Bojenje po Gramu

Metoda po Gramu je bojenje kojim se razvrstavaju bakterije na Gram(+) i Gram(- )na osnovu osobenosti ćelijskog zida.• Gram-pozitivne bakterije imaju ćelijski zid koga čine debeli (višeslojni)

sloj peptidoglikani (50-90 %). Peptoglikani zadržavaju boju (kristalviolet) unutar ćelije i nakon ispiranja alkoholom.

• Gram-negativne bakterije imaju tanji sloj peptidogilkana (10 %), te se kristalviolet ispire alkoholom. Gram-negativne bakterije imaju i dodatnu spoljnu membranu koja sadrži lipide.

Postoje neki mikroorganizmi koji se drugačije ponašaju po Gramu:• Gram-neosetljive bakterije su vrste bakterija koje se ne mogu obojiti

postupkom bojanja po Gramu (spirohete).• Gram-varijabilne bakterije su vrste bakterija koje u različitim uslovima

rasta mogu pokazati osobine i gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija.

1844. god Hans Kristian Gram

film

Bojenje po Gram-u

Omogućava razlikovanje:

- Gram-pozitivnih bakterija (plavo-ljubičasto obojene)

- Gram-negativnih bakterija (crveno obojene)

* razlika u bojenju je posledica razlika u građi ćelijskog zida

Ćelijski zid Gram pozitivnih bakterija

Ćelijski zid Gram negativnih bakterija

Princip bojenja po Gramu

• Gram+ bakterije ne omogućavaju prodor alkoholu u ćelijski zid pa ostaju plavo ljubičaste

• Gram- bakterije propuštaju alkohol koji oboji gencijana violet a zatim zadržavaju karbol-fuksin i vide se kao crvene

Bojenje po Gram-u

Gram pozitivnebakterije

Gram negativnebakterije

Genciana violet

Rastvor joda

Alkohol (etanol)

Voda

Karbol fuksin / safranin

Voda

GRAM

Faze bojenja po Gramu

• Bojenje kristal violet-om• Stabilizacija boje jodom• Dekolorizacija actonom i alkoholom• Kontra-bojenje safraninom

Postupak bojenja po Gramu

- Fiksacija preparata

- Gencijana violet 3 min

- Lugolov rastvor 2min

- 96% alkohol pa dest voda

- Karbofuksin 30sek

- Ispere vodom i osuši

PRIPREMA PREPARATA

Fikiranje preparata

– zaustavljanje enzimatske aktivnosti bakterija, ubijanje ćelija i lepljenje ćelija za pločicu.

Razmaz bakterija se fiksira brzim prenošenjem pločice kroz plamen nekoliko puta (toplotna fiksacija).

Trajni preparati- kanada balzam + pokrovno staklo

Sterilan rad obezbeđuje odsustvo svih drugih mikroorganizama osim ispitivanog

Staphylococcus spp.,S. aureus

Streptococcus spp., S. PneumoniaeB group streptococcus

Micrococcus spp.

Gram-pozitivne koke

Gram pozitivni bacili

Debeli : Clostridium spp., C. Perfringens,C. septicum C. tetanomorph                     

 TaListeriaTanki

Razgranati: Actinomycetes i Nocardia, A. israelii

Gram-negativne koke

Diplococci: Neiseria spp.N. meningitidis

: Acinetobacter spp., mogu biti Gram-positivniCoccobacilli ili Gram-negativni, često Gram-variabilni

Gram-negativni bacili

Coccobacilli: Haemophilus spp., H. influenzae

Zakrivljeni: Vibrio spp.; Campylobactor spp., V. Cholerae, C. jejuni

Tanki: Enterobacteriaceae, E. Coli

Bojenje po Gram-u