Les tests phénotypiques pour la détection des bêta-lactamases

dans le laboratoire de microbiologie clinique: rôle de

l'acide boronique

Dr. Ziad DaoudAssociate Professor

Faculty of Medicine & Medical SciencesUniversity of Balamand

BLSE- AmpC

La diffusion rapide au niveau mondial des Enterobacteriaceae produisant les bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) et les bêta-lactamases AmpC plasmidique (PABLs) représente une menace clinique importante

Les AmpC

Origine de AmpC

• Les BL-AmpC sont devenues bien connues en 1970s

• Ces enzymes sont des cephalosporinases capables d’hydrolyzer presque toutes les b-lactamines

• Les BL-AmpC peuvent etre d’origine nucleoidique (inductibles) ou plasmidique

AmpC nucleoidique

• Les enzymes AmpC nucleoidiques sont secrétées par toutes les Entérobactéries (bas niveau)

• Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Hafnia alvei et Serratia marcescens produisent ces enzymes d’une façon plus abondante

• Typiquement, les AmpC nucl. sont induites par les beta-lactamines telles que cefoxitine et imipenem mais très faiblement par les CG3-CG4

AmpC plasmidique

• En1980s, ces gènes nucleoidiques ont été trouvés sur des plasmides (la plus part sans aucune capacité d’induction) et pouvaient être transmis même a des bactéries telles que Klebsiella spp., Escherichia coli, Salmonella spp.

Detection de AmpC

• La détection des beta-lactamases AmpC chez les BGN est problématique vu que:• Les test phénotypiques disponibles ne sont pas assez

précis dans ce cas

• Bien que la résistance a la cefoxitine soit utilisée comme un “screening test”, la fiabilité de ce test est discutable

• L’absence de recommandations claires pour cette détection

• La lecture peut être compliquée par la production simultanée de BLSE

Les KPC

BL-KPC

• Les enzymes Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) ont gagné une importance primordiale vue leur prévalence parmi les K. pneumoniae et les autres espèces d’ Enterobacteriaceae

• Epidémies dans plusieurs pays et continents

• Vues les options thérapeutiques limitées, la bonne détection de ces enzymes s’avère primordiale pour un meilleur control d’infection

Le MHT

• Les recommandations pour la détection phénotypique de KPC se basent sur l’observation d’une sensibilité diminuée au carbapenems

• Une confirmation avec le “Modified Hodge Test (MHT) sera demandée a la suite

• Le MHT est un test fiable avec un sensibilité qui ne dépasse pas les 75%, cependant, il s’agit d’un test

• souvent difficile a interpréter

• pas spécifique de KPC et

• pouvant donner des faux positifs avec beaucoup d’autres enzymes surtout la BLSE-CTX et les AmpC

• La PCR devient la seule technique de différentiation

L’Acide Boronique comme detecteur de Beta-Lactamases

Acide Boronique

• Les composés de l’acide boronique sont les seuls inhibiteurs de BL (serines) dirigés vers les sites actifs et non basés sur les structures beta-lactames.

• L’activité inhibitrice de ces molécules a été étudiée contre une variété de beta-lactamases

• Des études cinétiques ont montré que des composés différents de l’acide boronoque inhibent les BL-class C (AmpC), plusieurs BL-class A ainsi que quelques BLSE type CTX-M

L’ étude

• On a utilisé différents composés de l’acide boronique• 3′-aminophenylboronic acid –APBA en combinaison de

cefoxitin pour la détection des AmpC plasmidiques

• Phenyl boronic acid-PBA pour la détection de KPC

• En parallèle, L’acide clavulanique a été utilise pour la différenciation dans les souches qui co-produisent AmpC et BLSE

Population bactérienne

• 29 souches épidemiologiquement indépendantes de K. pneumoniae et E. coli ont été étudiées:• 5 produisant des BL-KPC (2 souches libanaises et 3 souches

égyptiennes)

• 3 souches résistantes a l’ertapenem sans production de KPC

• 15 souches produisant des BLSE

• 6 souches produisant des BL-AmpC plasm.

Techniques Moleculaires

• La détection génotypique des gènes de résistance a été faite par PCR• KPC (primers KPC-1-F (5-GGC TTG CCGCTC GGT GAT

ATT-3) and KPC-1-R (5-TAT CTG TGAGGG CGA AGG TTA-3)

• Les souches productrices de BLSE et BL-AmpC nucl. provenaient de patients libanais sujets d’une étude précédente

BA & detection of BL

Use of Boronic Acid compunds for the detection of AmpC and KPC in E.coli and K.pneumoniae

Zone Diameters (mm)

ETP ETP+BA IPM IPM+BA CXT CXT+BA CZT CZT+CA MHT

KPC+(4KP, 1EC) 6-12 (8)

13-25 (17)

12-24 (17)

19-29 (22)

6-9 (5) 6-9 (3) 6-12 (12)

6-17 (15) All +

ETPR,KPC-(2KP, 1EC)

8-13 (10)

11-14 (12)

20-26 (24)

20-26 (24)

6-7 (2) 6-9 (4) 7-10 (13)

6-13 (13) All -

ESBL+(9KP, 6EC) 21-33 (26)

21-34 (28)

26-33 (29)

26-32 (12)

14-25 (16)

15-26 (19) 6-17 (23)

13-24 (20)

6+9 -

AmpC +(2KP, 4EC) 20-26 (19)

26-32 (29)

26-28 (27)

27-28 (16)

6-8 (2) 14- 26 (5) 6-13 (12)

7-19 (21) 1 +5 -

Detection de AmpC

• Cefoxitin avec et sans le APBA

AmpC vs ESBL

CFX + BA CFX + BA

KPC detection

IMP + BAIMP

Conclusions

• Les tests phénotypiques sont très importants et ne peuvent pas être remplacés par des tests moléculaires dans la pratique microbiologiques

• Ces tests ne sont pas toujours accompagnes d’une spécificité élevée, cependant, vu le prix et l’efficacité de ces tests, il faut toujours essayer de les améliorer

• L’acide boronique semble etre un test promettant pour la détection des Amp C-plasm et des KPC

• Plus des donnees libanaise sont necessaires