BİYOMÜHENDİSLİK LABORATUVARI 2

MİKROORGANİZMALARIN BİYOREAKTÖR KULLANILARAK ÜRETİLMESİ

Deneyin Amacı Teorik Bilgi Deneysel Yöntem

◦ Deney Düzeneğinin Şematik Gösterimi ve Yapılışı◦ Deney Koşulları ve Güvenlik Kaygısı

Deney Verilerinin Saptanması ve Analizi Grafik ve Çizimler Deney Sonuçları ve Yorum

SUNUM İÇERİĞİ

DENEYİN AMACI:

Kapalı sistemde çalışan 5 L hacimli bir biyoreaktörde Saccharomyces cerevisiae üretmek ve gelişim sürecinde örnekler alarak büyüme eğrisi oluşturmaktır.

Saccharomyces cerevisiae biracılıkta bir üst fermantasyon mayası olarak tanımlanır. Üst Saccharomyces cerevisiae, kalın bağırsak iltihabına (kolit) neden olan Clostridium difficile bakterisinin biyolojik kontrolunda bir probiyotik katkı olarak kullanılır. Çok hasta insanlarda bu uygulamanın sistemik maya iltihabına yol açabileceği gözlemlenmiştir.

Beta-glukan "Saccharomyces cerevisiae" adlı maya mantarının hücre duvarından ekstrakte edilen, polisakkarit lif yapısında, enfeksiyöz hastalıklara ve kansere karşı immun sistemi stimule ederek güçlendiren organik bir biyolojik yanıt düzenleyicidir.

TEORİK BİLGİ

Saccharomyces cerevisiae hücre duvarının yapısı

FERMENTASYON: Mayalanma ya da fermantasyon, bir

maddenin bakteriler, mantarlar ve diğer mikroorganizmalar aracılığıyla, genellikle ısı vererek ve köpürerek kimyasal olarak çürümesi olayıdır.

2 tür fermentasyon çeşidi vardır:

1. Glikozun Fermantasyonu  a-Alkol fermantasyonu

b-Laktik asit fermantasyonu c-Karışık asit fermantasyonu

d-Butirik asit fermantasyonu e-Solvent fermantasyonu f-Bütandiol fermantasyonu g-Propionik asit fermantasyonu

2. Amino asit fermantasyonu (Stickland Fermantasyonu)

Mikroorganizmalar bitkiler ve hayvanlara göre çok hızlı şekilde ve 2 'ye bölünerek çoğalır.

Genel olarak küfler bakteri ve mayalara göre daha geç çoğalırlar.

mantarlar sporlanma (sporulasyon) ile eşeysiz (aseksüel) ve eşeyli (seksüel) olarak üreme yeteneğine sahiptirler.

Mayalar üreme yönünden başlıca iki gruba ayrılırlar (aseksüel ve seksüel üreme).

Virüsler ise bir canlı grubuna rastlamasıyla kendini çoğaltmaya başlar. Bir virüsün canlı bir hücre olmaksızın kendini çoğaltması ise mümkün değildir. Yani virüs ancak ve ancak canlı bir hücre vasıtasıyla kendini çoğaltabilir.

Biyoreaktörler, aktif bir biyoçevre yaratan sistem ya da cihazların genel adıdır.Temel olarak küçük hacimli ve büyük hacimli olarak 2 gruba ayrılırlar.

Genel olarak küçük hacimli reaktörler hacim olarak 3 tona kadar ulaşabilmektedirler

Biyoreaktörler operasyon tipine göre;

1-Kesikli prosesler: Kesikli proseslerde reaktöre giren ya da çıkan bir besiyeri söz konusu değildir.Substratın tamamı reaktöre başlangıçta konur.

2-Yarı kesikli prosesler: Reaktöre sürekli olarak besiyeri eklenir ancak ortamdan uzaklaştırılmaz.Yani reaktörde sıvı miktarı sürekli artar.

3-Sürekli prosesler:Reaktör sürekli beslenir ve genellikle aynı hızda da ortamdan uzaklaştırılır.

BİYOREAKTÖRÜ OLUŞTURAN ANA ELEMANLAR !!

1)Reaktör kabı; 2)ceket; 3)izolasyon sağlayıcı;4)örtü;5)mikroorganizma girişi; 6)pH için giriş noktası;7)karıştırıcı ve paletler ;8)gaz püskürtücü;9)mekanik conta; 10)indirgeyici dişli kutusu; 11)motor; 12)ürün çıkış ağzı;13)ceket bağlantıları;14)buhar bağlantılı örnek

kapakçığı;

15)görüş camı;16)asit,alkali ve köpük

kırıcı kimyasal bağlantısı;

17)hava girişi;18)çıkarılabilir baş;19)besiyeri ya da

besleyici girişi; 20)hava çıkışı 21)aygıt girişi(çeşitli);22)köpük kırıcı; 23)ışıklı görüş camı ve

buhar bağlantısı;24)bağlantı koparıcı disk

nozül bölümlerinden oluşur

DENEY DÜZENEĞİNİN ŞEMATİK GÖSTERİMİ

DENEYİN YAPILIŞI

Saccharomyces cerevisiae’nin saf kültürü katı besiyerine yayma yöntemiyle ekilip,48 saat 30ºC’de inkübe edilmiştir.

Katı besiyerinden (yeast pepton dekstroz agar) tek koloni ekimi ile 10 mL’lik sıvı besiyerinden tek koloni ekimi ile 10mL’lik sıvı besiyerine geçilir(mini prep).48 saat 30ºC’lik çalkalayıcı inkübatörde bırakılır.

Ölçek büyütme işleminde kullanılan sıvı besiyeri(agar hariç yeast pepton dekstros) hacmi büyük ölçeklinin %10 kadarı olmalıdır.Yani 1Lt için %10 besiyer kullanılır.

Süre sonunda 10mL’lik kültür 100 ml lik steril besiyerine aktarılır ve 48 saat 30ºC’lik çalkalayıcı inkübatörede bırakılır.

Süre sonunda 100 mL’lik besiyerinin tamamı büyük ölçekli besiyerine(biyoreaktöre)aktarılır.

Biyoreaktöre ekim yapıldığında(t=0) örnek alınmaya başlanır ve büyümenin gerçekleşeceği 48 saat içinde belirli aralıklarla örnek alımına devam edilir.Ancak zaman süresinin uzunluğundan dolayı biz 330 dk boyunca ölçüm aktarılır.

Spektrofotometrede ölçüm alınır.Blank olarak steril besiyeri kullanıldık.Blank cihaza yerleştirilir.Auto zero yapıldıktan sonra örnek küvete ekledik ve 600 nm.de absorbansı ölçtük.

30 dk ararlıklarla örnekler alınıp absorbansları ölçüldü örnekler alındığında O2 girişini kapattık, bulanıklığın oluşumundan mayaların üremesi gözlemlendi ve değerlerin artışı yeterince azalıncaya kadar bu işleme devam edildi.

Deney Koşulları: Deney normal laboratuvar koşullarında gerçekleştirilecektir

Güvenlik KaygısıSaccharomyces cerevisiae biracılıkta bir üstfermantasyon mayası olarak tanımlanır. ÜstSaccharomyces cerevisiae, kalın bağırsak iltihabına(kolit) neden olan Clostridium difficile bakterisininbiyolojik kontrolunda bir probiyotik katkı olarakkullanılır. Çok hasta insanlarda bu uygulamanın sistemikmaya iltihabına yol açabileceği gözlemlenmiştir. İnsansağlığı üzerinde ciddi etkileri çok olmayan bir maya olsada el temizliğine ve eldiven kullanmadanmikroorganizmayla direkt temastan kaçınmaya özengösterilmelidir.Biyoreaktörden numune alınırken dikkatliolunmalı,numunenin alındığı ince hortum serbestbırakılmamalı böylece tazyikten dolayı madde çıkışınıengelleyebiliriz.

DENEY VERİLERİNİN SAPTANMASI VE ANALİZİ

5 litrelik biyoreaktöre dalgalanma,köpük oluşumu ve çok az da olsa mikroorganizmaların sayısının artışından dolayı 2.5 Lt kültür besiyer karışımını koyduk.Cihaz elektronik olduğundan kendi beslemelerini otomatik bir şekilde yapmaktadır.

Ölçek büyütme işlemi; 2.5 lt lik taze YPDA besiyerine hacmin %10’u

kadar doygun Saccharomyces cerevisiae kültürü aşılanır.

2.5x0.10=250 mL Saccharomyces cerevisiae kültürü

Deneye ilk başlanıldığında pH değeri 7.0 iken bu değerin zamanla düştüğü gözlemlendi.

0-30 dk lar arası lag fazı

30-330.dk lar arası log faz

330.dk dan sonra durağan faza geçiş gözlendi.

GRAFİK VE ÇİZİMLER

0 100 200 300 4000.5

1

1.5

2

zaman (dk)

Abs

orba

ns(6

00nm

.de)

A

t

DENEY SONUÇLARI VE YORUMLAR

Spektrofotometrede 100-200 dk lar arasındaki değerlerin artışı çok küçük değerlerde görülmüştür.Bunun spektrofotometreden kaynaklandığı sanılmaktadır.0-15. dk lar arsında mikroorganizma üremesi olmamasından dolayı absorbans değerinde herhangi bir değişiklik olmadığından bu süre ‘lag fazı’dır.

30.dk dan itibaren mikroorganizma sayısı artmaya başlamıştır.90.dk da ani bir artış gözlemlememizin nedeni üremenin hızlı bir şekilde gözlendiği ‘log fazına’ geçiştir.

330.dk daki değerimizde artış miktarı çok azaldığından(≈%4.9) durağan faza geçiş gözlemlendi.

Yeterince uzun süre boyunca numune almamız mümkün olmadığından ölüm fazını gözlemleyemedik.Fakat maya hücreleri bir süre sonra tüm enerji kaynaklarını tüketeceklerinden dolayı metabolik aktiviteler duracaktır,bu faza geçildiğinde işlem durdurulur.

Sonuç olarak Saccharomyces cerevisiae üremesini absorbans değerlerindeki değişmelerle üreme safhalarını belirleyerek gözledik.Absorbans değerlerindeki artış ile log fazında maya hücrelerinin sayısının arttığını logaritmik olarak orantılı arttığını gözlemledik.Biyoreaktörün çalışma şeklini,kontrol modüllerini ve diğer kısımları hakkında bilgilendik.

TEŞEKKÜRLER…