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BIOTECNOLOGIE BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro utilizzo di organismi viventi o loro derivati derivati allo scopo di allo scopo di produrre produrre quantità quantità commerciali di commerciali di prodotti utili prodotti utili migliorare le caratteristiche di piante ed migliorare le caratteristiche di piante ed animali animali

BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

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Page 1: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

BIOTECNOLOGIEBIOTECNOLOGIE

utilizzo di organismi viventi o loro derivatiutilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di allo scopo di produrreprodurre quantità commerciali quantità commerciali di di prodotti utiliprodotti utili

migliorare le caratteristiche di piante ed migliorare le caratteristiche di piante ed animalianimali

Page 2: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Tecniche biochimicheTecniche biochimiche

Page 3: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHETECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE

Il passaggio della luce o di radiazioni elettromagneticheIl passaggio della luce o di radiazioni elettromagnetiche

attraverso attraverso

Una sostanzaUna sostanza

Informazioni Informazioni InformazioniInformazioni

qualitativequalitative quantitativequantitative

INTERAZIONE tra una radiazione elettromagnetica e la MATERIA FENOMENO QUANTICO

Page 4: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Le radiazioni sono onde elettromagnetiche che Le radiazioni sono onde elettromagnetiche che viaggiano alla velocità di 3x10viaggiano alla velocità di 3x108 8 m/sec.m/sec.

Sono caratterizzate da una componente elettrica ed una Sono caratterizzate da una componente elettrica ed una magnetica perpendicolari fra loro e che vibrano in una magnetica perpendicolari fra loro e che vibrano in una infinità di pianiinfinità di piani

PARAMETRI CHE LE CARATTERIZZANO

= lunghezza d’onda: distanza tra due stessi punti dell’onda elettromagnetica (si misura in METRI)

T = periodo d’onda: intervallo di tempo in cui avviene una oscillazione completa (si misura in SECONDI)

= frequenza: numero di oscillazioni compiute nell’unità di tempo

(si misura in Hertz; 1 Hz = 1 ciclo/sec)

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RAPPRESENTAZIONE DI UNA RADIAZIONE RAPPRESENTAZIONE DI UNA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICAELETTROMAGNETICA

T

E = energia o intensità di una radiazione elettromagnetica

detta:

FOTONE o QUANTO DI LUCE

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La lunghezza d’onda ( ) di una radiazione elettromagnetica e la sua frequenza ( ) sono grandezze tra loro inversamente proporzionali:

= C

C = rappresenta la velocità di propagazione nel vuoto Il suo valore è di circa 3 x 108 m/sec.

Per una qualsiasi radiazione è necessario conoscere solo uno dei due parametri per poter ricavare anche l’altro.

E =

Radiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata energiaElevata lunghezza d’onda ed bassa frequenza: bassa energia

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Spettro delle radiazioni elettromagnetiche

Nome radiazioneNome radiazione

Lunghezza d’ondaLunghezza d’onda

Å (10 -8cm)

Raggi gammaRaggi gamma 10-3 – 10-1

Raggi XRaggi X 10-1 – 10

Ultravioletto (UV)Ultravioletto (UV) 10 – 35010 – 350

VisibileVisibile 350 - 800350 - 800

InfrarossoInfrarosso 800 -10800 -10- 4

Onde hertzianeOnde hertziane 1010- 4 – 1010

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SPETTRO DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE

Lunghezza d’onda

Lunghezza d’onda

Nella regione del VISIBILE: radiazioni che possono essere percepite dall’occhio umanoRadiazioni a bassa lunghezza d’onda e ad elevata frequenza: elevata energiaElevata lunghezza d’onda ed bassa frequenza: bassa energia

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Come avviene l’interazione tra le radiazionielettromagnetiche e la materia ?

Il fenomeno può essere spiegato sulla base della Il fenomeno può essere spiegato sulla base della teoria quantistica della materiateoria quantistica della materia

Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o molecolare si distribuiscono secondo molecolare si distribuiscono secondo unità discrete unità discrete di energia o quanti di energia o quanti

L’energia associata al passaggio dallo stato fondamentale Eo a quello eccitato avviene solo se è di una particolare frequenza o lunghezza d’onda

= frequenza

E eccitato

Eo fondamentale

Page 10: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

SI VERIFICANO TRANSIZIONI ELETTRONICHE SI VERIFICANO TRANSIZIONI ELETTRONICHE associabili ALLE DIVERSE RADIAZIONI associabili ALLE DIVERSE RADIAZIONI

ELETTROMAGNETICHEELETTROMAGNETICHE

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La spettroscopia atomica o molecolarein seguito a transizioni che si verificano a livello

atomico e molecolare

Considera l’energia delle radiazioni elettromagnetiche che viene assorbita:

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO

Oppure quella parte dell’energia delle radiazioni elettromagnetiche che viene emessa:

SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE

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Sulla base delle diverse radiazioni elettromagnetiche avremo:

· spettroscopia rotazionale (onde radio)

· spettroscopia vibrazionale (infrarosso)

spettroscopia molecolare elettronica (visibile e ultravioletto)

· spettroscopia atomica (raggi X)

Page 13: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

LA TECNICA SPETTROSCOPICA CONSENTE AI CHIMICI DI LA TECNICA SPETTROSCOPICA CONSENTE AI CHIMICI DI OTTENERE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVEOTTENERE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVE

Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio di energia che si verifica fra scambio di energia che si verifica fra l’energia l’energia radianteradiante e la e la materiamateria

SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTOSPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTOassorbimentoassorbimento delle radiazioni luminose della delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del appartenenti al campo del visibilevisibile (350 – 700 (350 – 700 nm) e del vicino nm) e del vicino ultravioletto ultravioletto (200 – 350 nm) (200 – 350 nm)

L’assorbimento di questi tipi di radiazioni da parte L’assorbimento di questi tipi di radiazioni da parte

delle molecole è in grado di produrre delle delle molecole è in grado di produrre delle transizioni energetichetransizioni energetiche degli elettroni esterni degli elettroni esterni della molecoledella molecole

Page 14: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Quando una radiazione elettromagnetica

attraversa una sostanza, provocherà

una transizione elettronica e la radiazione

emergente dalla sostanza avrà una intensità

Inferiore (SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO )

I0 = Intensità radiazione incidente

IR = “ “ riflessa

IA = “ “ assorbita

IT = “ “ trasmessa

I0 = IR + IA + IT

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LA LEGGE DI LAMBERT-BEER LA LEGGE DI LAMBERT-BEER IIt t / I/ I0 0 = = 10 -cl

Nelle soluzioni:Nelle soluzioni:

II0 0 = I= IA A + I+ Itt

IL SOLUTOIL SOLUTO è responsabile dell’assorbimento è responsabile dell’assorbimentol = il cammino ottico (cm) l = il cammino ottico (cm) c = concentrazione molare del solutoc = concentrazione molare del soluto

= coefficiente di estinsione molare, costante = coefficiente di estinsione molare, costante caratteristica di ogni solutocaratteristica di ogni soluto

ma il log Ima il log I00 / I / Itt = = E =E = c lc l

E = E = c lc lE = Densità ottica o ASSORBANZAE = Densità ottica o ASSORBANZA è direttamente è direttamente

proporzionale alla concentrazione del soluto che sta proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luceassorbendo la luce

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It / I0 = 10 -cl

E = E = c lc l

La legge di Lambert-Beer consente di calcolare facilmente la concentrazione di una soluzione dalla misura dell’intensità della radiazione trasmessa IItt

quando è nota l’intensità della luce incidente II00 , , ed ed

il cammino otticoil cammino ottico

= coefficiente di estinsione molare

Rappresenta quella densità ottica di una soluzione in cui la concentrazione = 1 (C = 1)

ed il cammino ottico è unitario (l = 1)

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T = TRASMISSIONE PERCENTUALET = TRASMISSIONE PERCENTUALE

T = 100 T = 100 IIt t

II00 Log T = 2 - log ILog T = 2 - log I00 / I / It t

Log T = 2 - ELog T = 2 - E

E = 2 - Log T E = 2 - Log T T = 1 sostanza trasparente E = 0 T = 0 sostanza opaca E =

T varia da 0 a 100E varia da + a 0

E = 2 – log T8

8

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Componenti schematici di una apparecchiatura per analisi Componenti schematici di una apparecchiatura per analisi spettroscopicaspettroscopica

S = Sorgente di radiazioniS = Sorgente di radiazioni (lampada)(lampada) LP = Radiazione policromaticaLP = Radiazione policromatica

M = Monocromatore M = Monocromatore LMI = Rad. Monocromatica incidenteLMI = Rad. Monocromatica incidente

LME = Rad. Monocromatica emergenteLME = Rad. Monocromatica emergente SP = Specchio SP = Specchio

C = Contenitore campioneC = Contenitore campione (cuvetta) (cuvetta) R = RivelatoreR = Rivelatore

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SpettrofotometriSpettrofotometri UV-VISIBILEUV-VISIBILE, i tipi più , i tipi più comuni sono il “comuni sono il “monoraggio”monoraggio” e il “ e il “doppio doppio raggio”:raggio”:

1) 1) SORGENTESORGENTE DI RADIAZIONEDI RADIAZIONE 2) 2) SELEZIONATORESELEZIONATORE DI LUNGHEZZE D’ONDA O DI LUNGHEZZE D’ONDA O

MONOCROMATORE MONOCROMATORE 3) 3) CELLACELLA 4) 4) RIVELATORE RIVELATORE 5) 5) LETTORELETTORE

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Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel visibile ed ultravioletto visibile ed ultravioletto (spettroscopia molecolare elettronica)(spettroscopia molecolare elettronica)

·· Ad incandescenzaAd incandescenza ( compresa tra 350 800 nm) ( compresa tra 350 800 nm)

adatte solo per il visibileadatte solo per il visibile

· · Ad idrogenoAd idrogeno ( compresa tra 200 400 nm) ( compresa tra 200 400 nm)

adatte solo per ultraviolettoadatte solo per ultravioletto

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Lampada al Tungsteno + deuterio

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Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate

in successione sul campione. in successione sul campione.

Essi sono basati su un Essi sono basati su un ELEMENTO DISPERDENTEELEMENTO DISPERDENTE

(prisma o reticolo), che separano le varie componenti della (prisma o reticolo), che separano le varie componenti della radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda

desiderata.desiderata.

Consistono nel far incidere il fascio policromatico su un oggetto Consistono nel far incidere il fascio policromatico su un oggetto (un prisma o un reticolo) in grado di deviare le diverse (un prisma o un reticolo) in grado di deviare le diverse

radiazioni con diversi angoli: la radiazione uscente sarà quella radiazioni con diversi angoli: la radiazione uscente sarà quella che passa attraverso la fenditura di uscita.che passa attraverso la fenditura di uscita.

Page 23: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

MONOCROMATORIMONOCROMATORIsepara separa la luce policromatica in bande monocromatiche, che la luce policromatica in bande monocromatiche, che

vengono inviate in successione sul campione.vengono inviate in successione sul campione.

A prisma A reticolo

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CUVETTECUVETTE

Sono i contenitori dei campioni da analizzareSono i contenitori dei campioni da analizzare Cammino ottico calibrato (1 cm)Cammino ottico calibrato (1 cm) Volume diversoVolume diverso Materiale diverso in dipendenza della lunghezza Materiale diverso in dipendenza della lunghezza

d’ondad’onda Quarzo per UV e visibileQuarzo per UV e visibile Vetro solo per il visibileVetro solo per il visibile

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Durante questi esperimenti vengono utilizzate cuvette in quarzo,in quanto questo materiale permette alla luce bianca di oltrepassare senza alcun cambiamento.

Page 26: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

PORTACUVETTEPORTACUVETTE dove inserire il campione dove inserire il campione

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Sono dispositivi capaci di produrre un segnale Sono dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico che dipende dall'energia delle elettrico che dipende dall'energia delle radiazioni ricevuta.radiazioni ricevuta.

Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità

luminosa) viene poi trasferito a un indicatoreluminosa) viene poi trasferito a un indicatore

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RILEVATORIRILEVATORI

Sistemi capaci di determinare l’intensità di una Sistemi capaci di determinare l’intensità di una radiazione trasformando un segnale luminoso in radiazione trasformando un segnale luminoso in energia elettricaenergia elettrica

Fotocella (o fototubo)Fotocella (o fototubo)Effetto fotoelettricoEffetto fotoelettrico

FotomoltiplicatoriFotomoltiplicatoriEffetto fotoelettrico amplificatoEffetto fotoelettrico amplificato

Rivelatori a serie di diodiRivelatori a serie di diodiElettronici, fanno anche lo spettro delle radiazioni Elettronici, fanno anche lo spettro delle radiazioni di cui determinano l’intensità.di cui determinano l’intensità.

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Tramite un convertitore analogico digitale è possibile Tramite un convertitore analogico digitale è possibile così ottenere i risultati dell’analisi direttamente su un così ottenere i risultati dell’analisi direttamente su un personal computer che ne elabora i dati.personal computer che ne elabora i dati.

Il segnale proveniente dal rivelatore viene Il segnale proveniente dal rivelatore viene opportunamente amplificato e un amperometro ne opportunamente amplificato e un amperometro ne rileva l’intensità. rileva l’intensità.

Il lettore converte quindi il segnale elettrico in un valore Il lettore converte quindi il segnale elettrico in un valore numerico proporzionale all’intensità del segnale, e numerico proporzionale all’intensità del segnale, e questo valore va da 0 a 100.questo valore va da 0 a 100.

Ponendo pari a 100 il valore del segnale in Ponendo pari a 100 il valore del segnale in

assenza del campione, otteniamo la assenza del campione, otteniamo la trasmittanza trasmittanza e da questa e da questa l’assorbanzal’assorbanza..

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ASSORBANZAASSORBANZA

L’assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanzaL’assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza

A = 2 - log(T)A = 2 - log(T)A = A = clcl

Secondo la legge di Lambert – Beer Secondo la legge di Lambert – Beer l’assorbanza A è l’assorbanza A è proporzionale alla concentrazione della sostanza proporzionale alla concentrazione della sostanza

assorbente, assorbente, per cui più elevata è la concentrazione delle per cui più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato,

maggiore sarà l’assorbanzamaggiore sarà l’assorbanza

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Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzate le varie componenti: organizzate le varie componenti:

♥ ♥ SPETTROFOTOMETRI SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO MONORAGGIO ♥ ♥ SPETTROFOTOMETRI A SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO DOPPIO RAGGIO Gli Gli SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIOSPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO, , sono usati prevalentemente in sono usati prevalentemente in

analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimento assorbimento

La difficoltà sta nel fatto che per ogni misura, si deve ripetere l'azzeramento La difficoltà sta nel fatto che per ogni misura, si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco, oppure registrare prima lo spettro del bianco, poi lo contro il bianco, oppure registrare prima lo spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo.spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo.

Negli Negli SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIOSPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO si ha invece un sistema che si ha invece un sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. tra l'assorbanza del campione e quella del bianco.

Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro di assorbimento. spettro di assorbimento.

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SCHEMA DI UNO STRUMENTO SCHEMA DI UNO STRUMENTO A SINGOLO RAGGIOA SINGOLO RAGGIO

IL MONOCROMATORE è un PRISMA o un RETICOLO DI DIFFRAZIONE

Converte l’Intensità della radiazione in Intensità di corrente

1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura l’Intensità.

2) Si lava la cuvetta.

3) Si mette la soluzione e si misura l’intensità.

4) Si fa il rapporto fra le due Intensità

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SCHEMASCHEMA DI UNO STRUMENTO DI UNO STRUMENTO A DOPPIO RAGGIOA DOPPIO RAGGIO

Il bianco (o riferimento) è costituito dal solvente ad eccezione della sostanza di cui si vuol esaminare l’assorbimento

La radiazione proveniente dal MONOCROMATORE si divide in due raggi che sono inviati contemporaneamente al campione ed al solvente.

Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l’Intensità trasmessa Icampione

Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto.

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I valori di T sono convertiti in E o assorbanza (A)Per risalire dai valori di E alla concentrazione della soluzione in esame :Noto il coefficiente di estinsione molareNoto il cammino otticoSi allestisce una CURVA STANDARD di una soluzione a concentrazione nota

FOTOMETRIA

Page 35: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Ass

orba

nza

280n

m

Concentrazione albumina mg0’5 1,0 1,5

Conoscendo il valore dell’assorbanza del campione si puòInterpolare graficamente il valore della sua concentrazione

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

2,0 2,5

.

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Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza (SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza

A SCOPO ANALITICO

Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano passare o riflettono altre

SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune radiazioni che costituiscono la luce bianca e lascia passare tutte le altre

SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna radiazione che costituisce la luce bianca ma assorbe radiazioni a lunghezza d’onda comprese nell’ultravioletto o nell’infrarosso

Page 37: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Il massimo dell’assorbimento dipende Il massimo dell’assorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle dai gruppi funzionali presenti nelle

molecole ed identifica molecole ed identifica LO SPETTRO DI ASSORBIMENTOLO SPETTRO DI ASSORBIMENTO

Page 38: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI

Il triptofano e la tirosinaAssorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza d’onda di 280nm

Page 39: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

Spettri di di assorbimento della luce da parte dei comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici, per effettuare misure di assorbimento viene usata la luce a 260 nm

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I citocromi possono essere distinti in base agli spettri diassorbimento della luce

LUNGHEZZA D’ONDA

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ApplicazioniApplicazioni METODI DIRETTI Sfruttano le proprietà ottiche delle

molecole analizzate

PROTEINE = 280 nm ACIDI NUCLEICI = 260 nm

METODI INDIRETTI Amminoacidi = ninidrina (570nm) Proteine = biureto (540) Zuccheri = proprietà riducenti Enzimi = substrati o prodotti

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Metodi enzimatici indiretti

Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene utilizzato come substrato in un’altra reazione nella quale è utilizzato come substrato in un’altra reazione nella quale è coinvolta una sostanza cromoforacoinvolta una sostanza cromofora

Glucosio ossidasiGlucosio ossidasi

Glucosio + OGlucosio + O2 2 + H+ H2 2 O = ac. Gluconico + HO = ac. Gluconico + H2 2 OO22

perossidasiperossidasi

HH2 2 OO2 2 + sost. Ridotta (incolore) = + sost. Ridotta (incolore) = sost. coloratasost. colorata

Glucosio + ATP = Glucosio-6-fosfato + ADPGlucosio + ATP = Glucosio-6-fosfato + ADP

Glucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPHGlucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPH

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La riduzione dell’anello nicotinamidico produce una nuova banda di assorbimento della luce con un massimo a 340 nm

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FLUORIMETRIAFLUORIMETRIA

Tecnica ottica quantitativa e qualitativaTecnica ottica quantitativa e qualitativa Una molecola assorbe una radiazione elettromagneticaUna molecola assorbe una radiazione elettromagnetica Si produce uno stato eccitato instabileSi produce uno stato eccitato instabile nel ritornare allo stato basale nel ritornare allo stato basale

EMETTE ENERGIA A LUNGHEZZA D’ONDA MAGGIORE EMETTE ENERGIA A LUNGHEZZA D’ONDA MAGGIORE

L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita,quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza d’onda superiorelunghezza d’onda superiore

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SPETTROFLUORIMETRIASPETTROFLUORIMETRIA

Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata sul fenomeno della fluorescenza.sul fenomeno della fluorescenza.

La fluorescenza è un fenomeno di emissione di una La fluorescenza è un fenomeno di emissione di una radiazione elettro-magnetica che si verifica in seguito ad radiazione elettro-magnetica che si verifica in seguito ad una transizione elettronica da uno stato energetico una transizione elettronica da uno stato energetico superiore ad uno inferiore. superiore ad uno inferiore.

Affinché possa avvenire è necessario che una molecola Affinché possa avvenire è necessario che una molecola si trovi in uno stato eccitato.si trovi in uno stato eccitato.

L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a L’energia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza d’onda superiore.lunghezza d’onda superiore.

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Page 48: BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI UNO RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI UNO SPETTROFLUORIMETROSPETTROFLUORIMETRO

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APPLICAZIONIAPPLICAZIONI

· · Metodi direttiMetodi diretti

Sfruttano la fluorescenza intrinseca delle molecole Sfruttano la fluorescenza intrinseca delle molecole da analizzareda analizzare Proteine 300-350 nmProteine 300-350 nm Gruppi prostetici (400 600 nm)Gruppi prostetici (400 600 nm)

· · Metodi indirettiMetodi indirettiSfruttano le proprietà di sostanze che diventano Sfruttano le proprietà di sostanze che diventano fluorescenti in seguito alla loro interazione confluorescenti in seguito alla loro interazione conle sostanze da analizzare.le sostanze da analizzare.

Cloruro di dansile (DNS)Cloruro di dansile (DNS) · · Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS)Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS) · · Etidio bromuro (EB)Etidio bromuro (EB)

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