Predavanje 4.Enzimi

• Enzimi ubrzavaju kemijske reakcije 108-1012 puta. • Enzimi kataliziraju reakcije snižavanjem energije aktivacije• Enzimi ne mijenjaju položaj ravnoteže, već samo ubrzavaju brzinu

reakcije • Reakcije katalizirane enzimima odvijaju se u blagim uvjetima

(temperatura, tlak) - ekonomičnija industrijska postrojenjaFunkcija enzima:

– Približava reaktante– Osigurava pravilnu orijentaciju reaktanata– Stabilizira prijelazno stanje

PREDNOSTI UPORABE ENZIMA• Zbog specifičnosti enzima u industriji se dobiva

– MANJI BROJ NUSPROIZVODA– VISOKO ISKORIŠTENJE– KONTROLIRANI SASTAV DOBIVENOG PROIZVODA

Enzimi su sposobni za manipulaciju:– velikih bioloških makromolekula– malih molekula (aminokiseline, vitamini)

Enzimi su biokatalizatori: Proteini i RNA

RNA: Carl Woese, Frances Crick, Leslie Orgel (1967) predvidjeli katalitička svojstva

1980: Thomas Cech: ribozim u protozoama - RNA procesiranje (izrezivanje introna)

Sidney Altman: ribozim u bakterijama-ribonukleaza P: dozrijevanje tRNA

1989 Nobelova nagrada za kemiju

Upotreba RNA u farmaceutskoj industriji: ribozimi koji specifično cijepaju RNA molekule, npr. RNA virusa HIV. Kad bi stanice sintetizirale takav ribozim ne bi se mogle zaraziti HIV-om.

PROTEINI: u prirodi oko 10.000 različitih enzima - U stanici prisutni od nekoliko kopija do 100.000

molekula- Za funkciju često neophodni kofaktori

- Ioni i/ili koenzimi (vitamini)- Univerzalna klasifikacija IUPAC:1. oksidoreduktaze 4. liaze2. transferaze 5. izomeraze3. hidrolaze 6. ligaze- Različita specifičnost za supstrat, općenito su

stanični enzimi specifičniji, a vanstanični manje specifični

LIZOZIM prvi detaljno opisani protein (Fleming, 1922)

Otkriće enzima1833. Anselme Payen: Klijanac ječma: razgradnja škroba

- supstancu koja razgrađuje škrob nazvao DIASTASE1836. Theodor Schwann: iz probavnog trakta izoliran čisti PEPSIN1878. Wilhelm Friedrich Kuehne uveo ime enzim (grč. enzumos)1926. James Sumner: prvi kristalizirani enzim -UREAZA, kasnije su

kristalizirani probavni enzimi

Od 19 st. do danas: Izolacija probavnih enzima iz iznutrica svinja i goveda (pepsin, tripsin, kimotripsin, lipaze i amilaze) te iz tropskih biljaka (papain, ficin, bromelain)

1894. Jokichi Takamine: industrijska proizvodnja enzima pomoću plijesni Aspergillus oryzae (rast na slami)-TAKADIASTASE

Taka-Diastase sold under domestic sales license granted by Dr. Takamine

Mikroorganizmi proizvode različite hidrolitičke enzime koje ispuštaju iz stanica

-Amilaze, proteaze, pektinaze... -Razvijena industrijska proizvodnja enzima

• Gigantske molekule razgrađuju na manje i koriste ih kao hranu

• Većinu industrijskih enzima secerniraju mikroorganizmi u medij– Lakša i jeftinija izolacija iz medija

• Za industrijsku primjenu potrebno proizvesti velike količine enzima koji moraju biti stabilni– Upotreba ekstermofila: termostabilnih, halofilnih... organizama – Upotreba mutageneze i genetičkog inženjerstva – stvaranje

modifikacija koje dovode do poželjnih svojstava

Industrijski sojevi za proizvodnju enzima• Bakterije, kvasci i pljesni

– Bacillus– Streptomyces– Aspergillus, Trichoderma, Fusarium– Saccharomyces, Kluyveromyces

• Općeniti zahtjevi: – domaćinove proteaze ne razgrađuju poželjni enzim – enzim se secernira u medij što olakšava njegovo pročišćavanje

• Specifični zahtjevi: – pravilne posttranslacijske modifikacije

• Većina komercijalnih enzima su rekombinantni proteini no pojačana sinteza nekih kompleksnijih enzima dobiva se upotrebom tradicionalnih tehnika: mutacije, selekcije i uzgoja (Aspergillus niger: glukoamilaza, Trichoderma: celulaza)

• Rekombinantni mikroorganizmidanas su glavni izvor komercijalnih enzima

• Godišnji prihod industrijskih enzima je oko 3 milijarde US$

• U proizvodnji trenutno sudjeluje oko 400 kompanija, a najjače su Novozymes (Danska), Danisco/Genencor (Danska, SAD), BASF (Njemačka), DSM (Nizozemska)Tržište enzima:

• Tehnološki – deterdženti, tekstil, koža,

papir, goriva• Hrana• Stočna hrana

Textile processing 10Grain processing 12Food processing 18Cleaning 44Feed enzymes 4Diagnostic/pharma 4Waste management 4Other 4

Ekspresijki domaćin – E. coliPREDNOSTI• Velik broj vektora (λ fag

i derivati pUC plasmida)• Visoka rata

transformacije• Dobro razrađene

tehnike fermentacije• Jednostavna

regeneracija stanica i liza

NEDOSTACI• Mali prinosi

eksprimiranih proteina• Nema glikozilacije

rProteina• Nema eksporta

rProteina

E. coli inzulin, hormon rasta,interferoni alfa, beta i gama, leukini, rekombinantne vakcine

Tipični plazmidni vektor E. coli

• Plavo/bijela selekcija• SP6 ili T7 RNA polimerazni promotori• Amp rezistencija

Ekspresijki domaćin –Saccharomyces cerevisiae

PREDNOSTI• Dobri prinosi

eksprimiranih proteina• rProteini se glikoziliraju• rProteini se eksportiraju • Dobro razrađene

tehnike fermentacije• Jednostavna

regeneracija stanica i liza

NEDOSTACI

• Mala-srednje mala rata transformacije

• Broj vektora ograničen

• rGeni moraju stabilno biti ugrađeni u genom domaćina

S. cerevisiae inzulin, terapeutski proteini

Ekspresijki domaćin –Pichia pastoris i Kluyveromyces sp.

PREDNOSTI• Dobri prinosi

eksprimiranih proteina• rProteini se glikoziliraju• rProteini se eksportiraju • Jednostavna

regeneracija stanica

NEDOSTACI• Mala-srednje mala rata

transformacije• Zahtjevne fermentacijske

tehnike• Broj vektora ograničen • rGeni moraju stabilno biti

ugrađeni u genom domaćina

• Upotreba neuobičajenih kododna

P. pastoris eritropoetinKluyveromyces lactis kimozin

Ekspresijki domaćin – Trichoderma reesii

PREDNOSTI• Visok prinos proteina

High expression yields• rProteini se glikoziliraju• rProteini se eksportiraju • Jednostavna

regeneracija stanica

NEDOSTACI• Mala-srednje mala rata

transformacije• Zahtjevne

fermentacijske tehnike• Broj vektora ograničen • rGeni moraju stabilno

biti ugrađeni u genom domaćina

• Upotreba neuobičajenih kododna

T. reesii celulaze i hemicelulazeT. longibratum ksilanazeT. harzianum hitinaze

Ekspresijki domaćin – Bacillus

PREDNOSTI• Vrli visoka rata

ekspresije (>10 g/L)• Jednostavne

fermentacijske tehnike• rProteini se

eksportiraju• Jednostavna

regeneracija stanica • Prirodno kompetentni

NEDOSTACI• Broj vektora ograničen• Optimiranje vektora je

prioritet• Nema glikozilacije• Varijabilna

transformacijska rata

B. amyloliquefaciens bernaza, alfa-amilaza, subtilizin

Aspergillus niger• proizvodnja enzima glukoamilaze• proizvodnja pektinolitičkih enzima

(pektinaza)Aspergillus oryzae• proizvodnja amilolitičkih enzima (beta-

amilaze)

INDUSTRIJSKA PRIMJENA ENZIMA:

• PROIZVODNJA ŠEĆERA• HIDROLIZA ŠKROBA• PEKARSKA INDUSTRIJA• PRERADA MLIJEKA• PRERADA POVRĆA I VOĆA

– POIZVODNJA VOĆNIH SOKOVA• PROIZVONJA VINA I PIVA• PROIZVODNJA JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA• DODATAK STOČNOJ HRANI• PROIZVODNJA DETERDŽENATA• DRVNA INDUSTRIJA• MEDICINA I FARMACIJA

Enzimi u industrijiDistribucija prema supstratu

– Hidroliza proteina 59%

– Hidroliza ugljikohidrata 28%

– Hidroliza lipida 3%

– Specijalni 10%

• analitički, farmakološki ili za istraživanja

• Stabilnost i poboljšana svojstva postignuti proteinskim inženjerstvom

Industrijski enzimi• Prerada hrane

• Tekstil

• Prerada žita

• Amilaze: pekarstvo• Lipaze: promjena arome• Proteaze: proizvodnja sira i pekarstvo

(razgradnja glutena), mesna ind. (mekšanje mesa)

• Pektinaze: dobivanje i bistrenje voćnih sokova.

• Pektin esteraze - gotova i smrznuta hrana

• Celulaze: obrada trapera - ‘stone-washed’, danas se koriste mikrobne -termostabilne

• Amilaze, glukoamilaze, glukoza izomeraza - pretvorba kukuruznog škroba u fruktozni sirup

• Stočna hrana

• Gospodarenje otpadom

• Deterdženti

• Dijagnostika

• Celulaze, ksilanaze, fitaze: Potpomaganje probavljivosti i iskoristivosti hranjiva

• Lipaze: kemijski čistači

• Hidrolaze: proteaze, lipaze, amilaze, celulaze

• Reporter proteini (alkalna fosfataza, glukoza oksidaza,β-glukozidaza) i diagnostičkienzimi (DNA polimeraze)

Primjer enzimskog procesa:Industrijska proizvodnja visoko fruktoznog sirupa

High Fructose Corn Syrup HFCS

• Potreba za šećerom kontinuirano raste– Šećerna repa i šećerna trska nepogodne za

veliku proizvodnju zbog klimatskih ograničenja i neophodnosti da se brzo, nakon berbe, procesiraju

• HFCS je sirup koji se dobiva iz škroba, ključna reakcija je enzimska izomerizacija glukoze u fruktozu

Fruktoza

• Fruktoza je slađa (80% slađa od saharoze) i brže se apsorbira pa se koristi za energetske napitke.

• Pojačava okus voća i čokolade te maskira gorak okus umjetnih zaslađivaća.

• Omekšava sladoled snizujući točku smrzavanja. • Metabolizira se u jetri i neovisna je o inzulinu (pogodno

za dijabetičare). • Osim iz škroba može nastati i iz saharoze, nakon kisele

hidrolize ili cijepanjem pomoću enzima invertaze -glukoza se odvaja kromatografijom.

ŠKROB

Amilozaα(1→4)

Amilopektinα(1→4)α(1→6)α(1→3)

•Škrob je ugljikohidrat koji predstavlja rezervnu hranu biljaka•Upotrebljavaju ga i mikroorganizmi i viši organizmi koji posjeduju enzime sposobne katalizirati hidrolitičko cijepanje škroba•Škrob se razlikuje po fizikalnim karakteristikama od vrste do vrste, a najveća razlika je u odnosu sastavnih jedinica – amiloze i amilopektina•Neki škrobovi imaju kovalentno vezani fosfat u malim količinama (krumpir, oko 0,2 %)

HFCS

Glukozni sirup Maltozni sirup

Upotrebljava se za meke bombone, u pekarstvu, vrenjupiva i kod bezalkoholnih pića.

Procesiranje škroba

Škrobna otopina40% wt., pH 6,5

Termamyl®Vodena paraInkubacija na 105oC, 5-7 min

MaltozaPodesiti pH na 4,5Sniziti temp. na 95oCDodati amiloglukosidazu

Glukoza

Fruktozni sirup

Sniziti temp. na 60-70oCPropustiti kroz ksiloza (glukoza) izomerazu

šarža

Fixed-bed

• Izomerizacija glukoze u fruktozu je reverzibilna• U industrijskim uvjetima ravnoteža se postiže kod 50%

udjelu fruktoze u reakcijskoj smjesi (bioreaktoru)• Reakcija je endotermna (potrebno je dovoditi toplinu

kako bi se reakcija uspješno odvijala)• Da bi se izbjeglo dugo trajanje procesa reakcija

izomerizacije se prekida kod prinos fruktoze od 45%• Reakcija izomerizacije je brza, efikasna i ekonomična

ako se koriste kolonski bioreaktori s nasutim slojem (eng. fixed-bed reactor) s imobiliziranim enzimom

• Tijekom procesa, dolazi do slabljenja aktivnosti enzima. Glukoza izomeraza se mijenja novom kad aktivnost enzima padne na približno 12.5% početne vrijednosti.

• Komercijalna glukoza izomeraza zadržava optimalnu aktivnostima oko 600 dana u industrijskim uvjetima.

• Da bi se osiguralo održavanje stalne koncentracije fruktoze u fruktoznom sirupu (produkt), brzina protoka kroz bioreartor se regulira ovisno o aktivnosti enzima.

• Proizvodnja sa samo jednim bioreaktorom uzrokuje odstupanja u sastavu fruktoznog sirupa. – Ovakve probleme moguće je izbjeći radom u kombinaciji s više

bioreaktora koji sadrže enzime različite starosti i aktivnosti kako bi se kontinuirano dobivao fruktozni sirup istog sastava.

Fixed-bed reactor

PREDNOSTI:1. Višestruka upotreba imobiliziranih enzima.2. Imobilizacija povećava aktivnost enzima.3. Kontinuirano vođenje procesa.4. Reakcijska smjesa se ne kontaminira s biokatalizatorom.

NEDOSTATAK:Skuplja priprema u odnosu na slobodne enzime.

• Enzim glukoza izomeraza izolirana iz bakterija (npr. Streptomyces sp.)

• Većina enzima glukoza izomeraze koja se komercijalno koristi u proizvodnji HFCS imobilizira se unakrsnim vezanjem s glutaraldehidom

-supstrat i produkt su mali pa lako difundiraju• Veličina granula imobiliziranog enzima je

između 0,3-1,0 mm• Promjer bioreaktora u proizvodnji

fruktoznog sirupa je između 0,6 i 1,5 m.• Visina bioreaktora između 2,4 i 6 m.• Visina nasutog sloja je 2-5 m.• Zadovoljavajuće strujanje u bioreaktoru osigurava minimalni

omjer između visine nasutog sloja i promjera bioreaktora 3:1.• Postrojenja koja proizvode više od 1000 t HFCS u jednom

danu upotrebljavaju najmanje 20 ovakvih bioreaktora.

HFCS– Zamjena za saharozu– Trećina zaslađivaća u SAD su HFCS– Godišnje se proizvede 9 000 000 t HFSC

• Potrebno 100.000 tona glukoza izomeraze (iz Streptomyces sp.) • Komercijalni proizvodi:

– HFCS 42: ~42% fruktoze i ~53% glukoze– HFCS 55: ~55% fruktoze i ~42% glukoze

• Proizvodnja HFCS-a predstavlja največukomercijalnu primjenu imobiliziranih biokatalizatora u industriji

Enzimi u industriji šećera

Potpuna ili djelomična HIDROLIZA saharoze na glukozu i fruktozu ('inverzija') daje sirup koji je znatno stabilniji (manje podložan kristalizaciji) od čistih otopina saharoze

Bioetanol• Dobiva se (uglavnom) od šećerne trske i

kukuruza• Miješa se u bezvodnoj formi s benzinom • Za sada ga je isplativo dobiti samo iz

šećera i škroba (šećerna trska i kukuruz)– Radi se na metodama za dobivanje etanola iz

celuloze

• Budućnost: celulaze i hemicelulaze• Manja emisija CO2, obnovljivi izvori

energije, ALI opasnost od erozije tla i širenja gladi

Subtilizin

• Koristi se za odstranjivanje mrlja proteinskog sastava (jaja, mlijeko, krv...), u kozmetici, procesiranju hrane, čišćenje kontaktnih leća...

• Problem: uz izbjeljivače gubi aktivnost– Genencor: iz kristalne strukture oksidiranog i nativnog enzima

utvrđen uzrok gubljenja aktivnosti enzima• genetičkim inženjerstvom Met pored aktivnog mjesta zamjenjen

drugom AK. Takav promjenjeni subtilizin je otporan na izbjeljivače i koristi se u deterdžentima

• Mora se granulirati – radnici u ind. deterdženata alergični. – Za granulaciju se koriste resini, staklene kuglice, celulozni polimeri,

agaroza...• U deterdžente se još dodaju amilaze i lipaze, te celulaze

koje služe za omekšavanjeJAPAN: perilice nemaju grijače, upotreba biloških deterdženata

- Ser proteaza niske specifičnosti iz Bacillus licheniformis stabilna u alkalnim uvjetima (275 AK)

Fitaze

Fosfati: -Ograničeni izvori, potrebna racionalna potrošnja-Glavni izvor eutrofikacije jezera i rijeka

Životinje s jednim želucem (svinje i perad) ne mogu iskorištavati velike količine fosfata iz stočne hrane

-fosfat je vezan na inozitol (FITAT)Fitaze su enzimi mikroba koji odcjepljuju fosfat od inozitola, kod životinja sa više želuca (krave) iskoristivost fosfata je veća zahvaljujući želučanoj mikrofloriDodatak FITAZA stočnoj hrani osigurava bolju iskoristivost prirodnih fosfata i smanjenu potrebu za dodatkom anorganskog fosfata

RENOZYME® PCT (DSM) je termostabilna fitaza pogodna za dodavanje stočnoj hrani koja se procesira na visokim temperaturama

CISTIČNA FIBROZAEnzimi kao terapeutici

• Cistična fibroza - najčešća nasljedna bolesti u bijelaca (1 na 2000 rođenih)

• “Krivac" za bolest je bjelančevina nazvana cystic fibrosis transmembraneconductance regulator (CFTR). – Nalazi se u membrani epitelnih stanica žlijezda s vanjskim lučenjem koje se

nalaze u dišnim putovima (od sinusa do pluća), u gušterači, crijevima, žučnim vodovima, koži i sjemenim kanalićima.

• Promijenjen CFTR ne obavlja pravilno ulogu transporta iona klora i natrija preko stanične membrane te su promijenjena svojstva i sastav stvorene sluzi– Znojne žlijezde –previše slanog ekskreta– Probavni sustav –opstipacija– Oštećenje pankreasa –dovodi do dijabetesa– Gusti mukozni sekret u plućima –osjetljivost na infekcije, konstantni kašalj,

glavni uzrok smrtnosti• Zbog nakupljanja sekreta dolazi do začepljenja izvodnih kanalića žlijezda i

oštećenja tkiva– izrazito smanjena djelotvornost prirođene obrane od infekcije– rano nastaje naseljavanje bakterijama kojih se organizam više ne može riješiti.

Cistična fibroza: pluća DNaza 1Pluća u cističnoj fibrozi su neprohodna i disanje je otežano

zbog debelih naslaga mukusa koji sadrži:– Alginat koji proizvode bakterije– DNA iz liziranih stanica– Leukocita koji se akumuliraju zbog infekcije

Genentech: izoliran gen za DNazu 1– Pročišćeni enzim se putem aerosola doprema u pluća gdje hidrolizira

visoko molekularnu DNA u kratke oligonukleotide što smanjuje viskoznost u plućima i olakšava disanje

PROBLEM: Aktin iz liziranih leukocita inhibira DNAzu 1– Prema prostornoj strukturi DNaze u kompleksu s aktinom i DNA

identificirane su aminokiseline kojima aktin stupa u interakciju s DNazom

• Ciljanom mutagenezom načinjena je DNaza 1 koja više ne može vezati aktin, ali i dalje hidrolizira DNA

• Njezina terapeutska učinkovitost trenutno u kliničkim studijama

Aliginat liazaAlginat je polisaharidni polimer koji proizvode morske trave te neke bakterije iz mora i tla • Ekskrecija alginata putem bakterije

Pseudomonas aeruginosa kod pacijenata s cističnom fibrozom pridonosti viskoznosti u plućima

Enzim alginat-liaza može razgraditi bakterijski alginat• Gen za alginat-liazu izoliran je iz bakterija roda

Flavobacterium i kloniran u E. coli

Mukus štiti bakterije i promovira hipermutacije

Aliginat liaza• Ekspresijom kloniranog gena dobiven je protein

molekulske mase 69 kDa• Dio tog proteina je i proteolitički enzim veličine 6

kDa. Preostali protein veličine 63 kDa može se skratiti do veličine 40 kDa i takav enzim je sposoban razgraditi bakterijski alginat

• U kombinaciji s DNAzom1 alginat liaza može reducirati mukus u plućima pacijenata s cističnom fibrozom