PHẦN THỰC HÀNH

KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

QUAN SÁT TẾ BÀO ĐỘNG – THỰC VẬT

I. MỤC ĐÍCH

Thực tập sử dụng kính hiển vi quang học có 2 mắt kính để quan sát các dạng tế bào thực vật và tế bào động vật. Phương pháp tính kích thước thực của tế bào và nhiễm sắc thể bằng sử dụng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ: Kính hiển vi một mắt kính và hai mắt kính với các vật kính 10X, 40X; trắc vi vật kính, trắc vi thị kính, lam kính, lamen, panh, kéo, lưỡi dao lam, khăn lau, đèn cồn,..

2. Hoá chất: Dung dịch thuốc nhuộm carmin axêtic 2%, axit axêtic 45%, nước cất, cồn tuyệt đối.

3. Mẫu vật: Tiêu bản cố định, quả dưa hấu.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học là dụng cụ quang học để phóng đại các cấu trúc nhỏ bé của sinh vật mà mắt thường không nhìn thấy được. Do đó, nó cần thiết cho việc nghiên cứu về sinh học, đặc biệt dùng kính trong việc nghiên cứu vi sinh học và tế bào học.

Vật quan sát dưới kính hiển vi được phóng đại qua 2 lần kế tiếp nhờ vật kính và thị kính, nên độ phóng đại chung sẽ bằng tích độ phóng đại của vật kính và thị kính.

2. Cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi

Kính hiển vi là một phương tiện kĩ thuật chính xác, cần có những hiểu biết nhất định về nguyên lí cấu tạo, thao tác thực hành đúng khi sử dụng và bảo quản kính theo đúng yêu cầu để tránh hư hỏng.

169

2.1. Cách sử dụng

– Chuẩn bị kính: Kính hiển vi cần được đặt trên bàn phẳng, chắc chắn, ở nơi có đủ ánh sáng. Đặt kính không quá thấp mà vừa tầm mắt để quan sát được dễ dàng.

– Lấy ánh sáng: Đối với kính hiển vi dùng điện, bật công tắc đèn và vặn chiết áp từ từ cho đèn có độ sáng phù hợp. Đối với kính hiển vi dùng gương để lấy ánh sáng thì phải điều chỉnh mặt phẳng của gương để lấy ánh sáng thiên nhiên (không dùng ánh sáng mặt trời trực tiếp) hoặc điều chỉnh mặt lõm của gương để lấy ánh sáng từ đèn điện, sau đó mở hết các chắn sáng rồi xoay bàn xoay để đưa vật kính có bội giác bé (10X) vào giữa mâm kính, điều chỉnh gương và chắn sáng để được ánh sáng phù hợp.

– Quan sát: Đặt tiêu bản lên mâm kính, điều chỉnh cho vật cần quan sát vào đúng giữa trường kính.

– Quan sát qua vật kính có độ phóng đại nhỏ, dùng ốc điều chỉnh sơ bộ để nâng mâm kính nên sao cho đầu vật kính cách tiêu bản khoảng 0,4 – 0,5mm. Nhìn vào thị kính và hạ từ từ mâm kính xuống cho đến khi nhìn rõ vật cần quan sát rồi tinh chỉnh bằng ốc vi cấp để nhìn thấy vật rõ nét hơn.

– Khi quan sát bằng vật kính có độ phóng đại lớn làm như sau:

Điều chỉnh cho vị trí cần quan sát vào giữa thị trường của kính. Dùng tay xoay nhẹ nhàng và từ từ để vật kính cần sử dụng vào vị trí làm việc.

Mở rộng thêm chắn sáng để tập trung nhiều ánh sáng hơn vào vật quan sát.

Dùng ốc vi cấp điều chỉnh từ từ trong khi mắt đang tập trung vào trường kính cho đến khi nhìn rõ nét tiêu bản.

2.2. Những điều cần chú ý khi quan sát

– Đối với kính dùng điện, kiểm tra điện thế sử dụng (110V hay 220V) được ghi sau đế chân kính. Nếu loại kính dùng điện thế 110V nhất thiết phải dùng nắn dòng trước khi cắm điện.

– Ốc vi cấp có thể vặn được cả hai chiều, mỗi chiều khoảng hai vòng. Nếu đang vặn mà ốc bị kẹt thì dừng tay và xoay lại ngược chiều. Nếu vẫn không nhìn thấy vật cần quan sát thì phải dùng ốc chỉnh sơ bộ để nâng hay hạ mâm kính cho đến khi đã nhìn thấy tiêu bản ở bội giác bé (10X), lúc đó mới đưa vật kính có bội giác lớn vào vị trí làm việc và dùng ốc vi cấp để điều chỉnh cho rõ.

– Khi quan sát tiêu bản ở bội giác lớn 100X nhất thiết phải dùng dầu kính.

– Khi di chuyển kính phải dùng cả 2 tay: tay phải cầm thân kính, tay trái đỡ dưới đế kính.

170

Nên dùng cả hai mắt để quan sát như thế sẽ quan sát trên kính thời gian lâu hơn, vừa quan sát vừa có thể vẽ hình.

2.3. Bảo quản kính hiển vi

– Kính sau khi dùng phải lau khô bằng khăn mềm, sạch. Nếu đã dùng dầu soi kính thì nhất thiết phải dùng xylen và giấy lau kính chuyên dùng để lau sạch vật kính.

– Để kính hiển vi nơi khô ráo tránh mốc ở bộ phận quang học. Khi không sử dụng kính trong thời gian dài thì cần giữ và bảo quản kính trong tủ kính khô (có thể dùng bóng điện để sấy khô kính trong tủ) hoặc tháo vật kính và thị kính ra cho vào trong hộp nhựa hay túi nilông rồi đặt vào trong bình hút ẩm.

– Kính phải được bảo quản định kì.

3. Thực tập sử dụng kính hiển vi quang học quan sát tế bào và nhân

3.1. Quan sát các dạng tế bào trên tiêu bản cố định (tiêu bản tế bào đỉnh rễ hành, rễ cây ráy,...)

3.2. Quan sát các dạng tế bào ở quả dưa hấu

– Dùng dao lam gọt thật mỏng lớp vỏ ngoài quả dưa hấu đặt lên một phía của lam kính.

– Cắt một lát thật mỏng thịt quả dưa hấu, đặt một mảnh nhỏ lên đầu còn lại của lam kính.

– Nhỏ vào mỗi mẫu một giọt nước cất, đậy bằng lamen.

– Quan sát dưới kính hiển vi ở bội giác bé và nhận xét kết quả. Vẽ tế bào quan sát thấy.

(Tế bào vỏ quả nhỏ, vách tế bào dày, đôi khi quan sát thấy lỗ khí. Tế bào thịt quả lớn và màng tế bào mỏng đôi khi còn quan sát thấy các bó mạch dẫn).

– Cắt lát thật mỏng vỏ hạt và tiến hành làm tiêu bản tương tự như trên, quan sát. So sánh hình dạng tế bào với 2 lát cắt trên (tế bào có vách rát dày).

4. Sử dụng trắc vi vật kính và trắc vi thị kính xác định kích thước thực của tế bào, nhiễm sắc thể

171

172

Lắp trắc vi thị kính vào vật kính

Trắc vi thị kính (5mm được chia thành 50 phần bằng nhau)

Vị trí trắc vi thị kính

Vị trí trắc vi vật kính

Đặt trắc vi vật kính lên chính giữa bàn kính. Quan sát vạch chia trên trắc vi vật kính bằng vật kính 40 hoặc 100. Khi các vạch thấy rất rõ, dùng tay xoay trắc vi thị kính để các vạch chia song song dọc theo vạch chia trên trắc vi vật kính. Tìm vạch trùng nhau và ghi lại số vạch trên mỗi trắc vi

Trắc vi vật kính (1mm đ được chia đều thành 100 phần bằng nhau)

Phóng đại phần giữa1 vạch tương ứng với 001mm = 10micromet

Cách tính:1 vạch của trắc vi thị kính bằng

Vạch thứ 21 của trắc vi thị kính trùng với vạch thứ 5 của trắc vi vật kính

Mỗi vạch trắc vi vật kính tương ứng với 10

Xác định kích thước vi khuẩn

Trắc vi thị kính

Đường kính của vi khuẩn= 2,41,2 = 2,88 2,9 ( ) (vạch)

Số vạch đo được trên trắc vi thị kính là

( 100

Lấy trắc vi vật kính ra khỏi kính và thay vào vị trí đó là tiêu bản cần xác định kích thước hiển vi. Điều chỉnh kính để xem rõ mẫu, đọc số vạch tương ứng với độ lớn mẫu cần đo

Quan sát thấy trên kính hiển vi

A

B

A

A. QUAN SÁT CÁC DẠNG TẾ BÀO

I. MỤC ĐÍCH

Nhận dạng các hoá chất và pha chế được các loại dung dịch thường dùng để cố định và nhuộm tế bào. Phương pháp làm tiêu bản hiển vi để quan sát các dạng tế bào, nhận xét về tính nhiều dạng của các loại tế bào. Rèn luyện kĩ năng và thao tác làm tiêu bản tế bào.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao cạo, tiêu bản cố định, đèn cồn, cốc thủy tinh, bút viết bảng, bột phấn màu.

2. Hoá chất: Nước cất, cồn tuyệt đối, cồn metylic (CH3OH), carmin axêtic (2%) Giemsa, xanh metylen, Fuchsin, axit axêtic 45%, dung dịch muối sinh lí (0,6% NaCl).

3. Mẫu vật: Củ hành tây, hoa các loài cây, lá cây thài lài tía, ếch sống.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Một số phương pháp cố định và nhuộm tế bào

1.1. Các chất cố định thường dùng

Chất cố định được dùng nhằm giết nhanh tế bào và mô cơ thể, cố định các cấu trúc và giữ cho tế bào không tiếp tục bị phá hủy, không gây ra những biến đổi lớn về cấu trúc. Do đó, các chất dùng cố định phải có khả năng xâm nhập nhanh vào tế bào, đình chỉ các hoạt động mà vẫn giữ nguyên cấu trúc. Dung tích thuốc định hình phải lớn hơn thể tích của mẫu. Thời gian cố định, loại thuốc cố định, thời điểm để cố định phải thích hợp từng đối tượng nghiên cứu. Sau thời gian cố định thích hợp, lưu giữ trong cồn 70% và bảo quản trong tủ lạnh.

Các chất cố định thường dùng:

– Cồn (êtylic hay mêtylic): thường dùng ở nồng độ 70 ~ 100%.

– Dung dịch Cacnoy (Cồn etilic tuyệt đối : clorofoc : axit axêtic theo tỉ lệ 6 : 3 : 1).

– Thuốc cố định Clarec (Cồn etilic tuyệt đối: axit axêtic đá tỉ lệ 3 : 1).

173

Ngoài ra còn nhiều dung dịch cố định khác mà ở đó axit axêtic được thay thế bằng axit propionic hay axit cromic...

1.2. Các chất nhuộm tế bào thông thường

+ Nhuộm xanh metylen: thuốc thường dùng để nhuộm màng tế bào thực vật.

+ Nhuộm Carmin: bột màu đỏ có nguồn gốc động vật, tan trong cồn, axit và nước. Nồng độ thích hợp 2% trong axit axetic 45% để nhuộm tế bào và nhiễm sắc thể.

+ Nhuộm Fuchsin: Dung dịch thuốc nhuộm Shift.

+ Nhuộm Giemsa: dùng nhuộm tế bào, nhiễm sắc thể, vi sinh vật.

+ Nhuộm iot–iođua.

Ngoài ra có thể nhuộm bằng axêto– orcein (C28H24N2O7) theo quy trình như Carmin, …

2. Quan sát các dạng tế bào

2.1. Làm tiêu bản quan sát tế bào vỏ hành

– Bóc bỏ lớp vỏ khô bên ngoài của hành. Bổ dọc củ hành làm hai. Dùng kim mũi mác bóc lớp vỏ lụa của lá trong, lá giữa và lá ngoài cùng.

– Cắt một miếng nhỏ (3 5mm) đặt lên lam kính đã nhỏ sẵn một vài giọt thuốc nhuộm xanh metylen hoặc carmin axêtic. Đậy lamen sao cho không có bọt khí dưới lamen. Để yên tại bàn, sau 20 phút tiến hành quan sát trên kính hiển vi. Có thể làm khô bằng hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội lại và quan sát. So sánh hình dạng tế bào của các tiêu bản lá hành.

– Ở độ phóng đại nhỏ (vật kính 10X, thị kính 10X), có thể thấy tế bào hành dài, hình chữ nhật, hình đa giác xếp sít nhau. Mỗi tế bào có màng tế bào, nhân, màu xanh đậm hoặc vàng (nếu dùng iot–iođua). Ở độ phóng đại lớn hơn có thể thấy những chi tiết về cấu tạo tế bào.

– Tế bào thực vật có vách xenlulozơ bao phía ngoài màng, lớp này thường dính liền nhau với màng sinh chất nên ta khó quan sát rõ bằng kính hiển vi quang học. Tế bào chất là các đám hạt nhỏ màu xanh (hoặc vàng) nhạt. Nhân tế bào nằm giữa tế bào hoặc ở một phía thành tế bào, còn một hai chấm sáng đó là hạch nhân.

2.2. Quan sát hình dạng của tế bào hạt phấn

– Gõ nhẹ bao phấn của nhiều loài hoa để hạt phấn rơi lên lam kính.

– Nhỏ 2 giọt Carmin lên mẫu và trộn đều, sau đó đậy bằng lamen.

174

– Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 ~ 800 lần. So sánh hình dạng các hạt phấn.

2.3. Quan sát tế bào lỗ khí

Tế bào lỗ khí bao gồm hai tế bào hình hạt đậu nằm giữa các tế bào biểu bì lá. Hai tế bào xếp đối xứng thành dày vào nhau. Ở mỗi tế bào hạt đậu có nhân tế bào, lục lạp và các bộ phận khác nằm trong tế bào chất. Ở lá của cây Hai lá mầm, tế bào lỗ khí thường phân bố chủ yếu ở biểu bì mặt dưới của lá, còn trong lá của cây Một lá mầm, các tế bào khí khổng thường phân bố đều ở cả hai mặt lá.

Tách biểu bì lá. Dùng lưỡi dao cạo, kim mũi mác tách lớp biểu bì của mặt dưới lá thài lài tía. Ngâm vào cồn tuyệt đối. Sau đó đặt biểu bì lên lam kính, nhỏ một giọt nước, đậy lamen lên. Đặt lên kính hiển vi quan sát.

2.4. Quan sát hình dạng tế bào và lông tế bào niêm mạc hàm trên miệng ếch

– Mở miệng ếch bằng cách cầm ngả ếch trong lòng bàn tay, dùng ngón trỏ kéo hàm dưới của ếch xuống. Dùng bụi phấn màu cho vào trong hàm trên của ếch.

– Quan sát dòng di chuyển của bột phấn đi vào thực quản ếch.

– Mở to miệng ếch, dùng lam quét cạo lấy lớp tế bào niêm mạc phía trong hàm trên ếch. (Có thể cố định ếch trên giá, dùng panh và lam quét để mở miệng ếch sẽ dễ dàng hơn).

– Đưa lớp niêm mạc lấy được dầm trong 1 – 2 giọt dung dịch muối sinh lí đã nhỏ sẵn trên lam kính. Đậy bằng lamen và quan sát trên kính. Ghi nhận kết quả và vẽ tế bào quan sát được.

2.5. Quan sát tế bào niêm mạc xoang miệng

Dùng lam quét đã được khử trùng, lấy một lớp tế bào phía trong khoang miệng

– Phết lên lam kính tế bào niêm mạc miệng đã lấy ra và để khô tự nhiên .

– Nhỏ lên chỗ mẫu vài giọt xanh mêtylen và để tại chỗ trong nhiều phút để nhuộm tế bào.

– Sau khi nhuộm rửa nhẹ lam kính trong nước cất để loại bỏ thuốc nhuộm.

– Nhỏ lên chỗ mẫu giọt nước cất, đậy mẫu bằng lamen sạch và đưa lam kính lên kính hiển vi chuẩn bị quan sát.

Quan sát sẽ thấy cấu tạo tế bào niêm mạc miệng giống với tế bào vỏ hành về các thành phần gồm: màng, nguyên sinh chất và nhân. Nhưng màng tế bào niêm mạc miệng rõ ràng hơn so với màng tế bào vỏ hành, không quan sát thấy không bào. Mỗi tế bào đều có nhân bắt màu mạnh, không thấy hạch nhân. Hình dạng tế bào thường là

175

hình tròn, hình đa giác nằm rời rạc.

B. NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TẾ BÀO

I. MỤC ĐÍCH

– Nhận biết được một số thành phần hoá học của tế bào như prôtêin, lipit, các loại đường có trong củ, lá thông qua các thí nghiệm. Rèn luyện kĩ năng và thao tác thực hành.

II. CHUẨN BỊ

1. Mẫu vật: Đường glucozơ, saccarozơ, cùi dừa, sữa, trứng gà, củ khoai tây, khoai lang, hạt lạc sống, gan lợn hoặc gà, lá cây (mướp, ngô,...).

2. Hoá chất: HCl đậm đặc, axit axêtic đặc, NaOH, CuSO4, dung dịch Benedict, nước cất, cồn, glyxêrin, etanol, Na(CH3COOH).

3. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, dao lam, kim mũi mác, giấy quỳ, giá ống nghiệm, bếp, đèn cồn, dụng cụ thủy tinh (cốc đun, ống nghiệm,...), ống nhỏ giọt, cối sứ.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm 1: Nhận biết đường đơn và đường đôi

– Cho dung dịch glucozơ vào ống nghiệm với vài giọt dung dịch Benedict, đun sôi 5 phút trong cốc nước. Quan sát và nhận xét kết quả.

– Cho dung dịch saccarozơ vào ống nghiệm đã có vài giọt Benedict, đun sôi. Quan sát và nhận xét (không có phản ứng gì xảy ra như ở thí nghiệm đối với glucozơ saccarozơ không có tính khử).

– Cho dung dịch saccarozơ vào ống nghiệm, cho thêm 2 giọt HCl đậm đặc và đun sôi trong 10 phút. Sau dó, trung hoà bằng NaOH (dùng giấy quỳ để nhận biết), nhỏ thêm 1ml dung dịch Benedict vào. Quan sát và nhận xét (Có phản ứng gì xảy ra như ở thí nghiệm đối với glucozơ không? Giải thích).

Thí nghiệm 2: Phát hiện tinh bột trong lá

Lấy lá cây mướp, ngô cho vào ống nghiệm, cho rượu êtylic vào và đun sôi trên đèn cồn để rút hết diệp lục và làm tinh bột biến thành hồ tinh bột. Sau đó dùng kẹp cặp

176

và nhúng lá vào dung dịch kali iotat có nồng độ loãng. Mô lá sẽ có màu gì?

Thí nghiệm 3: Phát hiện glicôgen trong gan

– Nghiền nhỏ mẫu gan lợn hoặc gan gà trong cối sứ rồi lấy ra một ít đặt lên lam kính.

– Cho thêm vào mẫu vài giọt dung dịch KI và quan sát, nhận xét kết quả.

Thí nghiệm 4: Nhận biết các hạt dầu (lipit) trong cùi quả dừa

– Cắt nhỏ cùi dừa cho vào ống nghiệm và cho thêm vào vài ml cồn. Lượng cồn trong ống nghiệm phải ngập hết cùi dừa, lắc đều trong ít phút.

– Để cùi lắng xuống và dùng pipet hút phần dịch nổi cho vào một ống nghiệm khác có đựng 3ml nước. Quan sát kết qủa và giải thích hiện tượng.

Thí nghiệm 5: Nhận biết prôtêin

– Dùng 3ml sữa (hoặc 10ml dung dịch lòng trắng trứng: lòng trắng một quả trứng + 0,5 lít nước + 3ml NaOH) cho vào 1 ống nghiệm rồi cho thêm vài giọt CuSO 4

1%, lắc đều. Quan sát và nhận xét kết quả.

(Dung dịch từ màu xanh biến thành màu tím đặc trưng của phản ứng Biurê có sự hiện diện của prôtêin).

C. THÍ NGHIỆM CO VÀ PHẢN CO NGUYÊN SINH

I. MỤC ĐÍCH

Quan sát hiện tượng thẩm thấu qua màng dẫn đến co và phản co nguyên sinh ở tế bào thực vật, hiện tượng tan bào và teo bào ở tế bào động vật, giải thích cơ chế thông qua đó củng cố kiến thức về sự trao đổi chất qua màng tế bào. Rèn luyện kĩ năng và thao tác thực hành.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ: Kính hiển vi với các vật kính 10X, 40X, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao cạo, đèn cồn, cốc thủy tinh, đĩa đồng hồ, giấy thấm.

2. Hoá chất: Nước cất, dung dịch NaCl 10% và 0,6%.

3. Mẫu vật: Lá rong mái chèo tươi, củ hành khô, thân hành ta, ếch sống (hoặc máu tươi của ếch).

177

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm 1: Quan sát tế bào và các bào quan trong tế bào lá cây rong mái chèo

Ngâm lá rong còn tươi trong cốc nước 300C trong thời gian 15 phút. Cuộn lá đó

vào ngón tay trỏ của bàn tay trái để làm chỗ tì, tay phải cầm lưỡi dao lam, cạo hớt nhẹ

một lớp mỏng trên mặt lá. Đặt miếng lá đó lên lam kính, nhỏ một giọt nước, đậy

lamen, quan sát trên kính hiển vi.

Lúc đầu quan sát ở bội kính bé trước rồi chuyển sang quan sát ở bội giác lớn. Ta

thấy các tế bào xếp sát nhau, chung quanh có thành, sát mép thành có tế bào chất,

trong tế bào chất có các hạt lục lạp màu lục, ta cũng thấy nhân phình to hơn lục lạp.

Quan sát, vẽ tế bào và các bộ phận nhỏ trong tế bào.

Thí nghiệm 2. Co và phản co nguyên sinh ở tế bào thực vật (củ hành khô)

Dùng kim mũi mác bóc một lớp tế bào biểu bì hành. Đặt miếng biểu bì trên lam kính đã nhỏ sẵn một giọt nước, đậy lamen và quan sát. Ta thấy vô số tế bào hành xếp sát nhau. Mỗi tế bào được cấu tạo bởi màng, nguyên sinh chất, nhân. Các không bào trong tế bào tương đối lớn chiếm phần lớn thể tích của tế bào.

Nhỏ vào mép lamen một giọt nước muối NaCl 10%. Dùng miếng giấy thấm đặt ở phía bên kia lamen để hút hết phần nước cho đến khi dung dịch muối thay thế hoàn toàn. Sau 1 – 2 phút ta thấy màng tế bào tách khỏi lớp vỏ xenlulozơ thể tích tế bào chất bị thu hẹp lại. Đó là hiện tượng co sinh chất.

Giữ nguyên tiêu bản ở vị trí này, dùng ống hút nhỏ một vài giọt nước ở một mép lamen và ở mép lamen phía đối diện, dùng giấy thấm hút hết dung dịch muối ra, quan sát sẽ thấy hiện tượng ngược lại với co nguyên sinh chất: Thể tích của tế bào chất và các không bào dần dần mở rộng trở về vị trí ban đầu do nước được hút ngược trở lại. Đó là hiện tượng phản co nguyên sinh.

Nếu giết chết tế bào (hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn) hoặc giữ trạng thái tế bào co nguyên sinh sau một thời gian dài. Lặp lại thí nghiệm và nhận xét hiện tượng.

Cũng cách làm tương tự trên, ta cho tế bào trong dung dịch NaCl 0,6%. Quan sát hiện tượng xảy ra và tự giải thích.

Thí nghiệm 3. Co nguyên sinh ở tế bào thực vật (thân hành)

– Cắt một đoạn thân hành (phần thân màu trắng). Dùng lưỡi lam bổ dọc thành hai, sau đó bóc tách các lá.

– Bóc lớp biểu bì trong của lá hành giữa và đặt lên lam kính.

178

– Dùng 2 lamen đặt hai bên miếng biểu bì hành và nhỏ vào giữa một giọt dung dịch đường 20%, dùng lamen thứ 3 đậy lên mẫu.

Quan sát dưới kính ở thời điểm sau khi nhỏ đung dịch đường, sau 10 phút và sau 20 phút. Nhận xét kết quả và giải thích.

Thí nghiệm 4. Hiện tượng tan bào và teo bào ở động vật (tế bào máu người hoặc máu ếch)

Nhỏ một giọt máu người hoặc máu ếch lên lam kính, đậy lamen, quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy rất nhiều tế bào hình cầu trôi lơ lửng trong huyết tương của máu, hồng cầu là những huyết cầu sáng và không màu, có hình đĩa với hai mặt lõm. Quan sát sự thay đổi hình dạng của các hồng cầu này khi để chúng trong dung dịch có áp suất thẩm thấu khác nhau.

Nhỏ vào mép lamen một giọt NaCl 0,6%, quan sát ở bội giác 40X thấy các hồng cầu bị trương lên, tế bào bị căng phồng rồi vỡ tung đó là hiện tượng tan bào. Khi đặt hồng cầu trong dung dịch nhược trương (NaCl 0,6%) gây ra trạng thái nước đi vào tế bào nên tế bào bị trương lên và vỡ tung (Trường hợp là máu ếch thì không có hiện tượng trên xảy ra vì dung dịch NaCl 0,6% là đẳng trương đối với máu ếch).

Lấy một giọt máu khác, đậy lamen, nhỏ một giọt NaCl 10% vào mép lamen. Hiện tượng xảy ra tương tự như tế bào vỏ hành. Nhưng vì tế bào hồng cầu có hai lớp màng mỏng ngoài cùng khi nước từ trong tế bào chảy ra ngoài làm cho thể tích tế bào bị thu hẹp lại, màng tế bào nhăn nhúm. Đó là hiện tượng teo bào ở hồng cầu khi để trong dung dịch ưu trương.

Cho biết hiện tượng gì đã xảy ra và giải thích nguyên nhân? Điền vào các ô trống có dấu chấm hỏi câu trả lời thích hợp?

179

? ? ?

? ? ? ?

D. SỰ SINH SẢN CỦA TẾ BÀO

I. MỤC ĐÍCH

Quan sát sự phân bào nguyên nhiễm ở tế bào sinh dưỡng và phân bào giảm nhiễm ở tế bào sinh dục. Hình thái và hoạt động của NST qua các kì của 2 quá trình phân bào và sự sai khác có ý nghĩa của 2 quá trình này.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao cạo, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình đung ổn nhiệt, đĩa đồng hồ, giấy thấm, panh, kéo.

2. Hoá chất: Dung dịch cố định (3 cồn : 1 axetic); thuốc nhuộm Shiff, axêto–carmin 2%, H2O cất, cồn tuyệt đối, axit axêtic, xylen.

3. Mẫu vật: Củ hành tây, hành ta, hạt đại mạch (để lấy rễ non); châu chấu đực.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm 1: Quan sát phân bào nguyên nhiễm ở tế bào rễ hành

Ngâm cho hành ra rễ trước thí nghiệm độ 4 – 7 ngày (ngâm củ trong cốc có

nước).

Khi có rễ dài khỏang 1cm, dùng dao cạo cắt 1 đoạn 0,5cm (kể từ chóp rễ). Cố

định rễ trong dung dịch cố định trong 2 giờ.

Mẫu rễ sau khi đã được cố định thì rửa sạch bằng nước cất và cho vào các dung

dịch thuốc nhuộm (dung dịch carmin axetic 2% : HCl 1N (9:1)) trong 2 ngày.

Rễ đã nhuộm trên đây, thuỷ phân trong 45% dung dịch axetic nóng trong

khoảng 30 giây trên ngọn đèn cồn.

Làm tiêu bản bằng phương pháp nén và quan sát trên kính hiển vi.

Lấy rễ ra đặt lên lam kính, dùng dao lam cắt bỏ chóp rễ, sau đó cắt một lát

mỏng phần đỉnh sinh trưởng (phần đỉnh rễ nhuộm màu đậm). Nhỏ thêm một giọt 45%

axetic hoặc 1% axêto–carmin. Đậy bằng lamen và đặt lam kính trong một tờ giấy thấm

gấp đôi, dùng đầu que diêm hoặc đầu panh gõ nhẹ thẳng góc lên mẫu. Đưa lam kính

hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn (tránh để qua nóng làm khô mẫu và không khí lọt vào)

khoảng 5 – 10 giây. Đặt lam kính trở lại tờ giấy thấm và dùng đầu ngón tay cái ép

thẳng góc lên lamen mẫu qua lớp giấy thấm.

180

Chú ý: Phải ép đều và thẳng góc tránh vỡ lamen mà mẫu được trải đều. Đặt lên

kính hiển vi, điều chỉnh cho rõ. Quan sát, vẽ hình, phân biệt các pha phân chia, gọi tên

các pha đó.

(Trong thí nghiệm này, ta có thể tìm thấy hình thái của tế bào phân chia ở các kì

phân bào. Nếu là kì giữa thì toàn bộ thể nhiễm sắc tập trung trên mặt phẳng xích đạo;

nếu là kì sau thì các nhiễm sắc thể đã phân li và đang tách xa dần mặt phẳng xích đạo

để về hai cực mới. Ngoài ra, chúng ta có thể thấy hai tế bào con mới xuất hiện, kích

thước tế bào còn bé so với tế bào mẹ, thể nhiễm sắc đã cụm lại trong nhân ở hai tế bào

con. Cũng có thể thấy các tế bào mẹ chưa phân chia to hơn so với các tế bào con mới

sinh ra).

Đối với các tiêu bản tốt có thể tiến hành chụp ảnh trên kính hiển vi có hệ thống

chụp ảnh sau đó cố định tiêu bản.

Thí nghiệm 2: Quan sát phân bào giảm nhiễm ở tinh hoàn châu chấu đực

Dùng kim nhọn mổ lấy tuyến sinh dục (ở gần phần bụng) của châu chấu. Đem

ngâm tuyến này trong dung dịch nhược trương natri xitrat 1% để gây nhược trương tế

bào. Chuyển tinh hoàn sang dung dịch cố định carnoy, dùng kim mũi mác tách các tế

bào riêng ra, sau đó nhỏ dịch bào lên lam kính. Nhuộm tiêu bản bằng hematoxilin (Có

thể quan sát nhanh bằng cách: ngay sau khi tách tinh hoàn, lấy một ít đặt lên lam kính.

Dùng kim mũi mác xé rách bào cơ của ống sinh tinh để phân tán tế bào. Nhỏ lên mẫu

dung dịch axêto – orcêin hoặc axêto–carmin 2% để nhuộm trong 5 – 10 phút. Đậy

lamen lên và ép nhẹ bằng đầu ngón tay cái, thấm sạch thuốc nhuộm còn thừa và quan

sát trên kính hiển vi). Tinh hoàn bao gồm hàng ngàn ống dẫn tinh, mỗi ống này phát

triển hàng triệu tinh trùng. Những tế bào sinh dục đầu tiên gọi là tinh nguyên bào.

Trong quá trình phát triển, tinh nguyên bào phân chia theo kiểu nguyên phân làm cho

số tinh nguyên bào nhiều lên. Sự phát sinh tinh trùng bắt đầu từ lúc tinh nguyên bào

lớn trở thành những tế bào lớn hơn gọi là tinh bào cấp 1. Các tinh bào cấp 1 bước vào

thời kì phân chia.

Kì trước I của giảm phân kéo dài, bao gồm nhiều giai đoạn, nhiều quá trình

phức tạp xảy ra nhưng trên tiêu bản chỉ quan sát thấy giai đoạn cuối. Nhiễm sắc thể có

nhiều hình dạng.

Ở kì giữa I, ta không quan sát thấy màng nhân, thoi phân chia xuất hiện. Mỗi

tâm động của nhiễm sắc thể hướng về một cực của tế bào, các nhiễm sắc thể chuẩn bị

phân li.

181

Kì sau I: Các nhiễm thể của cặp tương đồng tách nhau và đi về hai cực.

Kì cuối I: Các nhiễm sắc thể tương đồng nằm gọn trong tế bào. Chúng vẫn giữ

nguyên hình thái.

Lần phân chia thứ II:

Về cơ bản lần phân chia thứ II giống với phân bào nguyên nhiễm thông thường

nhưng không có sự nhân đôi của NST. Ở lần phân chia thứ II của quá trình phân bào

giảm nhiễm, NST từ kì cuối I sẽ chuyển ngay sang kì giữa II trong khoảng thời gian

rất nhanh.

Kì sau II: Các NST đơn trong NST kép tách nhau ở tâm động và di chuyển về hai cực của tế bào.

Kì cuối II: Màng nhân và nhân con được hình thành, màng tế bào co thắt lại tách tế bào mẹ thành hai tế bào con giống hệt nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHUYÊN ĐỀ 2

1. B. Alberts et all. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed, Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994.

2. J. Ohta. Sinh học tế bào (tiếng Nhật). 1989.

3. Phạm Thị Trân Châu và nhiều tác giả khác. Hoá sinh học. NXB Giáo dục Hà Nội, 1992.

4. Nguyễn Thành Đạt (Tổng chủ biên), Trần Dụ Chi – Trịnh Nguyên Giao, Phạm Văn Lập, Phạm Văn Ty. Sinh học 10 (Sách giáo khoa thí điểm, Ban khoa học Tự nhiên). NXB Giáo dục, 2002.

5. Nguyễn Như Hiền & Trịnh Xuân Hữu. Tế bào học. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2000.

182

6. Nguyễn Như Hiền. Di truyền và công nghệ tế bào. NXB KH&KT, Hà Nội, 2002.

7. Phạm Thành Hổ (1998). Di truyền học. NXB Giáo dục.

8. Phan Cự Nhân (chủ biên), Trần Bá Hoành, Lê Quang Long, Phạm Đình Thái, Hoàng Thị Sản, Mai Đình Yên. Sinh học đại cương, Tập I, II NXB ĐHSP, (Tái bản), 2005.

9. Thái Duy Ninh. Tế bào học. NXB Giáo dục, 1996.

10. Vũ Văn Vụ và nhiều tác giả khác. Sinh lí thực vật. NXB Nông thôn.

183

CHUYÊN ĐỀ 3

VI SINH HỌC (MICROBIOLOGY)

Người biên soạn

GS. TS. Nguyễn Thành Đạt

PGS. TS. Vương Trọng Hào

TS. Mai Thị Hằng

Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh học, khoa Sinh – Kĩ thuật nông nghiệp – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

1. Số tiết: 17 tiết lí thuyết và 3 tiết thực hành.

2. Mục tiêu: Nhằm giúp cho giáo viên dạy THPT nắm vững những vấn đề khó trong SGK – Sinh học 10 (phần sinh học vi sinh vật), cả về nội dung khoa học, tính cập nhật và khả năng thực hành, để giảng dạy tốt các phần có liên quan trong SGK – Sinh học 10. Đồng thời qua tài liệu bồi dưỡng có thể góp phần nâng cao tiềm lực khoa học và khả năng nghiên cứu của giáo viên

3. Phương pháp giảng dạy

Giáo viên nghiên cứu tài liệu, so sánh với các phần có liên quan trong SGK – Sinh học 10, đề xuất thắc mắc, các điểm cần bồi dưỡng đi sâu

Các giảng viên kết hợp thuyết trình và phát vấn, sử dụng các phương tiện dạy học để đi sâu vào các phần khó, thực hiện một số bài thực nghiệm

4. Nội dung của chuyên đề 3

Chuyên đề 3 gồm các chương và phần như sau :

Phần lí thuyết (17 tiết)

Chương I – Vi sinh học và vi sinh vật

I – Vi sinh học là gì ?

II – Các nhóm đối tượng của vi sinh học

III – Vi khuẩn

IV – Archaea

V – Vi sinh vật nhân chuẩn

184

VI – Virut

VII – Hệ thống sinh giới và vị trí của các nhóm vi sinh vật

VIII – Câu hỏi và bài tập

Chương II – Dinh dưỡng và sự chuyển hoá các chất ở vi sinh vật

I – Các chất dinh dưỡng

II – Các nhân tố sinh trưởng

III – Các loại môi trường sống của vi sinh vật

IV – Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật

V – Các kiểu hô hấp của vi sinh vật

VI – Các hình thức lên men chính

VII – Quá trình tổng hợp một số chất

VIII – Câu hỏi và bài tập

Chương III – Sinh trưởng và sinh sản ở vi sinh vật

I – Khái niệm sinh trưởng ở vi sinh vật

II – Sự sinh sản ở vi khuẩn và Archaea

III – Sự sinh sản ở vi sinh vật nhân chuẩn

IV – Sinh trưởng trong nuôi cấy không liên tục

V – Sinh trưởng trong nuôi cấy liên tục

VI – Các tác nhân ức chế sự sinh trưởng và ứng dụng

VII – Công nghệ sinh học và công nghệ vi sinh

VIII – Câu hỏi và bài tập

Chương IV – Khái niệm bệnh truyền nhiễm và miễn dịch học

I – Khái niệm bệnh truyền nhiễm và phương thức lan truyền

II – Độc tố và độc lực

III – Bệnh do vi sinh vật, virut và các phân tử hữu cơ khác

IV – Kháng nguyên

V – Kháng thể

VI – Các loại miễn dịch

VII – Câu hỏi và bài tập

Chương V – Ôn tập và kiểm tra

185

Sử dụng các câu hỏi tự luận, trắc nghiệm ở cuối các chương.

Phần thực hành (3 tiết)

Bài 1: Quan sát một số loại vi sinh vật

1 – Thí nghiệm 1: Cách làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định nhuộm màu

2 – Thí nghiệm 2: Quan sát vi khuẩn trong khoang miệng, nấm men rượu, mốc trên một số cơ chất

Bài 2: Sự chuyển hoá các chất ở vi sinh vật

1 – Thí nghiệm 1: Phân giải prôtêin, phân giải xenlulozơ

2 – Thí nghiệm 2: Lên men rượu etanol

3 – Thí nghiệm 3: Lên men lactic, làm sữa chua, muối dưa cà.

186

PHẦN LÍ THUYẾT CHUYÊN ĐỀ 3 (17 TIẾT)

CHƯƠNG 1

VI SINH HỌC VÀ VI SINH VẬT

I. VI SINH HỌC LÀ GÌ ?

Vi sinh học (Microbiology) là khoa học nghiên cứu sự sống hiển vi bao gồm các vi sinh vật và dạng sống vô bào, hoạt động sống và vai trò của chúng đối với đời sống trên hành tinh, nó là khoa học liên ngành và hiện đại.

Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ (từ vài trăm nm đến vài mm), muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi. Chúng có thể là đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, một số ít là cơ thể đa bào chưa phân hoá thành mô, chúng bao gồm các nhóm chủ yếu: Archaea, vi khuẩn (kể cả vi khuẩn lam) (nhân sơ–Prokaryota), tảo đơn bào, nấm đơn bào và nấm sợi, động vật nguyên sinh (nhân thực–Eukaryota).

Virut chưa có cấu trúc tế bào và chưa phải là cơ thể sống, nhưng lại có một số đặc điểm của cơ thể sống khi kí sinh trong tế bào sống. Virut được coi là một nhóm đối tượng của Vi sinh học.

II. CÁC NHÓM ĐỐI TƯỢNG CỦA VI SINH HỌC

Theo nhóm đối tượng, Vi sinh học có các chuyên ngành:

1. Virology: Khoa học nghiên cứu các virut, bao gồm những virut kí sinh trên vi khuẩn (thực khuẩn thể – Bacteriophage), các virut kí sinh trên tảo, nấm, động vật nguyên sinh, các virut kí sinh trên thực vật và động vật, virut học hiện biết tới 79 họ, có 10.000 loài và dạng được thống kê *.

2. Bacteriology: Khoa học nghiên cứu cơ thể nhân sơ, bao gồm các vi sinh vật cổ và vi khuẩn (tên cũ gọi là vi khuẩn cổ–Archaeobacteria và vi khuẩn chuẩn – Eubacteria). Hiện khoa học biết được khoảng 1500 loài vi khuẩn lam và 2000 loài vi khuẩn khác *

3. Mycology: Khoa học nghiên cứu về nấm. Giới nấm gồm ba ngành: nấm thực bào (nấm nhày) (Gymnomycota), nấm roi (Mastigomycota) và nấm không roi (Amastigomycota); có thể chia thành 11 lớp với các nhóm bậc thấp như: nấm amíp

* Theo Nelson, Biology. 2003.

187

(Myxomycetes), lớp nấm roi sau (Chytridiomycetes), lớp nấm noãn (Oomycetes) và nấm tiếp hợp (Zygomycetes), chúng lập thành giới phụ nấm cổ (Archimycota).

Các lớp nấm bậc cao chủ yếu là: Nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm (Basidiomycetes) và nấm bất toàn (Adelomycetes hay Deuteromycetes).

4. Algology: Khoa học nghiên cứu về vi tảo, khoa học hiện biết 15.000 loài tảo *.

5. Protozoology: Khoa học nghiên cứu về động vật nguyên sinh, 30.000 loài động vật nguyên sinh được thống kê *.

Số lượng cá thể của từng nhóm cũng như số nhóm vi sinh vật có thể thay đổi theo điều kiện sinh thái cụ thể, hơn nữa tại một số vùng sinh thái số lượng đó cũng thay đổi theo chiều sâu các lớp đất và các lớp nước. Trong 1g đất trồng có khoảng 109

– 1010 mầm vi sinh vật (CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc), trong 1ml dịch dạ dày của động vật nhai lại có 109 mầm vi sinh vật, trong 1g phân người chứa tới 1012 mầm sống hiển vi.

Có thể sử dụng kính hiển vi quang học (kính hiển vi thường), kính hiển vi nền đen, kính hiển vi đối pha, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử thường (TEM), kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Muốn nghiên cứu cấu tạo siêu hiển vi của các vi sinh vật và tế bào sống, người ta dùng phổ biến các phương pháp siêu li tâm với tốc độ 5 vạn vòng phút hay nhanh hơn nữa cho phép lắng đọng thành lớp các hạt vi mô và những phân tử lớn hơn; dùng máy cắt lớp siêu mỏng có thể cắt tế bào nấm men (đường kính khoảng 10m) ra 100 lát. Những lát cắt như vậy cho phép nhìn cấu trúc dưới mức tế bào. Các phương pháp đồng vị phóng xạ (thường dùng S35 đối với prôtêin chứa S và P32 đối với axit nucleic), huỳnh quang kháng thể cho phép theo dõi các quá trình tổng hợp sinh học bên trong tế bào ở mức độ phân tử, nhiễu xạ quang để nghiên cứu cấu trúc không gian của những phân tử. Sử dụng các phương pháp sắc kí, điện di (ví dụ điện di trên gel các poliacrylamit) để tách các hợp chất, dùng các vi điện cực để đo thế hiệu các lớp màng trong và ngoài tế bào. Một nhóm phương pháp rất phổ biến trong vi sinh học là phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặc để nghiên cứu khả năng hiếu khí của tế bào và các hợp chất mà chúng tiết ra, các phương pháp cố định và nhuộm màu (nhuộm đơn, nhuộm kép, nhuộm phân li...) để nghiên cứu hình dạng, kích thước và một số cấu tạo trong tế bào vi sinh vật.

Vi sinh vật có nhiều chức năng quan trọng trong môi trường tự nhiên, trong đó có thể tóm tắt:

a – Phân giải các hợp chất hữu cơ (vô cơ hoá).

* Theo Nelson, Biology. 2003.

188

b – Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các vi sinh vật hoá dị dưỡng hữu cơ khác, tức là chuyển hoá nhanh các chất hữu cơ trong chu trình thức ăn.

c – Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức ăn.

d – Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được.

e – Biến đổi rất lớn các chất bằng cách hình thành các chất hoà tan và khí, từ đó tạo ra các chất tham gia vào các con đường chuyển hoá trực tiếp hoặc biến đổi môi trường một cách gián tiếp.

g – Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác, của thực vật và động vật.

Do đó, số lượng và chủng loại vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng và luôn biến đổi. Ở một nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng, các chất độc hại và các tác nhân giới hạn khác.

Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S, P... và có khả năng chuyển hoá các hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc, vàng, thuỷ ngân, đồng, kẽm... thành các dạng không độc hoặc ít độc hơn đối với cơ thể người, động vật và cây trồng.

Người ta sử dụng các kĩ thuật khác nhau để đánh giá sự có mặt, các loại và hoạt động của vi sinh vật trong môi trường. Đối với các mẫu nước ô nhiễm, nước cống rãnh chứa nồng độ chất hữu cơ cao và chứa nhiều vi sinh vật, người ta có thể đo lượng cacbon hữu cơ bằng chỉ số BOD (nhu cầu sinh hoá đối với ôxi) và COD (nhu cầu hoá học đối với ôxi).

Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn gia súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ vệ sinh môi trường làm việc và hoạt động sống.

III. VI KHUẨN

Vi sinh vật, đặc biệt vi khuẩn là mô hình lí tưởng trong công nghệ di truyền, công nghệ sinh học. Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người, động vật và cây trồng. Hiện có khoảng 1000 loại virut gây bệnh trên thực vật, gần 90% các bệnh đường hô hấp ở người là do virut, trong đó có bệnh viêm đường hô hấp cấp (bệnh SARS), HIV/AIDS vẫn là một đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi. Các bệnh vi khuẩn trên người cũng rất nhiều như viêm xoang mũi (Staphylococcus sp.), bạch hầu (Corynebacterium diphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), tả (Vibrio cholerae), lị trực khuẩn (Shigella spp.), lậu (Neisseria gonorrboeae), giang mai (Treponema pallidum), lao phổi (Mycobacterium tuberculosis), ...

189

Những hình dạng chính của vi khuẩn:

+ Cầu khuẩn (coccus): Khi phân chia theo một phương và dính nhau, ta có song cầu khuẩn (Diplococcus), hoặc chuỗi cầu khuẩn, liên cầu khuẩn (Streptococcus), phân chia hai phương và dính với nhau ta có Tetracoccus, phân chia ba phương và dính với nhau ta có Sarcina hoặc phân chia theo nhiều phương ta có tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) (đường kính 0,8 – 1,0m).

+ Trực khuẩn:

– Trực khuẩn không sinh bào tử như Escherichia coli... (0,5 2 – 3m).

– Trực khuẩn sinh bào tử: Bacillus, Clostridium với kích thước khoảng 2 – 3 1m.

+ Xoắn khuẩn và xoắn thể: Xoắn khuẩn như Spirillum, Campylobacter, xoắn thể với các vòng khác nhau: Spirochaeta, Leptospira (1 5 – 500m).

+ Xạ khuẩn: Gồm những vi khuẩn thuộc bộ Actinomycetales trong đó có các giống quan trọng như Streptomyces, Micromonospora...(1 – 2 100 – 5000m).

+ Vi sinh vật hình sao như giống Stella và vi sinh vật hình vuông như giống Haloarcula, một loại vi sinh vật cổ ưa mặn.

Một số hình dạng vi khuẩn được giới thiệu trong hình I–1.

190

Hình I.1. Một số hình dạng vi khuẩn

a- Tụ cầu (Staphylococcus aureus) nhuộm Gram dương (màu tím, 1.000)

b- Enterococcus faecalis, chuỗi cầu ( 200)

c- Thực khuẩn (Bacillus megaterium), tạo thành chuỗi, nhuộm Gram dương (màu tím, x 600)

d- Xoắn khuẩn đỏ (Rhodospirullum rubrum, 500)

e- Phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) có tiên mao ở cực ( 1.000)

f- Xạ khuẩn (Actinomyces) dưới kính hiển vi điện tử quét ( 21.000)

g- Mycoplasma pneu moniae dưới kính hiển vi điện tử quét ( 62.000)

h- Archaeoglobus fulgidus, loại vi sinh vật cổ có tiên mao ( 40.000)

191

g

a b

dc

fe

h

Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã biết rất rõ tổ chức dưới mức tế bào của vi khuẩn:

– Lớp màng nhày (capsule)

– Thành tế bào (cell wall)

– Màng tế bào chất (membrane cytoplasmic)

– Chất nguyên sinh với các thành phần quan trọng cho sự sống của vi khuẩn: vật chất nhân, ribosom, plasmid, mesosom, cacboxysom, chất mang màu (ở vi khuẩn quang hợp), không bào khí, các chất dự trữ…

Hình I.2.. Sơ đồ cấu tạo vi khuẩn

Nhiều vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bằng một lớp màng nhày có bản chất hoá học là polisaccharit của một loại gốc đường (homopolisaccharit) hoặc của nhiều gốc đường khác nhau (heteropolisaccharit), ở một số vi khuẩn trong vỏ nhày còn chứa một ít lipoprôtêin, người ta xác định được 90 – 98% trọng lượng màng nhày là nước.

Màng nhày có tác dụng hạn chế khả năng thực bào, do đó tăng cường độc lực

192

(ADN)

(Pili)

(Cilia)

(flagella)

đối với vi khuẩn gây bệnh, do cấu trúc hoá học của màng nhày là polisaccharit có ít lipoprôtêin nên có liên quan đến tính kháng nguyên của vi khuẩn gây bệnh.

Hợp chất cơ bản của thành tế bào vi khuẩn là hai chất dị cao phân tử (heteropolyme): glucopeptit và axit tecoic. Glucopeptit (hay còn gọi là peptidoglycan, mucopetit, murein) là khung chắc giữ vững hình dạng vi khuẩn, khi thuỷ phân glucopeptit ta sẽ được hai hợp chất với số phân tử Gram như nhau là N–axetyl Glucozamin và axit N–axetyl muramic, chúng liên kết với nhau qua liên kết 1,4 glucozit.

Enzim lyzozim cắt liên kết glucozit giữa C1 còn lại của axit N–axetyl muramic và C4 còn lại của N–axetylglucozamin (liên kết –1,4). Các gốc N–axetyl muramic liên kết với nhau qua dây nối peptit, tạo ra mạng lưới chằng chịt như tổ ong, trong thành phần của axit N–axetyl muramic có mặt của các axit amin với trọng lượng phân tử Gram: 2 D.L.alanin, 1 D. glutamic và 1. Axit điamin. Axit điamin này ở St.aureus là lyzin; ở E.coli là axit L – điaminpimelic (ADP), các axit điamin này có thể kết hợp với mạch peptit của chuỗi bên, do đó mà hình thành một mạng murein chắc chắn.

Hình I.3. Sơ đồ thành vi khuẩn

a. Sơ đồ cấu trúc peptidoglucan.

b. Lớp thành dày của vi khuẩn Gram dương, màng lưới murein đan xen với

hai loại axit teicoic.

Ta thấy đơn phân murein lặp đi lặp lại có tỉ lệ phân tử gram như sau:

N–axetylglucozamin : Axit N–axetylmuramic : L.ala : D.glu : Axit diamin : L.ala = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1.

193

a b

A.ribiteicoic

Đây chính là nét đặc trưng của thành tế bào vi khuẩn. Trong khi đó thành của Archaea không chứa axit axetylmunamic nhưng chứa axit talozaminuronic vì vậy ở vi sinh vật cổ có thành là Pseudomurein.

Ngoài ra, trong chuỗi peptit còn có một số sai khác về thành phần và trật tự các axit amin.

Đối với nhóm vi khuẩn tiêu giảm thành tế bào (Mycoplasmatales, Mollicutes, Tenericutes), người ta không tìm thấy các hợp chất murein. Những vi khuẩn này không có thành rắn chắc cho nên chúng có thể thay đổi hình dạng, phần lớn chúng là những cơ thể đa hình như các dạng PPLO, Mycoplasma (vi khuẩn nhỏ nhất có thể nuôi cấy trên môi trường).

Trong thành tế bào vi khuẩn còn có một loại hợp chất đặc biệt đó là axit teicoic, hợp chất thấy nhiều ở vi khuẩn Gram dương (có thể chiếm tới 50% trọng lượng khô của thành xạ khuẩn), ở vi khuẩn Gram âm hiện chưa tìm thấy hợp chất này. Axit teicoic liên kết với axit muramic qua mạch photphođieste. Axit teicoic có hai loại là ribiteicoic và glyxêrin teicoic.

Bên ngoài thành tế bào là lớp S (lớp không cố định về thành phần các hợp chất và độ lớn), lớp bên ngoài này thấy ở một số loài Bacillus, Clostridium, đặc biệt thấy ở nhiều loài vi khuẩn Gram âm, vì vậy tạo ra các lớp màng ở ngoài thành vi khuẩn Gram âm rất phức tạp và không đồng nhất đối với các loài khác nhau.

Hình I.4. Thành và các lớp màng ở vi khuẩn Gram âm.

Phân tử đặc trưng ở lớp màng ngoài vi khuẩn Gram âm là phân tử lipopolisaccarit (LPS) có cấu tạo gồm 3 phần: phần lipit A ở gốc, polisaccarit ở giữa và chuỗi đường phân nhánh O, phần lipit A ăn sâu vào màng ngoài, còn phần polisaccarit và chuỗi đường xetodezoxioctonat ở phía ngoài nằm ở lớp S của tế bào. Ở Salmonella chuỗi đường phân nhánh O là kháng nguyên O của vi khuẩn và rất khác nhau ở các loài khác nhau (Hiện biết tới 170 KN–O, 100 KN – K và 55 KN – H ở

194

Salmonella).

Ở vi khuẩn Gram âm, lớp LPS tích điện âm; còn ở vi khuẩn Gram dương, axit teicoic vượt ra ngoài lớp murein, vì axit này tích điện âm nên làm cho thành tế bào vi khuẩn Gram dương ở phía ngoài cũng tích điện âm.

Thành phần của thành tế bào là một chỉ tiêu sinh hoá quan trọng (các hợp chất peptidoglucan, các polisaccharit, các loại axit teicoic) dùng trong phân loại số để phân loại loài và giống.

Thành tế bào vi khuẩn có chức năng quan trọng là giữ hình dạng ổn định của tế bào, tham gia và việc duy trì áp suất thẩm thấu, sự phân bào, tham gia vào quá trình nhuộm Gram…

Từ những đặc điểm trên và tính chất của protêin tế bào chất đã quyết định tính nhuộm Gram khác nhau giữa 2 nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Xem thêm phần thực hành ở cuối sách).

Trong môi trường đẳng trương, khi vi khuẩn mất thành sẽ vón thành hình cầu, ở vi khuẩn Gram dương sẽ tạo thành tế bào trần (Protoplast), còn ở vi khuẩn Gram âm sẽ hình thành thể hình cầu (Spheroplast).

Người ta có thể làm mất thành tế bào vi khuẩn bằng lyzozim trong dung dịch đẳng trương có đường, enzim này tác động vào mạch – 1,4 Glucozit giữa axit N–axetylmuramic và N–axetyl glucozamin. Penicillin khi mở vòng –lactam sẽ tác động vào mối liên kết của sự vận chuyển peptit, do đó Penicillin cản trở sự tổng hợp mạch peptit bình thường của thành tế bào. Tác động vào mạch ngang nối các mạch peptit trong murein còn có một enzim có tên là Endomuropeptiđaza.

Màng tế bào chất

Màng tế bào chất của vi khuẩn và vi sinh vật cổ có thể thấy được nhờ gây co nguyên sinh; lớp màng này dưới kính hiển vi đối pha là lớp có độ dày khoảng 7,5nm, nằm ngay dưới lớp thành hoặc các lớp màng ngoài, nó bao bọc toàn bộ khối chất nguyên sinh, khoa học còn gọi nó là màng cơ sở vì có cấu tạo giống hầu hết các màng trong tế bào như màng nhân, màng ti thể, lục lạp, màng lưới nội chất, màng bào quan…

195

Hình I.5. Sơ đồ cấu tạo màng tế bào chất

Sơ đồ màng khảm động (để dễ hình dung, các phân tử photpholipit được làm to hơn so với các

prôtêin) (Theo Tracey Green Wood et al. Biology, 2003)

Màng tế bào chất ở vi khuẩn không hình thành màng lưới nội chất, nhưng ở một

số loại vi khuẩn (như vi khuẩn nitrat hoá, vi khuẩn quang hợp…), người ta thấy màng

tế bào chất gấp lại thành màng trong của tế bào. Màng tế bào chất của vi khuẩn khác

với màng tế bào chất của cơ thể nhân thực ở chỗ nó không chứa cholesterol (một loại

sterol), nhưng màng tế bào chất vi khuẩn lại chứa sterol pentacyclic như hopanoid.

Phân tích hoá sinh cho thấy màng tế bào chất gồm 3 loại phân tử: lipit (chủ yếu

ở dạng photpholipit – chiếm khoảng 30 – 40%), prôtêin (gồm rất nhiều hệ enzim,

trong đó có các hệ permeaza, thành phần prôtêin này có thể chiếm tới 60 – 70%) và

một ít hợp chất gluxit. Các photpholipit có thể là phophatidylglyxerol và hoặc

photphatidylethanolamin. Các photpholipit dưới kính hiển vi điện tử gồm hai lớp phân

tử trong suốt, trong khi các lớp prôtêin có màu đậm tối.

Chức năng chủ yếu của màng tế bào chất là tấm bình phong ngăn trở dòng các chất ra, cũng như cho đi qua các hợp chất từ phía ngoài vào. Nó đảm bảo tế bào hấp thụ được các chất dinh dưỡng, các nguyên tố có lợi cho quá trình trao đổi chất. Nó lựa chọn cho đi qua cả những phân tử chất hữu cơ loại nhỏ đồng thời ngăn cản các hợp chất phân tử lớn. Đối với các phân tử bé kị nước như O 2, N2, CH4, N2O, H2 hoặc các phân tử có cực nhưng không tích điện như H2O, urê, CO2… màng tế bào chất thể hiện như một màng vật lí cho đi qua theo quy luật lí học.

Màng tế bào chất chứa các enzim sinh tổng hợp kiểm soát các khâu kết thúc tổng hợp lipit của màng và các hợp chất kiến tạo thành tế bào.

Cuối cùng, màng thế bào chất là nơi định vị của nhiều enzim tham gia tổng hợp ATP. Ở các cơ thể nhân thực, các enzim này có mặt ở trong các ti thể. Các chuỗi hô hấp của màng tế bào chất vi khuẩn và vi sinh vật cổ làm chức năng tương tự như màng

196

trong của ti thể.

Khi màng tế bào chất gấp nếp để biến thành mezosom thì nó là nơi định vị của ADN của tế bào nhân sơ. Các hạt này có lẽ đóng vai trò quan trọng làm điểm khởi đầu của quá trình nhân đôi vòng ADN và vách ngăn trong sự phân bào vô tơ thành hai tế bào con. Sự gấp nếp của màng tế bào chất còn thấy ở vi khuẩn tía, ở đây chúng hình thành các túi hoặc các ống chứa sắc tố quang hợp. Ở các vi khuẩn cố định đạm, hệ nitrogenaza bị ức chế bởi O2, sẽ được bảo vệ trong các nếp gấp của màng tế bào chất. Trong các vi khuẩn nitrat hoá, rất nhiều nếp gấp của màng tế bào chất làm tăng bề mặt tiếp xúc của các hệ enzim thực hiện quá trình này.

Ở các vi sinh vật metan (vi sinh vật cổ) cũng có các cấu tạo gấp nếp màng tế bào chất, đây là nơi định vị của nhiều sắc tố loại bacteriorhodopsine, là sắc tố rất đặc trưng của Archaea. Sắc tố này tạo ra một gradient vận chuyển các proton qua màng nhờ tác động của ánh sáng.

Tế bào chất và các hạt nội bào

Tế bào chất của cơ thể nhân sơ gồm có 80 – 90% là nước. Nước có thể ở trạng thái tự do (chiếm phần lớn) làm nhiệm vụ hoà tan các chất và tạo nên dung dịch keo với các chất cao phân tử. Nước ở trạng thái kết hợp (phần nhỏ) thường liên kết trong các vi cấu trúc như prôtêin, lipit và hiđrat cacbon. Phần còn lại của tế bào chất là lipoproteit (chiếm từ 10 – 20%). Hệ keo của tế bào chất bao gồm 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch muối khoáng và các hợp chất hoà tan có bản chất là lipoproteit; pha thứ hai là pha huyền phù gồm các hạt nuclêôprôtêin, lipit và nhiều loại hạt có kích thước rất khác nhau.

Khi còn non, đang sinh trưởng, chất nguyên sinh có cấu tạo đồng nhất và bắt màu giống nhau. Khi trưởng thành, trong chất nguyên sinh xuất hiện các vật thể ẩn nhập, không bào khí làm cho tế bào chất có dạng huyền phù lổn nhổn bắt màu không đồng đều và có tính chiết quang khác nhau. Tế bào chất của vi khuẩn có pH bình thường là 7 – 7,2. Để nghiên cứu tế bào chất, người ta dùng siêu li tâm cao tốc để tách chất nguyên sinh và các cấu trúc siêu hiển vi riêng ra.

Trong tế bào chất, ngoài vật chất nhân, các hạt và các cấu trúc thường thấy là ribosom, các axit ribonucleic, các chất dự trữ ẩn nhập và vài bào quan chuyên hoá đặc biệt.

Các chất dự trữ có thể chia thành 2 loại:

– Các chất vô cơ như volutin (dự trữ photphat), hạt lưu huỳnh (ở các vi khuẩn lưu huỳnh)…

197

– Các chất hữu cơ như PHB (polihiđroxybutyrat), glicogen, cyanophyxin (chất dự trữ nitơ ở vi khuẩn lam), hạt cacboxysom (chứa enzim ribulozo–1,5 diphotphat–cacboxylaza, nơi cố định CO2)... Như vậy ta thấy trong Cyanobacteria có các hạt dự trữ phổ biến là cyanophyxin, cacboxysom và không bào khí.

Các hạt dự trữ cacbon dễ dàng nhìn thấy khi nhuộm bằng dung dịch có iot, hợp chất này nhuộm các hợp chất đa trùng hợp (polime) không phân nhánh của glucozơ (tinh bột) thành màu xanh thẫm và các hiđrat cacbon phân nhánh (glicogen) thành đỏ nâu. Các hợp chất poli––hiđroxy butyrat được nhuộm màu bởi Sudan đen như màu các giọt mỡ.

Chất nhân (thể nhân – Nucleoid) của vi khuẩn

ADN của tế bào vi khuẩn chiếm khoảng 1 – 2% trọng lượng khô của chúng, đó là hợp chất chứa đựng lượng thông tin di truyền chủ yếu của tế bào. Để xác định chất nhân của vi khuẩn, người ta dùng phản ứng Feulgen.

Chất nhân của vi khuẩn không có màng bọc, hình dạng chất nhân rất khác nhau, chỉ có một chuỗi gồm hai mạch ADN. Chiều dài của nó trong tế bào E.coli đo được là 1mm, tức là gấp từ 500 đến 1000 lần chính chiều dài của vi khuẩn. Vòng thể nhiễm sắc được định vị tại một điểm trên màng tế bào chất lúc sắp phân chia. Độ lớn ADN vào khoảng 5.106pb (cặp bazơ nitơ) với trọng lượng phân tử vào khoảng 3.109 dalton (4,5.108 đối với Mycoplasma, 1.109 đối với Acholeplasma). Không thấy có histon kiểu tế bào nhân thực, mà chỉ có các poliamin như specmidin và specmin làm chức năng củng cố ổn định ADN.

Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy ở Thermoplasma (một loại vi sinh vật cổ – Archaea) đã tìm thấy histon.

Vật chất di truyền ngoài thể nhiễm sắc bao gồm ADN của các plasmid, các yếu tố giới tính, các yếu tố “diệt”, một số prophage…

Khoa học đã xác định plasmid có ở rất nhiều loài vi khuẩn.

Tiên mao (flagella), tiêm mao (cillia) và nhung mao(pilia)

Tiên mao thường thấy ở Vibro, Spirillum và ở nhiều loài vi khuẩn Gram âm. Số lượng tiên mao có thể từ 1 đến 30 sợi tùy thuộc vào loài vi khuẩn. Một tiên mao có chiều dài từ 6 đến 30m và đường kính từ 10 đến 30nm (12nm ở Proteus, từ 20 đến 25nm ở Vibiro và Pseudomonas). Khi tiên mao ngắn thì người ta thường gọi là tiêm mao. Tiên mao có cấu tạo từ một loại đơn phân prôtêin gần với keratin mà người ta gọi là flagelline; prôtêin này có trọng lượng phân tử khoảng 40.000 (trong đó các axit amin chủ yếu là acginin, lysin, axit aspactic, axit glutamic); những prôtêin này có tính

198

kháng nguyên (H).

Tiên mao giúp cho vi khuẩn chuyển động. Khi vi khuẩn di động, tiên mao xoáy vào nước hoặc môi trường lỏng (có thể 100 vòng trong 1 giây), trong khi tiêm mao chuyển động như que gạt. Mặc dù vậy, trong Vi sinh học người ta thường dùng tiên mao và tiêm mao với một nghĩa khác với chúng là nhung mao, là những sợi mảnh và ngắn hơn nhiều, thường có xung quanh tế bào Gram âm, ít thấy ở vi khuẩn Gram dương.

Các loại bào tử của vi khuẩn

+ Nội bào tử vi khuẩn (endospore)

Một số loài vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng ở môi trường cạn kiệt và chất qua trao đổi độc hại quá nhiều, hoặc có sự thay đổi đột ngột các điều kiện sinh trưởng, có khả năng hình thành bào tử ở bên trong tế bào, nên gọi là nội bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ tạo một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là bào tử sinh sản. Nội bào tử có thể ở giữa hay lệch tâm của tế bào sinh dưỡng.

+ Khác với nội bào tử, ở một số loài vi khuẩn có thể hình thành bào tử bên ngoài tế bào (ngoại bào tử – exospore), bào tử nhày (Myxospore), bào tử giáp (Cyste) và các bào tử đốt (Arthrospore hay Conidium) là những bào tử sinh sản.

Ví dụ xạ khuẩn, có thể sinh sản bằng bào tử đốt, ngoài ra có loại có thể sinh sản bằng cách nảy chồi (ví dụ vi khuẩn tía quang dưỡng Rhodomicrobium vanniellii).

Ở vi khuẩn, quá trình hình thành nội bào tử có thể chia làm 6 – 7 giai đoạn, trong đó có giai đoạn IV – là giai đoạn hình thành lớp vỏ dày (Cortex) kèm theo sự hình thành hợp chất đặc trưng axit dipicolinic giúp cho bào tử bền nhiệt.

Khi đưa bào tử vào môi trường thuận lợi để phát triển, bào tử sẽ có hàng loạt thay đổi tích cực và mọc mầm. Quá trình mọc mầm gồm 3 giai đoạn chủ yếu: hoạt hoá, nứt vỏ và mọc ra. Muốn quan sát được bào tử, người ta dùng phương pháp nhuộm đơn hoặc kép.

Ở một số vi khuẩn sinh nội bào tử, ví dụ Bacillus thuringiensis (BT) thường hình thành tinh thể diệt sâu bọ. Khi sâu ăn phải dưới tác động pH kiềm, proteaza của ruột sâu, nên endotoxin tinh thể này được hoà tan ra và trở thành prototoxin có hoạt tính làm tê liệt đường tiêu hoá của sâu ăn phải.

Khi hình thành bào tử, tế bào có thể mất đi đến 70% nước. Một số vi khuẩn khi hình thành bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên, ví dụ Bac. anthracis có thể tiềm sinh trong nhiều năm. Trong một số chất độc,

199

tế bào vi khuẩn chết rất nhanh, nhưng bào tử có thể tồn tại được khá lâu, ví dụ trong phenol có thể vẫn sống trong 15 ngày, trong HgCl2 1% – tồn tại trong 2 ngày. Thời gian để hình thành bào tử khác nhau tuỳ theo loài (vài giờ – 20 giờ).

IV. ARCHAEA

So sánh một số tính chất giữa vi khuẩn và Archaea

Tính chất Vi khuẩn Archaea

Thành phần thành tế bào Murein Pseudomurein, prôtêin,

polisaccharit

Lipit của màng Glyxerol, axit béo, este Glyxerol, ete isopranyl

Hình dạng tế bào có loại

hình vuông và dẹt

– + (hoặc không)

Nội bào tử (endospore) + hoặc không –

Chất ‘ở nhánh’ của

ARNt

Ribothymidine Pseudouridine hoặc

L.methylpseudouridine

Hình thành chất kích

thích methyonyl ARNt+ –

Có intron trong genom – + (nhiều loài)

Có polimeraza–ARN

loại nhân thực– +

Có coenzim đặc biệt – +

Những nghiên cứu gần đây về nhiệt độ và pH tối ưu của vi khuẩn ưa nhiệt và Archaea cho phép chia vi sinh vật cổ (Archaea) thành 2 nhóm: Crenarchaeota và Euryarchaeota; dựa trên ARNr trong Bergey’s Manual mới xuất bản đã chia Archaea

200

thành 2 giới (Kingdom):

Giới Crenarchaeota là những vi sinh vật cổ kị khí bắt buộc, ưa nhiệt và ưa axit.

Giới Euryarchaeota là những vi sinh vật cổ ưa mặn, sinh metan và một vài loài kị khí ưa nhiệt.

Có 3 nhóm sinh lí và sinh thái quan trọng là:

1) Các cơ thể sinh metan (methanogen), đây có lẽ là nhánh cổ xưa nhất, ở các lớp nước sâu, ở đáy, kị khí, một số loài tìm thấy trong đường tiêu hoá của động vật nhai lại.

Phân loại cơ thể sinh metan dựa chủ yếu vào khả năng và cơ chế sinh metan của chúng.

Ví dụ những cơ thể sinh metan như: Hansenula polymorpha, Metlylo monas...

2) Các cơ thể ưa mặn (halophile), những cơ thể này sống trong môi trường có nồng độ muối cao (ở biển, ở mỏ muối), hấp thụ chất dinh dưỡng chủ yếu là do chênh lệch gradien nồng độ muối tạo ra; quá trình quang hợp ở đây khá đặc biệt nhờ bacteriorhodopsine, hợp chất liên kết với màng tế bào chất chứ không phải là khuẩn diệp lục.

Ví dụ: ta gặp nhiều loài của Haloarcula (vi sinh vật cổ hình vuông) và Halobacterium.

3) Các cơ thể ưa nhiệt, ưa axit (thermoacidophile), là những cơ thể sống ở nguồn đất – nước nóng, ở vùng núi lửa như các loài của Sulfolobus, Thermoplasma, chúng là những cơ thể hiếu khí hoặc hiếu kị khí.

Ví dụ: Sulfolobus acidocaldaricus có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 900C và tối ưu là 750C ở pH tối ưu là 2,5. Thermoplasma acidophilum có Tmax là 650C, pHopt là 1,5.

Một số Archaea ưa mặn có trên màng tế bào sắc tố bacteriorhodopsine, chúng là những cơ thể quang dưỡng hữu cơ (photoorganotroph), còn sự chuyển hoá vật chất của các Archaea hoá tự dưỡng vô cơ (chemolithoautotroph) thì nhờ năng lượng của các phản ứng oxi hoá khử.

V. VI SINH VẬT NHÂN THỰC

Sự khác biệt rõ ràng nhất so với các tế bào nhân sơ là tế bào nhân thực có cấu trúc màng bao quanh nhân, các bào quan. Các cơ quan này là những hạt có cấu trúc đặc trưng nằm trong tế bào chất, mỗi cấu trúc thực hiện những chức năng riêng.

201

Chức năng chính của các bộ phận tế bào nhân chuẩn có thể tóm tắt:

1) Tế bào chất: Nơi có các bào quan khác nhau, nơi diễn ra các quá trình chuyển hoá vật chất

2) Vi sợi (microfilament), sợi gian bào (filament intermediate) và các vi ống (microtubule):

Cấu trúc tạo bộ khung tế bào, vận chuyển nội bào, chuyển động tế bào

3) Màng lưới nội chất: Vận chuyển các chất, tham gia tổng hợp lipit và prôtêin

4) Ribosom: Tổng hợp prôtêin

5) Thể Gôngi: Bọc gói và tiết các chất, hình thành các hạt lyzôxôm

6) Lyzôsôm: Tiêu hoá nội bào

7) Ti thể: Giải phóng năng lượng từ chu trình axit tricacboxilic, của sự vận chuyển electron, của quá trình photphorin ôxi hoá và từ các con đường khác

8) Lục lạp: Quang hợp thu tóm năng lượng ánh sáng và hình thành các gluxit từ CO2 và nước

9) Nhân: Chứa thông tin di truyền, trung tâm điều hành hoạt động tế bào

10) Vùng nhân bé (hạch nhân), (nucleolus):

Tổng hợp ARNr, hình thành các ribôsôm

11) Thành tế bào và các lớp ngoài:

Tạo nên hình dạng tế bào và sự cứng rắn

12) Roi, lông: Chuyển động tế bào

1. Tế bào chất (cytoplasm)

– Phần vật chất chủ yếu của tế bào (trừ nhân), cấu tạo từ dịch có cấu trúc phức tạp khác nhau (chất vô cơ và hữu cơ, nước có hàm lượng lớn), trong tế bào chất có các

202

bào quan như màng lưới nội chất, thể Gôngi, ti thể, lục lạp và các thể mang màu khác nhau (ở vi sinh vật quang hợp), ribôsôm... Ở trong dịch tế bào (Cytosol, bào tương) diễn ra các quá trình chuyển hoá vật chất.

Trong tế bào chất còn có các sợi gian bào có đường kính 8 – 10nm. Các sợi gian bào cùng với vi sợi và vi ống tạo nên bộ khung tế bào giữ hình dạng tế bào và giúp chúng chuyển động. Ở các tế bào nhân sơ không có khung tế bào được tổ chức như vậy và không có prôtêin actin.

Hình I.6. Sơ đồ màng lưới các vi ống, vi sợi và các sợi gian bào

của tế bào vi sinh vật nhân thực

ER – màng lưới nội chất; MT – vi ống; M – ti thể;

PM – màng tế bào chất; R – Ribôsôm tự do hoặc poliribôsôm.

2. Màng lưới nội chất

Cùng với bộ khung tế bào và màng lưới các vi ống, vi sợi, còn có một hệ thống các ống màng liên kết chằng chịt, phân nhánh có kích thước đường kính khoảng 40 – 70nm với vô số các túi dẹt. Toàn bộ hệ thống các ống này và các túi dẹt được gọi là màng lưới nội chất (endoplasmic reticulum – ER). Cấu tạo màng lưới nội chất thay đổi theo trạng thái hoạt động chức năng của tế bào. Ví dụ khi tế bào đang cần tổng hợp một lượng lớn prôtêin trong quá trình tiết dịch, thì một bộ phận rất lớn màng lưới nội chất có trên mặt phủ đầy ribôsôm, do đó có tên gọi là màng lưới nội chất xù xì (RER). Ở tế bào khác khi cần sản xuất nhiều lipit sẽ có phần lớn ER không có ribôsôm đính vào và do đó những ER không có ribôsôm được gọi là màng lưới nội chất nhẵn (REL).

203

ER có vô số chức năng, nó là hệ thống vận chuyển các prôtêin, lipit và những hợp chất khác được tế bào tiết ra. Các prôtêin được tổng hợp nhờ các enzim và ribôsôm liên kết ở ER. Các chuỗi polipeptit được tổng hợp nhờ các ribôsôm liên kết ở RER có thể đi vào trong màng của ER hoặc được tiết vào khoảng giữa các lớp màng của ER.

ER cũng là nơi chủ yếu tổng hợp lớp màng tế bào.

3. Thể Gôngi

Thể Gôngi là một bào quan cấu trúc màng được tạo bởi các túi dẹt sắp xếp cái nọ trên cái kia.

Hình I.7. Sơ đồ cấu trúc thể Gôngi

Thể Gôngi có mặt trong phần lớn các tế bào nhân thực, nhưng cũng có một số nấm và động vật nguyên sinh có roi không có thể Gôngi thực thụ, đôi khi ở chúng chỉ có một túi dẹt làm chức năng như thể Gôngi; trái lại rất nhiều tế bào nhân thực có thể chứa đến 20 túi dẹt, trong trường hợp này chúng có tên là hạt đĩa (dictyosome) và có thể tập trung trong một vùng hoặc phân tán trong tế bào.

Thể Gôngi làm chức năng bao gói và tiết các chất. Ngoài ra còn thấy chúng thực hiện một số chức năng khác, như tham gia hình thành thành cứng của tảo silic (Diatomea), một số nấm. Trong quá trình tiết dịch các dịch tiết được vận chuyển từ ER đến thể Gôngi và thường được tách ra từ ER, được chuyển đến thể Gôngi và hợp

204

nhất với túi cis. Như vậy là thể Gôngi có mối liên hệ chặt chẽ với ER cả về cấu trúc và chức năng.

4. Lyzôxôm và nội bào tiêu (endocytosis)

Hình I.8. Sơ đồ cấu tạo, hình thành và chức năng lyzôxôm

Một chức năng quan trọng nhất của thể Gôngi và mạng lưới nội chất (ER) là tổng hợp một loại bào quan khác đó là lyzôxôm. Lyzôxôm thấy có ở nhiều loại vi sinh vật nhân thực như động vật nguyên sinh, một số loại tảo đơn bào và nấm, cũng như trong động vật và thực vật. Các lyzôxôm có dạng hình cầu, được bao bọc bởi một lớp màng, với kích thước từ 50nm đến vài m tuỳ loài. Chúng là nơi tiêu hoá nội bào vì trong lyzôxôm chứa các enzim cần thiết để tiêu hoá tất cả các phân tử lớn. Các enzim này gọi là enzim thuỷ phân xúc tác cho quá trình thuỷ phân các phân tử và chỉ hiệu quả nhất trong điều kiện axit yếu (thường vào khoảng pH 3,5 và 5). Các lyzôxôm giữ được môi trường axit bên trong nhờ bơm proton từ phía ngoài. Các enzim tiêu hoá được tổng hợp nhờ RER và được bao gói nhờ thể Gôngi để hình thành nên lyzôxôm. Một bộ phận của REL ở gần thể Gôngi cũng có thể tách ra và hình thành các hạt lyzôxôm.

205

Một điểm đáng chú ý của lyzôxôm là khi thực hiện tất cả chức năng tiêu hoá của mình thì lyzôxôm không giải phóng các enzim tiêu hoá vào tế bào chất

5. Các ribôsôm của tế bào nhân thực

Các ribôsôm của tế bào nhân chuẩn có thể đính vào màng lưới nội chất hoặc tự do trong tế bào chất; chúng là những hạt 80S, lớn hơn ribôsôm 70S của vi khuẩn.

Một số loại prôtêin được tổng hợp ở các ribôsôm tự do có thể tham gia vào hình thành các bào quan như nhân, ti thể và lục lạp. Rất nhiều ribôsôm thường liên kết với một ARNm và dịch mã đồng thời thông tin ARNm thành các phân tử prôtêin giống nhau. Tập hợp ARNm và ribôsôm này được gọi là poliribosom hay polisom.

6. Ti thể

Ti thể có mặt trong phần lớn tế bào nhân chuẩn, là “trung tâm điện năng” của tế bào. Ti thể là nơi hoạt động của chu trình axit tricacboxylic, sinh ra ATP nhờ sự vận chuyển electron và quá trình photphorin oxi hoá.

Ti thể được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng ngoài cách màng trong bằng một khoang giữa các màng từ 6 – 8nm. Bề mặt màng trong ti thể được tăng lên rất nhiều là nhờ sự hình thành các tấm răng lược; hình dạng sự gấp nếp màng trong ti thể thành các tấm này rất khác nhau tuỳ theo loài, ví dụ ở nấm thì các tấm có dạng bản mỏng, còn ở trùng roi Euglena các tấm có dạng đĩa, ở một số nấm và phần lớn động vật nguyên sinh các tấm có dạng ống, còn ti thể của amip lại có tấm dạng túi. Màng trong của ti thể được giới hạn tạo thành khoang trong ti thể chứa dịch với các ribosom ti thể, ADN và thường chứa những hạt photphatcanxi. Các ribosom ti thể bé hơn ribosom tế bào chất và giống với ribosom của vi khuẩn về kích thước, độ lắng và các đơn phân. ADN của ti thể là phân tử 2 mạch vòng giống ADN vi khuẩn.

7. Lục lạp

Mặc dù lục lạp khác nhau về kích thước, hình dạng ở các loài, nhưng chúng có nhiều đặc điểm cấu tạo giống nhau. Thông thường, chúng có hình trái xoan với kích thước (2 – 4m) (5 – 10m). Một vài loại tảo có một lục lạp khổng lồ choán đầy tế bào. Cũng giống như ti thể, lục lạp được bao bọc bởi hai lớp màng. Một khoang giữa các phiến tạo nên bởi các màng trong gọi là stroma; trong stroma chứa ADN, ribosom và các giọt lipit, hạt tinh bột. Hệ thống phiến tạo nên bởi các màng trong hình thành các túi dẹt gọi là tilacoit. Một nhóm hai hay nhiều tilacoit rải ra trong stroma thấy ở các lục lạp của tảo. Ở một số tảo có nhiều tilacoit tạo nên chồng đĩa tựa như chồng các đồng xu hình thành grana.

206

8. Nhân và sự phân bào

Nhân là bào quan đặc biệt của tế bào nhân thực, nó là nơi chứa hầu như tất cả thông tin di truyền của tế bào và do đó là trung tâm điều khiển tế bào.

Nhân có hình cầu với đường kính 5 – 7m, được bao bọc bởi màng nhân.

Có thể thấy các chromatin trong nhân tế bào đã nhuộm màu, trong tế bào chưa phân chia các chromatin phân tán, nhưng chúng được tập trung lại thành các nhiễm sắc thể trong nguyên phân và giảm phân. Màng nhân gồm 2 lớp cách nhau 15 – 75nm. Màng nhân liên hệ trực tiếp với ER và màng ngoài của nó được phủ các ribosom, các chromatin thường đính vào màng trong. Màng nhân có rất nhiều lỗ, mỗi lỗ màng nhân có đường kính 70nm và thường chiếm khoảng 10 – 25% bề mặt của màng nhân. Các lỗ màng nhân giúp cho sự trao đổi dễ dàng giữa tế bào chất và nhân. Cấu trúc thấy rõ ở trong nhân khi được nhuộm màu là vùng nhân bé (hạch nhân), có thể có một hoặc vài vùng nhân bé trong nhân tế bào nhân thực, vùng nhân bé không có màng bọc, nhưng là vùng chứa các hạt và vi sợi, nó có mặt trong tế bào không phân chia và thường biến mất trong nguyên phân và tái xuất hiện sau phân bào.

Vùng nhân bé có vai trò chủ yếu trong quá trình tổng hợp ribôsôm. ADN của nhân điều khiển sự phiên mã của ARN ribôsôm, từ đó hình thành ARNr, các phân tử ARNr chín liên kết với các protêin của ribôsôm (các phân tử này được tổng hợp trong tế bào chất) để hình thành các tiểu phần của ribosom. Các tiểu phần ribosom chưa thành thục rời khỏi nhân qua lỗ màng nhân ra tế bào chất nơi chúng gắn các tiểu phần để tạo ra ribôsôm hoàn chỉnh. Tham gia vào quá trình hình thành các ARN có các enzim ARN–polimeraza, ở các cơ thể nhân thực hiện biết 3 loại: I, II và III.

Hình I.9. Nhân với lỗ màng nhân

207

Một tiêu bản làm sạch ở nhiệt độ thấp đính bào tử nấm Geotrichum candidum ( 44.600) thấy rõ trên bề mặt lồi của nhân có các lỗ màng nhân nằm rải rác.

208

Hình I.10. Chu trình sống của tế bào nhân thực

Chu trình này gồm 2 giai đoạn kế tiếp nhau: kì trung gian (interphase) và kì nguyên phân. Giai đoạn M (kì nguyên phân) được vẽ to và kéo dài ra để chỉ rõ các kì của nguyên phân, nó gồm các kì: kì đầu (prophase), kì giữa (metaphase), kì sau (anaphase), kì cuối (telophase) và phân chia tế bào chất (cytocinesis).

Kì trung gian gồm các pha G1, S và G2.

Pha G1: Tổng hợp ARNm, ARNt, ribôsôm và các thành phần tế bào chất, vùng nhân bé phát triển nhanh.

Pha S: Tổng hợp nhanh và nhân đôi ADN của nhân và tổng hợp histon.

Pha G2: Chuẩn bị cho nguyên phân và phân bào.

Như vậy sự lớn lên của tế bào diễn ra chủ yếu ở kì trung gian, pha G1, S, G2 có thể dài ngắn tuỳ theo loại vi sinh vật. Ở vi sinh vật, giai đoạn nguyên phân (M) có thể không hoàn toàn giống như các mô tả điển hình của tế bào nhân thực, ví dụ màng nhân không biến mất ở nhiều loại nấm, ở một số động vật nguyên sinh và ở một số loại tảo đơn bào. Thông thường, sự phân chia tế bào chất của tế bào bố mẹ để hình thành hai tế bào con bắt đầu từ kì sau và được kết thúc ở cuối kì cuối, giai đoạn nguyên phân (M) có thể diễn ra mà không có sự phân chia tế bào chất do đó hình thành các cơ thể đa nhân hoặc cộng bào (sợi nấm cộng bào).

209

Trong nguyên phân số lượng nhiễm sắc thể không thay đổi sau khi tế bào phân

đôi, một tế bào lưỡng bội (diploid) vẫn là lưỡng bội hay 2N.

Vi sinh vật nhân thực có thể giảm một nửa số lượng nhiễm sắc thể để chuyển sang

trạng thái đơn bội (haploid) tức 1N (chỉ chứa một bản sao của mỗi nhiễm sắc thể). Các

tế bào đơn bội trở thành các giao tử và hợp nhất để sinh ra cơ thể lưỡng bội mới. Quá

trình dẫn đến số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa trong các tế bào con gọi là quá

trình phân chia giảm nhiễm (meiosis) hay giảm phân. Nếu như nguyên phân từ một tế

bào tạo ra 2 tế bào con có số nhiễm sắc thể giống nhau và giống tế bào bố mẹ, thì ở

giảm phân từ một tế bào ban đầu cho ra 4 tế bào con với số lượng nhiễm sắc thể giảm

đi một nửa. Sở dĩ như vậy là vì giảm phân diễn ra theo 2 bước: giảm phân I và giảm

phân II. Có hai lần phân chia liên tiếp nhưng chỉ có một lần nhân đôi nhiễm sắc thể

diễn ra ở giảm phân I.

Ở vi sinh vật độ dài các kì của giảm phân I và giảm phân II có thể khác nhau

tuỳ theo loài và điều kiện nuôi cấy. Cũng xin nhắc lại là trong genôm của vi sinh vật

nhân chuẩn có intron nên khi phiên mã để tạo ra ARNm sơ cấp rồi sau đó mới tạo ra

ARNm thứ cấp.

9. Lông (cilia) và roi (flagella)

Ở nhiều vi sinh vật nhân thực có lông và roi phủ ở phía ngoài màng sinh chất.

Khác với vi khuẩn, phần lớn vi sinh vật nhân chuẩn không có thành tế bào, màng của

chúng chứa sterol. Các vi khuẩn thường được gắn thêm vào lớp màng hợp chất

hopanoid (một loại sterol pentacyclic).

Lông và roi là những cơ quan vận động quan trọng của tế bào nhân thực. Lông

khác roi ở mấy điểm sau:

– Độ dài: lông (5 – 20m) còn roi dài hơn (100 – 200m).

– Kiểu chuyển động: Roi chuyển động bằng cách xoáy vào chất lỏng, còn lông

chuyển động như mái chèo thuyền.

– Đôi khi trên roi còn có các lông ngắn, còn ở lông không thấy có. Mặc dù có sự khác nhau về chiều dài ngắn và cách chuyển động, nhưng chúng có cấu trúc siêu hiển vi rất giống nhau, đó là những vi ống đường kính 0,2m có gốc đính với màng, bên trong ống có cặp siêu vi ống ở giữa và bao quanh bởi 9 cặp siêu vi ống khác.

210

a. b.

Hình I.11. So sánh cơ chế tách các thể nhiễm sắc trong phân chia vô tính

ở vi khuẩn (a) và ở nấm men (b)

a. Ảnh chụp hiển vi điện tử quét tế bào nấm men nảy chồi

Thấy rõ tế bào bố mẹ (Parent cell), chồi (Bud) và sẹo chồi (Bud sear);

(SEM 20.000) Sac.cerevisiae (a)

Hình I.12. Sơ đồ cấu tạo tế bào nấm men

SC– Sẹo chồi Rb– Ribosom (80S) D– Thể Gôngi Cm– Màng tế bào

Cp– Tế bào chất N– Nhân Li– Lipit NL– Vùng nhân bé

ER– Lưới nội chất Po– Poliphosphat Cw– Thành tế bào

V– Vacuole – không bào Mi– Ti thể chứa ADN và ARN riêng.

Nấm mốc là loại nấm sợi điển hình, cũng như nấm men chúng là những cơ thể dị dưỡng. Một số sống cộng sinh với thực vật, khi cộng sinh với tảo đơn bào hoặc tập hợp đơn bào thì hình thành địa y (Lichens)

211

Các lớp Nấm thường gặp

Lớp Nấm Loại sợi Bào tử vô tínhBào tử

hữu tính

Nơi sống

chínhVí dụ

Oomycetes Không có vách ngăn

(Coenocytic)

Bào tử chuyển động

Oospora (bào tử noãn)

Thuỷ sinh, nhiều loài gây bệnh cá, mốc sương khoai tây

Allomyces

Zygomycetes Coenocyte Bào tử túi, đôi khi bào tử đính (conidium)

Zygospora (bào tử tiếp hợp)

Đất, phân giải chất hữu cơ thực vật

Mucor, Rhizopus

Ascomycetes Có vách ngăn (một số đơn bào)

Bào tử đính (conidium) (nảy chồi)

Bào tử túi (Ascospore)

Đất, phân giải chất của thực vật

Neurospora

Saccharomyces

Morchella

Basidiomycetes

Có vách ngăn (một số đơn bào)

Uredospores, conidium (nảy chồi)

Bào tử đảm (Basidios–pore)

Đất, phân giải chất của thựcvật

Agaricus, Amanita

Deuteromycetes

Có vách ngăn (một số đơn bào)

Bào tử đính, bào tử đốt (Arthrosp ora)

Chưa thấy Đất, thực vật và trên cơ thể động vật

Candida,

Trychophyton,

Epidermophyton

Vi tảo

Vi tảo là tảo hiển vi có sắc tố quang hợp. Vi tảo đơn giản nhất là cơ thể đơn bào, hoặc tập hợp đơn bào: Có thể có roi như Chlamydomonas, Peridium và Euglena (tảo mắt), hoặc không có roi như Chlorella (Tảo lục), Diatomia (tảo cát). Các vi tảo thường gặp hơn là những cơ thể đa bào hoặc tập hợp đơn bào, như các tập đoàn Volvox, Pediastrum, Scenendesmus (thuộc nhóm Archethalle) hoặc phức tạp hơn có bộ phận dính bám và bộ phận dựng đứng như các sợi mảnh phân nhánh hoặc không (có thể có vách ngăn tạo thành các tế bào tương đối độc lập hoặc không có vách ngăn

212

như một ống cộng bào, Những tảo này sinh sản bằng cách chia của tế bào lạ ở giữa hoặc bằng cách rụng tế bào ở đầu cùng (Sphacelaria, Ectocarpus...), chúng sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp đẳng giao (hai giao tử bằng nhau) hoặc dị giao (hai giao tử khác nhau).

Hình I.13. Sinh sản của một số loài tảo

a. Chu trình phát triển của tảo lục đơn bào Chlamydomonas;

b. Sinh sản vô tính ở tảo cát (diatoms) Achnanthes minutissima.

Phần trên là ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy 2 mảnh úp vào nhau. Phần dưới cho thấy trong gián phân (mitosis) mỗi tế bào con có một nửa từ tế bào bố mẹ, phần nửa kia được tổng hợp bổ sung.

Với hơn 30.000 loài được mô tả, động vật đơn bào là những “cư dân” ở đất và nước. Nhiều động vật đơn bào có vai trò quan trọng ở các lớp bùn hoạt tính tại các trạm lọc nước thải.

Một số nhóm động vật đơn bào và tính chất của chúng

Nhóm Một số tính chất Nơi sống Ví dụ

213

Mastigophora Một hoặc nhiều roi

(Flagella), tế bào có thể chia

dọc

Nước ngọt, kí sinh

trên động vật

Trypanosoma,

Giardia,

Leishmania

Sarcodina Dạng Amip, giả túc, không

roi, chia đôi

Nước ngọt và mặn, kí

sinh trên động vật

Amoeba,

Entamoeba

Sporozoa Thường bất động, một số có

thể trườn, bò, chia đôi, kí sinh

động vật, sâu bọ

Kí sinh sơ cấp trên

động vật chân đốt,

tác nhân truyền bệnh

kí sinh

Plasmodium

(gây bệnh sốt rét

cơn Malaria)

Toxoplasma

Ciliophora Nhiều roi ngắn (tiêm mao,

cilia), chia đôi ngang, mỗi tế

bào thường có nhân lớn và

nhân bé làm chức năng khác

nhau

Nước ngọt và mặn, kí

sinh trên động vật,

trong dạ của động vật

nhai lại

Paramecium

Balantidium

Cnidospora Hình thành chuỗi bào tử nhờ

sợi phình ra và cắt khúc

Kí sinh trên động vật

có xương và không

xương

Nosema gây

bệnh tầm gai

214

Hình I.14. Sơ đồ cấu tạo một số đại diện động vật nguyên sinh

a. Cấu tạo loại có roi (Trypanosoma brucei rhodesience)

b. Cấu tạo Amip (Amebaproteus)

c. Cấu tạo Sporozoite

d. Cấu tạo loại có lông (Paramecium caudatum)

Như vậy là chúng ta đã nghiên cứu các nhóm vi sinh vật có nhân sơ như vi khuẩn, nhân thực như nấm, tảo đơn bào và động vật đơn bào khác với các loại virut mà chúng ta sẽ nghiên cứu sau.

215

So sánh một số tính chất của các nhóm vi sinh vật

Tính chất Vi khuẩn Nấm TảoĐộng vật đơn bào

Ghi chú

Loại tế bào

Nhân sơ Nhân thực Nhân thực Nhân thực

Kiểu dinh dưỡng

Hoá dị dưỡng (một số quang dưỡng)

Hoá dị dưỡng hữu cơ

Quang tự dưỡng

Hoá dị dưỡng hữu cơ

Tính chất của số đông

Đa bào, đơn bào

Đơn bào Đa bào (trừ nấm men)

Một số đơn bào và một số đa bào

Đơn bào

Cách sắp xếp tế bào

Riêng lẻ, một số hình thành tập hợp

Đơnbào, sợi không vách ngăn (cộng bào) và sợi có vách ngăn

Đơn bào, tập hợp sợi và bắt đầu hình thành mô

Riêng lẻ, tập hợp

Phương pháp thu nhận thức ăn

Hấp thụ Hấp thụ Quang hợp, hấp thụ

Hấp thụ, thực bào

Tính chất của số đông

Tính chất đặc trưng

Phân bào vô tơ (trực phân)

Bào tử hữu tính và vô tính

Sắc tố quang hợp và sắc tố hỗ trợ

Chuyển động

Thành tế bào

Murein Hemycellulose và kitin

Xenlulozơ Không có hoặc có lipoprôtêin

pH tối ưu 6,5 – 7,5 3,8 – 5,6 Gần trung tính Trung tính

Tính chất số đông

Nhu cầu O2

Kị khí đến hiếu khí

Hiếu khí Hiếu khí Hiếu khí Tính chất số đông

Chất dự trữ chính

Các loại polisaccharit

Glucogen Tinh bột Glicogen và nhiều loại polisaccarit

216

Số loài hiện biết

4000 80.000 (tất cả giới nấm)

15.000 (chỉ tính tảo đơn bào)

30.000 (chỉ tính động vật đơn bào)

VI. VIRUT

Người ta nhận định virut như sau :

– Virut là dạng sống siêu hiển vi (từ 18nm đến 300 – 400nm)

– Virut có cấu tạo rất đơn giản: lõi mang yếu tố di truyền chỉ có axit nuclêic một loại và vỏ bao bên ngoài là prôtêin gồm các đơn vị hình thái (capsome); những virut phức tạp có thêm màng bọc và enzim riêng.

– Virut là dạng sống kí sinh bắt buộc, chỉ sinh trưởng và phát triển trong tế bào vật chủ sống, khi ở ngoài cơ thể vật chủ có thể tồn tại ở trạng thái đại phân tử hoá học và có tính truyền nhiễm; một số virut thực vật có khả năng hình thành tinh thể.

– Virut nhân lên một cách đặc biệt trong tế bào sống: tổng hợp các thành phần của mình và lắp ráp thành virut hoàn chỉnh và được giải phóng ra ngoài.

– Virut rất dễ biến dị đặc biệt đối với các virut có ARN

Hình I.15. Kích thước (đơn vị là nm), vài loại virut so sánh với một số vi khuẩn bé

217

(Chlamydia), vi khuẩn E.coli và tế bào hồng cầu của người.

Cấu tạo của virut

Virut có 3 dạng cấu trúc: xoắn, khối (icosahedron) và phức hợp (các phage).

Cấu trúc xoắn:

Cấu trúc xoắn đặc trưng cho các virut hình ống như virut đốm thuốc lá (TMV), cúm, sởi, quai bị, dại... Đây là cấu trúc đối xứng trụ, có một trục đối xứng trùng với trục dọc – khi quay hạt virut 180o xung quanh trục dọc thì sẽ dẫn đến một vị trí hoàn toàn giống như vị trí lúc đầu.

Mỗi đơn vị hình thái TMV (capsomer) chứa khoảng 158 axit amin, một ống rỗng có đường kính 15nm và dài 300nm.

A B

Hình I.16. Virut đốm thuốc lá (TMV)

A. Ảnh chụp TEM của virut đốm thuốc lá

B. Mô hình cấu tạo TMV

Axit nucleic của TMV là sợi ARN một mạch có khối lượng phân tử khoảng 25.106 dalton, chiếm 5,5% trọng lượng của cả hạt. Sợi ARN này được uốn theo chiều xoắn của capsit và gắn vào 2/3 chiều dày của capsit tính từ bên trong. Người ta còn biết được rằng chỉ có 474 nucleotit trong số 6400 nucleotit trong ARN của TMV mã hoá cho quá trình tạo vỏ capsit của nó.

Không phải tất cả các virut hình ống đều có cấu trúc vỏ capsit giống như TMV.

218

Virut cúm có capsit mềm, dễ uốn, lõi axit nucleic được gói gọn trong vỏ mỏng lipit chứ không uốn theo chiều xoáy của vỏ capsit.

Cấu trúc khối:

Nhiều loại virut nhìn thoạt qua có dạng hình cầu (Adenovirus, Retrovirus, Poliovirus...) nhưng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử lại thấy vỏ prôtêin của chúng có cấu trúc hình khối đa diện, thường là các hình khối 20 mặt tam giác đều (icosahedron).

Cấu trúc icosahedron là một hình khối đa diện 20 mặt tam giác đều: 5 mặt ở đỉnh, 5 mặt ở đáy, và 10 mặt ở giữa. Các tam giác đều này đều bằng nhau và đối xứng, có thể xếp theo bất cứ hướng nào. Icosahedron có 12 đỉnh (góc hợp của 5 tam giác đều) và 30 cạnh (đường gấp của từng cặp cạnh tam giác gần nhau). Icosahedron có ba loại trục đối xứng xuyên qua tâm của nó (hình I.17) là:

Hình I.17. Sơ đồ cấu trúc khối

Trong cấu trúc icosahedron, mỗi tam giác đều được cấu tạo từ các đơn vị hình thái (ĐVHT). Mỗi ĐVHT có thể được cấu tạo từ cấu trúc dưới đơn vị hình thái.

219

Trục đối xứng cấp 3 Trục đối xứng cấp 5 Trục đối xứng cấp 2

Hình I.18. Sơ đồ cấu trúc một số loại virut cấu trúc khối

Cấu trúc phức tạp:

Các virut kí sinh trên vi khuẩn gọi là thực khuẩn thể (Bacteriophage hay phage). Chúng thường có hình nòng nọc với kiểu hai đối xứng phức tạp (Binal symetry).

Hình I.19. Phage T2 – một loại virut kí sinh trên E.coli

a. Sơ đồ cấu tạo phage T2

b. Ảnh chụp TEM phage T2.

Các giai đoạn phát triển phage gây độc

Nói chung sự sinh sản của Bacteriophage độc có thể chia làm

220

B

A

C

D

A. Virut cà chua B. Poliovirus C. Virut SV–40 D. Virut nhũn thân thuốc lá

Lizôzim

Nhẫn ở cổ

b 0,1m

a

5 giai đoạn :

Hấp phụ xâm nhập tổng hợp các thành phần lắp ráp giải phóng phage

HIV – tế bào: Ở các virut động vật, ngoài cơ chế trên virut còn xâm nhập vào tế bào theo cơ chế ẩm bào (Pinocytosis) hay thực bào (Phagocytosis), sau đó tế bào chủ sinh ra các enzim làm tan vỏ prôtêin của virut và giải phóng các axit nucleic trong tế bào chất.

Phage ôn hoà và hiện tượng tiềm tan

Khi phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, quá trình kí sinh có thể xảy ra theo hai hướng:

1. Phage nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn sau đó làm tan tế bào vi khuẩn, đây là chu trình làm tan hay li giải tế bào (Lytic cycle). Những phage li giải tế bào vi khuẩn gọi là phage gây độc.

Hình I.20. Mối liên quan giữa tế bào, phage độc và phage ôn hoà

2. Có một số phage, sau khi vào tế bào chúng gắn bộ genom của mình vào genom của tế bào vật chủ. Hệ gen của phage tồn tại song song với tế bào chủ, không làm tan tế bào và ở dạng nghỉ (dormant). Lúc này người ta gọi chúng là prophage. Khi có tác nhân cảm ứng tác động (như tia UV, X, etylen imin, peroxit hữu cơ v.v...), các

221

prophage sẽ hoạt động trở lại thành phage gây độc. Đây là mối quan hệ tiềm tan giữa phage và tế bào (Lysogeny). Các phage này gọi là các phage ôn hoà. Các tế bào vi khuẩn chứa các phage ôn hoà gọi là tế bào tiềm tan (hay tế bào tiềm tan).

Bệnh virut có thể lan truyền theo hai cơ chế chính:

+ Sự lan truyền dọc (lan truyền di truyền): các tế bào bố mẹ nhiễm virut ở dạng tiềm sinh truyền cho các tế bào con cháu từ thế hệ này qua thế hệ khác. Ví dụ các virut thuộc Retrovirus gây AIDS, virut Rubella (Togaviridae).

+ Lan truyền ngang (lan truyền tiếp xúc): bao gồm một số con đường chính sau:

– Qua đường hô hấp (qua không khí bẩn chứa các virut gây bệnh). Ví dụ: Virut cúm, quai bị, sởi, đậu mùa....

– Qua đường tiêu hoá (qua thức ăn và nước uống bị nhiễm). Ví dụ: Virut bại liệt (poliomyelite), virut viêm gan A (Piconaviridae).....

– Viêm qua đường sinh dục và tiết niệu: HIV, HBV ...

– Lan truyền do vật trung gian như muỗi, bọ chét, chấy rận... (Ví dụ: các virut gây bệnh sốt vàng da, viêm não, sốt vẹt, sốt xuất huyết..)

– Lan truyền qua vết cắn: Virut dại (Rhabdoviridae)...

– Lan truyền đường truyền máu. Ví dụ HBV hoặc HIV....

VII. HỆ THỐNG SINH GIỚI VÀ VỊ TRÍ CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT

Hệ thống 5 giới

Ngay từ năm 1969, dựa vào những nghiên cứu của Masgulis về cấu tạo và hệ enzim ôxy hoá các cơ thể nấm, mà Whittaker đã đề nghị tách nấm thành một giới riêng và nêu ra hệ thống sinh giới gồm 5 giới:

1. Giới (Kingdom) khởi sinh (Monera): Gồm tất cả cơ thể nhân sơ, mà chủ yếu là vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn lam.

2. Giới nguyên sinh (Protista): Gồm tất cả cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào nhân thực.

3. Giới nấm (Fungi): Các cơ thể nấm dinh dưỡng theo kiểu "thấm".

4. Giới thực vật (Plantae): Gồm tất cả các cơ thể đa bào nhân thực quang hợp.

5. Giới động vật (Animalia): Gồm tất cả các cơ thể đa bào nhân chuẩn dinh dưỡng kiểu nuốt.

Ba tiêu chí cơ bản của hệ thống 5 giới là:

– Loại tế bào nhân sơ hay nhân thực.

222

– Mức độ tổ chức cơ thể: Đơn bào riêng lẻ, tập hợp thành tập đoàn hay là cơ thể đa bào đã có phân hoá.

– Kiểu dinh dưỡng.

Năm 1970, Takhtakjan đã phê phán giới nguyên sinh của Whittaker, cho rằng trong giới đó đã xếp tất cả các cơ thể nhân thực đơn bào là nấm bậc thấp, động vật nguyên sinh và thực vật đơn bào vào cùng một giới là không hợp lí và đề nghị hệ thống gồm bốn giới 1, 3, 4, 5.

Hệ thống 3 lãnh giới (domain, lãnh địa) sinh vật

Dựa vào trật tự các Nucleotit của 16S ARNr hoặc 18S ARNr mà khoa học đã phân chia các vi khuẩn thành hai nhóm khác biệt nhau bởi nhiều đặc điểm: vi sinh vật cổ (Archaea) và vi khuẩn (Bacteria). Những cơ thể nhân sơ này khác hoàn toàn với các cơ thể nhân thực.

Virut là đối tượng quan trọng của vi sinh học. Có thể xem virut là loại vật chất sống khi ở ngoài tế bào chủ và là dạng sống vô bào khi kí sinh trong cơ thể chủ đang phát triển. Vì chúng chưa có cấu tạo tế bào nên không được xếp vào hệ thống sinh giới. Virut có vai trò to lớn đối với đời sống của con người và muôn loài sinh vật. Ví dụ virut là vật tải gen có ích từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, hay virut viêm đường hô hấp cấp (SARS) đã gây thiệt hại lớn cho sản xuất và du lịch của nhiều nước hay virut cúm A H5N1 đã làm thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm hàng trăm tỉ đồng.... Như vậy, đối tượng của vi sinh học nằm cả ở 3 cấp tổ chức.

223

Hình I.21. Các nhóm đối tượng của vi sinh học (trong khung chữ nhật)

CÂU HỎI, BÀI TẬP CHƯƠNG I

1. Cho sơ đồ cấu tạo tế bào vi khuẩn như hình dưới đây:

224

VirutARN

VirutADN

Vi khuẩn Archaea

Thực vật đơn bàoNấm đơn bào,

nấm sợiĐộng vật nguyên

sinh

Thực vật Nấm Động vậtCấp các cơ thể nhân chuẩn

Cấp các cơ thể nhân sơ

Cấp vật chất sống–virut

(Tổ chức dưới cấp tế bào)

a. Thay các số trong sơ đồ bằng tên các cấu trúc.

1 .................... 5 ...................................

2 ................... 6 ...................................

3 .................. 7 ...................................

4 .................. 8 ..................................

b. Cấu trúc số 1, 5, 8 khác nhau về chức năng như thế nào?

c. Cấu trúc số 2 chứa hợp chất không gặp ở các cơ thể nhân thực và nó khác với Archaea. Cho biết cấu tạo hoá học của cấu trúc số 2 và vai trò của nó.

d. Cấu trúc số 7 có vai trò gì? Nêu 3 ví dụ vi khuẩn có cấu trúc này.

e. Cấu trúc số 6 khác gì giữa vi khuẩn và cơ thể nhân thực?

2. Điền vào chỗ dấu chấm thuật ngữ (tập hợp từ) phù hợp nhất.

a. Trong phân tử .............. của thành vi khuẩn, thay ....................... bằng ................. cấu tạo nên thành của Archaea có thành.

b. Thành tế bào vi khuẩn có hợp chất đặc trưng là .........................., còn gọi là ................. hay phức chất ...........................

c. Các hợp chất .................. là loại prôtêin chủ yếu của ............................. của thành tế bào vi khuẩn Gram âm.

d. Bên ngoài lớp ............................ có các ...................... có vai trò quan trọng về tính kháng nguyên của vi khuẩn Gram âm.

e. Thành vi khuẩn Gram dương dưới tác động của ................. làm đứt liên kết................... tế bào biến thành tế bào trần, còn ở vi khuẩn Gram âm sẽ thành ..................................

3. Các câu sau đúng hay sai, giải thích.

a. Các loài vi khuẩn đều có khả năng hình thành nội bào tử (endospore).

b. Cơ chế nhân đôi ADN bán bảo tồn là vì nó giữ lại 50% số lượng ADN có mặt trong tế bào bố mẹ.

c. Axit teicoic là thành phần đặc trưng của thành vi khuẩn Gram dương.

d. Thành phần và kiểu cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm đã làm cho rượu khó đi qua trong quá trình nhuộm Gram.

4. Chức năng của thành tế bào vi khuẩn:

1. Tham gia vào quá trình phân bào

225

2. Thực hiện quá trình hô hấp

3. Giữ hình dạng tế bào ổn định

4. Là nơi xuất phát của tiên mao (flagella)

5. Có vai trò quan trọng trong quá trình nhuộm Gram

6. Tham gia vào việc duy trì áp suất thẩm thấu

Tổ hợp đúng là: A = 1–2–5–6 ; B = 2–3–4–5 ; C = 1–3–5–6 ; D = 3–4–5–6.

5. Nghiên cứu sự kháng thuốc penixilin của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, người ta thấy ở Việt Nam có đến 70% số tụ cầu vàng mới phân lập từ người bệnh chữa bằng Penixilin có khả năng kháng penixilin gốc.

a. Sự kháng thuốc này thường có nguồn gốc từ plasmid. Vậy plasmid là gì? Vai trò của các loại plasmid?

b. Sự có mặt của plasmid trong vi khuẩn cho phép nó sinh tổng hợp một loại phân tử mới, đó là phân tử gì? Hoạt động của phân tử này như thế nào?

c. Người ta làm một kháng sinh đồ đối với chủng tụ cầu vàng được phân lập từ một người bệnh chỉ chữa bệnh bằng penixilin. Chủng vi khuẩn này xuất hiện sự đề kháng đồng thời với penixilin và tetraxyclin, biết rằng lúc đầu khi chữa bệnh, các tụ cầu vàng là những chủng mẫn cảm với cả hai loại kháng sinh trên.

– Có thể giải thích hiện tượng trên như thế nào?

– Có thể sử dụng phương pháp điều trị nào để tránh hiện tượng trên?

226

CHƯƠNG 2

DINH DƯỠNG VÀ SỰ CHUYỂN HOÁ CÁC CHẤT Ở VI SINH VẬT

I. CÁC CHẤT DINH DƯỠNG

Phân tích tế bào vi sinh vật cho thấy 95% sinh khối khô cấu tạo từ các nguyên tố cơ bản: C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe. Những nguyên tố này gọi là các nguyên tố đại lượng, được vi sinh vật sử dụng xây dựng nên gluxit, lipit, prôtêin và axit nuclêic (6 nguyên tố đầu khoảng 10–2 mol/l), còn 4 nguyên tố sau tồn tại trong tế bào dưới dạng cation và thực hiện nhiều chức năng khác. K+ rất cần để hoạt hoá nhiều loại enzim, trong đó có enzim tham gia tổng hợp prôtêin, Ca2+ có nhiều chức năng trong đó có vai trò giúp cho nội bào tử bền nhiệt, Mg2+ là côfactor của nhiều enzim, nó hình thành một phức chất với ATP làm bền vững các ribôsôm và màng tế bào. Các loại Fe 2+

và Fe3+ được dùng để tổng hợp xitochrom và là côfactor của nhiều loại enzim và các prôtêin vận chuyển electron.

Tất cả vi sinh vật có nhu cầu đối với một số nguyên tố vi lượng (vi chất dinh dưỡng) như mangan, kẽm, coban, molipđat, niken, đồng được vi sinh vật sử dụng với lượng rất nhỏ (10–5 – 10–6 mol/lít); thông thường thì chúng đã có sẵn trong nước, trong môi trường sống tự nhiên của vi sinh vật. Rất khó có thể liệt kê hết chức năng của các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố vi lượng tham gia vào hoạt hoá các enzim hoặc duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào.

II. CÁC NHÂN TỐ SINH TRƯỞNG

Bổ sung cho các nguyên tố cơ bản ở trên, một số vi sinh vật còn cần một số hợp chất hữu cơ cho sự sinh trưởng phát triển của mình mà chúng không thể tự tổng hợp được, người ta gọi chúng là các nhân tố sinh trưởng.

Tuỳ thuộc vào nhu cầu các chất này mà người ta thường chia vi sinh vật thành hai nhóm:

– Nguyên dưỡng (prototroph) là những vi sinh vật không nhất thiết cần các nhân tố sinh trưởng, những yếu tố của môi trường nuôi cấy thường là đầy đủ đối với chúng, vì chúng có khả năng tự tổng hợp các chất này.

– Khuyết dưỡng (auxotroph) là những vi sinh vật đòi hỏi các chất hữu cơ nhất

227

định cần cho sự sinh trưởng của chúng.

Các vi khuẩn nguyên dưỡng có thể nuôi cấy được trên môi trường tối thiểu, loại môi trường này chỉ chứa các nguyên tố dinh dưỡng vô cơ chủ yếu.

III. CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG SỐNG CỦA VI SINH VẬT

Tuỳ thuộc vào thành phần của môi trường người ta chia ra thành 3 loại:

1. Môi trường tự nhiên: Gồm các hợp chất tự nhiên chưa xác định rõ thành

phần, ví dụ đơn giản thường dùng như môi trường canh thịt để nuôi cấy vi khuẩn.

Các pepton là kết quả thu được từ thủy phân hoá học hay bằng enzim các chất

hữu cơ prôtêin như thịt, casein, gelatin.

Trong các môi trường lên men công nghiệp, người ta thường dùng các phụ

phẩm hoặc bã thải của công nghiệp thực phẩm làm nền của môi trường, như các loại

mật rỉ (mật rỉ củ cải đường, rỉ mía đường trong các nhà máy đường), bột đậu tương ép,

bột cá, cám, tinh bột kiều mạch, sắn, sirô mantozơ...

2. Môi trường tổng hợp hay là môi trường đã biết thành phần hoá học, ví dụ môi

trường dưới đây dùng để nuôi cấy D.desulfuricans: K2HPO4 – 1g; NH4Cl – 1g; CaSO4

– 1g; MgSO4 – 2g và nước nguyên chất 1000ml.

3. Môi trường bán tổng hợp: Trong môi trường này có chứa một số hợp chất từ

nguồn gốc tự nhiên và một số chất hoá học đã biết rõ thành phần hoá học, đây là loại

rất hay sử dụng, ví dụ môi trường thạch EMB: Pepton – 10g, K2HPO4 – 2g, Lactozơ –

10g, Eosine – 0,4g, Xanh metylen – 0,065g, Aga – 15g, Nước cất – 1000ml.

Môi trường có thể phân thành các nhóm theo cách sử dụng chúng như môi

trường làm giàu một nhóm vi sinh vật, định loại,...

Nhờ phương pháp phân lập bằng cách pha loãng trong môi trường lỏng hoặc cấy zic zăc trên môi trường đặc, chúng ta thu được những chủng vi sinh vật thuần khiết.

228

Hình II.1. Phương pháp cấy (zic zăc) để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ.

IV. CÁC KIỂU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

Như trên đã trình bày, các vi sinh vật thu năng lượng dùng cho hoạt động sống nhờ hai cơ chất chủ yếu là: quá trình chuyển hoá các chất quang dưỡng và chuyển hoá các chất hoá dưỡng. Trong bảng dưới đây tóm tắt hai quá trình đó.

Hai kiểu chuyển hoá vật chất quang dưỡng (phototrophic metabolism)

Kiểu trao đổi chất Chất cho

electron

Nguồn cacbon Ví dụ vi sinh vật, cơ

thể

Quang dưỡng vô cơH2O CO2

Vi khuẩn lam

(Cyanobacteria) thực

vật

H2S, S0, H2 CO2

Chromatiaceae

Chlorobiaceae

Quang dưỡng hữu cơ Cơ chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ Rhodospirillaceae

Hai kiểu chuyển hoá vật chất hoá dưỡng (chemotrophic metabolism)

Kiểu trao

đổi chất

Chất cho electron Chất

nhận

electron

Nguồn cacbon Ví dụ

Hoá dưỡng

hữu cơ

Hợp chất hữu cơ O2 Cơ chất hữu cơ Pseudomonas

bacillus

Hợp chất hữu cơ N Hợp chất hữu

cơ

Bac.licheniformis

229

Hợp chất hữu cơ S Cơ chất hữu cơ Các vi khuẩn khử

sunfat

Cơ chất hữu cơ Cơ chất

hữu cơ

Cơ chất hữu cơ Clostridium vi

khuẩn lactic

Hoá dưỡng

vô cơ

H2 O2 CO2Vi khuẩn oxi hoá

hydrogen

H2S O2 CO2 Thiobacillus

H2S N CO2Th.denitrificans

Fe2+ O2 CO2 Th.ferrooxidans

NH3 O2 CO2 Nitrosomonas

N O2 CO2Nitrobacter

H2 CO2 CO2Vi khuẩn sinh

metan

H2 CO2 CO2Vi khuẩn sinh

axetic

V. CÁC KIỂU HÔ HẤP CỦA VI SINH VẬT

Thông thường khi chất nhận electron cuối cùng là ôxi phân tử thì người ta gọi là quá trình hô hấp và vi sinh vật thuộc dạng này gọi là vi sinh vật hiếu khí. Khi chất nhận electron cuối cùng là một chất khác không phải là ôxi tự do, thì gọi là quá trình lên men và tác nhân gây lên men gọi là vi sinh vật kị khí.

Trong số các cơ thể kị khí, có loại có thể dùng chất nhận electron là chất hữu cơ, loại khác – chất vô cơ. Đối với loại đầu gọi là lên men (nghĩa hẹp), đối với loại sau người ta gọi là hô hấp kị khí.

Ngày nay, khi người ta hiểu rõ cơ chế phân tử của quá trình và dựa vào quy luật Mitchell, khái niệm hô hấp và lên men càng được cụ thể hơn:

– Hô hấp đối với một vi khuẩn là do nó có một chuỗi vận chuyển electron liên kết ở màng tế bào và sự đi vào của một dòng electron theo một chiều (hướng về bên trong của tế bào trong trường hợp các cơ thể nhân sơ) và một dòng tương đương các proton theo chiều ngược lại (hướng ra ngoài), mà hợp chất làm chất nhận electron cuối cùng có thể là O2, nitrat, hợp chất hữu cơ... (Hình II.2A).

230

– Lên men để chỉ sự có mặt của chuỗi vận chuyển electron nằm trong tế bào chất, không có sự tự động đi qua của dòng electron hoặc proton ở phần bên này và phần bên kia của màng tế bào (một dòng vận chuyển thứ cấp được thiết lập nếu cần thiết, nhờ năng lượng của ATP) (Hình II.2B).

Hình II.2. Sơ đồ vận chuyển electron và proton

Do đó, hô hấp của một cơ thể là một quá trình vận chuyển electron và proton qua màng với ôxi phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn “hô hấp kị khí” dùng để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton cho đến tận chất nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxi phân tử, như nitrat trong trường hợp hô

hấp nitrat, hợp chất hữu cơ như fumarat như hô hấp fumarate, ion S trong hô hấp

sunphat...

Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng họat động, hoặc được họat động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định.

A. Hô hấp: Vận chuyển electron và proton qua màng. Các proton vận chuyển để tạo ra ATP hoặc để đảm bảo một chức năng khác (vận chuyển chẳng hạn…).

B. Lên men, với khả năng vận chuyển proton nhờ ATP aza thực hiện chức năng khác theo hướng ngược lại.

231

DH2 – cơ chất cho electron

Substrat – cơ chất

Mem cyt – màng tế bào chất

Ví dụ như ở E.coli, vi khuẩn đường ruột này có một chuỗi vận chuyển electron với ôxi phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động như cơ thể hiếu khí) và chuỗi “hô hấp nitrat” hoạt động kị khí trong môi trường nitrat, một chuỗi “hô hấp fumarat”, hoạt động kị khí trong môi trường chứa cơ chất hữu cơ, mà vi khuẩn này có thể lên men.

Bên cạnh quá trình photphorin ôxi hoá cơ chất, còn tồn tại những con đường khác, đặc biệt là con đường ôxi hoá trực tiếp nhờ các enzim vận chuyển các electron từ cơ chất đến oxi với sự tạo thành nước ôxi hoá hoặc hiđro peroxit.

Hợp chất này rất độc và cần phải ngay tức khắc được phân giải nhờ catalaza, peroxiđaza hoặc superoxit dimutaza, tránh cho tế bào khỏi bị chết.

Có thể có hai cơ chế:

H2O2 H2O + 1/2O2

H2O2 + 2H+ + 2e– 2H2O

Tùy thuộc vào số và lượng các enzim có thể phân giải H2O2 mà quyết định tính hiếu khí hay kị khí ở các vi khuẩn.

VI. CÁC HÌNH THỨC LÊN MEN CHÍNH

Về phương diện chuyển hoá năng lượng, lên men cũng là một quá trình ôxi hoá khử, nhưng chất nhận electron cuối cùng là các hợp chất hữu cơ, chứ không phải là các phân tử ôxi. Quá trình này cũng giải phóng năng lượng nhưng ít hơn nhiều so với quá trình hô hấp.

Glucozơ

Ở tế bào nhân chuẩn, hầu như toàn bộ glucozơ được chuyển hoá thông qua con đường đường phân.

Các vi sinh vật có những con đường khác nhau, có khi hoạt động song song.

232

FADH2 + O2 FAD–oxidaza FAD + H2O2

Sự tham gia của các con đường khác nhau trong trao đổi chất hexozơ

(tính theo %)

Loại vi sinh vậtCon đường

frutozơ–1,6–điphotphat

Con đường

pentozơ–photphat

Con đường

2–xeto–3–deoxi–6–

photphogluconat

Candida utilis 70–80 30–20

Streptomyces griseus 97 3

Penicillium chrysogenum 77 23

Escherichia coli 72 28

Bacillus subtilis 74 26

Pseudomonas aeruginosa 29 71

Gluconobacter oxidans 100

Pseudomonas saccharophila

100

Alcaligenes eutrophus 100

Ghi chú: – Con đường fructozơ–1,6–diphotphat (hay là glycolyse, Embden–Meyerhof–Parnas)

– Pentozơ–photphat (hay là hexozơ–monophotphat, Warburg–Dickens–Horecker)

– 2–xeto–3 deoxi–6–photpho gluconat (hay Entner–Doudoroff).

Số phận của pyruvat sẽ tiếp tục như thế nào là tùy thuộc vào hệ enzim của vi sinh vật. Nếu ở các vi sinh vật hiếu khí hoàn toàn thì các hợp chất 3 cacbon này sẽ được oxi hoá đến cùng để tạo ra CO2 và H2O, còn nếu pyruvat được các vi sinh vật hoạt động kị khí sử dụng, thì tùy thuộc vào hệ enzim của từng loài mà có các sản phẩm lên men khác nhau.

Lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hoá sinh học kị khí các hợp chất đường thành axit lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác nữa.

Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm là axit lactic.

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như axit axêtic, etanol, CO2...

233

Streptococcus lactis (x500)

Leuconostoc mesenteroides (x1000)

Lactobacillus acidophilus (x1000)

Lactobacillus lactis (x500)

Hình II.3. Ảnh chụp hiển vi một số loài vi khuẩn lactic

Cơ chế của quá trình lên men lactic

Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic đồng hình từ glucozơ có thể viết là:

C6H12O6 2C3H6O3 + 136kJ (32,4kcal)

Đường được vi khuẩn lactic lên men chủ yếu thành axit lactic. Khi lên men đồng hình, đường sẽ đi theo con đường EMP để biến thành axit lactic, còn khi lên men lactic dị hình thì con đường pentozophosphat sẽ được sử dụng để hình thành lactat, etanol và axetat.

234

2ATP

2ADP

2Glyxeranđehit–3–P

2 1,3– Biphotphoglyxerat

Glucozơ

2Pi*

2NAD+

2NADH+2H+

2Lactat

2Pyruvat

4ATP 4ADP

*

*

Lactatđehiđrogenaza

Mức năng lượng:

A. Trong lên men đồng hình: 2 ATP cho một glucozơ 5ATP cho 1 phân tử lactozơ

B. Trong lên men dị hình: 1 ATP cho 1 glucozơ và 3 ATP cho phân tử lactozơ.

Ngoài vi khuẩn còn có một số cơ thể bậc cao có thể tạo được axit lactic, ví dụ một số loài nấm Rhizopus như Rh.oryzae có thể tạo ra được khoảng 60% axit lactic so với lượng đường sử dụng, nhưng ở đây là lên men oxi hoá.

Ứng dụng của quá trình lên men lactic

1. Sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, quả, ủ chua thức ăn gia súc

Đây là hình thức bảo quản thực phẩm bằng công nghệ lên men vi sinh vật.

Vi khuẩn lactic không phá vỡ tế bào thực vật nên dưa, quả muối chua vẫn có hình dạng gần như không đổi.

Để kích thích vi khuẩn lactic phát triển nhanh, ta có thể muối dưa, quả bằng nước ấm, để vại muối ở nơi kín gió, gần bếp, thêm một ít đường, cấp giống bằng ít nước dưa chua của mẻ trước.

Ủ chua thức ăn cho gia súc thực chất cũng là sử dụng vi khuẩn lactic để giữ cây cỏ dùng trong chăn nuôi được tươi “sinh học”, tức là không bị giảm chất lượng dinh dưỡng, ngược lại được bổ sung nhiều loại vitamin do vi khuẩn tổng hợp nên.

2. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất sữa chua (yaourt)

Vi khuẩn lactic phát triển, làm pH hạ thấp, cùng với pH và các yếu tố khác, casein của sữa sẽ đông tụ, làm sữa chuyển trạng thái từ lỏng sang keo sệt, sản phẩm yaourt hơi chua, keo sệt và có hương vị thơm ngon.

Cũng bằng phương pháp lên men lactic người ta còn tạo ra được các sản phẩm khác như kem chua, fomat (fromage), làm nem chua...

3. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic

235

Axit lactic được dùng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm, thuộc da, trong y học, chế tạo chất dẻo, sơn… Nguyên liệu chủ yếu để lên men lactic trong công nghiệp là ngô, khoai, sắn, khoai tây.

4. Tác dụng gây hại của vi khuẩn lactic

Ngoài những tác dụng có lợi của vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn lactic còn làm chua rượu vang, bia, nước ngọt.

Lên men etylic

Lên men rượu là một quá trình sinh hoá phức tạp cần có sự tham gia của nấm men hoặc một số vi sinh vật khác. Trong quá trình lên men rượu, đường được biến đổi thành rượu etylic và CO2.

Tác nhân chính của quá trình lên men rượu là các loại nấm Saccharomyces. Đây là tên nấm men theo nghĩa hẹp. Còn nấm men theo nghĩa rộng là nhóm nấm đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi, chúng có thể thuộc về 3 lớp Nấm: Nấm túi (Asscomycetes), Nấm đảm (Basidiomycetes) và Nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi imperfecti). Các loài nấm men Saccharomyces có tế bào hình ôvan. Kích thước khoảng 3–10 5–12m. Trong công nghệ sinh học, người ta có thể tuyển chọn các chủng nấm men có kích thước lớn, đa bội và hoạt tính sinh học rất cao. Nấm men Saccharomyces sinh sản vô tính theo cách nảy chồi, có khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhất định, thường 1 – 4 bào tử.

Cơ chế hoá học của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết là:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kJ

Theo M.Larpent–Gourgaud và cộng sự (1992) thì tỉ lệ các sản phẩm về lí thuyết là: etanol 48,4%; CO2 46,6%; glyxerol 3,2%; axit xuccinic 0,6%; sinh khối tế bào 1,2% so với glucozơ được sử dụng.

– Phương trình của giai đoạn cuối cùng là:

CH3CHO + NADH + H+ CH3CH2OH + NAD+

Thật ra phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, qua hơn 10 phương trình phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzim xúc tác, kết quả cuối cùng cho ta rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác. Neiberg đã bổ sung bisunfit vào môi trường lên men, lượng rượu giảm đi để chứng minh rằng axetanđehit là chất nhận hiđro từ NADH.H+ (NAD–H2) để biến thành rượu.

236

Các loài S.cerevisiae lên men rượu theo con đường EMP, trong khi vi khuẩn Zymomonas mobilis lại phân giải glucozơ theo con đường xetodioxiphotphogluconat (XDPG), còn các nấm mốc như Mucor lên men glucozơ chủ yếu (70% cơ chất) theo EMP và phần khác (30% cơ chất) theo HMP.

Hiệu suất năng lượng khi nấm men rượu sống trong điều kiện hiếu khí:

Glucozơ 6CO2 + 6H2O + 36(38)ATP

Còn trong điều kiện kị khí:

Glucozơ 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

– Hiệu ứng Pasteur

Như trên đã trình bày, muốn biến thành rượu, axetanđehit phải nhận hiđro từ NAD–H2 (NAD+H+H khử) dưới sự xúc tác của ancol đehiđrogenaza. Khi môi trường hiếu khí, phần lớn nucleotit khử phải đi vào con đường hô hấp hiếu khí, do đó làm giảm lượng NAD–H2 cho quá trình biến axetanđehit thành rượu, vì vậy mà lượng rượu giảm đi, sinh khối tăng và glyxêrin cũng tăng, cho nên thực chất của hiệu ứng Pasteur là sự cạnh tranh của NAD–H2 trong quá trình hô hấp đối với quá trình lên men ở nấm men S.cerevisiae. Chính L.Pasteur là người đầu tiên phát hiện ôxi tự do cảm ứng quá trình hô hấp và ức chế quá trình lên men ở nấm men; về sau này Custeurs đã bổ sung thêm những điều kiện của quá trình lên men rượu: kị khí; đường có thể lên men; pH giữ ở 4,5–5,5; nhiệt độ ở khoảng 25–300C; số lượng nấm men giống là 0,26% trọng lượng cơ chất. Khi pH trở nên kiềm (khoảng 7,5–8) thì nấm men sẽ tạo thành glyxerin là sản phẩm chủ yếu.

Ứng dụng của quá trình lên men rượu

a. Sản xuất công nghiệp rượu etylic

Rượu etylic là một dung môi rất phổ biến, người ta sử dụng rượu trong công nghiệp chế biến cao su nhân tạo, este… Rượu vang là loại rượu lên men dịch quả không qua chưng cất; hiện nay ở nước ta đang nghiên cứu chế tạo vang điều, vang

237

vải…

b. Sản xuất bia

Bia là một loại nước giải khát lên men rượu nhẹ không chưng cất gồm; 92% nước, 2–9% rượu etylic và các loại đường sót, rất nhiều vitamin nhóm B, nên là loại nước uống rất được ưa chuộng ở nhiều nước. Bốn nguyên liệu cơ bản quyết định chất lượng bia: lúa mạch (orge) mọc mầm, hoa houblon, nấm men và nước.

Quá trình làm bia gồm 2 công đoạn chủ yếu:

– Nấu malt (biến tinh bột thành đường, maltage);

– Lên men, nhào trộn, ủ chín.

c. Nấm men rượu làm nở bột mì

Chính các ổ CO2 sẽ nở ra khi nướng bánh làm cho bánh xốp.

Giống nấm men làm nở bột mì là S.cerevisiae phải đạt những tiêu chuẩn sau: dễ khuếch tán vào nước, có đặc tính sinh hoá ổn định và độ bền vững tốt (không dễ tự thủy phân), khả năng sinh sản nhanh, năng suất lên men cao, hàm lượng chất dinh dưỡng dễ hấp thụ cao.

d. Sản xuất sinh khối nấm men, sản xuất prôtêin đơn bào

Nấm men có nhiều ưu điểm so với các vi sinh vật khác để tạo sinh khối: Sinh trưởng và phát triển nhanh (30–60 phút một thế hệ), lên men nhanh, tận dụng được phế liệu rẻ tiền, có thành phần dinh dưỡng hết sức quý giá đối với người và vật nuôi.

VII. QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP MỘT SỐ CHẤT

Các đại phân tử có một kiểu cấu trúc giống nhau: đó là các hợp chất trùng hợp (polime), tức là một chuỗi dài các phân tử được hình thành bởi các đơn phân (monome) nối với nhau bằng các mạch nối đặc trưng. Nếu các đơn phân giống nhau thì ta có các polime đơn giản hay homopolime. Ngược lại, nếu các đơn phân khác nhau, thì ta gọi đó là hợp chất dị trùng hợp (heteropolyme). Sự sắp xếp các đơn phân có thể là mạch thẳng hay thường gặp hơn là mạch có phân nhánh, trong đó có thể là kiểu sắp xếp có quy luật hay bất quy luật, theo đặc điểm này người ta chia thành:

– Các polisaccharit, các polime đơn H–H–H–H–H–... (ví dụ như tinh bột, xenlulozơ) hoặc các polime dị trùng hợp có quy luật (ví dụ: G–M–G–M–G–... trong murein của thành tế bào vi khuẩn).

– Các axit nuclêic gồm có 4 loại bazơ purin hoặc pyrimiđin, trong đó trật tự sắp xếp các bazơ là bất quy luật, đó là các dị trùng hợp bất quy luật: A–T–G–G–T–G–X–A–T–T–...

238

– Các prôtêin được hình thành do tập hợp của hơn 20 loại axit amin và sắp xếp bất quy luật, đó là các dị trùng hợp bất quy luật: A–B–L–G–D–D–...

Sự trùng hợp các đơn phân để tạo ra các hợp chất trùng hợp đòi hỏi một số năng lượng nhất định, trừ một số ít các chất trùng hợp đơn giản và các đơn phân trước đó có hoạt tính.

Ngày nay, bên cạnh các chất chuyển hoá sơ cấp, người ta đã biết rất nhiều chất chuyển hoá thứ cấp (khoảng 1100 sản phẩm khác nhau từ vi khuẩn, gần 2000 hợp chất từ nấm, khoảng 6500 hợp chất từ xạ khuẩn, 110 chất từ địa y, 270 chất từ tảo, 3000 chất rút chiết từ thực vật bậc cao và 750 chất do các cơ thể động vật tạo ra).

CÂU HỎI – BÀI TẬP CHƯƠNG 2

1. Bài tập

Để nghiên cứu kiểu hô hấp của 3 loại vi sinh vật: Pseudomonas aeruginosa,

Escherichia coli và Clostridium sporogenes, người ta cấy sâu chúng vào môi trường

thạch loãng có nước thịt và gan (VF) với thành phần sau (g/l):

Lô A Lô B

Nước chiết thịt

Glucozơ

Thạch

Nước cất

: 30g

: 2g

: 6g

: 1 lít

Môi trường như A

có thêm KNO3 – 1g

Sau khi nuôi ở nhiệt độ phù hợp kết quả thu được như sau:

Ở lô A: - Ps.aeurinosa phát triển ở mặt thoáng ống nghiệm.

- E.coli phát triển trong toàn bộ ống nghiệm.

- Cl.sporogenes phát triển ở đáy ống nghiệm.

Ở lô B: - Ps. aecerinosa phát triển ở toàn bộ ống nghiệm.

- E.coli giống như ở lô A.

- Cl.sporogenes như ở lô A.

a. Hãy xác định kiểu hô hấp của mỗi loại vi khuẩn, giải thích.

239

b. Con đường phân giải glucozơ và chất nhận electron cuối cùng trong trường hợp

lô A, lô B của mỗi loại vi khuẩn.

c. Vì sao Ps.aeruginosa ở hai lô lại có sinh trưởng khác nhau? Enzim đặc trưng

trong sự chuyển hoá nitrat là gì?

2. Viết sơ đồ các bước chính:

a. Len men rượu etylic do Sac. Cerevisiae.

b. Len men lactic do Streptococcus lactis.

3. Để định lượng một dung dịch piridoxin chiết từ hạt ngô đang nảy mầm, người ta

chuẩn bị một môi trường dinh dưỡng lỏng chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết

cho sự sinh trưởng của chủng Streptococcus faecalis, trừ piridoxin. Phân phối môi

trường này vào 8 ống nghiệm khác nhau, đánh số từ 1 đến 8, sau đó tiến hành:

– Bổ sung vào các ống nghiệm từ 2 đến 6 những thể tích nhất định của một dung

dịch mẹ chứa 2mg/ ml piridoxin chuẩn.

– Bổ sung vào các ống 7 và 8 những thể tích nhất định một dung dịch được chuẩn bị

từ hạt ngô nảy mầm.

– Bổ sung nước cất vào tất cả các ống nghiệm để chúng đạt cùng một thể tích.

– Sau khi cấy vi khuẩn để đạt nồng độ tế bào ban đầu là 105 tế bào /ml, tất cả các

ống ngiệm được giữ trong tủ ấm 370C trong 24 giờ trên máy lắc. Đo sự sinh trưởng

bằng cách đếm khuẩn lạc trên mặt thạch của khay petri, kết quả trong bảng sau:

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7 8

Môi trường dinh dưỡng (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5

Dung dịch piridoxin chuẩn (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0

Dung dịch ngô nảy mầm (ml) 0 0 0 0 0 0 2,5 5

Nước cất (ml) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2,5 0

Sinh trưởng của vi sinh vật logN 5 5,12 5,24 5,36 5,39 5,40 5,12 5,24

a. Có thể thay thế chủng vi khuẩn Streptococcus faecalis trong thí nghiệm trên bằng

bất kì chủng vi khuẩn nào khác được không? Vì sao?

b. Ống nghiệm 1 có cần thiết không?

c. Các ống nghiệm từ 2 đến 6 có tác dụng gì?

d. Tính nồng độ của piridoxin trong dung dịch chuẩn bị từ hạt ngô nảy mầm.

240

241

CHƯƠNG 3

SINH TRƯỞNG VÀ SINH SẢN Ở VI SINH VẬT

I. KHÁI NIỆM SINH TRƯỞNG Ở VI SINH VẬT

Sự sinh trưởng thường được hiểu là sự tăng số lượng vật chất sống kèm theo sự lớn lên của tế bào về kích thước và khối lượng. Tuy nhiên, ở vi khuẩn có khi trong quá trình sinh trưởng, chúng hình thành bào tử, khi đó khối lượng và kích thước tế bào giảm đi so với tế bào sinh dưỡng, ta gọi hiện tượng này là sinh trưởng âm. Sự phát triển có thể hiểu là sự tăng kích thước tế bào dẫn đến sự phân chia, làm tăng số lượng cá thể trong quần thể.

Ở cơ thể đơn bào cần phân biệt sự tăng số lượng tế bào và tăng khối lượng tế bào. Để xác định số lượng vi khuẩn hoặc khối lượng vi khuẩn, người ta dùng huyền phù tế bào thuần chủng và xác định “nồng độ vi khuẩn” (số tế bào trong 1ml) hoặc “tỉ khối vi khuẩn” (mg/ml).

II. SỰ SINH SẢN Ở VI KHUẨN VÀ ARCHAEA

Thể nhiễm sắc của vi khuẩn nhân đôi dẫn đến sự hình "thành vách ngăn và sự phân thành 2 tế bào con, những tế bào này có thể tách nhau (Micrococcus) hoặc không (liên cầu khuẩn – Streptococcus, liên trực khuẩn – Streptobacillus,...) nhưng về hình dạng, cấu tạo, tính chất lí hoá và sinh lí giống như tế bào mẹ.

III. SỰ SINH SẢN Ở VI SINH VẬT NHÂN THỰC

Vi sinh vật nhân chuẩn có thể sinh sản bằng bào tử vô tính (bào tử có thể ở trong túi hoặc ở trên cuống sinh bào tử), bằng nguyên phân tạo thành hai tế bào... Có thể sinh sản bằng các bào tử hữu tính (bào tử nấm men, bào tử nấm đảm...).

Nấm men sinh sản vô tính bằng nẩy chồi hoặc phân đôi, xen kẽ quá trình này có thể sinh sản hữu tính. Nấm men có 3 dạng chu trình sống sinh học.

Nấm men phân đôi được giới thiệu ở đây giống chu kì tế bào điển hình đối với cơ thể nhân chuẩn cũng có các pha G1, S, G2 và M.

Ở nấm men nảy chồi có các pha G1 và S bình thường, nhưng thoi vô sắc ở đây được hình thành rất sớm, ngay cuối pha S làm cho pha G2 không bình thường (ngắn lại), và trong khi chưa hình thành xong nhân, thành tế bào đã bắt đầu gấp lại.

242

IV. SINH TRƯỞNG TRONG NUÔI CẤY KHÔNG LIÊN TỤC

Nếu bắt đầu từ một tế bào vi sinh vật, sau thời gian của một lứa (g), chúng ta có 2 tế bào, tiếp theo có 4 tế bào... Nên số lượng của chúng tăng theo cấp số mũ  : 1(20) 21 22(4) 23(8) 24(16) ... 2n.

Trong điều kiện thích hợp nhất, thời gian của một lứa đối với:

– V.parahaemolyticus là 10 phút.

– E.coli là 20 phút (sau 24 giờ sẽ sinh ra số lượng tế bào từ một tế bào ban đầu có thể đắp thành khối tháp có đáy là 1km2 và chiều cao 1km).

– Vibrio cholerae (vi khuẩn gây bệnh tả) sau 48 giờ tạo được 22.1024 (cứ 20 phút phân chia 1 lần) tế bào, có khối lượng 22.1024 tấn, tức là nặng gấp 4000 lần chính trọng lượng Trái Đất.

Chúng ta có thể xác định số lần phân chia trong một đơn vị thời gian (trong một giờ), tức là số đảo ngược (1/g), ứng với các vi sinh vật kể trên ta có:

– 6 đối với V.parahaemolyticus.

– 3 đối với E.coli.

Nếu trong một đơn vị thể tích lúc đầu có N0 tế bào thì sau n lần phân chia số tế bào sẽ là : N = N0.2n (1)

Lôgarit hoá ta có : lgN =lgN0 + nlg2 (2)

Từ đó tính được số lần phân chia theo công thức :

(3)

Số lần phân chia trong một giờ, hay tốc độ sinh trưởng trung bình () là:

(4)

Nếu các giá trị logN1 (t1), logN2(t2) lấy trong pha log thì ta có là cực đại và là hằng số.

Rõ ràng, nếu thời gian của một lứa ( ) càng ngắn thì vi khuẩn sinh trưởng

và phát triển càng nhanh. Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy.

Đồ thị sinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong hệ “kín” (nuôi cấy không liên tục)

243

Hệ "kín" ở đây có nghĩa là trong môi trường không được đổi mới, ta biết trên môi trường đặc (thạch đĩa) một tế bào vi khuẩn sau 24–48 giờ sẽ tạo thành một khuẩn lạc.

Sự sinh trưởng trong hệ "kín” theo những quy luật chi phối không chỉ đối với cơ thể đơn bào mà còn đối với cả cơ thể đa bào nữa.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của log số tế bào với thời gian gọi là đồ thị sinh trưởng. Đồ thị này có thể chia làm 6 pha liên tiếp :

a. Pha tiềm phát (lag) : Ở pha này số lượng tế bào (X) không tăng, tức là bằng

X0, đặc trưng khi x = 0, khi đó = x.x = 0.

b. Pha tăng tốc: Số lượng tế bào tăng dần, do đó x tăng dần.

c. Pha cấp số mũ (pha log): Ở pha này x tăng theo thời gian theo cấp số mũ và lnX tỉ lệ thuận theo t, ở suốt pha này cực đại và là cực đại đối với điều kiện nuôi cấy cụ thể và đối với một chủng vi sinh vật nhất định, ta có x là cực đại.

d. Pha giảm tốc: Ở pha này, sự tăng số lượng vi sinh vật trong quần thể x bị chậm dần, x giảm dần, tốc độ sinh trưởng riêng chậm dần.

e. Pha cân bằng động: Số lượng vi sinh vật x đạt đến cực đại và không đổi theo thời gian, chính ở pha này x = 0, tốc độ sinh trưởng riêng bằng 0, vì có một số tế bào tự phân huỷ cung cấp một số chất dinh dưỡng để một số tế bào tiếp tục phân chia, nên số lượng tế bào trong quần thể (N) không đổi.

f. Pha suy vong: Ở đây x giảm dần, tế bào tự phân giải do các enzim nội bào và các chất ngoại bào.

Hình III.1. Đồ thị sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ “kín”.

V. SINH TRƯỞNG TRONG NUÔI CẤY LIÊN TỤC

244

Khi nuôi cấy vi sinh vật trong hệ “kín”, tức là môi trường không được đổi mới, điều kiện môi trường sống bị thay đổi, hàm lượng chất dinh dưỡng cạn kiệt dần, sự tích luỹ các sản phẩm đã qua trao đổi tăng lên không ngừng, đó là nguyên nhân chính làm cho pha sinh trưởng cấp số chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, nguyên nhân làm thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng, hình thái và các đặc điểm sinh lí – sinh hoá, điều này rất bất lợi cho quá trình công nghệ vi sinh, sản xuất công nghiệp. Để tránh sự “già” của giống, để giữ giống nuôi cấy ổn định trong cùng một trạng thái, ví dụ ở pha log chẳng hạn, bằng cách đưa liên tục các dung dịch dinh dưỡng vào và đồng thời loại bỏ một lượng tương đương dịch huyền phù nuôi cấy ra, đó là nguyên tắc cơ bản cho quá trình nuôi cấy liên tục trong các hệ nồi lên men kiểu chemostat (máy điều chỉnh bằng phân tích sinh hoá) và turbidostat (máy điều chỉnh bằng con mắt điện).

VI. CÁC TÁC NHÂN ỨC CHẾ SỰ SINH TRƯỞNG VÀ ỨNG DỤNG

* Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự sinh sản của vi sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hưởng đến tốc độ của các phản ứng hoá học và sinh hoá học). Căn cứ vào nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng, người ta chia vi sinh vật ra làm các nhóm: vi sinh vật ưa ấm (20 – 400C), vi sinh vật ưa lạnh (0 – 100C), vi sinh vật ưa nhiệt (> 450C).

* Hoạt tính pH thể hiện ở 3 mức độ: tại môi trường, tính dễ thấm qua màng và

hoạt động trao đổi chất. Khi sử dụng một số chất dinh dưỡng (nhất là có các ion kim

loại) môi trường có bị thay đổi do sự cân bằng ion, sự tổng hợp ATP phụ thuộc nhiều

vào dòng ion, hoạt tính enzim rất nhạy cảm với sự thay đổi pH.

– Các nấm mốc và nấm men ưa sống trong pH axit (pH 3–6), có một số loài

(Sac.bailii) sống ở pH 1,5–2.

– Các vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở môi trường trung tính (pH 6,5–7,5). Đối

với nhiều vi khuẩn giới hạn pH tương đối rộng, ví dụ như E.coli có thể phân chia từ

pH 4,4 đến pH 9. T.thiooxydans có pH tối ưu gần 2 để sinh trưởng lại có thể phát triển

ngay cả khi pH = 0.

* Nước được vi sinh vật sử dụng theo hai cách: dung môi của các chất dinh

dưỡng vận chuyển các chất này để tế bào sử dụng khi cần và như một tác nhân hoá

học và các phản ứng thuỷ phân.

Mỗi loại vi sinh vật cần một ngưỡng độ ẩm. Khi độ ẩm thấp, chúng phát triển

chậm. Khi giảm Aw dẫn đến sự thuỷ phân bào tương và làm giảm hoạt tính của các

enzim. Chẳng hạn Staphylococcus aureus giảm tốc độ sinh trưởng đến 10% khi Aw =

0,9. Người ta có thể sử dụng yếu tố nước để khống chế sự sinh trưởng của vi sinh vật.

245

* Các lượng tử bức xạ gây nên những biến đổi hoá học của các nguyên tử và

phân tử có chiều dài bước sóng khoảng 10.000Å, trong đó có ánh sáng mặt trời, tia tử

ngoại, tia X, tia gamma, tia vũ trụ...

Các tác nhân gây đột biến:

Trong môi trường sống quanh ta có rất nhiều nhân tố hoá lí, những sản phẩm

thải ra của hoạt động công nghiệp và đời sống, những nhân tố tiềm tàng gây ung thư,

đang là mối lo ngại khôn lường. Người ta dự tính rằng có khoảng 80% ung thư của

người là do tiếp xúc (hấp thụ, hít thở, ăn uống...) với các tác nhân trên. Hằng năm, có

khoảng một ngàn hợp chất mới tổng hợp được tung ra thị trường thế giới và hàng ngàn

chất được vứt bỏ ra môi trường mà không có khả năng kiểm soát.

Sự thăm dò các tác nhân gây ung thư thường được làm trên động vật, là những thí nghiệm rất dài (từ hai đến ba năm) và rất tốn kém (tốn khoảng vài triệu đô la). Trong điều kiện như vậy, người ta tính rằng các thí nghiệm tác nhân gây ung thư lên vi khuẩn dễ dàng hơn và đỡ tốn kém hơn nhiều lần, mà vẫn đưa ra được những kết luận cần thiết. Khoảng 90% số chất hoá học đem thử tác nhân gây ung thư, thực tế đã tạo ra các đột biến.

VII. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI SINH

Ngày nay công nghệ sinh học mà trong đó chủ yếu là công nghệ vi sinh vật và công nghệ di truyền đang hướng tới việc giải quyết nạn ô nhiễm môi trường, việc sản xuất nguồn năng lượng mới nhờ vi sinh vật tái tổ hợp. Khoa học hiện nay có thể thực hiện việc lai bằng cách hợp nhất hai tế bào trần, kĩ thuật bắn gen có thể đưa một gen ngoại lai vào tế bào nhận, trong đó tế bào nhận có thể có vị trí chủng loại phát sinh rất xa với cơ thể cho gen ngoại lai... Kĩ thuật PCR có thể nhân nhanh các đoạn ADN mong muốn; người ta có thể đưa cả gen cố định đạm từ Agrobacterium tumefaciens vào cây nhờ plasmid Ti, tạo ra được cây cố định nitơ khí quyển... Tất nhiên từ những thí nghiệm ra sản xuất còn là một quá trình cần thời gian và công sức của nhiều người.

Sản xuất một loại prôtêin bằng công nghệ di truyền bao gồm 5 công đoạn chủ yếu:

– Tổng hợp hoặc chiết một cách tinh khiết một đoạn ADN mã hoá cho loại prôtêin cần.

– Kết ghép đoạn ADN lạ này vào một vectơ (plasmid hay phage) tạo ra một ADN tái tổ hợp.

– Đưa vectơ đã ghép với gen lạ vào tế bào vi khuẩn nhận.

– Tuyển chọn dòng tế bào tái tổ hợp.

246

– Xác định và làm tinh khiết prôtêin được tổng hợp.

Có thể nói rất nhiều về ứng dụng và triển vọng của công nghệ di truyền trong hiện tại và tương lai. Trong lĩnh vực y học phải kể tới interferon, insulin...

Việc tổng hợp insulin là một bước phát triển mới của công nghệ, nó đã giảm rất nhiều những chi phí trong việc chữa bệnh tiểu đường (đái tháo đường); sự tinh khiết của insulin đảm bảo tính dung nạp tuyệt vời của nó so với các insulin có nguồn gốc từ động vật.

CÂU HỎI, BÀI TẬP CHƯƠNG 3

1. Nguyên nhân gì làm cho một chủng vi sinh vật cần phải có pha tiềm phát (pha lag)

khi bắt đầu nuôi cấy chúng trong môi trường mới?

2. Hãy tính tốc độ sinh trưởng trung bình và thời gian một thế hệ của một chủng vi

sinh vật, khi nuôi cấy nó tăng từ 5.102 lên 1.108 tế bào trong 12 giờ.

3. Nếu thời gian một thế hệ là 90 phút và quần thể ban đầu khi nuôi cấy gồm 103 tế

bào, thì quần thể sẽ là bao nhiêu tế bào sau 8 giờ nuôi cấy trong pha sinh trưởng cấp

số mũ (pha log)?

4. Nuôi cấy liên tục có lợi thế gì và nhược điểm gì so với nuôi cấy không liên tục?

5. Bài tập

Người ta nuôi vi khuẩn Acetobacter suboxydans trên môi trường lỏng chứa các chất

dinh dưỡng phù hợp, trong bình A không có axit para–aminobenzoic (PAB) và

trong bình B có hợp chất này. Ở từng thời điểm người ta tính sự sinh trưởng của vi

khuẩn giấm theo lnN = f(t), kết quả ghi trong bảng sau; biết rằng chỉ có vi khuẩn

phát triển trong môi trường B.

t (giờ) lnN t (giờ) lnN

0 11,50 9 15,75

1 11,50 10 16,55

2 11,50 11 17,05

3 11,50 12 17,40

4 11,85 13 17,55

5 12,45 14 17,65

6 13,25 15 17,70

247

7 14,10 16 17,75

8 14,90 17 17,75

a. Hợp chất PAB là loại hợp chất gì và có vai trò như thế nào đối với vi khuẩn giấm

này?

b. Hãy kẻ đồ thị sinh trưởng của vi khuẩn theo hàm số lnN = f(t).

c. Xác định các pha sinh trưởng và ý nghĩa sinh lí của từng pha.

d. Nêu mối liên hệ giữa 2 đại lượng lnNt (logarit N ở thời điểm t) và lnNt + g (logarit

N ở thời điểm t+g). Biết rằng g là thời gian một thế hệ tế bào; t và t+g đều nằm

trong pha log (pha cấp số mũ).

e. Hãy tính hằng số tốc độ sinh trưởng riêng và thời gian một thế hệ của vi khuẩn

này (lấy ln2 = 0,7).

6. Một vi khuẩn hình cầu có khối lượng khoảng 5.10–13 gam, cứ 20 phút lại nhân đôi

một lần. Giả sử nó được nuôi trong các điều kiện sinh trưởng hoàn toàn tối ưu, hãy

tính xem sau một khoảng thời gian là bao lâu khối lượng do tế bào vi khuẩn này

sinh ra sẽ đạt tới khối lượng của Trái Đất là 6.1027 gam? (lấy lg2 = 0,3)

248

CHƯƠNG 4

KHÁI NIỆM BỆNH TRUYỀN NHIỄM VÀ MIỄN DỊCH HỌC

I. KHÁI NIỆM BỆNH TRUYỀN NHIỄM VÀ PHƯƠNG THỨC LAN TRUYỀN

Bệnh truyền nhiễm dùng để chỉ toàn bộ quá trình sinh học diễn ra khi lan truyền xâm nhập và phát triển của vi sinh vật gây bệnh trong cơ thể chủ, làm thay đổi hoạt động sinh sống bình thường.

Bí mật của bệnh truyền nhiễm đã được vi sinh học và y vi sinh học phát hiện, do 3 yếu tố sau đây quyết định:

– Trạng thái cơ thể

– Vi sinh vật gây bệnh

– Hoàn cảnh sống.

1– Trạng thái cơ thể: Trước hết là hoạt động của hệ thần kinh và sự trao đổi chất quyết định khả năng nhiễm bệnh hay không, do đó những bệnh tác động mạnh lên hệ thần kinh là nguy hiểm nhất (bệnh dại, uốn ván...). Lứa tuổi của cơ thể cũng dễ làm mắc bệnh này ít mắc bệnh khác.

2– Vi sinh vật là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm: Vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể chủ yếu thông qua ba con đường:

– Con đường hô hấp, như vi trùng gây bệnh lao, bạch hầu, cúm...

– Con đường tiêu hoá như vi trùng thương hàn, vi trùng tả, lị...

– Qua da và niêm mạc bị tổn thương như xoắn khuẩn giang mai, cầu khuẩn lậu...

3– Hoàn cảnh sống của người là yếu tố khá quan trọng để bệnh truyền nhiễm phát sinh và lây lan. Mỗi người bị chi phối bởi hai loại hoàn cảnh: hoàn cảnh tự nhiên như khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm... và hoàn cảnh xã hội mà chủ yếu là chế độ dinh dưỡng, làm việc, giải trí, nghỉ ngơi...

249

II. ĐỘC TỐ VÀ ĐỘC LỰC

Độc lực của vi sinh vật phụ thuộc vào độc tố và chất trợ độc tố. Ngoại độc tố (exotoxin) thường do vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống, như vi khuẩn uốn ván, bạch hầu, độc thịt.... Ngoại độc tố cũng có tác dụng đặc hiệu như vi sinh vật sinh ra nó, còn độc tố nằm bên trong tế bào vi sinh vật và chỉ thoát ra ngoài khi tế bào bị tan, gọi là nội độc tố (endotoxin). Những sai khác chính giữa hai loại độc tố này được trình bày trong bảng sau:

Các tính chất cơ bản của ngoại độc tố và nội độc tố

Tính chất Ngoại độc tố Nội độc tố

– Liên hệ giữa tế bào vi

sinh vật và độc tố

– Dễ dàng khuếch tán từ

vi sinh vật vào môi

trường.

– Khó khuếch tán ra môi

trường, kết hợp chặt chẽ với

các phần bên trong tế bào.

– Vi sinh vật sinh độc tố – Chủ yếu là các vi khuẩn

Gram+

– Thường là các vi khuẩn

Gram–

– Bản chất hoá học – Các dạng prôtêin hoà

tan

– Tổ hợp các loại gluxit – lipit

– polipeptit không tan

– Đối với tác động của

nhiệt độ

– Không bền nhiệt – Bền nhiệt

– Khả năng gây độc – Độc tính mạnh – Độc tính yếu

– Tính kháng nguyên – Rất cao – Yếu hơn

– Khả năng trở thành

vacxin

– Rất cao – Rất thấp

– Biến thành anatoxin

(kháng nguyên độc tố)

– Có thể – Không thể

Những chất trợ lực cho độc tố là những chất chống lại sự bảo vệ của cơ thể,

giúp cho vi sinh vật dễ dàng xâm nhập và phát triển mạnh mẽ trong cơ thể vật chủ.

Muốn gây bệnh, vi sinh vật phải có số lượng nhất định trong cơ thể chủ và phải có

đường xâm nhập thích hợp. Có những vi sinh vật gây bệnh là do chúng kí sinh sinh

sản làm tan tế bào như Plasmodium malariae gây bệnh sốt rét. Lại có những loài

không sống kí sinh trong cơ thể, chúng sống trên các chất thức ăn của người và động

vật, tiết ra các chất độc, gây hại cho người và động vật sử dụng các loại thức ăn này,

250

như Clostridium botulinum tiết độc tố thịt (botulin) ra canh thịt để lâu ngày. Fusarium

graminerum khi phát triển trên hạt lúa mì, bột mì để lâu, tạo thành đám mốc mầu

hồng, tiết ra chất độc tác động lên hệ thần kinh của người và động vật ăn, gây ra say

nôn mửa. Khi cây mọc, nấm cũng mọc theo, tiết vào hạt lúa mì độc tố, nướng cũng

không thể phá huỷ hết được, độc tố này gây viêm hoại tử. Clavicepa purpures nhiễm

trên lúa mạch đen (đôi khi trên lúa mì và đại mạch) tiết độc tố cogotin và cogutaxin

gây bệnh ocgotin (nấm cựa gà)… Một số nấm mốc (đặc biệt Aspergillus flavus) khi

phát triển trên lạc, sắn... sinh ra độc tố aflatoxin; độc tố này gây tổn thương chủ yếu ở

gan, thận và hệ thần kinh, dẫn đến ung thư gan. Nhiều loại nội độc tố (LPS) gây hiện

tượng giảm bạch cầu rất nhanh, chỉ một liều nhỏ tiêm ven đã gây ra chứng giảm 60%

bạch cầu.

Một loại vi khuẩn gây bệnh có độc lực còn là do chúng có một hệ thống enzim

giúp chúng nhanh chóng xâm nhập vào cơ thể chủ, ví dụ rõ nhất ở Staphylococcus

sinh ra các enzim :

– Coagulaza dẫn đến hình thành cục máu đông ở các đường ven, ngăn trở các tế

bào thực bào chui qua và là ổ để vi khuẩn nhân lên.

– Fibrinolyzin làm rời các cục máu và giải phóng các mầm bệnh đi.

Chỉ số LD50 là liều vi sinh vật và độc tố của chúng gây chết 50% động vật được

tiêm (Lethal Dose 50%)

III. BỆNH DO VI SINH VẬT, VIRUT VÀ CÁC PHÂN TỬ HỮU CƠ KHÁC

Có những vi sinh vật sống hoại sinh (dạng Coli, Streptococcus...) trong ống tiêu

hoá (ruột) của người, nhưng khi quá nhiều hoặc cơ thể yếu thì chúng có thể gây bệnh

tiêu chảy... Người ta phân biệt vi khuẩn gây bệnh đặc trưng (BPS) và vi khuẩn gây

bệnh cơ hội (BPO). Loại thứ nhất (BPS) là loại cấp cần chữa kịp thời như dịch hạch,

bệnh tả, bệnh lao, bệnh giang mai, bệnh lị, bệnh thương hàn, v.v...

Virut có thể gây nên 70% số bệnh hiện biết ở trên cơ người, động vật và thực

vật. Prion là loại phân tử prôtêin khi thay đổi cấu hình thì sẽ gây bệnh (ví dụ nhiều

bệnh liên quan đến thần kinh).

Khi cơ thể đang bị vi sinh vật gây bệnh tấn công mạnh thì cần sử dụng ngay các

biện pháp để ngăn chặn sự nhân lên của chúng; một phương pháp hiệu quả là sử dụng

chất kháng sinh thích hợp với liều lượng được thầy thuốc chỉ dẫn. Các chất kháng sinh

là những chất hoá học đặc hiệu có nguồn gốc từ hoạt động sống của sinh vật, có khả

251

năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách có chọn lọc sự sinh trưởng của những vi sinh vật

hoặc tế bào sống nhất định, ngay ở nồng độ thấp.

Trong số 8000 chất kháng sinh đã công bố thì xạ khuẩn (chủ yếu từ chi

Streptomyces) đã tạo ra 60% số chất. Hơn 80% số xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất

vùng Hà Nội nuôi cấy trên ba môi trường cơ bản đã biểu hiện hoạt tính kháng sinh

(Nguyễn Thành Đạt, 1977).

Hình IV.1. Sơ đồ cơ chế tác động chủ yếu của các chất kháng sinh.

IV. KHÁNG NGUYÊN

Cơ thể đề kháng lại với vi sinh vật gây bệnh bằng cơ chế không đặc hiệu và đặc hiệu.

Cơ chế không đặc hiệu Cơ chế đặc hiệu

– Sự ngăn cản bên ngoài bằng da, niêm mạc, lông – Tế bào lymphô T (thuộc tuyến

ức) (lymphocyte T)

– Phản ứng viêm tấy – Tế bào lymphô B

252

– Hiện tượng thực bào (các tế bào bạch cầu)

– Các hợp chất kháng khuẩn như interferon.... – Các kháng thể đặc hiệu

Tham gia vào quá trình thực bào gồm các loại bạch cầu. Sốt là sự tăng nhiệt độ

trên mức 370C, là cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể, do nhiệt độ cao làm tăng tốc độ

hoạt động của các enzim phân giải vi sinh vật, làm tăng hoạt động của interferon và

giảm lượng sắt trong máu, hạn chế sự sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh. Viêm tấy

là hiện tượng do các tế bào (chủ yếu là bạch cầu ưa kiềm) tiết các histamin làm dãn

mạch, giúp máu dồn về nhiều hơn, do đó làm đỏ nơi khu trú nhiều vi sinh vật gây

bệnh; nơi viêm đỏ nóng lên, các bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng cường hoạt

động thâu bắt các vi sinh vật gây bệnh, tạo nên sưng tấy và có mủ.

Cơ chế đề kháng đặc hiệu của cơ thể gồm hoạt động của tế bào lympho (T và B)

và các kháng thể, cơ chế đặc hiệu có thể là miễn dịch tế bào (cơ chế tế bào) hay miễn

dịch thể dịch (cơ chế thể dịch).

Các phản ứng miễn dịch có thể được tăng cường nhờ các hợp chất khác nhau

khi thêm vào mà người ta gọi là các tá dược. Các chất này có thể là chất vô cơ nhôm

hiđroxit, nhôm photphat, các chất từ vi khuẩn (BCG) v.v... Chúng làm chậm quá trình

tái hấp phụ của kháng nguyên và do đó làm tăng cường phản ứng viêm nhiễm. Ngược

lại, có một số dược chất (corticoit, các globulin kháng thực bào lympho ...) được sử

dụng trong ung thư học hay trong ghép cấy lại làm giảm tính miễn dịch do chúng tác

động lên tế bào lympho T.

Như vậy là trong phản ứng miễn dịch, các tế bào lympho B và T đều cần thiết

bắt buộc. Sự nhận biết một kháng nguyên là điểm mấu chốt và phải thực hiện nhanh

để cơ thể có chiến lược và sách lược phòng thủ thích hợp nhờ các kháng thể và miễn

dịch tế bào.

Kháng nguyên là chất hoá học có khả năng gây ra trong cơ thể đáp ứng miễn

dịch. Kháng nguyên là các chất lạ như các loại prôtêin, các chất độc thực vật (abin,

rôbin, crotin, rixin, curxin...), các chất độc động vật (nọc rắn, nọc ong, nọc rết), các

loại enzim, các chất có khối lượng phân tử lớn hơn 10.000 Da, các bào quan của tế

bào, ribôsom, thể nhiễm sắc, một số loại polisaccarit. Tuy nhiên, không phải bất kì

chất lạ nào cũng là kháng nguyên. Có loại tự mình nó cũng gây cho cơ thể hình thành

kháng thể đặc hiệu, gọi là kháng nguyên thực (kháng nguyên hoàn toàn), loại khác tự

nó không thể kích thích tổng hợp kháng thể gọi là bán kháng nguyên (haften), mà chỉ

253

có khả năng phản ứng đặc hiệu với loại kháng thể nhất định sẵn có, ví dụ các bán

kháng nguyên như các haften polisaccarit, axit penicillinic... Khi kháng nguyên không

hoàn toàn liên kết với prôtêin mang thì trở thành kháng nguyên hoàn toàn.

Các kháng nguyên có thể được xếp vào hai lớp:

– Các prôtêin và các polipeptit lớn hơn octopeptit.

– Các polisaccarit.

V. KHÁNG THỂ

Như trên đã nêu, miễn dịch có thể là miễn dịch thể dịch hoặc miễn dịch tế bào.

Các kháng thể là những prôtêin được tổng hợp nhờ các tế bào lympho. Các kháng thể

có thể tồn tại dưới dạng các phân tử tự do lưu chuyển trong dịch thể của cơ thể miễn

dịch hoặc dưới dạng phân tử nằm trong màng tế bào chất của các tế bào lympho B. Tất

cả các kháng thể (KT) là loại prôtêin miễn dịch thuộc họ globulin và viết tắt là Ig

(immunoglobulin G). Các Ig là những glucoprôtêin có ít gluxit. Các immunoglobulin

thường có dạng chữ Y.

254

Hình IV.2. Sơ đồ cấu trúc phân tử globulin miễn dịch

Bên trái : Sơ đồ một phân tử kháng thể. H– chuỗi polipeptit nặng (2 chuỗi giống nhau), L – các chuỗi nhẹ (giống nhau), V (phần gạch) vùng thay đổi của các chuỗi (NH2

điểm mút). C– vùng không đổi của các chuỗi (COOH điểm mút). SC – điểm kết hợp với kháng nguyên. Bốn polipeptit được nối với nhau bởi các cầu đisunfit (S–S).

Bên phải : Mô hình phân tử của G. Edelman.

Bốn phân tử polipeptit bằng nhau từng đôi một: có 2 chuỗi nặng khoảng 450

axit amin, hay chuỗi H (heavy chains) và hai chuỗi nhẹ khoảng 200 axit amin, hay

chuỗi L (light chains). Bốn chuỗi được liên kết với nhau nhờ các cầu đisunfit, tạo

thành một đại phân tử có đối xứng hai bên kiểu hình chữ Y. Các kháng thể có khối

lượng phân tử rất lớn từ 160.000 trở lên, khá bền với lạnh và khô, nhưng rất dễ bị phá

huỷ bởi nhiệt, chúng bị hỏng ở 70oC và bởi các enzim như pepxin, tripxin... Như vậy

kháng thể IgG có 3 phần lớn I, II, III. Phần I và II rất giống nhau về khối lượng phân

tử và có trung tâm hoạt động của kháng thể (điểm kết hợp với kháng nguyên) mỗi

phần có một chuỗi nhẹ L và một nửa chuỗi nặng H, còn phần III gồm hai nửa chuỗi

nặng.

Cấu trúc sơ cấp của các vùng cố định của các chuỗi H và L cho phép phân biệt

các Ig thành các lớp và lớp phụ. Người ta biết có 5 loại chuỗi nặng: gamma, mu,

alpha, delta và epsilon. Đặc điểm của 5 lớp chủ yếu của Ig: IgG, IgM, IgA, IgD và

IgE.

VI. CÁC LOẠI MIỄN DỊCH

Cơ chế tác động của kháng nguyên, kháng thể

255

Cấu trúc phân tử của kháng thể (KT) giúp nó có thể kết hợp với 2 phân tử kháng nguyên (KN) khác nhau. Mặt khác, mỗi phân tử KN với các điểm xác định KN khác nhau của nó lại có thể kết hợp với rất nhiều phân tử KT. Khi các phân tử KT tự do cùng có mặt với KN tương ứng thì chúng tạo ra phản ứng kết tủa (precipitation). Khi các KN được đính trên bề mặt của tế bào (vi khuẩn, hồng cầu...), các phân tử KT tương ứng đính vào các thụ thể bề mặt này, thì thấy sự ngưng kết (agglutination) của các tế bào KN.

Như thế là các hình thức tác động của KT rất đa dạng, các hình thức này có thể là:

– Trung hoà độc tố do kết tủa.

– Ngưng kết các vi khuẩn hay các loại tế bào khác.

– Làm tan các vi khuẩn khi có mặt của bổ thể trong huyết thanh bình thường.

– Dẫn dụ và giao nộp các vi khuẩn cho quá trình thực bào của các đại thực bào và tế bào bạch cầu nhờ quá trình biến dụ (opsonization) của các kháng thể.

Hình IV.3. Hiệu quả kết tủa và ngưng kết của các kháng thể

1– Sự kết tủa của các phân tử kháng nguyên, ví dụ một độc tố vi khuẩn, nhờ các phân tử kháng thể.

2– Sự ngưng kết của hồng cầu mang kháng nguyên màng nhờ các phân tử kháng thể IgM (các pentame).

Miễn dịch và bệnh lí miễn dịch

a. Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch của loài)

Loại miễn dịch này do bản thân loài xác định, phụ thuộc vào các nhân tố tế bào có mặt ở trong máu và trong các mô khác nhau, chẳng hạn như các nhân tố protêin có mặt trong máu và trong dịch thể.

256

+ Các nhân tố tế bào bao gồm :

– Các tế bào lympho NK (Natural killer – Tế bào tiêu diệt tự nhiên): chúng nhận biết và tiêu diệt các tế bào gây bệnh.

– Các tế bào thực bào: chúng thực hiện nội thực bào đối với các tế bào đã chết.

+ Các nhân tố prôtêin có thể xếp vào bốn loại tham gia vào các tình huống khác nhau của quá trình nhiễm khuẩn :

– Các lyzozye, prôtêinaza làm tan thành vi khuẩn và thường có mặt trong các chất tiết ra ngoài cơ thể.

– Các interferon, loại prôtêin được sinh ra do tế bào bị nhiễm virut.

– Các prôtêin huyết tương khi bệnh cấp, hợp chất rất khó xác định nguồn gốc, hợp chất tăng lên hàng trăm lần khi nhiễm khuẩn, những hợp chất này cố định lên màng các vi khuẩn gây nhiễm.

– Hệ thống bổ thể gồm đến 17 loại prôtêin khác nhau có khả năng tương tác và kết hợp với các prôtêin của màng một số loài vi khuẩn. Các prôtêin bổ thể bao bọc và làm tan các vi khuẩn.

b. Miễn dịch thu được (riêng đối với từng cá thể)

Miễn dịch thu được chống lại tác nhân gây bệnh nhất định không chỉ là đặc hiệu đối với tác nhân gây bệnh này mà còn được kéo dài. Sự kích thích của KN đối với cơ thể cảm ứng tổng hợp các KT tương ứng diễn ra trong một thời kì có thể trong thời gian rất dài có bệnh truyền nhiễm, hệ thống miễn dịch bao gồm cả những tế bào ghi nhớ miễn dịch; chính những tế bào này là cơ sở của phòng bệnh miễn dịch.

Sự kết hợp của KN và KT có tính đặc hiệu cao, nó phụ thuộc vào sự tương tác của cấu trúc phân tử của KN và KT tương ứng, mối liên kết giữa KN và KT giống như kiểu liên kết giữa enzim và cơ chất, là những mối liên kết yếu, không đồng hoá trị, như mối liên kết hiđro, liên kết ion, liên kết Van der wal, liên kết kị nước.

Tất cả các động vật có xương sống là những cơ thể có khả năng tổng hợp một số lớn các kháng thể khác nhau, thường là hàng triệu kháng thể và là sự đáp ứng đối với các kích thích của kháng nguyên, kết quả của quá trình tiến hoá. Khả năng của cá thể có thể tổng hợp nhiều loại prôtêin kháng thể khác nhau đặc hiệu cho sự kích thích của kháng nguyên làm chúng ta rất ngạc nhiên, nhưng là hiện tượng có thể lí giải được nhờ kĩ thuật tái tổ hợp invitro của ADN. Các kháng thể được mã hoá bởi các gen thuộc về 4 loại V, J, D và C nằm trong hệ gen của động vật, các đoạn gen thuộc về một trong bốn loại có thể tổ hợp ngẫu nhiên và do đó có thể sinh ra hàng triệu gen khác nhau (S Tonegawa nhận giải thưởng Nobel về y học năm 1987). Người ta tính rằng, nhờ có quá trình tái tổ hợp di truyền khác nhau mà hệ thống miễn dịch có thể sản sinh được

257

1012 tế bào lympho, khoảng 1 tỉ các KT khác nhau.

Như vậy các hiện tượng miễn dịch thu được có thể tóm tắt vào sơ đồ sau:

Một số bệnh lí miễn dịch ở người như kháng tổng hợp insulin do KT gắn vào thụ thể tế bào tuyến tuỵ ngăn cản tổng hợp insulin, bệnh vô sinh do dịch hoàn sinh KT chống lại tinh trùng, các bệnh quá mẫn do truyền máu không phù hợp...

CÂU HỎI, BÀI TẬP CHƯƠNG 4

1. Vi sinh vật gây bệnh đặc trưng (BPS) và vi sinh vật gây bệnh cơ hội (BPO) là gì?

Vi khuẩn, vi sinh vật và vi trùng là thuật ngữ giống nhau?

2. Ngoại độc tố và nội độc tố, cho ví dụ bệnh và vi sinh vật gây bệnh.

3. Miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, cho ví dụ.

4. Miễn dịch tự nhiên và miễn dịch nhân tạo, cho ví dụ.

5. Kháng nguyên: đặc điểm, cho ví dụ. 6–Haften là gì?

258

Chủ động(Sau khi khỏi bệnh...)

KN vào cơ thể một cách tự nhiên và cơ thể tạo ra KT tương ứng và các tế bào lympho đặc trưng

Bị động(Do kháng thể

truyền qua nhau thai, sữa...) KT vào cơ thể từ nguồn cơ

thể khác

Chủ độngKN trong vacxin

được chủng vào cơ thể, cơ thể tạo ra

kháng thể và các tế bào

lympho đặc trưng

Bị độngCung cấp cho cơ thể các loại KT ở dạng huyết thanh miễn

dịch

Miễn dịch thu được tự nhiên Miễn dịch thu được nhân tạo

Miễn dịch

Miễn dịch bẩm sinh (miễn dịch loài)

Miễn dịch thu được

7. Kháng thể: cấu trúc phân tử?

8. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể.

9. Sự khác biệt giữa tế bào lympho B và T.

10. Bệnh tự miễn là gì, cho ví dụ?

11. Điền vào chỗ dấu chấm :

a– Bệnh viêm gan B là do một loại virut truyền chủ yếu qua đường......

b– Một hợp chất gọi là ....... khi nó làm chết toàn bộ tế bào, còn hợp chất gọi là....

khi nó chỉ tiêu diệt một số loại vi sinh vật nhất định.

c– Các kháng sinh penixillin và........ được đặc trưng bởi cấu trúc vòng

–lactam và chúng ức chế sự tổng hợp........ vi khuẩn.

d– KN của thành tế bào vi khuẩn Gram âm là............ còn ở đầu tiên mao là..........

12. Các câu sau đúng hay sai, giải thích?

a– Nước lã đun sôi 100o C là đủ để diệt tất cả các mầm vi sinh vật gây bệnh.

b– Nước javel (hipochlorit natri) sẽ mất tác dụng nếu lạm dụng thường xuyên.

c– Xà phòng là chất diệt khuẩn.

d– Vi sinh vật gây bệnh là vi sinh vật kí sinh.

13. Người ta tính rằng ở Việt Nam có đến 70% số tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)

mới phân lập từ bệnh phẩm có khả năng kháng lại penixilin gốc.

a– Sự nhờn thuốc này thường có nguồn gốc từ plasmid. Vậy plasmid là gì?

b– Sự có mặt của plasmid cho phép tụ cầu tổng hợp một loại phân tử mới, đó là chất

gì?

c– Để tránh sự nhờn thuốc người ta phải làm gì trong điều trị?

259

CHƯƠNG 5

ÔN TẬP VÀ KIỂM TRA

1. Ôn tập toàn học phần

2. Kiểm tra (cả lí thuyết và thực hành)

Sử dụng các câu hỏi và bài tập của các chương 1, 2, 3, 4.

260

PHẦN THỰC HÀNH CHUYÊN ĐỀ 3 (3 TIẾT)

BÀI 1: QUAN SÁT MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT

1. Thí nghiệm 1: Cách làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định nhuộm màu

Cách chuẩn bị một số loại vi sinh vật (VSV): vi khuẩn hiếu khí và kị khí, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn

1.1. Chuẩn bị dịch huyền phù VSV

– Nếu VSV nuôi trên môi trường đặc: Dùng que cấy vòng lấy một ít tế bào VSV, đưa vào thành trong của ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, vừa mài nhẹ vào thành ống nghiệm vừa chấm vào mặt nước để phân tán đều các tế bào vào nước tạo ra dịch huyền phù VSV.

– Nếu VSV nuôi trong môi trường dịch thể chỉ cần lắc đều dịch trong môi trường lỏng (có thể pha loãng bằng nước cất vô trùng).

a. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép

+ Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên cầu rửa trong chậu rửa.

+ Dùng pipet hoặc que cấy lấy lên phiến kính một giọt dịch huyền phù VSV.

+ Đậy lá kính nhẹ nhàng lên giọt dịch huyền phù VSV, tránh tạo bọt khí.

+ Thấm nhẹ lớp dịch trào ra xung quanh lá kính bằng giấy thấm.

+ Quan sát tiêu bản ở hệ kính khô (10; 20; 40; 60). Nếu cần soi ở hệ kính dầu thì nhỏ lên lá kính một giọt dầu seđre (hoặc dầu khoáng).

b. Phương pháp làm tiêu bản ép lam

Loại tiêu bản này thường được dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của xạ khuẩn hay nấm mốc. Có thể ép lam theo một số cách thông dụng sau.

Phương pháp Henrici hoặc Henrici cải tiến

261

1. Đổ môi trường và hộp petri vô trùng thành một lớp mỏng (2mm), để nguội.

2. Dùng khoan nút chai ( = 5–10mm) khoan môi trường thành các khối thạch nhỏ.

3. Dùng pinset hoặc que cấy lấy một khối thạch lên phiến kính. Cấy ria VSV xung quanh khối thạch.

4. Dùng pinset vô trùng úp một lá kính vô trùng lên khối thạch.

5. Đặt tiêu bản lên que thuỷ tinh bẻ cong trong hộp lồng vô trùng ẩm (Cách chuẩn bị hộp lồng vô trùng ẩm: Miếng giấy lọc được thấm nước và đặt ở đáy hộp, trên miếng giấy đặt một thanh thuỷ tinh bẻ cong, thanh trùng ở nồi áp suất ở 1210C trong 30 phút).

6. Gói hộp lồng vào túi nilon vô trùng, để vào tủ ấm ở nhiệt độ, thời gian thích hợp... Bào tử của nấm hoặc xạ khuẩn khi phát triển sẽ lan sang mép lá kính. Khi quan sát lấy tiêu bản ra khỏi hộp lồng đặt lên bàn kính và quan sát dưới hệ kính khô.

Hình dạng tự nhiên của nấm mốc hoặc xạ khuẩn cũng có thể quan sát trực tiếp

khi nuôi cấy trên lớp môi trường đặc mỏng và không màu ở hộp petri hay ống nghiệm,

hay dùng phương pháp xẻ rãnh khối thạch trong hộp petri.

c. Làm tiêu bản vi sinh vật nhuộm màu

262

Để quan sát hình thái của các tế bào vi sinh vật được rõ hơn, người ta thường

dùng các phương pháp nhuộm đơn hoặc nhuộm kép tế bào bằng thuốc nhuộm. Hầu hết

các thuốc nhuộm là các loại muối, trong đó có một ion mang màu.

+ Nếu ion mang màu là ion dương của muối thì gọi là thuốc nhuộm kiềm,

ngược lại ion màu là ion âm thì gọi là thuốc nhuộm axit. Các thuốc nhuộm kiềm

thường dùng là xanh metylen, tím gentian, tím kết tinh, safranin, fuchsin kiềm...

Chúng thường liên kết với các thành phần mang điện tích âm của tế bào. Xanh

metylen nhuộm tế bào tế bào chậm (mất khoảng 30 – 60 giây), tím kết tinh nhuộm

màu nhanh hơn (10 giây), còn fuchsin kiềm chỉ cần 5 giây. Trong môi trường trung

tính, điện tích của tế bào vi khuẩn thường âm cho nên nó bắt màu mạnh với các

thuốc nhuộm bazơ. Bởi vậy trong thực hành vi sinh thường sử dụng các thuốc

nhuộm bazơ.

+ Các thuốc nhuộm axit thường dùng là êozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin axit...

thường liên kết với các thành phần mang điện tích dương của tế bào.

Nhuộm đơn là nhuộm tế bào bằng một loại thuốc nhuộm. Toàn bộ tế bào bị bắt

màu đậm của thuốc nhuộm đó, bởi vậy cách nhuộm này thường dùng để quan sát hình

dạng tế bào vi sinh vật.

Nhuộm kép là nhuộm tế bào bằng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm. Phương

pháp nhuộm kép thường dùng trong nghiên cứu cấu tạo tế bào vi sinh vật.

Nhuộm màu tế bào sống: Thường nhuộm tế bào bằng các dung dịch thuốc

thuốc nhuộm loãng như xanh metylen hay fuchsin (1 : 1000), hoặc đỏ côngô 3%, hay

đỏ trung tính 0,001%.

Cách nhuộm: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm lên phiến kính đ dùng que cấy đưa vào đó một ít vi sinh vật đ trộn đều đ đậy lá kính đ giữ khoảng 1–2 phút đ quan sát.

+ Muốn nhuộm màu nấm sợi trước hết phải nhỏ 1–2 giọt lactophenol lên tiêu

bản để thấm ướt sợi nấm đ nhỏ tiếp 1–2 giọt thuốc nhuộm đ đậy lá kính, đ giữ 1–2

phút đ quan sát.

d. Làm tiêu bản cố định nhuộm màu

Thực chất đây là phương pháp nhuộm tế bào sau khi đã giết chết chúng. Ưu

điểm của phương pháp này là: VSV độc cố định tại vùng nhất định trên phiến kính ít

bị rửa trôi khi rửa hoặc tẩy màu, hơn nữa tế bào đã chết bắt màu nhanh và rõ, thuận

tiện khi soi ở hệ kính dầu và có thể giữ được thời gian lâu hơn tiêu bản nhuộm sống.

263

Quy trình nhuộm gồm các bước sau:

1. Lấy 1 giọt nước sạch (50 –100l) đặt lên phiến kính.

2. Chuẩn bị giọt huyền phù VSV trên phiến kính như đã hướng dẫn ở trên.

3. Dùng que cấy hoặc lá kính dàn mỏng giọt dịch huyền phù thành một vùng nhất định trên phiến kính.

4. Hong khô vết bôi trong không khí.

5. Cố định vết bôi: Thường cố định bằng

cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn: đưa vết

bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2–3 lần

(Hoặc bằng một số các dung dịch hoá

chất như trong phần phụ lục).

Tránh hơ quá nóng dễ làm biến dạng hình

thái và cấu trúc của tế bào VSV.

6. Dùng pipet nhỏ lên vết bôi một vài

giọt thuốc nhuộm, giữ trong khoảng 1–

2 phút.

264

7. Dùng bình rửa có vòi hoặc pipet dội nước từ một đầu phiến kính cho trôi qua tiêu bản đến khi nước rửa không còn màu thuốc nhuộm.

8. Thấm khô tiêu bản.

9. Nhỏ 1 giọt dầu seđre lên tiêu bản, soi kính dầu.

2. Thí nghiệm 2: Quan sát vi khuẩn trong khoang miệng, quan sát nấm men rượu hoặc nấm váng dưa cà để quá chua, nấm mốc đen ở vỏ cam quýt, cơm, bánh mì để mốc.

a. Quan sát hình dạng các loại vi sinh vật trong cao răn.

Khu hệ vi khuẩn trong cao răng rất đa dạng và phong phú, dễ dàng quan sát bằng nhuộm tiêu bản cố định.

Cách làm: Lấy một giọt nước cho lên phiến kính, dùng tăm vô trùng lấy một ít cao răng hoà vào giọt nước, sau đó tiến hành làm tiêu bản theo phương pháp nhuộm tiêu bản cố định. Quan sát ở hệ kính dầu (có thể tham khảo hình ở phần đầu).

b. Quan sát hình thái nấm men Saccharomyces:

Hình thái tế bào và kiểu sinh sản nảy chồi của nấm men rất dễ quan sát bằng tất cả các phương pháp trên, nhất là phương pháp nhuộm tiêu bản cố định.

265

Nấm men nhuộm và không nhuộm màuSaccharomyces

c. Quan sát hình thái nấm mốc

Nên dùng phương pháp ép lam hoặc khối thạch để quan sát hệ sợi dinh dưỡng

và cơ quan sinh bào tử vô tính của cácVSV này.

Yêu cầu thấy rõ hệ sợi của chúng (sự phân nhánh, sợi có vách ngăn hay không

có vách, nguyên sinh chất có chuyển động hay không), cuống sinh bào tử (tế bào gốc

nơi xuất phát cuống, hình dạng, kích thước cuống sinh bào tử, có vách ngăn hay không

có, có màu sắc hay trong suốt...), hình dạng của tế bào sinh bào tử (hình dạng, xuất

phát trực tiếp từ cuống sinh bào tử hay từ bọng đỉnh giá, hình dạng của bọng đỉnh giá,

tế bào sinh bào tử mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá, hay qua một lớp cuống (melatue),

hình dạng bào tử, bề mặt bào tử…).

Để quan sát rõ hơn hình thái cuống sinh bào tử của Aspergillus và Penicillium

có thể làm như sau:

+ Lấy lá kính đã chuẩn bị bằng phương pháp ép lam (hoặc dùng que cấy vòng lấy một khóm nấm mốc có đủ hệ sợi cơ chất, hệ sợi khí sinh và cơ quan sinh bào tử đính lên phiến kính).

+ Nhỏ một vài giọt lactophenol lên nấm mốc đ dùng que cấy đập nhẹ, kĩ cho bào tử của nấm mốc tách ra khỏi cuống sinh bào tử của chúng đ Đậy lá kính đ soi ở hệ kính khô (40).

Hình dạng cơ quan sinh bào tử trần ở nấm mốc

– Cũng có thể quan sát các VSV gây bệnh trên thực vật hoặc quan sát hình dạng

266

Cấu tạo quan sinh bào tử trần

ở Penicillium ( 400)

Cấu tạo quan sinh bào tử trần

ở Aspegillus ( 400)

các tế bào nguyên sinh động vật trong nước cỏ khô bằng một trong các phương pháp trên.

BÀI 2: SỰ CHUYỂN HOÁ CÁC CHẤT Ở VI SINH VẬT

1. Thí nghiệm 1: Phân giải prôtêin, phân giải xenlulozơ

a. Phân giải prôtêin

Bản chất của quá trình amôn hoá là sự tạo thành NH3 từ các hợp chất nitơ hữu cơ (prôtêin, urê, axit nucleic..) dưới tác động của VSV.

Quá trình amôn hoá prôtêin:

Các vi sinh vật: phân giải mạnh prôtêin là các loại vi khuẩn: Bacillus (B. mycoides, B, mésentericus, B. subtilis..), Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris, E. coli, Clotridium putrificum, C. sporogenes. Các loại nấm mốc (Asperigillus, Trichoderma, Cladosporium, Alternaria...), xạ khuẩn...

Quá trình phân giải prôtêin của VSV được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống và lên men công nghiệp sản xuất mắm tôm, mắm cá, nước chấm, nước mắm... Trong thiên nhiên, đây là quá trình phân giải các chất nitơ hữu cơ thành các hợp chất nitơ vô cơ dinh dưỡng cho thực vật.

Đặt thí nghiệm:

Vật liệu, hoá chất: Thịt hoặc tôm, cá; bình tam giác 100ml; giấy quỳ hồng; dung dịch 10% chì axetat; dung dịch Nesler; dung dịch 5% KNO2.

Tiến hành thí nghiệm:

+ Lấy 3 – 5g thịt hoặc cá (cắt nhỏ) vào bình tam giác, thêm khoảng 1g đất trồng, khoảng 50ml nước.

+ Để trên miệng bình các giấy chỉ thị sau để xác định một số sản phẩm phân huỷ:

– Một dải giấy quỳ hồng để xác định sự có mặt của NH3.

267

Phân giải kị khí Phân giải hiếu khí

Phân giải (thu năng lượng)

Xây dựng tế bào

Prôtêin Polipeptit Đipeptit Axit amin

– Một dải giấy lọc tẩm dung dịch 10% chì axetat để xác định sự có mặt của H2S (các axit amin có chứa S (xistein, xistin…) khi bị VSV phân giải sẽ tạo ra H2S).

+ Đậy nút bông để ở nhiệt độ từ 28 – 35oC.

Sau 1 ngày quá trình phân huỷ prôtêin đã xảy ra tạo ra mùi hôi thối đặc trưng. Sau 5 – 7 ngày, các miếng thịt đã có thể nát vụn, môi trường lên men đổi màu.

Kiểm tra kết quả:

Xác định các sản phẩm lên men

+ Xác định sự có mặt của NH3: Nếu giấy quỳ hồng biến thành màu xanh chứng tỏ có NH3 bay ra.

+ Xác định sự có mặt của N trong dịch lên men: nhỏ một giọt dịch phân huỷ

lên bản sứ, thêm một giọt dung dịch Nesler. Nếu có mặt N dung dịch Nesler

chuyển từ màu vàng trong sang vàng sẫm.

+ Xác định sự có mặt của H2S: Quan sát màu của miếng giấy lọc tẩm axetat chì, nếu có H2S được giải phóng từ dịch lên men giấy sẽ hoá đen do tạo thành sunfua chì:

H2S + Pb(CH3COO)2 đ PbS + 2CH3COOH.

Quan sát VSV: Lấy một giọt dịch phân huỷ làm tiêu bản nhuộm màu cố định để quan sát các vi sinh vật.

268

Một số vi khuẩn phân giải prôtêin

b. Phân giải xenlulozơ

Sự phân giải các chất xenlulozơ kị khí

Bản chất : Các VSV phân giải xenlulozơ giống Clostridium trong đất hoặc trong phân chuồng, phân xanh (C.thermocellum, C.thermocelluloseum, C.cellulosaeomeliansskii...) hoặc các vi sinh vật sống trong dạ cỏ trâu bò (Ruminococcus và Bacteroides) phân huỷ xenlulozơ thành axit butyric, axit axetic, CO2 (hoặc CH4) và H2O như phương trình sau:

Đặt thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường phân giải kị khí: 300ml nước thịt – pepton; 700ml nước; 1g (NH4)2HPO4; 1g K2HPO4; 0,5g MgSO4; 0,5 NaCl; 2,0g CaCO3; 2 giọt dung dịch 0,1% FeSO4. Không cần thanh trùng.

Đổ môi trường đến 2/3 ống nghiệm, thêm 0,5 – 1g đất vườn, nhúng chìm vài dải giấy lọc trong môi trường. Đun sôi môi trường 5 – 10 phút, nút kín tạo điều kiện kị khí và để vào tủ ấm ở 30 – 350C trong 2 – 3 tuần. Nếu có sự phân huỷ xenlulozơ, giấy lọc sẽ hoá màu vàng, dần dần nát vụn và tan thành dịch lỏng.

Kiểm tra kết quả

+ Quan sát Clostridium : Làm vết bôi từ dịch phân huỷ cố định tiêu bản nhuộm đơn hoặc nhuộm bào tử quan sát ở hệ kính dầu.

Phân giải xenlulozơ hiếu khí

Bản chất: Khi có O2, xenlulozơ bị VSV phân huỷ thành CO2 và H2O

(C6H10O5)n + nH2O C6H10O5 R–CHCOOH CO2 + H2O + Q

VSV phân giải xenlulozơ hiếu khí nấm mốc (Apergillus, Penicillium, Cladosporium, Botrytis, Fusarium, Trichoderma...), vi khuẩn (Bacillus, Cellvibrio, Cellfalicula, Cytophaga), xạ khuẩn (Streptomyces).

Đặt thí nghiệm

– Chuẩn bị môi trường Getchinson: 1g KH2PO4; 0,1g CaCl2; 0,3g MgSO4; 0,1g NaCl; 0,01g FeCl3; 6H2O; 2,5g NaNO3; 1000ml nước; pH = 7,0 – 7,3. Không cần

269

thanh trùng.

– Đổ một ít môi trường Getchinson vào bình nón dung tích 150ml (dày khoảng 2cm), thêm 0,5g đất trồng và một mẩu phấn nhỏ (bằng hạt đậu xanh). Gấp một miếng giấy lọc thành hình nón hoặc hình gấp nếp đặt vào môi trường trong bình tam giác, sao cho một phần giấy lọc chìm trong môi trường, phần còn lại nằm trong không khí. Đậy nút bông lên miệng bình và để ở 20 – 250C trong 10 – 15 ngày. Sự phân huỷ giấy lọc sẽ xảy ra mạnh ở vùng tiếp xúc giữa không khí và môi trường. Có thể nhìn thấy các khuẩn lạc vi sinh vật mọc tại vùng này.

Kiểm tra kết quả

– Quan sát sự phân huỷ của giấy lọc tại vùng có các khuẩn lạc vi sinh vật

– Làm tiêu bản vi sinh vật từ các khuẩn lạc mọc trên vùng giấy lọc và quan sát.

2. Thí nghiệm 2: Lên men rượu etanol

Bản chất: Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí VSV chuyển hiđro từ NADH sang axetanđehit tạo thành rượu etylic để tái tạo NAD. Sản phẩm tạo thành rượu etylic và CO2.

C6H12O6 CH3COCOOH CH3CHO C2H5OH + CO2 + 113,4kJ

VSV lên men: Quá trình lên men rượu chủ yếu là do các nấm men chi Saccharomyces (S.cerevisiae, S.elipsoideus.) hay Schizosaccharomyces (Schiz. pombe…) thực hiện. Ngoài ra, một số loài nấm mốc Mucor (M. rouxi) hay vi khuẩn Sarcina ventriculi cũng có khả năng lên men etylic.

Tiến hành thí nghiệm xác định khả năng lên lên men rượu:

* Vật liệu

+ Chuẩn bị dịch lên men: Để quá trình lên men xảy ra tốt nhất, dùng dịch lên men có thành phần: 15% nước đường, 0,5% pepton, 0,3% KH2PO4 và 0,1% MgSO4. Cũng có thể dùng dung dịch 10% đường hoặc dung dịch 10% đường bổ sung 1% (NH4)2SO4. Đun sôi để nguội.

+ Nấm men: dùng 10% dịch nuôi cấy nấm men S. cerevisiae thuần, hoặc bánh men thuốc bắc tán nhỏ.

+ Dụng cụ: Bình lên men Smith cải tiến; nếu không có có thể dùng chai bia có nút kín.

* Hoá chất: dung dịch 10% Ba(OH)2; dung dịch 20% NaOH; iot tinh thể ở dạng bột; H2SO4 đậm đặc; dung dịch kali đicromat (K2Cr2O7).

* Tiến hành lên men như sau:

270

Cách 1: Lên men trong bình Smith cải tiến

+ Cho dịch lên men vào bình lên men được đậy bằng nút cao su nối với ống thuỷ tinh uốn cong, một đầu được nhúng chìm vào ống nghiệm chứa đầy nước úp ngược trong một lọ đầy nước ống nghiệm có thể chia độ sẵn.

+ Đặt các bình thí nghiệm vào 30 – 35oC, sau vài giờ lên men CO2 thải ra sẽ đẩy cột nuớc trong ống nghiệm tụt xuống.

Cách 2. Cho dịch lên men vào chai bia, dập nút kín lại, để 24 – 36 giờ, khi mở nút chai thấy bọt khí CO2 nổi mạnh lên.

Phân tích kết quả thí nghiệm:

Xác định cường độ lên men rượu: Cường độ lên men rượu có thể xác định dựa vào luợng CO2 thoát ra hoặc hàm lượng etanol được tạo thành từ một thể tích môi trường xác định trong một thời gian nhất định. Thông thường người ta dùng phương pháp xác định theo hàm lượng CO2 vì nó dễ dàng xác định hơn hàm luợng rượu etylic.

Thí nghiệm lên men rượu

1. Lên men trong bình tự lắp 2. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Định tính CO2:

– Phản ứng với Ba(OH)2: Cho 5ml dung dịch lên men vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch 10% Ba(OH)2. Dùng kẹp gỗ kẹp ống nghiệm rồi đun sôi nhẹ trên ngọn đèn cồn. Để lắng. Nếu có mặt của CO2 sẽ tạo thành kết tủa màu trắng do sự tạo thành BaCO3 theo phản ứng:

271

CO2 + Ba(OH)2 BaCO3 + H2O

– Nếu đặt thí nghiệm trong bình Smith (cách 2): đánh giá mức độ thải CO2 bằng mức tụt của cột nước trong ống nghiệm.

+ Định tính rượu etylic bằng phản ứng tạo màu với dung dịch kali đicromat (K2Cr2O7):

Lấy vào ống nghiệm 1 – 2ml dung dịch đã lên men,1 – 2ml H2SO4 đậm đặc rồi thêm từng giọt dung dịch 1% K2Cr2O7, lắc đều. Nếu trong dung dịch phản ứng có mặt rươu etylic sẽ xuất hiện màu xanh lam, do phản ứng của rượu etylic với K 2Cr2O7 theo phương trình:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + CH3CH2OH KCr(SO4)2 + CH3COOH + 11H2O

Ống đối chứng: Làm tương tự như trên song thay 1 – 2ml dịch lên men bằng 1 – 2ml dịch chưa lên men. So sánh sự thay đổi màu ở hai ống thí nghiệm và đối chứng.

+ Phát hiện etylic bằng phương pháp chưng cất: Thay ống thuỷ tinh bẻ cong của bình lên men Smith bằng ống thuỷ tinh thẳng đứng rồi đun trên ngọn đèn cồn cho sôi lăn tăn. Rượu etylic sẽ bốc hơi thoát ra ngoài. Dùng diêm châm lửa lên đầu ống thuỷ tinh, nếu có rượu etylic bay ra sẽ cháy thành ngọn lửa xanh.

Xác định sự có mặt của nấm men:

Dùng que cấy lấy một vòng dịch lên men làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn tế bào. Tế bào Saccharomyces có hình cầu hay ovan, nảy chồi.

3. Thí nghiệm 3: Lên men lactic, làm sữa chua, muối dưa cà

Bản chất: Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí, VSV lactic chuyển hiđro từ NADH sang axit pyruvic để tái tạo NAD+, sản phẩm tạo thành axit lactic.

C6H12O6 CH3COCOOH CH3–CHOH–COOH + Q

Căn cứ vào sản phẩm sinh ra, quá trình lên men lactic được chia thành hai kiểu:

– Lên men lactic đồng hình:

+ Bản chất: Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hoá đường tạo thành sản phẩm chủ yếu là axit lactic (95%).

+ VSV lên men: là giống Streptococcus (S. cremoris, S. lactis, S.thermophillus) và Lactobacillus (L. bulgaricus, L. acidophillus, L. cucumerris, L. plantarum...).

– Lên men lactic dị hình:

+ Bản chất: Khi lên men các vi khuẩn chỉ tạo ra 60% axit lactic, phần còn lại là axit axetic, rượu etylic, glyxerin và một vài sản phẩm khác.

272

NADH NAD+

+ VSV lên men: L. brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, E. coli...

Đặt thí nghiệm lên men lactic:

a. Lên men rau quả:

+ Rau cải (hay bắp cải, su hào, cà,...) rửa sạch, phơi trong chỗ râm để loại bớt nước.

+ Đổ dung dịch nước 6% muối vào vại (sành sứ hoặc thuỷ tinh), có thể bổ sung 5% đường làm nguồn cacbon dễ hấp thụ lúc đầu cho các vi khuẩn lactic.

+ Cho rau vào vại, nén rau chìm hẳn trong dung dịch trên. Để ở chỗ ấm hoặc tủ ấm 30 – 350C trong 2 – 3 ngày. Vi sinh vật có mặt trên rau, củ sẽ lên men đường chiết rút từ tế bào, làm chua rau quả. Vì vậy nếu quá trình lên men lactic xảy ra tốt, dưa không bị nát, có màu vàng, thơm đặc trưng của dưa muối.

b. Lên men sữa thành sữa chua:

Sữa tươi là cơ chất thích hợp nhất cho lên men lactic, vì trong sữa tươi đã có từ 10 – 200T axit lactic (10T = 0,009g axit lactic), tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn lactic phát triển và lên men. Khi lên men sữa tươi có thể thêm 1% đường.

+ Rót sữa tươi vào cốc đong đun sôi nhẹ để thanh trùng (85 – 870C trong 5 – 10 phút hoặc 90 – 920C 2 –3 phút).

+ Bổ sung tỉ lệ 10% giống vi sinh vật thuần chủng (S. cremoris, S. lactis, S. diacetylacetíc, L. acidophyllus... đã nhân giống ở môi trường sữa.), hoặc sữa chua thành phẩm loại tốt khuấy đều đậy bằng nilon sạch buộc kĩ để ở nhiệt độ từ 30 – 350C khoảng 5 – 7 giờ, sữa bắt đầu đông tụ.

+ Giữ ở 5 – 100C trong 10 – 12 giờ cho prôtêin trong sữa dãn nở, giảm độ ẩm tự do làm sản phẩm trở nên mịn.

+ Nếu làm bằng sữa hộp thì không cần phải cho đường, chỉ pha sữa vừa uống để nguội 400C, cho một thìa sữa chua thành phẩm Vinamilk khuấy đều rồi đổ ra cốc.

Phân tích kết quả thí nghiệm:

Định tính sự có mặt của axit lactic:

+ Phản ứng tạo axetanđehit: Cho 10ml dịch lên men dưa chua vào cốc đong dung tích 50ml, thêm vào đó 1ml dung dịch 10% axit H2SO4, 2ml dung dịch 5% KMnO4. Tẩm dung dịch AgNO3 trong NH4NO3 vào một miếng giấy lọc, đậy lên miệng cốc và đun sôi trên ngọn đèn cồn. Quan sát sự chuyển màu của giấy lọc. Nếu có mặt của axit lactic, phản ứng sẽ xảy ra và tạo thành axetanđehit. Axetanđehit tác dụng với hỗn hợp AgNO3 trong NH4NO3 tạo ra chất làm đen giấy lọc. Phương trình phản ứng:

2KMnO4 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 3H2O + 5O (1)

5CH3CHOHCOOH + 5O2 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O (2)

273

Quan sát VSV: Làm vết bôi từ dịch nước dưa chua hay sữa chua cố định trên ngọn đèn cồn nhuộm đơn quan sát ở vật kính dầu.

Hình dạng của một số vi khuẩn lactic trong sữa chua

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHUYÊN ĐỀ 3

1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 1997.

2. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, tập 1 – 1999, tập 2 – 2001. Tái bản có bổ sung, sửa chữa 2005.

3. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào, Thực hành vi sinh học, NXB Giáo dục, 1990.

4. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng, Vi sinh học, tái bản lần thứ nhất, NXB Giáo dục, Hà Nội, 2001.

5. Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A., Microbiology, fifth edition, W.C.Brown communication, Inc. USA. 2003.

274

Cầu khuẩn lactic Trực khuẩn lactic

Chịu trách nhiệm xuất bản:Giám đốc ĐINH NGỌC BẢOTổng biên tập LÊ A

Biên tập nội dung:PHẠM NGỌC BẮC

Kĩ thuật vi tính:ĐÀO PHƯƠNG DUYẾN

Thiết kế bìa:

TÀI LIỆU BỒI DƯỠNG THƯỜNG XUYÊN

CHO GIÁO VIÊN THPT CHU KÌ III – MÔN SINH HỌC

In cuốn……., khổ 17 24cm, tại

Đăng kí kế hoạch xuất bản số: 89-2005/CXB/99 – 41/ĐHSP, kí ngày 3/11/05

In xong và nộp lưu chiểu tháng 3 năm 2005.

275