosomal activity of Castela coccinea Griseb extracts. Cell viability was also evaluated after treating cells with different extracts of Castela coccinea Griseb to investigate the behaviour in biological systems, because it is well-know that many Simaroubaceae plants show cytotoxic activity (Among others, Cuendet and Pezzutto, 2004; Guo et al., 2005; Lopez Saez et al., 2008).


Plant Material Castela coccinea Griseb. (Simaroubaceae) was

collected from Argentina: Santa Fe Province, General Department Obligado, Berna Locality in December 2004 and October 2007 and was authenticated by Luis Oakley, Departamento de Biología y Recursos Naturales, Universidad Nacional de Rosario (UNR). A voucher specimen was deposited in the Herbarium of SF referring Pensiero 6943 to material collected in 2004 and in the Herbarium of UNR referring Oakley et al. 053 to material collected in 2007.

Chemicals 1,1-diphenyl-2-picryldydrazyl (DPPH), dimethyl

sulfoxide (DMSO), 2-aminoethyl diphenylborinate and anisaldehide were purchased from Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA. The culture media Eagle’s minimum essential medium (MEM), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), trypsin, penicillin G, streptomycin were purchased from Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). All other chemicals and reagents used were of the highest commercially available purity.

Preparation of extracts and partial purification The bark (100 g) and the wood (100 g) of Castela

coccinea Griseb were extracted three times with ethanol (EtOH) or dichloromethane (DCM) at room temperature and then concentrated under reduce pressure yielding the residues: BarkEtOH (2.0 g), WoodEtOH (2.0 g), BarkDCM (1.24 g) and WoodDCM (0.93 g). Each of them was resuspended in the corresponding solvent or in DMSO.

WoodDCM extract was subjected to chromatography on a Silica gel-60 column (40 cm length, 2 cm i.d.) equilibrated with hexane and eluted with a stepwise gradient of hexane and ethyl acetate. 90 fractions of 5 mL each were collected and analyzed by TLC aluminium sheets. On the basis of the TLC profile the similar fractions were pooled into 5 fractions: I, II, III, IV and V.

Trypanocide assay Epimastigotes from CL Brener and Y strains were

cultured in modified liver infusion tryptose (LIT) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 28 ± 0.5 °C in 24 wells culture flasks (Camargo, 1964). Cultures (3 - 4 x 106 parasites/mL)



where incubated with increasing amounts of each extract. The parasite’s growth was monitored by counting them in a Neubauer chamber. Percentage of inhibition was calculated as the ratio between parasite’s growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture. IC50 was obtained by plotting the percentage of inhibition against extract concentration. Each experiment was performed in triplicate and trypanocide drug benznidazole (BZL) was used as positive control.

Cytotoxicity assay Human myelogenous leukaemia K-562 cell line

was cultured in DMEM supplemented with penicillin G (100 units/mL), streptomycin (100 µg/mL) and 10-15% fetal bovine serum in a 5% CO2 humidified incubator at 37 °C.

The extracts were first dissolved in DMSO and then in MEM. Confluent cultures were treated with medium containing the extracts at concentrations ranging from 1 up to 450 µg/mL or the solvent alone (control) for 24, 48 and 72 h. Each drug concentration was tested in quadruplicate. Final concentration of DMSO in the test medium and controls was 1%. After the indicated treatments, cells were removed from culture flasks by treatment with trypsin.

The effect of the DMSO 1% was analyzed in all experimental procedures and there was no significant difference between the solvent and the control on all the measured parameters.

Cell death was determined by incubating with 0.4% Trypan Blue, and then the stained cells were counted in a Neubauer haemocytometer. The results were expressed as the percentage of cell death relative to solvent-treated control incubations and the IC50 values were calculated using non-linear regression analysis (percentage of cell death vs. concentration). In vitro cytotoxicity effect was calculated as the ratio between cell’s growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture.

Morphological features of the cells (variation in size or nuclear/cytoplasmic ratio, presence of granules) were monitored by light microscopy.

General experimental procedures The extracts were subjected to thin layer

chromatography (TLC) examination on aluminium sheets pre-coated with silica gel 60 F 254 (Merck). Mobile phase I Toluene: ethylacetate: formic acid (9:3:0.7), II: ethylacetate: Acetic Acid: Formic acid: water (10:1.1:1.1:2.6), III Toluene: ether (1:1

saturated with 10% acetic acid). The chromatograms were observed first without chemical treatment, under UV 254 and UV 365 nm light, and then using the spray reagents: NP/PEG, Dragendorff, KOH 5%, Liebermann-Burchard reagent or FeCl3 3% (Wagner et al., 2001). TLC sheet was also immersed in a 0.4 mM DPPH methanolic solution for 10 s.

GC-MS analysis was carried out on PERKIN ELMER Gas Chromatograph attached to a TURBOMASS Mass Spectrometer. SE-30, 25 m x 0.22 mm de ID column was used for fraction IV separation. Helium was used as the carrier gas and kept at 1 mL/min. Oven temperature was programmed at 100 ºC (5 min) to 310 ºC at a rate of 10 ºC/min (10 min). The mass-scanning was done by electron impact (EI) source with electron energy set to 70 eV and mass range m/z 50-450.

RESULTS

Cytotoxicity The in vitro cytotoxic effect was determined using

the haemocytometer to estimate the total number of viable and non-viable cells and was also evaluated by Trypan-blue exclusion method (Fig. 1A). All extracts have shown significant cell death at the highest dosage of 0.45 mg/mL. IC50 was estimated from graphical interpolation. Among the tested fractions, BarkEtOH extract has shown the strongest inhibition with an IC50 of 0.20 mg/mL. IC50 for wood extracts was 0.45 mg/mL. Microscopically detectable alterations were observed in the cell morphology. When cells were incubated with bark extract granulation and vacuolization in the cytoplasm were observed, as well as irregular borders and a lower number of cells were detected (Fig. 1B).

Antitrypanosomal activity of the extracts Ethanolic and DCM extracts of Castela coccinea

Griseb bark and wood were screened for antiprotozoal activity against Trypanosoma cruzi epimastigotes (Fig. 2). WoodDCM extract showed the strongest activity with an IC50 = 60 µg/mL. BZL was used as positive control and showed an IC50 = 10 µg/mL. Cytotoxicity did not correlate with antiprotozoal activity. Wood extracts were more selective against the parasites than against mammalian cells. This was demonstrated by their Selectivity Index (SI = IC50 for K-562 cells/ IC50 antiprotozoal activity) values > 1. WoodDCM SI has been 7.5.


Figure 1. Effect of Castela coccinea Griseb extracts on inhibition of the leukemic cell line K-562.

A. In vitro cytotoxicity effect calculated as the ratio between cell’s growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture. B. Photomicrographs 1) Cells incubated with solvent alone (Control) 2) BarkEtOH (100 μg/mL) treated cells and staining with Trypan blue. Death staining cells are shown with an arrow. It was observed a lower number of cells, irregular borders and cytoplasmic granules. 3) BarkEtOH (200 μg/mL) treated cells without staining. A very low number of cells and abundant granules were observed.

A

-20

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Concentration (μg/ml)

% C

ell d

eath

Wood DCM Wood EtOH Bark DCM Bark EtOH

B

Fractionation and phytochemical screening of WoodDCM extract

The WoodDCM extract was purified by column chromatography. When tested against the parasite, Fraction I, the high non-polar fraction, showed an IC50 value of 185 µg/mL, while fraction III exhibited an IC50 value of 60 µg/mL. The highest activity was concentrated at fraction IV (Fig. 3), and this fraction also had activity against DPPH.

Phytochemical analysis by TLC has demonstrated the presence of alkaloids and terpenoids in fraction III and alkaloids, phenolic acids and coumarin in fraction IV. When this fraction (IV) was subjected to GC-MS,

scopoletin and an 8-amino-6-methoxyquinoline group were detected, however the identity of the whole alkaloid molecule could not be determined. Despite scopoletin being the main component of fraction IV (Fig. 4), it did not show any trypanocide activity up to 6 µg/mL. On the other hand, the phenolic acids detected in fraction IV were also detected in fraction V (the most polar fraction). It is a very interesting fact that this last fraction had not trypanocide activity at all. Therefore, trypanocide activity would not be caused by effect of these phenolic acids. On the contrary, they were responsible for DPPH scavenging activity.



Figure 2. In vitro trypanocide activity of Castela coccinea Griseb extracts expressed as percentage of parasite’s growth inhibition..

0

20

40

60

80

100

120

1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 0.015

Extract Concentration (mg/mL)

Try

pano

cide

act

ivity

(%

Woodol WoodDCM Barkol BarkDCM

Figure 3. In vitro trypanocide activity of different wood DCM fractions expressed as percentage of parasite’s growth inhibition.

0

20

40

60

80

100

120

1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 0.015

Extract Concentration (mg/mL)

Try

pano

cide

act

ivity

(%

FI FII FIII FIV




Table 1. In vitro trypanocide activity and cytotoxicity of Castela coccinea Griseb extracts.

Cytotoxicity IC50 (µg /mL) Selectivity indexa

T. cruzi K-562

Woodol 81 450 5.5

FI 185 - -

FII - - -

FIII 60 - -

FIV 15 - -

FV - - -

WoodDCM 60 450 7.5

Barkol 220 200 0.9

BarkDCM 168 300 1.78

(a) Selectivity index was determined by the ratio of the IC50 value on K-562 cells to the IC50 value on T. cruzi.

Figure 4. Analysis of fraction IV by TLC. TLC plate was stained with NP-PEG. Fraction IV exhibited eight to ten blue fluorescent zones from the start up to Rf 0.53. Solvent system III. S: commercial scopoletin 0.1% in ethanolic solution (5 µL).

DISCUSSION

This work showed that Castela coccinea Griseb presents a strong trypanocide activity and particularly wood extracts displayed the most intensive effect. On the other hand, all extracts have exhibited cyto-toxicity at high concentrations. However, WoodDCM was more selective against parasites than against mammalian cells with a selectivity index of 7.5. A fraction of this extract enriched in coumarins, phenolic acids and alkaloids was more effective against Trypanosoma cruzi with an IC50 of 15 µg/mL.

Several coumarins and indol or quinoline alkaloids exhibit remarkable parasitaemia suppression against different strains of Plasmodium or Trypanosoma (among others Phillipson, 1999; Camacho, 2004; Muhammad et al,. 2003 and 2004; Argotte-Ramos et al., 2006; Huang et al., 2006; Fournet et al., 2007; Bringmann, 2007; Frederich, 2008). Our results suggest that alkaloids could be responsible for this activity. The 8-amino-6-methoxyquinoline group was detected but the whole molecule could not be identified yet. Interestingly, compounds containing this group, as for example, primaquine (CAS Nº 63-45-6) are already being used to produce radical cure and prevent relapse of vivax and oval malarias following treatment with blood schizontocide (Dongre et al., 2005; Musonda et al., 2007; Kaur et al., 2007).

0.23

0.53

Rf

The fraction with the highest trypanocide activity also showed antioxidant capacity. It has been proven that Trypanosoma is sensitive to oxidative stress, in particular by reactive oxidant species produ-ced during the immune response of the host. The fact that this fraction both show radical scavenging and kill parasites suggests that these activities should be associated with two different molecules present in the extract. The detected antioxidant compounds were phenolic acids, also present in the most polar fraction without show trypanocide activity. However, the possibility that the same molecule works as a radical scavenger in mammalian cells and as a radical inducer in parasites could not be completely miss-considered.

IV S



The screening of natural products provides the chance to discover new molecules of unique structure with high activity and selectivity, which can be further optimized by semi- or fully synthetic procedures. Alkaloids are one of the most fascinating natural products, providing many drugs for human use (Phillipson et al., 1999; Kayser et al., 2003). The results of this work show that Castela coccinea Griseb extracts are potentially a rich source of bioactive compounds and the search of these entities is carried out. A preliminary phytochemical study is done but further studies are needed as this plant is unknown from the phytochemical point of view.

CONCLUSION

Castela coccinea Griseb has not been previously studied for their trypanocidal effect. Wood DCM showed strong activity against Trypanosoma cruzi with an IC50 of 15 µg/mL. Our results suggest that alkaloids could be responsible for this activity. Interestingly, although the whole molecule identity could not be assessed, an 8-amino-6-methoxyquino-line group was detected. A bioguided fractionation is in progress to identify the active compounds.

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Estudio de la eficacia antibiótica de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en dos modelos de infección

en piel de ratón [Study of the antibiotic efficacy of an ethanolic extract from Rosmarinus officinalis against Staphylococcus aureus

in two skin infection models in mice]

María V. BARNI, Adriana FONTANALS y Silvia MORENO*

Fundación Instituto Leloir I.I.B.B.A-CONICET, Patricias Argentinas 435, C1405FFX, Ciudad de Buenos Aires, Argentina.

Abstract

In this paper we examined the antibacterial efficacy of an ethanolic extract of Rosmarinus officinalis L. containing a high amount of antioxidant polyphenols against the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus in two skin infection models in mice, superficial and subcutaneous. Results obtained showed that the rosemary extract containing 2.3% of polyphenols had bacteriostatic activity against S. aureus on the skin infection. Using a double concentration of bioactive polyphenols in the treatment (4.6% of polyphenols), a total bacterial growth inhibition on the skin was suggested since we did not recover any bacteria viable in the skin mouse. A similar effect was observed in two skin models. Our results also showed that the antibacterial efficacy of the bioactives of rosemary is comparable with the antibiotic action of the well recognized antibiotic fusidic acid. All findings indicated that bioactive polyphenols of rosemary are able to carry out bactericide as well as bacteriostatic action against S. aureus in the skin mouse.

Keywords: Rosmarinus officinalis L;, Antimicrobial activity; Superficial skin infection model in mouse; Subcutaneous skin infection model in mouse.

Resumen

En este trabajo evaluamos la eficiencia antibacteriana de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis L. que contiene altas concentraciones de polifenoles antioxidantes, en dos modelos de infección en piel de ratón: superficial y subcutáneo contra la bacteria patógena Staphylococcus aureus. Los resultados obtenidos muestran que el extracto de romero que contiene 2,3% de polifenoles bioactivos presentó una acción bacteriostática contra S. aureus sobre la piel del ratón, mientras que ensayando una doble concentración de polifenoles bioactivos (4,6%) se observó una inhibición total del crecimiento bacteriano. En los dos modelos de infección experimentados se observaron efectos similares. Los datos obtenidos también demuestran que la eficacia antibacteriana del extracto de romero es comparable con la acción del antibiótico comercial ácido fusídico. Los resultados indican que los polifenoles bioactivos del romero, dependiendo de su concentración, pueden ejercer in vivo acciones bacteriostáticas y bactericidas contra S. aureus.

Palabras Clave: Rosmarinus officinalis L.; Actividad antimicrobiana, Modelo de infección superficial en piel de ratón, Modelo de infección subcutáneo en piel de ratón.

Recibido | Received: December 30, 2008. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: May 18, 2009. Publicado en Línea | Published Online: May 29, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: uthors have no competing interests. aFinanciación | Funding: This work was supported by Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) and ANPCyT, proyecto PICT2005-35401 This article must be cited as: María V. Barni, Adriana Fontanals y Silvia Moreno. 2009. Estudio de la eficacia antibiótica de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en dos modelos de infección en piel de ratón. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):219– 223. {EPub May 29, 2009}.

*Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]








Barni et al. Eficacia antibiótica de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en ratones


INTRODUCCIÓN

Las enfermedades infecciosas representan en la actualidad una importante causa de mortalidad en humanos, especialmente en los países en desarrollo.

Actualmente la emergencia de resistencia a antibióticos de uso común en la clínica, se ha incrementado en algunas bacterias patógenas (Cabrera Cao et al., 2005) y es un problema particular en pacientes infectados con Staphylococcus aureus debido al aumento de variantes resistentes a β-lacatamasas, aminoglicósidos (Styers et al., 2006). Esta bacteria puede ingresar al cuerpo a través de heridas, quemaduras, úlceras o puede ser trasportada a través de sondas o cánulas en los pacientes hospitalarios, pudiendo llegar al torrente sanguíneo y así diseminarse en el organismo, comprometiendo el corazón, la sangre o los huesos (Naimi et al., 2003). Además, recientemente se encontraron bacterias resistentes en ámbitos hospitalarios que fueron transmitidas en la comunidad (Kollef et al., 2006).

En consecuencia, dichos sucesos impulsan la búsqueda de nuevas drogas para controlar las bacterias resistentes. La obtención de nuevos agentes antimicrobianos de origen vegetal es una estrategia competente en la farmacología actual (Cowan et al., 1999). Se sabe que las plantas bajo condiciones de estrés biótico y abiótico sintetizan metabolitos secundarios que incluyen flavonas, taninos, antocianinas y terpenos (mono-di y sesqui terpenos) para adaptarse al medio que las rodea (Demming-Adams et al., 2002, Kliebenstein, 2004). Algunos de estos compuestos presentan actividad antimicrobiana (Lewis et al., 2006).

Las plantas pertenecientes a la familia Lamiaceae crecen en zonas áridas y de alta irradiación UV, por lo tanto acumulan una gran cantidad de metabolitos secundarios, en particular el género Rosmarinus officinalis L. es una fuente importante de compuestos antioxidantes de naturaleza polifenólica que presenta propiedades biológicas como antibacteriano, anti-inflamatorio y antitumoral. Previamente reportamos que la eficacia antimicrobiana in vitro de diferentes extractos de romero estandarizados en el contenido de ácido rosmarínico, ácido carnósico y carnosol dependía de la composición de sus polifenoles (Moreno et al., 2006). El objetivo de este trabajo es estudiar la eficacia antibacteriana in vivo de un extracto etanólico de R. officinalis contra la bacteria patógena Staphylococcus aureus, en dos modelos de infección en piel de ratón comparando su potencia

antimicrobiana con el antibiótico comercial ácido fusídico.


Material vegetal El material vegetal fue cosechado en marzo del

2008 en el Valle de Lerma (Salta, Argentina). El extracto de R. officinalis L. fue obtenido a partir de hojas secas por extracción etanólica y se determinó por HPLC la composición de polifenoles (ácido carnósico, carnosol y ácido rosmarínico) como se describió previamente (Moreno et al., 2006). El extracto de romero seco se almacenó a -20 ºC.

Preparación de inóculo bacteriano Se preparó un cultivo bacteriano de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 en caldo Mueller Hinton (DIFCO) que se creció durante 20 horas a 37 ºC con una agitación de 250 rpm, luego se midió la concentración bacteriana por densidad óptica a 625 nm y se diluyó a una concentración final de 0,5 Mc Fardland correspondiente a 1 x 108 UFC (unidades formadoras de colonias)/mL.

Animales y modelos de infección en piel de ratón Se utilizaron ratones hembras BALB/cAnNCrl de

2 meses de edad y peso variable (19-21 g), criados en la Fundación Instituto Leloir. El protocolo de trabajo fue aprobado por el bioterio del Instituto Leloir, y cumple con el reglamento interno vigente y con la legislación nacional (Disposición 6344/96 de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica y Resolución 617/2002 del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria). Responsable a cargo del bioterio Adriana Fontanals.

Los ratones fueron anestesiados vía intra-peritoneal con una dosis de 100 mg/kg de ketamina (Ketonal, Richmond) y 5 mg/kg de clorhidrato de xilacina (Xilacina 20, Richmond). Luego se procedió a rasurar con gillette la parte dorsal izquierda del animal para eliminar el pelaje.

Se establecieron dos modelos de infección en piel de ratón:

Modelo de infección superficial. Se utilizó el modelo de infección superficial previamente descripto por Kugelberg et al. (2005), con algunas modificaciones. Se removieron las primeras capas dérmicas del área de la piel de ratón rasurada, con tres pasajes de hoja de afeitar de acero inoxidable


para facilitar la infección bacteriana. Bajo campana de flujo laminar se colocaron 5 μL del inóculo bacteriano (5 x 105 bacterias) sobre una superficie de piel de 2 cm2. Pasados 5 min, para dar lugar a la absorción de las bacterias en la piel del ratón, se colocó un apósito estéril sobre el área inoculada.

Modelo de infección subcutánea: Como describió Gisby et al. (2000), se estableció el número de bacterias adsorbidas en 1 cm de hilo de cirugía en ensayos in vitro (7,5 x 104 bacterias). Para llevar a cabo la infección subcutánea se colocaron hilos de cirugía de 10 cm en tubos con 5 mL del inóculo bacteriano (1 x 108 UFC/mL) y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Luego cada hilo inoculado se enhebró en una aguja de cirugía. Esta se introdujo en la parte rasurada del ratón de modo de atravesar la dermis sin llegar al músculo carnoso y dejando 1 cm de hilo bajo la piel. Luego se anudaron y se cortaron los extremos del hilo. Para permitir la penetración de las cremas de tratamiento se realizó un incisión con bisturí por debajo de la sutura en la misma dirección que el hilo (Gisby et al., 2000). Posteriormente se colocó un apósito estéril sobre la herida.

Tratamientos El extracto seco de R. officinalis L., empleado

para la preparación de los tratamientos, contiene un porcentaje total de compuestos fenólicos de 23%, que comprende un 20% de diterpenos fenólicos (ácido carnósico 10% y su derivado carnosol 10%) y un 3% de ácido rosmarínico, determinados por HPLC.

Se realizaron dos preparaciones del extracto de romero que contienen diferentes concentraciones de compuestos polifenólicos bioactivos: 2,3% (p/p) y 4,6% (p/p), respectivamente. Para ello, se emulsionó de manera homogénea el extracto de R. officinalis L. con crema base hidrosoluble comercial.

El placebo consistió en la aplicación de la crema base hidrosoluble sin ningún agregado, y se consideró como control negativo. Como control positivo se utilizó el antibiótico tópico comercial, ácido fusídico (FUSIMED, Laboratorio Cassará) al 0,5; 1 y 2%.

Las dosis aplicadas fueron de 20 mg/2 cm2 de piel.

Ensayos y diseño experimental Para el modelo de infección subcutáneo se

realizaron 2 ensayos que difieren en el diseño temporal y cantidad de dosis aplicadas. Uno consistió en la aplicación de 2 dosis a las 4 y 6 h post-inoculación y la recuperación de bacterias de la piel a

las 8 h post-inoculación (Fig. 1A). En el otro ensayo se aplicó una única dosis de tratamiento a las 4 h post-inoculación y la recuperación de bacterias se realizó a las 6 h post-inoculación (Fig. 1B).

Para el modelo de infección superficial se realizó el ensayo que consistió en la aplicación de 2 dosis a las 4 y 6 h post-inoculación y la recuperación de bacterias se realizó a las 8 h post-inoculación (Fig. 1A).

La primera dosis de los tratamientos se aplicó a las 4 h post-inoculación como se describió previa-mente (Gisby et al., 2000) dado que la colonización bacteriana se establece dentro de dicho período. Figura 1. Diseño experimental. A - Modelo de infección subcutáneo y superficial (2 dosis). B - Modelo de infección subcutáneo (1 dosis).

Por lo tanto, para evaluar la acción antibiótica del

extracto de romero se realizaron 3 tipos de ensayos diferentes en total, considerando los dos modelos de infección, variable tiempo y dosis aplicadas. En cada ensayo se incluyeron los controles: placebo, sin tratamiento y el control positivo (ácido fusídico a tres concentraciones).

Recuperación de bacterias de la piel de ratón La determinación de la concentración bacteriana

post-tratamiento en ambos modelos se realizó según Gisby et al. (2000). Se retiró con bisturí el área de 2 cm2 de la piel tratada, se colocó en un tubo con 1 mL de caldo Mueller Hinton donde se homogeneizó con un grinder. Luego se realizaron diluciones del homogenato en solución fisiológica y se sembraron alícuotas de 100 μL en placas de Petri con agar Mueller Hinton. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 h y posteriormente se determinaron las UFC/mL.

Se realizó un control de inóculo recuperando las bacterias de la piel del ratón sin tratamientos previos para confirmar su viabilidad en la piel.




Análisis estadístico Se utilizó el programa Info Stat para el análisis

estadístico. El test t de Student (α = 0,001) se aplicó a muestras independientes para cada grupo de tratamiento (n = 6).

El promedio del número de bacterias (UFC) recuperadas de la piel de ratón (n = 6) en cada tratamiento con su respectiva barra de error se transformó a log10 UFC/herida.


Se utilizaron dos modelos de infección en piel de ratón para determinar la actividad antibiótica del extracto de R. officinalis. El modelo de infección subcutáneo fue ensayado para estudiar el efecto del extracto de romero sobre infecciones que se producen a niveles intradérmicos, como por ejemplo las infecciones producidas en heridas quirúrgicas. Por el contrario, el modelo superficial fue diseñado para estudiar infecciones provocadas en zonas dérmicas expuestas al ambiente.

En el modelo de infección superficial los promedios de concentración bacteriana recuperados de la piel de ratón para cada tratamiento expresados en UFC/herida fueron: placebo (1,55 x 104 ± 5,47 x 102), no tratado (1,25 x 104 ± 8,99 x 102), extracto de R. officinalis 2,3% (2,02 x 101 ± 4,12), extracto de R. officinalis 4,6% (0), ácido fusídico 0,5% (1,27 x 101

± 1,63), ácido fusídico 1,0% (0), ácido fusídico 2,0% (0). Mientras que para el modelo de infección subcutáneo con el diseño experimental (Fig. 1A), los promedios para cada tratamiento fueron: placebo (1,95 x 104 ± 5,47 x 102), no tratado (1,72 x 104 ± 5,61 102), extracto de R. officinalis 2,3% (2,57 x 102 ± 22,03), extracto de R. officinalis 4,6% (0), ácido fusídico 0,5% (1,78x 101 ± 3.33), ácido fusídico 1,0% (0), ácido fusídico 2,0% (0).

En el tercer ensayo, modelo de infección subcutáneo con el diseño experimental (Fig. 1B) los resultados fueron: placebo (1,02 x 104 ± 5,63 x 102), no tratado (1,10 x 104 ± 1,74 103), extracto de R. officinalis 2,3% (1,21 x 102 ± 30,09), extracto de R. officinalis 4,6% (0), ácido fusídico 0,5% (1,27 x 102 ± 27), ácido fusídico 1,0% (4,40 x 101 ± 3,52), ácido fusídico 2,0% (0).

Para los 3 ensayos se determinó que los resultados individuales de los tratamientos: placebo y no tratado, no fueron significativamente diferentes (α = 0,001). En cada ensayo se compararon los resultados individuales de los tratamientos: extracto de R. officinalis 2,3% y ácido fusídico 0,5% y se obtuvo que no fueron significativamente diferentes (α = 0,001) para el modelo de infección superficial y para el subcutáneo con una dosis, mientras que para el modelo subcutáneo con dos dosis si fueron significativamente diferentes (P<0,001).

Tabla 1. Actividad antibiótica in vivo del extracto de R. officinalis.

* Se realizó según diseño experimental A. ** Se realizó según diseño experimental B.

log10 UFC/herida

Tratamiento Modelo de infección superficial (2 dosis)*

Modelo de infección subcutáneo (2 dosis)*

Modelo de infección subcutáneo (1 dosis)**

Extracto de R. officinalis (%) 2,3 1,30 ± 0,24 2,41 ± 0,27 2,07 ± 0,08 4,6 - - - Ácido fusídico (%) 0,5 1,11 ± 0,04 1,24 ± 0,16 2,10 ± 0,07 1 - - 1,64 ± 0,03 2 - - - Placebo 4,19 ± 0,38 4,29 ± 0,30 4,01 ± 0,02 No Tratado 4,10 ± 0,35 4,23 ± 0,24 4,00 ± 0,02

( - ) Ausencia de crecimiento bacteriano. Los tratamientos fueron realizados con al menos n = 6 animales. Ácido fusídico, control positivo.


Se determinó que los resultados de los tratamientos con extracto de R. officinalis 2,3% y 4,6%, lograron ser significativamente diferentes (P<0,001) a los obtenidos con el tratamiento placebo para los tres ensayos realizados.

El extracto de R. officinalis 2,3% logra reducir entre 2-3 log10 UFC/herida según el modelo de infección y diseño experimental utilizado, logrando una acción bacteriostática sobre S. aureus (Tabla 1). Mientras que el tratamiento con extracto 4,6% logra inhibir el crecimiento bacteriano en su totalidad ejerciendo un efecto bactericida en los tres ensayos evaluados. Es importante destacar que el mismo efecto se logra por la aplicación de una única dosis en el modelo subcutáneo.

Estos resultados demuestran que el extracto vegetal presenta una acción antibiótica eficaz in vivo contra la infección de la bacteria patógena S. aureus.

CONCLUSIÓN

Los resultados evidenciaron la acción bacteriostática del extracto de R. officinalis que contiene un 2,3% de polifenoles activos y la acción bactericida del extracto que contiene un 4,6% de polifenoles activos contra la bacteria patógena S. aureus en los dos modelos de infección en piel de ratón. Además se estableció que el extracto de romero tuvo una potencia antibiótica in vivo comparable a la del ácido fusídico. Los sistemas ensayados, de carácter preclínico, aportan información científica y son útiles para la evaluación de los compuestos vegetales como potenciales drogas terapéuticas que podrían ser competentes con los antibióticos de uso común que actualmente ya no son efectivos contra las bacterias resistentes. Por dicha razón es pertinente la evaluación que hoy en día se lleva a cabo en nuestro laboratorio, sobre los mecanismos de acción de los compuestos activos que componen el extracto de R. officinalis L. y el estudio de la acción antibiótica de los bioactivos combinados con otras drogas, para aumentar su eficiencia antimicrobiana sobre un amplio espectro bacteriano.

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The effect of Minthostachys verticillata essential oil on the immune response of patients allergic to dust mites

[Efecto del aceite esencial de Minthostachys verticillata sobre la respuesta inmune de pacientes alérgicos a ácaros del polvo]

Laura CARIDDI1,*, Marina MOSER1, Melisa ANDRADA1, Mirta DEMO1, Julio ZYGADLO2, Liliana SABINI1, Ana MALDONADO1

1Department of Microbiology and Immunology, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Córdoba, Argentina 2Faculty of Exact, Physical and Natural Sciences, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina.

Abstract

The essential oil from leaves of Minthostachys verticillata was obtained by steam distillation and analyzed by gas chromatography. Peripheral blood mononuclear cells from allergic patients were stimulated with essential oil. By application of MTT or 3,(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric test the proliferation was assayed. In lymphocyte cultures CD4+, CD8+ and B cells were quantified, and in supernatants, IFN-γ and IL-13. The liberation of β-hexosaminidase enzyme was determined for basophils with essential oil added and challenged with allergen and its effects were compared with those of anti-allergic drugs. The main constituents identified were pulegone, menthone and limonene. Essential oil increased absolute values of CD4+, CD8+ and B cells (p<0.002), stimulated IFN-γ synthesis and reduced IL-13 levels. Essential oil diminished β-hexosaminidase liberation by basophils (p<0.0001), with effects majors to those of the drugs tested. Essential oil stimulated the Th1 deviation and reduced β-hexosaminidase enzyme liberation by basophils from allergic patients.

Keywords: Minthostachys verticillata; Essential oil; Immunomodulator; Basophil degranulation; β-hexosaminidase.

Resumen

El aceite esencial de hojas de M. verticillata fue obtenido por destilación en corriente de vapor y analizado por cromatografía gaseosa. Células mononucleares de sangre periférica de pacientes alérgicos, fueron estimuladas con aceite esencial. La proliferación fue ensayada mediante método colorimétrico del MTT o 3,(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide. Se cuantificaron células CD4+, CD8+ y B en cultivos de linfocitos y en sobrenadantes, IFN-γ e IL-13. Se determinó la liberación de la enzima β-hexosaminidasa de basófilos adicionados de aceite esencial, y desafiados con el alergeno. Los efectos del aceite esencial fueron comparados con los de drogas antialérgicas. Los principales constituyentes identificados fueron pulegona, mentona y limoneno. Aceite esencial incrementó los valores de células CD4+, CD8+ y B (p<0.002), estimuló la síntesis de IFN-γ y redujo los niveles de IL-13. El aceite esencial disminuyó la liberación de β-hexosaminidasa de basófilos (p<0.0001) con mayores efectos que los de las drogas ensayadas. Aceite esencial estimuló la desviación Th1 y redujo la liberación de la enzima β-hexosaminidasa de basófilos de pacientes alérgicos.

Palabras Clave: Minthostachys verticillata; Aceite esencial; Inmunomodulador; Desgranulación de basófilos; β-hexosaminidasa.

Recibido | Received: March 19, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: May 18, 2009. Publicado en Línea | Published Online: May 25, 2009 Declaración de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was supported by grants from PICTOR 8/20325 BID 1728/OC-AR, Agencia Córdoba Ciencia-Nación, Resolution #222, years 2007/09, and SeCyT, Resolution #425, years 2007/09, from Universidad Nacional de Río Cuarto and CONICET. This article must be cited as: Laura Cariddi, Marina Moser, Melisa Andrada, Mirta Demo, Julio Zygadlo, Liliana Sabini, Ana Maldonado. 2009. The effect of Minthostachys verticillata essential oil on the immune response of patients allergic to dust mites. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):224– 233. {EPub May 25, 2009}.

*Contactos | Contacts: E-mail: [email protected]; Tel.: 54-0358-4676433; Fax: 54-0358-4676231.








Cariddi et al. Immunomodulatory effects of Minthostachys verticillata essential oil


INTRODUCTION

Allergic pathologies occur at an incidence of up to 30% in the population. Allergic patients are generally treated with corticoids and/or antihistamines, which constitute the anti-inflammatory therapies of choice because they block many inflammatory routes that are abnormally activated in this type of pathology (Barnes, 2001). Nevertheless, these methods are not always effective and can produce several adverse effects. Corticoids suppress both the innate inflammatory response and cellular immunity, inhibiting synthesis of IL-1, on behalf of macrophages, and of IL-2, on behalf of T cells. A correlation has also been discovered between their anti-lymphoproliferative effects and capacity to produce apoptosis in lymphocyte populations (Winiski et al., 2007).

Antihistamines can produce diverse adverse effects such as anemia or reduced platelets, reduced white cells and bone marrow failure (Leonardi et al., 2007).

In addition, some allergic patients display no response to treatment with these drugs, which, in conjunction with the fact that this resistance has also been observed in other inflammatory diseases (Barnes, 2001), justifies the search for new immunomodulators. A quarter of the drugs used in industrialized countries are obtained from the Plant Kingdom. Current investigations aim to find plant/herbal medicines whose therapeutic indices: permit phytomedicinal application, are low-priced and do not bring about adverse reactions or undesirable indirect effects, in order to be administered as an alternative or complementary therapy for conventional treatments.

Several in vitro or in vivo investigations have demonstrated that different extracts or pure compounds derived from medicinal plants can modulate the Th1/Th2 response, towards the Th1 profile, producing a beneficial effect for allergic patients (Na et al., 2002; Ko et al., 2004; Lee et al., 2006; Park et al., 2009).

Minthostachys verticillata (Griseb.) Epling, (Labiatae) commonly referred to as ‘peperina', has a wide geographical distribution and is known for its ethno-medicinal properties. It is used as a digestive, a sedative, an anti-spasmodic, a stimulant and a bronchial-dilating agent (Ratera & Ratera, 1980).

Previous studies have revealed that the essential oil derived from this herb presents antimicrobial activity against some staphylococcal strains and antiviral properties against HSV-1, strain RC/79 of PrV and Herpes Suis Virus (Primo et al., 2001). Furthermore, in

an in vitro study carried out on patients allergic to environmental fungi, essential oil, in concentrations of mg/mL, revealed mitogenic properties similar to those of PWM on human lymphocytes (Cariddi et al., 2005), were able to stimulate CD8+ T cells, increased levels of IFN-γ and demonstrated anti-allergic properties majors to those of dexamethasone and theophylline

(Cariddi et al., 2006). The purpose of this investigation was to determine

if the essential oil from M. verticillata, at concentra-tions smaller than previously evaluated, can modulate the Th1/Th2 response in allergic patients with history of allergies and asthma, and to verify if it maintains its inhibiting properties on basophil degranulation in these patients, comparing its effects with those of conventional anti-allergic drugs.


Plant samples Green leaves and thin stems of Minthostachys

verticillata (Griseb.) Epling (Labiatae) were collected, during morning hours, from the city Santa Rosa in the Córdoba province, Argentina, in April 2004. The plant was identified by Dr. Margarita Grosso, professor in the Area of Botany of the Universidad Nacional de Río Cuarto, and a voucher specimen was stored in the RCV (Río Cuarto Vasculares) herbarium as file #1955. The morphological characterization of the plant was executed macro-and microscopically to confirm the identity of these specimens. The aerial parts of the plant were made up of the leaves and parts of the stem. The oil was isolated from the aerial parts.

Oil isolation To prepare the essential oil (EO), 60 g of ground

plant material were hydro-distilled for 3 h using a Clevenger-type apparatus, yielding 4.8% of the oil. The oil was separated from the aqueous phase, dried over anhydrous Na2SO4 and stored in the dark at -20 °C until use (Senatore, 1998). In order to perform the immunological in vitro assays, various concentrations were obtained, and the oil was emulsified in dimethylsulfoxide (DMSO) and diluted in Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) medium.

Identification and quantification of EO compounds by Gas chromatography (GC)

Quantification of components present in the oil sample was made by measuring the area under each peak of the chromatogram (Zygadlo et al., 1996;



Cariddi et al., 2007). Briefly, analytical GC was performed on a Shimadzu GC-R1A gas chromato-graph fitted with a DB5 capillary column (30 x 0.25 μm). Carrier gas N2, flow rate 1.5 mL/min, split mode. Oven temperature programmed from 40–260 ºC at 3 ºC/min. Injector temp 280 ºC. Detector used FID, temperature 300 ºC. The identification of the compounds was made comparing their retention times against standard pure drugs injected in the same conditions.

Human blood sample The sample included peripheral blood mononuclear

cells (PBMCs) and basophils from 57 allergic patients, 27 male and 30 female (ages 1 to 30, average value: 17) with positive prick tests for allergy to dust mites (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae). This study was approved by the Universidad Nacional de Río Cuarto Institutional Review Board. In accordance with ethical standards, parents of underage children were properly informed of the study and signed an agreement authorizing the test. The characteristics of these patients are shown in Table 1. Skin prick testing was performed using a standard technique (single-headed lancet technique) and standard commercial solutions (International Pharmaceutical Immunology SA). All tests were performed by a single operator, an allergist doctor. Each patient underwent skin prick testing for allergens. Saline solutions and histamine were used as negative and positive controls, respectively. The size of the wheal was measured after 15 min and a positive result was noted if the wheal size was at least 3 mm greater than the negative saline control (Barbaud 2001). The allergen extracts were provided by International Pharmaceutical Immunology, S.A. (Alicante, Spain) Dropper vials were used, containing 3 mL of the antigen extract in 50% glycerin solution, plus 0.42% phenol each (concentration = 10.000 PNU/mL). The in vitro assays were performed with the same extracts. Ten milliliters of venous peripheral blood were obtained from each patient and stored in sterile tubes containing heparin.

PBMCs cultures The effects of different concentrations (6 x 103,

600, 60, 6, 0.6, 0.06 and 0.006 μg/mL) of EO on the proliferation of lymphocyte from healthy individuals

were evaluated. A dose-response curve was construc-ted in a previous in vitro assay. EO visibly demonstrated lymphoproliferative capacity, with dose-dependency. The concentration of 6 μg/mL obtained constituted the highest Proliferation Index (PI)

PBMCs were isolated from blood samples using Ficoll-Hypaque (Hystopaque®-1077; Sigma, St. Louis, US) centrifugation. The cellular proliferation assays were carried out with the Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA). Cells (2 x 105/mL), with a final volume of 200 µl, were cultured in 96-well sterile microplates containing RPMI-1640, to which was added 25 mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 5% FCS, 50 mM 2-ME, 100 μg/mL streptomycin and 100 μg/mL penicillin (Merck). Cultures were stimulated with 10 µg/mL PHA, 5 µg/mL ConA and 6 µg/mL oil. Control lymphocyte cultures were performed using only media.

Cells were incubated during 72 h at 37 °C with 5% CO2 in a humid atmosphere. An aliquot of 100 μL of fresh RPMI-1640 and 10 μL of MTT (3,(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) solution (1 mg/mL of MTT in PBS 0.01 M pH 7.2) was added to each well and the plate was incubated at 37 °C with 5% CO2 for 4 h. After incubation, the plate was centrifuged and supernatants, removed. DMSO (50 µL) was added to each well in order to dissolve the formazan crystals that resulted from the conversion of the salt (MTT). The plate was read in a UV spectrophotometer (Labsystems Multiskan MS) at 570/690 nm wave lengths.

The cellular expansion reached by the classic mitogens was compared with that produced by EO by calculating the PI according to the following formula: PI = stimulated cells/ non-stimulated cells > 1.20

(Tuchscherer et al., 2002).

CD4+ and CD8+ T cells and B cells quantification by immunofluorescence (IF)

The CD4+ and CD8+ T cells present in the EO-stimulated cultures were counted with the indirect IF technique using anti-human CD4 and anti-human (Sigma, St. Louis, US) CD8 monoclonal antibodies (Sigma, St. Louis, US), and B cells were counted with direct IF using anti-human γ-globulin-FITC (Sigma, St. Louis, US) (Edidin, 1989).



Table 1. Characterization of select allergic patients, including: age in years, symptoms, total IgE values and skin prick testing results.

Skin prick testing with dust mite

Nº clinical history

Age (years)

Symptoms IgE (UI/mL)*

D. pteronyssinus D. farinae

5 2 As Rh 618 ++ +++ 9 5 Rh Ecz 190 +++ + 10 5 As Rh 790 +++ ++ 12 6 As Rh Sin Pr 1133 ++ +++ 13 6 As Rh 1664 ++ + 14 7 Rh, As 1236 ++ + 15 8 Rh Si 365 + + 16 8 As Rh 760 ++++ ++ 18 9 As Rh 1000 + + 20 11 Rh As 1321 ++ ++ 21 11 As Rh 786 ++ ++ 23 12 Rh Si 420 ++ ++ 27 15 Rh 460 +++ +++ 28 17 Rh Ecc 350 + + 33 19 As Rh 512 ++++ ++ 35 21 As Rh Ecz 122 + + 36 21 As Rh Ecz 122 + + 38 23 Rh Ecz 280 + + 39 23 As Rh 139 + + 41 26 As Rh 141 + + 44 27 As 512 + + 45 27 As RhEcz 123 + + 47 28 Rh Ecz 790 + + 50 29 As Ecz Rh 1560 + + 51 29 As Rh Sin Pr 1133 ++ +++ 52 29 As Rh 355 + + 53 29 Rh, As 236 ++ + 54 30 As Ecz Rh 568 + + 55 30 As Rh Sin Pr 1233 ++ +++ 56 30 As Rh 965 + + 57 30 Rh, As 1236 ++ +

As - Asthma; Rh - Rhinitis; Ecz - Eczema; Pr - Prurigo; Si - Sinusitis. D. Pteronyssinus - Dermatophagoides pteronyssinus; D. Farinae - Dermatophagoides farinae. Prick test: scale from + to ++++ according to Bousquet (1988). * IgE was measurement by ELISA Kit (Iema Well de Radim, Rome, Italy)

IFN-γ and IL-13 measurement IFN-γ and IL-13 synthesis was quantified in EO-

stimulated supernatants of PBMC cultures from allergic patients, collected at 60 h incubation to optimize the detection of cytokine levels. IFN-γ detection was performed using a commercial Human Interferon Gamma (Hu- IFN-γ) ELISA kit (PBL Biomedical Laboratories, USA) and the lower limit of detection for the cytokine assay was less than 2 pg/mL

(Kelder et al., 1986). IL-13 detection was performed using a commercial EHIL13 Human Interleukin-13 ELISA Kit (Pierce Endogen, France) and the lower limit of detection for the cytokine assay was less than 7 pg/mL (Ly et al., 2005). This assay was carried out with PBMC cultures stimulated with: a) allergen alone (a suspension of dust mite at 10.000 PNU/mL) and b)

6 μg/mL of EO, plus allergen. As a control, these cytokines were quantified in PBMC cultures with media alone. Each instance was triplicated.

β-hexosaminidase enzyme release assay The effects of different concentrations (160, 80, 40,

20, 10 and 1 μg/mL) of EO on the release of β- hexo-saminidase enzyme were evaluated constructing a dose-response curve in a previous assay. It was observed that EO reduced the levels of enzyme released in a dose-dependent way. The concentration of 10 μg/mL was that which produced the highest diminution of the release of enzyme.

Basophils of peripheral blood were obtained by density gradient using 6% of dextran 70 with NaCl 0.9%. The interphase that contained the cells was centrifuged and re-suspended in RPMI-1640. An



aliquot from the cellular suspension was taken and the cells were dyed with Toluidine Blue that it dyes only basophils. The cellular count was realized in camera Fuch Rosenthal in optical microscope. The concen-tration of basophils was increased 100 to 200 times after the treatment with dextran (from 1-2 to 128-256 cells in 64 fields). It had contamination by other PMN, such as neutrophils and eosinophils.

Fifty microliters of the basophil suspension at a concentration of 1 x 105 cells/mL were placed in each well of the 96-well microplate and pre-incubated for 15 min at 37 °C with the specific allergen alone (dust mite suspension), and the allergen plus: a) 0.04 mg/mL dexamethasone (Sidus); b) 0.2 mg/mL theophylline (Phoenix); c) 0.2 mg/mL disodium cromoglicate (Phoenix); d) 0.05 mg/mL ipratropium bromide (Altana Pharma), or e) 10 μg/mL essential oil. The negative control values were obtained using RPMI-1640 and the cells alone, without any allergen stimulation, in order to view unspecific spontaneous degranulation. In addition, montelukast (0.04 mg/mL) (Merck) was used as a negative control of β-hexosaminidase enzyme inhibition because it acts in the late phase of the allergic reaction, inhibiting leukotriene receptors. Blank values were obtained using just the media or DMSO. Following incubation, 50 μL of the chromogenic substrate for the enzyme β-hexosaminidase (4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosa-minide) (Sigma-Aldrich, Inc, St. Louis, USA) 1 mmol/L, was added to each well and dissolved in 0.1 mol/L of citrate buffer, pH 5. The system was incubated at 37 ºC for 1 h. The reaction was stopped with 200 μL of carbonate buffer 0.1 M, pH 10.5 per well. The product of the cleavage (4-nitrophenol) was interpreted by reader ELISA (Labsystems Multiskan MS) at 405 nm (Shibata et al., 1996). The percentage of β- hexosaminidase release inhibited was calculated according to the formula: Inhibition % = (A – B) x 100/A, where A is the amount of β-hexosaminidase released by basophils in the presence of the specific allergen alone and B, in the presence of the allergen aggregates from the anti-allergic drugs or oil (Na et al., 2002).

Statistical analysis All of the values obtained in the assays carried out

during this investigation were expressed in averages and standard deviation. The parameters were evaluated using the program GraphPad Prism version 4.0 (Inc. San Diego, USA, 2004) and compared with the parametric test t-Student for twin samples. Statistical

differences were considered significant when the value was p <0.05.

RESULTS

Identification and quantification of essential oil compounds

GC analysis revealed a composition not significantly different than those reported previously by the authors (Zygadlo et al., 1996; Cariddi et al., 2007). The main components were pulegone 63.0%, menthone 16.4% and limonene 1.9%, accompanied by other minor terpenoid components such as α-pinene (0.2%), β-pinene (0.3%) and 1,8-cineole (0.1%) were found in lower quantities in accordance with previous reports.

Lymphocyte response to stimulation with essential oil

EO (6 μg/mL) stimulated the proliferation of lymphocyte from allergic patients, revealing significant statistical differences in comparison with the cultures lacking stimulus (p<0.0001) and no differences when compared to PHA (p=0.1396) or ConA (p=0.1749). The PI calculated for EO, PHA or ConA, were > 1.20, indicating cellular proliferation (Fig. 1).

Absolute values of CD4+ and CD8+ T cells and B cells in cellular cultures stimulated with EO revealed an increase (p<0.002 to each one of cell types) in regard to the cultures without stimulus (Table 2).

In supernatants of EO-stimulated cultures, values of IFN-γ revealed an increase in regard to cultures without stimulus (p<0.001) and cultures stimulated with allergen alone (p<0.0001) (Fig. 2). IL-13 levels were greater in the cultures stimulated with allergen than in cultures without stimulus (p<0.0001). In allergen-stimulated cultures with EO, the levels of IL-13 were visibly reduced in regard to cultures stimulated with the allergen alone (p<0.0001) (Fig. 2).

Effects of essential oil on basophil degranulation Basophils of all the allergen-challenged patients

released high amounts of β-hexosaminidase enzyme in comparison with the values of enzyme released spontaneously (p<0.01) (Fig. 3). The anti-allergic drugs, excluding montelukast, reduced the in vitro levels of released enzyme in comparison with basophils challenged with the allergen alone (p<0.02) (Fig. 3). This result demonstrated that the plant fraction did not reveal allergenic effects in vitro. The



addition of EO to allergen-challenged basophils reduced β-hexosaminidase liberation to the same levels as those of the spontaneous release of the enzyme. The inhibiting activity of the oil at 10 μg/mL on the enzyme was higher than the one produced by standard drugs at concentrations: 0.04 mg/mL of dexa-methasone, 0.2 mg/mL of theophylline, 0.2 mg/mL of

disodium cromoglicate and 0.05mg/mL of ipratropium bromide (p<0.05 for each one) (Fig. 3). The per-centage of inhibition of β-hexosaminidase released under different treatments is shown in Table 3 and the essential oil is significantly active.

Tabla 2. Average absolute values + SD of total leukocytes from allergic patients and T CD4+, T CD8+ and B cells in cultures without stimulus (W/S) or stimulated with essential oil (EO).

W/S cultures Cultures stimulated with EO n Total leukocytes/mm3

CD4+ CD8+

B cells CD4+

CD8+

B cells

22

6432.6 + 1321,6

1677 + 65

714 + 60

705 + 57

2174 + 82

988 + 60

916 + 61

Table 3. Percentage + SD of inhibition of β-hexosaminidase enzyme release from basophils of allergic patients by anti-allergic drugs or essential oil.

Anti-allergice drugs or essential oil

n=57 dexa theo crom Ip EO

Inhibition (%) 44.8 + 8 47.6 + 10 44.7 + 7 46.9 + 5 54.2 + 7

Dexa - dexamethasone; theo - theopylline; crom - disodium cromoglicate; Ip - ipratropium bromide; EO - essential oil.

Figure 1. Proliferation of lymphocytes from allergic patients (n=57), stimulated with 6 μg/mL essential oil (EO) from M. verticillata, according to MTT colorimetric assay.

Figure 2. Quantification of IFN-γ and IL-13 in supernatants of lymphocyte cultures from allergic patients (n=38).

W/S

allerg

en

EO (6mg/m

L)W/S

allerg

en

EO (6mg/m

L) + al

lergen

0

50

100

150

200

IFN-γ

IL-13

a b

d

e

fc

conc

entr

atio

n (p

g/m

l)

allergic patients

W/S

PHA

(10

ug)

Con

A (5

ug)

EO (6

ug)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

a

b

c d

Lym

phoc

yte

prol

ifera

tion

(OD

570

/690

nm

)

IFN-γ was quantified in lymphocyte cultures without stimulus or stimulated with 6 μg/mL essential oil (EO) from M. verticillata. IL-13 was quantified in lymphocyte cultures without stimulus, stimulated with allergen alone or stimulated with allergen and with 6 μg/mL EO from M. verticillata added. W/S, without stimuli; a vs b p= 0.1332; a vs c p<0.001; b vs c p<0.0001, d vs e p<0.0001; d vs f p<0.0001, e vs f p<0.0001.

PHA (10 μg/mL) or ConA (5 μg/mL) were used as positive controls of proliferation, and lymphocyte cultures without stimulus, as negative controls. W/S, without stimuli; a vs d p < 0.0001; b vs d p = 0.1396; c vs d p = 0.1749; PI (PHA) = 1.81 + 0.12; PI (ConA) = 1.90 + 0.11; PI (EO) = 1.87 + 0.10


Figure 3. The amount of β-hexosaminidase enzyme released by allergen-challenged basophils from allergic patients (n=57) was reduced by essential oil (EO) and several anti-allergic drugs, excluding montelukast.

blank

DMSO

basophils

bas +

EO

bas +

allerg

bas+a

llerg

+dex

a

bas+a

llerg

+theo

bas+a

llerg

+cro

m

bas+a

llerg

+iprat

bas+a

llerg

+EO

bas+a

llerg

+ mont

0

10

20

30

40

50

60

70

80

ab

c

d fe g

h

i

*

β-h

exos

amin

idas

e re

leas

ed (%

)

Basophils were incubated with EO alone, without allergen, and no significant liberation of the enzyme was observed. Cells without the addition of allergen and cells with addition of dimethylsulfoxide (DMSO) were also evaluated as controls.

a vs c p< 0.0001; a vs b p = 0.3373; b vs c p <0.002; c vs d p < 0.01; c vs e p < 0.002; c vs f p< 0.01; c vs g p < 0.002; c vs h p < 0.0001; c vs i p = 0.8245; h vs * p = ns; h vs i p<0.0001; d vs i p < 0.01; e vs i p< 0.002; f vs i p< 0.02; g vs i p<0.003.

blank, media alone; DMSO, dimethylsulfoxide; bas, basophils; allerg, allergen ; dexa, dexamethasone ; theo, theopylline ; crom, disodium cromoglicate; iprat, ipratropium bromide; EO, essential oil; mont, montelukast

DISCUSSION

In the present study, the essential oil from M. verticillata was composed mainly by mono-and sesquiterpenes. Zygadlo et al. (1996) analyzed oils of M. verticillata of different geographic areas from Argentina. They found that the main components are terpenes and seem to be divided in three chemotypes: carvone, thymol-carvacrol and predominantly pulegone-menthone. Our results agree those of De Feo et al. (1998), González Pereyra et al. (2005), Cariddi et al. (2007), Maldonado et al. (2007), who studied M. verticillata oil and reported the composition.

At optimal concentrations, EO from M. verticillata was able to stimulate in vitro the lymphocyte proliferation in patients allergic to dust mites with effects similar to those of PHA or ConA. These lectins bond specifically to carbohydrate components, including proteins of the TcR-CD3 complex. This produces the activation of several

types of enzymatic routes which involve Ras-Map kinases, calcium-dependent PLCγl and PLCγl–DAG, key participants in cellular proliferation, differen-tiation and apoptosis (Crespo & Gutkind, 2004).

According to some authors in vitro studies of allergic patients have shown increased values of CD4+ T cells (1500-1750 cells/mm3), differentiating towards the Th2 profile; a decrease in CD8+ T cells (370-520 cells/mm3) (Bratke et al., 2006) and high values of B cells (480-650 cells/mm3) (Mohamed et al., 2003) in comparison with non-allergic individuals. In this study EO (6 μg/mL) increased in vitro absolute values for both T CD4+ and CD8+ cells subpopulations in patients allergic to dust mites, indicating that this plant fraction stimulated cellular immunity. These data are compatible with those from a previous in vitro study in which high EO concentrations (mg/mL) increased values of CD8+ T cells in both patients allergic to environmental fungi and healthy individuals alike (Cariddi et al., 2006).

The EO also increasing the absolute values of B cells. Previously we demonstrated that EO had effects similar to those of PWM, mitogen of B and T cells, on lymphocyte proliferation in both allergic and healthy individuals (Cariddi et al., 2005). These results correspond with those of this investigation, where we demonstrated that EO was able to stimulate both T and B cells.

Treatment with the EO increased the levels of IFN-γ, which is why it is suggested that the EO-ac-tivated CD4+ T cells in this study could be Th1 cells, which produce IFN-γ. EO was able to stimulate in vitro CD8+ T cells as well, also producers of IFN-γ. In addition, we observed that EO reduced IL-13 values in lymphocyte cultures co-stimulated with the allergen, as compared to cultures stimulated with allergen alone. These data demonstrated that EO mo-dulated the in vitro Th1/Th2 response, favoring Th1 deviation. Anti-allergic therapies aim to redirect the profile of Th2 cells towards Th1, increasing IFN-γ synthesis and decreasing IL-4 and IL-13 values, thus reducing IgE levels (Bang & Plosker, 2004). It was confirmed that the vegetal derivative acts on the immune response by means of the stimulation of the Th1 profile. In previous studies this was deduced of the cuantification of IFN-γ and LT CD8+ (Cariddi et al., 2006, 2007; Maldonado et al., 2007).

β-hexosaminidase, an acid hydrolase, is released along with histamine when basophils are activated. Therefore, β-hexosaminidase is accepted as a degranulation marker (Shibata & Yagi, 1996).




During the β-hexosaminidase enzyme release assay, we confirmed that the anti-allergic drugs tested, excluding montelukast, were able to reduce the levels of enzyme released, as compared to basophils challenged with allergen alone. Dexamethasone, in addition to bonding to the cytoplasmic specific receptor that enters the nucleus and attaches itself to the DNA, works by stimulating cAMP production, inhibiting the degranulation process in basophils and mast cells (Fukui, 2008). Theophylline acts as inhibitor of phosphodiesterase. This enzyme deactivates cAMP forming icAMP, which favors cell degranulation (Lipworth, 2005). Cromoglycate is a basophil and mast cell membrane stabilizer, as it prevents their degranulation (Gotua et al., 2008). Ipratropium inhibits the liberation of chemical mediators, increased by acetylcholine, by blocking cholinergic receptors on the surface of basophils and mast cells (Spooner et al., 2003). In contrast, montelukast, a leukotriene receptor antagonist (Kawai et al., 2008), which was used in this study as a negative control for inhibition of the immediate reaction, did not decrease the levels of β-hexosaminidase released by basophils challenged with allergen, as expected in this model.

EO, at a concentration of 10 μg/mL, reduced the levels of β-hexosaminidase released by basophils, with effects majors to the anti-allergic drugs tested, excluding montelukast, which is why it has been suggested that this plant fraction could act upon cell membranes with a mechanism similar to that of one of these drugs. These results demonstrated that EO maintained its inhibiting properties on basophil degranulation at high (Cariddi et al., 2006) and small concentrations alike.

Some of main components of EO identified by GC could be responsible for its biological activity. Numerous investigations demonstrate the protective effects of terpenes on cell membranes. These substances also carry out a regulating activity on T cells, the synthesis of cytokines and inhibition of the apoptosis processes (Yeh et al., 2006; Ashibe et al., 2007).

Essential oils are complex mixtures of numerous molecules and their biological effects are the result of a synergy between all of them or the reflection of main molecules present at high levels according to analysis by GC (Bakkali et al., 2008).

According to the aforementioned, EO could have displayed protective effects on cell membranes when added to the basophils. This indicates that the

increase in basophil membrane permeability may be an essential trigger for the release of β-hexo-saminidase. The terpenes from EO may have acted upon basophil membranes, avoiding the disturbance induced by the specific allergen. There would not be modifications related at least to types of allergens both tried (fungi and dust mite) (González Pereyra et al., 2005; Cariddi et al., 2006, 2007; Maldonado et al., 2007). Moreover the active concentrations seem to be much lower than previously thought, as this work found activity in the range 6 mg/ml at 0.006 µg/mL, in contrast with our previous tests at only 150 mg/mL (Cariddi et al., 2005).

CONCLUSION

The EO from leaves of Minthostachys verticillata at small concentrations acted as a mitogen, increasing proliferation of T and B cells from allergic patients. As an immunomodulator, it favored Th1 deviation by increasing IFN-γ synthesis and decreasing IL-13 pro-duction. EO maintained its inhibiting effects on baso-phil degranulation, reducing the levels of β-hexo-saminidase released.

Additional studies are being realized along the same line of investigation to reveal if the terpenes identified can have therapeutic applications in allergies. In the future, these products could be applied in alternative or complementary therapies with patients who do not respond to conventional treatment.

ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Mónica Wagner for the English version.

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Comunicación | Communication

Actividad repelente de los extractos hexánicos y etanólicos de frutos de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) sobre adultos de Blattella

germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae)* [Repellent activity of hexanic and ethanolic extracts from fruits of Solanum eleagnifolium (Solanaceae) against

Blattella germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae) adults]

Carolina SÁNCHEZ CHOPA1,2, Verónica BENZI1,2, Raúl ALZOGARAY3 y Adriana A. FERRERO1 1Depto de Biología, Bioquímica y Farmacia. UNS. San Juan 670, Bahía Blanca, Argentina.

2Becario CONICET. 3Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CITEFA/CONICET). Villa Martelli, Bs. As, Argentina.

Abstract

Plant extracts have been used all over the world as an alternative method to control pests. Hexanic and ethanolic extracts from fruits of Solanum eleagnifolium were tested for repellent activity against adult males of Blattella germanica in a choice-test arena. Half of a circular filter paper (9 cm diameter) was treated with the hexanic and ethanolic extracts (50, 100 and 150 mg/mL) and the other half only with the solvents. The activity of the extracts was compared to DEET. The repellency response to S. eleagnifolium extracts was significantly different from the control at all concentration. In both cases, the lowest concentration produced the same IR = 0.93 at one hour. At 24 h, hexanic extract at 50 mg/mL produced the higest effect (IR = 0.9).The response of the cockroaches to both extracts did not differed from DEET. Both extracts could be use for the control of B. germanica.

Keywords: Plant extracts; Repellency; Blattella germanica; Solanum eleagnifolium.

Resumen

Los extractos vegetales cobraron importancia como método alternativo para el control de insectos-plaga. El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto repelente de extractos héxanicos y etanólicos de frutos de Solanum eleagnifolum en adultos de Blattella germanica. Mitades de discos de papel de filtro (9 cm diámetro) fueron rociadas con soluciones de los extractos (50, 100 y 150 mg/mL) y la otra mitad con solvente solo. Como control positivo se utilizó DEET. El efecto repelente de ambos extractos fue significativamente distinto del control a todas las concentraciones. A la menor concentración, ambos extractos produjeron a la hora el mismo IR = 0,93. A las 24 h el extracto hexánico de frutos a la menor concentración produjo la mayor repelencia (IR = 0,9). La respuesta de las cucarachas a los dos extractos empleados no difirió del DEET. Ambos extractos podrían usarse en el control de B. germanica.

Palabras Clave: Extractos vegetales; repelencia; Blattella germanica; Solanum eleagnifolium.

Recibido | Received: December 23, 2008. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 10, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009. Declaración de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiación | Funding: This work was financed by SECyT-UNS and CONICET, Argentina. This article must be cited as: Carolina Sánchez Chopa, Verónica Benzi, Raúl Alzogaray y Adriana A. Ferrero. 2009. Actividad repelente de los extractos de hexánicos y etanólicos de frutos de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) en adultos de Blattella germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):172 – 175. {EPub April 10, 2009}.

*Contacto | Contact: [email protected]


* Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotánica. Enero de 2009, Chillán, Chile.






Sánchez Chopa et al. Actividad repelente de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) contra Blattella germanica


INTRODUCCIÓN

La cucaracha Blattella germanica (L.) (Dictyoptera, Blattellidae) es de suma importancia para la salud humana debido a que actúa como vector mecánico de agentes patógenos y sus secreciones, heces y regurgitaciones causan reacciones alérgicas en personas sensibles (Chang & Anh, 2001). Además, esta plaga es cosmopolita y de gran abundancia dentro de los hogares ocasionando no solo los problemas mencionados anteriormente sino también pérdidas y daños en una gran variedad de productos alimenticios almacenados (Appel & Mack, 1989).

En estos últimos años se ha puesto énfasis en la búsqueda de métodos alternativos de control a los insecticidas sintéticos debido a los problemas ambientales, a la salud humana así como al fenómeno de resistencia que generan estos (WHO, 1999; Pridgeon & Liu, 2003; Limoee et al., 2007). Dentro de estos métodos alternativos se encuentran las sustancias derivadas de plantas como aceites esenciales o extractos vegetales con marcada repelencia que se han estudiado sobre B. germanica (Appel & Mack, 1989; Peterson et al., 2002a,b; Sánchez Chopa et al., 2006; Ferrero et al., 2007). El objetivo de nuestro trabajo fue evaluar la repelencia de los extractos hexánico y etanólico de frutos de Solanum eleagnifolium (L.) (Solanaceae) sobre machos adultos de B. germanica y comparar dicha repelencia con la ocasionada por el DEET.


Obtención de los extractos Los extractos polares y no polares de los frutos de

S. eleagnifolium se obtuvieron por maceración (extracción en frío) del material vegetal fresco. La muestra de material vegetal se extrajo sucesivamente con hexano y etanol. Los solventes orgánicos fueron evaporados a presión reducida y se obtuvieron los extractos hexánico y etanólico de frutos. Estos extractos se almacenaron a 5 ºC hasta el momento de su utilización.

Insectos Los machos adultos de B. germanica utilizados

provinieron de una colonia criada en el Laboratorio de Zoología de Invertebrados II, Universidad Nacional del Sur (Bahía Blanca, Argentina). Todos los insectos se mantuvieron en condiciones fijas de temperatura y

humedad relativa ambiente (25º C y 60-70% de humedad relativa) y fotoperíodo 0L:24O. Los ejemplares se alimentaron con dieta artificial.

Actividad repelente Se usó la prueba de preferencia descripta por

Scheffler y Dombrowski (1992). Discos de papel de filtro de 9 cm de diámetro se dividieron en dos mitades. Una de las mitades se roció con 0,5 mL de solución hexánica o etanólica de los extractos; la otra, con solvente solo. Se trabajó con tres concentraciones de cada extracto: 50, 100 y 150 mg/mL. Se dejó evaporar el solvente y los papeles fueron colocados en el fondo de cajas de Petri. En los controles, una de las mitades se roció con el solvente correspondiente y la otra mitad no recibió tratamiento alguno. Como control positivo se utilizó dietiltoluamida (DEET, N, N dietil-m-toluamida, pureza 98%, Aldrich, Milwaukee, USA) un conocido repelente de insectos de amplio espectro, en las mismas concentraciones empleadas en los extractos. Grupos de diez insectos se liberaron en el centro de las cajas de Petri y se registró su ubicación sobre los discos de papel 1 y 24 h después del comienzo del experimento. Finalmente se calculó el Índice de Repelencia (IR = NT / T; donde NT es la cantidad de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T es el número total de insectos). Los datos fueron analizados mediante análisis de varianza ANOVA y las medias de cada concentración se compararon mediante la prueba de diferencias mínimas (DMS, p<0,05).

RESULTADOS

Todas las concentraciones de los extractos hexánicos y etanólicos frutos de S. eleagnifolium tanto a la hora como a las 24 h produjeron repelencia en B. germanica significativamente diferente del control (DMS, p<0,05).

A la menor concentración (50 mg/mL), ambos extractos produjeron el mismo efecto repelente a la hora con un IR de 0,93. Este efecto repelente no se diferenció significativamente de la repelencia ocasionada por el DEET (DMS, p>0,05) (Fig. 1).

A las 24 h el extracto hexánico de frutos a la menor concentración evaluada produjo la mayor repelencia con un IR = 0,9 y no se hallaron diferencias significativas entre este extracto y el resto de los compuestos utilizados (DMS, p>0,05) (Fig. 2).


Figura 1. Índice de Repelencia a la hora de los extractos hexánico y etanólico de frutos de S. eleagnifolium y de DEET sobre machos adultos de B. germanica.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Control 50 100 150

Concentraciones (mg/mL)

Indi

ce d

e R

epel

enci

a (N

T/T

)

Control Fruto Hexano Fruto Etanol DEET

bbbb b b b b b

a

NT/T: NT: número de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T: número total de insectos. Cada valor es la media de tres réplicas independientes (n=10). Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente (DMS, p>0,05)

Figura 2. Índice de Repelencia a las 24 horas de los extractos hexánico y etanólico de frutos de S. eleagnifolium y de DEET sobre machos adultos de B. germanica.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Control 50 100 150

Concentraciones (mg/mL)

Indi

ce d

e re

pele

ncia

(NT

/T)


Control Fruto Hexano Fruto Etanol DEET

a

bb

bb b

b b b b

NT/T: NT: número de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T: número total de insectos. Cada valor es la media de tres réplicas independientes (N=10) Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente (DMS, p>0,05)


DISCUSIÓN

Varios autores han demostrado que ciertos extractos botánicos o aceites esenciales derivados de plantas poseen efecto repelente sobre B. germanica (Appel & Mack, 1989; Peterson et al., 2002a,b; Sánchez Chopa et al., 2006; Ferrero et al., 2007). Los resultados presentes indican que los extractos hexánico y etanólico de frutos de S. eleagnifolium producen un gran efecto repelente sobre B. germanica y este se mantiene a lo largo del tiempo. Scheffler & Dombrowski (1992) usando extractos etanólicos de diferentes familias de plantas a concentraciones de 500, 700 y 960 mg/mL encontraron considerables fluctuaciones del efecto repelente de estas. En nuestro estudio con menores concentraciones (50, 100 y 150 mg/mL), se obtuvieron siempre efectos repelentes.

CONCLUSION

Los extractos hexánico y etanólico de S. eleagnifolium podrían incluirse en el manejo integrado de B. germanica al producir barreras de exclusión para la entrada y establecimiento de esta plaga en áreas de difícil tratamiento.

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Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle (Anacardiaceae) y Tagetes terniflora (Asteraceae) sobre adultos de Pediculus humanus capitis

(Insecta; Anoplura; Pediculidae)* [Fumigant activity of essential oils of Schinus molle (Anacardiaceae) and Tagetes terniflora (Asteraceae)

against adults of Pediculus humanus capitis (Insecta; Anoplura; Pediculidae)]

María M. GUTIÉRREZ1, Natalia STEFANAZZI1,2, Jorge WERDIN GONZÁLEZ1,2, Verónica BENZI1,2, Adriana A. FERRERO1 1Dpto de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670, (8000) Bahía Blanca, Argentina.

2Becario CONICET

Abstract

Dried leaves of each species were hydrodistilled. The bioassays were performed at 28 ± 2 ºC, 65% ± 5 RH and in darkness. Each experimental unit consisted of a glass Petri dish (5cm diameter) containing 50 µL of the essentials oils on a micro coverglass. Then, it was covered with a lid with a fine wire sieve attached over the central hole. Batches of 10 adults were placed over the sieve. Each unit was then covered with another Petri dish. Control units were the same but without addition of any substance. All treatmentes wre replicated three times. The percentage of knockdown was evaluated every 5 min for one hour. The KT50 value was calculated by probit analysis. The results showed that the KT50 for Schinus molle was 12.75 min and for Tagetes terniflora was 23.44. Both essential oils could be considered for the control of Pediculus humanus capitis.

Keywords: Essential oils; Pediculus humanus capitis; Fumigant toxicity.

Resumen

Los aceites esenciales de hojas se aislaron por hidrodestilación. Los bioensayos se realizaron a 28 ± 2 ºC, 65% ± 5 H.R y en oscuridad. Se utilizaron cajas de Petri de vidrio (5cm de diámetro), en sus bases se colocaron 50 µL de los aceites puros. La caja se cubrió con una tapa plástica perforada que posee un tejido de hilo. Sobre este se liberaron 10 insectos protegidos por una segunda caja con diámetro equivalente. El conjunto de cajas se cerró con cinta adhesiva. Se realizaron tres réplicas por tratamiento. Como control se utilizaron cajas sin aceites. El porcentaje de volteo se evaluó cada 5 minutos durante una hora. Se calculó el TV50 por un análisis Probit. El TV50 fue 12,75 min para el aceite de Schinus molle y para el de Tagetes terniflora de 23,44 min. Ambos aceites podrían ser utilizados para el control de Pediculus humanus capitis.

Palabras Clave: Aceites esenciales; Pediculus humanus capitis; Toxicidad fumigante

Recibido | Received: December 23, 2008. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 10, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009. Declaración de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiación | Funding: This work was financed by SECyT-UNS y CONICET, Argentina. This article must be cited as: María M. Gutiérrez, Natalia Stefanazzi, Jorge Werdin González, Verónica Benzi, Adriana A. Ferrero. 2009. Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle (Anacardiaceae) y Tagetes terniflora (Asteraceae) en adultos de Pediculus humanus capitis (Insecta; Anoplura; Pediculidae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):176 – 179. {EPub April 10, 2009}.

*Contacto | Contact: [email protected]








Gutiérrez et al. Actividad fumigante de Schinus molle y Tagetes terniflora contra Pediculus humanus capitis


INTRODUCCIÓN

Pediculus humanus capitis De Geer (piojo de la cabeza), agente causal de la Pediculosis capitis, es un ectoparásito obligado del hombre confinado a los pelos del cuero cabelludo (Ko y Elston, 2004). Es un insecto cosmopolita que afecta a individuos de todos las edades, sexos, razas y niveles socioeconómicos (Burkhart y Burkhart, 2005).

El control químico de esta plaga comenzó en la década del 40 utilizando DDT y ha continuado a nivel mundial con insecticidas organoclorados y piretroides. Actualmente el uso de estos compuestos está limitado por el desarrollo de resistencia (Picollo et al., 2000; Vassena et al., 2003; Burgess, 2004).

En contraposición a los insecticidas antes mencionados, los insecticidas naturales basados en aceites esenciales representan una alternativa interesante en el control de insectos-plaga. Entre sus efectos biológicos podemos mencionar la toxicidad por contacto y fumigante, la repelencia, las alteraciones en la fisiología nutricional y el efecto fagodisuasivo (Yang et al., 2005; Sánchez Chopa et al., 2006; Stefanazzi et al., 2006; Werdin González et al., 2008). Por otra parte se ha demostrado que los aceites esenciales tienen acción neurotóxica, citotóxica, fototóxica, mutagénica, etc. sobre distintos organismos (Isman, 2000; Bakkali et al., 2008). Debido a los múltiples blancos sobre los cuales el aceite esencial puede actuar, la posibilidad de desarrollar el fenómeno de resistencia en insectos resulta poco probable.

El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad fumigante de los aceites esenciales de hojas de Schinus molle L. (Anacardiacea) y Tagetes terniflora Kunth (Asteraceae) en adultos de Pediculus humanus capitis.


Obtención de los aceites esenciales Las hojas de S. molle y T. terniflora se recolectaron

durante la época estival en la ciudad de Bahía Blanca, Buenos Aires, y en la ciudad de Salta, Salta, Argentina. Los aceites esenciales se aislaron a partir de material vegetal fresco, por destilación por arrastre de vapor de agua en un aparato tipo Clevenger durante 3 a 4 h, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se

almacenaron en oscuridad a 4º C. Los mismos se analizaron por Cromatografía Gaseosa y Espectrometría de Masas.

Recolección de P.h. capitis Los piojos fueron recolectados de cabezas de niños

infestados de entre 3 a 6 años de edad pertenecientes a instituciones educativas de la ciudad de Bahía Blanca, provincia de Buenos Aires, Argentina siguiendo el protocolo de Picollo et al. (1998).

Bioensayo Se utilizaron cajas de Petri de vidrio de 5,5 cm de

diámetro por 1 cm de altura. En la base de la caja se colocó un cubreobjeto de 18 x 18 mm con 50 µL del aceite esencial puro. Al control no se le adicionó sustancia alguna. Cada caja se cubrió con una tapa con un orificio central recubierta con un tejido de hilo para permitir la circulación de aire; sobre este tejido se liberaron 10 insectos protegidos por una segunda caja de diámetro equivalente para evitar su fuga. El conjunto de cajas fue herméticamente sellado con cinta adhesiva a fin de constituir una cámara fumigante. Cada tratamiento se repitió 3 veces. Se observó el porcentaje de volteo cada 5 min durante una hora. Se calculó el parámetro TV50 (tiempo de volteo) utilizando el programa Micro Probit 3.0. El modelo de regresión fue verificado usando el estadístico Chi-cuadrado.


La evaluación del porcentaje de volteo es un buen estimador de la potencialidad de un compuesto químico para actuar como pediculicida debido a que estos productos deben poseer acción potente sobre el parásito en el menor tiempo de exposición posible sobre el hospedador. Los aceites esenciales de hojas de Schinus molle y Tagetes terniflora produjeron actividad de volteo dependiente del tiempo de exposición en Pediculus humanus capitis.

El aceite esencial de T. terniflora produjo a los 5 min de exposición un 6% de volteo. A los 60 min de exposición este aceite provocó un 80% de actividad (Fig. 1). El TV50 fue de 23.44 min (Tabla 1). Stefanazzi et al. (2006) al ensayar este aceite en adultos y larvas de Tribolium castaneum no observaron efecto fumigante.


Figura 1. Actividad fumigante de los aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora sobre Pediculus humanus capitis.

Tabla 1: Actividad fumigante de los aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora en Pediculus humanus capitis.

Aceite TV50 (min) I.C. a b (E.E) b

Schinus molle 12,75 5,44 – 17,51 6,34 (0,68)

Tagetes terniflora 23,44 20,22 – 27,00 2,90 (0,47)

a: Intervalos de Confianza del 95% b: Pendiente de la recta de regresión (error estándar) TV: Tiempo de volteo

El aceite esencial de S. molle produjo a los 5 min

de exposición un porcentaje de volteo superior al 35% mientras que a los 35 min provocó un 100% de actividad ((Tabla 1). El TV50 fue de 12.75 min (Tabla 1). Toloza et al. (2006) utilizando aceite esencial de esta especie sobre P. h. capitis demostraron que el TV50 fue de 40.40 min. Estas diferencias podrían deberse a variaciones en la composición química del aceite esencial influenciadas por las condiciones biogeográficas.

CONCLUSION

Los aceites esenciales de hojas de Schinus molle y Tagetes terniflora podrían ser utilizados en el control de Pediculus humanus capitis.

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Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mágico-religiosos en comunidades del Pacífico colombiano norte*

[Traditional knowledge of vegetable species used with magic-religious purpose in communities of the Northern Colombian Pacific]

Nayive PINO BENÍTEZ y Giovanni RAMÍREZ

Universidad Tecnológica del Chocó, Bloque 6, Laboratorio 316, Grupo de Productos Naturales, Quibdó-Chocó, Colombia.

Abstract

To know about effective medicinal plants and to know about the existence of a power that involves forces that are above the human understanding, it is to know about plants with magic-religious uses. Their methodological framework is based on the exchange of experiences of faith healers that for more than 15 years have been working on this occupation, registrations in database Spica, of the “herbarium CHOCÓ” and bibliographical revisions. They were 129 species contained in 91 genders and 53 families, being the most representative Piperaceae 19 spp (15%) followed by Lamiaceae 10 spp (8%). According to the use purpose they are classified in 3 subcategories: beneficent, malicious and rituals.

Keywords: Traditional medicine; Magic-religious plants; Piperaceae; Lamiaceae.

Resumen

Conocer sobre plantas medicinales eficaces y sobre la existencia de un poder que entraña fuerzas que están por encima de la comprensión humana, es conocer de plantas con usos mágico-religiosos. Su marco metodológico se fundamenta en el intercambio de experiencias con curanderos que por más de 15 años vienen ejerciendo este oficio, registros en Base de datos Spica, del herbario “CHOCÓ” y revisiones bibliográficas. Resultaron 129 especies agrupadas en 91 géneros y 53 familias, siendo la más representativa Piperaceae 19 spp (15%) seguida de Lamiaceae 10 spp (8%). Según la finalidad de uso se clasifican en 3 subcategorías: benéficas, maléficas y rituales.

Palabras Clave: Medicina tradicional, Plantas mágico-religiosas, Piperaceae, Lamiaceae.

Recibido | Received: March 1, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 7, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009. Declaración de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiación | Funding: This work was financed by UTCH (Cod. 019) This article must be cited as: Nayive Pino Benítez y Giovanni Ramírez. 2009. Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mágico-religiosos en comunidades del Pacífico colombiano norte. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):182 – 183. {EPub April 10, 2009}.

*Contacto | Contact: E-mail: [email protected], Tel, 57 3104559617, Fax: 57 46712492








Benzi et al. Efecto insecticida de dos especies de Aloysia (Verbenaceae) sobre Rhizopertha dominica


INTRODUCCIÓN

Esta investigación muestra resultados del proyecto “Especies útiles del departamento del Chocó”, ejecutado en el marco de las investigaciones del grupo Productos Naturales, busca corroborar, que el conocimiento y aplicación que algunos pobladores del pacífico colombiano norte, han dado a través del tiempo a las plantas, obedece a una gran experiencia empírica obtenida a través de generaciones sucesivas, la cual, se desarrolla bajo estricta confidencialidad y dedicación para el aprendizaje de dicho conocimiento. La medicina tradicional de los curanderos herbolarios del Pacífico colombiano, ha coexistido con un conocimiento de las plantas medicinales eficaces que entrañan ciertas fuerzas que están por encima de la comprensión humana y la creencia de un poder Divino (religioso) o sobrenatural que le da un carácter mágico. Hablar de plantas con uso mágico-religioso es hablar de plantas que pueden ser utilizadas con fines curativos, de prosperidad, de hechicería, de tramas u otros, que para su efectividad requieren el empleo de secretos, rezos, cantos u oraciones, técnicas que ejercen fuerzas ocultas o ritos de invocación de espíritus, las cuales favorecen el acto de curar o dañar, puesto que pueden ser utilizadas con fines bondadosos o malignos.


El marco metodológico se fundamenta en el intercambio de experiencias con curanderos que por más de 15 años vienen ejerciendo este oficio, realizado por observación directa en campo; registros en la base de datos Spica del herbario CHOCÓ, iniciadas desde 1983 y reportes bibliográficos para la región. En campo se visitaron 12 comunidades de cinco municipios (Atrato, Certeguí, Itsmina, Quibdó y Unión Panamericana) del pacífico colombiano norte, socialización a los miembros de las comunidades, teniendo en cuenta lineamientos para el trabajo tal como lo propone Phillips & Gentry (1993), mediante talleres y presentaciones orales donde se genera un espacio de discusión sobre el desarrollo del mismo, lo que permite participación activa, previamente al aval de los miembros de los consejos comunitarios y autoridades locales tal como lo reza la ley 70/93 o ley de las comunidades negras. Las entrevistas se diseñaron con base a las interacciones estructuradas sugeridas por TRAMIL (Weniger y Robineau, 1988). Fueron seleccionados 20 curanderos, a los cuales se les

tomó testimonios, vivencias y datos biográficos en cintas de video y magnetofónicas. Para la identificación de las especies inicialmente se llevó a cabo en el herbario CHOCÓ, para posteriormente ser corroboradas o determinadas en el herbario nacional colombiano COL del instituto de ciencias naturales de la universidad nacional de Colombia.


Pegue aquí el texto. Se registran 129 especies, 128 determinadas a Familia y Género, y 115 a especie, agrupadas en 91 géneros y 53 familias, de las cuales 50 familias pertenecen a Magnoliophyta y 3 a Pteridophyta, siendo las más representativas en número de especies las Piperaceae 19 spp (15%), seguida de Lamiaceae 8% (10 spp), Asteraceae, Gesneriaceae y Leguminosae 7spp c/u (5%), Acanthaceae 6 spp (5%) y Liliaceae y Solanaceae 4 spp c/u (3%), observados en la Fig. 1, en la Fig. 2, se registran los géneros con mayor número de especies usados con fines mágico-religiosos. Según la finalidad de uso se clasifican en 3 subcategorías: benéficas (94), maléficas (31) y rituales (13), solo 9 especies comparten en más de una subcategoría.

El conocimiento que poseen estas comunidades es tratado como un tesoro, al que consideran sagrado, el cual no permiten que quede en manos de alguien que no esté lo suficientemente preparado para ello, de los 20 curanderos 12 aprendieron desde niños a conocer y trabajar con las plantas, constituyéndose en el relevo generacional de sus antepasados, otros 4 dicen haber obtenido el conocimiento siendo ya adultos de espíritus (ánimas) y los últimos 4 aprendieron de otros adultos (indígenas y/o negros), de los cuales solo uno ya había transmitido su conocimiento a un heredero, el resto manifestaron no haber encontrado la persona idónea aduciendo que aun no estaban preparados para salvaguardar su conocimiento; en dichas acciones no se visualizan actos de egoísmo, ellos consideran que la juventud actual no está por aprender este tipo de saber. Resulta preocupante la forma acelerada como se pierde el saber, a la fecha han fallecido 7 curanderos y de los 13 restantes la mayoría son anágrafos con edades entre los 60 años hasta mayores de 90.

En poblaciones como las del pacífico colombiano el concepto de cultura se entiende fácilmente cuando se estudian etnociencias como la etnobotánica, que es una aproximación a las formas de vida de los grupos étnicos, donde se involucran las visiones culturales como la relación hombre-planta; lo anterior hace parte de lo que hoy conocemos como etnobiología, la cual



es entendida aquí, en el sentido que le dio Castetter (1944) inventor del término, “conjunto formado por la etnobotánica y la etnozoología”, en realidad se la podría considerar como la que trata del saber popular en materia de historia natural. Lo anterior concuerda con Acosta et al. (1997), cuando menciona que el conocimiento de una cultura en una sociedad, comprende, entre otros aspectos, el análisis de las costumbres, las creencias, la forma de percibir el mundo y las ideas mágico-religiosas, que forman parte de su realidad. En la concepción que el hombre ha tenido sobre la enfermedad, sus causas, sus formas de prevención y curación, se identifican 3 tipos de conocimientos: el mágico- religioso, el empírico y el científico. Lemos (1998) enmarcó la visión mágico- religiosa de la naturaleza, como el territorio o escenario ritual con connotaciones no solo naturales sino también culturales, menciona que la selva, el

monte, el río son espacios habitados por los espíritus, las divinidades y los ancestros, aunque se trata de poblaciones afrobrasileras, al igual que los pobladores del pacífico colombiano en su mayoría afrocolombianos, piensan que allí están presentes las fuerzas naturales y sobrenaturales con quienes es preciso mantener un diálogo, a quienes hay que tener en cuenta y pedir su permiso a la hora de intervenir. Aunque existe esta convivencia en la región, no existen suficientes trabajos publicados en ese sentido, aunque existen reportes de estudios sociológicos donde se hace alusión (Velásquez, 1961; Córdoba, 1983; Echavarría, 1999, 2000). En otros registros etnobotánicos como lo citan Duke (1970, 1975), Forero-Pinto (1980), Cayón y Aristizábal (1980), García (1995), Mahecha (1994), Giraldo (1995), Gómez (1996), Medina y Medina (1999), Pino-Benítez (2000). Recientemente Pino-Benítez (2008).

Figura 1. Familias de plantas usadas como mágico-religiosa en el Pacífico colombiano norte.

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Figura 2: Géneros más representativos registrado en plantas con fines mágico-religioso.



CONCLUSION

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REFERENCIAS o G, Llano AM, Valencia S,

Cast ”. Am

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Pino das con fines mágico-

Pino antas

Velá 61. Apuntes Socioeconómicos del Atrato

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Los pobladores del pacífico colombiente, tienen como eje central la selva que a la vez

se convierte no solo en la despensa para conseguir el sustento diario, sino también, en su templo o sagrario, sitio donde relajan su espíritu y se llenan de sabiduría, especialmente curanderos que además de usar las plantas en tratamientos para enfermedades del cuerpo, refiriéndose a enfermedades naturales, también las usan para curar enfermedades adquiridas por males (maleficios, hechizos o hechicería), y al igual que los médicos ortodoxos se especializan en la cura de un solo tipo de enfermedad, es por ello que se puede encontrar curanderos para: tramas, cogida del rastro, tamborito, locura, mordeduras de serpientes, mal de ojo, males de nacimiento (mal de ombligo o mal de los 8 días, mal de baba o mal de los 13 días y mal de los 40 días); las que atienden partos son parteras o comadronas, los que atienden fracturas y luxaciones son pegahuesos y sobanderos. Cuando un curandero usa las plantas con el ánimo de hacer maldad se considera brujo y este acto se denomina brujería. Los curanderos aquí mencionados no se consideran brujos pero saben curar la brujería causada por otros.

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Precauciones en el empleo de plantas medicinales* [Precautions in the use of medicinal plants]

Mariela A. MARINOFF1, José L. MARTÍNEZ2 & María A. URBINA3 1Facultad de Agroindustrias, Farmacia, Cdte. Fernández N° 755, H3700LGO Sáenz Peña, Chaco, Argentina.

2Escuela de Kinesiología, Universidad Santo Tomás, Talca, Chile. 3Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción, Campus Chillán, Chile.

Abstract

In our country, almost medicinal plants are not scientifically validated and their safety and effectiveness are frequently unknown; therefore, like any other medicines, they should be used with caution because toxic plants consumption may carry intoxication and even death. Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., among others may be referred to as risky. Fatal cases are recorded due to the misuse of Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et. al., Illicium verum Hook. F. Although they may possess curative properties, they may leave their innocuous conditions for different reasons. But this doesn´t mean all phytotherapy is harmful; many drugs come from plants, and an appropiate knowledge and information about healing herbs is necessary to prescribe and administrate them accurately.

Keywords: Phytotherapy; Curative properties; Intoxication; Folk medicine.

Resumen

En nuestro país, las plantas medicinales prácticamente no están validadas científicamente y “se desconoce si son seguras y eficaces” por lo que, como todo medicamento, deben ser empleadas con cautela, ya que pueden aparecer cuadros tóxicos derivados del consumo de plantas. Mencionadas como riesgosas: Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., entre otras. Casos letales se registran con el uso inadecuado de Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et al., Illicium verum Hook. F. Si bien pueden poseer propiedades curativas, por distintas causas pueden transformarse en factores de intoxicación. Esto no quiere decir que toda la fitoterapia sea nociva, muchos medicamentos proceden de plantas, pero el conocimiento de las hierbas curativas muchas veces es limitado y se desconocen sus efectos, lo que hace necesario informar y alertar sobre su correcta administración y prescripción.

Palabras Clave: Fitoterapia; Propiedades curativas: Intoxicación; Medicina tradicional.

Recibido | Received: March 22, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: March 28, 2009. Publicado en Línea | Published Online: April 10, 2009. Declaración de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiación | Funding: This study wasn´t supported. This article must be cited as: Mariela A. Marinoff, José L. Martínez & María A. Urbina. 2009. Precauciones en el empleo de plantas medicinales. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):184 – 187. {EPub April 10, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: [email protected] Tel: 00.54.3732.420137








Marinoff et al. Precauciones en el empleo de plantas medicinales


INTRODUCCIÓN

El uso de hierbas con fines medicinales es una costumbre ancestral (Martinez & Marinoff, 2008), desconociéndose en muchos casos que debe ser controlado y hasta mortal. Si bien estos productos pueden poseer propiedades curativas, por distintas causas pueden transformarse en factores de intoxicación. En el proceso de infusión y decocción, algunas alcanzan una gran concentración de sus sustancias activas, por lo tanto es necesario conocer con exactitud la cantidad de hierba a usar, el volumen de agua y el tiempo de cocción. Ya sea por una idealización de lo natural o por la situación de pobreza de grandes sectores de la población, echar mano a las plantas para curarse de diversos males es una práctica que ha ido en aumento en los últimos tiempos. En nuestros países, las plantas medicinales prácticamente no están validadas científicamente y “se desconoce si son seguras y eficaces” y, como todo medicamento, deben ser empleadas con cautela. (Rizzo, 2000). Muchas hierbas medicinales son vendidas en farmacias y herboristerías, inclusive sin la debida autorización de las autoridades correspondientes e ignorándose además lo que ocurre con la automedicación de las mismas (Medina, 1999). Si bien la utilización de plantas curativas es una medicina alternativa válida, en algunas oportunidades su uso es empírico y hasta fraudulento. Pueden aparecer cuadros tóxicos derivados del consumo de plantas. Niños, desde el nacimiento, ancianos, mujeres en gestación o lactancia, son los individuos más propensos. Existen tipos de intoxicaciones agudas, las cuales son fácilmente detectables, por cuanto los síntomas de la intoxicación aparecen en el corto tiempo después de su administración e intoxicaciones crónicas, no son fácilmente detectables, resultando difícil atribuir la presencia de algún trastorno de la salud por consumo de alguna planta medicinal, dado que el individuo se relaciona en forma permanente con su medio.

Se puede considerar además, que las plantas medicinales pueden presentar dos tipos de toxicidad: a) Toxicidad intrínseca, en la cual la planta produce metabolitos tóxicos para el ser humano. La presencia de síntomas dependerá de la dosis (intoxicación aguda) o del tiempo de empleo (intoxicación crónica). Ejemplos de metabolitos tóxicos: alcaloides, algunos flavonoides, glicósidos cardiotónicos y cianogenéticos, ác. aristolóquicos, derivados terpenoides (taxol, ascaridol, cucurbitacinas). b) Toxicidad extrínseca, la planta no produce sustancias potencialmente tóxicas.

La toxicidad proviene de la presencia de contaminantes (mezclas con especies tóxicas, metales pesados, pesticidas de la agricultura, micotoxinas, alta carga microbiana). Los resultados de trabajos regionales entre otras cosas permitieron determinar la existencia de plantas con uso medicinal que en otros lugares se vuelven tóxicos. Es por ello que se vuelve trascendente estudiar la composición fitoquímica. (Ricciardi, 2001).


Se indagó acerca de ideas, conocimientos y prácticas de curación con plantas medicinales, a fin de contribuir al conocimiento de sus beneficios y riesgos, consideración obtenida mediante datos registrados de casos clínicos en hospitales y salas de primeros auxilios en zonas del Dpto. Comandante Fernández, Provincia del Chaco, Argentina. Los datos fueron registrados a partir de información aportada voluntariamente por profesionales de la salud, sobre casos reportados. Los mismos fueron analizados, corroborados y justificados mediante bibliografía especializada.


Entre plantas medicinales mencionadas como riesgosas: Lippia turbinata Gris., “poleo”; Aristolochia triangularis Cham., “mil hombres”; Ruta graveolens L.,“ruda”; Huperzia saururs (Lam.) Trevis, “cola de quirquincho”; Brugmansia arborea (L.) Lagerh., “floripón”; entre otras. Casos letales se registran con el uso inadecuado de Chenopodium ambrosioides L., “paico”; Alternanthera pungens Humb. et al., “yerba del pollo” e Illicium verum Hook. F., “anís estrellado”.

La ingesta de yerba del pollo sirve para combatir el estreñimiento, pero además es un potentísimo diurético; entonces, si no se tiene cuidado, el niño puede terminar deshidratado; el paico, tiene alto grado de ascaridol, que lo hace tóxico, siendo el principal motivo de intoxicación en niños, ambas han registrado casos letales. El anís estrellado, en niños y lactantes, se suele utilizar en casos de gastroenteritis y espasmos gástricos e intestinales, sin embargo también se sabe que, por su alto contenido en anetol, esta esencia puede resultar tóxica y hasta mortal, si se la suministra en dosis elevadas, produciendo delirio, irritación GI y convulsiones. El poleo, que se utiliza como digestivo en la región noreste, en otras regiones tiene distinta composición pudiendo generar contracciones uterinas en mujeres embarazadas. La



mil hombres (Aristolochia spp), que figura en el listado negativo de drogas vegetales para medicamentos fitoterápicos del INAME, es una planta particularmente peligrosa, se trata de un muy buen antirreumático, pero también tiene compuestos que producen intoxicación crónica, uno de los primeros síntomas es el decaimiento debido a la anemia que produce. (Gurni, 2000). La cola de quirquincho, de propiedades diuréticas, es utilizada como afrodisíaco, especialmente en los casos de impotencia masculina, puede traer problemas serios en el sistema nervioso central. El té de ruda, utilizado por las adolescentes como abortivo, no sólo puede producir convulsiones, sino también hemorragias graves, pudiendo ocasionar la muerte. (Usandizaga, 2000).

Las plantas medicinales sufren modificaciones cuantitativas en sus constituyentes principales originados por efectos climáticos o de crecimiento de la misma, el contenido de ciertas sustancias varía cuando la planta alcanza su máximo desarrollo. La concentración del principio activo depende de la época y lugar de recolección de las hierbas, de la parte de la planta recolectada, de la forma de preparación. Muchos principios activos de estos preparados interfieren o interactúan con medicamentos prescriptos por el médico. Además, quien los usa muchas veces se evita la consulta médica y se autoprescriben estas hierbas. También se debe evaluar que el gran peligro de estas prácticas radica en que es muy difícil controlar la dosis. Las intoxicaciones por plantas medicinales afectan principalmente a lactantes y niños entre 1 y 5 años, en un 50% de los casos. La vía oral es forma la más frecuente de administración, seguida por la transdermal (a través de la piel) y la inhalatoria. Los grupos de individuos más propensos a sufrir intoxicaciones por las plantas medicinales son: Niños desde el momento del nacimiento hasta los 2 años de edad. Es el más vulnerable de todos los grupos. El sistema enzimático hepático aún no está maduro y por lo tanto no los protege contra posibles intoxicaciones. Esto es válido para cualquier tipo de medicamento, se deben extremar los cuidados para su administración. En ancianos el problema es inverso. El estado en que se encontrará el hígado depende del tipo de vida que haya llevado la persona, además del deterioro lógico debido a la edad. En casos de mujeres en gestación o lactancia se deberán administrar bajo estricta vigilancia médica. Mujeres fértiles, hay plantas medicinales que poseen principios activos de naturaleza esteroide, que podrían interactuar. Otros factores que pueden dar lugar a intoxicaciones

provienen del mal empleo de la especie (dosis inadecuadas, errores en la vía de administración, errores en la preparación), de la sustitución de la parte usada del vegetal y de la confusión con otras especies vegetales. Esto no quiere decir que toda la fitoterapia sea nociva, muchos medicamentos proceden de plantas, pero el conocimiento de las hierbas curativas muchas veces es limitado y se desconoce sus efectos. Por ello, es necesario informar y alertar sobre su correcta administración y prescripción. No se recomienda la mezcla de plantas medicinales, por desconocerse la interacción de sus principios activos y sus efectos aún en el ámbito del uso tradicional. Tener siempre presente que automedicarse constituye un riesgo. No existen reglas ni métodos prácticos seguros para determinar cuándo una planta puede ser tóxica. (Chifa, 2005). Todo esto influye en la calidad de vida de la población, si bien esta es sinónimo de progreso (Joo, 1999), las condiciones en que viven, con remuneraciones muy bajas y en donde deben realizar actividades extras, para sobrevivir les llevan a la cultura de la automedicación sin control empeorando muchas veces sus condiciones de vida.

CONCLUSIÓN

En el presente estudio se demostró que las especies Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et al., Illicium verum Hook. F. presentan un riesgo potencial y real de intoxicación y muerte por el uso indiscriminado y no controlado de su ingesta. Esto demuestra una vez más que no por ser natural, las plantas con atributos medicinales son inocuas; son medicamentos y deben ser utilizados con cautela, contienen principios activos y actividad farmacológica, pueden ser útiles para tratar determinadas patologías pero también producir efectos adversos. Se debe prestar mayor atención al consumo y expedición de este tipo de material sin el debido control de especialistas en la materia.

REFERENCIAS Chifa C. 2005. Plantas Medicinales Usadas por las Comunidades Aborígenes del Chaco Argentino.

(Castellano, Mocoví, Wichí, Toba). Universidad Nacional del Nordeste. Editorial Universitaria de la Universidad Nacional del Nordeste. Edición realizada



Medina E. 1999. Autoatención doméstica de la salud en Chile Rev Chilena Salud Pública 3(2-3):118-125.

por Estudio Sigma S.R.L.. Buenos Aires, Argentina. P.p.28.

Ricciardi AIA. 2001. Toxicología de las Especies Vegetales Autóctonas e Implantadas del centro Norte Argentino. Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Norte. 124pp.

Joo I. 1999. Tesis para optar al título de Químico Farmacéutico, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Gurni AA. 2000. Las hierbas curativas y un trágico final.. De interés general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15. Rizzo, 2000. La idealización de un producto que muchas

veces resulta peligroso para el ser humano. De interés general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15.

Martínez JL & Marinoff MA. 2008. Historia de las plantas medicinales: su evolución e implicancias en Chile, Capitulo 8 en: Comprender el mundo a través de la Historia de la Ciencias. Mario Quintanilla y Gerardo Saffer, compiladores. Una producción G.R.E.C.I.A. - Universidad Católica de Chile, Santiago de Chile. Pp 49 – 58.

Usandizaga, 2000. Recomendaciones para tener en cuenta. De interés general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15.

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