Biotecnologia-y-Mejoramiento-Vegetal-INTA.pdf

15Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

PARTE IBiotecnología y Agricultura

16 IZQUIERDO, Juan


I.-Capítulo1

Hacia una agricultura sustentable: lasalternativas de las ciencias de la vida yde la biotecnología

Izquierdo, Juan

1 El contexto del debate

En línea con las conclusiones de la últimaCumbre de la Alimentación de la FAO y diezaños después de la Cumbre de Río y de laadopción de la Agenda 21, la Cumbre Mun-dial sobre Desarrollo Sustentable organizadaen Johannesburgo, Africa del Sur, por el Pro-grama de las Naciones Unidas para el MedioAmbiente (PNUMA), reforzó que la soste-nibilidad es cada vez más un precepto crucial,ampliamente aceptado y prioritario en el pla-no internacional dentro de un contexto in-tegral que involucra la lucha contra la pobre-za, el hambre y la malnutrición, la lucha con-tra las enfermedades infecciosas, la coopera-ción tecnológica, la educación y la liberaliza-ción de los intercambios.

Las previsiones indican un importanteaumento de la demanda alimentaria, espe-cialmente en los países en vías de desarrollo,lo que implica que para poder dar respuestaa este reto una de las posibilidades es au-mentar la superficie de terrenos cultivados.Sin embargo, estos terrenos adicionales, li-mitados por la protección indispensable delos entornos naturales, tan sólo representa-rían una quinta parte del crecimiento de laproducción mundial de cereales. Por consi-guiente, resulta obligatoria la mejora del ren-dimiento y/o la adaptación a condicionesextremas de producción (sequía, salinidad,frío, altas temperaturas y otras) en zonaspoco aptas para la agricultura convencionalque permitan intensificar a los cultivos alimen-ticios y diversificar, sobre la base de especiesde cultivos introducidas o autóctonas, alimen-ticias o volcadas al agroprocesamiento, labase productiva de los países de la región.

En este desafío, en donde las ciencias dela vida y la biotecnología tienen un rol cen-tral, deben estar juntos todos los actoresdel proceso del desarrollo (científicos, legisla-dores, expertos en desarrollo, agricultores y

los representantes de la sociedad civil) paraabordar los aspectos tecnológicos y econó-micos, más urgentes y polémicos, relaciona-dos con el desarrollo y utilización segura delas biociencias y su capacidad de ofrecer solu-ciones sustentables para la producción dealimentos y la reducción de la pobreza. Eneste contexto, la cooperación entre el mun-do desarrollado y el mundo en vías de desa-rrollo resulta crucial si se quieren lograr losobjetivos relativos a la sostenibilidad.

La seguridad y el uso de organismosgenéticamente modificados (OGM) implicana priori, situar a la ciencia en un contexto dedesarrollo mucho más amplio, tratando deasegurar que los agricultores de los países envías de desarrollo formen parte del procesocolaborativo de investigación. Compartiendoel derecho de la sociedad civil a cuestionar,sobre bases bien informadas, los avancescientíficos y las consecuencias que de elloseventualmente pudieran derivar, debe to-marse nota de que un cierto grado de escep-ticismo es un elemento saludable y esencialdel «proceso de demostración» que permitedar a conocer las cuestiones científicas apro-piadas para así poder proceder a un debateen toda regla.

2 Movilizar los recursos

El proceso anterior significa movilizar re-cursos tanto para apoyar a la innovación y ala investigación en biotecnología, así comopara desarrollar un marco regulatorio alcan-zable dentro de las realidades de los paísesde la región, acompañado por canales deinformación tecnológica confiables y hones-tos, que permitan y promuevan una percep-ción pública crítica pero realista de las venta-jas que ofrecen los nuevos desarrollos de lasciencias de la vida y la biotecnología. Esteproceso es, en la actualidad, el centro vitalde la cooperación horizontal que lleva ade-lante la red REDBIO/FAO (http://www.redbio.org) con más de 12 años deexistencia y un cuerpo de laboratorios de másde 650 instituciones de 32 países de Américalatina y el Caribe.

Si la solución a tal desafío dependiera enprimer y único lugar de la movilización de losrecursos humanos y de los medios financie-ros, los progresos actuales y futuros de las

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ciencias de la vida y de la biotecnología, re-presentarían un potencial nada desdeñablepara el impulso de una agricultura sustenta-ble y segura en los países en vías de desarro-llo. En concreto, dicha acción podría permitirabandonar el uso de métodos más agresivospara el ambiente como, por ejemplo, losmétodos mecánicos y químicos que incidenen los costos de producción, en sus efectosdesfavorables sobre las fuentes hídricas, lafauna y la flora y sobre la salud de los agricul-tores.

Este planteamiento no queda exento defuertes reticencias en ciertos sectores de laopinión pública mundial y especialmente enEuropa, que expresan su desconfianza encuanto al uso de organismos modificadosgenéticamente en el ámbito de la agriculturay la alimentación. Estas fuerzas compuestasde variados actores de la sociedad civil repre-sentan, a su vez, un fuerte desafío que limitala movilización de los recursos. El tema de losOGM es ineludible pero no supone más queuna parte de la totalidad del debate. La sa-lud de los suelos y de los cultivos, el conoci-miento real del estado de la biodiversidad,las producciones vegetales en los límitesecoclimáticos y la emancipación tecnológicaen las zonas rurales son también temas querevisten la misma importancia.

3 Un contexto propicio para la acción

La producción agrícola en los países envías de desarrollo ha de aumentar en la me-dida en que continúe creciendo el númerode bocas que alimentar. Este incremento seha de lograr en gran medida con los terre-nos agrícolas existentes y mediante el uso demétodos que no agoten los recursos de latierra o causen daños medioambientalesduraderos. Las perspectivas de las generacio-nes venideras resultarán dañadas irreversible-mente si no se emplean adecuadamente for-mas sustentables de cultivar la tierra.

La adopción de métodos agrícolassustentables es un elemento importante entodo el proceso del desarrollo rural. La Agen-da 21 indica que: Con el fin de crear las con-diciones para la agricultura y el desarrollorural sustentables es preciso reajustar con-siderablemente la política agrícola, ambien-tal y macroeconómica, a nivel tanto nacio-

nal como internacional, en los países desa-rrollados y en los países en desarrollo. Elprincipal objetivo de la agricultura y el deldesarrollo rural sustentables es aumentarla producción de alimentos de manera sus-tentable y mejorar la seguridad alimentaria.La reciente conferencia «Rio+10», celebradaen Johannesburgo en septiembre de 2002,reforzó el compromiso mundial con los prin-cipios del desarrollo sustentable. Entre losmuchos logros importantes de la cumbre hayque destacar el mejor entendimiento de loque representa el desarrollo sustentable y,en particular, en cuanto a la interrelaciónentre la pobreza, el medio ambiente y el usode los recursos naturales.

América latina y el Caribe, como regiónproductora y exportadora de alimentos,debe transformarse en uno de los protago-nistas en el campo de las ciencias de la vida yla biotecnología. Dentro de este interés su-perior por ayudar al desarrollo de nuevas tec-nologías no se debe olvidar la necesidad degenerar, acceder y compartir los avances conel mundo desarrollado de un modo justo yresponsable. La región debe preparar y en-dosar una declaración de política en donde«las ciencias de la vida y las biotecnologíasson una opción estratégica para los países»( h t t p : / / e u r o p a . e u . i n t / c o m m /biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf)subrayándose con claridad la necesidad deponer los medios necesarios a la disposiciónde los países en vías de desarrollo. El progre-so en estos ámbitos ayudará a la investiga-ción y a la evaluación cuidadosa de las aplica-ciones potenciales, con el fin de cubrir los te-mas de seguridad medioambiental y las ne-cesidades locales relacionadas con la reduc-ción de la pobreza, la mejora de la seguridadalimentaria y el aumento de la calidadnutricional.

El desarrollo rural sustentable y la seguri-dad alimentaria son componentes importan-tes de las estrategias regionales contra lapobreza. Habida cuenta de que el sustentode la población rural depende de una agri-cultura sostenible, no se podrá erradicar lapobreza sin una modernización sustancial dela producción agrícola en los países en víasde desarrollo.

4 Alimentar sin destruir

Según las estadísticas de la Organizaciónde las Naciones Unidas para la Alimentación


y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800millones de personas en el mundo que su-fren malnutrición. Muchas más dependen deaprovisionamientos poco fiables de alimen-tos a causa de problemas naturales, econó-micos o políticos. Las prácticas agrícolas nosustentables tan sólo vienen a sumarse atodas estas dificultades. El uso adecuado delas ciencias de la vida y de la biotecnologíapuede contribuir al logro de aumentossustentables de la producción agrícola me-diante la transferencia de prácticas de ges-tión mejoradas, un mejor rendimiento, laresistencia a plagas y enfermedades y el au-mento de la tolerancia al estrés abiótico delas cosechas, el ganado y la pesca. La selec-ción adecuada de estas tecnologías reducirála necesidad de recurrir a sustanciasagroquímicas, de modo que se protegerá elmedio ambiente y a los agricultores de susefectos negativos. Además, las ciencias de lavida y la biotecnología pueden contribuir a laconservación de la diversidad genética. Porejemplo, ya hay proyectos en marcha queevalúan cómo se explotan y se extenúan losecosistemas a causa del uso humano de losrecursos naturales. Con la información reco-pilada se puede lograr un uso más razonablede los ecosistemas que reduzca el riesgo depérdida de especies esenciales.

5 La creación de un diálogo responsable

Organizar y promover una Plataforma deDebate sobre las Ciencias de la Vida, quepermita a los científicos participar en un de-bate con las diversas «partes implicadas» in-teresadas en las aplicaciones beneficiosas yen la divulgación de los nuevos conocimien-tos, es parte del proceso. En este sentido sedebe organizar un debate informativo y plu-ral sobre el papel de las ciencias de la vida enun contexto de urgencia económica y social,centrado en las necesidades de los países envías de desarrollo y apoyar foros de debatecon la sociedad civil presentando estudiosde científicos nacionales, cada uno claramen-te ubicado en su contexto social y económi-co. Las presentaciones deben realizarse enun lenguaje comprensible para los legos enla materia, porque se evitarán las referenciasa teorías e ideologías y se prestará atencióna las soluciones prácticas a problemas con-

cretos. Estas presentaciones servirán de va-liosa introducción general a los diversos te-mas e irán dirigidas a un público amplio, conel fin de que ofrezcan una base para el iniciodel debate público.

6 Reforzar los conocimientos

Las «ciencias de la vida y biotecnología»( h t t p : / / e u r o p a . e u . i n t / c o m m /biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) sonpilares en el contexto de la construcción deuna sociedad y una economía basada en elconocimiento. Las inversiones en investiga-ción y desarrollo, en educación y formación yen los nuevos enfoques de gestión tienenuna importancia clave para hacer frente a losdesafíos de la biotecnología y las ciencias dela vida. Coherente con lo anterior, elreforzamiento de los vínculos entre la inves-tigación y otras políticas socioeconómicas yla necesidad de la participación de los cientí-ficos en el proceso de creación de un consen-so es parte de la creación de nuevas asocia-ciones de investigación entre los países de-sarrollados y los países en vías de desarrollo,a fin de aprovechar al máximo las ventajasde tecnologías prometedoras y el potencialde la biodiversidad.

El libro «Biotecnología y MejoramientoVegetal», para el cual he tenido el honor deescribir este capítulo, es producto del traba-jo de un número importante de investiga-dores jóvenes latinoamericanos. La obra re-presenta una contribución significativa a larealidad de las instituciones académicas y deinvestigación en ciencias agronómicas y bio-lógicas al aportar conocimientos y el estadodel arte y llenar el vacío temporal en la dis-ponibilidad de un libro en español de consul-ta actual, dando seguimiento a la obra pio-nera «Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fun-damentos y Aplicaciones» realizada en 1991y llevada a cabo por el Centro Internacionalde Agricultura Tropical bajo la edición de losDrs. William Roca y Luis Mroginski. La OficinaRegional de la FAO para América Latina y elCaribe colaboró con la edición de dicho libroy reafirma el interés por este tipo de mate-rial, que provee un conjunto de documenta-ción consolidada para el uso de estudiantesy profesionales.


I.-Capítulo 2

El papel de las nuevas biotecnologíasen la producción agropecuaria

Pagliano, Daniel

1 Introducción

La nueva economía determina que aque-llas naciones que pretendan crecer y generarriqueza deberán necesariamente aceptar eldesafío que implica el aprender a utilizar losidiomas «digital y genético». Es así entoncesque las empresas e instituciones basadas enel uso intensivo del conocimiento son funda-mentales en la creación de prosperidad. Em-presas de distinto porte han evolucionado ycrecido en el sector de la biotecnología ge-nerando, directa e indirectamente, cientosde miles de puestos de trabajo en todo elmundo1 como resultado de inversiones quese realizaron tanto en el sector público comoen el privado, y que hoy «se consolidan» através de la generación de un modelo pro-ductor de bienes y servicios. Entender estecontinuum es vital.

Pero el punto principal es la creación decomunidades con visión competitiva. Es asíque desde un tiempo a esta parte muchospaíses desarrollados están implementandodiferentes estrategias para impulsar el sectorde la biotecnología como un área prioritariade su economía, no sólo por lo que significaen términos productivos sino también por loque significa culturalmente.

Para los países latinoamericanos es enton-ces fundamental entender que hay que bus-car un lugar dentro de esta nueva economía,que es una economía de conceptos más queuna economía de toneladas, y a la vez tratarde establecer parámetros de desarrollosustentables que generen inversión, empleogenuino y valor agregado.

El incremento de la demanda por facto-res de productividad y calidad en el produc-to terminado exige la utilización de tecnolo-gías que introduzcan calidad en el materialinicial y que la continúen y expandan hasta

la obtención de un producto final de mayorcalidad. Considerando que los sectores pro-ductivos más importantes son la producciónanimal, de granos, hortifruticultura y fores-tales, la biotecnología incide fundamental-mente desde el inicio de las cadenas produc-tivas. Son básicamente nuevas semillas, plan-tas o animales con nuevas característicasgenéticas que confieren caracteres sanitarios,de calidad o adaptativos, los que llevan unvalor agregado biotecnológico.

A modo de ejemplo, si consideramos alsector lácteo, las demandas comenzarían enpasturas con especies forrajeras de alta pro-ductividad, seguirían en una genética animalque aporte la mejor capacidad de una pro-ducción de calidad, se continúan en la indus-tria con elaboración de productos diferencia-dos y más aún, sigue en la valorización de losdesechos industriales. Hay un continuum tec-nológico donde la suma de los valores agre-gados en cada tramo expande el valor agre-gado final.

Por otra parte, la agricultura y la industriafarmacéutica comparten ahora una mismacaja de herramientas. El desarrollo de tecno-logías que pueden ser usadas en cualquiercampo de la vida es un elemento dinami-zador nuevo que permite que un logro enun campo pueda ser rápidamente traspasa-do a otro. Los códigos usados en genómica,bioinformática, química combinatoria yproteómica también son compatibles. Portodo esto, se habla de una industria de lasciencias de la vida.

Los países de la región poseen una espe-cial habilidad para el agregado de valor a suproducción agropecuaria mediante la utiliza-ción de conocimientos de base biológica. Lospaíses poseen no sólo el «know how» (co-nocimiento) sino también la experiencia dehaber llevado esos conocimientos al campoproductivo, como lo demuestran las indus-trias láctea, forestal, citrícola, cafetera y elcomplejo ganadero, entre otros.

Pero es necesario comprender que la ac-tual revolución existente en las ciencias de lavida modificará o sustituirá progresivamentetecnologías existentes, permitiendo superarlímites técnicos básicos, haciendo viables nue-vos parámetros de productividad y de cali-dad para productos y procesos existentes,sentando la base de nuevas industrias.

1 The economic contributions of the biotec industry of the USeconomy.Informe realizado por Ernst & Young, Mayo 2000. www.bio.org

22 PAGLIANO, Daniel

Esto generará cada vez más cambios sus-tanciales en toda la cadena productivaagroalimentaria, donde nuevos patrones tec-nológicos serán los responsables de la apari-ción de nuevos productos en los mercados.Estar preparados o ser parte de estos cam-bios se torna una cuestión de soberanía.

2 Desarrollo de una visión

La sociedad de un país, como sistemahumano, se mueve en dirección a las pregun-tas que se formula, y actúa en función deéstas.

Para el diseño de una visión, la regióndebe lograr entender los cambios que en elplano mundial se están procesando. Cual-quier tecnología compleja necesita para sudesarrollo de una infraestructura sustentadaen una comunidad que involucra la investi-gación, el gobierno, la educación, los nego-cios, las finanzas, la legislación y otros. Se re-quiere de varios actores para hacer que unatecnología pase por etapas de prueba deconcepto, desarrollo, maduración, extensióny finalmente termine con su adopción.

Es fundamental tener una capacidad deseguimiento de lo que ocurre mundialmenteen el desarrollo de nuevos productos, pro-gramas marcos de investigación, prioridadesestratégicas de programas de ciencia y tec-nología, etc. Luego de tener estas tenden-cias mundiales es menester generar una es-trategia regional de desarrollo y posiciona-miento en el contexto mundial.

Los ejercicios de prospectiva tecnológicason una herramienta válida en este sentido.De acuerdo con la definición de la OCDE (Or-ganización para la Cooperación y el Desarro-llo Económico), prospectiva tecnológica es«un conjunto de intentos sistemáticos paramirar a largo plazo el futuro de la ciencia, latecnología, la economía y la sociedad, con elfin de identificar aquellas tecnologías genéri-cas emergentes que probablemente genera-rán los mayores beneficios económicos y/osociales».

El objetivo central de una prospectivatecnológica es la estimación de las tenden-cias futuras para llevar a cabo en forma anti-cipada acciones para diseñar el futuro desea-do. En este sentido la prospectiva tecnológi-ca identifica aquellas tecnologías emergentes

y estima el impacto de éstas sobre el mundode los negocios y la sociedad en general.

Históricamente, la región ha invertido deforma sistemática en programas de I+D (In-vestigación y Desarrollo) en apoyo a la inves-tigación biológica aplicada, lo cual ha permi-tido mantener y aumentar la competitividadde los sectores productivos de base natural.En la actualidad, es prioritario para los siste-mas de I+D y producción de la región teneruna visión prospectiva para poder alcanzarun nuevo paso en su nivel de desarrollo.

Es prioritario que los líderes comprendanla profundidad del cambio, los cambios tec-nológicos, económicos, culturales y que sepromuevan las reformas y los cambios estruc-turales necesarios para lograr desarrollar sis-temas de innovación propios en biotec-nología. Esto permitirá a la región seguirliderando el desarrollo de productos y proce-sos de base biológica.

Las estrategias de «Usuario de Biotec-nología» son una posibilidad para aquellospaíses que tengan importantes industriasagrícolas y agroindustriales, pero que carecende industrias productoras de insumos bioló-gicos. Sin embargo, países que quieran po-tenciar estas últimas y ser parte del «merca-do del conocimiento», se verán forzados aacciones más proactivas y ambiciosas.

3 Interacción sistema académico y sectorprivado

Hoy, la mayor parte de la infraestructuray de las capacidades disponibles en la regiónse encuentran fuertemente orientadas a lainvestigación. Esto es fundamental paraavanzar hacia las etapas de desarrollo y pos-teriores, que permitan alcanzar los mercadoscon productos y servicios. Estas etapas suce-sivas necesitan ser practicadas y es fundamen-talmente en el sector privado donde debenarticularse, contando con un sistema produc-tivo organizado para hacer demandas al sis-tema científico. La ciencia pura es tan perti-nente como la aplicada, pero en el medianoy largo plazo la única forma de competir se-riamente es a través de productos y serviciosinnovadores.

En la nueva sociedad del conocimiento elrol que cumplen las universidades se tornaaún más clave. Es importante que las universi-


dades de la región puedan analizar y canali-zar lo que está pasando en países como Esta-dos Unidos, Inglaterra, Bélgica, Canadá y Aus-tralia, donde existe una fuerte integración delas carreras científico-tecnológicas con escue-las de negocios, integrando la visión comer-cial al desarrollo de la ciencia y la tecnología.

En este sentido la región posee una ex-celente capacidad científica-tecnológica, perodebe complementarla con la capacidad de«gestión» de la tecnología. Se requiere, porejemplo, del «marketing» (mercadeo) parapoder vender productos fuera de la región,para lo cual habrá que estudiar y compren-der los mercados que van a recibir nuestrosproductos.

Para esto, es menester lograr sinergiasentre científicos y empresarios, y potenciarla formación de nuevas empresas a partir delreconocimiento de la capacidad de labiotecnología de la región.

4 Conclusiones

Para la región es muy importante, sinduda, continuar trabajando en el caminoemprendido, buscando forjar las alianzas es-tratégicas entre los ámbitos público y priva-do de las bioindustrias, coordinando esfuer-zos en investigación y desarrollo hacia obje-

tivos que potencien las capacidades. De estaforma se podrán lograr mejores parámetrosde competitividad global que permitan con-tinuar con la creación de emprendimientos ypuestos de trabajo altamente calificados yasí contribuir al desarrollo.

La región tiene una gran oportunidadgenerada por la globalización pero, paraaprovecharla, necesita entender que es in-dispensable involucrar a la comunidad ente-ra y participar activamente para capturarla.

Se debe promover una cultura que favo-rezca a los emprendimientos y genere unmayor grado de asociatividad entre las em-presas y la capacidad científica, así como laformación de redes de capital de riesgo quepermitan la generación de nuevos negocios.

Albert Einstein afirmaba que «…todos losimperios del futuro van a ser imperios delconocimiento, y solamente serán exitosos lospueblos que entiendan cómo generar cono-cimientos y cómo protegerlos, cómo buscara los jóvenes que tengan la capacidad parahacerlo y asegurarse que se queden en elpaís. Los otros países se quedarán con litora-les hermosos, con iglesias, minas, con unahistoria fantástica; pero probablemente nose queden con las mismas banderas ni conlas mismas fronteras ni, mucho menos, conun éxito económico».


PARTE IIHerramientas Básicas

26 RADICE, Silvia


II.-Capítulo 1

Morfogénesis in vitro

Radice, Silvia

1 Introducción

La embriogénesis somática y laorganogénesis son dos procesos morfogé-nicos muy frecuentes en el cultivo in vitro deespecies vegetales. La embriogénesis somá-tica es el proceso por el cual se obtiene unaestructura similar al embrión zigótico sin quemedie la fertilización de las gametas, mien-tras que por organogénesis pueden obtener-se tallos, raíces o flores. Estos órganos soninducidos a partir de una célula o de un gru-po de células que, según las condiciones decultivo, tienen la propiedadde mantenerse en activa di-visión.

Esta totipotencialidadcelular había sido anunciadapor Haberlandt en 1902,quien propuso la teoría deque todas las células vege-tales tienen la capacidad deregenerar plantas comple-tas. Este autor, sin embar-go, no pudo demostrar suhipótesis debido a que nopudo lograr la división celu-lar porque los medios decultivo que empleaba no in-cluían reguladores del creci-miento, aún desconocidosen ese entonces. Los avan-ces en cultivo de tejidos fue-ron muy lentos en sus ini-cios. En 1934, White pudomantener en forma ilimita-da el crecimiento de raícesen medios líquidos a partirde ápices de tomate. Al mis-mo tiempo se identificó elácido indol acético (AIA),que posibilitó el manteni-miento indefinido in vitrode callos de zanahoria y ta-baco.

Posteriormente se des-

cubrió el efecto de la leche de coco como es-timulante de la formación de callo sobre elcultivo de embriones de Datura stramonium.Skoog y Tsui en 1948, trabajando con culti-vos de callo de tabaco, demostraron la exis-tencia de una regulación química en la parteaérea y en la raíz. Trabajos posteriores encallos de tabaco y con el agregado decinetina, la primera citocinina descubierta, fueposible demostrar que la diferenciación debrotes, raíces o de ambos, era regulada porel balance de auxinas/citocininas.

2 Tipos de morfogénesis. Definiciones

En condiciones de cultivo in vitro, las cé-lulas somáticas pueden regenerar embriones(Fig. 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig. 2) comorespuesta a un determinado estímulo. La re-

Figura 1: A-F) Embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, C y E)Embriogénesis somática en diferentes fases de crecimiento observada enCodiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B, D y F)Embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partirde embriones zigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las barrasrepresentan 5 mm.

28 RADICE, Silvia

generación es un proceso que comprendediferentes fases que se suceden de manerasimilar para los tres tipos de morfogénesiscitadas. De Klerk y colaboradores en 1997denominaron a estas diferentes fases comofase de adquisición de la competencia, fasede inducción y fase de realización.

En la primera fase las células no respon-den al estímulo organogénico pero adquie-ren esa competencia durante una fase dedesdiferenciación. En la segunda fase o fasede inducción, las células son receptivas al es-tímulo morfogénico y hay una relación direc-ta entre el tipo, concentración y combinaciónde reguladores del crecimiento agregados almedio de cultivo y el órgano a desarrollar. Enla fase de realización, la célula sufre las sucesi-vas divisiones para formar el órgano deter-minado.

A partir de la siembra in vitro de diferen-tes explantes relativamente grandes y encondiciones adecuadas, puede inducirse laformación de nuevos órganos de manera di-recta sin la formación de callo. Si la forma-

ción es de brotes, raíces o flores se denomi-na organogénesis directa. Si en cambio seinduce la formación de embriones somáticos,este proceso se denominará embriogénesisdirecta (Fig. 1 y Fig. 3). Si por el contrario, apartir de la siembra de un explante in vitrose observa la proliferación de células en for-ma desordenada y sin ninguna función pre-

determinada, se iniciará la producciónde callos o suspensiones celulares (Fig.2 A y Fig. 3). La diferenciación de órga-nos a partir de callos o morfogénesisindirecta, estará condicionada a la pre-via formación de los meristemoides. Ladenominación de morfogénesis direc-ta o indirecta fue descripta por prime-ra vez por Hicks en 1980.

Figura 2: A-E) Organogénesis somática obtenidapor cultivo in vitro. A) Callo organogénicoobtenido en Abelia sp. (André) Rehder cultivadaen MS + 1 mg l-1 de picloran. B) Inicio de brotes(flechas) en hojas crecidas in vitro de «CrimsonGold» (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C) Brotes deGerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir delcultivo de capítulos florales en MS 0,05 mg l-1 deIBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D)Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André)Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E)Raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp.(André) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1de picloran. Las barras representan 5 mm.

Figura 3: Esquema de los diferentes procesosmorfogénicos obtenidos a partir de la siembra in

vitro de diferentes explantes. Las líneascontinuas expresan organogénesis o

embriogénesis directa mientras que las líneasquebradas indican que la morfogénesis se

obtiene por vía indirecta.


3 Histología de la morfogénesis

Después de 48 horas de realizada la siem-bra del explante en el medio de cultivo ade-cuado, a partir de una célula epidérmica o delmesófilo foliar, como ocurre en las coníferas,se suceden una serie de divisiones mitóticas.Así se pueden observar, a través del estudiohistológico, pequeñas masas de células quecontienen un citoplasma denso y grandesnucléolos. Este conjunto de células agrupa-das a modo de esferas fueron denominadasmeristemoides por Torrey en 1966, y son losresponsables de la diferenciación de los nue-vos órganos. Este tipo de meristema puedeiniciarse en forma directa a partir de célulasdiferenciadas, pertenecientes a un explantecultivado in vitro o, indirectamente, a partirde una célula o grupo de células diferencia-das que promueven la proliferación celular(Fig. 4 A). Su evolución determinará el creci-miento de un órgano como, por ejemplo,una yema adventicia (Fig. 4 B).

Las células embriogénicas son similares alas células meristemáticas debido a que noson demasiado voluminosas, tienen gran can-tidad de ribosomas, citoplasma denso, unnucléolo agrandado y pequeños granos dealmidón. Estas células en general se agrupany pueden variar en tamaño y número. Den-tro de un grupo de células embriogénicas, eldesarrollo de las mismas no está sincroniza-

do. Estas células son capaces de dividirse ode transformarse en embriones según lascondiciones del medio de cultivo. Seguida-mente, las células que no desarrollanproembriones comienzan el proceso de dife-renciación, es decir, se vacuolizan, disminuyeel volumen de núcleo y nucléolo y desapare-cen los gránulos de almidón.

Las experiencias demuestran que las cé-lulas embriogénicas se desarrollan sólo cuan-do se modifican las condiciones de cultivo.En general ocurren cuando se reducen lascantidades de auxina y citocinina o cuandose elimina la auxina.

Las células embriogénicas desarrollancomo embriones cuando las condiciones ex-perimentales permiten que éstas expresensu potencial. Pueden ocurrir dos situacionesontogénicas diferentes, es decir que su ori-gen sea unicelular o pluricelular. En el caso deiniciarse a partir de una célula, ocurre que es-tas células embriogénicas se aíslan unas deotras por una importante modificación en supared celular, en particular por la gelificaciónde la laminilla media. Esta célula, que estárodeada por un polisacárido mucilaginoso,sufre divisiones polarizadas formando unembrión globular, en donde pueden diferen-ciarse deposiciones de almidón en una eta-pa previa a la polarización de este proem-brión. Luego ocurre la formación de la epi-dermis y adquiere la simetría bilateral. Sucesi-vamente se observa el crecimiento de unoo más cotiledones, el desarrollo de los teji-dos provasculares, la iniciación de los ápicesradicales y de tallo y una progresiva acumu-lación de sustancias del tipo almidón, lípidosy proteínas.

En el caso de que los embriones somáti-cos se originen de un grupo de células pue-

Figura 4: A-E) Cortes histológicos de diferentesexplantes cultivados in vitro. A) Meristemoides(flechas) observados en cultivo de Silybummarianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 deBAP 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en ápicesde Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus+ 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 deGA3 4 x. C) grupo de células embriogénicas(flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blumecultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D)Embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L)Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E)Embriogénesis secundaria en Codiaeumvariegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 detidiazurón 10 x.

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den observarse diversos patrones. Los em-briones somáticos se forman a partir de gru-pos de células epidérmicas y subepidérmicas(Fig. 4 C). Este tipo de ontogenia de origenmulticelular se llama comúnmente buddingo embriogénesis adventicia. Estas célulaspequeñas tienen una alta relación núcleo/citoplasma, un denso citoplasma y unnucléolo voluminoso y teñido. Se diferenciande las células embriogénicas por la falta desustancias de reserva, por su delgada paredcelular y su frecuente división celular. Estasestructuras pueden ser denominadas comoproembriones globulares (Fig. 1 A y B). En unaetapa posterior, desarrollan una epidermis,un tejido provascular, acumulan material dereserva y también sufren la polarización. Es-tas estructuras globulares producen cotiledo-nes y se transforman en embriones somáticoscon la formación de ápices de tallo y raíz.

Para una misma especie puede ocurrir unou otro tipo de inicio según las condiciones decultivo. El desarrollo de un embrión somáti-co de origen unicelular es comparable a la deun embrión zigótico. En dicotiledóneas, laetapa globular es seguida por una etapa co-razón que se corresponde con la adquisiciónde la simetría bilateral: desarrollo de la epi-dermis, de los estratos procambiales y, demanera sucesiva, el desarrollo del ápice radi-cal. El ápice de tallo se desarrolla más tardeen la etapa de cotiledonar. En los embrio-nes somáticos de algunas especies hay unaetapa intermedia entre la globular y corazónllamada oblonga, que corresponde a la indi-vidualización del ápice de la raíz y alprocambium en respuesta a la elongaciónaxial del embrión somático debido al trans-porte de auxinas (Fig. 1 C).

Los embriones de origen multicelular ob-tenidos por budding muestran la mismaontogenia que los zigóticos, así como tam-bién la producción de sustancias de reserva.

Sin el seguimiento histológico detallado,la formación del embrión somático sólo pue-de ser confirmado por la germinación (Fig. 1F). Sin embargo debido al bajo porcentajede embriones que llegan a esta etapa, estatarea es casi imprescindible para una correc-ta evaluación de las respuestas encontradascon los diversos medios de cultivo emplea-dos.

Los embriones somáticos, comparadoscon los embriones zigóticos de la misma es-

pecie, frecuentemente desarrollan de mane-ra anormal o son inmaduros. La anomalíamás frecuente es la formación doble o tripledel sistema vascular, causada por la pobrepolarización del transporte de auxinas. Tam-bién se puede encontrar un contenido exce-sivamente alto, reducido o ausente de lasreservas de almidón y/o proteicas, que elmeristema apical o radical no estén desarro-llados o que la embriogénesis sea repetitivao secundaria (Fig. 4 E).

La falta del meristema apical o de unaescasa deposición de sustancias lipoproteicasobservada en los embriones somáticos dealgunas especies, no debe ser tomada comouna anormalidad sino que puede ser sínto-ma de inmadurez debido a la rápida forma-ción de los mismos. En este caso una etapaintermedia que permita la maduración de lasestructuras formadas permitirá incrementarel porcentaje de embriones somáticos capa-ces de germinar.

4 Factores que afectan los procesosmorfogénicos

• Los cuatro factores principales que con-dicionan la obtención y el crecimiento de nue-vos órganos en condiciones in vitro son:

• el genotipo• las condiciones químicas seleccionadas

para realizar el cultivo• las condiciones físicas seleccionadas para

realizar el cultivo• el explante• El genotipo es un factor determinante

en todos los procesos morfogénicos desdela capacidad del explante para su estableci-miento en condiciones in vitro así como tam-bién para la proliferación de callo, o la dife-renciación y crecimiento de nuevos órganos.Por esta causa, no es posible generalizarmetodologías o protocolos de trabajo debi-do a que los medios de cultivo como las con-diciones de cultivo seleccionados, deben serespecíficos para cada situación en particular.Un ejemplo de ello es el protocolo emplea-do por Stamp y Meredith en diferentescultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellosfue posible la obtención de embrionessomáticos a partir de embriones zigóticos,pero estos resultados no se repitieron con elcultivar «Pinot Noir».


• Varios son los compuestos químicos queinfluyen en los patrones morfogénicos invitro dentro de los cuales podemos conside-rar:

1. La composición salina del medio decultivo. La composición salina más emplea-da para inducir la formación de callo, laorganogénesis directa o indirecta en la ma-yoría de las especies vegetales, es la deMurashige & Skoog (1962) (MS). Sin embar-go, existen otras formulaciones diseñadaspara inducir determinados patronesmorfogénicos. Existe, además, una estrecharelación entre la composición hormonal delexplante y la concentración de reguladoresdel crecimiento agregada al medio de culti-vo.

2. Reguladores del crecimiento. Estoscompuestos pueden promover la morfogé-nesis aun cuando la concentración salina nosea la adecuada. En condiciones óptimas decultivo pueden incrementar significativamen-te la diferenciación de órganos. En muchasde las especies vegetales, para la inducciónde embriones somáticos, es necesario el agre-gado de auxinas como ocurre en Tilia spp.;sin embargo, para otras, como es el caso delcrotón (Codiaeum variegatum), es suficien-te con el agregado de thidiazurón. Elgenotipo y el tipo y concentración de regula-dores del crecimiento empleados están es-trechamente relacionados.

3. Antibióticos. En procesos de transfor-mación es muy común el agregado deantibióticos del tipo cefotaxime, kanamicinay carbenicil ina para la eliminación deAgrobacterium tumefaciens. En explantesde hoja de diferentes cultivares de Malus do-mestica se ha encontrado que 250 mg. L–1

de cefotaxime aumentan significativamentela regeneración de brotes mientras que 500mg. L–1 de carbenicilina promueven la forma-ción de callo y la kanamicina inhibe los pro-cesos morfogénicos.

4. Carbón activado. En general se usapara absorber compuestos tóxicos de lamicroatmósfera gaseosa o el exceso de regu-ladores del crecimiento presentes en el me-dio de cultivo. E.K. Pettersson y su equipo decolaboradores de la Swedish University ofAgriculture, Suecia, demostraron que estecompuesto puede promover la embriogéne-sis somática debido a ciertos compuestos que

se incorporan por difusión al medio de culti-vo.

5. Agar. Otro aspecto importante a te-ner en cuenta es la consistencia del mediode cultivo. Puede emplearse como semisólidoo líquido. El agente gelificante más emplea-do en el cultivo in vitro es el agar extraídode diversas algas marinas. Las diferentes cali-dades existentes en el mercado modifican laexpresión morfogénica debido a que puedencontener sustancias inhibitorias o promoto-ras del crecimiento. Tal es el caso del cultivode hojas de Actinidia chinensis, cultivadasen una solución de MS con el agregado de0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP, dondese observó una respuesta morfogénica diver-sa según el tipo de agar seleccionado. Porejemplo, cuando el gelificante empleado fueChubut-agar, de producción nacional, se ob-servó una gran diferenciación de yemas ad-venticias, mientras que con el agregado deagar SIGMA R sólo se indujo la proliferaciónde callo.

En caso de seleccionar medios de cultivolíquidos, la respuesta morfogénica observa-da varía de manera considerable. El cultivolíquido es imprescindible cuando se buscapromover la morfogénesis indirecta a travésde suspensiones celulares. Para ello es nece-sario cultivar los callos en medio líquido conagitación para permitir que las células se dis-greguen y puedan diferenciar raíces, broteso embriones somáticos en forma aislada.

La selección del medio de cultivo líquidoo sólido depende, además, de la especieempleada. En Cymbidium spp, por ejemplo,se ha observado que el empleo de medio decultivo líquido promueve una mayor diferen-ciación de protocormos respecto del mismomedio gelificado. A su vez, este proceso pue-de mantenerse durante varios subcultivosmientras que en medio de cultivo gelificadose observó que los protocormos tienden aformar tallos.

6. Atmósfera gaseosa. Es un factor de-terminante en los procesos morfogénicos yestá condicionada por el tipo y tamaño deenvase seleccionado así como también el sis-tema de cobertura del mismo. Las tapas usa-das en cultivo in vitro varían desde el tapónde algodón, papel de aluminio, película deresinite transparente o tapas rígidas depolipropileno. El intercambio gaseoso es di-

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ferente para cada tipo de tapa; en conse-cuencia, la atmósfera interna también sufri-rá variaciones.

En condiciones in vivo la atmósfera con-tiene 78 % de nitrógeno; 21 % de oxígeno y0,035 % de dióxido de carbono. En cultivosin vitro se han registrado, además, etileno yotros compuestos hidrocarbonados.

El nivel de oxígeno disponible para elexplante condiciona el crecimiento y los pro-cesos morfogénicos. En general se necesitauna buena aireación para obtener cualquiertipo de proceso morfogénico. En alfalfa sepuede obtener un buen incremento de ma-terial a partir de suspensiones celularesembriogénicas cuando la solución se saturacon 70% de oxígeno en la solución. Por elcontrario, una tensión de oxígeno del 5 %estimula la producción de plantas a partir deanteras de tabaco.

La concentración de dióxido de carbono(CO2) en la atmósfera gaseosa in vitro varíasegún la respiración y la actividadfotosintética de las plantas. En condicionesde oscuridad, el CO2 se incrementa mientrasque, en condiciones de luz disminuye. En tra-bajos realizados con Ficus lyrata se han en-contrado concentraciones variables que vandel 0,5 al 8,5 %, según el tipo de sello o tapaempleados. Estas concentraciones superioresa 1 %, generalmente tóxicas para las condi-ciones in vivo, probablemente no sonlimitantes para la actividad fotosintética.

La presencia de etileno en condiciones invitro promueve diversas respuestas. Para elcultivo de células, callos y anteras, su acumu-lación tiene efectos inhibitorios. La cantidadde etileno producida in vitro varía con la es-pecie, el tipo de explante, la concentraciónde citocininas en el medio de cultivo, el tipode agar seleccionado y con la luz. Una formade incorporar etileno al envase de cultivo esa través de la esterilización del material dedisección realizada con el material embebi-do en alcohol y flameado con mecheroBunsen. En muchos casos, el etileno actúacomo promotor de la morfogénesis, pero lue-go es inhibitorio del crecimiento de los órga-nos diferenciados.

• Entre las condiciones físicas podemosmencionar los efectos de la temperatura, lahumedad relativa y la luz.

1. La temperatura de incubación de loscultivos es un factor importante a tener encuenta. Si bien en las condiciones naturalesde cultivo las plantas tienen diferencias tér-micas durante el día y la noche, las tempera-turas in vitro se mantienen casi estables. Esimportante señalar que cuanto más se ase-mejen las condiciones in vitro a las óptimasde crecimiento de la especie estudiada, ma-yor será la respuesta esperada. En cultivos dehojas de Streptocarpus x hybridus someti-dos a diferentes temperaturas, se observóque la regeneración mayor de brotes se ob-tuvo a 12 ºC, mientras que por encima de los30 ºC casi no hubo diferenciación.

2. La humedad relativa (HR) como medi-da de la cantidad de vapor de agua conteni-da en la atmósfera gaseosa, es otro de losparámetros físicos a tener en cuenta. La HRdependerá del sello o cobertura del envaseempleado. Si este cierre es hermético, la hu-medad interior será del 100 %. Si existe laposibilidad de un intercambio gaseoso, lahumedad interna puede descender a nivelescercanos al 50 %. Este importante descensodel contenido de HR puede promover unapérdida veloz de agua del medio de cultivo,variando la concentración de sus compues-tos hasta llegar a niveles tóxicos (Debergh,comunicación personal).

3. La luz suministrada a los cultivos debeser evaluada en cuanto a la calidad, intensi-dad y período de suministro. La respuestamorfogénica de un explante puede variarsegún se le proporcione luz o no. Para esti-mular la formación de callo es común que seprefiera la oscuridad. El suministro de luz fa-vorece la diferenciación de órganos.

Tal como ya se señaló anteriormente, losprocesos morfogénicos dependen delgenotipo seleccionado, pero, además, debesumarse el efecto del explante seleccionado.El tratamiento de la planta madre, las condi-ciones físicas y fisiológicas en las que ésta seencuentre y el sector del cual se tome elexplante determinarán a su vez la respuestamorfogénica en condiciones in vitro. Unejemplo muy interesante es la diferente res-puesta morfogénica observada sobre hojasde Camellia japonica cultivadas en un mis-mo medio de cultivo, según la porción de lalámina que se cultive. Estos resultados fue-ron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des-


pués de seis semanas de cultivo in vitro pre-via inmersión del explante en una soluciónde IBA (1 mg l–1) durante 20 minutos (Fig. 5).

5 Lecturas recomendadas

BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C. and WOLTERING, E.J.1994. Components of the gaseous environment and theireffects on plant growth and development in vitro. PlantGrowth Regulation 15: 1-16.

DE KLERK, G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. andNeumann K.H. 1997. Regeneration of roots, shoots andembryos: physiological, biochemical and molecularaspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66.

GEORGE, E. 1993. Plant propagation by tissue culturePart 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). GranBretaña. 1361pp.

HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in planttissue culture and the problem of organ determination.Bot. Rev. 46: 1-23.

WILLIAMS, E.G. and MAHESWARAN, G. 1986. Somaticembryogenic factors influencing coordinated behaviorof cells as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-597.

Figura 5: Esquema de las diferentes respuestasmorfogénicas obtenidas después de seis semanas decultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segúnla porción de la lámina cultivada. 1. organogénesisindirecta, 2. embriogénesis somática directa, 3.regeneración directa de raíces, 4. callo organogénico.


II.-Capítulo 2

Establecimiento de cultivos de tejidosvegetales

Mroginski, Luis; Sansberro, Pedro;Flaschland, Eduardo

1 Introducción

El cultivo de tejidos –en su acepción am-plia– puede ser definido como un conjuntomuy heterogéneo de técnicas que presentanen común el hecho de que un explante (unaparte separada del vegetal que pueden serprotoplastos –células desprovistas de paredcelular– células, tejidos u órganos) se cultivaasépticamente en un medio artificial de com-posición química definida y se incuba en con-diciones ambientales controladas. La impre-cisión de esta definición puede generar mu-chas polémicas, pero es actualmente acep-tada.

Generalmente es común dividir las técni-cas del cultivo de tejidos en dos grandes gru-pos: a) cultivos en medios semisólidos y b)cultivos en medios líquidos, los que a su vezpueden ser agitados (mediante el empleode agitadores de uso continuo) o estaciona-rios. También es frecuente dividir al cultivode tejidos atendiendo a los niveles de com-plejidad en cultivo de órganos, cultivos celu-lares y cultivo de protoplastos. Para el esta-blecimiento de los cultivos utilizando cualquie-ra de los sistemas es necesario tener en cuen-ta algunos aspectos generales comunes rela-cionados con el explante, la asepsia, el me-dio de cultivo y las condiciones de incubación.La discusión de estos aspectos constituye elobjetivo de este capítulo. Adicionalmente seincluye el tema de la aclimatación de las plan-tas regeneradas in vitro, que es de gran im-portancia en la mayoría de las aplicacionesdel cultivo de tejidos en la agricultura.

2 Explante

Varios factores deben ser tenidos en cuen-ta en la elección del explante apropiado para

el establecimiento de los cultivos in vitro,entre ellos:

1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tra-tar de clasificar las aplicaciones que se persi-guen con el cultivo de tejidos, se podríaesquematizarlas en aplicaciones para:

• Estudios básicos. En este caso, losexplantes cultivados pueden ser diversos. Silo único que se quiere lograr es un sistemade callos para estudiar algún proceso fisioló-gico, se puede cultivar cualquier órgano, teji-do o célula viva. En este caso –en que lo úni-co que se busca es la inducción de callos– loideal es cultivar explantes jóvenes, derivadosde semillas en germinación, donde se obtie-nen respuestas rápidas y, en general, haymenores problemas de contaminación conmicroorganismos.

A veces se hace uso del cultivo de tejidosporque representa un sistema experimentalque simplifica la complejidad generada porlos fenómenos de correlación entre las dis-tintas partes que normalmente están presen-tes en una planta entera. El explante que seusará estará condicionado por lo que se quie-re estudiar. Un buen ejemplo lo constituye elcultivo de ovarios fecundados del tomatepara estudiar los requerimientos nutricionalesdurante el crecimiento de los frutos. Asimis-mo, el cultivo de óvulos ha sido muy útil paraestudiar aspectos relacionados con la forma-ción de las fibras en algodón. El cultivo dediscos de tallos brindó una valiosa ayuda paraestudiar la rizogénesis in vitro.

• Obtención de plantas con sanidadcontrolada. Es muy común la utilización delcultivo de tejidos para la obtención de plan-tas libres de virus (ver VIII.-9). El explante idealpara ello es el meristema (dependiendo dela especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consis-tente del domo y de un par de primordiosfoliares.

• Micropropagación. En este caso de-penderá del sistema que se quiere utilizar. Silo que se quiere explotar es la brotación demeristemas, los ápices terminales y los seg-mentos uninodales de ramas jóvenes consti-tuyen excelentes explantes. En este caso elcultivador de tejidos debe conocer perfecta-mente la biología de la reproducción de laplanta para aprovechar aquellos explantesque en forma natural son propágulos.

En cambio, si se pretende micropropagarmediante el empleo de semillas sintéticas (ver

36 MROGINSKI, Luis; SANSBERRO, Pedro; FLASCHLAND, Eduardo

V.-2) el explante original deberá posibilitar lainducción de la embriogénesis somática. Eneste caso, la utilización de embriones zigóticosinmaduros u hojas, suelen ser frecuentescomo explantes.

• Obtención de híbridos interespecí-ficos. Una de las primeras aplicaciones delcultivo de tejidos en la agricultura lo consti-tuyó su empleo como ayuda para la obten-ción de híbridos derivados de cruzamientosinterespecíficos, donde se produce el abortotemprano de embriones. En estos casos, elexplante cultivado es el embrión cigótico enestadios tempranos de su desarrollo. Con lamisma finalidad también se utilizan ovariosu óvulos fecundados.

• Obtención de plantas de semillas conembriones rudimentarios. Para esta finali-dad los explantes pueden ser semillas (porej. orquídeas) o bien, se aíslan los embrionesen un estado temprano de desarrollo («co-razón») como en el caso de yerba mate o dealgunas variedades de duraznero.

• Obtención de plantas haploides (con-siderando como haploide a un esporofito quecontiene el complemento gamético decromosomas). En este caso, los explantesmás utilizados son las anteras, aunque tam-bién pueden emplearse microsporas aisladas,óvulos y ovarios no fertilizados.

• Inducción de variación somaclonal. Eneste caso se pueden utilizar varios explantes,pero si la finalidad de su utilización es la apli-cación en planes de mejoramiento genéticode plantas, los explantes utilizados debenposibilitar la regeneración de plantas ente-ras.

• Producción y/o conversión de sustan-cias útiles. Se puede utilizar una gran varie-dad de explantes. Explantes de raíces suelenser muy utilizados.

• Obtención de híbridos somáticos.Para esta finalidad se recurre a la fusión deprotoplastos. En la mayoría de los casos seaíslan los protoplastos de mesófilos de ho-jas y de suspensiones celulares.

• Conservación e intercambio degermoplasma. Los meristemas son losexplantes preferidos para el desarrollo de sis-temas de conservación a mediano y largoplazo (crío- conservación con nitrógeno líqui-do) y para el intercambio de materialgenético.

• Establecimiento de suspensiones ce-lulares. En este caso se recomienda iniciar loscultivos a partir de explantes extraídos desemillas en germinación (hipocótilo, epicótilo,cotiledones, raíces).

2. Posibilidad de contaminación conmicroorganismos. De ser posible, se debencultivar explantes de plantas dadoras quecrecen en condiciones de invernadero, conello se reduce sustancialmente las tasas decontaminación. Por otra parte, es recomen-dable evitar el uso de «explantes sucios» (raí-ces, rizomas) que provienen de plantas creci-das en macetas o en el campo, dado que enla mayoría de los casos no es posible conse-guir una buena desinfección de los mismos.

3. Edad fisiológica. Este es un aspecto degran influencia en la morfogénesis. Comoregla general se puede decir que cuando másjoven e indiferenciado se encuentre elexplante a cultivar, mejor será su respuestain vitro. Es por ello que los meristemasapicales y axilares son ampliamente usadosen numerosas especies. En el caso de lamicropropagación de plantas leñosas, laedad del explante es un factor crítico. Si lostejidos son jóvenes, la micropropagación tie-ne mayores posibilidades de ser exitosa quecon tejidos maduros. Este hecho genera lanecesidad de realizar tratamientos de reju-venecimiento de las plantas dadoras deexplantes.

4. Tamaño. En general, cuanto más gran-de sea el explante mayores serán las posibili-dades de inducir la proliferación de callos o laregeneración directa de órganos. Sin embar-go, a mayor tamaño de explante tambiénson mayores las probabilidades de que loscultivos se contaminen con microorganismos.También es necesario tener en cuenta queexiste un tamaño mínimo del explante, quedepende de la especie y del material vege-tal, por debajo del cual no es fácil lograr elestablecimiento de los cultivos. Los explantesmuy pequeños suelen requerir del empleo demedios más complejos o de los denomina-dos medios acondicionados.

5. Epoca del año. Es un factor que sueletener mucha importancia en la micropropa-


gación y que generalmente está asociado algrado de dormición que presentan ciertosexplantes (yemas, por ejemplo) y tambiéncon la posibilidad de mayor o menor prolife-ración de microorganismos.

3 Asepsia

Uno de los principales problemas que sepresentan cuando se tratan de establecer loscultivos es el de la contaminación de los mis-mos con diversos tipos de microorganismos(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas,virus). El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones físicas deincubación es altamente propicio para la pro-liferación de muchos de estosmicroorganismos que pueden provocar ladestrucción de los cultivos. Es difícil cuantifi-car el impacto de estas pérdidas, pero enpromedio, en laboratorios dedicados a lamicropropagación se lo puede estimar en al-rededor del 10%. En el mejor de los casos,estos microorganismos no destruyen los cul-tivos pero compiten con el explante por losnutrientes del medio de cultivo o bien lomodifican. Es muy difícil conseguir cultivosestrictamente asépticos dado que en la ma-yoría de los casos es altamente probable quelos mismos contengan virus y fitoplasmas, porlo que en la práctica, cuando se refiere a cul-tivos asépticos, en general se quiere signifi-car que son cultivos donde no se produce laproliferación de hongos y bacterias.

Dos son las fuentes de contaminaciones:a) microorganismos presentes en el interioro en la superficie de los explantes y b) fallasen los procedimientos de cultivo en el labo-ratorio. La correcta detección de estas fuen-tes y del tipo de microorganismo son aspec-tos importantes para el éxito de los cultivos,pues por un lado ayuda a determinar la fuen-te de contaminación y por otro lado, ayudaa la planificación de los procedimientos paracontrolarlos. Varios géneros de bacterias(Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia,Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus,Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus,Mycobacterium, Corynebacterium) y dehongos filamentosos (Aspergillus,Penicilium, Fusarium, Alternaria,Cladosporium y Neurospora) están frecuen-temente en los cultivos . Es conveniente ins-

peccionar visualmente –con la ayuda de unmicroscopio estereoscópico– los cultivos enforma periódica (por lo menos semanalmen-te). También se pueden realizar pruebas conmedios de cultivo diferenciales y «test»bioquímicos específicos.

Para evitar y/o minimizar las contamina-ciones de los cultivos con microorganismoses necesario:

1)Conocer el material vegetal con que setrabaja y los posibles contaminantes especí-ficos.

2) Realizar una adecuada preparación dela planta dadora de explantes, cultivándolapreferentemente en invernaderos tratadascon productos químicos que eliminenpatógenos y eventuales microorganismosendófitos.

3) Proceder a la desinfección superficial delos explantes mediante el uso de compues-tos químicos con el objeto de eliminar losmicroorganismos con el menor daño posiblepara el explante. Si bien no es posible reco-mendar un procedimiento general, se pue-de señalar que el procedimiento más popu-larizado consiste en una doble desinfecciónmediante la inmersión de los explantes enetanol (70%v/v) durante 20-60 segundos se-guido de hipoclorito de sodio 1 -3%, conteni-do en el agua de lavandina comercial, duran-te 3 a 30 minutos, dependiendo de la natu-raleza del explante. Algunos procedimientosse basan en el empleo de únicamente etanolo de hipoclorito de sodio. Finalmente, esnecesario eliminar los restos de estos produc-tos mediante varios lavados con agua desti-lada estéril.

En este último punto hay que aconsejarque se utilice agua destilada estéril de recien-te preparación, dado que está demostradoque el almacenaje prolongado del agua es-téril puede ser la causa de contaminacionescon bacterias. Es aconsejable realizar estasoperaciones de desinfección superficial enuna cámara de transferencia con aire estéril.

En lugar del hipoclorito de sodio se pue-de utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o elcloruro de mercurio (0,1-1,5%). Es preciso re-comendar extrema cautela con el empleode este último compuesto, dado que es alta-mente tóxico y además no es removido confacilidad del explante.


En los casos en que no se utilice etanol, laadición de agentes tensoactivos junto con eldesinfectante es una práctica recomendada.Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01– 0,1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre-vio de los explantes con agua corriente ydetergentes, ayuda a una mejor desinfección.

La inmersión de los explantes en solucio-nes conteniendo sustancias antibióticas y /oantimicóticas (gentamicina, sulfato deestreptomicina, ampicilina, tetraciclina,carbenicilina, sulfato de gentamicina,pentacloronitrobenceno, rifampicina,anfotericina B, benomil, carbendazim) pue-de ser de utilidad, pero deben ser utilizadosen casos excepcionales. Estos productos tie-nen el inconveniente de que alteran la com-posición de los medios de cultivo y ademáspueden ser metabolizados por los explantes.Ultimamente han aparecido solucionesbiocidas que matan bacterias y hongos, pre-vienen la germinación de esporas y a altasconcentraciones pueden eliminar contamina-ciones de microorganismos endófitos. Unode estos compuestos es el PPM (PlantPreservative Mixture). Otro ejemplo es eldenominado G-1, un compuesto derivado delos furfurales de la caña de azúcar. Este com-puesto, químicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en laUniversidad Central de las Villas (Cuba) y tie-ne efecto bactericida y fungicida de amplioespectro.

En los casos en que se utilicen plántulascrecidas in vitro como plantas dadoras deexplantes, es necesario desinfectar las semi-llas para su cultivo y germinación y luego esaconsejable desinfectar también las plántulasresultantes.

En algunos materiales vegetales se utilizala preincubación de los explantes mediantelo cual éstos son desinfectados suavementey precultivados durante 24 horas en un me-dio conteniendo sacarosa, y finalmente sondesinfectados nuevamente y cultivados.

4)Emplear medios e instrumentos de cul-tivo esterilizados, es decir, liberados comple-tamente de cualquier microorganismo vivo oesporas. Para la esterilización, en la mayoríade los casos se hace uso del calor en sus di-versas formas: llama directa, calor húmedo(en forma de vapor abierto o bajo presión),calor seco (aire caliente). Se pueden usar hor-

nos a microondas. El agua caliente tambiénpuede ser usada. En el caso de sustanciastermolábiles, la esterilización se puede hacermediante filtración a través de filtrosbacteriológicos.

No es posible recomendar ningún siste-ma de esterilización dado que la exitosa des-trucción de los microorganismos depende demúltiples factores entre los que interesan eltamaño del recipiente, el tiempo de esterili-zación y la naturaleza de la sustancia a este-rilizar. Sin embargo, se pueden dar algunassugerencias:

• La esterilización en estufas mediantecalor seco (aire caliente) es recomendablepara esterilizar recipientes de vidrios secos(pipetas, cápsulas de Petri, tubos). En estoscasos, 2-4 horas en estufas a 180-200 ºC brin-dan excelentes resultados.

• La esterilización con calor húmedo convapor bajo presión (en autoclave o en una«olla a presión»), es el procedimiento másempleado para la esterilización de los mediosde cultivo (salvo, como se indicó más arriba,para aquellos que posean componentestermolábiles). En este caso, lo más común esusar una presión de 1.46 kg.cm-2 durante 20minutos, con lo que prácticamente se des-truyen todas las formas de vida. Es impor-tante que en todos los puntos del autoclavese alcance dicha temperatura, para lo cualhay disponibles cintas detectoras colorimétri-cas.

5)Cultivar los explantes en una cámara detransferencia con aire estéril («gabinete deflujo laminar»), localizada en un ambiente lim-pio y no expuesta a corrientes de aire. De nodisponer este equipamiento, se pueden sus-tituir con cuartos esterilizados previamentecon luz ultravioleta (nunca exponerse a la luzUV en forma directa). La mesada de trabajoy las paredes del gabinete deben ser desin-fectadas previamente con etanol al 70%. Dela misma manera deben ser desinfectadosexteriormente todos los recipientes (conte-niendo medios de cultivo, agua, etc.) que in-gresen en el área del aire estéril.

Los operarios constituyen frecuentemen-te una importante fuente primaria de con-taminación, por lo que es recomendable que,antes de comenzar a trabajar laven sus ma-nos y antebrazos con abundante agua y ja-bón y se desinfecten con etanol al 70 %. La


utilización de guardapolvos, guantes y más-caras protectoras de la boca y de la nariz, asícomo los gorros protectores de los cabellos,ayudan a reducir sensiblemente los niveles decontaminación.

Los instrumentos de trabajo (pinzas,pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri)deben ser esterilizados antes de su uso. Mu-chos de estos instrumentos pueden ser colo-cados en etanol al 95% y, antes de ser usa-dos, se deben flamear cuidadosamente enla llama de un mechero. También es necesa-rio flamear la boca de los recipientes que con-tienen los medios de cultivo antes y despuésde cultivar el explante.

6) Incubar los cultivos en cámaras o cuar-tos de cultivo, cerrados, libres de corrientesde aire y bien higienizados. En lo posible sedebe restringir la circulación de personas, ylos recipientes con cultivos contaminadosdeben ser rápidamente eliminados de estesector. Es conveniente que antes del lavado,estos cultivos sean esterilizados.

4 Medios de cultivo

Un medio de cultivo puede ser definidocomo una formulación de sales inorgánicas ycompuestos orgánicos requeridos para lanutrición y manipulación de los cultivos. Exis-ten numerosas formulaciones, cada una delas cuales comprende entre 6 y 40 compues-tos. Para dar una idea de la cantidad deformulaciones disponibles, George y col., lue-go de revisar más de 3.000 trabajos científi-cos describen en dos tomos (casi 1.000 pági-nas en total) más de 2.000 medios de culti-vo. También dos empresas multinacionalesofrecen para la venta más de 60 medios cadauna, listos para su utilización especialmenteen la micropropagación comercial de plantas.En la Tabla 1 se presentan tres medios queson muy usados en la actualidad.

Básicamente, los medios de cultivo secomponen de:

• ·Una fuente de carbono• ·Nutrientes minerales• ·Sustancias vitamínicas• ·Sustancias reguladoras del crecimiento• ·Agente gelificante (en el caso de me-

dios semisólidos)• ·Otros compuestos

Fuente de carbono: Prácticamente todoslos cultivos son heterótrofos (comparativa-mente unos pocos son autótrofos) y porende necesitan del suministro de una fuentede carbono. La sacarosa, en concentracionesde 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. Enalgunos medios se la reemplaza por glucosa.En casos particulares se cita el empleo demaltosa o galactosa. También myo-inositol(100 Mg/L) suele ser incorporado a los me-dios resultando un mejor crecimiento de loscultivos.

Nutrientes minerales: Los medios de cul-tivo deben suministrar los macro y micro-nutrientes esenciales para el crecimiento delas plantas enteras. En general se destacanlas concentraciones relativamente altas denitrógeno y potasio. El nitrógeno es suminis-trado en forma de amonio y/o nitrato. Tam-bién se pueden utilizar urea, glutamina y ca-seína hidrolizada. Es fundamental que el hie-rro sea incorporado conjuntamente con unagente quelante (Na2EDTA), lo que lo hacedisponible en un amplio rango de pH.

Sustancias vitamínicas: De todas las quecomúnmente se incorporan a los medios,pareciera que la tiamina es la única realmen-te imprescindible para el buen crecimiento delos cultivos.

Sustancias reguladoras del crecimiento:En la mayoría de los casos los medios utiliza-dos para el establecimiento de los cultivos con-tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA,Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN,ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (espe-cialmente GA3) son requeridas en algunasocasiones para el cultivo de meristemas opara la elongación de brotes. El ABA, es usa-do en algunos casos.

Agente gelificante (en el caso de me-dios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%)es el compuesto más utilizado. También pue-den emplearse «Agargel» (0,40-0,60%),«Transfergel» (2-2,60%), «Phytagel» (0,25-0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y «Gelrite»(0,10-0,20%).

Otros compuestos: Muchas sustancias,de variada composición química, suelen seradicionadas a los medios básicos. Además dela glicina, otros aminoácidos se pueden agre-gar a los medios. Es el caso de L-tirosina,asparagina y cisteína, aunque hay que tenerpresente que en dosis altas pueden inhibir el


crecimiento de los cultivos. El carbón activa-do (0,1 a 5%) suele ser incorporado al me-dio, dado que es probable que absorbametabolitos tóxicos para los cultivos.

En algunos medios se incorporan ácidosorgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvicoy el succínico y es frecuente el empleo de L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoyse siguen utilizando ciertas sustancias de com-posición química indefinida como el agua decoco (5 a 15%), jugo de tomate y puré debanana. También en ocasiones es necesariala incorporación de agentes antioxidantes (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona)para prevenir el ennegrecimiento tisular cau-sado por la oxidación de polifenoles presen-tes en los explantes. Este ennegrecimientopuede causar la muerte de los mismos.

La preparación de los medios de cultivopuede llevarse a cabo de diferentes mane-ras, en «lecturas recomendadas» se citanmanuales de laboratorio donde se describedetalladamente este punto.

calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, hu-medad atmosférica e higiene. Estas condicio-nes se logran con el empleo de cámarasclimatizadas o cuartos especialmente prepa-rados con aire acondicionado (frío-calor), unabuena y uniforme circulación de aire en el in-terior, dotados de un buen sistema de alar-ma para interrumpir la iluminación en casode no funcionar el aire acondicionado.

En general, los cultivos son incubados atemperatura constante de 25-28 ºC, con ci-clo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz esgeneralmente provista por lámparasfluorescentes del tipo «luz día» con unairradiancia de entre 50 y 200µmol.m-2.s-1.Lahumedad atmosférica debe ser elevada (80-90%).

6 Aclimatación de las plantasregeneradas in vitro.

Durante el período de incubación, los cul-tivos son expuestos a condiciones ambien-

tales disímiles al ambiente externo.La atmósfera interna se caracterizapor presentar una considerable varia-ción diurna en la concentración deCO2, humedad relativa elevada, tem-peratura constante e intensidadlumínica baja. A su vez, el medio decultivo compuesto por concentracio-nes elevadas de azúcares (en aque-llos sistemas heteró-trofos ysemiautótrofos de micropro-pagación), sales y reguladores del cre-cimiento, sumado a la ausencia demicroorganismos, generan anormali-dades morfológicas, anatómicas y fi-siológicas que las plantas deberán co-rregir cuando son transferidas al am-biente externo. Este período deadaptación al nuevo hábitat es llama-do fase o etapa de aclimatación.

La estrategia a implementarse du-rante el mencionado ciclo deberá con-templar el control minucioso de losparámetros ambientales (humedad,temperatura y luz) de tal manera quepermita disminuir la deshidratación y,

al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis conel objeto de generar un rápido crecimientode los plantines.

El retraso en el desarrollo de la cutícula yla escasa funcionalidad del aparato estomá-tico que presentan las hojas de la mayoría

Tabla 1: Composición de tres medios básicos usados en el cultivoin vitro de tejidos.

5 Condiciones ambientales para laincubación.

La incubación de los cultivos se debe lle-var a cabo en condiciones controladas. Porlo menos en lo que se refiere a temperatura,


de las especies cultivadas in vitro, determi-nan una alta tasa de transpiración que pue-de ocasionar la muerte por deshidratación.El control de este proceso fisiológico es devital importancia durante la aclimatación, te-niendo en cuenta que la disminución de latranspiración será gradual y dependerá de larehabilitación de los estomas, así como tam-bién del desarrollo de la cutícula. El equi-pamiento necesario estará sujeto a la espe-cie, pudiendo utilizarse desde túneles depolietileno para plantas que posean un ele-vado control de la transpiración (por ej.Malus pumila o Agave tequilana) o bien, através del empleo de cámaras climatizadas(Fig.1) equipadas con sensores que permitenun descenso paulatino de la humedad relati-va. En algunos casos puede resultar necesa-ria la aplicación exógena de ABA (hormonainvolucrada en el control del cierre de losestomas) o bien, el empleo de sustanciasantitranspirantes que forman una capasemipermeable en la superficie de la hoja. Eneste último caso deberán tomarse algunasprecauciones debido a que pueden observar-se reacciones de fitotoxicidad.

Resulta imprescindible evitar la exposicióna temperaturas extremas tanto en la faseaérea como en el substrato. Mediante elempleo de extractores y/o acondicionadoresde aire combinados con un sistema de nie-bla, es posible establecer la temperatura dela fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durantela estación estival, mientras que en la épocainvernal es necesario, a veces, el empleo demantas térmicas o serpentinas, sea de aguao aire caliente a nivel del substrato, paramantener la temperatura por encima de los18-20 ºC.

Sin lugar a dudas, la opción más econó-mica es el empleo de la luz natural, disminu-yendo su irradiancia (20-50%) mediante elagregado de mallas de sombreado («saram»).No obstante, en aquellas latitudes donde elnivel medio de luz natural es bajo y los díasson cortos durante una parte considerabledel año, la luz artificial puede ser aplicadacomo complemento de la luz natural. Las lám-paras tubulares fluorescentes del tipo «luzdía» son empleadas en horticultura para pro-longar el fotoperíodo. Asimismo, las lámpa-ras tubulares de sodio alta presión presen-

tan una distribución espectral de la energíaadecuada para estimular fotosíntesis y seemplean para tal fin en una amplia variedadde cultivos.

Otro aspecto importante a tener en cuen-ta lo constituye la elección del sustrato; sien-do el adecuado aquel que permita el normalcrecimiento y desarrollo de las raíces. Se pue-de emplear: arena, perlita, turba, vermiculita,o mezclas de ellos, teniendo la precaución derealizar una esterilización previa. Es conve-niente el agregado de fertilizantes, ya sea através del sustrato (fertilizantes de liberacióncontrolada) o bien, mediante el sistema deriego (fertilizantes solubles); empleándoseproporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15)y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán eldesarrollo radicular y la rustificación de lasplantas.

En todo momento deberá realizarse unriguroso control fitosanitario empleándoseantibióticos, fungicidas e insecticidas de usouniversal.

En la Figura 1, se detalla un modelo decámara de aclimatación diseñada por los au-tores y empleada por el Laboratorio de Cul-tivo de Tejidos del Instituto de Botánica delNordeste. Básicamente, está compuesta poruna fase aérea construida en aluminio ypolicarbonato alveolar (9) y un recipiente obatea (11) que contiene gránulos de arcillaexpandida a fin de facilitar el drenaje. Me-diante el agregado de arena u otro substratoadecuado, esta cámara puede ser utilizadatanto para el enraizamiento ex vitro de losbrotes obtenidos en la etapa de multiplica-ción, como así también, para el enraizamientoconvencional (a «raíz desnuda») de estacasde tallos u hojas.

La humedad relativa de la fase aérea escontrolada por un sensor (6) ubicado porencima de la tubería de riego (4). El sistemahumidificador está compuesto por picos tipo«fog» y es alimentado por una bomba debajo caudal y alta presión (13). Con el pro-pósito de evitar el goteo que pudiese oca-sionar el agua remanente en las cañerías, elsistema consta de una válvula solenoide dedescarga y desagüe (7). La fase gaseosa esrenovada en forma intermitente medianteel empleo de extractores ubicados en ambosextremos de la cámara (3) los que, conjunta-


mente, introducen o extraen aire, generan-do un movimiento masal.

Debido a la latitud geográfica en que seencuentra, la cámara está equipada con unacondicionador de aire (3000 frigorías) paraevitar situaciones de estrés térmico en épo-ca estival. A su vez, y dado que la mayoría delas especies estudiadas son originarias de cli-mas tropicales y subtropicales, el sistemacuenta con mantas térmicas que son coloca-das por debajo de los tubetes, mantenien-do la temperatura del substrato durante elinvierno. En este último caso se agrega unmaterial aislante entre la leca (10) y la mallade hierro (16) de tal manera de dirigir el calorhacia la fase aérea.

7 Agradecimientos

Los autores agradecenal Ing. Pablo F. Luna porla planificación digital dela cámara de aclimata-ción. A la Secretaría Gene-ral de Ciencia y Técnica(UNNE) y al Establecimien-to La Cachuera por elaporte financiero recibidopara construir la misma.

8 LecturasRecomendadas

GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK yH.J. GEORGE. 1987. Plant CultureMedia . Vol. 1 (Formulations andUses). Exegetics Limited.England. 567 pág.

GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK yH.J. GEORGE. 1988. Plant CultureMedia . Vol. 2 (Commentary andanalysis). Exegetics Limited.England. 420 pág.

HURTADO, D.V. y MERINO, M.E.1991. Cultivo de TejidosVegetales. Ed.Trillas. México. 232pág.

PÉREZ PONCE, J.N. 1998.Propagación y Mejora Genéticade Plantas por Biotecnología.Instituto de Biología dePlantas.Santa Clara. Cuba. 390pág.

POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S.PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagatedplants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.

ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edición).Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos yaplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pág.

TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura deTecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.1)Embrapa. Brasil.509 pág.

TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura deTecidos e Transformacao Genética de Plantas. (Vol.2)Embrapa. Brasil.355 pág.

Figura 1: Diseño de una CÁMARA DE ACLIMATACIÓN


II.-Capítulo 3

Herramientas básicas de ingenieríagenética

Gómez, Marisa; Echenique, Viviana

1 Introducción

Hasta aproximadamente 1970 el ADN erala molécula de la célula que planteaba másdificultades para su análisis bioquímico. Exce-sivamente larga y químicamente monótona,la secuencia de nucleótidos del ADN sólopodía ser estudiada por caminos indirectos,tales como la determinación de la secuenciade proteínas, del ARN o por el análisisgenético. Actualmente es posible separar re-giones determinadas del ADN, obtener can-tidades ilimitadas de esos fragmentos y de-terminar incluso la secuencia de esosnucleótidos. Estos adelantos técnicos formanparte de la tecnología del ADN recom-binante, constituida por una mezcla de téc-nicas, algunas de las cuales son nuevas, perootras son adaptaciones de procesos natura-les de la genética microbiana que han sidoestudiados y se conocen en profundidad.

2 Genética microbiana

En los procariotas existen mecanismos deintercambio genético que permiten tanto latransferencia de genes como la recombina-ción. La recombinación genética en procario-tas ocurre porque se transfieren fragmentosde ADN homólogos desde un cromosomadonador a una célula receptora por uno deestos tres procesos:

• Transformación: es un proceso porcual el ADN libre del medio ambiente se in-corpora en una célula receptora, trayendoaparejado un cambio genético. Esto ocurresólo en algunas especies bacterianas. El mo-vimiento de las moléculas de ADN a travésde la membrana y dentro del citoplasma dela célula receptora es un proceso activo, querequiere energía. Una célula que es capaz detomar una molécula de ADN y ser transfor-mada se dice que es competente. Estas célu-las secretan el factor de competencia, que es

una pequeña proteína que induce la síntesisde 8 a 10 nuevas proteínas requeridas parala transformación.

• Transducción: es un proceso por el cualel ADN se transfiere de una célula a otra pormedio de un virus (que en el caso dehospedadores bacterianos se denominafago). Puede ocurrir de dos maneras. En lallamada transducción generalizada, unafracción del ADN celular, que puede proce-der de cualquier porción del genoma delhospedador, pasa a formar parte del ADNde la partícula vírica madura, reemplazandoal genoma del fago. En la transducción es-pecializada, que ocurre sólo en algunos fagosatemperados (aquellos que se integran en elgenoma como parte de su ciclo biológico), elADN de una región específica del cromosomadel hospedador se integra directamente enel genoma del fago, reemplazando algunosde sus genes. En ambos casos, la partículavírica transductora es normalmente defectivacomo virus, ya que los genes víricos han sidoreemplazados. No todos los fagos puedentransducir, ni todas las bacterias sontransducibles. Pero el fenómeno está lo sufi-cientemente extendido para suponer quedesempeña un importante papel en lastransferencias genéticas que se producen enla naturaleza.

• Conjugación: es un proceso de trans-ferencia genética que requiere contacto decélula a célula y que está mediado por unplásmido. Consiste en la transferencia deuna copia de este plásmido al nuevohospedador. Sin embargo, otros elementosgenéticos resultan a veces movilizados duran-te la conjugación, como pueden ser otrosplásmidos o grandes bloques del cromosomadel hospedador. La conjugación requiere unacélula donadora, que contiene un tipo parti-cular de plásmido conjugativo, y una célulareceptora que carece de él. El contacto serealiza a través del filamento o pelo sexual,que permite el apareamiento específico y queposeen sólo las células donadoras. Constitu-ye un puente de conjugación a través delcual pasa el ADN.

3 La clonación molecular

El desarrollo de la tecnología del ADNrecombinante y la clonación molecular han

44 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

aportado sofisticados procedimientos quepermiten el aislamiento, purificación yreplicación de fragmentos específicos deADN. La finalidad de la clonación moleculares aislar gran cantidad de genes específicos,en forma pura. El procedimiento implica esen-cialmente dos etapas (Fig 1):

• Creación del ADN recombinante, queconsta de dos pasos:

1) Aislamiento del ADN de partida. Estepuede ser ADN genómico, ADN sintetizadoa partir del ARNm por transcripción reversa(ADNc por «copia»), ADN amplificado porla reacción en cadena de la polimerasa o sin-tetizado in vitro. Si se parte de ADNgenómico, generalmente se corta conenzimas de restricción para obtener los frag-mentos a clonar.

2) Unión de los fragmentos de ADN a unvector de clonación utilizando una ligasa deADN. Un vector es una molécula de ADN quevehiculizará al fragmento de interés. Losvectores de clonación están diseñados deforma tal que permiten la recombinación deADN foráneo en un sitio de restricción delvector, sin afectar su replicación. A fin de se-leccionar las células que incorporaron el vector,el mismo lleva genes marcadores (por ejem-plo un gen de resistencia a antibióticos).

• Introducción del ADN en una célulahospedadora donde se replicará (amplifi-cación): éste es realmente el verdadero even-to de clonación, en el cual el ADNrecombinante es multiplicado para producirvarias copias idénticas. Involucra tres pasos:

1) Introducción y mantenimiento delADN recombinante en un organismohospedador. La molécula de ADNrecombinante se introduce en el organismohospedador, que puede ser procariota (bac-terias) o eucariota (levaduras, células de ma-míferos cultivadas). En el caso de la utiliza-ción de sistemas bacterianos, la introducciónse realiza por los procesos naturales de lagenética microbiana (transformación,transducción, conjugación) o modificacionesespecíficas de los mismos. También se utilizaampliamente la introducción del ADN me-diante electroporación (descargas eléctricasque crean poros en la membrana celular per-mitiendo la introducción del ADN).

2) Detección y purificación del clon desea-do. La transferencia del ADN al hospedador

a menudo genera un grupo de clones queportan el vector. A fin de separar las célulasque incorporaron el plásmido de las que nolo hicieron se inoculan las células en un me-dio sólido (agarificado) que contiene el anti-biótico al cual son resistentes las células queposeen el vector. Sólo éstas sobrevivirán. Lue-go deberá buscarse específicamente aquellascélulas que poseen el fragmento de interés.Para ello puede utilizarse la reacción en ca-dena de la polimerasa (PCR) o la hibrida-ción molecular con una sonda específica.

3) Crecimiento y amplificación de las cé-lulas hospedadoras que incorporaron el ADNrecombinante deseado para su aislamiento,estudio, etcétera

ADN foráneoa insertar

Ligación

Vectorplasmídico Gen de resistencia

a antibiótico

Molécula de ADNrecombinante

Introducción en lacélula hospedadora

Selección de las células que contienen moléculas de ADNrecombinante por crecimiento en presencia de antibiótico

Figura 1: Pasos básicos en la clonación de unfragmento de ADN..... En primer lugar el ADN a clonar yel vector (plásmido) se cortan con la misma enzima derestricción. Luego se ponen en contacto en presencia deuna ligasa para obtener una molécula de ADNrecombinante que se introduce en bacterias quemultiplicarán el plásmido junto con el fragmento deinterés (Modificado de Watson y col., 1992).


4 Herramientas y procedimientosimplicados.

• Endonucleasas de restricciónLa habilidad para clonar cualquier gen o

secuencia de ADN de interés, depende, engran medida, de un tipo especial de enzimasdenominadas endonucleasas de restricción,que son enzimas que cortan la molécula deADN en sitios específicos denominados sitiosde restricción. Estas enzimas reconocen se-cuencias específicas de 4 a 8 bases. Las di-ferentes endonucleasas de restricción sonproducidas por distintos microorganismos,para los cuales constituyen un mecanismo dedefensa contra el ataque de fagos. Cuandoel ADN de un fago ingresa en la célulabacteriana, ésta lo degrada gracias a su ba-tería de enzimas de restricción. Para prote-ger su propio ADN, las bacterias contienenenzimas (metilasas) que se encargan demodificar (metilar) ciertas bases en los sitiosque reconocen sus propias enzimas de res-tricción, de manera que ya no pueden reco-nocer dichos sitios de clivaje. La metilaciónocurre rápidamente después de la replicación,catalizada por metilasas producidas por elmicroorganismo.

Las enzimas de restricción se denominanutilizando la primera letra del género y lasdos primeras letras de la especie que la pro-duce, seguidas por un número que indica elorden en que han sido identificadas lasenzimas correspondientes a la misma espe-cie (Tabla 1). Una interesante característicade las enzimas de restricción es que común-

mente reconocen secuencias de ADN que sonpalíndromes (conjunto de caracteres que selee de igual manera de derecha a izquierdaque de izquierda a derecha). Además produ-cen cortes en las dos cadenas. Muchasenzimas de restricción están compuestas dedos unidades idénticas, cada una de las cua-les reconoce y corta una de las cadenas.Como las secuencias reconocidas son relati-vamente cortas y frecuentemente palindró-micas, tales enzimas siempre hacen cortes enADN bicatenarios y tales cortes no están su-jetos a corrección por enzimas de reparación.Gracias a este mecanismo pueden destruir elADN extraño.

Ciertas enzimas como EcoRI producencortes escalonados que crean colas cortas decuatro bases de cadena simple en cada ex-tremo del fragmento. Estas colas tienden aasociarse a una cadena complementaria porapareamiento de bases, por eso se denomi-nan extremos cohesivos o pegajosos(«sticky ends») (Fig. 2 A). Los extremoscohesivos pueden unirse permanentementea secuencias complementarias de otro frag-mento con colas producidas de la mismamanera (corte con la misma enzima), adicio-nando la enzima ADN ligasa, que cataliza laformación de nuevos puentes fosfodiésteresy las apropiadas condiciones de renaturaliza-ción. Esta cohesividad permite unir fragmen-tos de ADN no homólogos, una característi-ca de relevancia para la creación del ADNrecombinante.

Existe otro tipo de enzimas de restricción,como HindII, que cortan el ADN en el centro

Organismo Designación Secuencia Nota

Bacillus subtilis BsuRI 5’..GG�CC..3’

3’..CC�GG..5’

Genera extremos romos

Escherichia coli EcoRI 5’..G�AATTC..3’

3’..CTTAA�G..5’

Genera extremoscohesivos

Escherichia coli EcoRII 5’..�CCAGG..3’

3’..�GGTCC..5’

No palindrómica

Escherichia coli EcoRV 5’..GAT�ATC..3’

3’..CTA�TAG..5’

Genera extremos romos

Haemophilusinfluenzae

HindII 5’..GTPy�PuAC..3’

3’..CAPu�PyTG..5’

Pu: cualquier purinaPy: cualquier pirimidina

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restricción de diferentes endonucleasas de restricción


de la secuencia de reconocimiento (en el mis-mo punto, en ambas cadenas) produciendoextremos romos («blunt-ends»), es decir quelas bases están apareadas en sus extremos,y por lo tanto no presentan tendencia paraunirse con las bases complementarias (Fig. 2B). Esto puede solucionarse adicionando ex-tremos cohesivos por medio de la transfera-sa terminal, enzima que permite adicionarcolas de «poliA» o «poliT», que se comporta-rán como extremos cohesivos (Fig. 2 C).

• Vectores de clonaciónComo se mencionara más arriba, un

vector es una molécula de ADN quevehiculizará al fragmento de interés y permi-tirá su amplificación. Los vectores declonación más utilizados derivan del genomaviral o de plásmidos bacterianos. Un vectorde clonación tiene tres componentes esen-ciales:

1. Un origen de replicación2. Un gen marcador fácilmente seleccio-

nable3. Al menos un sitio único de restricción

Los vectores de clonación de última ge-neración son muy prácticos y sencillos demanejar. Incluyen un sitio múltiple declonación o sitio de restricción múltiple(«polylinker»), que es un segmento corto deADN con muchos sitios de restricción diferen-tes, cada uno de ellos único para el vector(Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte delmarco abierto de lectura («ORF») de un genresponsable de alguna característicafenotípica, por lo que resulta sencillo confir-mar si tras la restricción y ligado se ha inser-tado efectivamente un fragmento de ADN,ya que la inclusión de este interrumpe la se-cuencia del vector, lo cual redunda en la pér-dida de funcionalidad del gen medianteinactivación por inserción.

Los vectores pueden clasificarse de la si-guiente manera:

A) Plásmidos: son moléculas de ADN cir-cular, de doble cadena, extracromosómicas,presentes en las bacterias, que poseen pro-piedades muy útiles como vectores de clona-ción:

Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restricción..... a. Corte en secuencias palindrómicasoriginando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de laenzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporación de extremos cohesivos a un fragmento deextremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).


1. Pequeño tamaño que permite mayorfacilidad de aislamiento y manipulación.

2. Son circulares, lo que hace que el ADNsea más estable durante su aislamiento quí-mico.

3. Su replicación transcurre independien-temente del ADN nuclear en la célula bacte-riana.

4. Existen múltiples copias en la célula,dependiendo del plásmido y de la especiehospedadora, puede haber de varias a nu-merosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copiasde pBR322 por célula).

5. La presencia de genes de resistenciaa los antibióticos que actúan como marca-dores seleccionables facilita la detección yselección de los clones que los contienen.

6. El tamaño de los insertos que se pue-den clonar puede ser considerable; sin em-bargo, si son mayores de 10 kb, el plásmidose hace generalmente inestable.

Figura 3: Vectores de clonación. a. Sitio de restricciónmúltiple: corto segmento de ADN con varios sitios derestricción, cada uno de ellos único para el vector. b.Plásmido pBR322 con los sitios de restricción de BamHIy PstI dentro de los genes marcadores (genes deresistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente).(Modificado de Watson y col., 1992).

Aunque en el ambiente natural losplásmidos conjugativos generalmente setransfieren por contacto célula a célula, losplásmidos vectores de clonación generalmen-te han sido modificados a fin de evitar sutransferencia por conjugación y así lograr sucontención biológica. Sin embargo, en ellaboratorio es posible realizar la transferen-cia a la célula hospedadora por transforma-ción, utilizando choque de calor, o porelectroporación.

Los primeros plásmidos utilizados comovectores de clonación existían en forma na-tural. El plásmido pBR322 constituye una ge-neración posterior de vectores construidos invitro (Fig 3 B). En este plásmido, el sitio derestricción de BamHI está dentro del gen deresistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstIestá dentro del gen de resistencia a laampicilina. Si se inserta un trozo de un ADNen uno de estos sitios, la resistencia al anti-biótico conferida por el gen que contieneeste sitio se pierde (inactivación por inserción).Por tanto, cuando pBR322 es digerido conBamHI y se liga a un ADN, y luego se aíslanlos clones transformados, aquellostransformantes que posean resistencia a latetraciclina y ampicilina no portan ningúnADN clonado. Aquellas células que continúansiendo resistentes a la ampicilina pero sensi-bles a la tetraciclina, contienen el plásmidocon el fragmento del ADN clonado. Como laresistencia a la ampicilina y a la tetraciclinapueden determinarse independientementeen placas con agar, resulta fácil aislar bacte-rias que contengan los clones deseados y eli-minar las células que no los contengan.

B) Bacteriófagos o fagos:Fago λ: tiene un mapa genético comple-

jo. Se conoce la secuencia completa de sus48.502 pares de nucleótidos y la función desus genes. El tercio central del cromosomacontiene genes que son requeridos para lalisogenia (estado integrado) pero no para elciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partí-culas virales). Esa parte central (de aproxima-damente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restricción y subs-tituida por un fragmento de ADN foráneo(Fig. 4 A). La molécula resultante de ADNrecombinante puede ser empaquetada enlas cabezas del fago in vitro. Las partículas


del fago pueden inyectar el ADNrecombinante en E. coli, que se replica pro-duciendo colonias bacterianas que contienenlos fragmentos a clonar.

El fago l silvestre no es indicado comovector de clonación porque tiene demasia-dos sitios para enzimas de restricción. Paraobviar esta dificultad se han construído fagosl modificados (Charon), en los cuales los si-tios de restricción no deseados han sido al-terados de manera tal que la correspondien-te enzima no los reconozca.

Es un vector de clonación particularmen-te útil porque:

1. Se conoce bien su estructura, secuen-cia y funcionamiento

2. Puede insertar mayor cantidad de ADNque la mayoría de los plásmidos (entre 10 y20 kb)

3. El ADN puede ser eficientemente em-paquetado in vitro dentro de las partículasdel fago

4. Las partículas del fago son mucho máseficientes en la infección de las célulashospedadoras (transfección) que la trans-formación.

Fago M13: es un fago filamentoso quecontiene ADN monocatenario y se replica sinmatar a su hospedador. Para poder utilizarlocomo vector de clonación es necesario dis-poner de una forma bicatenaria, ya que lasenzimas de restricción sólo trabajan sobreADN de doble cadena. El ADN bicatenariode M13 puede obtenerse de células infecta-das, donde se encuentra en formareplicativa bicatenaria. La mayor parte delgenoma del tipo silvestre contiene informa-ción genética esencial para la replicación. Exis-te, sin embargo, una pequeña región llama-da secuencia intergénica que puede ser uti-lizada como sitio de clonación. Es posibleclonar ADN de longitudes variables (hasta5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADNmonocatenario de M13 y de sus vectoresderivados ha sido extremadamente útil parasecuenciar ADN.

Tanto en el fago l como en M13 se hainsertado un fragmento funcional de lacZ, elgen de E. coli que codifica para la enzima β-galactosidasa (β-gal), que es utilizado comogen marcador. En el inicio de este gen se hainsertado un sitio múltiple de clonación. Porlo tanto, los fragmentos de ADN clonadosen el «polylinker» interrumpen el gen lacZ y

anulan la actividad de la β-galactosidasa.Cuando esta enzima hidroliza un compues-to químico denominado X-gal, se libera uncolorante azul relativamente insoluble. El X-gal se incorpora al medio de cultivo en placade Petri, donde crecerán las célulashospedadoras del ADN recombinante. Si elADN clonado se insertó en el polylinker ydesactivó la β-galactosidasa, no se produci-rá pigmento azul y las células formarán co-lonias que se verán blancas en la placa dePetri. En caso contrario, las colonias de lascélulas hospedadoras se verán de color azul.

Figura 4: Vectores de clonación..... a. Utilización delfagoλ. 1. Dos sitios de restricción EcoRI en el ADN delfagoλ. 2. Región central no esencial del fago 3. El ADNforáneo puede reemplazar al segmento no esencial delADN del fago 4. Unión con ADN ligasa, se eligen lascondiciones para que el ADN híbrido tenga la longitudadecuada para ser empaquetada dentro de la partículadel fago y 5. Empaquetamiento del ADN híbridoañadiendo extractos celulares que contengan laspartículas de la cabeza y cola para permitir la formaciónde partículas viables del fago. b. Cromosoma artificialde levadura (YAC). ARS: origen de replicación, CEN:centrómero, TEL: telómeros, URA. gen marcadorseleccionable par el desarrollo en medio con uracilo.Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomasartificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith etal., 2000).

a

C


C) Cósmidos:Son vectores híbridos, que combinan las

características ventajosas de los plásmidosbacterianos y del fago λ. Cos proviene desitio cohesivo («cohesive site»), en referen-cia a las secuencias terminales de simple ca-dena de 12 bases complementarias en elcromosoma de λ maduro. El sitio cos es re-conocido por el sistema de empaque-tamiento de ADN de λ, que hace cortes es-calonados que originan los extremoscohesivos complementarios en el cromosomamaduro del fago. Poseen la habilidad delplásmido para replicarse autónomamente enlas células de E. coli y la capacidad deempaquetamiento in vitro del cromosomade λ. Contienen el origen de replicación y losgenes de resistencia a los antibióticos de suplásmido parental. La principal ventaja de loscósmidos como vectores es su habilidad parainsertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

D) Fásmidos (fagémidos):Son vectores que combinan las caracte-

rísticas de un fago filamentoso (M13) y unplásmido (pBR323) y contienen tanto el ori-gen de replicación del fago como delplásmido. Normalmente la replicación depen-de del plásmido, pero cuando una célula quecontiene un fásmido se infecta con un fagode tipo silvestre, el origen del fago es respon-sable de la replicación y se generan copias

monocatenarias. Este ADN monocatenarioes empaquetado en viriones y puede aislar-se fácilmente y ser utilizado para secuenciar.Habitualmente, los fásmidos pueden trans-portar de forma estable un fragmento deADN clonado mayor que un vector típicoderivado de M13.

E) Cromosomas artificiales:Estos vectores se desarrollaron con el

objetivo de clonar grandes segmentos decromosomas eucarióticos. En la preparaciónde mapas físicos de genomas se utilizanvectores como los cósmidos, los YAC(cromosomas artificiales de levaduras), losBAC (cromosomas artificiales de bacterias) ylos PAC (cromosomas artificiales basados enel fago P1).

Los YAC son minicromosomas de leva-dura creados por ingeniería genética quepueden contener insertos de ADN de 200 a500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen dereplicación y un centrómero de levadura, dostelómeros en los extremos del cromosoma,un marcador seleccionable y un sitio múlti-ple de clonación.

Los BAC se basan en el plásmido F de7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BACy los PAC aceptan fragmentos menores quelos YAC tienen algunas ventajas:

Figura 5: Método de hibridación de Southern. a. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. b. las moléculas de ADNmigran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma, c. transferencia de las moléculas de ADN del gel a unamembrana por capilaridad (S. Solución tampón, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:papel de filtro y peso), d. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN, f: detección porautorradiografía, contacto de la membrana con el filme autorradiográfico, g: revelado de la autorradiografía,observación de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).


1. Son menos complejos y por lo tantomás fáciles de construir. Pueden amplificarseen bacterias y manipularse con la tecnologíabásica de los plásmidos bacterianos.

2. Contienen menor cantidad de insertoshíbridos (insertos compuestos por dos o másfragmentos no contiguos en el genoma) quelos YAC. Estos insertos híbridos pueden en-torpecer los intentos de ordenar los clones

Por estos motivos los BAC han reempla-zado a los YAC como vectores en la construc-ción de mapas físicos de cromosomas ente-ros.

Estos vectores simplifican mucho el pro-ceso de secuenciación, ya que aún organis-mos simples como el nemátodoCaenorhabditis elegans poseen enormescantidades de ADN (100 Mb). En este casose necesitarían 2.500 cósmidos para conte-ner el genoma completo (el inserto prome-dio de un cósmido es de 40 kb). Los YACpueden aceptar 1Mb, por lo cual el procesose simplifica.

5 Análisis molecular de ADN, ARN yproteínas: hibridación.

La hibridación es la construcción artifi-cial de un ácido nucleico bicatenario porapareamiento (emparejamiento) de basescomplementarias de dos ácidos nucleicosmonocatenarios. Para que exista la formaciónde híbridos estables debe haber un alto gra-do de complementaridad. Se define formal-mente como sonda («probe») a un fragmen-to determinado de ARN o ADN marcadoquímica o radiactivamente, utilizado para lo-calizar determinadas secuencias de ácidosnucleicos mediante hibridación.

• Análisis de ADN por hibridacionesSouthern Blot

La electroforesis en gel es una podero-sa herramienta para separar macromoléculasde diferentes tamaños y cargas. Las molécu-las de ADN tienen esencialmente una cargaconstante por unidad de masa, por lo tan-to se pueden separar en geles de agarosa oacrilamida, casi completamente, sobre la basede su tamaño o conformación. Los geles deagarosa o acrilamida actúan como tamicesmoleculares, retardando el pasaje de lasmoléculas más grandes en relación con lasmás pequeñas. Los geles de agarosa actúan

como mejores tamices para las moléculas másgrandes, mientras que los de acrilamida se-paran mejor las moléculas pequeñas. Los pro-cedimientos utilizados, para separar ácidosnucleicos y proteínas tienen el mismo princi-pio, pero involucran algunas diferencias detécnicas debidas a las características particu-lares de cada clase de moléculas.

En 1975 E. M. Southern, publicó un nue-vo procedimiento que permitió a los investi-gadores ubicar los genes y otras secuenciasde ADN sobre fragmentos de restricciónseparados por electroforesis en gel. La prin-cipal característica de esta técnica es la trans-ferencia de las moléculas de ADN que hansido separadas por electroforesis en gel a unamembrana de nylon o nitrocelulosa. Estatransferencia se denomina Southern Blot, enhonor al científico que desarrolló la técnica(Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnatura-lizado (abierto en sus dos cadenas), sea an-tes o durante la transferencia, ubicando elgel en una solución alcalina. Una vez comple-tada la transferencia, el ADN es inmovilizadosobre la membrana por exposición a eleva-da temperatura o a radiación UV. Una son-da de ADN conteniendo la secuencia de in-terés es entonces incubada con el ADN in-movilizado. La sonda sólo va a hibridar conmoléculas de ADN que contienen la secuen-cia de nucleótidos complementaria a su se-cuencia. El excedente de sonda no hibridadase elimina mediante repetidos lavados de lamembrana. Las sondas pueden marcarse pordiferentes métodos: con elementos radio-activos, por métodos químicos que produ-cen color o luminiscencia, etc. Luego de lahibridación, la membrana se somete a dife-rentes procedimientos para poner en eviden-cia la sonda, de acuerdo al método con elque haya sido marcada.

• Análisis de ARN por transferencia ehibridación: Northern Blot

De manera similar al tratamiento realiza-do con las moléculas de ADN, las moléculasde ARN también pueden ser separadas porelectroforesis en geles de agarosa, transferi-das a membranas y analizadas. La transfe-rencia de ARN se denomina Northern blot,en reconocimiento al hecho de que el proce-dimiento es la imagen de espejo de la técni-ca Southern blot.

Ambos procedimientos son esencialmen-


Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva latemperatura de la reacción para separar las hebras de ADN (1) y a continuación la temperatura baja nuevamente, loque permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entoncesse ensamblan, actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva latemperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nuevacomplementaria (4). Después de varios ciclos se obtienen múltiples copias del fragmento en cuestión. b) La PCR esuna reacción donde el número de copias del gen de interés crece exponencialmente. c) Verificación de un productode PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases(bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 falló la amplificación y en la calle 5 se hanformado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el genoma.


te idénticos. Sin embargo, las moléculas deARN son muy sensibles a la degradación porARNasas. Por lo tanto, se debe tener muchaprecaución para evitar la contaminación delos materiales con estas enzimas. Además, lamayoría de las moléculas de ARN contienenestructuras secundarias (producidas porapareamiento complementario intracade-nas), por lo tanto deben mantenerse des-naturalizadas durante la electroforesis parapoder separarlas sobre la base de su tama-ño. La desnaturalización se provoca incorpo-rando formaldehído u otro químicodesnaturalizante a la solución tampón («bu-ffer») utilizada en la electroforesis. Despuésde la transferencia a la membrana apropia-da, las moléculas de ARN pueden hibridar consondas de ADN o ARN.

• Análisis de proteínas por transferen-cia e inmunodetección o Western Blot

La electroforesis en gel de poliacrilamidaes una herramienta muy importante para laseparación y caracterización de proteínas.Debido a que muchas de las proteínas estáncompuestas por dos o más subunidades, lospolipéptidos individuales son separados porelectroforesis en presencia del detergentedodecil sulfato de sodio (SDS), que desna-turaliza las proteínas. Los polipéptidos sepa-rados por electroforesis también pueden sertransferidos del gel a una membrana de ni-trocelulosa y pueden ser detectados utilizan-do anticuerpos específicos. Esta transferen-cia de proteínas se denomina Westernblotting y se realiza utilizando una corrienteeléctrica para trasladar las proteínas del gel ala superficie de la membrana. Después de latransferencia, la proteína de interés es iden-tificada colocando la membrana con las pro-teínas inmovilizadas en una solución que con-tiene un anticuerpo contra esa proteína. Elanticuerpo está conjugado (marcado) ya seacon isótopos radioactivos, que permiten ladetección por autorradiografía, o conenzimas que producen un producto visiblecuando se adiciona el sustrato correspondien-te.

6 La reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

La PCR es una tecnología poderosa queinvolucra la síntesis enzimática in vitro de

millones de copias de un segmento especí-fico de ADN. La reacción se basa en la hibri-dación y extensión de un par de oligonu-cleótidos, sintetizados artificialmente, utiliza-dos como iniciadores o cebadores (primers)que delimitan una secuencia de ADN de do-ble cadena que se desea amplificar.

Un ciclo de PCR comprende tres etapas(Fig. 6): desnaturalización de la doble ca-dena, unión de una secuencia de ADN (pri-mer) a la hebra simple y replicación delADN a partir del primer. La doble cadenade ADN se desnaturaliza por elevación de latemperatura a 92-95º°C. Luego la tempera-tura se baja rápidamente a 35-60ºC, depen-diendo del tamaño y secuencia del oligonu-cléotido utilizado, permitiendo la hibridaciónADN-ADN de cada primer con las secuenciascomplementarias que flanquean la regiónobjetivo. Luego, se eleva la temperatura a72º °C para que la Taq polimerasa (una ADNpolimerasa termoresistente aislada deThermus aquaticus, bacteria que vive enfuentes termales) realice la replicación a par-tir de cada extremo 3´ de los primers. Esteciclo es repetido por algunas decenas de ve-ces y, como el producto de cadapolimerización sirve como molde para el si-guiente, cada ciclo duplica la cantidad deproducto del anterior. El resultado de la re-acción es un fragmento de ADN de doblecadena, cuyos extremos corresponden a losextremos 5´ de los primers y su tamaño a ladistancia entre los mismos. A pesar de quese forman moléculas más largas a partir delmolde original en cada ciclo, se acumulan soloa una tasa lineal y no contribuyen signifi-cativamente a la masa final de secuencia blan-co.

Después de apenas 20 ciclos se logra másde un millón de veces la cantidad inicial dela secuencia de interés. Esta escala de ampli-ficación permite, por lo tanto, iniciar el pro-ceso con cantidades mínimas de ADN (delorden de pico o nanogramos) y terminar lareacción con grandes cantidades de una se-cuencia de interés. La versatilidad de estareacción es enorme y la combinación de laPCR y la secuenciación constituye una pode-rosa herramienta para el análisis de genes.

La tecnología de PCR es de suma utilidadpara amplificar ADN a partir de fragmentosclonados en distintos vectores. Solo se nece-


sita un par de iniciadores complementarios alos sitios del vector que flanquean el fragmen-to para amplificar cualquier fragmento inde-pendientemente de su secuencia. Puedeamplificarse ADN de material embebido enparafina por varios años, de material momi-ficado, de restos fósiles, etc. Se utiliza paradetectar enfermedades genéticas, determi-nar el sexo en embriones humanos, paraclonar genes, para mutagénesis in vitro y paramapeo y secuenciación de genomas, entreotras aplicaciones.

• RT-PCRLa reacción de PCR en unión con la trans-

cripción reversa (RT-PCR) puede ser utiliza-da para el estudio de ARNm casi a nivel deuna célula individual. Esta técnica puede utili-zarse para determinar la presencia o ausen-cia de un transcripto, para estimar el nivelde su expresión y para el clonado de ADNcsin la necesidad de construir una genoteca.Consiste en la síntesis de una cadena de ADNa partir de ARNm por medio de latranscriptasa reversa (enzima extraída devirus tumorales cuyo material genético esARN), que utiliza ARN como molde para sin-tetizar una hebra de ADN. La cadena com-plementaria se sintetiza por PCR .Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten te-ner cantidades apropiadas del ADNc paradiversas manipulaciones genéticas.

• PCR cuantitativaLa clave en la PCR cuantitativa es la posi-

bilidad de detectar el nivel de amplificaciónde una secuencia de interés, con el objetode estimar la cantidad de esa secuencia en lamuestra original. Para llevar a cabo esta de-tección existen varios métodos pero casi to-dos basados en la utilización de otro frag-mento de ADN (sonda) complementario auna parte intermedia del ADN que se quiereamplificar. Esta sonda lleva adherida unamolécula fluorescente y otra molécula queinhibe esta fluorescencia («quencher»), detal forma que sólo cuando la sonda es des-plazada de su sitio por acción de la ADNpolimerasa la molécula fluorescente se libe-ra de la acción del «quencher» y emite fluo-rescencia al ser iluminada con un láser. Lafluorescencia detectada durante cada ciclode la PCR será proporcional a la cantidadde ADN que se está amplificando. En gene-

ral para que sea válida esta técnica requiererealizar en paralelo una curva patrón en lasmismas condiciones para conocer la cantidadtotal de ADN que se está amplificando. Exis-ten varios tipos de PCR cuantitativa. La másmoderna y sofisticada es la llamada PCR entiempo real.

• PCR en tiempo realLa PCR en tiempo real es una técnica que

ha ganado mucha importancia en los últimosaños debido a que ofrece la posibilidad decuantificar el número de copias de untransgen incorporadas en un genoma.Como se explicara más arriba, se basa en ladetección de un informador fluorescentecuya señal aumenta en proporción directacon la cantidad de producto de PCR en lareacción. Se emplea un ciclador térmico quetiene acoplado un sistema de detección ca-paz de captar y cuantificar la señal emitidapor el informador al final de cada ciclo. Sepueden utilizar diferentes reactivosfluorescentes como agentes intercalantes(SYBR green®) que se unen a la doble cade-na de ADN dando un incremento de la fluo-rescencia a medida que aumenta la cantidaddel producto de PCR. También se puedenemplear sondas que tienen unidas unfotocromo informador y un fotocromo«quencher» (TaqMan®). Cuando ambosfotocromos están unidos a la sonda, el infor-mador no emite señal, pero cuando éstahibrida con la secuencia de interés, durantela reacción de PCR, la enzima Taq polimerasa,mediante su actividad de exonucleasa, clivaal fotocromo informador, liberándolo delresto de la sonda y permitiendo la emisiónde una señal fluorescente. Se monitorea estaseñal que se va acumulando en los sucesivosciclos de PCR. De este modo, es posible es-timar la cantidad de la secuencia originalexpresada en número de copias porgenoma o en unidad de masa.

En la Parte IX, Capítulo 4, se detalla máseste punto y se aplica esta técnica para ladetección de organismos genéticamentemodificados (OGM).

7 Genotecas

Una genoteca («gene library») es unacolección de fragmentos de ADN clonadosque representan en su conjunto el ADN to-


tal de un organismo de interés o bien elADNc, que representa el conjunto de genesque se están expresando en un órgano otejido determinado o bajo una situación par-ticular o momento de crecimiento o desarro-llo. En el primer caso hablamos de unagenoteca genómica, donde se encuentrantodas las secuencias que se expresan y no seexpresan en el organismo y en el segundode una genoteca de ADNc, donde se en-cuentran sólo las secuencias expresadas.

Estas genotecas carecen de un catálogoa través del cual se pueda saber cuál es el clonque contiene una secuencia de interés. Porello es necesario realizar un relevamiento detodas las colonias utilizando una sonda conla secuencia de ácido nucleico que tenga quesea complementaria a la secuencia o genbuscados. Parte de esta secuencia puede serconocida o puede deducirse de la secuenciade aminoácidos de la proteína purificada.Alternativamente, puede buscarse la proteí-na producida por un gen clonado usandoanticuerpos contra la proteína o a través deun análisis funcional.

Una de las principales dificultades en elclonado de ADN genómico es que algunassecuencias están representadas una sola vezen el genoma y es difícil hallarlas. Para obviaresta dificultad puede clonarse directamenteel ADNc, ya que el número de copias delARNm en el tejido es más elevado. El proble-ma se plantea cuando no se sabe en qué cir-cunstancias o en qué tejido se expresa un genen particular. Pero existen varias formas dedeterminarlo. Actualmente es posible clonarun ADNc a partir de mensajeros poco abun-dantes en la célula, con concentraciones de1 a 2 moléculas por célula.

• Genotecas de ADNcEl primer paso en la construcción de una

genoteca de ADNc consiste en el aislamien-to del ARN del cual es posible separar elARNm tomando ventaja de la característicacola de poliadeninas que posee en su extre-mo 3´. Para ello se empaqueta en una co-lumna de celulosa a la cual se unenoligonucleótidos compuestos sólo pordesoxitimina –oligo(dT)–, a través de la cualpasa el ARN quedando el mensajero unido ala timina a través de la cola de poliA. Este esluego eluido de la columna utilizando unasolución tampón adecuada.

Estas colas de poliA también son utiliza-das en el próximo paso de clonado. La reac-ción consiste en poner en contacto el ARNmaislado con oligo(dT) de 12 a 20desoxitiminas que actúan como cebadores oprimers para la transcriptasa reversa. El pro-ducto de la reacción es un híbrido ARN-ADN.El problema que tiene esta técnica es que siel ADNc es muy largo, al comenzar en el ex-tremo 3´, muchas veces no se llega al extre-mo 5´. Para salvar esta dificultad existe otratécnica donde se utilizan primers al azar. Es-tos constan de 6 a 10 nucleótidos de longi-tud y están confeccionados de manera derepresentar muchas secuencias diferentes,por lo que la reacción comienza a partir demuchos sitios diferentes, no sólo del extre-mo 3´. Por cualquiera de los dos métodos seobtiene un híbrido ARN-ADN, a partir del cualse obtienen moléculas de ADN de doble ca-dena que puede clonarse en el vector apro-piado.

El primer método desarrollado para ob-tener la segunda cadena tomaba ventaja deuna «vuelta» o «giro» que da la hebra reciénsintetizada, como un efecto de cambio derumbo de la transcriptasa reversa al llegar alfinal de la cadena de ARN. Este artefacto pro-vee un cebador adecuado para la síntesis dela segunda cadena de ADN y puede eliminar-se una vez obtenida la segunda cadena, conuna nucleasa S1, perdiéndose parte de lasecuencia correspondiente al extremo 5’ delmensajero.

Existe una segunda técnica, que presen-ta dos ventajas sobre la anterior. Una es quegenera moléculas de ADNc más largas y lasegunda es que contiene prácticamente todala secuencia correspondiente al extremo 5´.Se basa en la utilización de la enzima RNasaH,que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN ydigiere la cadena de ARN dejando trozospequeños que permanecen unidos a la pri-mera cadena del ADNc y sirven como primerspara la ADN polimerasa I, que usa el ADNcoriginal como molde para sintetizar la hebracomplementaria de ADN. Sólo queda un pe-queño segmento de ARN en el extremo 5´.La segunda cadena de ADN tiene algunos sec-tores no unidos que son sellados por unaligasa de ADN.

Estas moléculas de ADNc de doble cade-na están listas ahora para ser insertadas en


un vector, que puede ser unplásmido o un derivado delfago l. Para ello se utiliza latransferasa terminal, queadiciona colas de poliA opoliT, o se agreganadaptadores, que son sitiosartificiales de reconoci-miento de alguna enzima derestricción que se unen a losextremos de la secuencia. Setrata de oligonucleótidos ar-tificiales (8-12 bp) que seunen al fragmento utilizan-do una ligasa de ADN y soncortados con la enzima derestricción apropiada (Fig. 7a). Ambos procedimientossirven para generar extremoscohesivos a fin de unir el frag-mento al vector, que poseeextremos cohesivos cortadospor la misma enzima.

Los plásmidos son intro-ducidos en bacterias portransformación (choque tér-mico o electrofusión), y se se-leccionan por la característi-ca del gen marcador delplásmido. Si se trata defagos, los vectores son em-paquetados in vitro paraformar partículas víricas, queintroducirán su ADN en elhospedador apropiado porinfección de un césped debacterias crecido sobre la su-perficie de una placa de agar(Fig. 7 a). Si bien los vectoresplasmídicos son más fácilesde manipular, las genotecasconstruidas en los fagos po-

Figura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadenasimple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con unaenzima de restricción, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNclos adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Losadaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADNdel fago, cortado con la misma enzima. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem,flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, quese utilizarán para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de unamolécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construída la genoteca puedelocalizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson etal., 1992).


seen fragmentos de mayor tamaño.Como resultado del cultivo en placa

(plaqueo) de la genoteca, se obtienen cien-tos de miles a un millón de placas de fagos(zonas claras o de lisis resultado de la pro-ducción de particulas víricas) o, en el caso devectores plasmídicos, colonias bacterianas,cada una conteniendo un fragmentoclonado, distribuidas sobre la placa de agar.A fin de realizar la búsqueda de un gen parti-cular («screening»), la genoteca es replicadaen membranas de nylon o nitrocelulosa, demanera tal que el patrón de placas en la cajaoriginal se vea exactamente reproducido enla membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B).

Búsqueda del gen clonado: Elección dela sonda

La búsqueda se lleva a cabo por hibrida-ción con una sonda de ácido nucleico, locual requiere un conocimiento previo de lasecuencia de interés. En algunos casos, don-de parte del gen ha sido clonado, este seutiliza para buscar las partes faltantes. Si seusa una sonda donde la homología es com-pleta, el «screening» puede realizarse en con-diciones de alta rigurosidad (es decir, conlavados más fuertes, temperatura elevada yconcentración salina baja, que tienden a des-pegar lo que se ha unido inespecíficamente).Si la sonda no es completamente homólogael «screening» deberá realizarse a menorestemperaturas y utilizando concentracionessalinas más elevadas en los lavados. Si no setiene conocimiento previo de la secuenciapuede construirse una sonda a partir de lasecuencia de aminoácidos de la proteína.Cuando se utiliza esta estrategia, el tamañomínimo de la sonda debe ser de 15 a 16nucleótidos (que permite encontrar secuen-cias únicas en genotecas de ADNceucarióticos. Generalmente se utilizan sondasde 17 a 20 nucleótidos (correspondientes a6 aminoácidos contiguos). Otra consideracióna tener en cuenta cuando se construye lasonda es que existe más de un codón otriplete para definir la mayoría de losaminoácidos (es lo que se conoce como la«degeneración» del código genético), por loque un aminoácido puede estar especifica-do por hasta 6 codones diferentes. Por ello,estas sondas oligonucleotídicas están consti-tuidas por una mezcla de todas las combi-naciones posibles. Una de ellas corresponde-

rá a la secuencia correcta del gen buscado. Elproblema de esta estrategia es el elevadonúmero de falsos positivos que pueden darlas secuencias adicionales. Una variante con-siste en usar un menor número deoligonucleótidos o uno solo pero de mayorlongitud (35-75 nucleótidos), eligiendo unaregión de la proteína que contenga el me-nor número posible de codones degenera-dos, utilizando el conocimiento de loscodones más probables para la especie enestudio.

Existen otras técnicas para localizar genesen las genotecas de ADNc, como hibridacióndiferencial, si se trata de genes expresadosen diferentes tejidos o la utilización de son-das de regiones conservadas en familias deproteínas para encontrar genes relacionadoso bien la utilización de vectores de expre-sión.

• Genotecas GenómicasUn genoteca genómica puede obtenerse

de cualquier tejido, ya que todas las célulasde un organismo tienen la misma constitu-ción genética. Como se mencionara previa-mente, se encuentran en ella no sólo secuen-cias expresadas y no expresadas sino tam-bién las correspondientes secuenciasregulatorias.

Pueden utilizarse fagos como vectores,pero sucede que muchos de los genomaseucariotas son muy grandes, por ejemplo elde mamíferos contiene 3x109 pb de ADN. Siel promedio típico de inserto es de 15.000pb, se necesitarán unos 200.000 fagos paracontener el genoma completo. Para asegu-rar que todas las secuencias estén represen-tadas al menos una vez, los cálculos estadís-ticos dicen que deberán analizarse aproxima-damente de 1 a 2 millones de fagos.

Muchos genes eucarióticos tienen más de1000 kb, por lo que deben ser clonados comoun conjunto de fragmentos parcialmentesuperpuestos. Para esto pueden utilizarsecósmidos, que pueden contener unas 45 kb.Para hacer una genoteca con estos vectoresel ADN se corta con enzimas de restricciónde manera de dejar fragmentos de tamañoapropiado. El cósmido se empaqueta in vitroen fagos que se usan para infectar E. coli .Una vez dentro de la célula el cósmido se re-plica y puede recuperarse de la célula comoun plásmido.


Cuando se trata de genomas muy gran-des, como es el caso del humano o de variasespecies vegetales y animales la utilización decósmidos resulta ineficiente. Por ello en es-tos casos se utilizan los YAC y BAC.

A) Genotecas genómicas en cromo-somas artificiales

La capacidad de clonar fragmentos demás de 100 kb es crucial para la genómicaestructural, funcional y comparativa de or-ganismos complejos. El primer sistema declonado de grandes fragmentos de ADN fue

informado en 1987 por Burke y colaborado-res. Este sistema estaba basado en YAC, quepermitían clonar y mantener fragmentos demás de 1000 kb en levaduras. Debido a estaventaja el sistema fue rápidamente adopta-do para los proyectos de genómica. Sin em-bargo, tienen algunos problemas que limitansu utilización, como el alto nivel dequimerismo o insertos híbridos (artefactoque resulta de la unión de fragmentos nocontiguos en el genoma original en un mis-mo clon), la inestabilidad de los insertos y la

dificultad de purificar losinsertos clonados.

Para minimizar estosproblemas se desarrollaronsistemas alternativos queutilizan bacterias en lugarde levaduras: los BAC y losPAC, que son vectores declonación de copia simple.Cuando se los utiliza paratransformar plantas se losllama BIBAC. BAC y PACpueden contener estable-mente fragmentos mayo-res de 300 kb en E. coli.

Para preparar unagenoteca genómica, el ADNse corta con enzimas derestricción o, para evitar lapresencia de fragmentosdemasiado largos o cortos,se fragmenta al azar. Unpaso crítico en el proceso esel aislamiento de moléculasintactas de ADN de eleva-do peso molecular, esen-cialmente ADN cromosómi-co. Para ello las células seembeben en bloques deagarosa de baja tempera-tura de gelificación y setratan con en-zimas y otros

Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasapara buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen ungenoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismofiltro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés. Comocontrol positivo se utiliza un ADN vegetal, también amplificado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel deagarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de losclones. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales seencuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos darála posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al.,1992).


reactivos para separar el ADN de las proteí-nas celulares y del RNA. La función del blo-que de agarosa es proteger a las grandesmoléculas, que, embebidas en esta matriz,se someten a la digestión con enzimas derestricción que realicen cortes poco fre-cuentes («rare cutters»). La preparación deADN de alta calidad en plantas es más com-plicada que la correspondiente para el casode animales debido a la presencia de la pa-red celular, que dificulta el embebido enagarosa de bajo punto de gelificación. Paraobviar esta dificultad se aíslan los núcleos yse trabaja con ellos directamente. Si se de-sea separar estos fragmentos porelectroforesis, los bloques de agarosa conte-niendo el DNA digerido pueden ser directa-mente embebidos en la matriz del gel quese correrá.

B) Separación de grandes trozos deADN: electroforesis de campo pulsátil

Las técnicas estándares de separación deADN en geles de agarosa no son adecuadaspara moléculas mayores de 10 kb. Esta limi-tación ha sido subsanada con una técnica lla-mada electroforesis de campo pulsátil, porla cual el campo eléctrico que conduce a lasgrandes moléculas de ADN a través del gelcambia periódicamente de orientación. Deesta manera pueden separarse moléculas tangrandes como los cromosomas de levaduras(200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación delas moléculas de este tamaño depende desu relativa facilidad o dificultad para reorien-tarse en respuesta a direcciones cambiantesde un campo eléctrico. Esta técnica puedeutilizarse para hacer mapas físicos a gran es-cala.

C) Preparación de una genoteca de BACEl procedimiento consiste en 4 pasos,

preparación del vector, aislamiento y diges-tión del ADN y selección de los fragmen-tos por tamaño, transformación de las bac-terias y ensamblado de la genoteca

El vector debe estar bien purificado, di-gerido y defosforilado (cuando se corta conuna sola enzima, se eliminan los fosfatos ter-minales, para evitar la recircularización). Ladigestión del ADN es crítica para obtener frag-mentos adecuados para clonar. Los fragmen-tos son seleccionados por electroforesis decampo pulsátil y se separan de la matriz deagarosa por digestión de la misma con

agarasa o gelasa, o por elución del ADNdesde el gel. Esto permite construirgenotecas con fragmentos de tamaños simi-lares, de aproximadamente 150 kb.

Estas genotecas de grandes insertos sonconsideradas recursos de largo plazo para in-vestigación genómica y deben ser manteni-das continuamente, especialmente cuandoson utilizadas para proyectos de secuenciadoy mapeo a gran escala. En general, cuandose va a construir una genoteca debe elegirsecuidadosamente el genotipo de la especieutilizada como fuente de ADN, el tipo de in-serto, etc. ya que la misma puede utilizarsepara variados propósitos. Si en lugar de unagenoteca de BAC se hace una de BIBAC, setiene la ventaja adicional de poder usar di-rectamente los fragmentos para transformarplantas utilizando Agrobacteriumtumefaciens

En la Fig. 8 se esquematiza la búsquedade un gen en una genoteca de BAC. Másdetalles acerca del ensamblado de los distin-tos fragmentos clonados pueden encontrar-se en el capítulo correspondiente a genómica.

· Genotecas de cromosomas específi-cos o de segmentos de cromosomas

Cuando se busca un gen que se sabe estáubicado en un cromosoma específico simpli-fica mucho el trabajo hacer una genoteca deese cromosoma solamente. Se trata de unatécnica que permite separar cromosomasmetafásicos teñidos con un colorante fluo-rescente (Hoechst 33258) (para regiones ri-cas en AT) y cromomicina A (para regionesricas en GC) y tratados de manera que el ADNno se desnaturalice. Los cromosomas teñidosfluorescerán cuando se expongan a luz UV(de longitudes de onda de 361 y 363 nm)(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A).Las cantidades y proporciones de colorantesvarían para cada cromosoma y una compu-tadora reconoce el patrón fluorescente típi-co de cada cromosoma. Algunoscromosomas son muy similares, por lo queno pueden ser separados. Se necesita unmillón de cromosomas para hacer unagenoteca. Equipos automáticos pueden ha-cer este trabajo en unas pocas horas.

También puede microdisectarse uncromosoma, tomando un segmento del mis-mo que tenga la región de interés. En princi-pio se utilizó esta técnica para cromosomas


grandes, fácilmente distinguibles pormicroscopía de contraste de fase. Actual-mente, la combinación con PCR posibilita laaplicación de la técnica a cualquiercromosoma. Estos son teñidos con Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son cortadascon agujas de vidrio ultrafinas y clonadas.Primers posicionados en el vector permitenamplificar secuencias desconocidas. El ADNamplificado se clona en un vector apropiadoy la localización cromosó-mica de cada clonse determina utilizando hibridación in situ(ver III.5)

8 Secuenciación

Una vez que se ha obtenido el clon conel fragmento de interés, el paso siguiente essecuenciarlo. La determinación de la secuen-cia puede realizarse por el método químicode Maxam y Gilbert o por el métodoenzimático de Sanger. El primero consisteen la utilización de un compuesto que des-truye selectivamente una o dos de las 4bases que constituyen el ADN. Se realizan4 reacciones de síntesis de ADN, marcandoun extremo de las moléculas, dependiendode la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De estaforma, se generan fragmentos de distintotamaño en función de la distancia de la basedestruida al extremo marcado radiactiva-mente del fragmento a secuenciar. Los pro-ductos de las 4 reacciones se corren lado alado en un gel de poliacrilamida y la secuen-cia del fragmento se determina a través delpatrón de bandas, después de efectuada unaautorradiografía para revelarlas.

El método de Sanger, se basa en el mis-mo principio y consiste en preparar 2´,3´-didesoxinucleótidos (ddNTP) de cada unade las 4 bases. Estas moléculas pueden serincorporadas al ADN por el ADN polimerasade E.coli porque tienen un 5´trifosfato nor-mal, pero no pueden formar un enlacefosfodiéster con el nucleótido siguiente,por lo que el crecimiento de la cadena sedetiene. En la mezcla de la reacción se inclu-ye la cadena a secuenciar, una proporcióncontrolada de uno de los 4 ddNTP con sudesoxinucleótido normal y los otros 3 dNTP.Cuando se agrega polimerasa la reaccióncomienza a partir del primero hasta que seintroduce en la cadena un ddNTP, con lo

cual su crecimiento cesa. Con una propor-ción correcta ddNTP:dNTP, se generan unaserie de fragmentos de distinta longitud,dependiendo de la distancia de la última baseincorporada al extremo marcado del ADN.Estos fragmentos son separados en un gelde poliacrilamida, donde, previa autorradio-grafía, se determina el patrón de bandas, querefleja la secuencia del ADN. Al principio, laposición de cada banda revelada en la pelí-cula radiográfica se anotaba manualmente,luego, los digitalizadores de imágenes posi-bilitaron la lectura directa de la película. Exis-ten actualmente secuenciadores automáti-cos que realizan la electroforesis en gel y de-terminan automá-ticamente la secuencia uti-lizando un sistema de detección con láser.

Messing desarrolló una serie de vectoresde clonado basados en el fago filamentosoM13, muy útiles para el secuenciadoenzimático. La ventaja es que sólo una delas cadenas del vector es empaquetada enlas cabezas del fago (ver Vectores declonación). Este ADN de simple cadena esideal para utilizar con el método de Sanger.Clonando el inserto en M13, en las dosorientaciones posibles, se obtiene una o laotra hebra del ADN a secuenciar. Para ello seutiliza un primer que se posiciona en un lu-gar adyacente a la región de policlonado deM13, que se llama «primer universal», ya quese puede utilizar para secuenciar cualquierclon recombinante.

Actualmente se utilizan fásmidos (verVectores de clonación). La adición de un«fago ayudante» («helper phage») a las cé-lulas que lo contienen, hace que el ADN delmismo, de simple cadena, sea replicado,empaquetado y extraído de la célula. Al serde menor tamaño (aprox. 3000 bp) que M13permite la inserción de fragmentos de ADNmás largos.

Los proyectos de secuenciacióngenómica han requerido métodos desecuenciado más veloces y económicos. Paraello se ha desarrollado una técnica llamadaMultiplex, que permite manejar mayor can-tidad de muestras en menor tiempo. Se utili-zan 20 vectores plasmídicos que permitenconstruir 20 genotecas diferentes a partir delmismo ADN. Cada vector lleva dos secuen-cias únicas que flanquean al sitio declonado, que pueden ser usadas como eti-


quetas («tags») para el ADN clonado y esta-rán presentes sobre cada fragmento a sersecuenciado. Se toma un clon de cada unade las genotecas plaqueadas (20 colonias) yse mezclan. Se hace crecer el cultivo, se aíslael ADN y se secuencian los plásmidos utilizan-do el método Maxam y Gilbert. Los produc-tos de 12 conjuntos de reacciones desecuenciación se corren en un gel y se trans-fieren a una membrana de nylon. El filtro sehibrida secuencialmente (es decir, se despe-ga una sonda para luego hibridar con las si-guiente y así sucesivamente), utilizando comosonda la etiqueta de cada uno de los 20vectores. En cada caso se van leyendo lassecuencias correspondientes a cada uno delos distintos vectores. De esta manera, unasola reacción produce datos de 20 clones ala vez.

Actualmente existen equipos robotiza-dos que pueden llevar a cabo dos de las re-acciones más limitantes en el proceso desecuenciado: la detección de las bandas deADN y la traducción de un patrón de ban-das en uno de secuencia. Estos equipos uti-lizan nucleótidos marcados con fluorocromos.Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al serexitados por láser emiten luz de diferentelongitud de onda. Los colorantes puedenutilizarse para marcar el primer universal desecuenciación de M13 o cada uno de los 4terminadores de cadena didesoxi. En estecaso, cada mezcla de reacción con unterminador diferente se marca con un co-lorante diferente. Cuando la reacción es com-pletada, los productos de las 4 reacciones semezclan y se corren en una sola calle de ungel, en un secuenciador automático. A medi-da que los fragmentos pasan a través del lá-

ser, sus marcas fluorescentes se excitan yemiten luz que se detecta mediante unfotomultiplicador. Después de ser procesadapor una computadora, la secuencia es mos-trada como una serie de picos o cromatogra-ma, donde cada uno de los 4 colores repre-senta a un nucleótido diferente (rojo:timina, verde: adenina, negro: guanina yazul: citosina).

9 Lecturas Recomendadas

FÜTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.;MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL,G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.;WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques forthe Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer toPlants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer LabManual.

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II.- Capítulo 4

Marcadores Moleculares

Picca, Aurora; Helguera, Marcelo;Salomón, Nelly; Carrera, Alicia

1 Introducción

Desde sus comienzos, el objetivo del me-joramiento vegetal ha sido seleccionargenotipos superiores a partir del reconoci-miento de fenotipos superiores. El grado deéxito en este proceso depende de i) el con-trol genético de la característica, es decir elnúmero de genes que la codifican y contro-lan (herencia monogénica o poligénica) y lasrelaciones interalélicas (dominancia oaditividad), ii) el grado de influencia ambien-tal que se mide normalmente a través delparámetro de heredabilidad. Una serie detécnicas moleculares de gran desarrollo en losúltimos veinte años permiten conocer la in-formación genética que los organismos por-tan. Funcionan como señaladores de diferen-tes regiones del genoma y se los conoce enforma genérica como marcadores molecu-lares. Son ampliamente utilizados engenética humana, vegetal, animal ymicrobiana. Permiten evidenciar variaciones(polimorfismos) en la secuencia del ADNentre dos individuos, modifiquen éstas o nosu fenotipo. En relación a los vegetales sonde utilidad en estudios evolutivos y degenética poblacional, manejo de bancos degermoplasma, identificación, protección legalde germoplasma, mapeo, selección asistidapor marcadores y clonado de genes.

Para que un carácter sea considerado unmarcador genético debe mostrar una varia-ción experimentalmente detectable entre losindividuos de la población y un modo de he-rencia predecible según las leyes de Mendel.Esta variación puede ser considerada a dife-rentes niveles biológicos, desde cambiosfenotípicos heredables significativos hasta lavariación de un solo nucleótido. Un marca-dor ideal debe ser: altamente polimórfico ovariable dentro y entre especies, de herenciamendeliana no epistática (sin interacción

entre genes), insensible a los efectos ambien-tales, codominante, de rápida identificacióny simple análisis y de posible detección en losestadios tempranos del desarrollo de la plan-ta.

En los análisis genómicos, se han utiliza-do varios tipos de marcadores genéticos:morfológicos, isoenzimas, proteínas y marca-dores basados en ADN.

2 Marcadores morfológicos

Son características fenotípicas de fácilidentificación visual tales como forma, color,tamaño o altura. Muchos de ellos se convier-ten en importantes «descriptores», a la horade inscribir nuevas variedades. Por ejemplo,alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo,hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizanpara inscribir e identificar variedades de trigoen la Secretaría de Agricultura Ganadería Pes-ca y Alimentación. Este tipo de marcadorescontribuyó significativamente al desarrolloteórico del ligamiento genético y a la cons-trucción de las primeras versiones de mapasgenéticos. Un gran número de marcadoresmorfológicos ha sido mapeado en tomate ymaíz. En girasol, los primeros híbridos se ob-tuvieron utilizando el «color de hipocótile»como marcador l igado al gen ms deandroesterilidad; de este modo las plantasverdes que eran androestériles se utilizabancomo líneas maternas y las plantas conantocianas que eran fértiles se eliminaban dellote de producción al comienzo de su desa-rrollo.

Las principales limitaciones de los marca-dores morfológicos se encuentran en: i) nú-mero reducido de marcadores disponibles encada población, ii) bajo nivel de polimorfismo,iii) pueden producir alteraciones fenotípicasque dificultan el desarrollo de la planta, iv)varios se hallan bajo control poligénico, v)dominancia, vi) muchos de ellos se expresanen estadío de planta adulta, lo cual prolon-ga los tiempos de evaluación en los progra-mas de mejoramiento. No obstante, losmarcadores morfológicos permanecen comocaracteres útiles en la identificación de mate-riales dado que representan un conjunto degenes que pueden ser evaluados con méto-dos sencillos y a bajo costo.

62 PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMÓN, Nelly; CARRERA, Alicia

3 Isoenzimas

Se definen como diferentes formasmoleculares de una enzima, que poseen unaactividad catalítica común, es decir actúansobre el mismo sustrato. Ciertos cambios enel ADN que codifica estas enzimas (mutacio-nes) pueden resultar en cambios en la com-posición de aminoácidos, originando proteí-nas con la misma actividad biológica pero condiferente carga neta y por tanto con dife-rentes velocidades de migración en un cam-po eléctrico. Estas diferencias determinanpatrones característicos de migraciónelectroforética de las formas iso-enzimáticas.

Varios factores determinan el patrón debandas o zimograma:

1) Número de genes que las codifican.La presencia de varios genes codificando parauna misma enzima ha sido atribuida a proce-sos de duplicación génica y subsecuente di-vergencia a través de mutaciones diferentesen cada caso.

2) Estados alélicos. El proceso más sim-ple de generación de nuevas formasenzimáticas es la mutación de un gen estruc-tural; las variantes alélicas se denominanaloenzimas. Estos marcadores muestrancodominancia

3) Estructura cuaternaria de los produc-tos proteicos. La enzima funcional puedeestar compuesta por un número variable desub-unidades. En las formas más simples omonoméricas los individuos homocigotas pre-sentan una banda y los heterocigotas sim-plemente la suma de ambas. Cuando la es-tructura cuaternaria se vuelve más compleja,encontramos enzimas activas compuestaspor dímeros, tetrámeros, etc.. En este casoel individuo heterocigota presenta bandasadicionales no presentes en los homocigotas,que se generan por la combinación de sub-unidades codificadas por los distintos aleloso loci. (Fig. 1).

4) Compartimentalización subcelular. Seencuentran formas enzimáticas localizadasen citoplasma, cloroplasto o mitocondria,codificadas todas por genes nucleares perocon diferentes velocidades de migración.

Las isoenzimas se obtienen porhomogenización del tejido (semilla, raíz, hoja)

en soluciones «buffer» y se analizan median-te electroforesis en un soporte sólido, gene-ralmente almidón. El gel puede ser cortadoen capas horizontales y cada una se destinaa una solución de revelado específica queconsta de un sustrato, un colorante ycofactores, disueltos en un buffer apropiado.La preparación del gel es relativamente sim-ple y el equipamiento es de bajo costo.

Las enzimas se clasifican de acuerdo a sufunción y se representan con una sigla de tresletras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcoholdehidrogenasa ADH, glutamato dehidroge-nasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX),hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP, esterasasEST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) ytransferasas (fosfoglucomutasas PGM). Losloci en general se representan con las tresletras señaladas en tipo cursiva y se agregaun número para designar al locus y una letrapara el alelo, de acuerdo a distancias decre-cientes de migración. Por ejemplo: Adh-1a,Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c.

Las isoenzimas han tenido un rol promi-nente en estudios de poblaciones vegetalespara determinar variabilidad y estructuragenética, sistemática y biología evolutiva asícomo en descripción de germoplasma e iden-tificación de variedades. Su aplicación en laconstrucción de mapas se ha visto limitadapor el número de marcadores isoenzimáticosdisponibles, en general menor a 50 y por sureducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otrolado, las formas enzimáticas extraídas de hojao raíz (no así las de semilla) presentan varia-ciones en relación a las condiciones ambien-tales de crecimiento y a la edad del tejido, locual afecta la reproducibilidad de loszimogramas. No obstante, estos loci repre-sentan importantes marcas de referenciapara relacionar mapas obtenidos a partir de

Figura 1: Locus isoenzimático Pgd-3 en girasol. Variantesalélicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas yF1 heterocigota


distintos marcadores de ADN.

4 Proteínas de reserva

El endosperma de los cereales es el prin-cipal componente de la semilla ya que repre-senta aproximadamente el 80-90% de supeso seco. Almidón y proteínas son las dosmacromoléculas más importantes. El conte-nido de proteína varía según la especie y elmanejo de cultivo a campo. Los valores másaltos se dan en trigo y avena (10-17%) y losmás bajos en maíz y arroz (6%). La concen-tración de proteínas en los cereales es apre-ciablemente menor que en las leguminosasya que en éstas los órganos de reserva ocotiledones son capaces de almacenar hastaun 40% de su peso seco en proteínas.

Las proteínas del endosperma fueron es-tudiadas ya a comienzos del siglo pasado porOsborne, quién dio las bases para las clasifi-caciones actuales. La misma se basa en lasolubilidad relativa en diferentes solventes:albúminas solubles en agua, globulinas ensolución salina, prolaminas en alcohol yglutelinas en ácidos o álcalis. Para el grupode las prolaminas se ha asignado un nombreespecífico para cada uno de los cereales. Deesta manera en maíz se la denomina zeína,en cebada hordeína, en avena avenina y entrigo gliadina. En el caso específico de trigo alas glutelinas se las conoce con el nombre degluteninas.

En la mayoría de los cereales lasprolaminas y glutelinas están codificadas porvarios genes relacionados conformando fa-milias. Durante la evolución de estos genesse han detectado duplicaciones, transloca-ciones, inserciones de elementos móvilesentre otros re-arreglos cromosómicos. Estoscambios genéticos han generado un alto ni-vel de polimorfismo proteico entre especies,así como entre variedades de la misma espe-cie. Además, el análisis genético de cruza-mientos ha demostrado que la variación enel patrón de proteínas es debida a la exis-tencia de variantes alélicas en cada locus.

Las glutelinas se analizan en gelesdiscontinuos de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, en medio básico (SDS-PAGE)utilizando diferentes tamaños de poros (ta-miz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento delas prolaminas se realiza en electroforesis áci-

da (A-PAGE), en geles continuos, utilizandoel principio de diferencias en la carga eléctri-ca. La visualización se realiza en ambos casosmediante tinción con Coomassie Brilliant BlueR250.

En trigo pan, Triticum aestivum, los genesestructurales para las dos principales proteí-nas, gluteninas y gliadinas, están confinadosal conjunto de los cromosomas homeólogos(cromosomas parcialmente homólogos per-tenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Losgenes para las subunidades de gluteninas dealto peso molecular (GAPM) están ubicadosen el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y1D, cercanos al centrómero. Las gluteninasde bajo peso molecular (GBPM) son codifica-das por genes ubicados en los brazos cortosde ese mismo grupo de cromosomas, distan-tes del centrómero.

El patrón electroforético de las gliadinasmuestra cuatro grupos proteicos denomina-das a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y wse encuentran codificadas por genes delcromosoma 1 de los tres genomas, próximosal grupo de genes correspondientes a GAPM.Los genes de las fracciones a y b se ubican enel brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y6D.

La localización cromosómica de los genesde proteínas en trigo se ha establecido prin-cipalmente utilizando materiales aneuploidestales como nulisómicos o tetrasómicos de lavariedad Chinese Spring. La posición relativadel locus sobre el cromosoma fue determi-nada por cruzamientos entre líneas con con-tenidos contrastantes de proteína y deter-minando la frecuencia de recombinación enla progenie. La posición cromosómica de es-tas proteínas ha sido estable a lo largo de la

Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedadesde trigo por SDS-PAGE para su correlación con variablesde calidad industrial.


evolución y han sido usadas como marcado-res para el estudio de la homeologíacromosómica de la Tribu Triticeae.

5 ADN y marcadores moleculares

Un marcador de ADN es simplemente unpunto de referencia en un cromosoma, quepuede o no corresponder a un gen. Diversastécnicas de biología molecular se encuentrandisponibles para detectar variabilidad en lasecuencia de ADN. La reacción en cadena dela polimerasa (PCR), las enzimas de restric-ción, la separación electroforética de los frag-mentos de ADN, las sondas marcadas y lashibridizaciones son algunas de las técnicasque permiten obtener un número virtualmen-te ilimitado de marcadores moleculares y cu-brir la totalidad del genoma de un organis-mo (para más detalles ver II.- 3)

Los marcadores moleculares pueden serclasificados en tres grupos:

A) Marcadores basados en la hibridacióndel ADN: los más utilizados en plantas sonlos RFLP «restriction fragment lengthpolymorphisms» o polimorfismos en la lon-gitud de fragmentos de restricción de ADN.Este tipo de estudio involucra la detecciónde un segmento específico (marcadormolecular) en el ADN de estudio por hibrida-ción con un fragmento marcadoradiactivamente de secuencia complementa-ria al marcador (sonda). En el proceso, el ADNen estudio es digerido por medio de unaenzima de restricción. Este tipo de enzimascorta el ADN en una secuencia determinadao sitio de restricción. La variabilidad genéticapresente en el marcador molecular se obser-va como diferencias en la secuencia del ADNgenómico debidas a duplicaciones, deleciones,inserciones, etc. que modifican la distanciaentre pares de sitios de restricción y generanfragmentos polimórficos (de diferentes ta-maños). Los fragmentos clivados por la enzi-ma de restricción se separan por su tamañomediante electroforesis y se transfieren a unamembrana donde son hibridados con la son-da. En el proceso, la sonda hibrida solamen-te con fragmentos de ADN inmovilizados enla membrana que presenten la secuencia com-plementaria a la misma. Para visualizar lospolimorfismos se expone la membrana a una

placa radiográfica La ventaja de los RFLPs ra-dica en que son altamente reproducibles,codominantes y multialélicos. A su vez cuen-tan con la desventaja de ser muy laboriosos,difíciles de automatizar, requieren de infra-estructura adecuada para mantener las son-das, trabajar con radiactivos, lo que los hacerelativamente caros.

Los minisatélites o VNTR «variablenumber of tandem repeats» son repeticio-nes en tandem de secuencias del genoma quecontienen de 9 a 100 pares de bases. El nú-mero de repeticiones es variable pero en ge-neral es menor a 1000. Existen dos formasde detectar los VNTR ya sea por hibridacióno por técnicas de PCR. El ADN genómico esdigerido con enzimas de restricción que re-conocen los sitios de restricción queflanquean las repeticiones en tandem, sepa-rado electroforéticamente e inmovilizado enuna membrana. Cuando la enzima de restric-ción corta las secuencias adyacentes a un locushipervariable, la longitud de los fragmentosde restricción producidos en diferentes indi-viduos varía con el número de repeticionesde minisatélites. Estos fragmentos con dife-rentes longitudes son detectados utilizandosondas diseñadas a partir de las secuenciasde ADN que flanquean las repeticiones o apartir de las repeticiones mismas. Estos frag-mentos pueden ser considerados como untipo específico de RFLP. La diferencia básicaentre RFLP y VNTR reside en el tipo de son-da utilizada. En la técnica de VNRT las son-das están constituidas por secuenciashomólogas a las secuencias repetidas de losminisatélites, por lo tanto todos los locushipervariables son detectados simultánea-mente, mientras que en RFLP, las sondas sonhomólogas a secuencias únicas del genoma,detectando así uno o pocos loci cada vez. Deesta manera, en el autoradiograma al con-trario del patrón simple de bandas obteni-do por RFLP (una banda para genotiposhomocigotas o dos bandas para genotiposheterocigotas), para minisatélites se obtieneun perfil complejo de bandas múltiples. Unaventaja de los VNRT, es que además de ex-plorar el polimorfismo en la longitud de losfragmentos de restricción en cada locushipervariable, utilizan también el polimor-fismo en el número y distribución de estosloci a lo largo del genoma, posibilitando así


la visualización simultánea de diversas regio-nes del mismo. Las limitaciones para esta téc-nica, son las mismas descriptas oportunamen-te para RFLP. Los minisatélites también pue-den ser detectados mediante la amplificaciónpor PCR de los segmentos conteniendo dife-rente número de repeticiones, utilizando«primers» o cebadores, que flanqueen dichossegmentos.

B) Marcadores basados en la amplifica-ción del ADN: mediante la reacción de PCR«polymerase chain reaction» o reacción encadena de la polimerasa de ADN. Esta téc-nica se basa en la síntesis enzimática de mi-llones de copias de un segmento específicode ADN en presencia de una polimerasa deADN termoestable. Para ello se utilizan dosoligonucleótidos llamados «cebadores» o«primers». El segmento de ADN a amplificaresta compuesto por dos hebras (a y b), lasecuencia de uno de los oligonucleótidoshibrida en uno de los extremos del segmen-to y es complementaria a la hebra a, el se-gundo oligonucleótido hibrida en el otro ex-tremo del segmento y es complementario ala hebra b. Para que exista amplificación delfragmento es imprescindibleque ambos oligonucleótidoshibriden en secuencias com-plementarias presentes enlas hebras del ADN en estu-dio. La presencia de mutacio-nes en el sitio de hibridaciónde cualquiera de losoligonucleótidos impide laamplificación del fragmento.

La necesidad de disponerde información previa acercade la secuencia del ADN a am-plificar para diseñar oligonu-cleótidos, limitó inicialmenteel desarrollo de marcadoresbasados en la reacción dePCR en plantas. La primerasolución a este problema vino de la mano delos RAPDs «random amplified polymorphicDNAs» o fragmentos polimórficos de ADNamplificados aleatoriamente. Esta técnicase basa en la util ización de un únicooligonucleótido de 10bp que hibrida al azarcon el ADN en estudio. Para que se genereun fragmento RAPD es necesario que las dos

hebras del ADN en estudio presenten sitiosde hibridación con el oligonucleótido enorientaciones opuestas suficientemente cer-canas (menos de 3000bp) como para permi-tir la amplificación. La secuencia deloligonucleótido es aleatoria al igual que lossitios de hibridación, por lo que la secuenciaamplificada es desconocida. El polimorfismoque se observa entre distintos individuos con-siste en la presencia o ausencia de fragmen-tos de ADN amplificado (Fig. 3).

DAF «DNA amplification finger-printing» y AP-PCR «arbitrary primer PCR»son técnicas similares a RAPDs. DAF involucrael uso de primers arbitrarios de longitud tancorta como 5 pares de bases. Esto reduce laespecificidad del apareamiento con el ADNmolde y resulta en un perfil más complejo debandas. La visualización se lleva a cabo pormedio de geles de poliacrilamida teñidos conplata. AP-PCR utiliza primers ligeramente máslargos que la técnica anterior (aprox. 20 pa-res de bases). Los productos de amplificaciónson marcados radiactivamente y tambiénpueden ser resueltos por electroforésis engeles de poliacrilamida

La ventaja de estas técnicas consiste en

que son rápidas y sencillas, de bajo costo deimplementación, automatizables y no radio-activas. La desventaja, además de su bajareproducibilidad, es que es un marcador do-minante (al observar un fragmento es impo-sible determinar si el mismo se originó de unao dos copias de la secuencia amplificada).

La disminución en los costos de secuen-

Figura 3: RAPDs en DNA genómico de trigo candeal.Genotipos parentales K y D y progenie F7.


ciación y PCR, junto a la creciente informa-ción sobre genomas animales y vegetales hanpermitido el desarrollo de marcadores basa-dos en PCR con diferentes características,entre ellos los más frecuentemente utilizadosen plantas son: SSR «simple sequencerepeats» o microsatélites y AFLPs«amplified fragment length polymor-phisms».

Los microsatélites (SSR), son regionesgenómicas hipervariables constituidas porrepeticiones en tandem de unos pocos pa-res de bases (1 a 4) flanqueadas por secuen-cias de copia única. La base genética delpolimorfismo detectado en microsatélites sebasa en la variabilidad del número de repeti-ciones en tandem y consecuentemente deltamaño del microsatélite amplificado en in-dividuos de una especie. El microsatélite am-plificado por PCR es sometido a electroforesisen geles de alta resolución que permiten de-tectar diferencias de 2, 3 o 4 nucleótidos quecorresponden al mínimo polimorfismo de lon-gitud en un microsatélite. Por el altopolimorfismo que presentan por locus(multialelismo) se los considera los marcado-res ideales para el mejoramiento en especiesautógamas como el trigo. Estos marcadoresson codominantes, genoma-específicos y al-tamente polimórficos en comparación con losRFLPs y RAPDs. Su implementación en un la-boratorio requiere de mayor infraestructuray presupuesto que los RAPDs.

C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfis-mo en la longitud de fragmentos amplifica-dos de ADN) puede considerarse como unacombinación de RFLP y RAPDs. Esta técnicaconsiste en esencia de cuatro etapas: 1) elADN genómico es cortado con enzimas derestricción (generalmente una de corte raroy otra de corte frecuente). 2) adaptadoresde ADN de doble cadena se adhieren en for-ma específica a los extremos de los fragmen-tos obtenidos en el paso anterior, generan-do así el molde para la amplificación del ADN.3) una fracción de los fragmentos obtenidoses amplificada selectivamente por la acciónde primers específicos que fueron diseñadospara reconocer la secuencia de losadaptadores ligados en el segundo paso, elsitio de la enzima de restricción, más una atres bases selectivas al azar agregadas en el

extremo 3’. El uso de bases selectivas al azarpermite la amplificación de sólo un grupo defragmentos de restricción (aquellos en quecoincide la secuencia del adaptador + sitio derestricción + bases selectivas). 4) análisis de lasubpoblación de fragmentos amplificadosmediante su desnaturalización por electro-foresis en geles de alta resolución (poliacri-lamida) y visualización por autoradiografía opor tinción con nitrato de plata (Fig. 4). Suimplementación en laboratorio requiere deuna infraestructura y presupuesto similar a losmicrosatélites. Estos marcadores presentanun alto poder de detección de la variabilidadgenética, ya que se explora simultáneamen-te el polimorfismo de ausencia/presencia desitios de restricción (como los RFLP) y la ocu-rrencia o no de amplificación a partir de se-cuencias arbitrarias (como los RAPDs). La basedel polimorfismo es la ausencia o presenciade fragmentos amplificados de un tamañodeterminado y al igual que en los RAPDs, noes posible distinguir individuos heterocigotaspor lo que se trata de un marcador domi-nante. Es un marcador mucho más robusto

Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinacionesde primers para las enzimas de restricción Pst I y Mse Ien las variedades K y D.


que los RAPDs, ya que en la amplificación seutilizan oligonucleótidos más largos, que au-mentan significativamente la especificidad dela reacción sin perder las ventajas de la am-plificación de secuencias al azar (no requiereinformación previa de secuencia de ADN).Otra ventaja de los AFLPs es el número defragmentos (marcadores) resueltos porelectroforesis que oscila entre 30 - 50 contralos 4 – 10 de RAPDs.

Para una utilización más eficiente en pro-gramas de mejoramiento de marcadoresRFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad detransformarlos en marcadores PCR alelo-es-pecíficos, que son económicos, robustos y desencilla implementación en cualquier labora-torio.

Existen distintas estrategias para la con-versión de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPsen marcadores PCR alelo-específicos, en ge-neral ligados a un caracter de interés agro-nómico. Se conocen como STS «sequence-tagged sites». En estos casos se aisla el frag-mento de ADN polimórfico del gel, se clona,se secuencia y se diseñanoligonucleótidos específicos dealrededor de 20 pb, para ser uti-lizados como cebadores. Cuan-do se parte de un fragmentoRAPD, el marcador derivado me-diante este proceso es conocidocomo SCAR «región amplifica-da de secuencia caracteriza-da». El paso siguiente es detec-tar el alelo de valor agronómicosuperior, por ejemplo un aleloasociado a la resistencia a un pa-tógeno y el marcador entoncesse hace evidente con una simplereacción de PCR. El problema que enfrentanestas estrategias suele ser el bajo nivel depolimorfismo entre variedades de una espe-cie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las po-sibilidades de encontrar mutaciones útilespara desarrollar estos marcadores. De todosmodos, existen antecedentes exitosos dedesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe-cíficos en trigo para locus altamentepolimórficos como pueden ser alelos degluteninas.

Los ESTs «expressed sequence tags» sonsimilares a los STSs y sirven para los mismospropósitos pero derivan de clones de cDNA

(ARNm transcripto a ADN utilizando la enzi-ma transcriptasa reversa). La ventaja de losESTs, al ser derivados de ARNm maduro esque generalmente se ven libres de intronesy de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTsrepresentan genes funcionales y son por lotanto más útiles como marcadoresmoleculares que las secuencias anónimas.

En una variante conocida como CAPs«cleavage amplified polymorphicsequence», los productos de amplificación desecuencias específicas se digieren con unaenzima de restricción. Este método permiteidentificar individuos heterocigotas, por loque se comporta como marcador codomi-nante. La información para la secuencia delos primers utilizados en CAPs puede prove-nir de un banco de genes o de clonesgenómicos o de cDNA. Recientemente me-diante CAPS ha sido posible seleccionar plan-tas de trigo hexaploide portadoras del alelo2NS, proviente de una translocación deTriticum ventricosum que contiene genes deresistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5).

Existen técnicas de alta resolución quepermiten detectar mutaciones a nivel de unsolo nucleótido conocidas como SNPs «sin-gle nucleotide polymorphisms». Entre ellas,los SSCPs «single-strand conformationalpolymorphism» tienen la capacidad de de-tectar cambios de un solo nucleótido en frag-mentos de más de 1000 pares de bases. Latécnica de SSCPs se basa en la movilidad delas cadenas simples del ADN en geles depoliacrilamida no desnaturalizantes, movili-dad que depende tanto de su tamaño comode su secuencia. Las cadenas simples de ADNtienen tendencia a formar apareamientos

Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificación). Calles2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109).Calles 4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas2AS/2NS.


intramoleculares de bases que resultan enuna conformación dependiente de la secuen-cia y con una movilidad específica en gelesde acrilamida. Por lo tanto cambios en la se-cuencia del ADN, aunque sea de un solo parde bases, causan modificaciones en la con-formación y consecuentemente en la movili-dad electroforética. Los SSCPs pueden detec-tarse clivando el ADN con enzimas de restric-ción, separando los distintos fragmentos se-gún su conformación por corrida en un gel.Posteriormente se realiza una hibridación deSouthern a partir del gel con fragmentos es-pecíficos como sondas para la hibridación.Otra metodología para obtener SSCPs con-siste en la amplificación de un fragmento es-pecífico por PCR y posterior corridaelectroforética en geles de alta resolución.

De la descripción realizada, se desprendeque los marcadores varían ampliamente enel grado de complejidad del método, el modode herencia, el nivel de polimorfismo y en losfactores costo y tiempo, de gran importan-cia cuando los objetivos del estudio incluyenel análisis de un número elevado de indivi-duos. La tabla 1 resume algunos aspectosimportantes a considerar a la hora de elegirel tipo de marcador a utilizar.


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Tabla 1: Comparación entre algunos sistemas demarcadores moleculares.

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II.-Capítulo 5

Citogenética

Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A.

1 Introducción

Los estudios citogenéticos han permitidorealizar valiosos aportes al conocimiento delos mecanismos de aislamiento reproductivoy modos de especiación en plantas. Laespeciación híbrida es muy común en el rei-no vegetal, en especial la especiación porpoliploidía. En estos casos la citogenética, através del análisis genómico, ha contribuidoa la resolución del origen y evolución de dis-tintos grupos taxonómicos. Mutacionescromosómicas que alteran la morfología delos cromosomas jugarían un papel importan-te en la determinación de los mecanismosde aislamiento reproductivo y distintos mo-dos de especiación. Aun sin alterar la morfo-logía de los cromosomas, existen ejemplosen los que mutaciones génicas que afectanel apareamiento han sido determinantes enla evolución de distintos grupos. Lacitogenética brinda valiosos aportes para laresolución de problemas taxonómicos, evo-lutivos y aplicados. Esta disciplina tiene gran-des ventajas pero también limitaciones y susaportes deben ser complementados con es-tudios provenientes de otros campos. Sinembargo es importante señalar que traba-jar en biología o genética de eucariontes,usando técnicas clásicas o moleculares, perodesconociendo las características y el compor-tamiento de sus cromosomas puede llevar aerrores en la interpretación de causa y efec-to de muchos fenómenos. En esta contribu-ción se explicará brevemente la informaciónque la citogenética puede brindar, con elanálisis del cariotipo, análisis meiótico enhíbridos y poliploides, estudio de la variaciónintra e interespecifica en el tamaño delgenoma y con la citogenética molecular (hi-bridación in situ, FISH, GISH), exponiendocomo ejemplos, algunos aportes realizadospor nuestro grupo de trabajo.

2 Análisis del cariotipo

Las características estructurales y cuanti-tativas de los cromosomas (cariotipo) sonimportantes en investigaciones básicas(taxonómicas y evolutivas) y aplicadas. Lostaxónomos y evolucionistas están familiari-zados con el hecho de que los cromosomasson parte de un sistema dinámico que estámoldeando el proceso de evolución. Esta va-riación se expresa en características fácilmen-te analizables como el número, forma y ta-maño de los cromosomas y no está relacio-nada con complejidad genética uorganísmica. Es importante analizar también,la cantidad y localización de heterocromatina(ADN repetitivo no codificante) mediantedistintas técnicas de bandeo, y caracterizarcitoquímicamente distintos tipos deheterocromatina utilizando fluorocromos, yen algunos casos, identificar ADN satélite yrelacionarlo con bandas heterocromáticas.Además, deben localizarse las regiones orga-nizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente ynormal la existencia de variación cariotípicainterespecífica. Por otro lado, aunque menosfrecuente, también puede existir variabilidadcariotípica intraespecífica manifestada comopolimorfismos o politipismos cromosómicos.

Varios parámetros del cariotipo puedenser alterados por rearreglos estructurales. Enalgunos casos puede variar el númerocromosómico y la simetría del cariotipo. Unejemplo de este caso lo constituyen las fu-siones céntricas entre cromosomas concentrómero subterminal produciendocromosomas metacéntricos de mayor tama-ño, con o sin eliminación de regionescentroméricas. El fragmento con centrómeropuede persistir como un cromosoma super-numerario o cromosoma B. En otros casosno se encuentra variación en el númerocromosómico ya que en muchos géneros elnúmero y, a veces, la morfología cromosómicaes constante entre las distintas especies quelo componen.

En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de lasnueve especies que lo componen sondiploides (2n=26). Sin embargo existen dife-rencias importantes interespecíficas en cuan-to a la morfología cromosómica, simetría delcariotipo y tamaño del genoma. El cariotipode B. retama es el más asimétrico ya que

70 POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

posee un cariotipobimodal por adición deheterocromatina en 24de los 26 cromosomasdel complemento.

El número cromo-sómico también puedevariar por poliploidía.Nuevos números bási-cos que no tengan re-lación directa con losancestrales pueden sur-gir si ocurren nuevas re-estructuraciones o hibri-dación entre poliploi-des con distintos nú-meros básicos.

Variaciones en elcariotipo pueden ocu-rrir sin cambios notoriosen el exofenotipo. Sinembargo rearreglos encondición heterocigotapueden ocasionar dis-turbios en el aparea-miento meiótico e ini-ciar aislamiento repro-ductivo. Si se dan lascondiciones adecuadaspara la fijación de estosrearreglos pueden ini-ciarse eventos especio-génicos que involucrenrearreglos cromosómi-cos. Estos procesospueden conducir, enalgunos casos, a la exis-tencia de especiescrípticas o hermanas,con pocas diferencias anivel bioquímico omorfológico pero condiferencias cromosó-micas que las manten-drían aisladas reproductivamente.

Un análisis más preciso de la variacióncariotípica puede obtenerse empleando téc-nicas de bandeo que revelan marcadorescromosómicos (secuencias de ADN altamen-te repetidas ricas en AT o GC, regiones orga-nizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C esel que se utiliza de rutina y revela heterocro-

matina constitutiva compuesta por secuen-cias cortas repetidas en tandem. Laheterocromatina constitutiva es un compo-nente aditivo del genoma y presenta, enmuchos grupos, variación intra einterespecífica. Aunque no contiene genesactivos podría tener importancia en eventosregulatorios, en el desarrollo y en la organi-

FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitóticas. B, D = interfases. A, B =Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas señalanel único par de cromosomas metacéntricos eucromáticos.- F = Metafase I. Eulophiapaiveana ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociaciónsecundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis , n = 10; G =Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha señala un bivalente heteromorfo;H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea maysssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J =Asincronía meiótica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K =Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones.Ver explicación extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al.,1991.


zación tridimensional de los cromosomas enel núcleo. Bennett (1983, 1988) crea el térmi-no «cariotipo natural» para referirse al orde-namiento de los cromosomas de acuerdo ala posición real que los mismos ocupan en elnúcleo interfásico. Se han postulado variosmodelos que explican la organizaciónsupracromosómica en los núcleos eucariontesestableciendo que si bien ésta no es univer-sal, es indudable que la información genéticano está contenida caoticamen-te en el nú-cleo sino que está ordenada de acuerdo apatrones que actualmente no conocemos.

3 Análisis meiótico en híbridos ypoliploides

Una especie diploide con reproducciónsexual para ser fértil debe poseer un compor-tamiento meiótico normal, o sea que debeposeer buen apareamiento entrecromosomas homólogos y consecuentemen-te formación de bivalentes. Ello determinaque exista buena segregación y formación degametos balanceados y fértiles. En generalel grado de apareamiento meiótico es unamedida de la homología que existe entre loscromosomas. Esto es cierto cuando son nor-males los genes que regulan fisiológicamentetodas las etapas y procesos de la divisiónmeiótica.

Estos principios han permitido realizarrápidas evaluaciones de la homologíagenómica entre dos entidades por medio delestudio meiótico de su híbrido F1, cuandoéstos han sido posibles de obtenerartificialmente o se los ha encontrado enpoblaciones naturales. Si el híbrido analiza-do es fértil y posee formación de bivalentesse puede concluir que hay afinidad(homología) entre los genomas parentales.El grado de irregularidades meióticas es unaestimación de diferencias génicas y estructu-rales de las entidades en estudio. Configura-ciones meióticas anormales como univalen-tes, bivalentes heteromórficos o multivalen-tes en Profase-Metafase I y, en estadíos pos-teriores (puentes, fragmentos, cromosomascon cromátidas desiguales, husos multipo-lares, etc.,), pueden deberse a heterocigosispara distintos tipo de rearreglos estructura-les.

Si el híbrido es estéril habrá que analizarsi el aislamiento reproductivo postcigóticoobedece a causas génicas o cromosómicas.La formación de univalentes podría significarfalta de homología entre los cromosomas delos progenitores y, en estos casos, elpoliploide artificial debería poseer meiosisregular y fertilidad elevada. Sin embargo po-dría ocurrir que aunque las especiesparentales tuvieran una elevada homologíaen cuanto a las secuencias de ADN, loshíbridos fueran estériles, con formación deunivalentes en su meiosis. Esto último podríadeberse a la acción de genes que interfierencon el proceso normal de apareamiento (for-mación del complejo sinaptonémico, ocurren-cia y/o posición de sobrecruzamientos) o al-teran la disposición espacial de los genomasen el núcleo provocando asinapsis.

En algunos casos la formación deunivalentes en los híbridos se debería a di-vergencia cuantitativa en el número de co-pias de secuencias de ADN altamente repeti-das. Este mecanismo disminuye el valoradaptativo del heterocigota por provocardisturbios en la alineación estructural de loscromosomas.

Otro caso frecuente en la naturaleza esla existencia de híbridos diploides con forma-ción regular de bivalentes y desarrollo nor-mal de los estados II de la meiosis, pero ele-vada esterilidad. Este fenómeno es muy co-mún en híbridos entre distintas especies deAmaranthus, Prosopis y Bromus entre otros.Stebbins (1971) ha denominado a este fe-nómeno «hibridez estructural críptica» y ocu-rriría cuando las especies progenitoras se di-ferencian en pequeños rearreglos estructu-rales. En estos casos se pueden formarbivalentes pero se segregan combinacionesgénicas inviables a las gametas.

El comportamiento meiótico puede tam-bién verse alterado por interacciones parti-culares «núcleo - citoplasmáticas». En loshíbridos el citoplasma puede ejercer una ac-ción diferencial sobre la condensacióncromosómica de los genomas parentales oen el ritmo de contracción cromosómica du-rante la meiosis (alociclia genómica). Cuatrolíneas aloplásmicas fueron obtenidas por elIng. Agr. L. Mazoti utilizando maíz (Zea maysssp mays) como progenitor masculino recu-rrente durante al menos 10 retrocruzas so-


bre teosinte como progenitor femenino. Es-tas líneas presentaron comportamientomeiótico regular con formación de bivalentes.Todas las líneas aloplásmicas presentaroncaracterísticas citológicas en común. Una deestas características es que, en mas del 50 %de las células analizadas en Diplotene -Metafase I, los 10 bivalentes se distribuye-ron en dos grupos de cinco bivalentes cadauno. Si bien este comportamiento meióticofue descripto en híbridos y en razas nativasde maíz, en las líneas aloplásmicas se obser-va con mayor claridad y frecuencia. Otra ca-racterística observada en las líneasaloplásmicas es que, en aproximadamente20-40% de los meiocitos en Profase I,Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 IIpresentan una leve asincronía en su compor-tamiento meiótico (es decir que, por ejem-plo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mien-tras que el resto de los bivalentes permane-cen en Metafase I). La drástica separación endos grupos de 5 II en la mayoría de las célulassugiere que la interacción «citoplasma deteosinte-nucleo de maíz « influencia la distri-bución espacial de los cromosomas en el nú-cleo. La presencia de dos grupos de 5 II y laasincronía de los mismos en líneasaloplásmicas de maíz sugiere que el citoplas-ma de teosinte promueve la separación yasincronía de dos genomas diferentes con 10cromosomas cada uno (x=5). Evidenciascitogenéticas de la naturaleza poliploide delmaíz y especies afines se discutirán con ma-yor detalle en la próxima sección.

Citogenética de poliploides. El estudiomeiótico de poliploides e híbridos entretaxones con distinto nivel de ploidía aportamayor información que el realizado enhíbridos diploides puesto que se puede ana-lizar la afinidad relativa de distintos genomasen el mismo fondo genético. En estos casosla formación de multivalentes es decisiva paraestablecer las relaciones entre genomas.

En el género Larrea el híbrido estéril en-tre la especie diploide L. divaricata (2n=26)y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado,en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje delas células analizadas, indicando que L.divaricata o una especie muy afín sería unprogenitor de L. cuneifolia. El análisis de lasasociaciones meióticas en especies e híbridosdel género Zea nos reveló la naturaleza

alotetraploide del maíz y especies relaciona-das con 2n=20 cromosomas. En híbridos con2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z.perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) laconfiguración meiótica más frecuente fue 5III + 5 II + 5I. Zea perennis, con 2n=40cromosomas presentó, con frecuencia eleva-da, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones sólopueden ser claramente explicadas proponien-do dos genomas (A y B) de 5 cromosomascada uno, siendo AmAm BmBm y ApApA’pA’p Bp1Bp1 Bp2Bp2 las fórmulas genómicaspostuladas para maíz y Zea perennis, res-pectivamente. Nuestro grupo de trabajo haencontrado, en especies e híbridos con 2n=20cromosomas, formación frecuente de dosgrupos de 5 II cada uno en MI. Este «doblehuso» observado sería una evidencia de laexistencia de genomas ancestrales con 10cromosomas cada uno. Además, en alrede-dor del 50 % de las células observadas en al-gunas líneas de maíz e híbridos interespecí-ficos se observó «asociación secundaria» debivalentes, sugiriendo la existencia dehomeología entre los genomas ancestralesA y B postulados.

Tratamientos premeióticos con solucionesdiluidas de colchicina (0,5 x 10 -4) en el géne-ro Helianthus indujeron apareamientohomeólogo y formación de multivalentes enespecies que, aunque tienen origenpoliploide, poseían meiosis regular con for-mación de bivalentes. Los resultados obteni-dos sugirieron que estos tratamientos pue-den inducir apareamiento intergenómico.Este tratamiento produce el mismo efectoque alelos mutantes de genes que controlanel apareamiento, permitiendo recombinaciónentre genomas que normalmente norecombinarían. Hemos realizado tratamien-tos con soluciones diluidas de colchicina enmaíz y Z. perennis con la finalidad de detec-tar recombinación entre los genomas A y Bpostulados anteriormente. El maíz tratadomostró en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientrasque el maíz testigo sólo formó bivalentes.Estos resultados sugirieron que en maíz exis-ten genomas homeólogos (Am y Bm) con 5cromosomas cada uno. El tratamiento en Zeaperennis dió como resultado un incrementoen la frecuencia de IV señalando tambiénmanifestación de homeología dentro de losgenomas A y B. El tratamiento con colchicina


de los híbridos con 2n=30 cromosomas, Z.diploperennis x Z. perennis y Z. perennis xZ. mays ssp mays dieron resultados diferen-tes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tra-tamiento con colchicina provocó un aumen-to en la frecuencia de trivalentes, no obser-vándose nunca IV ó VI. En cambio el híbridoZ. perennis x Z. mays ssp. mays tratado concolchicina, no sólo mostró un aumento en elporcentaje de III sino que el 43% de las célu-las analizadas en Diacinesis -MI mostraron IVy VI. Estos resultados permitieron concluir quesi se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd yAp-Bp, sólo son homeólogos los genomasAm y Bm.

El análisis conjunto de los datos obteni-dos en nuestro laboratorio no sólo confirmala naturaleza alopoliploide del maíz y espe-cies afines con 2n=20 cromosomas, sino quesugiere que en estas especies existen genes(semejantes al Ph descripto en trigo) queimpiden el apareamiento entre genomashomeólogos.

En Amaranthus la configuracióncromosómica de 8 II + 17 I observada en elhíbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus(2n=34), conjuntamente con la asociaciónsecundaria de bivalentes observada en espe-cies e híbridos con meiosis regular apoyaronla hipótesis de que las especies actuales deAmaranthus con 2n=32 cromosomas sonpoliploides con x=8. EL número n=16 sería unnúmero básico derivado y n=17 habría surgi-do por trisomía primaria.

Se han dado varios ejemplos en los cua-les el análisis meiótico ha permitido dilucidarel origen y postular modos de especiación envarios grupos. Como ya se ha discutido, elapareamiento puede estar bajo controlgenético (por ejemplo genes tipo Ph) y amenudo estos genes pueden constituir unsistema mucho mas simple que los que con-trolan caracteres diagnósticos de especies ygéneros.

El establecimiento de sistemas taxonó-micos basados en relaciones genómicas de-ben en lo posible estar apoyados por estu-dios citogenéticos completos (cariotipo, ban-deo C y fluorescente, contenido de ADN,etc.), morfológicos, bioquímicos y molecu-lares.

Además de la utilidad en estudiostaxonómicos y evolutivos el conocimiento de

la meiosis es de importancia fundamental enestudios aplicados. En la producción dehíbridos o poliploides de importanciaagronómica se debe lograr un máximo defertilidad y esto está relacionado con el com-portamiento cromosómico. Aunque no siem-pre la esterilidad es de origen cromosómico,éste es un parámetro que debe ser controla-do.

4 Variación intra e interespecifica en eltamaño del genoma: evolución ysignificado adaptativo

Durante el proceso evolutivo ocurren cam-bios cuantitativos y cualitativos en el conte-nido de ADN total. En Angiospermas el ta-maño del genoma es muy variable entre gru-pos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsisthaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriacano estando esta variación relacionada nece-sariamente con nivel de ploidia. El conteni-do de ADN (valor C) se evalúa mediantemicrodensitometría o citometría de flujo. Sise descarta la variación en el nivel de ploidía,las principales causas de variación (intra ointerespecífica) del contenido de ADN serian:aneuploidía, polimorfismo numérico paracromosomas accesorios o supernumerarios,reordenamientos cromosómicos con perdidao duplicación de material genético y variaciónen el número de copias de secuencias nocodificantes.

La variación del tamaño del genoma seencuentra, a grandes rasgos, relacionada condiferencias en la complejidad organísmicapues los virus tienen genomas mas peque-ños que las bacterias y éstas a su vez meno-res que el de eucariotas. Sin embargo en or-ganismos superiores se encontró que el au-mento en el valor C no estaba relacionadocon complejidad organísmica, ni era explica-ble por la existencia de mayor número degenes funcionales (el contenido de ADN deun alga unicelular, por ejemplo, puede serigual al de una angiosperma leñosa). Estaparadoja o enigma del valor C (C: contenidode ADN del genoma haploide no replicado)fue explicada, en parte, cuando se demostróque en Angiospermas la variación del tama-ño del genoma involucra cambios en la can-tidad y proporción de secuencias de ADN re-petidas. Los estudios moleculares han reve-


lando gran complejidad dentro de losgenomas existiendo, además del ADNcodificante, secuencias repetidas que no co-difican tales como ADN satélite, minisatélites,microsatélites, y elementos transponibles.

En general, la relación «ADN génico, nogénico» disminuye con el aumento del tama-ño del genoma y en angiospermas con ele-vado contenido de ADN las secuencias repe-tidas pueden representar hasta el 90% delADN total. Estos resultados explican la natu-raleza de la variación pero planteaninterrogantes acerca del significado evoluti-vo de esta arquitectura repetida del genoma:¿cuál es el origen, función y/o significado deesta variación? ¿cuál es el papel del ADN re-petido, típicamente no codificante?, ¿quérelación poseen estos cambios con la fluidezy plasticidad del genoma en plantas? y ¿cuales la dirección, distribución y extensión deestos cambios en distintos grupos vegetales?.

Un enfoque para comprender el signifi-cado del tamaño del genoma fue analizar lasrelaciones que existían entre el contenido deADN y características celulares, organísmicasy geográficas. En varios grupos de plantas sevio que las variaciones en el contenido deADN total están correlacionadas positivamen-te con: volumen o longitud cromosómicas,área y volumen celular, porcentaje deheterocromatina, longitud del complejosinaptonémico, duración del ciclo mitótico,duración de la meiosis, tiempo mínimo degeneración, factores fenológicos, latitud yaltitud. Bennett (1987) crea el término«nucleotipo» para referirse a los aspectos delADN nuclear que afectan al fenotipo inde-pendientemente del ADN codificante. En laliteratura existen muchos datos que sugierenque el tamaño del genoma posee significa-do adaptativo y que los parámetrosnucleotípicos juegan un papel importante enla evolución, diversificación y adaptación adistintos ambientes, limitando el rango deexpresión fenotípica que puede ser alcanza-do por acción génica.

Por otro lado, varios autores opinan quelas secuencias de ADN no génico que pue-den variar en el genoma no poseen significa-do adaptativo constituyendo ADN «egoísta,parásito o ignorante». Otros investigadoresseñalan que no puede descartarse la existen-cia de mecanismos moleculares que generen

ADN repetido no codificante que, en formaoportunista, actúe como mutágeno y /oagente regulador.

En algunos organismos se ha demostra-do que la transposición de elementos móvi-les retrovirales pueden alterar la dinámica delgenoma provocando una inestabilidad quese puede traducir en una súbita explosión devariabilidad. Se conocen procesos de escisión-inserción de elementos móviles produciendopor ejemplo, plantas variegadas. Estos pro-cesos pueden, además, producir reestructu-raciones cromosómicas alterando el orden yposición de los genes. Estos cambios rápidospueden ser potentes mecanismos evolutivosya que concomitantemente con el aislamien-to reproductivo que implica la diferencia enrearreglos estructurales, los mismos puedeninvolucrar efectos de posición que, en algu-nos casos, poseen valor adaptativo. Todosestos procesos tienen, además relevancia enaspectos aplicados más inmediatos ya queun cambio en la posición de un gen puedecambiar la expresión o la función bioquímicadel mismo.

Se ha demostrado que el genoma de lasplantas es inestable y responde al estrés pro-vocado por alteraciones genómicas, ambien-tales, cromosómicas o citoplasmáticas. Estosfactores físicos, bioquímicos o genéticos in-ducen mecanismos de inestabilidadinsercional o modifican el numero de copiasde secuencias de ADN no codificante. La hi-bridación, en la naturaleza o en prácticas demejoramiento, ha sido, en algunos casos, unfactor que desencadena mecanismos de au-mento de ADN repetido. Otros experimen-tos han mostrado que la interacción entre elgenoma y el medio resulta en una rápidageneración de variación. En lino, por ejem-plo, se encontraron diferencias en el núme-ro de copias de ADN repetido entre líneasque crecían en medios con diferentesnutrientes. En líneas aloplasmicas de maízhemos encontrado que el citoplasma deteosinte provocaba activación de elementostransponibles concomitantemente con au-mento de secuencias de ADN repetido co-rrespondientes a las zonas heterocromáticas.El análisis del contenido de ADN ha permiti-do evaluar rápidamente fenómenos deaneuploidía y poliploidía generados por estrésdurante prácticas de cultivo de tejidos.


La variabilidad intraespecífica en el con-tenido de ADN fue informada y probada envarios grupos taxonómicos. El maíz y espe-cies silvestres relacionadas constituyen unejemplo de variación intraespecífica dondeestá bien demostrada la variación en el con-tenido de ADN debida a variación en por-centaje de heterocromatina (ADN repetido)y en el número de cromosomas supernume-rarios. En veintiuna razas nativas de maíz delnoroeste argentino ubicadas a lo largo de ungradiente altitudinal encontramos una corre-lación lineal negativa significativa entre elcontenido de ADN de los cromosomas nor-males (A) y la altitud de cultivo, esto significaque el contenido de ADN de los cromosomasdel maíz es menor en lugares de cultivo ele-vado, sugiriendo que las diferencias no pue-den ser al azar y obedecen a procesos selec-tivos. Es interesante señalar que esta dismi-nución del contenido de ADN de loscromosomas A se correlaciona con un aumen-to en la frecuencia de cromosomas acceso-rios no codificantes (B). Aunque se descono-cen las causas de este cline discordante en-tre dos tipos de ADN supernumerario nocodificante (ADN repetido- cromosomas B),su repetibilidad en distintos ambientes sugie-re que existen fuerzas selectivas involucradasen su mantenimiento. La presencia decromosomas accesorios (heterocromáticos,no codificantes sin funciones vitales para elorganismo), en razas nativas de plantas cul-tivadas tales como maíz y centeno, es unade las incógnitas actuales de la biología evo-lutiva y aun no se comprende el papel quepueden jugar los mismos en futuros planesde mejoramiento. El particular modo de he-rencia de estos cromosomas accesorios (conmecanismos de impulso que hacen que sehereden con mayor frecuencia que la espe-rada por herencia mendeliana) abre un nue-vo campo de investigación en lo que se refie-re a su utilidad como portadores de genesútiles en programas de mejora.

En resumen, la evolución del genomaeucariota ha involucrado casos de amplifica-ción, divergencia, reamplificación y deleciónde secuencias de ADN repetido. Estos proce-sos han llevado a grandes diferencias en eltamaño del genoma, quedando aun muchascuestiones por resolver en lo que se refiere alos mecanismos moleculares involucrados, la

frecuencia con que ocurren estos eventos yla relación de los mismos con factores am-bientales, genéticos ó fisiológicos. Resolverestas cuestiones permitirá comprender elpapel de la variación del tamaño del genomaen la evolución y analizar la relevancia de lavariación del contenido de ADN con relacióna características de importancia agronómica.

5 Citogenética molecular: resolución deproblemas básicos y aplicados

El hallazgo de técnicas para identificargenomas y cromosomas en preparaciones derutina ha representado un gran progreso enla citogenética vegetal, ya que disponer demarcadores cromosómicos permite estudiarla organización del genoma y la arquitecturanuclear. Las técnicas de bandeo (C, fluores-cente) permiten revelar zonas de ADN alta-mente repetido (heterocromatina constitu-tiva), pero no diferencian la composiciónmolecular del ADN. En ausencia de bandasmarcadoras no es posible identificarcromosomas con morfología similar. Ademásen especies alógamas suele existirpolimorfismo para número y posición de zo-nas heterocromáticas, lo que dificulta la ca-racterización cromosómica y la detección deregiones introgresadas. Un notable ejemplode polimorfismo y politipismo para bandasheterocromáticas lo constituye el estudio delíneas y razas nativas de maíz. Los marcado-res moleculares combinados con lacitogenética resultaron ser de gran utilidadpara entender la organización cromosómicay la distribución física de las secuencias repe-tidas. El gran potencial de las técnicas de hi-bridación in situ resulta de combinar infor-mación acerca de la morfología nuclear ocromosómica con la información molecular dela estructura de las secuencias. Aunque estastécnicas se conocen desde 1969 utilizandomarcación radioactiva, en plantas se comen-zó a aplicar a fines de la década del 80 debi-do a la gran disponibilidad de secuenciasclonadas para utilizar como sonda. Además,la posibilidad de utilizar ADN genómico totalcomo sonda ( GISH) y modernos sistemas demarcación y detección no radioactivos hanimpulsado el uso de esta técnica en formarutinaria, complementando los resultadosobtenidos por metodologías más clásicas.


Mediante la aplicación de estas técnicas seobtienen datos que podrán ser utilizados enestudios de sistemática, filogenia,biodiversidad, evolución, mejoramiento ybiotecnología.

La hibridación in situ (ISH) de sondas deácidos nucleicos en preparaciones cromo-sómicas involucra cuatro pasos fundamenta-les que son: 1) Obtener una sonda marcan-do secuencias de ADN; 2) reacción de hibri-dación entre la sonda y el ADN blanco(cromosomas), ambos desnaturalizados pre-viamente. Las secuencias complementarias dela sonda y del ADN de los cromosomashibridarán, en relación a su homología, enun «sitio citológico»; 3) remoción de la son-da que no se unió o que se hibridó en formainespecífica; 4) Detección de la hibridación yvisualización de la hibridación a través defluorocromos.

Una de las aplicaciones de esta técnica(FISH o «fluorescent in situ hybridization») esla obtención de un mapa físico, funcional yestructural del genoma utilizando secuenciasde distinto origen como sondas. El análisisde la organización física de secuencias repeti-das, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs,ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc.,permite identificar cromosomas, analizar laarquitectura nuclear del genoma y verificar hi-pótesis acerca de la relación entre posición yfunción de determinadas secuencias. Otrasaplicaciones de esta técnica consisten en de-terminar la distribución y posición de mate-rial cromosómico extraespecífico, la existen-cia de apareamiento y recombinaciónintergenó-mica, la existencia de segregaciónpreferencial (responsables de herencia nomendeliana de algunos tipos cromosómicos),la presencia y tipo de rearregloscromosómicos y analizar la segregación dedeterminados cromo-somas en estudios evo-lutivos y planes de mejora. Estos son relevan-tes para comprender la relación entre estosfenómenos y variaciones en la expresióngénica.

La hibridación in situ utilizando ADNgenómico total como sonda (GISH o GenomicISH) revela homologías específicas del ADN,principalmente en lo que respecta a secuen-cias repetidas y ha permitido realizar apor-tes relevantes en estudios evolutivos,biosistemáticos y en mejoramiento vegetal.

Esta técnica ha facilitado, por ejemplo, el re-conocimiento de especies parentales enhíbridos y poliploides, analizar afinidadesgenómicas interespecíficas, detectar reestruc-turaciones cromosómicas, corroborar que enel núcleo existen dominios espaciales degenomas o secuencias particulares, detectarla existencia de apareamiento intergenómicoy recombinación. Además, permite analizarla organización nuclear y desarrollocromosómico en especies e híbridos; detec-tar la presencia de cromosomas o segmen-tos cromosómicos introgresantes en planesde mejoramiento; analizar afinidadesgenómicas interespecíficas en cuanto a varia-ción en secuencias de ADN repetitivo disper-so y determinar la naturaleza del apareamien-to meiótico en generaciones segregantes dehíbridos y poliploides. Es importante señalarque las relaciones obtenidas mediante GISHno son afectadas por genes que producendisturbios en el apareamiento meiótico(asinapsis, desinapsis, apareamientohomeólogo o heterólogo).

Como ya fue mencionado, el ADN repeti-do es el mayor componente del genoma enla mayoría de los eucariontes. En maíz, porejemplo, el genoma está dominado por ele-mentos repetidos, siendo la mayoría de és-tos del tipo disperso (como, por ejemplo,retroelementos), los que ocuparían el 33- 62%del genoma. En el género Zea, por ejemplo,existen variaciones intra e interespecíficas enel tamaño del genoma. Su valor (2C) en es-pecies con 2n = 20 oscila, en líneas y razasargentinas de maíz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z.luxurians. Estas variaciones, tanto inter-como intraespecíficas se deberían principal-mente a diferencias en la heterocromatina,reveladas por bandeo C y DAPI, que corres-ponderían a secuencias repetidas «entandem». Sin embargo, tanto este tipo deADN repetido «en tandem», como así tam-bién el «disperso» correspondiente a losretrotransposones, pudieron haber experi-mentado amplificaciones y diversificacionesdurante la evolución de las especies del gé-nero Zea. La técnica GISH es, en la actuali-dad, la herramienta adecuada para revelartales amplificaciones y divergencias. Esta téc-nica puede discriminar en forma directa aque-llos genomas que presentan secuencias tandivergentes que no existe hibridación cruza-


FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridación con la sonda«Knobs» de maíz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratinción con DAPI, las zonas intensamentehibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , núcleo interfásico; lamayoría de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte señal de hibridación en C; se utilizó sonda «Knob»de maíz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B),hibridación con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se señalan (puntas de flechas)los organizadores nucleolares en cromosomas y núcleo interfásico. F = Prometafase I meiótica de la F1 Zea mays ssp.mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la señal de hibridación se encuentra en un trivalente (señaladocon flecha), se utilizó como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = célula de Tricepiro; G = hibridada consonda de ADN genómico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14cromosomas con fuerte señal de hibridación indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igualcélula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte señal con Cy3 (en rojo), permitióreconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratinción con DAPI. La barra representa 10 micrones,todas con igual aumento. Ver explicación extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,by 2000.


da entre ellas. El uso de ADN genómico totalcomo sonda especie-específica tiene algunasventajas sobre sondas clonadas pues el ADNgenómico total incluye un rango muy ampliode secuencias múltiple copia y es por lo tan-to improbable que exista sólo un lugar afín ala sonda. Esto es una ventaja cuando se ne-cesita una amplia especificidad, ya que unasonda clonada sería homóloga de algunospocos cromosomas o segmentos decromosomas. En los casos en que la divergen-cia sea leve, puede modificarse el nivel deexigencia en la hibridación y utilizar DNA nomarcado como bloqueante. Esta modifica-ción consiste en agregar a la mezcla de hibri-dación ADN no marcado en alta concentra-ción. Este bloqueo no sólo aumenta la dife-renciación entre la especie que se usa comosonda y la que se usa como bloqueante, sinoque reduce la hibridación cruzada con otrasespecies, ya que muchas plantas de la mismafamilia comparten muchas secuencias. Paradiferenciar especies y cuando la resolución esimportante se requiere bloqueo y estrictocontrol de exigencia.

Estudios de hibridación in situ (FISH, GISH)mostraron que el cereal sintético Tricepiro(2n=6x=42) está compuesto por 28cromosomas de trigo, 14 de centeno y pe-queñas zonas de introgresión de Thyno-pyrum. Mediante el uso de sondas repeti-das particulares se logró identificar la totali-dad de los cromosomas de Tricepiro. Experi-mentos con GISH han demostrado queBromus setifolius (2n=28), es uno de los pro-genitores de B. pictus (2n=70), gramíneapatagónica de potencial importanciaforrajera. En el genero Zea la técnica GISHnos ha permitido: analizar la afinidadgenómica entre subespecies de la sección Zea,y entre maíz, teosinte y géneros relaciona-dos. Mediante GISH hemos demostrado queexisten zonas de alta homología entreTripsacum dactyloides (una de las especiesque pudieron haber estado involucradas enel origen del maíz) y Zea mays spp. mays. Es-tas zonas coinciden con regiones contro-ladoras de la apomixis y secuenciasneocentroméricas. Estos resultados apoyanhipótesis planteadas previamente sobre laexistencia de zonas de homología entre am-bas especies que favorecerían el intercambio

genético y la transferencia de genes de im-portancia para el mejoramiento del maíz.Estudios realizados en especies de la secciónLuxuriantes permitió determinar, mediantetécnicas de FISH, que Zea luxurians presen-taría secuencias teloméricas de ADN altamen-te repetitivo. El análisis de estas secuenciasmarcadoras en meiosis nos permitió resolverla constitución cromosómica de las comple-jas configuraciones meióticas que se obser-van en híbridos intra e interseccionales. Es-tos resultados permitieron corroborar las fór-mulas genómicas planteadas para las distin-tas especies, avalando la hipótesis propues-ta sobre el origen poliploide del maíz y espe-cies afines. Las mismas técnicas, aplicadas enrazas de maíz que presentan polimorfismonumérico para cromosomas B, permitieronpostular hipótesis acerca del origen de losmismos.

6 Lecturas recomendada

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PARTE IIIMétodos

para generar variabilidad

82 CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana


III.-Capítulo 1

Variación somaclonal

Cardone, Susana; Olmos, Sofía;Echenique, Viviana

1 Introducción

El comportamiento celular normal es elresultado de una compleja cascada de pro-gramas genéticos que son sensibles a ladisrupción por estreses bióticos y abióticos.El cultivo in vitro per se puede ser muyestresante para las células vegetales einvolucra procesos mutagénicos durante elestablecimiento del explanto, la inducción decallo, la formación de embriones y la regene-ración de plantas. Por esta vía es posible ob-tener variación, de origen nuclear y/ocitoplasmática, que podría ser utilizada parael mejoramiento vegetal. Este proceso, de-nominado variación somaclonal por Larkiny Scowcroft (1981), involucra cambios en lasplantas regeneradas que son transmitidos ala progenie. Asimismo cabe citar la ocurren-cia in vitro de interacciones no específicas queno generan variación estable y transmisible,pero que conducen a cambios en la expre-sión génica. Dichos cambios, denominados«epigenéticos», son también consideradospor algunos autores como variaciónsomaclonal mientras que otros sólo incluyenen la misma los cambios estables.

Los mecanismos por los cuales ocurre lavariación somaclonal no han sido completa-mente dilucidados, pero entre sus causas semencionan alteraciones en el cariotipo, mu-taciones puntuales, recombinación somáticae intercambio de cromátidas hermanas,rearreglos génicos somáticos, elementosgenéticos transponibles, amplificación y/ometilación del ADN y cambios en el ADN delas organelas. Por ello, aunque los caracteresmorfológicos (como por ejemplo el hábito decrecimiento, la morfología floral, etc.) sonfáciles de evaluar, muchos aspectos de la va-riación suceden sin manifestarse en cambiosmorfológicos evidentes. Una diferencia es-tructural en un producto génico puede noalterar su actividad biológica lo suficientecomo para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variación debe analizarse a variosniveles.

Esta variación depende del genotipo, dela fuente de explanto, del tiempo en que elmaterial ha estado sometido al cultivo invitro, de las condiciones y composición delmedio de cultivo y de la vía de regeneración,donde la embriogénesis somática generaríamenores alteraciones que la organogénesis.

Los cambios producidos son generalmen-te indeseables, pero la aparición ocasional decaracteres no encontrados en las poblacio-nes naturales y que representan una venta-ja desde el punto de vista agronómico per-mite utilizar este fenómeno en programas demejora vegetal. Se ha utilizado en algunoscasos para conferir caracteres deseables acultivares de importancia económica, entrelos que se incluyen resistencia a enfermeda-des, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad.El desarrollo de nuevos cultivares por estatécnica involucra un balance entre la canti-dad de variación inducida y el mantenimien-to de los caracteres agronómicos del cultivar.Como ejemplo puede citarse el caso desomaclones de pasto bermuda, Cynodondactylon, donde se encontró resistencia a laoruga militar en un cultivar que reunía otrasbuenas características, dando origen al culti-var Brazos-R3.

Si bien desde el punto de vista prácticono resulta una técnica muy eficiente en to-dos los casos, debido a que no es posiblepredecir ni dirigir el tipo de variación y se hacemenester trabajar con grandes poblacionesde plantas, es necesaria la compresión delmecanismo para evitarlo en casos donde sequiere fidelidad genética, como en lamicropropagación, la conservación degermoplasma y la transformación de plantas.También, en algunos casos, puede represen-tar una fuente rápida y fácilmente accesiblede variación para ser utilizada en programasde mejoramiento, especialmente para espe-cies con sistemas genéticos limitados y/o debase genética estrecha, como en el caso dela apomixis, donde la variabilidad dentro delas poblaciones naturales o cultivadas es limi-tada.

Los primeros casos de variaciónsomaclonal fueron registrados en plantas dereproducción agámica como la caña de azú-car y la papa, pero el fenómeno ha sido ob-


servado en monocotiledóneas como trigo,maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalumdilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula)y en dicotiledóneas como tabaco, tomate,zanahoria y col, entre muchas otras especies.

2 Factores relacionados con la apariciónde variación somaclonal

La aparición de la variación somaclonaldepende de varios factores, entre los que sehan citado: el genotipo, el tipo de explanto,la vía de regeneración, la composición delmedio de cultivo utilizado, los reguladores decrecimiento y la duración del período de cul-tivo.

Genotipo. En general se asume que la fre-cuencia de cambios dependerá de variacio-nes preexistentes en el genotipo y de lasinteracciones que surgen entre el genotipo yel proceso de cultivo. En arroz, ciertas varie-dades estables muestran niveles de variaciónque oscilan entre el 0 y el 1%, mientras queen otras, consideradas inestables, oscilanentre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especieornamental, la variación somaclonal esgenotipo dependiente y se la utiliza comouna herramienta para la obtención de varie-dades.

El nivel de ploidía es otro factor a teneren cuenta. Por ejemplo en raigrás (Loliummultiflorum) y en papa se observó que lasvariedades diploides muestran estabilidad,mientras que las tetraploides tienden a ge-nerar aneuploidías durante el cultivo de teji-dos. La explicación más razonable es que lospoliploides, con más de dos juegos comple-tos de cromosomas, están «tamponados»,y por lo tanto toleran la ganancia o pérdidade cromosomas, pudiendo así cumplir con losrequisitos impuestos por la regeneración. Enlos diploides, la pérdida o la alteración decromosomas que llevan genes vitales impe-dirá la regeneración de las plantas, llegandocon éxito a esta etapa sólo aquellosexplantos que tengan su complementocromosómico completo.

Existen evidencias de una mayor inesta-bilidad en híbridos interespecíficos cultivadosin vitro, si se los compara con las especiesparentales. Como ejemplo puede citarse elcaso de los híbridos obtenidos de la cruza deHordeum vulgare x Hordeum jubatum,

donde el cultivo in vitro generó entre un 5%y un 10% de regenerantes haploides que con-tenían sólo el genoma de Hordeum vulgare.Por esta causa ciertos cruzamientosinterespecíficos suelen utilizarse como meto-dología para la obtención de haploides.

Explanto. La variación también puede seruna consecuencia de quimerismo en elexplanto original. Las quimeras son mosaicosgenéticos. Esto significa que dentro de unamisma planta existen células con diferenteconstitución genética, lo cual se debe a unaserie de cambios producidos durante el de-sarrollo en el ADN nuclear de ciertos tiposcelulares. Si estos tejidos se utilizan comoexplantos y sus células son inducidas a divi-dirse y rediferenciarse, las diferentes líneascelulares podrían entonces dar origen a plan-tas genéticamente diferentes. Por lo tanto,la utilización de explantos con tejidos quimé-ricos preexistentes puede resultar en unafuente extra de variación. Sin embargo, larecuperación de quimeras a partir deexplantos no quiméricos es un fenómeno fre-cuente que puede ocurrir a partir de proce-sos organogénicos.

La utilización de explantos con tejidosorganizados como esquejes radicales ocaulinares sería una buena opción si es nece-sario mantener estabilidad genética duran-te el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentesgenotipos reaccionan de manera distinta,aún con explantos «seguros». Parecería queel cultivo de meristemas aislados sería la me-jor opción para minimizar el riesgo de varia-ción somaclonal. Sin embargo, esto no de-bería tomarse como regla. Utilizando técni-cas moleculares fue posible detectar la ocu-rrencia de variación en plantas de frutilla yparaíso obtenidas a partir de meristemas.

El cultivo de protoplastos parecería indu-cir, en ocasiones, inestabilidad genética, comofue observado en papa y Nicotiana. Esto,en ocasiones, ha sido asociado a los mayo-res tiempos en cultivo involucrados en la re-generación de plantas a partir de explantostan pequeños.

La vía de regeneración también tiene unrol importante en la ocurrencia de alteracio-nes en plantas obtenidas in vitro. En espe-cies de los géneros Pennisetum, Panicum, yLolium la variación observada en cultivosembriogénicos es relativamente menor que


la que aparece en cultivos organogénicos.Esto probablemente se debe a la gran pre-sión de selección impuesta en la formaciónde los embriones, mayor que la requeridaen la formación de vástagos. Se postula queel gran número de genes requeridos para lainiciación y maduración de embrionescigóticos y somáticos impediría la acumulaciónde mutaciones deletéreas. Sin embargo, seobservaron variantes en plantas de café, apioy caña de azúcar regeneradas a través deembriogénesis somática. En estos casos seobservó que algunos fenotipos anormales deembriones somáticos se asemejan a losmutantes del desarrollo embrionario obte-nidos en Arabidopsis y maíz.

La mayor parte de la variación obtenidain vitro parece provenir de la fase de callo.La iniciación de un callo puede ser análoga ala respuesta de las plantas a heridas, que sesabe que activan elementos transponibles yestimulan la inducción de enzimas y produc-tos específicos que se inducen también ensituaciones de estrés. Cuando comienza ladivisión celular a partir de tejidos diferencia-dos, que dará origen a un callo, se incrementael riesgo de inestabilidad cromosómica. Lavariación que ocurre en los númeroscromosómicos en la primera fase de la induc-ción del callo sería el resultado de fragmen-tación nuclear seguida por mitosis de los frag-mentos nucleares, combinada con la mitosisnormal de los núcleos intactos (núcleoseuploides).

La naturaleza del callo también puedeafectar el nivel de variación obtenida. Un ca-llo verdadero es una masa de célulasdesdiferenciadas que proliferandesorganizadamente, lo cual probablemen-te genera considerable variación. En variasmonocotiledóneas, el callo representa, amenudo, una masa de órganos suprimidos oproembriones más que un tejido completa-mente desorganizado. Este tipo de callomantiene un alto grado de estabilidadgenética, como se ha observado en espárra-go. En un estudio realizado en Cymbopogonse observó que muchas de las plantas rege-neradas a partir de callos de semilla fueronanormales, mientras que las obtenidas porcallos de inflorescencias fueron muy semejan-tes a las plantas de las cuales provenían losexplantos. En ocasiones también fue posible

observar variación en plantas obtenidas porregeneración directa, es decir, sin que medieun proceso previo de desdiferenciación celu-lar y formación de callo.

Medio de cultivo. El estado físico delmedio de cultivo también influye en el nivelde variación obtenida. Un mismo explantopuede tener diferente comportamiento si selo cultiva en medio sólido o en medio líqui-do. Otro factor importante es la temperatu-ra, que puede inducir inestabilidad cariotípicao puede incrementar el número de plantasalbinas.

Los reguladores de crecimiento, princi-palmente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxia-cético) han sido señalados como inductoresde inestabilidad. Ejercen profundos efectossobre la respiración celular, el consumo deazúcares y en el control de la división celular.Por ello se especula acerca de su rol indirectoen la inducción de cambios en el metabolis-mo celular y tisular de plantas creciendo invitro. Si bien el modo de acción herbicida del2,4-D no es totalmente comprendido, apa-rentemente involucra un incremento sustan-cial en la transcripción que puede alterar laestructura de la cromatina, siendo utilizadoen gramíneas como inductor deaneuploidías. Lo que algunos autores sugie-ren es que el 2,4-D induce desdiferenciacióny este proceso sería el generador de los cam-bios.

La fragmentación nuclear amitótica cita-da anteriormente observada en algunasplantas regeneradas también se reconocecomo causa de aneuploidía. Este fenómenoes causado por una relación especialauxina:citocinina.

El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y elANA (ácido naftalenacético) han sido seña-lados como los responsables de los incremen-tos en la metilación de la citosina que tienelugar durante el cultivo in vitro. Los sectoresen el ADN, donde la citosina se encuentrametilada en posición 5 son considerados pun-tos calientes de mutación, ya que ladesaminación de una 5-metil citocina resultaen un cambio de la base de citocina a timina.Las auxinas naturales y sintéticas tienen unaelevada correlación con el porcentaje de 5-metil citocina, las citocininas no tienen efec-to en este sentido.


Estudios tendientes a analizar los efectosde los reguladores de crecimiento sobre laregeneración de plantas a partir deprotoplastos, realizados en papa, indicaronque la variación en el tipo y concentraciónde reguladores de crecimiento en los esta-dios iniciales de cultivo no generaría variacióngenética. Sin embargo, si el cambio en la com-posición de los reguladores ocurre en el esta-dio que va desde el crecimiento del callo a lainiciación de los vástagos, se generan eleva-dos niveles de variación genética. Estos da-tos sugieren que la fase de callo sería un pe-ríodo sensible en el cual la manipulación hor-monal afecta la estabilidad de las plantasregeneradas, de manera que las hormonasinducirían la inestabilidad genética sin ser,necesariamente, el origen de la misma.

Otro factor a considerar es la deficienciade oxígeno que se genera durante el cursodel cultivo. La tensión de oxígeno de las célu-las en la superficie del callo es diferente a lade aquellas células que se encuentran situa-das profundamente en la masa del mismo.La anaerobiosis resultaría en la producción deetanol, el cual podría comportarse como unmutágeno.

También existen especies de plantas queproducen compuestos mutagénicos duranteel cultivo. Un efecto similar podría tener laacumulación de metabolitos producidos porlas propias células durante el proceso. Se hamencionado que las condiciones de cultivoin vitro podrían afectar los niveles de resis-tencia celular al efecto de los metabolitos quenormalmente se encuentran presentes en lostejidos en bajas concentraciones.

La edad del cultivo es otro factor queafecta el nivel de variación, aumentando laproporción de variantes en cultivos envejeci-dos y también en plantas obtenidas a travésde varios subcultivos. Esto se ha observadoen ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrástriploide. La variación puede minimizarse rea-lizando subcultivos frecuentes de explantosno envejecidos. El número óptimo desubcultivos podría estimarse empíricamenteluego de realizar pruebas de fidelidadgenética en las plantas regeneradas a travésde subcultivos subsecuentes. Una observacióncomún es que en los períodos prolongadosde cultivo hay una pérdida de totipotencia yque esto sucedería debido a la acumulación

de mutaciones y a la alteración de los genesque son responsables de la regeneración. Sinembargo, un estudio realizado por nuestrogrupo de trabajo en la UNS, en colaboracióncon el IBONE, demostró que las variacionesse producen al azar en los diferentessubcultivos, no habiendo una relación linealentre el número de subcultivos y la cantidadde variación obtenida en plantasmicropropagadas de paraíso gigante. La va-riación en este caso se detectó mediante laténica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos(Olmos y col., 2002).

La deficiencia o exceso de minerales tam-bién podría afectar la estabilidad genética invitro. Se ha observado que las deficiencias oexcesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcioy magnesio pueden resultar en cambiosgenómicos. En la variedad de lino «StortmontCyrrus» se detectaron cambios genéticos es-tables y heredables inducidos por una altafertilización del suelo con fósforo o con ni-trógeno. Varias líneas estables obtenidas,fundamentalmente una llamada «L» y otrallamada «S», denominadas genotrofos, secaracterizaron por poseer diferentes conte-nidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo ydiferencias a nivel del ADN ribosomal.

3 Cambios genómicos producidosdurante el cultivo de tejidos

Las plantas poseen una amplia capacidadde acomodarse a las situaciones cambiantesde su entorno, pero en algún momento esacapacidad de amortiguación se vuelve defi-ciente y los organismos caen en un estadode crecimiento subóptimo que podría indu-cir a mecanismos generadores de cambiosgenómicos. Las bases metabólicas de lainteracción entre el estrés y estos cambiosson desconocidas. Sin embargo, en la litera-tura se menciona la posibilidad de ocurren-cia de alteraciones a nivel del ADN a conse-cuencia de diferentes estreses ambientales,dependiendo de la intensidad del estrés ydel estado de diferenciación de las células enel momento de experimentarlo. Estos cam-bios ocurren probablemente debido a unmecanismo de respuesta al estrés que com-prende la pérdida del control del ciclo celu-lar. En el caso de un callo, la desdiferenciaciónque se produce durante la inducción del mis-


mo provoca en las células una serie de proce-sos metabólicos que resultan enreordenamientos genómicos que podríandar lugar a fenotipos alterados.

Entre las alteraciones genéticas registra-das durante el cultivo in vitro pueden citarsemutaciones génicas, cambios cromosómi-cos que involucren la estructura o el nú-mero de los cromosomas y activación deelementos genéticos transponibles. Tam-bién existen anomalías, como el intercambioentre cromátidas hermanas o el «crossingover» somático, que pueden alterar su fre-cuencia de aparición en plantas regeneradasrespecto de plantas que no pasaron por cul-tivo in vitro.

Varias hipótesis han intentado explicar yrelacionar la serie de eventos que tienen lu-gar durante el cultivo in vitro, como por ejem-plo las perturbaciones del ciclo celular, lasaberraciones estructurales y numéricas, loscambios en la metilación y las mutacionesgénicas. Kaeppler y Phillips (1993) han pro-puesto una base molecular común para to-dos estos eventos mutagénicos. Tal mecanis-mo podría afectar la expresión génica y laestructura de la cromatina. Un posible meca-nismo involucra alteración en los patrones demetilación. Esta hipótesis establece que elestrés inducido por el proceso de cultivo invitro, al involucrar efectos hormonales ydesbalance en el conjunto de nucleótidos,provoca alteraciones en los patrones demetilación del ADN. Estas alteraciones po-drían afectar la expresión de genes específi-cos, incluyendo elementos transponibles y/o podrían afectar la estructura de lacromatina de una manera más global,involucrando, por lo tanto, a un gran núme-ro de genes. Los cambios en la metilación delADN podrían estar relacionados con lareplicación tardía de la heterocromatina, que,en definitiva resulta en eventos de rupturacromosómica.

El mecanismo por el cual se producen loscambios en metilación no ha sido totalmen-te dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indi-can que plantas bajo estrés severo denutrientes o de agua no presentan estos cam-bios de metilación encontrados en losregenerantes de cultivo in vitro. Esto podríaindicar que la variación en metilación no esuna respuesta general a todos los estreses.

El cultivo de tejidos podría representar, porlo tanto, un tipo muy particular de estrés quepodría inducir una respuesta única y un perfilparticular de mutación. Un posible efector deesta variación en la metilación sería la altaconcentración de reguladores de crecimien-to utilizada para inducir a las células a creceren cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la es-tructura de la cromatina en ápices de raíz deechalote y también en cultivos de células hu-manas. Las auxinas podrían ejercer el mismoefecto durante el cultivo de tejidos vegeta-les.

Se cree, además, que los cambios en losmodelos de metilación causados por el culti-vo de tejidos no serían aleatorios. En estesentido, en raigrás se ha propuesto la exis-tencia de puntos calientes de inestabilidaden el ADN genómico.

Los puntos de ruptura de muchas de lasalteraciones estructurales presentes en lasplantas regeneradas se hallan en zonasheterocromáticas, de manera que pareceríaque la variación somaclonal no es al azar yque habría loci específicos que tendrían ma-yor tendencia a la mutación. Los cambiosestructurales que no están asociados a cam-bios en el dosaje génico o a cambios en laregulación suelen pasar desapercibidosfenotípicamente, pero pueden causar infer-tilidad.

Por otra parte ocurren también cambiosgenómicos que involucran alteraciones en elnúmero de cromosomas, como aneuploidíasy poliploidías. La poliploidía es el más comúnde estos fenómenos y estaría relacionada confallas en la mitosis, mientras que laaneuploidía puede surgir por segregacióndesigual en la mitosis o por fragmentaciónnuclear, seguida de mitosis. A veces estoscambios en el número cromosómico puedenafectar el fenotipo a través de dosajesgénicos alterados. En papa, por ejemplo, seobservaron fenotipos aberrantes poraneuploidía o por duplicación cromosómica;sin embargo, no todos los regenerantesaneuploides o poliploides pudieron detectar-se a nivel fenotípico.

Los cambios pueden ocurrir también enel genoma de los plástidos y lasmitocondrias. Como ejemplo puede mencio-narse la restauración parcial de la fertilidaden plantas de sorgo androestériles obteni-


das in vitro. También puede citarse el casodel cultivo in vitro de plantas androestérilesde maíz con citoplasma «T» (susceptibles aHelminthosporium maydis), que condujo ala reversión de la androesterilidad y de la sus-ceptibilidad. Estos cambios se corresponde-rían con mutaciones en el ADN mitocondrial.

Otro caso de variación debida al cultivoin vitro es el albinismo, problema que se pre-senta frecuentemente en el cultivo deanteras en las Gramíneas. El análisis de losgenomas de cloroplastos de plantas albinasde trigo obtenidas a partir del cultivo deanteras reveló la presencia de deleciones yrearreglos. Si bien parecería que los tejidossomáticos son menos sensibles a la variación,también se ha observado albinismo en plan-tas regeneradas a partir de los mismos.

Como puede apreciarse a través de loscasos mencionados, son varios los mecanis-mos que conducen a la variación somaclonal.Como se mencionara anteriormente existen,además, variaciones epigenéticas, que noson estables y que son el resultado de cam-bios en los patrones de metilación del ADN yde amplificaciones génicas, provocados porlas condiciones microambientales del cultivode tejidos. Características tales como el acos-tumbramiento a la citocinina y la resistenciaa heladas pueden citarse como ejemplos deeste tipo de variación.

La comprensión de los mecanismos porlos cuales ocurre la variación somaclonal ayu-daría a comprender y definir los procesos ce-lulares de respuesta al estrés y permitiría de-finir cómo los mismos actúan en los procesosde evolución (Kaeppler et al., 2000).

4 Niveles de detección de la variaciónsomaclonal

Es evidente que los mecanismos que ope-ran para inducir variación son numerosos ydiversos, y probablemente actúan simultá-neamente, conduciendo a cambios en carac-teres cuali y cuantitativos. Detectar y anali-zar los distintos niveles de modificacionesgenómicas generadas por cultivo in vitro re-viste interés desde un punto de vista prácti-co, ya que las mismas podrían ser potentesfuentes de material para seleccionar caracte-res de interés y, desde un punto de vista teó-rico, ya que posibilitarían realizar estudios

básicos acerca de la variación y el posible con-trol de la misma.

La ocurrencia de variación somaclonalpuede detectarse con marcadoresfenotípicos, bioquímicos y moleculares. Lacorrelación de dichos marcadores con carac-teres agronómicos es un requisito relevantepara su implementación en los programas demejoramiento. Se citan a continuación algu-nos ejemplos de la utilización de marcadoresde varios tipos en la evaluación de la varia-ción somaclonal..

La utilización de marcadores morfoló-gicos para detectar variantes somaclonalesha sido exitosa y citada en varios trabajos deinvestigación. El examen visual y la utilizaciónde un analizador de imágenes posibilitaronla diferenciación entre fenotipos normales yaberrantes de plantas regeneradas dePelargonium x hortorum ¨Río¨. Plantas de(maní) presentaron variaciones epigenéticasen altura, tamaño de hojas, número y pesode semillas. El cultivo in vitro de yemas deananá dio como resultado plantas que exhi-bían cambios estables en el tamaño de fru-tos, tasa de proliferación de vástagos y colory textura de las hojas; el cultivo de tejidosde violeta africana, variedad «Crimson Frost»,resultó en un 67% de variación en el color delas flores de las plantas regeneradas.

A nivel fisiológico, se detectaron y se-leccionaron variaciones en cultivo de célulasy tejidos por presentar resistencia a enfer-medades, tolerancia a herbicidas, sales, dife-rencias de crecimiento en condiciones de pHsvariables, entre otros, tanto para cerealescomo para plantas frutales. La mayoría deestos estudios se basaron en laimplementación de una alta presión de se-lección durante la etapa de regeneración ce-lular mediante la adición de agentes selecti-vos en el medio de establecimiento y rege-neración, tales como inóculos, toxinas, her-bicidas, condiciones de pH extremas o con-centraciones salinas elevadas.

El estudio del cariotipo permite detectarcambios en el número y estructura de loscromosomas. De esta manera podrían detec-tarse translocaciones, inversiones, delecionesy duplicaciones. Los cambios cariotípicos cons-tituyen una fuente importante de variaciónque muchas veces es subestimada cuando serealizan recuentos cromosómicos. Por esto


mismo existen otras técnicas que estimancambios cariotípicos con mayor eficiencia,como por ejemplo el bandeo cromosómico.Esta técnica fue aplicada a suspensiones ce-lulares de Brachycome dichromosomatica(2n = 4), donde permitió detectar rearreglosimportantes en individuos donde el númerocromosómico permaneció estable. La hibri-dación in situ es otra de las técnicas que po-dría aportar información útil para detectarcambios genéticos estructurales.

Entre los marcadores bioquímicos utili-zados para analizar progenies de plantas re-generadas pueden mencionarse lasisoenzimas, que permitieron detectar entreun 24 a 35% de variación en plantas dePopulus tremuloides regeneradas a travésde callos. Esta variación fue detectada me-diante electroforesis en geles de almidón uti-lizando los sistemas isocitrato deshidro-genasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa(SKDH), malato deshidrogenasa (MDH),fosfoglucoisomerasa (PGI) y 6-fosfogluco-nato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patroneselectroforéticos permitieron caracterizar a lasplantas fenotípicamente normales y anorma-les. Sin embargo, las plantas albinas obteni-das en este estudio no presentaronpolimorfismos en los loci estudiados.

En otros casos el análisis isoenzimático nopermitió detectar variación. El estudio de lí-neas de callos derivadas de embrionescigóticos y de embriones somáticos de abe-to (Picea glauca x engelmannii) utilizando15 sistemas isoenzimáticos no evidenció lapresencia de variación somaclonal en 25 locianalizados. Los patrones isoenzimáticos delíneas isogénicas de Trifolium pratense L. quediferían en su capacidad de regeneración, re-sultaron idénticos para los sistemas deperoxidasas, glutamato deshidrogenasas, al-cohol deshidrogenasas y esterasas.

Las isoenzimas, por lo tanto, pueden pro-veer información útil acerca de la variacióngenerada in vitro. Sin embargo, se están ana-lizando los productos de genes expresados,cuya regulación puede estar en cierta medi-da afectada por factores ambientales o fisio-lógicos. Por otro lado, sólo se transcribe y tra-duce una pequeña proporción del genoma.Por ello, los métodos de análisis a nivelmolecular pueden proporcionar mucha infor-mación, ya que las secuencias de ADN son

esencialmente las mismas en todas las célu-las vivas de la planta, independientementedel estado fisiológico o de desarrollo de lasmismas. Los marcadores moleculares pre-sentan varias ventajas a la hora de detectarinestabilidad genética debido a su ampliacobertura del genoma y a que no soninfluenciados por el ambiente ni por los es-tados fenológicos de las plantas.

Utilizando RAPD pudo detectarse la exis-tencia de polimorfismos en plantas deTriticum tauschii obtenidas mediantecallogénesis. Los RAPD para diagnosticar fi-delidad genética en plantas regeneradas porcultivo in vitro han sido utilizados en Pinusmariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Pi-cea abies , Quercus suber L.y Panaxnotoginseng.

En Phalaenopsis se ha encontrado corres-pondencia entre variaciones morfológicas ymoleculares, pudiéndose discriminar plantasnormales de variantes morfológicas median-te la combinación de perfiles RAPD genera-dos por 38 cebadores. En otros casos no hasido posible realizar esta asociación, proba-blemente debido a la necesidad del empleode un mayor número de cebadores. EnPelargonium x hortorum «Río» el empleo deun conjunto de 13 cebadores permitieron ladetección de polimorfismos en solamente el50% de las plantas con fenotipos aberrantes.En Mentha arvensis se obtuvieron perfilesRAPD polimórficos con 12 cebadores en las 6plantas fenotípicamente diferentes obteni-das por micropropagación.

En otro estudio se observó que no todaslas plantas de Musa de fenotipo anormal(enanas) obtenidas presentaban el mismopatrón de bandas. En este mismo género, latécnica permitió detectar polimorfismos enplantas micropropagadas de fenotipo nor-mal. Esto indicaría que la variación molecularno siempre se expresa a nivel fenotípico y vi-ceversa.

Existen otros ejemplos que corroboraríanesta afirmación, tal es el caso de la palmeradatilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde nose detectaron polimorfismos en plantas re-generadas que habían presentado fenotiposflorales anormales o el de plántulasmicropropagadas de Populus deltoides, don-de a través de la utilización de microsatélitesse detectaron polimorfismos en plantas


fenotípicamente normales.Otros marcadores moleculares utilizados

con éxito para la evaluación de variaciónsomaclonal, como los AFLP, permitieron de-tectar en banana la existencia de diferenciasa nivel molecular entre plantas regeneradasde fenotipo normal y aberrantes.

A veces, para detectar un cambio es ne-cesario realizar pruebas específicas. Por ejem-plo, se evaluaron somaclones de Cynodondactylon en laboratorio, invernáculo y a cam-po para resistencia a la oruga militar. Unsomaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col.,1994), tenía un rendimiento a campo equi-valente al del cultivar madre, pero ademásera resistente a dicho insecto. Esto fue debi-do a que producía menores niveles de unestimulante para la alimentación del insec-to. Es decir que mantenía los caracteresagronómicos positivos del cultivar parental,pero tenía un cambio en la producción de unmetabolito secundario que confería resisten-cia a la oruga.

5 La variación somaclonal y su aplicaciónen el mejoramiento genético de lasplantas

La base del mejoramiento genético es laoptimización de interacciones génicas. Paralograr combinaciones génicas óptimas o su-periores se requiere de diversidad genética.Esta diversidad, que se encuentra normal-mente en las poblaciones de individuos, pue-de provenir de cruzamientos sexuales, muta-ciones inducidas (físicas o químicas o produci-das por ADN-T o por elementos transponibleso retrotrasposones), hibridación somática ytransformación genética. La variaciónsomaclonal proveería una fuente adicional devariabilidad genética, utilizable en programasconvencionales de mejoramiento.

Algunas de las ventajas que presenta lavariación somaclonal pueden resumirse de lasiguiente manera:

√ Es relativamente poco costoso generar-la: requiere de un laboratorio de rutina y fa-cilidades de campo.

√ Constituye una forma rápida de gene-rar variabilidad genética, particularmentepara cultivos con base genética estrecha y

que son difíciles de mejorar a través de técni-cas tradicionales.

√ Es exitosa para eliminar uno o pocosdefectos en cultivares bien adaptados.

√ Puede utilizarse para mejorar especiesde propagación sexual y vegetativa.

√ Las tasas de mutación son relativamen-te altas si se comparan con las tasas de mu-taciones espontáneas. La variaciónsomaclonal ocurre con una frecuencia de 1mutación cada 100 plantas regeneradas, encontraste con la tasa esperada de mutaciónespontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por parde nucleótidos por generación.

√ El conocimiento de las condiciones quegeneran inestabilidad genética durante elcultivo in vitro permitiría utilizar el fenóme-no como estrategia de mejoramiento y per-mitiría eludirlo en aquellos casos en que serequiera estabilidad genética, como en lamicropropagación, la conservación degermoplasma y la transformación genética.

√ El nivel de cambios no deseados es me-nor que cuando se utilizan mutágenos quí-micos o físicos, ya que, en el caso de la varia-ción somaclonal, la mayoría de los cambiosdeletéreos producidos son eliminados por elfiltro que representa la regeneración de plan-tas.

Entre las desventajas cabe mencionar:

√ En algunos casos, las variantessomaclonales no han avanzado de la etapade laboratorio o invernáculo, probablemen-te debido a que el material seleccionado tie-ne poca importancia práctica.

√ La escasa regeneración de plantas encultivos de largo término. Generalmente enestos casos existe pérdida de la capacidadmorfogénica.

√ La regeneración está limitada agenotipos específicos que pueden no ser demucho interés para los mejoradores.

√ Algunos somaclones son inestables (ori-ginados por variación epigenética).

√ Algunos presentan alteraciones no de-seables como aneuploidía, esterilidad, etc.

Desde el punto de vista productivo y co-mercial, una variante somaclonal deberíacumplir los siguientes requerimientos:


√ Involucrar caracteres agronómicamenteútiles.

√ El nivel de expresión del carácter debesuperar al de sus progenitores.

√ El carácter mejorado debe estar com-binado con todos los otros caracteresagronómicos de la variedad que son impor-tantes para el cultivo.

√ La variación debe ser heredable (o bienestable) en las generaciones subsiguientes.

En general, los mejoradores buscan en lossomaclones caracteres de importancia prác-tica. La estrategia es utilizar cultivares alta-mente adaptados para modificarunos pocos caracteres, ya que resul-ta más sencillo mejorarselectivamente una variedad corrien-te que crear una nueva.

5.1 Estrategias para la selecciónde variantes útiles

Las estrategias que se han utili-zado para obtener variaciónsomaclonal comprenden:

a) La obtención de plantas porcultivo de células o tejidos, que lue-go son analizadas para el carácterdeseado.

La Figura 1 resume los pasos aseguir para la obtención de un culti-var por variación somaclonal. Paraeste fin se cultiva la mejor variedaddisponible y se seleccionan, entre lasplantas regeneradas, aquellas queexpresen el carácter de interés. Estas plan-tas (generación R

0) se emplean para generar

progenies sexuales (en el caso de plantas coneste tipo de reproducción), sobre las cualesse vuelve a realizar la selección para el carác-ter agronómico buscado, tratando de man-tener a la vez todas las características favora-bles de la variedad. En plantas autógamas,como trigo, arroz y cebada, se consideraaceptable la evaluación de la estabilidad delcarácter hasta la generación R

4. A partir de

este momento pueden realizarse cruzamien-tos de las plantas R

4 selectas con las líneas

parentales a fin de determinar, mediante elanálisis de segregación, la base genética delcarácter mejorado. Posteriormente viene la

etapa de multiplicación de semillas, que per-mitirá realizar pruebas agronómicas en dife-rentes ambientes, al menos en dos años dis-tintos, para evaluar los efectos del compo-nente ambiental en la expresión del carác-ter. El programa finaliza con la etapa de mul-tiplicación de semillas para el lanzamiento dela variedad nueva al mercado.

Una modificación para la producción denuevas variedades está basada en el empleode variantes gametoclonales (Fig. 1). Si seutilizan células haploides como fuente de te-jido, las variantes obtenidas se denominanvariantes gametoclonales. Los gametoclones

se refieren a regenerantes haploides dupli-cados, derivados del cultivo de anteras. Estametodología tendría la ventaja de permitirrecuperar caracteres recombinantes ademásde los que pudieran surgir in vitro. Las plan-tas haploides obtenidas son duplicadas me-diante la exposición al alcaloide colchicina. Lasevaluaciones a campo se realizan en formaconjunta a medida que los nuevos materia-les van siendo multiplicados, de manera deaumentar las replicas bajo diferentes condi-ciones ambientales.

b) La selección a nivel celular, selecciónin vitro, que se hace con el objetivo de ob-tener resistencia a estreses bióticos o

Figura 1: Estrategia para la producción comercial de variantessomaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz.


abióticos y se utiliza general-mente para caracteres talescomo resistencia a toxinasfúngicas, herbicidas, concen-traciones salinas elevadas ytemperaturas extremas.

Mediante esta estrategiapueden cultivarse explantosde distintos genotipos y ob-servarse el comportamientode los callos frente al agenteselectivo, en condiciones de la-boratorio. Una vez selecciona-dos los genotipos resistentesse procede a la regeneraciónde las plantas, que son anali-zadas para ver si expresan laresistencia a campo y luegoson introducidas en el progra-ma de mejoramiento.

La selección efectuada so-bre cultivos celulares in vitropuede llevarse a cabo median-te dos modalidades:

- Selección directa en unsolo paso, donde el agente deselección es utilizado en con-centraciones dobles o triplesde la MIC (concentración mí-nima que produce un 100 %de inhibición).

- Selección en varios pasos, donde la con-centración del agente selectivo es gradual-mente incrementada en cultivos sucesivos yfrecuentes.

El primero es un método simple y efecti-vo, ya que las células sensibles al agente mo-rirían, permitiéndo el crecimiento de las tole-rantes. Sin embargo, elevados niveles deestrés serían deletéreos a nivel celular, elimi-nando materiales que tal vez, con un mayornivel de diferenciación tisular hubiesen sidocapaces de regenerar plantas tolerantes. Laelección de un método u otro dependerá deun monitoreo preliminar que proporcionauna indicación acerca de la reacción del teji-do vegetal a las concentraciones letales ysubletales del agente selectivo.

En la Figura 2 se representan las etapasde la selección in vitro. En el ejemplo dife-rentes líneas de arroz son evaluadas para to-lerancia al aluminio. La inducción y la prolife-

ración de callo en el medio de cultivo al quese ha adicionado aluminio es indicadora dela tolerancia del genotipo al metal en cues-tión. Una vez que se han regenerado las plan-tas se requieren posteriores evaluaciones acampo, en suelos con concentraciones ele-vadas de aluminio, a fin de corroborar la to-lerancia evidenciada in vitro por los materia-les.

A continuación se citan ejemplos dondese combinó la selección in vitro con la subsi-guiente regeneración de plantas:

- Producción in vitro de plantas de arrozresistentes a concentraciones tóxicas de alu-minio. Se obtuvieron plantas resistentes uti-lizando distintas concentraciones de alumi-nio en el medio de cultivo. Por otro lado, seobservó la aparición de plantas resistentes apartir de callos de variedades susceptiblesmantenidos en medio de cultivo desprovis-to de aluminio. Estos estudios indicarían que

Figura 2: Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altasconcentraciones de aluminio


el cultivo in vitro per se puede originar mo-dificaciones útiles en el genoma de arroz.

- Obtención de resistencia a Fusariumoxysporum en clavel. El cultivo de segmen-tos internodales de dos cultivares de clavelsusceptibles a Fusarium oxysporum f.sp.dianthi permitió, luego de dos ciclos de se-lección, la obtención de callos resistentes quese utilizaron para regenerar plantas. El 32%de las plantas regeneradas a partir estos ca-llos evidenció considerable resistencia al pa-tógeno en experimentos de campo.

La búsqueda de variantes a nivel celularpermitiría verificar y seleccionar fenotiposadecuados entre millones de células, con unainversión menor en tiempo, espacio y dineroy ha sido extensamente utilizada en diferen-tes cultivos. Sin embargo, no existe total ga-rantía de que la resistencia manifestada invitro se expresará a nivel de la planta ente-ra. Hay diferentes explicaciones para este fe-nómeno, como por ejemplo que la resisten-cia o tolerancia observada se deba a cambiosepigenéticos, a la naturaleza quimérica delmaterial, al uso de toxinas no específicas (enel caso de resistencia a enfermedades), a lacomplejidad del carácter a ser seleccionado(como por ejemplo la resistencia a salinidado sequía) o a la falla de las células para expre-sar el carácter cuando se diferencian.

En ambos casos (a y b) la obtención deresistencia sólo será posible si ésta existe enla población original (entonces el cultivo ser-viría sólo para recuperar los genotipos útiles)o bien si surge por variación somaclonal du-rante el proceso de cultivo.

6 Variantes somaclonales liberadascomercialmente

La variación somaclonal fue utilizada parala producción de variedades comerciales concaracteres agronómicos superiores en dife-rentes especies. A continuación se enumera,para cada especie, el carácter agronómico se-leccionado y el centro de investigación res-ponsable de dicho logro: en geranio,aquitectura florar (Purdue Univ., USA); enbatata: calidad de raíces y arquitectura de lacanopia (North Carolina Research Service,USA); en caña de azúcar: resistencia a estrésy a enfermedades (Sugarcane Research Cen-

tre, Fiji); en maíz: contenido de triptófano(Molecular Genetic, USA); en tomate y apio:contenido de materia seca y rendimiento,respectivamente (DNA Plant technology ofNew Jersey, USA); en arroz: resistencia a en-fermedades (Plantech Research Institute,Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary);en mostaza: rendimiento (ICAR, India).

Las primeras observaciones de variaciónen caracteres morfológicos fueron realizadasen arroz y otras especies a partir de 1968.Diez años más tarde se informó en detalle lavariación obtenida en la progenie de plan-tas de arroz cultivadas in vitro y autopo-linizadas. También se encontraron alteracio-nes en la altura de la planta, la longitud deltallo y otras características en alfalfa.

En arroz, la variación somaclonal resultóen el mejoramiento de varios caracteres cuan-titativos, incluyendo parámetros morfoló-gicos, caracteres agronómicos y tolerancia aestreses bióticos y abióticos.

Pueden mencionarse además otros ejem-plos de variación somaclonal en cultivos agrí-colas de interés, como por ejemplo caña deazúcar, donde se obtuvieron somaclonesprovenientes del cultivar Pindar resistentes auna virosis transmitida por áfidos. Paralela-mente, también por variación somaclonal, seseleccionó el cultivar Ono, que presenta re-sistencia al downy mildew, causado porSclerospora sacchari.

En papa, el cultivo de protoplastos obte-nidos de suspensiones celulares cromosómi-camente variables produjo gran cantidad devariantes somaclonales del cultivar «RussetBurbano», que presentaron resistencia aPhytophthora infestans, a Alternaria solanay a la colonización por áfidos que transmi-tían el virus Y de la papa (PVY) y el virus delenrrollamiento de la hoja (PLRV).

Se encontró también tolerancia aglifosato en somaclones de cebada regene-rados en medios conteniendo el herbicida.En sorgo se encontró variación somaclonalestable para altura, número de macollos,mayor producción de granos y mayor núme-ro de semillas y tolerancia a suelos ácidos y asequía.

La incidencia de variación somaclonal enbanana se encuentra extensamente docu-mentada. En el caso de cultivares comercia-les de banana Cavendish en Taiwán se obtu-


vo resistencia a la Raza 4 de Fusariumoxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivaresno habían podido ser mejorados por méto-dos tradicionales. No obstante, para lograruna variedad con rendimiento equiparable alas variedades no resistentes se necesitaronvarios ciclos de micropropagación adiciona-les, que permitieron combinar ambas carac-terísticas en un somaclon.

Otros ejemplos donde se han obtenidocultivares por variación somaclonal son taba-co (tolerante a aluminio y resistente a herbi-cida), trigo (resistente a Helminthosporiumsativum) y alfalfa (resistente a Fusariumoxysporum).

Se han detectado también caracteres in-teresantes modificados por esta técnica para

su explotación comercial en ornamentales,como por ejemplo variación en el color delas flores en gerbera, clavel y crisantemo.

En gramíneas forrajeras puede citarsevariación cromosómica en Festucaarundinacea y pasto llorón (Eragrostiscurvula), albinismo en Lolium perenne yFestuca pratense, cambios en la morfologíade planta, forma y tamaño de hoja y espiga,desarrollo floral, vigor, y supervivencia ensomaclones de Lolium y Festucaarundinacea, variación isoenzimática enFestuca arundinacea; disturbios reproducti-vos y resistencia al moteado de hoja en pas-to bermuda (Cynodon dactylon).

En el laboratorio de Genética del Dpto.

Figura 3: Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivode inflorescencias A) Formación de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfogénesis.C) Estudio histológico de los mismos callos mostrando células embriogénicas y D) embriones somáticos. E) En elmismo callo se observaron embriones bipolares y también F) organogénesis. G) Plántula completa en el momentode salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron fértiles (I). J) Cromosomas en el ápice radical dela planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomíctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R

0) obtenida a

partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando

variación, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.


de Agronomía de la UNS se llevó a cabo unproyecto para obtener somaclones de pas-to llorón (Fig.3). Se trabajó con varioscultivares de esta gramínea apomíctica y lue-go de la evaluación de gran número de plan-tas se seleccionaron los siguientes materia-les:

- Una planta diploide sexual, obtenida apartir de un cultivar tetraploide apomíctico.Dicho material está en proceso deregistración, y está siendo utilizado en estu-dios de apomixis.

- Dos plantas hexaploides apomícticas apartir de un cultivar tetraploide apomíctico.Dichas plantas dieron origen a dos nuevoscultivares de Eragrostis curvula, muypromisorios por sus características forrajeras,que están en proceso de registro.

La variación in vitro en trigo y en otroscereales como cebada es altamente depen-diente del genotipo. En plantas regeneradasde triticale y trigo se informaron variacionesa nivel del ADN mitocondrial y de proteínasde la semilla, como las gliadinas. A nivelfenotípico, se han informado cambios esta-bles en longitud de la espiga, número de gra-nos por espiga, peso de 100 granos, densi-dad y biomasa de la espiga, mayor conteni-do de proteína en grano sin reducción delrendimiento, aristas, altura de la planta, fer-tilidad, número de macollos, color del grano,tiempo de espigazón, dureza, sensibilidad alácido abcísico, color de las glumas, entre otroscaracteres morfológicos. Las mutaciones ob-servadas han sido de dominantes a recesivasy viceversa. El único antecedente en nuestropaís de búsqueda de variación somaclonal entrigo es un estudio acerca de la estabilidad invitro de tres cultivares de trigo con elevadosniveles de inestabilidad cariotípica espontá-nea. Se evaluaron caracteres tales como es-tructura cromosómica, patrón de gliadinas,color del grano y de las glumas, tipo de aris-tas, niveles de clorofila y morfología de laplanta, detectándose sólo una translocaciónno descripta previamente y un patrón dife-rente de gliadinas como consecuencia del cul-tivo in vitro, sugiriendo que esta técnica noes efectiva para inducir variación que puedaser utilizada en programas de mejoramiento(Franzone y col., 1996).


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III.-Capítulo 2

Hibridación somática

Polci, Pablo; Friedrich, Pablo

1 Introducción

La mejora genética de las plantas cultiva-das en procura de incrementar la producciónviene siendo practicada por el ser humanodesde hace miles de años, seguramente des-de el inicio mismo de la agricultura. Para ello,el hombre ha empleado los cruzamientos conel fin de incrementar la variabilidad genética,paso inicial en el proceso de mejoramiento.De esta manera la hibridación entre especiesdiferentes permitió aumentar de modo sig-nificativo la productividad de diversos culti-vos, como por ejemplo los cereales. Sin em-bargo, en otros cultivos esta estrategia noresultó exitosa a causa de esterilidad sexualo incompatibilidad genética.

La hibridación somática, es decir, la ob-tención de plantas híbridas a partir de la fu-sión de células o de protoplastos derivadosde células somáticas, surgió hace unos 30 añoscomo una herramienta muy promisoria parasortear problemas de incompatibilidadprecigótica.

Esta técnica, si bien presenta algunas li-mitaciones, como una elevada esterilidad oimposibilidad de regenerar plantas en algu-nos casos, demostró ser útil en la mejoragenética de plantas, principalmente por per-mitir la introgresión limitada de genes de es-pecies silvestres en los cultivos. Se utiliza, porejemplo, cuando se quiere transferir resisten-cia a enfermedades o tolerancia a estreses.También permite la obtención de citoplasmashíbridos (cíbridos). La hibridación asimétricay cibridización sirve como puente para latransferencia de genes individuales

La técnica de fusión de protoplastos sedesarrolló en la década de 1950-60, a partirde la observación de que ciertos virus pue-den inducir la fusión de células animales. Sinembargo, recién en la década de 1980-90 tuvoun mayor auge debido a la aparición de mé-todos químicos y eléctricos más apropiadospara la fusión de células vegetales. La paredpresente en estas células representa una

barrera que normalmente impide la fusiónentre ellas. Por ello, la obtención de plantashíbridas somáticas requiere del previo aisla-miento de protoplastos mediante la diges-tión enzimática de las paredes celulares, paraluego proceder a la fusión de protoplastosde distintos tipos parentales (distintosgenotipos) y posterior regeneración de plan-tas a partir de los productos de fusión. Lahibridación somática en plantas comenzó adesarrollarse a principios de 1970 con la apli-cación de métodos químicos de fusión, y seextendió en los ´80 con el empleo de méto-dos de electrofusión.

Es relevante destacar que, a los fines delmejoramiento genético, el sistema deprotoplastos no sólo se emplea para la ob-tención de híbridos somáticos, sino que tam-bién constituye un material apropiado parala incorporación de ADN exógeno. Asimismo,la fusión de protoplastos tiene un uso mu-cho más amplio que el estrictamente de in-terés agronómico; en tal sentido, es de granutilidad en estudios de biología celular asícomo para otras aplicaciones biotecnológicas,por ejemplo, la producción de anticuerposmonoclonales.

2 Hibridación somática vs. hibridaciónsexual

Con relación a su potencialidad para pro-ducir híbridos, existen diferencias importan-tes entre la fusión de protoplastos somáticosy el cruzamiento sexual:

• La hibridación sexual entre organismosde diferentes especies está limitada por ba-rreras de incompatibilidad. En algunos casosestas barreras son precigóticas, es decir, nopermiten que se produzca la fecundación. Tallimitación no existe en la fusión deprotoplastos, dado que este proceso es no-específico, permitiendo la fusión de células deorígenes muy diversos, incluso de organismosmuy distanciados filogenéticamente (porejemplo, células animales y vegetales). Ello nosignifica que pueda regenerarse un organis-mo viable y fértil a partir de cualquier tipo decombinación entre células. De hecho, la bús-queda de híbridos de interés agronómico hademostrado que el principal aporte de estametodología es la introgresión, en los culti-vos, de genes provenientes de plantas silves-tres emparentadas.

98 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

• ·La hibridación sexual ocurre normal-mente por fusión de células haploides (n +n), mientras que en la hibridación somáticase fusionan dos protoplastos con susgenomas completos (2n + 2n) o con uno deellos conteniendo sólo parte de su genoma.

• ·Otra diferencia está dada por la heren-cia de los genes extranucleares, esto es,plastídicos y mitocondriales. Mientras que enla reproducción sexual el genomacitoplasmático es aportado casi exclusiva-mente por la gameta femenina, en la hibri-dación somática se combinan organelas deambos progenitores, produciendo nuevascombinaciones de genes citoplasmáticos.

3 Hibridación somática vs.transformación genética

La preponderancia que han tomado lastécnicas de transformación genética ha rele-gado a la hibridación somática a un papel demenor significación como herramientabiotecnológica aplicada al mejoramiento delos cultivos. Comparando ambas metodolo-gías, podemos destacar las siguientes diferen-cias:

• En la transformación genética se incor-poran uno o pocos genes exógenos en unaplanta, mientras que en la hibridaciónsomática el número de genes introducidoses mayor dado que se transfierencromosomas de una especie aotra o se combinan dosgenomas completos.

• La hibridación somáticapermite transferir caracteres sinnecesidad de contar con un co-nocimiento detallado de los me-canismos moleculares que deter-minan la expresión de dichos ca-racteres. Por el contrario, la trans-formación genética requiere laprevia identificación y aislamien-to de los genes que determinanla expresión del carácter de inte-rés.

• Caracteres tales como pro-ductividad, tolerancia a ciertos ti-pos de estrés, resistencia hori-zontal a enfermedades y otrosson poligénicos, por lo que sutransferencia es factible por hi-

bridación somática pero no por transforma-ción genética. Sin embargo, en la actualidad,con las nuevas herramientas aportadas porla genómica se está avanzando en el conoci-miento de todos los genes involucrados endiversas vías metabólicas. Estos podrían sertransferidos en conjunto vía transgénesis.

4 Tipos de híbridos somáticos

Cuando se realiza la fusión de protoplas-tos se obtienen células con el aporte decromosomas de dos o más núcleos (Fig.1.) Silos protoplastos involucrados en la fusiónproceden de distintos tipos parentales seoriginan «heterocariones», y si proceden delmismo tipo parental se originan «homoca-riones». Cuando en el heterocarión ocurrela fusión de los núcleos (cariogamia), se for-ma una «célula híbrida».

A partir de una célula híbrida, que contie-ne dos genomas completos, se puede rege-nerar una planta que, según cual haya sidoel destino del material genético nuclear du-rante las divisiones celulares que siguen a lafusión, puede ser de tres tipos:

1. Híbrido simétrico, que tiene elgenoma nuclear completo de cada tipoparental.

2. Híbrido asimétrico , que tiene elgenoma nuclear completo de uno de losparentales y sólo una parte del genoma nu-clear del otro parental.

Fig. 1. Destino del material genético nuclear y extranuclear en la fusiónde protoplastos.


3. Cíbrido, que contiene el genoma nu-clear completo de uno de los parentales, re-teniendo sólo material genético extranucleardel otro parental.

Es usual que en el proceso de regenera-ción de plantas híbridas ocurra una elimina-ción gradual de cromosomas de uno de lostipos parentales, produciéndose de estemodo híbridos asimétricos o cíbridos. La prác-tica de la hibridación somática en plantasdemostró que, en general, los híbridosasimétricos y cíbridos son más valiosos quelos simétricos producidos entre plantas ale-jadas filogenéticamente. Por esta razón sehan desarrollado métodos para inducir la hi-bridación asimétrica o cibridación, alterandoel genoma de uno de los protoplastosparentales. En este caso se dice que se trans-fiere parte del genoma de un protoplastodonante a uno receptor. Por lo tanto, tenien-do en cuenta el material de partida emplea-do para la fusión, pueden producirse tres ti-pos de células híbridas:

1. Células híbridas simétricas, por fusiónde dos protoplastos con sus genomas com-pletos.

2. Célula híbrida asimétrica, por fusiónde un protoplasto conteniendo su genomacompleto con otro conteniendo su núcleoinviable o sólo una parte de su genoma nu-clear. Los protoplastos donantes son irradia-dos con rayos X o Gamma, lo que provoca lafragmentación de los cromosomas. Una vezproducida la fusión, dichos fragmentos tien-den a eliminarse en las sucesivas mitosis, peroalgunos de ellos pueden integrarse con elgenoma del receptor produciendo un híbri-do asimétrico. El tratamiento de irradiaciónparece no tener efectos deletéreos omutagénicos sobre los genomas deorganelas, probablemente debido a quecada célula posee varias copias de ellas. Tam-bién puede producirse una célula híbridaasimétrica fusionando protoplastos recepto-res con microprotoplastos, conteniendo unoo pocos cromosomas. Los microprotoplastosse obtienen induciendo la formación demicronúcleos por tratamientos con agentesantimicrotúbulos.

3. Cíbridos, por fusión de un protoplastoconteniendo su genoma nuclear completo

con un protoplasto enucleado o con su nú-cleo inviable. Los protoplastos enucleados ocitoplastos pueden obtenerse centrifugandolos mismos a alta velocidad en un gradientede densidad isosmótico. Asimismo, el méto-do de irradiación con rayos X o Gamma pue-de generar cíbridos en casos en que se pro-duzca la eliminación total de los fragmentoscromosómicos. Los protoplastos que poseensu genoma nuclear completo (receptores),pueden ser tratados previamente coninhibidores metabólicos. En este caso sólopueden sobrevivir, por complementaciónmetabólica, los heterocariones conteniendoel núcleo del receptor y el citoplasma del do-nante enucleado.

La segregación de los plástidos ymitocondrias de los dos tipos parentales tam-bién constituye una fuente importante devariabilidad en la regeneración de plantashíbridas. Es frecuente que ocurranrecombinaciones de los genomas mitocon-driales de ambos tipos parentales, pero elloes poco común entre plástidos. Dado que lasorganelas segregan independientementeunas de otras, la regla es que al cabo de po-cas divisiones mitóticas las células formadascontengan plástidos provenientes de uno uotro tipo parental. Así, una célula híbrida ori-gina una colonia de células que exhiben dife-rentes combinaciones de genes citoplasmá-ticos, pero con una mayor frecuencia de célu-las que poseen mitocondrias recombinantesy plástidos de uno u otro tipo parental. Eldestino que sufre el material genético nucleary extranuclear durante las divisiones celula-res determina que, a partir de una poblaciónde células híbridas similares, se puedan rege-nerar plantas con diferentes combinacionesde genes nucleares, plastídicos y mitocon-driales.

La Figura 2 muestra un esquema de lasetapas involucradas en la hibridaciónsomática, las cuales son tratadas a continua-ción.

5 Aislamiento de protoplastos

El desarrollo de métodos enzimáticos deaislamiento a partir de 1960 brindó la posibi-lidad de obtener grandes cantidades deprotoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-


cia en diferentes áreas de la biología y labiotecnología de plantas, dada la utilidad delos protoplastos como sistema experimentalpara estudios fisiológicos, bioquímicos ymoleculares, así como para su aplicación almejoramiento genético.

Los protocolos de aislamiento empleanenzimas fúngicas con actividad celulasa ypectinasa, siendo necesario en algunos casosel agregado de hemicelulasas. Las celulasas yhemicelulasas degradan la pared celular, entanto que las pectinasas digieren la matrizde pectina que mantiene adheridas a las cé-lulas. El uso de enzimas disponibles comer-cialmente posibilitó el aislamiento deprotoplastos de prácticamente cualquier te-jido vegetal, siempre que el mismo no estélignificado. Se ha podido aislar protoplastosde una gran cantidad de especies vegetalesy regenerar plantas a partir de los mismos,permitiendo el uso de este sistema para lapropagación clonal y la modificación genéticade plantas.

El número de protoplastos aislados, suviabilidad y la pureza de la suspensión obte-nida dependen de varios factores, debiendo

establecerse en forma empírica lascondiciones óptimas para un sistemadeterminado. Las etapas del aisla-miento y los factores a considerar encada una de ellas se describen a con-tinuación:

1. Selección del material departida. Influye en el resultado delaislamiento así como en el procesode regeneración posterior. General-mente se emplean hojas y células encultivo líquido o sólido. Cuando seemplean hojas, la edad y las condi-ciones de cultivo de la planta afectanel rendimiento. Se obtienen mejoresresultados con hojas jóvenes total-mente expandidas que con hojas vie-jas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contac-to de las enzimas con las células, lashojas suelen cortarse en trozos pe-queños, muy finos en el caso de lasmonocotiledóneas. Algunas veces seextrae la epidermis inferior antes decolocar la hoja en la soluciónenzimática, como sucede con lasdicotiledoneas. Cuando se emplean

células en suspensión, se obtienen mejoresresultados si se encuentran en la faseexponencial de crecimiento.

2. Tratamiento enzimático. La concentra-ción de la enzima y el tiempo de incubaciónrequeridos para lograr la liberación de losprotoplastos dependen del producto comer-cial utilizado. El pH generalmente se ajustaen un rango de 4,7 a 6, y la temperatura en-tre 25 y 30º C. La duración del tratamientoenzimático y la relación volumen de solución/cantidad de tejido influyen en el rendimien-to. Durante el aislamiento se produce la lisisde algunas células, que liberan enzimashidrolíticas y compuestos oxidantes que pue-den dañar los protoplastos, por lo que sesuelen agregar inhibidores de proteasas yantioxidantes tales como el Polivinilpirroli-dona-10. El agregado de un estabilizadorosmótico a la solución enzimática es esencialpara evitar la ruptura de los protoplastos amedida que son liberados, siendo más esta-bles si la solución es ligeramente hipertónica.Para ello se utilizan solutos osmóticamenteactivos, comúnmente manitol o sorbitol, enconcentraciones que varían entre 0,3 a 0,8

Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridaciónsomática.


M según el tipo de protoplasto. La soluciónenzimática es por lo general suplementadacon sales, comúnmente CaCl2, que incremen-tan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B).

3. Limpieza y purificación de losprotoplastos. Una vez lograda la liberaciónde los protoplastos, se procede a la remo-ción de las enzimas y de los restos de tejidoy de células rotas. La suspensión se pasa porun filtro de nylon o metálico con un diáme-tro de poro (30-100 mm) que permita el pasode los protoplastos y retenga los restos detejido y grupos de células no digeridas. Pos-teriormente, se efectúan 3 ó 4 lavadoscentrifugando la suspensión por 5 minutos abaja velocidad (50-100 g). Finalmente, losprotoplastos sedimentados se resuspendenen una solución salina que contenga un es-tabilizador osmótico. De este modo se elimi-nan las enzimas y restos celulares. Para lo-grar una mayor pureza de la suspensión esconveniente centrifugarla en un gradiente dedensidad (Fig. 3C). Para el recuento deprotoplastos se emplea un hemocitómetro.La viabilidad se determina generalmenteempleando colorantes que son incorporados(rojo neutro, diacetato de fluoresceína) oexcluidos (azul de Vean) por las células via-bles; también pueden evaluarse la actividadfotosintética (emisión de fluorescencia) y larespiratoria (consumo de O2).

6 Métodos de fusión

6.1 Métodos químicos

Los primeros casos informados de fusióncontrolada y reproducible de protoplastosvegetales y de regeneración de híbridossomáticos se produjeron a principios de ladécada de 1970, empleando nitrato de sodiocomo agente fusógeno. La frecuencia de for-mación de heterocariones en tales casos eramuy baja. Posteriormente, se lograron me-jores resultados fusionando protoplastos decélulas del mesófilo de Nicotiana en un me-dio conteniendo alta concentración de Ca++

(50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo,el fusógeno que alcanzó mayor aceptaciónes el polietilenglicol (PEG) debido a que, encomparación con los otros agentes químicos,produce mayor proporción de heteroca-riones y, para muchos tipos celulares, resultamenos tóxico. Además, el tratamiento conPEG genera una mayor proporción deheterocariones binucleados, con menor ocu-rrencia de fusiones entre más de dosprotoplastos.

El procedimiento de fusión con PEG másampliamente utilizada es, en lo esencial, unacombinación del método original del PEG yel de CA++ y pH elevados. Los protoplastosde dos tipos parentales se mezclan en unasolución conteniendo 15 a 45 % de PEG (pesomolecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30minutos. La temperatura de incubación óp-tima para inducir la fusión es de 35 a 37º Cpero, en la práctica, suele ajustarse a 24º C.La densidad de protoplastos adecuada parala formación de heterocariones es de 4 a 5 %(volumen de protoplastos/volumen de sus-pensión). La remoción del PEG se lleva a caboen forma gradual, siendo esto fundamentalpara asegurar una elevada frecuencia deheterocariones. Para ello, la suspensión sesomete a sucesivos lavados con una soluciónalcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, dismi-nuyendo progresivamente la concentraciónde PEG con cada lavado.

En la fusión de los protoplastos ocurren,en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1)las membranas plasmáticas de protoplastosadyacentes entran en íntimo contacto, (2)se producen alteraciones en sitios localizados

Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A.Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado dela hoja en trozos pequeños. B. Digestión enzimática delas paredes celulares. C. Centrifugación y obtención deprotoplastos libres de restos de tejidos vegetales.


de las mismas, formándose puentescitoplasmáticos entre protoplastos vecinos,y (3) las interconexiones citoplasmáticas seexpanden, provocando la fusión. La carganegativa neta de la superficie de las mem-branas produce la repulsión entre ellas; el tra-tamiento con Ca++ y pH elevados neutralizalas cargas superficiales, favoreciendo el con-tacto entre protoplastos. El PEG actuaríacomo un puente molecular causando altera-ciones en las membranas plasmáticas quepromueven la adhesión y formación de puen-tes citoplasmáticos entre protoplastos veci-nos, produciéndose finalmente la fusión.

6.2 Electrofusión

En 1973 se descubrió que pulsos de ele-vado potencial eléctrico en un rango muyestrecho de intensidad y duración conducena un incremento reversible, experimental-mente controlable, de la permeabilidad dela membrana celular. Este efecto se denomi-nó ruptura eléctrica reversible para enfatizarla habilidad de la membrana para reparartales perturbaciones. El voltaje mínimo paraun protoplasto (umbral) con el cual se pro-duce la formación de poros disminuye a ma-yor duración del pulso eléctrico. Este fenó-meno de ruptura reversible también es apli-cado en la técnica de electroporación, con laque se pueden introducir en las células cons-trucciones de ADN y otras moléculas de altopeso molecular.

El método de electrofusión en esenciainvolucra dos pasos:

1. Los protoplastos, colocados en un me-dio de baja conductividad entre dos electro-dos, se ponen en contacto al aplicar corrien-te alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz)en un campo eléctrico no uniforme. Las car-gas se separan dentro de las células forman-do un dipolo y generando, por lo tanto, unpotencial de membrana. La fuerza del cam-po a ambos lados de una célula es diferente(campo no uniforme), dando origen a unafuerza neta que la empuja a una región demayor intensidad de campo (hacia uno delos electrodos). Este proceso se denominadielectroforesis. La polaridad de la célulaincrementa el campo local no uniforme, atra-

yendo a las células vecinas. Luego, losprotoplastos se aproximan unos a otros yforman cadenas paralelas a las líneas de cam-po aplicadas (Fig. 4A).

La fuerza ejercida sobre la célula bajo con-diciones dielectroforéticas depende (1) de laintensidad de campo eléctrico, (2) delgradiente del campo, (3) del volumen delprotoplasto y (4) de la diferencia entre lasconstantes dieléctricas de la célula y su am-biente (así como la correspondiente diferen-cia entre sus conductividades).

2. El segundo paso consiste en la aplica-ción de uno o más pulsos cortos de corrientedirecta de 15 a 100 µseg., con una intensi-dad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), sufi-ciente para causar la ruptura reversible de lamembrana. Para que esto ocurra es necesa-rio que el voltaje crítico de membrana seaalcanzado en cuestión de nanosegundos amicrosegundos. Ocurre entonces la fusión delas dos células cuyas membranas están enestrecho contacto (1 a 2 nanómetros de dis-tancia). El proceso de resellado es principal-mente atribuido a las moléculas lipídicas de-bido a que su coeficiente de difusión es dosórdenes de magnitud mayor que el de lasproteínas. Durante este proceso pueden for-marse puentes lipídicos entre las membranasde las dos células. En otras palabras, las mem-branas no se vuelven a sellar separadamen-te en la zona de contacto. Los puentes for-mados de esta manera, con continuidadcitoplasmática entre las dos células, condu-cen a un radio de curvatura muy pequeño ya altas tensiones superficiales. Como conse-cuencia se forma una nueva célula esférica,ya que el proceso es favorecido energéti-camente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversi-ble si el número y el tamaño de los porosson pequeños en relación con el total de lasuperficie de la membrana. Fuerzas de cam-po supra críticas, así como también largosperíodos de exposición, rompen áreas ma-yores de membrana y pueden producir ladestrucción total de la célula

La frecuencia de fusión depende de va-rios factores:

• ·El genotipo.• ·La procedencia de los protoplastos

dentro del mismo genotipo. Diferentes po-blaciones de protoplastos exhiben frecuen-


cias de fusión diferentes, aun cuando proven-gan del mismo genotipo. En general, losprotoplastos obtenidos a partir de hojas sefusionan más fácilmente que los provenien-tes de raíz o de cultivos celulares.

• ·El tamaño de los protoplastos. Losmás grandes se fusionan más fácilmente.

• ·La densidad de los protoplastos.• ·El número, la duración y la fuerza de

los pulsos de corriente directa. La duracióndel pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. El tiem-po requerido para la fusión que sigue a laaplicación de un pulso varía desde pocos se-gundos a varios minutos. Esto probablemen-te esté relacionado a la diferencia de fluidezde la membrana en los distintos tipos celula-res y a las propiedades del citoesqueleto den-tro de la célula.

• ·El medio de fusión. Un factor de limi-tación en la agregación dielectroforética delas células es la conductividad eléctrica del me-dio; si ésta es muy alta, hay mucho flujo decorriente en la solución y se producencalentamientos y turbulencias que impidenla formación de cadenas.

• ·El potencial osmótico del medio de fu-

sión. La inclusión de iones en el medio pue-de incrementar el porcentaje de fusión. Sinembargo, existe la limitación de que ladielectroforesis debe realizarse en un mediode baja conductividad; el medio de fusiónusualmente consiste en manitol (cuya con-centración se ajusta según los protoplastosempleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos depresión osmótica en el medio de suspensiónde los protoplastos pueden favorecer el pro-ceso de fusión.

• ·La longitud de las cadenas deprotoplastos formadas durante la dielec-troforesis, que además depende de factorescomo la densidad de protoplastos, fuerza delcampo eléctrico y tiempo durante el cual esaplicado. Cadenas más largas darán mayorfrecuencia de fusión que las cadenas cortas.Pulsos de corriente más largos y de mayorvoltaje producen un aumento de los even-tos de fusión múltiple; obviamente, pulsosmuy largos y voltajes muy elevados puedenmatar a los protoplastos.

• ·La composición y propiedades de lamembrana plasmática pueden ser afectadaspor la actividad metabólica de losprotoplastos y por el tipo de enzimas em-pleadas en el proceso de aislamiento, influ-yendo en consecuencia en el proceso de fu-sión.

Las condiciones experimentales debenajustarse de modo de obtener la mayor fre-cuencia de fusión posible (número deprotoplastos fusionados sobre el total deprotoplastos), intentando maximizar la pro-porción de heterocariones (productos de lafusión de protoplastos diferentes) formadospor sobre la de homocariones (productos dela fusión de protoplastos del mismo tipoparental), y minimizando la ocurrencia deeventos de fusión múltiple (fusión de más dedos protoplastos). La proporción de cada unode los dos tipos de protoplastos en la sus-pensión puede fijarse a fin de incrementar laformación de heterocariones por sobre la dehomocariones. El tipo de protoplasto conmayor tendencia a fusionar se mezcla con elde menor tendencia a fusionar en una rela-ción de 1:5 a 1:10. Así, durante la formaciónde cadenas, los protoplastos más fusionablesestarán mayoritariamente en contacto conlos menos fusionables, y éstos a su vez esta-

Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo depasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las diferenciasen intensidad de campo eléctrico hacen que las célulasse muevan hacia la zona cercana al electrodo. B.Aplicación de pulsos cortos de corriente directa, queinducen la formación de poros en la membrana,generando puentes entre las membranas de las célulasadyacentes. C. Los puentes con continuidadcitoplasmática poseen un radio de curvatura muypequeño. Las altas tensiones superficiales generadas enese sector conducen a la formación de una nueva célulaesférica.


rán ligados entre ellos mismos. Seleccionan-do las condiciones –duración y voltaje de lospulsos– que promuevan sólo la fusión de losprotoplastos más fusionables, los productosserán mayormente heterocariones.

Sin embargo, aun cuando las condicionesde fusión puedan fijarse de modo de incre-mentar la frecuencia de fusión y la propor-ción de heterocariones formados, la fusiónde protoplastos a gran escala (macrofusión),tanto por métodos químicos como eléctricos,resultará en una mezcla de protoplastosparentales, homocariones y heterocariones.Esto conlleva la necesidad de emplear méto-dos de selección de los híbridos somáticosobtenidos. Una técnica alternativa que ofre-ce la ventaja de no requerir una posteriorselección de heterocariones, aunque deman-da mayor manipulación, es la microfusión oelectrofusión de pares de protoplastos. Estatécnica se basa en los mismos principios quela electrofusión a gran escala pero está dise-ñada para inducir la fusión en pares seleccio-nados de protoplastos. Este sistema empleamicroelectrodos de platino fijados a un so-porte montado debajo del condensador deun microscopio invertido. Los pares deprotoplastos seleccionados se colocan enmicrogotas de medio de fusión sobre un so-porte, recubiertas por aceite mineral. En cadaevento de fusión, los microelectrodos seposicionan a cada lado de una microgotaconteniendo un par de protoplastos, y seaplican los pulsos eléctricos. Después de lafusión, los heterocariones resultantes sontransferidos a gotas con medio de cultivopara la posterior regeneración de plantashíbridas. La tasa de fusión es de aproxima-damente 30 pares de protoplastos fusiona-dos y transferidos a medio de cultivo porhora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fu-sión cercanas al 50 %.

Ventajas de la electrofusión:

1. El proceso entero puede ser seguidobajo microscopio por lo que los híbridos pue-den ser fácilmente identificados y transferi-dos a un medio nutritivo o selectivo.

2. Puede preseleccionarse el número decélulas a ser fusionadas. Las formaciones dedos células son favorecidas por bajas densi-dades en la acanaladura entre los electrodos.

Para obtener productos de multifusión de-ben emplearse elevadas densidades.

3. El proceso de fusión es sincrónico, yaque el pulso provoca la fusión de todas lascélulas expuestas al campo.

4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80- 100 %) y cariogamia.

5. La viabilidad de las células fusionadases muy buena.

6. Este método ofrece ventajas sobre otroscomo el del PEG, que: -requiere condicionesno fisiológicas -las frecuencias de formación deheterocariones binucleados son bajas y varia-bles -resultan tóxicos para diversos tipos celu-lares- el fusógeno debe ser removido antesdel cultivo de los protoplastos y tiene bajorendimiento de células fusionadas.

7 Selección de heterocariones

La fusión de protoplastos a gran escalaproduce una mezcla de tipos parentales yproductos de fusión. Si no se efectúa unaprevia selección de las células híbridas, la re-generación de plantas y la posterior identifi-cación de los híbridos demandará mucho tra-bajo y recursos. Dicha selección es particular-mente necesaria cuando se emplean méto-dos químicos, que producen una baja pro-porción (<10%) de células híbridas. Por el con-trario, los métodos eléctricos no requierennecesariamente del posterior proceso de se-lección dado que normalmente producen fre-cuencias de fusión muy elevadas o porque,en el caso de la microfusión, no se generanmezclas heterogéneas de protoplastos de-bido a que se fusionan dos células por vez.Cualquiera que sea el caso, la condición dehíbrido debe verificarse en la planta regene-rada mediante diferentes análisis que se ex-plican más adelante.

La selección de células híbridas puede lle-varse a cabo empleando los siguientes mé-todos:

• Selección sobre la base de caracteresmorfofisiológicos. En ciertos casos es posi-ble diferenciar los callos híbridos de losparentales. Por ejemplo, en algunos cruza-mientos, los callos híbridos poseen un colorintermedio al de los parentales.

Cuando se produce un cruzamiento en-tre un parental con capacidad para regene-


rar planta con uno recalcitrante, los híbridossomáticos normalmente regeneran plantas,ya que este carácter se comporta como do-minante. Si los protoplastos del genotiporespondedor son tratados con inhibidoresmetabólicos irreversibles (iodoacetamida,dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirán, ysolamente podrán regenerarse los híbridos.

• Selección por complementación. La se-lección se produce porque el medio de culti-vo resulta restrictivo para el crecimiento delos parentales, pero no para el de los híbridos.La complementación puede lograrse por lassiguientes vías:

a) Empleando dos parentales con defec-tos metabólicos o genéticos no alélicos. Sidichos caracteres son recesivos, la fusión pro-duce una célula híbrida en la que los defec-tos se anulan por complementación. Porejemplo, la fusión de dos variedades albinasno alélicas (nucleares) de tabaco, permitióobtener plantas verdes.

AAbb (albina) x aaBB (albina) ↓

AAaaBBbb (verde)

Asimismo, a partir de dos líneas mutantesno alélicas de tabaco deficientes en nitratoreductasa, se obtuvieron colonias capaces decrecer en un medio conteniendo nitratocomo única fuente de nitrógeno.

b) Fusionando parentales que expresancaracteres dominantes tales como resisten-cia a antibióticos o herbicidas. Para ello seemplea una línea resistente a cierta droga, yotra resistente a una segunda droga, efec-tuándose la selección de las células híbridasen un medio conteniendo ambas drogas aconcentraciones que resultan letales para laslíneas parentales.

c) Una línea que presente una mutaciónautotrófica (por ejemplo: albinismo, deficien-cia a nitrato reductasa) y un carácter domi-nante (por ejemplo, resistencia a antibióticoso herbicidas) es de gran utilidad para la se-lección. Los híbridos producidos por el cruza-miento de estos parentales con cualquiergenotipo silvestre pueden ser seleccionadosen medio mínimo suplementado con el anti-biótico o herbicida, que no permite el creci-miento de los parentales.

• Selección por aislamiento de los

heterocariones o células híbridas. Es el sis-tema más confiable y de más amplio espec-tro de aplicación. El aislamiento puede reali-zarse de dos maneras:

a) Selección mecánica directa utilizandotécnicas de micromanipulación con micro-pipeta. Puede realizarse cuando los proto-plastos parentales presentan rasgos que losdistinguen al microscopio, permitiendo reco-nocer las células híbridas. Por ejemplo, al fu-sionar protoplastos del mesófilo (verdes) conprotoplastos de suspensiones celulares (inco-loros). También pueden colorearse las célu-las de ambos progenitores con diferentescolorantes vitales, como el rojo neutro y azulbrillante de cresilo.

b) Citometría de flujo. Los protoplastosparentales se marcan con diferentes coloran-tes fluorescentes; por ejemplo, rodamina(rojo) y fluoresceína (verde amarillento). Elaislamiento de los heterocariones marcadoscon ambos colorantes se realiza utilizando uncitómetro de flujo (FACS, fluorescence-activated cell sorter), que es preciso y muyrápido. El equipo posee fotocélulas que de-tectan fluorescencia, pudiendo separar losprotoplastos marcados con un solo fluoro-cromo (parentales) de aquéllos doblementemarcados (híbridos).

8 Cultivo de protoplastos

La habilidad para regenerar plantas apartir de células y tejidos en cultivo es un com-ponente esencial en la biotecnología para lamanipulación genética y el mejoramientovegetal. Esto resulta relativamente fácil paralas dicotiledóneas herbáceas, pero ha sidobastante difícil para las monocotiledóneas,particularmente las gramíneas.

Los protoplastos se cultivan en cajas dePetri en medio líquido o semisólido, rico encompuestos orgánicos e inorgánicos, suple-mentado con reguladores del crecimiento, yen presencia de un estabilizador osmótico.Suelen ser cultivados en cajas de Petri con me-dio agarificado, donde se mezcla la soluciónde protoplastos con un medio de cultivo lí-quido a 40º°C conteniendo 1,2% de agar,perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Losprotoplastos quedan, así, atrapados en elmedio semisólido y, luego de varios días, seven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-


bargo, el medio líquido da mejores resulta-dos por varias razones: (a) los protoplastosde varias especies sólo pueden dividirse enmedio líquido, (b) la presión osmótica delmedio puede ser fácilmente reducida a lospocos días en cultivo, (c) la densidad celularpuede ser modificada agregando medio decultivo o las células con especial interés pue-den ser aisladas y cultivadas a alta densidad,(d) la degradación de algunos componentesdel medio por la población de protoplastospuede producir algunas sustancias citotóxicas,cuya concentración alrededor de las célulasserá menor en el medio líquido. Una técnicamuy eficiente que combina medio sólido ylíquido es la de cultivo en perlas de agarosa,donde los bloquecitos con los protoplastosinmovi-lizados en agarosa son cortados encuatro mitades y colocados en medio líqui-do, donde se cultivan en continua agitación.

Los protoplastos regeneran la pared ce-lular luego de uno a cuatro días en cultivo. Lapresencia de pared es esencial para lograr unadivisión regular. Luego de dos a tres sema-nas, producto de mitosis sucesivas, se formanmicrocolonias derivadas cada una de una cé-lula, que dos semanas después se pueden vera simple vista. Estos callos son transferidos aun medio de cultivo y a condiciones apropia-das para regenerar plantas (Fig. 5).

Los principales factores a tener en cuen-ta para el cultivo de protoplastos son:

· Los requerimientos nutricionales: se hanutilizado en muchos casos los mismos mediosde cultivo que se utilizan en el cultivo de célu-las y tejidos, pero en general son enriqueci-

dos con vitaminas, azúcares, aminoácidos,reguladores de crecimiento y también conaditivos inespecíficos como leche de coco,hidrolizado de caseína, extracto de levadu-ra, etcétera.

· El potencial osmótico del medio de cul-tivo: los protoplastos requieren de protec-ción osmótica antes de regenerar la paredcelular. Normalmente se ajusta con el agre-gado al medio de cultivo de manitol osorbitol.

· La densidad celular: la densidad inicialde protoplastos varía de 104 – 105 proto-plastos/ml de medio de cultivo. Los cultivoscon altas densidades producirán, a partir decada protoplasto, colonias que deberán se-pararse tempranamente para evitar quime-ras. Si deseamos colonias bien separadas paraasegurar que provengan de un soloprotoplasto, la densidad inicial debe ser baja,de 100 – 500 protoplastos/ml. Hay proto-plastos de varias especies y tipos que no lo-gran dividirse a bajas densidades de cultivo.Para estos casos se desarrolló la técnica decultivo con células nodrizas o alimentadoras.Esta técnica consiste en exponer una suspen-sión de 106 protoplastos/ml a rayos X a do-sis que inhiben la división celular, pero quequedan metabólicamente activas. Estas cé-lulas se plaquean en un medio agarificado, yluego se colocan por sobre éstas losprotoplastos sin irradiar, de los cuales se for-marán las colonias. También suele utilizarsepapel de filtro para separarlas de las célulasnodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivoen microgota, donde se puede cultivar hasta

un solo protoplasto. Cada microgotacontiene entre 0,25 - 25 µl de mediode cultivo, logrando densidades de 2 –4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda deun micromani-pulador se coloca la célu-la y se la cubre con aceite mineral paraevitar la deshidratación del medio.

· Los tratamientos físicos: trata-mientos de choque eléctrico y térmicoestimulan la división de los protoplas-tos.

· Las condiciones de cultivo: en ge-neral los protoplastos son sensibles ala luz, por lo cual durante el cultivo selos mantiene en oscuridad o bajo luzmuy tenue.

· El origen de los protoplastos: el

Figura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos demesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosasuspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación decallo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneración.F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G.Planta regenerada.


estado fisiológico del tejido del cual provie-nen y la calidad de los protoplastos son muyimportantes para obtener una elevada efi-ciencia en la respuesta al cultivo.

9 Identificación de las plantas híbridas

La condición de híbrido debe verificarseen la planta regenerada aun cuando se hayaefectuado algún tipo de selección para el cul-tivo de las células híbridas. A tal fin es conve-niente efectuar diferentes evaluaciones, loque permite una mejor caracterización delhíbrido. Comúnmente se llevan a cabo lossiguientes estudios:

1. Morfológicos. Los híbridos somáticospueden presentar rasgos morfológicos carac-terísticos. Los mismos pueden ser interme-dios a los de los parentales, la suma de ellos,u otros completamente nuevos.

2. Citológicos. El análisis del complemen-to cromosómico permite revelar si el híbridoposee el total de cromosomas de cadaparental, si se han fusionado más de dosprotoplastos, el grado de aneuploidía y posi-bles translocaciones intergenómicas. Median-te hibridación in situ empleando sondas deADN repetitivo específico de especie puedeevaluarse con más profundidad la contribu-ción de los genomas parentales y reestructu-raciones cromosómicas en el híbrido.

3. Isoenzimáticos. El patrón de bandasisoenzimáticas del híbrido debe mostrar ban-das de ambos parentales, pudiendo haberotras bandas que resultan de nuevas combi-naciones de las subunidades enzimáticas.Habitualmente se analizan los patrones deglucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglu-coisomerasas, glutamato oxalacetatotransaminasas, esterasas, peroxidasas yfosfatasas ácidas. Las isoenzimas son extre-madamente variables entre tejidos vegeta-les, por lo que para el análisis se deben em-plear los mismos tejidos u órganos, y en elmismo estadío fenológico.

4. En el ámbito del ADN. La demostra-ción de la presencia de ADN de ambosparentales es la prueba más directa de la hi-bridación. El análisis de ADN es independien-te del tejido empleado y de la edad de laplanta. Puede llevarse a cabo por RFLP(polimorfismos en la longitud de los fragmen-tos de restricción), RAPD (polimorfismos en

el ADN amplificado al azar) o Southern blot,empleando sondas de ADN repetitivo espe-cífico de especie o de genes de ARNribosomal.

10 Logros y tendencias de la hibridaciónsomática

La hibridación somática ha permitido pro-ducir híbridos que no se habían podido ob-tener por cruzamientos sexuales, incremen-tando así el flujo de genes en los cultivos. Latabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridossomáticos que presentan algunas ventajasagronómicas.

En sus inicios, algunos esperaban que lahibridación somática permitiera producir nue-vas especies que expresaran las característi-cas deseadas de ambos progenitores. Porejemplo, por hibridación entre tomate ypapa, se buscó producir plantas que desarro-llaran tomates en la parte aérea y tubérculosen la raíz (pomato). La experiencia mostróque difícilmente puedan lograrse estoshíbridos espectaculares, debiéndose más biendirigir la técnica hacia la introgresión de po-cos genes silvestres en las especies cultivadasmediante hibridación asimétrica o cibridación,manteniendo las características generales delcultivo.

Uno de los factores que dificulta la ob-tención de híbridos simétricos es la progresi-va pérdida de cromosomas de uno de losparentales, que normalmente ocurre duran-te la regeneración. Si bien la fusión deprotoplastos permite sortear las barrerasprecigóticas, siguen existiendo barrerasgenómicas que resultan en la eliminación es-pontánea de cromosomas durante las divi-siones celulares. El mecanismo que determi-na la eliminación de cromosomas no estábien comprendido, pero generalmente seretienen los cromosomas del parental quetiene el ciclo celular más corto. Uno de losfactores que puede producir incompatibilidadgenómica es el estado de diferenciación delos tipos celulares involucrados en la fusión.Por ejemplo, cuando se fusionan células enfase de crecimiento activo con células delmesófilo, que no se dividen, generalmentese pierden los cromosomas de estas últimas.

Los híbridos somáticos o sexuales entreespecies silvestres y cultivadas contienen


muchas características no deseadas de la pri-mera, además de aquéllas deseadas. Elretrocruzamiento con la especie cultivada esrequerido para remover los genes no desea-dos del parental silvestre, pero ello no siem-pre es posible debido a que los híbridos sue-len ser estériles. La hibridación asimétrica y lacibridación tienen la ventaja de incorporarsólo uno o pocos caracteres provenientes delparental silvestre en la especie cultivada, y pro-ducir plantas con mayor fertilidad.

Algunos caracteres deseables están codi-ficados por el genoma extranuclear, talescomo la androesterilidad citoplasmática yciertos tipos de resistencia a enfermedadesy a herbicidas. Para estos casos es de particu-lar utilidad la cibridación, dado que es unmétodo simple para transferir estos genes.

11 Algunos ejemplos

Se han obtenido híbridos intergenéricosde Panicum maximum (+) Pennisetumamericanum (Ozias-Atkins et al., 1986),Saccharum officinalis (+) Pennisteumamericanum, Oriza sativa (+) Echinochloa

oryzicola, Triticummonococcum (+)Pennisetum ameri-canum, Festucaarundinacea (+)Lolium multiflo-rum. El primer casode regeneración deplantas maduras dehíbridos interge-néricos (simétricos yasimétricos) en gra-míneas fue el Festu-lolium.

A pesar de losesfuerzos realizados,la aplicación de estaestrategia no haconducido a la ob-tención de nuevoshíbridos de especiesimportantes, funda-mentalmente debi-do a problemas debaja o nula fertili-dad. Los métodosactuales de transfe-rencia de genes ais-

lados han desplazado el interés en la hibri-dación somática. Sin embargo son una exce-lente herramienta para estudiar las interac-ciones núcleo-citoplasmáticas entre genomas.


BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolationand culture. Somatic hybridization and cybridization. En:Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier,Amsterdam. pp. 337-406.

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ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principlesand industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:pp. 149-156.

Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhibenalgún carácter de interés agronómico


III.-Capítulo 3

Transformación genética

Díaz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.;Franzone, Pascual M.; Ríos, Raúl D.

1 Introducción

El mejoramiento genético vegetal se ori-ginó hace aproximadamente 10.000 años,cuando el hombre se hizo agricultor y comen-zó la domesticación de las plantas. En el si-glo XX, con la incorporación de los cruzamien-tos sexuales, el conocimiento de la biologíafloral de las especies, los avances de lagenética y de la estadística experimental,entre otros, se desarrollaron los métodos demejoramiento actualmente utilizados. Elmejoramiento genético se basa en la exis-tencia de variabilidad genética para los ca-racteres que se desea mejorar y la repro-ducción sexual para la incorporación de losmismos. Este hecho hace que el aprovecha-miento de la variabilidad esté restringido porbarreras de cruzabilidad. El reciente desarro-llo de métodos no sexuales para transferirgenes, como la transformación genética,permite superar esta limitación, abriendonuevas perspectivas en el mejoramiento delas plantas.

La ingeniería genética o transformacióngenética, técnica conocida como del ADNrecombinante, permite introducir en plantasgenes provenientes no sólo de otras espe-cies vegetales muy alejadas desde el puntode vista evolutivo sino incluso de hongos, vi-rus, bacterias y animales. Conviene destacarque la transformación de plantas es una tec-nología que aporta variabilidad genética co-nocida sin alterar el fondo genético. Este úl-timo aspecto es de gran importancia ya quela creación de cultivares es un procesoacumulativo; es decir que se desea incorpo-rar características favorables sin perder lasmejoras logradas anteriormente. Elgermoplasma transgénico es posteriormen-te incorporado al proceso de mejoramiento,el cual dependerá de la especie y del tipo decultivar a obtener.

En 1983 se informaron los primeros ex-perimentos de expresión de un transgen (gen

introducido) en células vegetales y al año si-guiente se obtuvieron las primeras plantastransgénicas (tabaco y petunia). Desde en-tonces se ha extendido la aplicación de estatecnología a unas 120 especies. Las plantastransgénicas obtenidas hasta la fecha se de-sarrollaron por diversos métodos, los que hansido modificados para cada especie en parti-cular, aumentándose de esta forma la efica-cia de los mismos.

Entre sus aplicaciones se encuentran laobtención de plantas con resistencia a virus,insectos, hongos y bacterias, tolerancia aherbicidas y a estreses abióticos y modifica-ción de la calidad nutritiva de los cultivos en-tre otras. Asimismo, a través del uso detransgenes es posible modificar la expresiónde genes presentes en el genoma de la plan-ta. La transformación genética también cons-tituye una herramienta útil para estudiosbásicos que permiten conocer y/o profundi-zar acerca de la estructura y función de genesespecíficos, aspecto particularmente relevan-te en la era genómica (ver VII.-1).

2 Requerimientos para la obtención deplantas transgénicas

Para todas las técnicas de transformacióndesarrolladas hasta el momento es necesa-rio disponer del transgen (secuenciasregulatorias y codificante clonadas en unvector de transformación) y de una meto-dología eficiente para la transferencia algenoma vegetal. Una vez introducido el gende interés en la célula, se induce el desarrollode plantas mediante distintas técnicas decultivo de tejidos. Se procede luego al análi-sis molecular de las plantas regeneradas invitro para identificar aquellas que porten yexpresen el o los transgenes en los nivelesdeseados. Finalmente, a través de experimen-tos de campo y laboratorio se estudia el com-portamiento de los individuos transgénicosy su descendencia.

Por lo tanto, los elementos básicos quese requieren en trabajos de transformacióngenética en plantas son:

1. Un sistema de cultivo de tejidos quepermita regenerar plantas completas y férti-les.

2. Vectores apropiados, que permitan el

110 DÍAZ, M.L.; ZAPPACOSTA, D.C.; FRANZONE, P.M.; RÍOs, R.D.

clonado del gen de interés y/o su transfe-rencia al tejido blanco de transformación.

3. Un protocolo de transformación (siste-ma de transferencia de genes y de seleccióndel material transformado).

4. Herramientas de análisis para detectarla presencia del transgen y los productos delmismo en la planta.

Antes de iniciar la descripción de los ítemanteriores, resulta importante destacar quepara lograr una planta transgénica debenocurrir tres procesos en la misma célula:

a) El transgen debe ser transferido al in-terior de la célula,

b) El transgen debe integrarse al ADNcelular y

c) Se debe regenerar una planta comple-ta a partir de la célula transgénica en la quese verificaron los procesos a y b.

Dado que las células tienen diferente com-petencia o capacidad de respuesta para cadauno de estos procesos, la puesta a puntode un protocolo de transformación eficien-te requiere maximizar la cantidad de célu-las competentes para todos ellos de ma-nera simultánea.

2.1 Cultivo de tejidos vegetales

Los métodos de transformación más uti-lizados actualmente se basan en la obten-ción de células transgénicas y posterior recu-peración de plantas completas y fértiles apartir de las mismas a través del cultivo y se-lección in vitro. Esto es posible gracias a lapropiedad de totipotencia expresada por lascélulas vegetales (ver II.-1). En la mayoría delas especies se observa una importante in-fluencia del genotipo en la respuesta al culti-vo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tec-nología con fines de mejoramiento genéticoes muy importante conocer la respuestamorfogenética de distintos genotipos conadaptación local. En el cultivo in vitro, un pro-longado período de subcultivos puede indu-cir la aparición de variación somaclonal nodeseable, ya que es conveniente introducirsólo las modificaciones que se desean y enforma controlada (ver III.-1).

2.2 Construcción del vector

Para introducir un transgen es necesarioque el mismo sea incorporado previamenteen un vector (por ejemplo un plásmido). Paraello se digiere el ADN extraído de un organis-mo, cualquiera que sea su origen, con enzimasde restricción. Estas endonucleasas tienen lacapacidad de reconocer en el ADN secuen-cias específicas compuestas por pocosnucleótidos y posteriormente producir cortesen las mismas. Los fragmentos de restricciónasí obtenidos pueden ser ligadosenzimáticamente a vectores de clonado,obteniéndose, de este modo, clones de ADNrecombinante (ver II.-3)

Un transgen está compuesto por una se-cuencia codificante (región comprendida en-tre los codones de iniciación y terminaciónde la traducción) y por secuencias regulatoriasque determinan el tejido, el momento deldesarrollo y el nivel de expresión del transgenen la planta. La adecuada expresión de lostransgenes es un aspecto importante en laobtención del fenotipo deseado en la plan-ta transgénica. Muchas veces los genes utili-zados provienen de bacterias y usualmenteno pueden expresarse eficientemente encélulas eucariotas. Por ello, para optimizar laexpresión del transgen es necesario reempla-zar las secuencias regulatorias bacterianas porotras aptas para su expresión en células ve-getales. En este contexto, la secuencia másimportante es el promotor, sitio del ADN alcual se une la enzima ARN-polimerasa parainiciar el proceso de transcripción (Fig. 1).Cabe destacar que la expresión génica es con-trolada por las secuencias regulatorias y nodepende de la secuencia codificante. Por lotanto, una secuencia codificante aislada deun gen A, puesta bajo el control de un pro-motor aislado de un gen B, se expresará deacuerdo con el patrón de expresión de dichopromotor. Asimismo, en la elección del pro-

Figura 1: Estructura molecular del transgen


motor a utilizar en la construcción deltransgen, hay que considerar la especie ve-getal a transformar, ya que su nivel y patrónde expresión pueden variar al ser utilizadosen especies distintas a la de origen del mis-mo. Dentro de los promotores se distinguenaquellos constitutivos, que permiten la ex-presión del gen en toda la planta en formacontinua, los inducibles que responden afactores ambientales y finalmente los espe-cíficos de tejido que permitirán la transcrip-ción en determinados órganos y tejidos (Ta-bla 1). Los promotores pueden ser modifica-dos con el fin de aumentar la expresión delos genes que regulan, pueden truncarse,adicionárseles un intrón o unírseles secuen-

cias de otros promotores. Al momento deelegir el promotor debe tenerse en cuentatambién la planta a transformar ya que algu-nos de ellos son menos activos enmonocotiledóneas, como el 35S; por otraparte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maíz esuno de los más efectivos en gramíneas. Ade-más, es necesario que el transgen dispongade una región no traducida en el extremo 3’del mismo, que incluya la señal de corte ypoliadenilación (terminador), necesaria parael correcto procesamiento del transcriptocorrespondiente.

Por otra parte el nivel y patrón de expre-sión del gen también puede estar afectadopor la posición del mismo en el genoma dela planta transformada (efecto de posición).Esto puede deberse a la presencia de otrassecuencias regulatorias cercanas, a la estruc-tura de la cromatina, al patrón de metilación,etc. La cantidad de proteína producida porel transgen comúnmente varía más de 100veces entre individuos transformantes obte-

nidos en el mismo experimento. La soluciónpara evitar los «efectos de posición» es diri-gir la secuencia de interés a sitios específicosdel genoma vegetal, elegidos por su patrónde expresión adecuado y estable. Esto sepuede lograr usando sistemas de recom-binación heteróloga sitio-específicos o me-diante reemplazo génico por recombinaciónhomóloga.

2.3 Métodos de transformación

La pared celular impide la entrada del ADNen la célula, constituyendo un obstáculo quetodos los métodos de transformacióngenética tienen que superar de algún modo.

Estos métodos pueden dividir-se en:

a) Transformación media-da por Agrobacterium, vectorbiológico que participa del pro-ceso de transferencia.

b) Métodos de transfor-mación genética directa, tam-bién llamados físicos, median-te los cuales, por distintos me-canismos, se introduce el ADNen la célula.

2.3.1 Transformación mediada porAgrobacterium

Las especies del género Agrobacteriumson bacterias Gram-negativas aeróbicas obli-gadas que viven en el suelo. Ellas son capa-ces de desarrollar un crecimiento saprofíticoo parasítico. El género comprende cuatroespecies fitopatogénicas, dos de ellas amplia-mente estudiadas (A. tumefaciens y A.rhizogenes). Ambas especies son capaces deinfectar una amplia variedad de especies dedicotiledóneas y tienen como blanco de in-fección a las heridas, atacando células indivi-duales y provocando su proliferación. A.tumefaciens causa tumores, enfermedadque se conoce como «agalla de la corona» yA. rhizogenes induce la proliferación de raí-ces dando lugar a la enfermedad denomina-da «raíz en cabellera». La capacidadpatogénica de estas bacterias esta asociadaa la presencia de megaplásmidos (150-200kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por

Constitutivos

nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium)35 S (virus del mosaico del coliflor)Ubi (ubiquitina de maíz)

Act 1 (actina de arroz)

Específicos de tejido

TA 29 (tapete de la antera de tabaco)

faseolina (cotiledones de poroto)TobRB 7 (raíz de tabaco)

patatina (tubérculo de papa)glutenina (endosperma de trigo)

Induciblessubunidad pequeña de Rubisco inducible por luzalcohol deshidrogenasa-1 inducible poranaerobiosisproteína de shock térmico inducible por calor

Promotores

Tabla 1: Promotores usados en transformación genética de plantas


«tumor-inducing»o inductor de tu-mores) o Ri (por«root-inducing» oinductor de raíces),presentes en algu-nas de las agrobac-terias. Se demostróque durante la pa-togénesis un frag-mento de estosplásmidos llamadoT-DNA (por«transfer-DNA»), es transferido a la célulavegetal, donde se integra al ADNcromosómico de la planta y cuya expresióncausa proliferación de células de la planta através de la síntesis y alteración de la respues-ta a hormonas vegetales. El T-DNA contienegenes que se expresan eficientemente en lacélula vegetal infectada y producen síntesisde hormonas vegetales (llamados oncogenesporque son los responsables de la prolifera-ción anormal del tejido) y genes que provo-can la síntesis de opinas (fuente de carbonoy nitrógeno para la bacteria).

A. tumefaciens es el caso más estudiadoy utilizado en la transformación de plantas.El T-DNA está delimitado por dos repeticio-nes directas imperfectas de 25 pares de ba-ses (bp) que lo flanquean, llamadas bordesderecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes sonlos únicos elementos en cis necesarios paradirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquierfragmento de ADN ubicado entre estos bor-des puede ser transferido a la célula vegetal.Contrariamente a lo que sucede con otrostipos de secuencias móviles de ADN, el T-DNAno codifica los productos que median sutransferencia. El T-DNA es una región relati-vamente grande (ca. 20 Kb) que contienegenes con secuencias regulatorias (promoto-res y señales de poliadenilación) típicamenteeucarióticas.

Desde la década de 1950-60 se sabe quelos tumores de la agalla de la corona se desa-rrollan si hay A. tumefaciens patogénicas enpresencia de heridas. Un aspecto destacablede esta bacteria es que usa la respuesta de laplanta a las heridas (cicatrización y defensa)como quimioatractivo y activador del proce-so de patogénesis. Luego de la adhesión dela bacteria a la célula vegetal, etapa en la que

están involucrados genes cromosómicos (chvA, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produceel procesado y la transferencia del T-DNA,mediados por los genes vir (por virulencia)que son inducidos por azúcares y compues-tos fenólicos, como la acetosiringona, produ-cidos por células vegetales heridas. Se cono-ce con mucho detalle la etapa de lapatogénesis que ocurre en la bacteria (verrevisión de Gelvin, 2000). La región de viru-lencia (de alrededor de 30 Kb) está organiza-da en operones esenciales para la transfe-rencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) oque permiten incrementar la eficiencia de latransformación (vir C, vir E). El ingreso deAgrobacterium en la era genómica permiti-rá avanzar en el conocimiento de lainteracción de esta bacteria con las plantas.

El desarrollo de la patogénesis de plan-tas por Agrobacterium representa una situa-ción única en la naturaleza: la transferenciade un elemento genético (T-DNA) de un or-ganismo procariota a un organismo eucariotasuperior, con su subsiguiente integración yexpresión en el genoma hospedador. Estemecanismo de ingeniería genética natural esaprovechado para la transferencia de genesde interés a las plantas, para lo cual, losoncogenes y genes de síntesis de opinas, sonreemplazados por un marcador seleccionabley el gen a transferir (Fig. 2). El método llama-do «del explante» (Horsch y col., 1984) con-siste en inocular un explante con A.tumefaciens, dejar la bacteria en contactocon el explante durante un cierto tiempo, enél se produce la transferencia del T-DNA quecontiene un gen marcador seleccionable y elo los transgenes de interés. Posteriormentese transfieren los explantes a un medio decultivo que contiene un antibiótico que ac-

Figura 2: Estructura del T-DNA


túa como bacteriostático y el agente selecti-vo correspondiente al gen marcadorseleccionable utilizado. Una vez completadoel protocolo de cultivo y selección in vitro serecuperan las plantas transgénicas (Fig. 3).Análisis por hibridación del T-DNA en plan-tas transgénicas y su progenie han demos-trado que el T-DNA se incorpora al ADNcromosómico y se hereda en forma estable.

Los plásmidos Ti sin oncogenes se deno-minan «desarmados», son de gran tamañoy resulta difícil introducir genes en su T-DNAusando técnicas habituales de ADNrecombinante. Por esta razón se han desa-rrollado dos sistemas de vectores para intro-ducir genes en Agrobacterium: los vectorescointegrados, que deben formar estructurascointegradas para replicarse en A.tumefaciens y los vectores binarios, que soncapaces de replicarse en forma autónoma enesta bacteria. En los vectores cointegrados,la inserción del ADN que contiene lostransgenes dentro del T-DNA de un plásmidoTi desarmado se logra por recombinaciónhomóloga. Sobre la base de la capacidad delos genes de virulencia de actuar en trans,movilizando el T-DNA presente en otroplásmido, se construyen vectores denomina-dos binarios que contienen un T-DNA nooncogénico en un plásmido pequeño, con unorigen de replicación de amplio espectro dehospedantes, características que permiten sufácil manipulación genética usando E. colicomo huésped. La introducción de esteplásmido a una cepa de Agrobacterium quecontenga un plásmido llamado «helper» devirulencia (con la región vir intacta y sin T-DNA) la hace apta para la transferencia delT-DNA a las células vegetales. Si bien ambostipos de vectores son herramientas eficien-tes para la transformación, se aprecia unanotable preferencia por el uso de vectoresbinarios.

La integración del T-DNA en el ADNcromosómico de la planta se produce al azar,por recombinación ilegítima, preferencial-mente en regiones con actividad trans-cripcional y con la participación de proteínasde la bacteria y de la planta. Este sistema detransformación permite transferir fragmen-tos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se uti-lizan vectores especiales que tienen caracte-rísticas tanto de cromosomas artificiales de

bacterias (BACs) como de vectores binarios.El uso de estos vectores permite clonar frag-mentos de ADN de gran tamaño y poste-riormente transferirlos al genoma vegetal víaA. tumefaciens. Esta tecnología es de granutilidad para el clonado posicional de genes.

Más de 600 especies vegetales sonhospedantes naturales de A. tumefaciens.Estas pertenecen en su mayoría a dicotiledó-neas y gimnospermas y más raramente amonocotiledóneas. Para muchas de ellas sehan puesto a punto protocolos de transfor-mación genética basados en este vector. Elinterés en el desarrollo de este tipo de tec-nología hizo que se expandiera el rango dehospedantes de A. tumefaciens a especiesque no son susceptibles en condiciones na-turales a este patógeno. Esto fue posibledebido al amplio conocimiento que se tienede esta patogénesis. Así, se ha puesto énfa-sis en la utilización de A. tumefaciens comovector de transformación en gramíneas y sehan desarrollado protocolos en varias espe-cies de este grupo (arroz, maíz, cebada, trigoy gramíneas forrajeras). Cabe notar que suaplicación es actualmente una rutina en arrozy maíz.

La transformación con A. rhizogenes tie-ne fundamentalmente dos aplicaciones: laproducción de raíces con alta tasa de creci-miento capaces de sintetizar metabolitossecundarios como productos farmacéuticos,aditivos alimentarios y cosméticos, y por otraparte representa una valiosa herramientapara la estimulación de la rizogénesis en es-pecies recalcitrantes, por ejemplo, leñosas.

La puesta a punto de un protocolo efi-ciente y reproducible de transformación me-diada por Agrobacterium es un proceso com-plejo en el que además de tener muy buenconocimiento de la respuesta al cultivo invitro de la especie a transformar, hay queconsiderar aspectos tales como el genotipovegetal, la cepa bacteriana, el tejido blancode transformación, la inducción de los genesde virulencia y el control del estrés durantetodo el proceso.

2.3.2 Transformación directa o pormétodos físicos

La primer metodología de transformacióngenética de plantas desarrollada fue la de A.


tumefaciens. Inicialmente esta tecnología noresultó de utilidad para abordar la transfor-mación de especies de gran importancia eco-nómica como los cereales, debido a que noson hospedantes naturales de esta bacteria.Este hecho condujo al desarrollo de los mé-todos físicos de transformación. En ellos eltransgen es introducido en la célula vegetalmediante distintas técnicas que se detallana continuación.

- Transformación de protoplastosLa introducción y expresión de ADN forá-

neo en protoplastos fue el primermétodo de transferencia directa cla-ramente demostrado en plantas yesto se debió a que se disponía,para algunas especies, de procedi-mientos eficientes para la regenera-ción a partir de protoplastos. Sebasa en el hecho de que la paredcelular es la principal barrera para laintroducción de ADN en las célulasvegetales por lo que ésta estemporariamente removida. Losprotoplastos pueden ser aislados enforma mecánica o por un procesoenzimático que digiere la pared. Asíse obtiene una suspensión conte-niendo millones de células individua-les lo que favorece la transformaciónde células aisladas.

Los protoplastos pueden sertransformados utilizando polieti-lenglicol (PEG), electroporación,microinyección o liposomas. Latransformación de protoplastosmediada por PEG es el método máscomúnmente usado. Tanto el PEGcomo la electroporación producenporos en la membrana plasmáticapor alteración de la polaridad de lamisma y por ellos penetra el ADNforáneo. En el último caso se some-ten los protoplastos a un campoeléctrico. Ambas técnicas permitenel tratamiento de un gran númerode protoplastos al mismo tiempo.La microinyección es un método di-fícil y laborioso que consiste en la in-troducción de ADN dentro deprotoplastos individuales medianteel uso de capilares de inyección ymicro-manipulador y aunque con

esta metodología es necesario manipular lascélulas individualmente, es posible lograr unalto grado de integración del ADN foráneo.

Cabe notar que el cultivo de protoplastoses la metodología más sofisticada de cultivoin vitro de plantas por lo cual representagran complejidad experimental y no está dis-ponible más que para algunas especies y den-tro de ellas particularmente en genotipos mo-delo. Por ello se desarrollaron metodologíasalternativas de transformación directa comola electroporación de tejidos, el uso de fibras

Figura 3: Comparación de técnicas de transformacióndirecta e indirecta


de carburo de silicio para facilitar la entradadel ADN en las células en cultivo y el bombar-deo con microproyectiles o micropartículas.

- Bombardeo de micropartículasEs un proceso por el cual micropartículas

cubiertas con ADN son aceleradas por un gascomprimido e introducidas en células vege-tales. Esta técnica se ha ido perfeccionandoy actualmente es la más difundida entre losmétodos de transformación directa. Inicial-mente, la fuerza impulsora de las partículasestaba dada por pólvora, peroluego fue reemplazada por elsistema de helio comprimidoque brinda una mejor regula-ción de la fuerza, distribuciónde microproyectiles y mayorreproducibilidad entre bombar-deos. Se utilizan micropro-yectiles de oro o tungsteno(químicamente inertes) cuyostamaños van desde 0,5 a 3mm, que al ser disparados agrandes velocidades puedenatravesar pared y membranas de la célulavegetal bombardeada sin causarle daños le-tales (Klein y col., 1987). Para el bombardeose puede emplear cualquier tipo de explantevegetal, desde células o protoplastos hastaplántulas completas, pasando por tejidos or-ganizados en embriones y meristemas. Elexplante es generalmente sometido a un tra-tamiento osmótico pre y posbom-bardeo,que produce plasmó-lisis celular, evitandoque el impacto y la penetración de las partí-culas dañen las células (Fig. 3). Los vectoresplasmídicos que se usan en este tipo de pro-cedimiento sólo requieren un origen dereplicación que permita un alto número decopias de los mismos en E. coli, aspecto quefacilita en la práctica la preparación del ADNnecesario en grandes cantidades para latransformación genética por este método.

Esta técnica, sin embargo, tiene manifies-tas limitaciones. Algunas especies oponenuna resistencia natural a la penetración delas partículas, dada por cutículas endurecidas,paredes celulares lignificadas o superficiesvellosas. Sin embargo, la principal limitacióndel método continúa siendo la baja relaciónentre el total de células sometidas al bom-bardeo y el número de células que logran in-

corporar de manera permanente la informa-ción genética transferida. A pesar de la des-ventaja que representa el bajo número detransformantes producido por un solo epi-sodio de bombardeo, la versatilidad de laaceleración de partículas para introducirtransgenes ha superado muchas de las ba-rreras asociadas a otros métodos de trans-formación, como son el rango de huéspedesde Agrobacterium y las dificultades inheren-tes al cultivo y regeneración de protoplastos.

La biolística ha demostrado ser la mejor op-ción para la producción de plantastransgénicas de soja, sorgo, papaya, espárra-go, caña de azúcar y trigo.

2.3.3 Transformación directa vs. indirecta

Con el transcurso de las investigacionesse ha logrado optimizar los protocolos detransformación para muchas especies vege-tales; igualmente, en la actualidad, ambasvías de transformación presentan ventajas ydesventajas que las hacen más o menos con-venientes para los distintos fines. En la Ta-bla 2 se presenta una comparación entre latransformación del genoma nuclear media-da por A. tumefaciens y el método biolísticocomo representante de los métodos detransformación directa.

Uno de los procesos necesarios para ob-tener plantas transgénicas es la integracióndel transgen al ADN cromosómico. Con re-lación a este proceso existen diferencias en-tre ambos métodos. A. tumefaciens poseeun mecanismo natural muy eficiente paratransferir, al núcleo celular, el T-DNA que con-tiene el transgen y producir una integraciónaleatoria en regiones cromosómicas con ac-tividad transcripcional. Generalmente, los

Agrobacterium Método biolístico

Especies a transformar - dicotiledóneas y algunasmonocotiledóneas

- sin limitaciones

Eficiencia de transformación - alta - baja

Tipo de integración en elgenoma vegetal

- aleatoria en regiones contranscripción

- bajo número de copiasindependientes

- precisa

- aleatoria

- multicopia en tandem

- imprecisa

Construcción de vectores - compleja - simple

Dependencia del genotipovegetal

- mayor - menor

Tabla 2: Comparación entre métodos de transformación del genomanuclear


patrones de inserción de transgenes son mássencillos en comparación a los producidos porel método biolístico. Así, el número de co-pias que se incorpora es bajo y cuando haymás de una copia, suelen distribuirse en lociindependientes, lo que facilita la posterioreliminación de las copias no deseadas porsegregación. Por otra parte, el mecanismoinvolucrado hace que se transfiera un seg-mento de ADN definido: el T-DNA, acompa-ñado de proteínas que lo protejen de la ac-ción de nucleasas. Por el contrario, en el mé-todo biolístico el ADN transferido no estáasociado a proteínas, por lo que al ser par-cialmente degradado, sólo parte del mismollega al núcleo donde se produce, con bajaeficiencia, la integración al azar en el ADNcromosómico. En este método es común quese produzcan inserciones de varias copias deltransgen en un mismo sitio del genoma condistinto grado de reordenamiento de la se-cuencia del transgen. Este último aspecto esconsiderado como una desventaja ya quetanto desde el punto de vista de la percep-ción pública como el de la optimización de laexpresión de los transgenes, es deseable dis-poner de inserciones simples y bien defini-das molecularmente. Esto es particularmen-te relevante cuando se tiene por objetivo eldesarrollo de productos comerciales. Así, elfenómeno de silenciamiento de transgenes(pérdida de su expresión), observado en al-gunos casos, puede resultar de la presenciade varias copias del transgen. Por otra parte,cuando se utiliza el método biolístico, el seg-mento de ADN plasmídico que se integra alADN cromosómico no está definido, comoen el caso de T-DNA, sino que es de longitudvariable.

La construcción de vectores es muchomás sencilla en el caso del métodobiolístico. Este aspecto puede resultar impor-tante en el contexto del desarrollo de pro-yectos de investigación, en los cuales muchasveces se requiere utilizar un número conside-rable de vectores diferentes.

Es conveniente destacar que en ambosmétodos la integración del transgen en elgenoma se produce al azar. Como conse-cuencia de ello, diferentes plantastransgénicas provenientes de un mismo ex-perimento, presentan inserciones en distin-tos sitios del genoma receptor. Así, la expre-

sión fenotípica de un transgen será diferen-te en distintas plantas que contienen el mis-mo transgen, por lo cual, para clarificar la si-tuación se considera a cada una de ellascomo eventos de transformación distintos.

La aplicación de cualquiera de estos mé-todos de transformación al mejoramientovegetal depende, en gran medida, de la dis-ponibilidad de genotipos con muy buenarespuesta al cultivo in vitro. Finalmente,cabe mencionar que en el caso de A.tumefaciens, debido a que se trata de unainteracción biológica entre una planta y unabacteria, la dependencia del genotipo esmucho más acentuada, ya que influyen tam-bién en la eficiencia de transformación, tan-to el genotipo de la planta como el de labacteria.

2.3.4 Genes de selección e informadores

En el proceso de obtención de plantastransgénicas, los genes marcadoresseleccionables (Tabla 3), generalmente deorigen bacteriano, cumplen un rol de relevan-cia, sea para poner a punto un protocolo detransformación o como acompañantes degenes de interés que se desean introducir. Elgen marcador seleccionable otorga a las cé-lulas transgénicas que lo expresan una impor-tante ventaja, con respecto a las células notransgénicas, al permitirles crecer en un me-dio de cultivo que contiene el agente selecti-vo correspondiente. Entonces, si el gen mar-cador codifica para una proteína que confie-re resistencia a agentes fitotóxicos comoantibióticos o herbicidas, las células que loexpresen podrán crecer y desarrollarse enmedio de cultivo que contenga dichos agen-tes selectivos mientras que las células notransgénicas no lo harán (selección negati-va). En otros casos, la ventaja estará dadapor la posibilidad de utilizar diferencialmenteun sustrato. Así, el gen man A de E. coli per-mite a las células vegetales que lo expresanutilizar la manosa como fuente de carbono,lo cual no es posible para las células notransgénicas (selección positiva). Es necesa-rio tener en cuenta que algunas especies pue-den poseer una resistencia natural a los agen-tes selectivos antes mencionados, por lo quees importante evaluar este aspecto cuandose elige el gen de selección a utilizar, así como


el agente selectivo y las concentraciones delmismo.

En la puesta a punto de las metodologíasde transferencia de genes son asimismo degran utilidad los genes marcadoresvisualizables o informadores que posibilitanla observación directa de las células que losexpresan (Tabla 3). Estos genes codifican paraproteínas que no están presentes en las cé-lulas vegetales y producen un fenotipo carac-terístico de fácil y rápida observación. Así, elgen gus A proveniente de E. coli codifica parala enzima ß-glucuronidasa. Esta proteínapuede ser detectada cualitativamente portinción histoquímica, en presencia de unsustrato específico, por la producción de unprecipitado azul-índigo de fácil visualización.Este marcador también puede ser detecta-do cuantitativamente usando técnicas fluoro-métricas. Como ejemplo de la aplicación deestos métodos de detección podemos men-cionar el estudio de la expresión de un pro-motor en una especie vegetal. Para ello sepuede construir un vector con la secuenciacodificante de gus A y con una secuencia determinación de transcripción, y estudiar enplantas transgénicas el patrón de expresiónespacio-temporal del promotor (en qué tipode células y cuándo se expresa) por tinciónhistoquímica y su nivel de expresión porfluorometría.

Recientemente, el gen de la proteínafluorescente verde, gfp («green fluorescentprotein»), aislado de una medusa, se ha con-vertido en un gen marcador visualizable invivo muy utilizado. Cuando se ilumina conluz ultravioleta o luz azul, tejidos que contie-nen células que expresan este gen, se obser-va un brillo verde fluorescente. Al ser éste unensayo no destructivo, es decir que permiteconservar vivo el material en estudio, repre-senta una herramienta de utilidad paravisualizar diferentes etapas del proceso detransformación.

2.4 Técnicas de deteccióndel transgen y susproductos

Luego de la selección invitro, las plantas regenera-das deben ser analizadaspor métodos molecularespara identificar aquellas

que porten y expresen los transgenes en losniveles deseados. Para ello se emplean técni-cas como:

- Reacción en cadena de la polimerasa(PCR): con el uso de «primers» homólogos ala secuencia del transgen se puede determi-nar la presencia del mismo. Esta técnica per-mite hacer un «screening» rápido de las plan-tas regeneradas, aunque tiene algunas limi-taciones, un resultado positivo indica sola-mente que en la muestra existe una secuen-cia que amplifica con los «primers» utilizadospero no indica si el transgen se encuentra in-corporado al genoma de la planta. Paramaximizar la robustez de esta prueba es ne-cesario utilizar temperaturas de ‘annealing’o apareamiento de primers altas (más de 60°C) y «primers» relativamente largos (más de20 nucleótidos). Una variación de esta técni-ca, PCR en tiempo real, resulta de utilidadpara evaluar el número de copias deltransgen incorporadas al genoma de la célu-la vegetal.

- Hibridación southern o «Southernblotting»: es una de las herramientasmoleculares más poderosas para caracterizarlas plantas transgénicas. Además de indicarla presencia o no de la secuencia de interés,da información acerca de la integración de lamisma en el genoma de la célula huésped(número de copias integradas y número deloci en los cuales se produjo la integración).En la Fig. 4 se representa el análisis de uncaso hipotético de transformación median-te Agrobacterium, aunque éste es aplicabletambién a plantas obtenidas por métodosdirectos. El esquema 4-a representa parte delvector que contiene el gen de interés y el genmarcador. Si se utiliza como sonda el T-DNAcompleto y la digestión del ADN genómicose realiza con enzimas de restricción que nocortan dentro del T-DNA, el número de ban-das del patrón representa el número de si-

Marcadores

Seleccionables (Agente selectivo) Visualizables (Fenotipos asociados)

npt II (kanamicina, paromomicina, G418)hph (higromicina)

pat o bar (phosphinotricina, bialaphos)

CP 4 (glifosato)

man A (manosa 6 fosfato)

gus A (color azul índigo)

luciferasa (luminiscencia)gfp (fluorescencia verde)

Tabla 3: Genes marcadores utilizados comúnmente en transformación deplantas


tios de inserción. El tamaño de las bandasserá mayor que el T-DNA ya que se están uti-lizando enzimas que cortan por fuera de éste.Plantas transgénicas obtenidas en forma in-dependiente tendrán patrones de hibrida-ción diferentes (4-b). Por otra parte, si la en-zima tiene un sitio de corte único dentro delT-DNA, utilizando la sonda antes menciona-da, ésta dará dos señales de hibridación para

1 2 3 4 5

Sitio de corte: Ausente dentro del Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entreT -DNA el marcador y el transgen

Sonda: T-DNA (frag.Hind III) T-DNA (frag.Hind III) Gen marcador

Frag: tamaño > 5 kb > 2 kb > 2 kb

b) c) d)

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5e) f)

Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre Dos sitios (Sal I) dentro delel marcador y el transgen transgen

Sonda: Transgen Fragmento (Sal I) del transgen

Frag: tamaño > 3 kb 1 kbcantidad Igual que en d) Uno

Gen Marcador Gen de InterésBI BD

2 kb 3 kb

Hind III Eco RI Sal I Sal I Hind III

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Figura 4: Patrones de Hidridación de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002)

cada sitio de inserción independiente del T-DNA (4-c). La aparición de un número imparde bandas indica que en un mismo sitio seinsertaron múltiples copias, ocurrieronrearreglos o se produjo el truncado del T-DNA. Si se digiere la muestra con una enzimade restricción que posee un sitio único decorte entre el gen marcador y el gen de inte-rés y utilizando como sonda el gen marca-


La actividad de la proteína debe ser me-dida, sea por ensayos bioquímicos o porbioensayos, a fin de interpretar correctamen-te el fenotipo de la planta obtenida. Ade-más, es conveniente confirmar la estabilidadmeiótica de los transgenes estudiando sutransmisión sexual a la generación siguiente.

Estas técnicas se encuentran descriptasdetalladamente en la sección II.3 y su aplica-ción para el análisis de plantas transgénicasen Register (1997) y en Bhat y Srinivasan(2002).

Finalmente, el comportamiento de losindividuos transgénicos se estudia en labora-torio, invernáculo y campo. Cabe aclarar quepara realizar experimentos de invernáculo yde campo es necesario contar con autoriza-ción de la Comisión Nacional Asesora deBiotecnología Agropecuaria (CONABIA) (verIX.-3).

3 Aporte de la transformación genética ala variabilidad genética

Como ya se mencionó, la transformacióngenética permite introducir variabilidadgenética novedosa en las diferentes especiesvegetales. Analizando con más detalle esteconcepto podemos considerar que este apor-te puede ser realizado de diferentes mane-ras. Así, este puede consistir en:

a) La expresión de secuencias codificantesno existentes en la especie (ejemplo: proteí-nas insecticidas de origen bacteriano).

b)La expresión de nuevas formas alélicasde genes que ya están presentes en elgenoma (ejemplo: tolerancia al glifosato ensoja).

c) La expresión de secuencias codificantespresentes en el genoma pero bajo el controlde nuevas secuencias regulatorias que modi-fican su nivel o patrón de expresión (ejem-plo: proteínas relacionadas a la patogénesis).

d)La inhibición de la expresión de genesresidentes en el genoma .

Para lograr la inhibición de la expresióngénica se pueden usar diferentes técnicas:cosupresión, antisentido y la denominadainterferencia del ARN. Todas ellas se basanen un proceso denominado silenciamientogénico post-transcripcional. Este involucra ladegradación del ARN mensajero producido

dor, se obtendrá una sola banda por cadainserción independiente (4-d). Si la membra-na se hibrida con el gen de interés (4-e) apa-recerá un patrón que tendrá el mismo nú-mero de bandas que el anterior. La ausenciade una banda es indicativo de la inserción deuna copia truncada de uno de los genes porlo que se pierde el sitio de corte. La apariciónde una banda del tamaño del T-DNA puedeindicar la presencia de repeticiones entandem. Para estimar el número de copiasdel transgen en un locus transgénico, se de-ben utilizar enzimas de restricción con sitiosflanqueantes del transgen y como sonda, eltransgen. Se observará una sola banda deltamaño del transgen; sin embargo, la inten-sidad de la señal variará entre las distintasplantas analizadas de acuerdo con el núme-ro de copias del mismo (4-f). Para realizar lacomparación es necesario utilizar simultánea-mente estándares conteniendo un númeroconocido de copias del transgen. Esta deter-minación no es del todo precisa ya que exis-te mucha variabilidad en los resultados debi-do a diferencias en la digestión de las mues-tras y a la degradación que sufre el ADN.

En lo que respecta a la cuantificación, estatécnica ha sido reemplazada en gran medi-da, en los últimos años, por la PCR en tiem-po real o «real time PCR», antes menciona-da, dado que esta última resulta menos cos-tosa en reactivos y tiempo y requiere menoscantidad de material vegetal para realizar elanálisis.

- Análisis de ARN: Las técnicas de RT-PCR (transcripción reversa seguida de PCR)con la hidridación de ARN o «Northernblotting» pueden resultar valiosas herramien-tas para detectar los transcriptos de interéspresentes en la muestra. La RT-PCR presen-ta algunas ventajas frente al Northernblotting: se requiere poca cantidad de mate-rial, posee una alta sensibilidad y la muestraes de fácil preparación. Por otra parte, la hi-bridación del ARN utiliza como sonda eltransgen, ofrece información sobre el tama-ño del transcripto y permite su cuantificación.

- ELISA y «Western blotting»: aquellasplantas que poseen la secuencia de interés yla expresan como transcripto, pueden seranalizadas con estas técnicas inmunológicasa fin de determinar la presencia de la proteí-na codificada por el transgen.


por un gen determinado. La cosupresiónconsiste en la obtención de plantastransgénicas que expresan un transgen ho-mólogo del gen residente que se desea si-lenciar. La técnica del ARN antisentidoinvolucra la síntesis de moléculas de ARN queson complementarias al ARNm producidopor la transcripción del gen que se quiere si-lenciar. El transgen consta de la secuenciacodificante del gen cuya expresión se deseaalterar pero con la orientación invertida,cuando esta secuencia se transcribe generaARN que hibrida con el ARNm formando unahebra doble que bloquea la traducción. Comoresultado de este mecanismo las célulastransformadas producirán poco o ningúnproducto proteico. Esta técnica ha sido utili-zada para obtener variedad de tomates(FlavrSavrä) la que mantiene su firmeza du-rante mas tiempo luego de la cosecha debi-do a que la enzima responsable de la roturade la pared celular, la polygalacturonidasa, seexpresa en un 10% del nivel normal. La in-terferencia del ARN es parte de un meca-nismo regulatorio natural de la expresióngénica que es actualmente muy estudiado yes la metodología más eficiente, y por ello lamás utilizada, para silenciar genes en plan-tas. La técnica se basa en la construcción detransgenes cuyo producto final es un ARN.Este contiene parte de la secuenciatranscripta del gen a silenciar en forma derepetición invertida. Como consecuencia deesta estructura , cuando este tipo detransgen se transcribe en la planta se gene-ra un ARN de doble cadena que dispara elmecanismo de degradación dependiente dela secuencia antes mencionado (Agrawal etal., 2003). El uso de una secuencia espaciadoraentre las repeticiones confiere a las construc-ciones mayor estabilidad durante las mani-pulaciones en bacterias. Este tipo de cons-trucciones se denominan ARN «hairpin».Además, se observó que el uso de un intróncomo secuencia espaciadora, produce unsilenciamiento más eficiente en la planta. Estametodología es una herramienta muy valio-sa para los proyectos de genómica funcionalpara poner en evidencia la función de genesclonados mediante su inactivación. Otra po-sibilidad es utilizarla para la obtención deplantas transgénicas mejoradas mediante lainactivación de genes endógenos cuya expre-

sión es indeseada (Kusaba, 2004). Una inte-resante aplicación de interés agronómico deesta tecnología fue la obtención de plantastransgénicas de café que no contienencafeína.

4 Obtención de plantas transplastómicas

Las células vegetales contienen tresgenomas: el nuclear, el plastídico y elmitocondrial. Los métodos presentados enlas secciones precedentes tienen como blan-co de transformación al genoma nuclear. Sinembargo, en los últimos años la obtenciónde plantas transplastómicas ha recibido no-table atención (Maliga, 2002). Así, el genomade los plástidos (plastoma) se ha convertidoen un blanco atractivo para la ingenieríagenética ya que esta tecnología ofrece unaserie de ventajas sobre la transformación delgenoma nuclear:

1. Se pueden obtener altos niveles deexpresión de los transgenes y elevados nive-les de acumulación de las proteínas codifica-das por ellos (hasta el 47% de las proteínassolubles totales). Cabe notar que el nivel deacumulación observado a partir de transgenesnucleares es generalmente inferior al 1%.

2. Es posible expresar un transgen‘operón’ con varias secuencias codificantesbajo el control de un mismo promotor.

3. No se observa efecto de posición de-bido a que la integración del transgen estádirigida a un sitio particular del plastoma. Estohace que no sea necesario obtener una granpoblación de transformantes, a diferencia delo que actualmente ocurre con las plantastransgénicas nucleares.

4. No se observa silenciamiento detransgenes.

5. Para las especies que tienen transmi-sión materna de los plástidos (la mayoría).Se minimiza la dispersión de los transgenespor el polen debido a la ausencia de transmi-sión de los plástidos por el mismo.

6. A pesar de la naturaleza eminente-mente procariota del sistema genético de losplástidos, se ha demostrado que estasorganelas pueden procesar proteínaseucariotas permitiendo su correcto plega-miento y la formación de puentes disulfurogracias a la presencia de proteínas


chaperonas y sistemas enzimáticosendógenos.

Los protocolos existentes para la obten-ción de plantas transplastómicas se basan enla transferencia de genes por el métodobiolístico, un eficiente proceso de cultivo yselección in vitro, y la utilización de vectorescon secuencias homólogas al genoma delcloroplasto. A diferencia de lo que ocurre enla transformación del genoma nuclear, la in-tegración dirigida de los transgenes en elplastoma se realiza mediante recombinaciónhomóloga. Para lograr esto, los vectores con-tienen los transgenes de interés flanqueadospor secuencias con alta homología al ADNplastídico. La homología entre el ADN delvector y del ADN del cloroplasto determinala potencialidad del plásmido para ser utili-zado en la transformación genética delplastoma. En este contexto, la existencia desecuencias altamente conservadas en elplastoma de varias especies es explotada parael diseño de vectores universales, potencial-mente útiles en la transformación de loscloroplastos de numerosas especies. La ex-presión exclusivamente plastídica de lostransgenes queda asegurada a través de lautilización de promotores específicos delcloroplasto, cuya transcripción tiene caracte-rísticas típicamente procarióticas.

5 Importancia y aplicaciones de lasplantas transgénicas

Las primeras plantas transgénicas experi-mentales fueron obtenidas a mediados delos años 80. La disponibilidad de esta tecno-logía permitió importantes avances en el áreadel conocimiento de la biología vegetal. Porotra parte, se constituyó en una herramien-ta disponible para el mejoramiento genéticovegetal (ver aspectos para esta aplicación enBirch, 1997) y el gran esfuerzo realizado eneste sentido tuvo como consecuencia la lle-gada al mercado, a partir de 1995, de los pri-meros cultivares transgénicos. Es destacablela rápida adopción que tuvieron estos pro-ductos. Así en el 2002 se cultivaron en elmundo 58,7 millones de hectáreas con plan-tas transgénicas. El 99% de este área globalse cultivó en 4 países (USA, Argentina, Cana-dá y China) mientras que el 1% restante se

distribuyó en 12 países. Esta superficie estu-vo ocupada prácticamente por 4 cultivos: soja(62%), maíz (21%), algodón (12%) y canola(5%). Los caracteres modificados que presen-taron estos cultivos fueron resistencia a her-bicidas (75%), resistencia a insectos (17%) ouna combinación de ambos (8%). En la Ar-gentina los eventos con autorización decomercialización son los siguientes: soja (to-lerancia a glifosato), maíz (resistencia alepidópteros, tolerancia a glufosinato deamonio) y algodón (resistencia alepidópteros, tolerancia a glifosato). LaCONABIA (ver en la página de la Secretaríade Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos,República Argentina; http://www.sagpya.mecon.gov.ar/), ha autorizadodesde el año 1991, 520 solicitudes para libe-raciones a campo, en distintas especies y condiferentes eventos de transformación.

Los cultivos transgénicos actuales corres-ponden a lo que se denomina «la primerageneración» que tiene por objetivo el aumen-to de la productividad de los cultivos, la re-ducción en el uso de agroquímicos, la conser-vación de la tierra arable, el agua y la ener-gía, la reducción de la contaminación delambiente y los beneficios para la salud hu-mana derivados de estos aspectos. Se consi-dera que ‘la segunda generación’ de cultivostransgénicos tendrá más beneficios directospara los consumidores. Estos comprenden elmejoramiento de la calidad nutricional (pro-teínas, aceite, vitaminas y minerales), la eli-minación de alergenos, la fitoremediación (esdecir la recuperación de ambientes contami-nados mediante el uso de plantas) y la utili-zación de plantas como bioreactores para laexpresión de proteínas recombinantes confines tales como la producción de vacunascomestibles, anticuerpos y otras proteínas deuso terapéutico o industrial. Esta aplicaciónse conoce como «molecular farming» (pro-ducción de moléculas en la granja) y presen-ta numerosas ventajas para la producción engran escala de estas proteínas en particularen lo que respecta a costos, practicidad y se-guridad. Sin embargo aún quedan algunosaspectos que limitan su potencial comobiorreactores como son la calidad y homo-geneidad del producto final. En los últimos10 años, se han desarrollado varios sistemasde expresión basados en plantas y en la ac-


tualidad se producen más de 100 proteínasrecombinantes en diferentes especies vege-tales, generándose un estrecho vínculo en-tre la agricultura y muchas ramas de la indus-tria. Un ejemplo destacable es el ‘arroz dora-do’, llamado así por la pigmentación amari-lla que tienen sus granos debido a que acu-mula altos niveles de provitamina A en elendosperma. ‘La tercera generación’ de cul-tivos transgénicos se basará en la informa-ción producida por los proyectos genómicosy tendrá por objeto aspectos tales como lamodificación de la arquitectura de la planta,la manipulación de la floración, el mejora-miento de la eficiencia fotosintética, la mani-pulación de la heterosis y la apomixis, etc.

6 Perspectivas

La continuidad en el desarrollo de tecno-logía de transferencia de genes en plantases importante tanto para ampliar el rangode especies a transformar como el degenotipos dentro de cada especie. En los úl-timos años se nota un creciente interés en elcontrol del nivel de expresión de transgenesasí como de su regulación espacial y tempo-ral. La expresión de los genes nucleareseucarióticos está controlada en varios nive-les que involucran la transcripción propiamen-te dicha, el procesamiento, transporte y es-tabilidad de los transcriptos y sutraducibilidad, así como la estabilidad, modi-ficación y compartimentalización del produc-to proteico final. Por otra parte, es necesarioaprovechar la experiencia acumulada en cuan-to a la expresión de transgenes, de modode diseñar protocolos de transferencia queminimicen las posibilidades de silenciamientogénico. En este contexto, está recibiendonotable atención el estudio de larecombinación homóloga como mecanismopara la transformación del genoma nuclear(ver revisión de Hanin y Paszkowski, 2003).

Del análisis comparativo de métodos pre-sentado cabe destacar dos aspectos actual-mente en desarrollo. Por un lado, continúael interés en extender el uso de la transfor-mación mediada por A. tumefaciens a espe-cies que no son hospedantes naturales de labacteria. Por otro lado, como fuera anterior-mente mencionado, los métodos de trans-formación genética actualmente en uso re-

quieren de genotipos con una excelente res-puesta al cultivo in vitro, lo cual resulta enuna clara limitación cuando se desea aplicaresta tecnología a los materiales usados porlos mejoradores, los que generalmente noposeen esta característica. Por ello, se estátratando de reducir y si es posible evitar lafase de cultivo in vitro durante el proceso detransformación, lo que permitirá ampliar elrango de genotipos a los cuales se podráaplicar esta moderna tecnología. Así, se de-sarrolló un método eficiente y reproduciblede transformación in planta paraArabidopsis thaliana. Este consiste en infil-trar con vacío plantas adultas de esta espe-cie, con una suspensión de A. tumefaciensde modo que los tejidos y órganosreproductivos sean invadidos por la bacteria.Posteriormente se propuso una simplificaciónde este método que consiste en reemplazarel tratamiento de vacío y sumergir lainflorescencia en una suspensión bacterianaque incluye un surfactante. Las plantastransgénicas que se obtienen porautofecundación de las plantas así transfor-madas, son hemicigotas y se demostró queesta metodología produce la transformaciónde la gameta femenina.

El logro de determinados objetivos comopuede ser el redireccionamiento de una rutametabólica o la modificación de un caráctercomplejo de interés agronómico como porejemplo la resistencia durable a enfermeda-des fúngicas, requiere de la integración demúltiples transgenes y de la expresión coor-dinada de los mismos en la plantatransgénica. Este tema está recibiendo no-table atención (ver revisión de François y col.,2002).

Los métodos de transformación que he-mos descripto se basan en la utilización degenes marcadores seleccionables. Sin embar-go, hay razones por las cuales la presenciadel marcador no es deseable en plantastransgénicas que se liberan al ambiente. Hayun manifiesto rechazo por parte del públicocon respecto a la utilización de genes de re-sistencia antibióticos y en determinadas si-tuaciones, el uso de genes de resistencia aherbicidas puede ser inconveniente. Por otraparte, desde un punto de vista experimen-tal puede ser necesario transformar una mis-ma planta varias veces con distintos trans-


genes y con la metodología convencional nohay más que un número limitado de genesmarcadores disponibles. Por ello se conside-ran estrategias alternativas para la obtenciónde plantas transgénicas libres de marcado-res (Puchta, 2003). La estrategia que ha reci-bido más esfuerzo hasta ahora, plantea laremoción vía cruzamiento sexual del marca-dor seleccionable luego de haber obtenidola planta transgénica. Una posibilidad paraello es cotransformar, esto implica que eltransgen de interés y el marcador seleccio-nable estén presentes en vectores distintosy que posteriormente se separen los genespor segregación luego de la reproducciónsexual. Sin embargo, esta puede ser una al-ternativa poco atractiva en circunstanciasparticulares como cuando no se dispone deun protocolo eficiente de cotransfor-macióno cuando no se desea reproducir sexualmentela planta transgénica. Otra opción dentro deesta línea es la utilización del sistema derecombinación sitio-específica de origen viralCre/lox. Más recientemente se ha propues-to como estrategia alternativa el desarrollode métodos de transformación que no usenmarcadores seleccionables. La idea subyacen-te es incrementar la frecuencia de transfor-mación a través del uso de genes que pro-muevan la regeneración.

Finalmente, las plantas transgénicas ac-tualmente cultivadas comercialmente, en sumayoría resistentes a herbicidas nos permi-ten ganar experiencia y acumular el conoci-miento necesario para desarrollar nuevas ymejores generaciones de productos.


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III.-Capítulo 4

Polinización y fertilización in vitro.

Picca, Aurora; Cardone, Susana

1 Introducción

Muchas plantas con flores producen me-nos frutos maduros que flores, y los frutos, asu vez, generan menos semillas que el núme-ro de óvulos disponibles para la fecundación.Considerando que la producción de polen noes el factor limitante, existen diferentes ra-zones que explican esta situación. En ocasio-nes, a pesar de la ocurrencia de la poliniza-ción, la fecundación no puede llevarse a cabo.Otras veces, la fecundación ocurre normal-mente pero el embrión aborta en forma pre-coz. En cualquiera de estas circunstancias, lastécnicas de cultivo in vitro y manipulación decélulas aisladas son apropiadas para lograr elproceso completo de desarrollo del embrióny del endosperma y la obtención de semillasnormales.

En este capítulo se utilizarán indistinta-mente los términos «fecundación» y «fertili-zación» como sinónimos, refiriéndose a launión de las gametas masculina y femeninapara originar un nuevo individuo.

La técnica de fertilización o polinizaciónovular in vitro fue desarrollada por Kantaet al. en 1962, quienes demostraron que enalgunas especies de papaveráceas los granosde polen tenían la capacidad de germinar invitro directamente sobre los óvulos en culti-vo. En estas condiciones el tubo polínico al-canzaba el saco embrionario para concretarla fertilización, con la consiguiente formaciónde semilla normal en el mismo medio de cul-tivo. Esta técnica desarrollada en Papaversomniferum, ha sido luego empleada en va-rias especies de plantas como Dianthuscaryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica,Argemone mexicana, Eschechloziacalifornica, Petunia violacea, Antirrhinummajus y Dicranostigma franchetianum.

Bajo el nombre de «polinización in vitro»se suele englobar a varias técnicas que si bienposeen puntos en común, difieren en otros.Entre ellas se pueden citar la «polinización invitro de óvulos», la «polinización placental

in vitro» y la «polinización estigmática invitro». En todos los casos la gameta femeni-na es fecundada por células espermáticas li-beradas por el tubo polínico, en forma «casi»idéntica a la vía natural.

El término «fertilización in vitro» se uti-liza para aquellos casos donde la fusión delas gametas aisladas se logra por distintosmétodos como electrofusión, alta concentra-ción de calcio o elevado pH.

A veces la fertilización ocurre normalmen-te, pero el embrión no puede alcanzar lamadurez debido a una ruptura del equilibrioentre el mismo y el endosperma o por ano-malías en el desarrollo embrionario que im-piden una nutrición normal. Esto es lo quese conoce como barreras posfertilización oposcigóticas, que pueden contrarrestarsecon el rescate de los embriones y su poste-rior crecimiento en un medio nutritivo ade-cuado.

2 Fertilización in vitro

Durante años, los científicos utilizarontécnicas de fertilización in vitro de gametasaisladas tanto en animales como en plantasinferiores. Sin embargo, estos métodos nopudieron ser aplicados a las plantas superio-res hasta comienzos de la década de los no-venta. Esto se debió a que la fertilización invitro de las gametas aisladas de plantas su-periores es un proceso muy diferente al queocurre in vivo, y también lo es de los siste-mas animales y de las plantas inferiores, don-de las gametas son de vida libre.

El hecho más notable de la fertilizaciónin vivo de las angiospermas es el de la «do-ble fecundación», que es un proceso muycomplejo en comparación con lo que acon-tece en todos los demás seres vivos. Estoocurre en el saco embrionario, que se hallaprofusamente cubierto por el tejido mater-no. Los núcleos espermáticos se encuentrandentro de los granos de polen o tubospolínicos. Durante la fertilización, el tubopolínico llega hasta el aparato ovular, desor-ganizándose entonces el núcleo vegetativo.Las dos células espermáticas contenidas enel tubo, se vuelcan en una de las sinérgidas,la misma se desorganiza y uno de los núcleosespermáticos se fusiona con la oósfera paradar el cigoto, que luego producirá el embrión.

126 PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

El otro núcleo masculino se reunirá con dosnúcleos femeninos secundarios para dar lacélula madre del endosperma triploide (Fig.1).

Para que la fertilización tenga lugar invitro no sólo deben aislarse las gametas fe-

meninas y masculinas sino que deben ser in-ducidas a fusionarse en ausencia de las célu-las asociadas. Las técnicas de micromani-pulación desarrolladas durante los años 80permitieron el aislamiento y la fusión in vitrode gametas femeninas y masculinas deangiospermas. La combinación de estas téc-nicas con métodos de cultivo de células úni-cas posibilitaron la fertilización in vitro. Sepudo concretar de esta manera el desarrollode cigotos y de endospermas en forma indi-vidual in vitro, lo cual demuestra que cigotosy endosperma son capaces de autoorga-nizarse en cultivo, independientemente deltejido materno. Tanto los cigotos obtenidosin vitro como los que son aislados despuésde la polinización in vivo desarrollan embrio-nes normales y posteriormente plantas fér-tiles en cultivo.

En 1989 se fusionaron por primera vezgametas aisladas de maíz in vitro (Zea mays).Llevó tres años más regenerar plantashíbridas fértiles, vía embriogénesis cigótica, apartir de esos cigotos cultivados individual-mente. Actualmente puede reproducirse invitro el ciclo completo de vida de una plantasuperior, comenzando con la electrofusión de

la célula espermática con la ovocélula, dandocomo resultado un cigoto, un embrión y fi-nalmente una planta madura.

Estudios posteriores (1998,1999) posibili-taron el desarrollo de endosperma in vitrode maíz a partir de la fusión por pares de

células espermáticas y nú-cleos secundarios aislados.La fusión del núcleo de la cé-lula espermática puede ocu-rrir con uno de los dos nú-cleos polares o con los nú-cleos secundarios y se com-pleta aproximadamente doshoras después de la fusión invitro de las células. Los estu-dios in vitro sobre los prime-ros eventos después de lafusión de las células y núcleosindicaron que las primerascélulas del endosperma re-sultante desarrollan un teji-do característico capaz deautoorganizarse en formaseparada del tejido mater-no.

2.1 Aislamiento y selección de lasgametas

Se han desarrollado métodos de aisla-miento y selección de gametas para unaamplia variedad de especies vegetales entreellas maíz (Zea mays), trigo (Triticumaestivum), cebada (Hordeum vulgare),raygrass (Lolium perenne) y algunasbrasicáceas.

Los pasos a seguir son los siguientes:a) Conocer exhaustivamente la morfolo-

gía floral de la especie a utilizar con el objeti-vo de ubicar el saco embrionario y sus célulasconstituyentes.

b)Aislar las gametas masculinas a partirde los granos de polen mediante choqueosmótico y/o de pH.

c) Aislar el saco embrionario y las gametasfemeninas mediante microdisección individualen asociación con maceración enzimática.Este paso es crítico y limitante ya que pue-den obtenerse pocas gametas femeninas yel proceso de manipulación es muy delicado.El tratamiento de las espigas no polinizadascon 2,4-D, que induce a la expansión del ova-

Tubo polínico

Saco embrionario

Sinérgida querecibió el extremodel tubo polínico

Núcleos polaresrecibiendo al segundogameto

Oósfera en fusión con uno delos gametos

Saco embrionario

Tubo polínico

Figura 1: Corte longitudinal de un óvulo mostrando la doble fecundaciónen angiospermas.


rio, facilita el proceso, resultando en ovariosmás grandes y óvulos más blandos, incre-mentando la eficiencia en el aislamiento delas ovocélulas.

Fertilización in vitro propiamente dicha.Esta puede ser realizada mediante lamicroinyección de células espermáticas o nú-cleos espermáticos aislados en células indivi-duales obtenidas de los sacos embrionarioso por electrofusión (Fig. 2). En este últimocaso las gametas se ponen en contacto enuna cámara de electrofusión por alineacióndielectroforética y se fusionan mediante pul-sos eléctricos. Los productos de fusión pue-den ser entonces cultivados en una solucióncon células nodrizas y algunos de ellos desa-rrollarán en proembriones.

2.2 Fusión de las gametas

Muchos de estos estudios, algunos de loscuales datan de 1994, fueron realizados enmaíz, donde las gametas masculinas se ob-tienen a partir de granos de polen frescosometidos a un shock de pH en una solución0,5 M de manitol. Las ovocélulas y losprotoplastos de las células centrales se aislan

de óvulos por tratamiento con enzimascelulolíticas y microdisección manual. Lasgametas femeninas y masculinas aisladas secolocan de a pares, bajo condiciones de es-terilidad, en un medio de fusión simple com-puesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl

2).

El uso de microagujas de vidrio permite po-ner en contacto las gametas femeninas ymasculinas a fin de facilitar y dirigir la fusión.La adhesión y posterior fusión de las gametases rápida (aproximadamente 10 segundos).A los 20 minutos de realizada la fusión, dejade visualizarse el núcleo masculino y 20 horasdespués es posible visualizar mediante con-traste de fases la presencia de dos núcleos,de manera similar a lo que se observa in vivo.En 1995 se logró la fertilización exitosa detrigo a través de la electrofusión deovocélulas con células espermáticas. En pro-medio, la frecuencia de fusión suele ser del30%, pero bajo condiciones óptimas es posi-ble alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dosdías después de la fusión eléctrica aproxima-damente el 60% de los productos de fusióncomenzó a dividirse y cerca del 90% de ellosformó estructuras multicelulares y en unospocos casos microcallos.

Pese a que se ha tomado al maíz (Zeamays L) como sistema vegetal modelo en elcual estudiar los procesos de fusión degametas y posterior embriogénesis, tambiénse han realizado trabajos exitosos de fusiónde gametas en trigo (Triticum aestivum L.)obteniendo como resultado estructurasmulticelulares y en algunos casos del tipo demicrocallos.

Los recientes progresos relacionados a lossistemas de fertilización in vitro así como losproyectos de genómica posibilitarán unamejor comprensión de los procesos de reco-nocimiento gamético, fusión, señalesintracelulares, eventos tempranos de activa-ción del huevo y formación del cigoto.

3 Polinización in vitro

En muchos casos el polen no puede ger-minar sobre el estigma de la propia flor aun-que éste se halle receptivo. Este hecho pue-de deberse a barreras genéticas o fisiológi-cas. Algunas de estas barreras deprefertilización o precigóticas se deben a:

Figura 2: Fertilización in vitro medianteelectrofusión.


a) la incapacidad del polen de germinaren estigmas extraños

b)la incapacidad del tubo polínico para al-canzar el óvulo debido a una lenta velocidadde crecimiento o a una excesiva longitud delestilo. En estos casos, el ovario aborta antesde que el tubo polínico alcance la base del es-tilo o sin que la alcance en absoluto

c) el hecho que el tubo polínico se desha-ga en el estilo.

La polinización in vitro de óvulos con eldesarrollo posterior de embriones ha sidoexitosa en 14 familias de Angiospermas, re-sultando más adecuada su aplicación en aque-llas especies que poseen ovarios grandes yque contienen muchos óvulos. No obstante,con el tiempo se desarrollaron varias técni-cas de polinización in vitro más sofisticadasampliando con esto las posibilidades de apli-cación. Entre estas técnicas se encuentran:

- La polinización estigmática, que con-siste en cultivar el pistilo in vitro y colocar elpolen sobre el estigma.

- La polinización placental, donde losóvulos se ponen en contacto con el polen através de un corte en la parte superior delovario o quedan directamente expuestos porremoción de la pared del ovario.

- La polinización de óvulos aislados quese cultivan directamente sobre el medio decultivo.

- El injerto del estilo, en el cual los gra-nos de polen germinan en un estilo compa-tible y luego se los une al ovario de la plantamadre que se desea fertilizar.

Es de esperar que en todos estos casos elpolen germine en pocas horas, y que despuésde la polinización, tenga lugar la fertilización.

En la polinización placental in vitro losporcentajes de supervivencia son muy bue-nos, ya que los óvulos no resultan dañadosdurante las manipulaciones involucradas ensu aislamiento. El cultivo junto con la placentaincrementa, en general, las posibilidades deun rápido desarrollo embrionario. El cultivode óvulos aislados (separados de su placenta)es un procedimiento mucho más complica-do y que ha sido empleado con éxito sólo enpocas especies de plantas.

Para que las técnicas sean exitosas es

crucial realizar el aislamiento de los óvulos ydel polen en el estado fisiológico adecuado,por lo que es indispensable realizar un estu-dio de la duración de los distintos estadiosdel desarrollo de ambos. Este estudio consis-te en:

a) Determinar los tiempos de antesis, de-hiscencia de las anteras y polinización.

b)Precisar el momento en que el estigmaesté receptivo

c) Especificar el momento adecuado parala polinización.

d)Establecer el tiempo adecuado pararecoger el polen.

Experimentalmente se intentó la polini-zación in vitro de óvulos de varias especiesde angiospermas con polen proveniente devarias especies de gimnospermas. El análisisembriológico de los óvulos de Melandriumalbum, fijados tres días después de la polini-zación con polen de Pinus wallihiana, revelóla presencia de remanentes de tubospolínicos y embriones de 2-células en los sa-cos embrionarios.

4 Cultivo de óvulos y embriones in vitro

El cultivo de óvulos es un procedimientomuy complejo debido a que la manipulacióndel material es difícil. El óvulo es una estruc-tura delicada, muy pequeña, altamentehidratada, que puede ser dañada con sumafacilidad. Es imprescindible realizar lamicrocirugía con rapidez para evitar que lostejidos sufran desecación durante el proce-so. Pese a las dificultades de la técnica, enalgunos cruzamientos interespecíficos comolos realizados en papa, algodón y Heveabrasiliensis, se comprobó que el cultivo deóvulos completos es más exitoso para el res-cate de embriones que el cultivo de los em-briones aislados.

El rescate de embriones consiste en aislarlos embriones de los óvulos de una planta ycultivarlos en un medio estéril que contengalos nutrientes esenciales que les permita con-cluir su desarrollo normal y germinar. Estatécnica es relativamente fácil de llevar a caboen embriones maduros y sus posibilidades deéxito son muy buenas. Las dificultadesincrementan cuanto más inmaduro sea el


embrión a rescatar, ya que los requerimien-tos nutricionales son más específicos en lasetapas tempranas de desarrollo del embrión.

El cultivo de óvulos y de embriones vege-tales se emplea en mejoramiento vegetalcuando se desea:

- sortear algunas de las barreras deautoincompatibilidad

- rescatar embriones abortivos derivadosde la hibridación interespecífica ointergenérica

- superar problemas de abscisión precozdel fruto

- recuperar embriones de cruzasinterespecíficas que conducen a la obtenciónde haploides

- acortar el período de latencia que ocu-rre en algunas semillas por presentarseinhibidores del desarrollo del embrión, en elendosperma o en la cubierta de la misma.

El cultivo de embriones ha ayudado tam-bién al mejoramiento genético de especiesleñosas que tienen dificultad en lagerminación de sus semillas como en Taxusmairei o con escasa producción de semillascomo es el caso de Pseudotsuga macrolepisy constituye una herramienta interesante enestudios básicos de biología reproductiva yaque permite analizar la embriogénesis invitro.

4.1 Factores externos que condicionan elcultivo de óvulos y de embriones

Entre los factores externos más importan-tes que afectan el cultivo de óvulos y de em-briones se citan el medio de cultivo, laosmolaridad y los reguladores de crecimien-to.

El óvulo presenta una gran cantidad derequerimientos nutricionales, que varían conel estadio de desarrollo del mismo y que esnecesario identificar para cada especie enparticular. Es importante además obtener unmedio de cultivo adecuado para favorecer lagerminación de los granos de polen y permi-tir el desarrollo de los óvulos fertilizados has-ta semillas maduras. En general, todos losmedios de cultivo para germinación de losgranos de polen poseen altas concentracio-nes de sacarosa y de ácido bórico.

Un aspecto fundamental a tener en cuen-

ta en el rescate de embriones es la seleccióncorrecta de un medio de cultivo que puedasoportar los cambios progresivos de requeri-mientos durante las distintas etapas del de-sarrollo embrionario. Se pueden reconocerdos fases en el desarrollo embrionario conrespecto a la nutrición: la fase heterotróficaen la que el embrión es dependiente delendosperma y demás tejidos maternos quelo rodean, y la fase autotrófica, en la cual elembrión es capaz de sintetizar las sustanciasrequeridas para su crecimiento a partir desales minerales y azúcares. La etapa crítica depasaje de una fase a otra varía con las espe-cies. Este cambio de requerimientosnutricionales hace que, cuando crecen invitro, sea imprescindible la transferencia delos embriones de un medio de cultivo a otropara garantizar un óptimo crecimiento. En-tre los medios de cultivo más difundidos po-demos citar el de Murashige & Skoog,Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu ycol., etcétera.

El agua de coco y los extractos deendospermas han sido muy útiles, activandoel crecimiento y desarrollo de los embrionesen el cultivo de óvulos de algunas especiesvegetales.

No existe demasiada evidencia acerca dela absoluta necesidad de los reguladores decrecimiento para el desarrollo de los embrio-nes extraídos, sean inmaduros o maduros,fuera de su rol en la ruptura de la dormición.

La concentración osmótica es un factorimportante en el desarrollo de óvulos y em-briones, dependiendo del estado de madu-rez de los mismos. La sacarosa presente enlos medios de cultivo no sólo provee la fuen-te de carbono necesaria para el crecimientosino que además mantiene la osmolaridadrequerida para cada etapa del desarrollo. Estádemostrado que una presión osmótica ele-vada previene la germinación precoz de losembriones inmaduros, evitando así la ocu-rrencia de malformaciones estructurales. Amedida que van creciendo, los embrionesnecesitan ser transferidos a medios con pro-gresivas disminuciones en los niveles de saca-rosa.

Los embriones de la mayoría de las espe-cies presentan un buen crecimiento en unrango de temperaturas que va de los 25ºC alos 30ºC. Aunque algunos estudios indican


que la luz no es crítica para el crecimiento delos embriones, se demostró que en el casode la cebada la luz disminuye las probabilida-des de germinación precoz en los embrionesinmaduros.

5 Aplicaciones

La polinización placental in vitro puedeser empleada para superar las barreras deautoincompatibilidad e incompatibilidad cru-zada. Los granos de polen de plantasautoincompatibles son capaces de germinardirectamente sobre los óvulos y llevar a caboel proceso completo de la reproducciónsexual. En algunas combinaciones de cruza-mientos, la polinización directa de los óvulospermite que se superen las barreras de in-compatibilidad precigótica, obteniéndoseembriones híbridos y aun plantas híbridasimposibles de obtener mediante técnicasconvencionales, como es el caso de Zea maysx Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N.amplexicaulis, Melandrium album x Viscariavulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. Enaquellos cruzamientos en los que la barrerade incompatibilidad se encuentra a nivel delovario como en Trifolium repens x T.hybridum, es necesario rescatar los óvulosrecién fecundados.

La polinización placental in vitro tam-bién se emplea como vía para la obtenciónde plantas resistentes a estreses ambienta-les, ya que permite seleccionar para la fecun-dación aquellos granos de polen que tuvie-ron capacidad de germinar bajo diferentescondiciones de estrés. La polinización in vitrocon polen obtenido de plantas de maíz cre-ciendo a temperaturas elevadas condujo ala obtención de plantas tolerantes a estréspor calor. En Brassica rapa, la selección depolen a baja temperatura tuvo un efectopositivo en el crecimiento de la progenie encondiciones de frío, logrando acumular máspeso seco que en progenies normales. Sepodría entonces seleccionar para la fecunda-ción aquellos granos de polen que hayan sidocapaces de germinar bajo condiciones deestreses ambientales, en este caso térmico,acelerando así la obtención de plantas resis-tentes.

Dentro de las aplicaciones del cultivo deembriones está la del rescate de embriones

para la producción de plantas haploides,donde se cultivan embriones que se formanpor partenogénesis o por eliminación decromosomas luego de la hibridacióninterespecífica o intergenérica. Los embrioneshaploides en algunos casos se distinguenmorfológicamente de los normales, de ma-nera que se extraen y se los cultiva in vitroen medios y condiciones de cultivo adecua-dos (ver IV.-1). Otras veces es necesario es-perar a obtener las plantas para determinarel nivel de ploidía. Esta técnica se ha utiliza-do con éxito en cebada, trigo y tabaco.

El cultivo de embriones se utiliza tam-bién en el caso de plantas que sufren el abor-to de los mismos en estadios tempranos deldesarrollo debido a la incompatibilidad conel endosperma, como en la producción artifi-cial del triticale. Precisamente fue en este casodonde la técnica de cultivo de embriones jun-to con la aplicación de colchicina fueron defundamental importancia en la transforma-ción del triticale en cultivo comercial, parasuperar el alto grado de incompatibilidad delcruzamiento inicial y la marcada esterilidadque poseía la F1. El perfeccionamiento deestas dos metodologías fue decisiva para laproducción de un gran número de triticaleshexaploides y octoploides, cruzando el cen-teno con trigos duros y harineros, respecti-vamente, con un alto grado de fertilidad.

También se emplea el cultivo de embrio-nes en casos en que el endosperma no sedesarrolla normalmente, como sucede en loscruzamientos de cultivares diploides ytetraploides de Citrus, o cuando el mismo sedesintegra después de la fecundación, comoen Oenothera biennis x O. muricata o O.biennis x O. lamarckiana. Esta técnica tam-bién es de utilidad para sortear barreras dedormición o en casos donde la viabilidad dela semilla es baja, como en yuca y otras espe-cies del género Manihot.

El cultivo in vitro de embriones es unaalternativa para el intercambio de semilla através de fronteras internacionales. En unproyecto de mapeo de genes con resistenciaal virus del mosaico en yuca, desarrolladoentre CIAT (Centro Internacional de Agricul-tura Tropical, con sede en Colombia) y IITA(Instituto Internacional de Agricultura Tropi-cal, con sede en Nigeria) donde fue necesa-rio trasladar «stocks» de semillas desde


Sudamérica al continente africano, el cultivode embriones resultó ser un excelente méto-do para transferir germoplasma con mínimosriesgos fitosanitarios.

El cultivo de embriones inmaduros tam-bién puede ser aplicado como complemen-to del mejoramiento convencional, entre lasestrategias utilizadas para disminuir el tiem-po necesario en la obtención de un nuevocultivar. Por ejemplo en soja se requierenunos diez años para este fin. Si se consiguenrealizar varias generaciones por año, encontraestación, se acelera el proceso. El culti-vo de embriones inmaduros ahorraría ade-más el tiempo de maduración de la semilla.

Cultivo de nucelas. Existen pocosexplantos que poseen la capacidad de pro-ducir callos embriogénicos. Las inflorescenciasy los embriones inmaduros se utilizan paraeste fin en los pastos y en los cereales, cons-tituyendo excelentes herramientas para latransformación de plantas. En las plantas le-ñosas los explantos de tejidos maduros pier-den la capacidad de regeneración, se ha in-ducido entonces con éxito la embriogénesissomática a partir de nucelas de óvulos jó-venes. Este es el caso de Citrus sp, Vitisvinifera, Malus domesticus, Psidiumguajava y Pyrus serotina. En estas especiestambién permiten acortar el período desiembra a floración.

Otro sistema que puede utilizarse en al-gunos experimentos básicos es la obtenciónde un embrión a partir de cigotostransgénicos o micromanipulados. Para elloson importantes la fertilización in vitro degametas aisladas y el cultivo de los produc-tos de fusión hasta la obtención de una plan-ta. Bajo esas condiciones el embrión no sediferencia de los embriones obtenidos invivo. En maíz también es posible cultivar loscigotos fertilizados in vivo dentro de sacosembrionarios parcialmente aislados.

5.1 El cultivo de óvulos y embriones y laembriogénesis somática para dilucidaraspectos básicos del desarrollo enplantas

Las plantas parecen poseer un programaembriogénico específico preestablecido quepuede dispararse en respuesta a condicionesespecíficas. La embriogénesis cigótica se dis-para por la fertilización mientras que la

somática lo hace a través del cultivo de teji-dos.

El estudio de los eventos moleculares quetienen lugar durante la embriogénesis tem-prana es actualmente uno de los camposprincipales de la biología vegetal. Los embrio-nes somáticos constituyen una excelenteherramienta para estudiar los procesos dedesarrollo en plantas, ya que facilitan el ac-ceso a gran cantidad de embriones libres. Ensu medio natural los embriones cigóticos ofre-cen dificultades debido a su pequeño tama-ño y al hecho de estar inmersos en el tejidomaterno.

Los embriones vegetales son morfoló-gicamente simples pero molecularmentecomplejos. A diferencia de lo que ocurre enlos embriones animales, donde los patronesde expresión génica se hacen más complejosa medida que progresa el desarrollo, en losembriones vegetales se encontraron unos20.000 ARN, número similar al encontradoen órganos más complejos como hojas, raí-ces, flores, anteras, etc., donde los ARN queson específicos de un estadio determinadoconstituyen una modesta fracción del total,representando, sin embargo, a un gran nú-mero de genes. En algodón, por ejemplo, el10% de los ARN presentes en embriones enla fase media de maduración son únicos deaquel estadio.

Muchos de estos genes específicos deestadio han sido clonados como ADNc, peroen general se trata de genes expresadosmayoritariamente, como aquellos de lasproteínas de reserva de la semilla. Estos ADNcresultaron ser marcadores útiles de la dife-renciación celular, como el gen inhibidor dela tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumulaen el polo micropilar del embrión globular(por donde penetra el núcleo espermático alsaco embrionario) antes de que sea eviden-te la diferenciación celular. La expresión deeste gen es uno de los primeros indicadoresmoleculares de polaridad en la transición delembrión globular a uno de simetría bilateralcon forma de corazón.

Para estudiar el desarrollo en plantas, aligual que en el caso de animales, se ha recu-rrido al uso de mutantes. El organismo mo-delo en este caso es Arabidopsis thaliana,que es una planta de genoma pequeño y ci-


clo de vida muy corto, lo cual la hace aptapara estudios genéticos. Se han detectadodos tipos de mutantes, letales embrionariosy con alteraciones en el patrón de desarro-llo.

Calculando el número de mutantes leta-les embrionarios que se encontraron, algu-nos investigadores han concluido que exis-ten unos 4.000 genes expresándose duran-te la embriogénesis. En el punto superior deesta compleja vía se encuentran genes regu-ladores principales («master regulators») ysólo de 40 a 50 genes que afectan el patrónembriogénico.

Entre las mutaciones estudiadas se en-cuentran bio1, que es letal y detiene laembriogénesis en el estadio de corazón tem-prano. No es un gen regulador principal y susefectos se ven revertidos en presencia debiotina. Otra mutación es raspberry. Estosmutantes quedan bloqueados en el estadoglobular y poseen protuberancias en las célu-las externas lo que le da el aspecto de unafrutilla. El bloqueo se presenta en un estadioanterior a la formación de órganos, momen-to en el que ya existe diferenciación celular.

En maíz también se han encontradomutantes letales embrionarios. En algunos seencuentran inhibidos el desarrollo del em-brión y el endosperma. En otros, sólo el em-brión.

Una importante conclusión a la que per-mitieron arribar estos mutantes es que elembrión de Arabidopsis está constituido porel ensamblaje de dos patrones superpuestos,uno a lo largo del eje apical-basal y el otro alo largo del eje radial.

Ninguno de los mutantes encontradosfueron mutantes tempranos, lo cual sugeri-ría un control de los primeros estadios deldesarrollo embrionario por parte de genesmaternos, como sucede en animales. Sinembargo, se han identificado pocos genesmaternos que afecten el desarrollo en plan-tas y el hecho de que se puedan formar losembriones somáticos o que se puedan desa-rrollar embriones producto de la fertilizaciónin vitro induciría a sospechar que los genesmaternos no juegan un rol primordial. Un genmaterno encontrado en Arabidopsis es sin1(short integument 1). Este gen afecta la for-mación de óvulos, el tiempo de floración y eldesarrollo embrionario. No se sabe si real-

mente se requiere para la embriogénesis o silos defectos observados se deben a las limi-taciones impuestas por los defectos en eltejido materno. Los embriones provenientesde madres sin1/sin 1 tienen grandes defec-tos morfogenéticos. Embriones con esegenotipo en madres normales tienen un de-sarrollo normal (Fig. 3).

Un gen embrionario muy importante esGN/EMB30. No se sabe si es un reguladorprincipal y actúa muy temprano en el desa-rrollo, durante la primera división celular delcigoto. En los mutantes las dos células resul-tantes no son diferentes, como ocurre enembriones normales, donde la primera divi-sión celular es asimétrica.

El sistema mejor estudiado en relacióncon la embriogénesis somática es el de sus-pensiones celulares de zanahoria (Daucuscarota). En este sistema, la remoción del áci-do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) genera unrespuesta embriogénica por la cual los agre-gados celulares forman embriones que cre-cen de a millares en un medio líquido. La dis-ponibilidad de gran cantidad de embrionescreciendo sincrónicamente en un medio líqui-do representa un buen sistema para estudiarlos eventos genéticos involucrados en el de-sarrollo embrionario. Los primeros estudiostendientes a identificar patrones de expre-sión génica relacionados con la embriogénesissomática fueron realizados en 1981. Utilizan-do electroforesis bidimensional se encontra-

GlobularPreglobular

Corazón Torpedo

Embrión maduro

Figura 3: Estadíos de la embriogénesis de Arabidopsisthaliana.


ron pocas diferencias entre patronesproteicos de embriones somáticos y célulasen proliferación, aunque, en virtud de lo ex-presado anteriormente, se esperaría un pa-trón más complejo.

Habría varias explicaciones para esta in-consistencia. Una es que los productos degenes individuales involucrados en el desa-rrollo embrionario no fueran muy abundan-tes como para ser detectados en lasgenotecas de ADNc. Otra es que la sincro-nización fuera sólo aparente, particularmen-te en estadios tardíos y que estas diferenciasenmascararan las diferencias entre estadios.Otra es que las constelaciones génicasinvolucradas en la embriogénesis somáticapodrían estar ya activadas en las células pro-liferando en cultivo. Algunos estudios indica-rían que muchos de los genes expresados enlos embriones somáticos ya estarían hacién-dolo en las masas proembriogénicas. Uno deestos genes es el SERK que se expresa encélulas competentes. Se conoce la secuenciade su ADNc y codificaría para una proteínareceptora con repeticiones ricas en leucina deltipo proteína quinasa. La expresión de estegen está correlacionada con la aparición decélulas competentes en cultivos primarios de-rivados de explantos de hipocótilos. La ex-presión continúa en las masas pro-embriogénicas y persiste hasta el estadio deembrión globular.

Se encontró una línea celular (ts11) sensi-ble a la temperatura (letal condicional) queen la temperatura restrictiva detiene su de-sarrollo en el estadio de corazón. Este efec-to es revertido al colocar las células en unmedio condicionado proveniente de suspen-siones celulares normales. El compuesto res-ponsable de la reversión resultó ser unaendoquitinasa acídica. Aparentemente, estaenzima puede hidrolizar un sustrato que seencuentra en las paredes celulares vegetalesy liberar un compuesto indispensable paradisparar la embriogénesis somática. Talsustrato no pudo ser identificado pero seencontró un lipoligosacárido de Rhizobium,NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar aestas líneas celulares mutantes a fin de queprosigan los procesos de embriogénesissomática. Hasta el momento no se ha en-contrado cuál es la sustancia en células vege-tales que produce este efecto.

El programa de eventos que tiene lugar

durante la embriogénesis somática es muyelaborado como para estar regulado sola-mente por el 2,4-D. La perturbación causadapor la deprivación de este regulador del cre-cimiento debe disparar una serie de eventosclave que involucran la acción de factores decrecimiento más específicos y fuerzasbiofísicas que confieren informaciónposicional y de desarrollo.


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PARTE IVMétodos para acelerar programas

de mejoramientoe identificación varietal

136 POLCI, Pablo; CONTI, Verónica; MIRANDA, Rubén


IV.-Capítulo 1

Obtención de plantas doblehaploides

Polci, Pablo; Conti, Verónica; Miranda, Rubén

1 Introducción

• Comentarios generales sobre loshaploides

Para referirnos al término haploide esnecesario conocer previamente el origen dedicha denominación, y definir algunos con-ceptos básicos sobre el tema.

Si consideramos haploide al individuo queposee un solo juego de cromosomas de laespecie, no estaríamos incluyendo en estaclasificación a aquellos individuos derivadosde especies poliploides, cuya constitucióngenética es igual a la de los gametos norma-les de dicha especie. Por ejemplo, unautopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar aindividuos «haploides» AA (n = 2x), que portener dos juegos cromosómicos (AA) no po-drían ser incluidos en la definición. Por lo tan-to, una solución sería denominar comohaploides a los individuos originados a par-tir de especies diploides, que posean un solojuego de cromosomas (n = x), llamandopolihaploides a aquellos individuos con unacomposición cromosómica igual que lagamética normal de la especie, que tengandos o más juegos cromosómicos (n > x). Otraposibilidad sería considerar el términohaploide en un sentido más amplio, com-prendiendo en éste a todos los individuosque posean una constitución cromosómicaigual a la de los gametos normales de la es-pecie (n = 2n/2). Llamaríamos de esta mane-ra monoploides y polihaploides a los indivi-duos provenientes de plantas diploides (2n=2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente.De aquí en adelante, a los fines prácticos yen concordancia con la segunda definición,nos referiremos al término haploide indistin-tamente del nivel de ploidía de la especie encuestión, como a aquellos individuos queposeen la mitad del número cromosómiconormal contenido en las células somáticas dela especie.

• Identificación de HaploidesVarios procedimientos facilitan la búsque-

da de haploides en muestras grandes ennúmero de individuos. Algunos de ellos son:

- Morfología: Las plantas haploides son,en general, más pequeñas que las diploides,tanto en sus partes vegetativas como flora-les. Esto se debe principalmente a la dismi-nución en el tamaño de sus células. Es lógicopensar que el fenotipo más pequeño de lasplantas puede ser una primera aproximaciónen la búsqueda de haploides. Si esta dismi-nución de tamaño fuera notable en las semi-llas, sería muy fácil realizar una selección me-cánica, aunque sucede en pocas especies.

- Poliembrionía: La presencia depoliembrionía facilita la detección de embrio-nes haploides; no obstante ello, debe reali-zarse el control citológico correspondiente.El porcentaje de embriones gemelos obser-vados varía con la especie y el genotipo.

- Genes marcadores: Con este fin puedeutilizarse cualquier par de alelos cuyosfenotipos dominante y recesivo sean fácil-mente distinguibles. En la práctica, convieneutilizar marcadores que posean manifestacio-nes fenotípicas claras en semilla o en plántulay de esta manera hacer una selección máseconómica en tiempo y esfuerzo. Para iden-tificar haploides en una variedad que se su-pone homocigota, se realizan cruzamientoscon otra variedad que sea homocigota parael alelo alternativo. La mayor parte de la des-cendencia será heterocigota (diploide), confenotipo dominante. Los individuos que apa-rezcan con el fenotipo recesivo seríanhaploides, obtenidos por partenogénesis oandrogénesis, según sea el fenotipo recesivomaterno o paterno, respectivamente.

• AntecedentesEl valor de los haploides es conocido des-

de 1922, cuando se descubrió la producciónespontánea de los mismos. Actualmente sonmás de cien las especies vegetales capacesde producirlos in vivo. Sin embargo, la fre-cuencia con la cual se producen es muy baja,con valores que van de 0,001 a 0,01 %.

Entre los casos de haploidía espontáneaes común la poliembrionía, que, con unagran variación entre los distintos genotipos,ocurre en una amplia gama de especies, gé-neros y familias. En estos casos es frecuente


la aparición de haploides procedentes de unasinérgida del saco embrionario, puesto quese ha comprobado en muchas especies quelas células antípodas degeneran antes de lafecundación.

En 1966, Guha y Maheshwari descubrie-ron que las anteras de Datura innoxia Mill.generaban plantas haploides al ser cultiva-das in vitro. Este proceso, confirmado pos-teriormente por Nitsch y Nitsch (1969) entabaco, se ha utilizado para producirhaploides en numerosas especies. En el casode Datura innoxia, las frecuencias de induc-ción son casi del 100% y el rendimiento es demás de mil plántulas o callos por antera encondiciones óptimas (Fig. 1).

En estudios de androgénesis in vitro seha detectado especial facilidad para regene-rar haploides a partir de anteras aisladas ode granos de polen en miembros de la fami-lia de las solanáceas También se han encon-trado resultados sorprendentes en numero-sos géneros de las crucíferas, gramíneas y delas ranunculáceas, aunque resulta comúnobservar diferencias significativas, incluso den-tro de un mismo género. No se ha logrado,sin embargo, el mismo éxito en especiesarbóreas y arbustivas.

2 Importancia de los haploides yaplicaciones en el mejoramiento vegetal

Los métodos tradicionales para el mejo-ramiento vegetal han sido practicados porcientos de años. Actualmente se ha llegadoa una etapa en donde estos métodos soninsuficientes para hacer frente a las deman-

das mundiales de producción. A pesar de quecada año se liberan al mercado numerosasvariedades, no persisten demasiado. Losobjetivos de mejoramiento a largo plazo nopodrán ser alcanzados a menos que se ge-nere mucha variabilidad genética que puedaser utilizada con estos fines y que existanmétodos que acorten el tiempo necesariopara la obtención de variedades.

El advenimiento de las técnicas biotec-nológicas y los avances en biología molecularhan permitido el desarrollo de nuevas herra-mientas de gran utilidad en el mejoramien-to vegetal. Entre éstas, la producción dehaploides y doblehaploides es una herramien-ta interesante ya que permite acortar el tiem-

po requerido para la obtención denuevas variedades, siendo un buencomplemento para los programasde mejoramiento tradicionales. Enalgunos casos, las poblacioneshaploides o doblehaploides (DH)carecen de genotipos heterocigo-tas y sirven para encontrargenotipos raros, especialmente enel caso de caracteres recesivos, yaque éstos no quedan enmascara-dos por los alelos dominantes. Es-tas poblaciones presentan mayorvariación genética aditiva y ausen-cia de varianza genética debida ala dominancia, si se las compara

con poblaciones segregantes. Es decir que seeliminan las complejidades del estadoheterocigota y se facilita enormemente elanálisis genético. De esta manera puedendistinguirse las mutaciones recesivas de for-ma inmediata, haciendo que el proceso deselección sobre una población de haploidesresulte más eficiente (Fig. 2).

La producción de haploides es una alter-nativa biotecnológica de gran importancia yha resultado exitosa en varios cultivos, entreellos cebada, arroz y trigo.

Un sistema de producción de DH debecumplir con tres requisitos básicos para suutilización en programas de mejoramiento:

- Debe producir líneas DH eficientementea partir de todos los genotipos.

- Los DH obtenidos deben ser normalesy estables.

Estos deberían representar una muestraal azar del conjunto de gametos parentales.

Figura 1: Obtención de plantas haploides por cultivo de anteras.


Entre las aplicaciones más importantes delos doblehaploides en el mejoramiento ve-getal podemos citar:

••••• ·Acortamiento de los programas demejoramiento

El desarrollo de nuevos cultivares por losmétodos tradicionales actuales comprendetres etapas fundamentales:

(a) Generación de variabilidad genética,sea por medio de hibridaciones sexuales intrae interespecífica, por inducción de mutacio-nes, o por transformación genética.

(b) Recuperación de progenies homoci-gotas a través de generaciones repetidas deautofecundación o retrocruzamiento, selec-cionando a favor de los caracteres de inte-rés.

(c) Evaluación del comportamiento de losnuevos materiales en ensayos comparativosa campo.

Estos pasos son básicos en un programade mejoramiento, pudiendo existir otras eta-pas en función del modo reproductivo de laespecie. Así, por ejemplo, el tiempo requeri-do para la obtención de un nuevo cultivar de

ABAbaBab

1/4

1/4

1/4

1/4

ABAABBAABbAaBbAaBb

1/4 AbAABbAAbbAaBbAabb

1/4 aBAaBBAabBaaBBaaBb

1/4 abAaBbAabbaaBbaabb

1/4

* La probabilidad de ocurrencia de los recuadrosinternos es de 1/16 (1/4 x 1/4)

Autofecundación

Genotipos posibles después de un Ciclode autofecundación de la F1:

Cultivo de anteras

Genotipos posibles después delcultivo de anteras:Plantas haploides AB Ab aB ab

Duplicación con colchicinaPlantas doblehaploidesAABB AAbb aaBB aabb1/4 1/4 1/4 1/4

AaBb

híbrido intervarietal

AB Ab aB ab

Generación parental

Gametos

Generación F

Gametos F

1

1

AAbb X aaBB

Ab aB

Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando loscultivares parentales difieren, teóricamente, en dos pares de genes. Si elgenotipo buscado es, por ejemplo, el doble recesivo aabb, se tiene, porautofecundación convencional, una probabilidad de 1/16 de encontrarlo.Si se induce haploidía, el mismo genotipo tendrá una probabilidad deocurrencia de ¼ porque no se producirán los genotipos heterocigotas.

De

Progenitor A x Progenitor B

F 1

@

@

Líneas puras

(homocigosis práctica: F7-8)

6-7 ciclos

Autofecundación

Selección

Figura 3: Representación esquemática de los pasosrequeridos para la obtención de líneas puras en unprograma de mejoramiento tradicional.

trigo de ciclo invernal es de aproxi-madamente diez años, a travésdel mejoramiento tradicional (Fig.3).

La biotecnología se presentacomo una alternativa atractiva nosólo para reducir el tiempo deobtención de los genotipos de-seados, sino también para lograruna economía de mano de obray espacio en el campo experi-mental.

En las plantas autógamas,con los métodos convencionalesde mejoramiento, la homocigosispráctica se logra recién luego deseis a ocho generaciones deautofecun-dación, mientras quecon una técnica de producción dehaploides, seguida de duplicacióncromosómica, es posible llegar ahomocigosis completa en una ge-neración.

En las plantas alógamas, laproducción de homocigotas resul-ta de gran importancia. Al traba-jar con especies de polinización

cruzada se favorece naturalmente la hetero-cigosidad, y, de ser posible la autofecun-dación, la obtención de homocigotas se vedificultada por la endogamia.

En plantas bulbosas, árboles frutales yforestales la homocigosis juega un rol muyimportante en el aceleramiento de los pro-gramas de mejoramiento. Debido al prolon-gado tiempo requerido para alcanzar la fase


adulta, el proceso de mejoramiento resultaextremadamente largo, aun siendo posiblela autopolinización.

• Generación de poblaciones de mapeoDiversos tipos de poblaciones pueden ser

utilizadas para el mapeo genético de plan-tas. La elección del tipo de población se rea-liza en función de los objetivos de la investi-gación y del tiempo y recursos disponibles.Las poblaciones de mapeo con el mayor con-tenido de información son aquellas obteni-das a partir del cruzamiento entre dosindivíduos homocigotos contrastantes. En lasplantas F

1 obtenidas, el desequilibrio de

ligamiento es máximo, y las poblaciones de-rivadas a partir de estas plantas F

1 procuran

explorar este desequilibrio. Para especies deautofecundación o que toleran la autofecun-dación pueden utilizarse poblaciones F

2, F

n,

RILs (Recombinant Imbreed Lines), derivadasde retrocruzas y doblehaploides.

Las poblaciones de doblehaploides repre-sentan la variabilidad genética entre los pro-genitores luego de ocurrida una meiosis (F

1),

y son especialmente indicadas cuando se rea-lizan estudios con QTL («quantitative traitloci»), ya que al obtenerse genotipos 100 %homocigotas se dispone de poblaciones es-tables o «inmortales» de mapeo. Esto per-mite analizar la misma población en diferen-tes años y localidades, debido a la constantedisponibilidad de semilla, obteniéndose esti-maciones mas precisas de los parámetros delos caracteres cuantitativos a ser mapeados.

• Estudio de especies poliploidesLa inducción de haploides en plantas

poliploides facilita el trabajo de investigacióny mejoramiento, ya que permite manejar ni-veles de ploidía menores para los estudiosde herencia y la combinación de caracteresde interés.

• Fusión de protoplastosAl fusionar dos protoplastos haploides se

origina uno diploide que puede duplicarse yllevar a la obtención de un híbridointerespecífico o intergenérico, siendo estouna ventaja importante cuando se trabajaen hibridación somática.

• Variación gametoclonal

La androgénesis in vitro provee un exce-lente sistema para analizar, a nivelesporofítico, la variación debida arecombinación y segregación meiótica. Lasvariantes gametoclonales expresan el carác-ter recesivo en la R

0, a diferencia de las

somaclonales, que requieren deautofecundación y análisis de progenie. Al-gunos logros de esta técnica:

- Frutos de tomate con mayor conteni-do de sólidos

- Plantas enanas de arroz con granosmás largos y con elevados niveles de proteí-nas de reserva y más macolladoras.

- Plantas de Datura innoxia con conte-nidos más elevados de alcaloides en las ho-jas.

- Plantas de tabaco con mayor resisten-cia a bajas temperaturas.

- Plantas de Brassica napus con mayorcontenido de aceite del ácido erúcico en lashojas. Este aceite se usa como lubricante enla industria.

• MutagenesisSi se aplica mutagénesis a un sistema de

haploides, se obtienen mutantes sólidos,lográndose la homocigosis del mutado rápi-damente luego de la duplicación concolchicina. Entre los agentes mutagénicosmás frecuentemente utilizados se encuentrala N-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos γ(0,5 krad) y el etil metil sulfonato.

• Transformación genéticaRige el mismo principio que para

mutagénesis. La transformación de haploidespermite la obtención del transgen enhomocigosis luego de la duplicación concolchicina. Puede realizarse con PEG,microinyección o utilizando Agrobacteriumtumefaciens.

• Producción de plantas homogamé-ticas

Asparagus officinalis es una especie cul-tivada, dioca, en la cual las plantas femeni-nas son XX y las masculinas son XY. De estamanera, para obtener una población deplantas deben cruzarse ambos tipos, lo quedará una progenie constituida por 50 % deplantas XX y 50 % de plantas XY. Sin embar-go, desde el punto de vista del productor, esdeseable la obtención de una población cons-


tituida solamente por plantas XY, que tie-nen un menor contenido de fibra y son, porlo tanto, preferidas por los consumidores.

Por este tratamiento se han obtenidohaploides de Triticum monococcum.

2) Polinización retrasada: la castración delas flores y la posterior polinizaciónen el límite de la madurez receptivadel estigma permiten obtener hastaun 30 % de haploides en trigo.

3) Polinización con polen inviable:a) Utilizando polen extraño (típi-

co de cruzamientos interespecíficos),incapaz de fecundar a la especie encuestión, puede servir de estímulopara inducir haploidía, como sucedeen el cruzamiento entre Solanumtuberosum x S. phureja (papa silves-tre). El polen de la papa silvestre con-tiene sólo un núcleo generativo, pro-ducto de una gametogénesis anor-mal, por lo cual la fertilización dobleno logra producirse, pero se formanembriones haploides por partenogé-nesis.

b) Utilizando polen previamenteirradiado.

4) Cultivo de ovarios: puede ser eficazpara obtener haploides a partir de cruza-mientos interespecíficos.

II. Androgénesis: desarrollo de un game-to masculino.

1) Cultivo de anteras: se ha inducidohaploidía en mono y dicotiledóneas, siendomás fácil en las últimas. Es una técnica simpleque, dependiendo del genotipo y de las con-diciones de cultivo permite obtener elevadosnúmeros de plantas en tiempos relativamen-te cortos. Ha sido más difícil en los cereales;no obstante ello, se obtuvieron haploides dearroz, trigo, cebada con diferentes grados dedificultad.

2) Cultivo de micrósporas: en 1974 Nitschindujo la regeneración de plantas haploidesde Nicotiana terbium y Datura inoxia a par-tir de cultivos en suspensión de micrósporas,previo choque térmico a baja temperaturade las flores. Este método tiene la ventajade producir haploides masivamente (más de7000 plantas por botón floral en tabaco), yde permitir la aplicación de diferentes trata-mientos a las micrósporas como transforma-ción o mutagénesis para luego obtener plan-tas por embriogénesis partiendo de una úni-ca célula inicial. Para conseguir diferenciar

Progenitor masculinoXY

Plantas haploides

Homocigotos,hembra y supermacho

Gametos

Formación de gametos

Cultivo de anteras

Duplicacióncromosómica

Formación degametos

X Y

X Y

XX YY

X Y

XYHíbrido

Para solucionar este problema y obtener 100% de plantas masculinas se ideó un sistemaque consiste en el cultivo de anteras ydiploidización de plantas YY, llamadassupermachos. La ventaja de estas plantas esque, al ser cruzadas con plantas XX darán100 % de plantas XY, como se muestra en elesquema:

Con este sistema, en 1990 fue liberadauna variedad llamada Andrea (es un híbridoobtenido como se mencionara anteriormen-te). Andrea es una variedad muy homogé-nea, de alto rendimiento y de excelente cali-dad.

3 Obtención de Haploides

Como se mencionara anteriormente, lasplantas haploides aparecen en muy baja fre-cuencia en la naturaleza, siendo necesaria laposterior ocurrencia de duplicacióncromosómica para la obtención de semillas.Por ello, la producción artificial de haploidesresulta siempre más efectiva.

• Origen de los haploides

I. Ginogénesis: desarrollo de un gametofemenino no fecundado. Se logra por:

1) Castración y aislamiento de las flores.


plantas a partir de micrósporas es necesarioquebrar el mecanismo responsable de la asi-metría en la primera mitosis del polen.

III. A partir de alguna célula haploide delsaco embrionario distinta del gameto feme-nino (sinérgidas o antípodas).

IV. Cruzamientos interespecíficos ointergenéricos con eliminación cromosó-mica: se produce la fertilización de manerade que se forme un cigoto diploide, que, a lolargo de las sucesivas divisiones mitóticas, vaperdiendo el genoma del individuo que apor-tó el gameto masculino, como sucede en loscruzamientos entre Hordeum vulgare y H.bulbosum.

V. Interacción núcleo-citoplasma: utili-zando líneas de sustitución y restauración nu-clear se encontró que los individuos concitoplasma de Aegilops caudata y núcleo deTriticum aestivum o Triticale mostraban unafrecuencia de haploidía del 3,1% y del 52,9%respectivamente. Esto se debe a que ciertasinteracciones entre un citoplasma y un nú-cleo extraño inducen haploidía.

VI. Semigamia: el núcleo del gameto mas-culino penetra en la ovocélula pero sin fusio-narse con el núcleo femenino. Ambos núcleoscomienzan a dividirse independientemente,produciendo un individuo haploide con teji-dos de origen materno y paterno.

• Métodos más utilizados para la ob-tención de plantas haploides:

Entre los métodos disponibles actualmen-te para la obtención de doblehaploides, losmás utilizados son la hibridación interespe-cífica e intergenérica y la androgénesis.

- Cultivo de Anteras: Consiste en el cul-tivo de anteras inmaduras en un medio deinducción, donde las micrósporas competen-tes originarán callos, que serán luego trans-feridos a un medio apropiado para la rege-neración de plantas (Fig. 1).

En algunas especies de dicotiledóneas elnúmero de plantas obtenidas por cada cienanteras cultivadas es muy elevado. En cam-bio en las gramíneas la técnica no ha sidotan exitosa. Sin embargo, los progresos en

los métodos de cultivo in vitro durante lasúltimas décadas han permitido obtener bue-nos resultados con gramíneas (Fig. 4), aun enaquellas consideradas recalcitrantes.

La capacidad de respuesta al cultivo deanteras, denominada capacidad androgé-nica, puede ser evaluada a través de la pro-ducción de callos y de plantas verdes, y sueficiencia es altamente dependiente de:

a) El genotipo: es quizás el factor másimportante que afecta al cultivo de anteras.En la naturaleza, la haploidía es controladapor el gen hap, llamado gen inhibidor de lahaploidía. Existe suficiente evidencia que su-giere que la androgénesis in vitro tambiénestá bajo control génico y que este carácterpuede ser transferido desde clones con altarespuesta a otros no respondedores. Se hahallado variabilidad en la respuesta entreespecies y aun dentro de ellas. En cebada ytrigo los caracteres de inducción de callos yregeneración de plantas son altamente he-redables, y ha sido sugerido que ambos ca-racteres estarían controlados por muchosgenes. Por lo tanto, el mejoramiento de lacapacidad androgénica no parece difícil, sien-

Figura 4. Producción de callos y plantas a partir del cultivode anteras de Triticum aestivum. A. Callo blanco ycompacto sobre una antera(flecha). B. Detalle del calloseñalado en (A). C. Callo transferido a medio de cultivopara regenerar planta. D. Plántula de trigo regenerada apartir de callo, con sistema radicular en formación. E.Planta haploide completa finalizando la etapa derusticación, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita).


do la identificación de genotipos con grancapacidad de respuesta un paso indispensa-ble para su incorporación en los bloques decruzamiento.

b) El % de albinismo: La ocurrencia deplantas albinas representa un serio proble-ma para la aplicación del cultivo de anterasen programas de mejoramiento de cereales.La incidencia depende no solo de la especiesino también de la variedad, citándose valo-res de 50, 70 y 100 % para tres variedadesdiferentes de arroz (Wang y col., 1978).Bernard (1980) ha sugerido que las altas tem-peraturas incrementan la diferencia entre lavelocidad de replicación del material nucleary el de las organelas, resultando en un desa-rrollo retardado o incompleto de losplástidos, lo cual conduciría a la producciónde fenotipos albinos. De acuerdo con esteautor, el desarrollo de un sistemafotosintético funcional es promovido por eltratamiento con bajas temperaturas, aunqueno siempre un pretratamiento con frío redu-ce incidencia de albinismo.

c) Las condiciones de crecimiento de lasplantas donantes: la edad y las condicionesambientales en que crecen las plantas afec-tan considerablemente la capacidadandrogénica de las mismas. Los factores am-bientales más críticos son el fotoperíodo, laintensidad de luz, la temperatura, la nutri-ción y la concentración de CO

2. Estos facto-

res incidirían en la capacidad de producir lasdivisiones celulares morfogénicas que condu-cen al desarrollo de embrioides y la regene-ración de plantas. Este último paso es críticodentro de todo el proceso, es altamentedependiente de la calidad del callo y estáasociado fuertemente a toda la historia pre-via del cultivo. En general, se ha informadoque la utilización de anteras de las primerasfloraciones favorece la respuesta androgénica,mientras que las colectadas al final de la es-tación muestran una menor respuesta al cul-tivo, generando una menor cantidad deembrioides. En Brassica napus, el crecimien-to de las plantas a bajas temperaturas me-jora la producción de embrioides obtenidosa partir de anteras.

d) El estado de desarrollo de lasmicrosporas: en la fase gametofítica de lasplantas, que comienza luego de la meiosis,las micrósporas sufren inicialmente una divi-sión mitótica asimétrica que da origen a dos

células de distintos tamaños: la generativa,más pequeña y con un núcleo altamente con-densado; y la vegetativa, más grande y conun núcleo difuso. En las gramíneas, el núcleogenerativo se divide nuevamente originan-do dos núcleos espermáticos. Uno generaráel endosperma triploide al fusionarse con losdos núcleos polares del saco embrionario,mientras que el segundo fertilizará a laoosfera produciendo el cigoto diploide, queconstituirá el primer paso de la nueva faseesporofítica. Los embrioides haploides se ori-ginan in vitro a partir de una de las vías quese enuncian a continuación. Cuando la pri-mer división mitótica de la micróspora esasimétrica, los haploides se originan por re-petidas divisiones de la célula vegetativa, dela generativa o de ambas. Cuando la primerdivisión mitótica es simétrica, ambas célulasresultantes contribuyen al desarrollo delhaploide. Por lo tanto, una célula gaméticamasculina puede revertir su desarrollogametofítico hacia el grano de polen y darorigen directamente a un nuevo individuo.En general, las micrósporas que se encuen-tran en la primera división mitótica son lasque mejor responden. Esto varía levementecon la especie vegetal, pero esta reversiónno es posible luego de iniciada la deposiciónde almidón. El estadío más apropiado paralos cereales es el de micróspora uninucleadamedia y tardía.

e) Los pretratamientos: distintos tipos deestrés aplicados durante el estadío adecua-do pueden enmascarar el programagametofítico e inducir la expresión de genesespecíficos del desarrollo esporofítico. Si bienlas bajas temperaturas son consideradascomo el mejor pretratamiento, tambiénotros pueden estimular la androgénesis,como el calor, el choque osmótico, lacentrifugación de las anteras o hasta una in-cisión en la parte superior de la inflorescenciadonante. También se citan la poda, la pulve-rización con etrel, la irradiación, la reducciónen la presión atmosférica, la anaerobiosis, eltratamiento en una atmósfera saturada deagua y la aplicación de gametocidas. Las ba-jas temperaturas aplicadas sobre la plantamadre, sobre las yemas florales jóvenes osobre las anteras, generalmente estimulan laembriogénesis. El frío estimula la divisiónmitótica simétrica de las micrósporas. Esto se


debería a una alteración en la orientación delhuso que conduciría a una primera mitosisanormal del grano de polen. Por otra parte,se ha mencionado que las bajas temperatu-ras retardan el envejecimiento de la paredde la antera, lo cual aumentaría la supervi-vencia y la viabilidad del polen. En general,las temperaturas citadas varían entre 2 y 10ºC y la duración del tratamiento de 2 a 30días. Es importante determinar la tempera-tura adecuada para cada especie vegetal, aunpara variedades dentro de la misma especie.En algunas especies, tales como Capsicumannun, avena y algunos genotipos de trigose ha logrado éxito con un choque con altatemperatura. Temperaturas de 30 - 35ºC du-rante los primeros 1 a 4 días del cultivo ayu-daron a inducir la androgénesis en varias es-pecies de género Brassica.

f) La composición del medio de cultivo:es otro de los factores importantes para eléxito en el cultivo de anteras. No existe unarecomendación general y las variaciones de-penden de la especie a cultivar.

• Medios de inducción: dos tipos deestrés, osmótico y nutricional, han sido iden-tificados como causas disparadoras de la in-ducción de embriogénesis en las micrósporasde mono y dicotiledóneas. En tabaco, el cul-tivo de las anteras en un medio carente desacarosa durante los primeros 6 días de laetapa de inducción permitió una máxima res-puesta androgénica. Los carbohidratos cum-plen dos roles fundamentales en los mediosde inducción ya que actúan como osmolito ycomo nutriente. Los agentes gelificantes re-presentan otro aspecto importante en laevolución de los medios de inducción. Tradi-cionalmente se utilizó agar como gelificantede los medios de cultivo, debido a su dispo-nibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se de-tectó una mejor respuesta androgénica entabaco cuando las anteras fueron cultivadasen un medio solidificado con agar y suplemen-tado con carbón activado. En medios líqui-dos la adición de Ficoll (polímero sintético desacarosa, inerte, no iónico y de alto pesomolecular) incrementa la tensión superficialy la viscosidad del medio. De esta manera,las anteras y callos flotan sobre el medio lí-quido y se desarrollan en condiciones

aeróbicas, permitiendo elevadas tasas deembriogénesis y de producción de plantasverdes. En cuanto a los reguladores de cre-cimiento, la mayoría de los cereales requierede la presencia de auxinas y de citocininas enel medio de cultivo y las respuestas parecendepender de los niveles endógenos de talesreguladores. Por ejemplo, para lograr la in-ducción en trigo es indispensable el uso de2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) en con-centraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otrassustancias que, adicionadas al medio de cul-tivo, ayudan en la estimulación de laandrogénesis, como la glutamina y el inositol.También se citan otros compuestosinespecíficos como extracto de papa, debatata, de mandioca, de trigo germinado yde endospermas de arroz y de maíz. En oca-siones, si el medio se suple con leche de coco,los granos de polen desarrollan directamen-te en embrioides.

• Medios de regeneración: la variedadde medios de regeneración citada es menorcuando se la compara con la de los mediosde inducción. Los más utilizados son modifi-caciones derivadas del medio MS, con con-centraciones de carbohidratos similares a lasutilizadas en los medios de cultivo de tejidostradicionales (30gr/l de sacarosa), utilizandoagar (0,6 %) como gelificante, auxinas menospoderosas, y un balance hormonal a favorde las citocininas.

g)Las condiciones de incubación: las ca-racterísticas ideales de cultivo son específicaspara cada especie, y aun para cada genotipodentro de una misma especie. Estas afectanparticularmente la tasa de absorción final denutrientes y la regeneración de plantas ver-des. La duración e intensidad lumínica, la tem-peratura y la orientación de las anteras so-bre el medio de cultivo pueden tener un efec-to considerable en algunas especies.

Cultivo de Micrósporas: comprende laobtención de individuos haploides a partir demicrósporas aisladas. Las espigas sonpretratadas y las micrósporas liberadas soncolocadas en un medio de cultivo donde de-sarrollarán embriones haploides, que seránluego transferidos a un medio de regenera-ción para originar plántulas (Fig. 5).


Este sistema es considerado el de mayorpotencial para la producción de dobleha-ploides, debido a que induce a los miles demicrósporas que contiene una flor a dividirsey producir embriones. La ausencia de la pa-red de la antera podría mejorar la nutrición yeliminar las restricciones físicas para laandrogénesis.

El cultivo de micrósporas tiene la ventajade originar embriones de similar tamaño yetapa fisiológica debido a que pueden sepa-rarse las micrósporas de tamaños semejan-tes por centrifugación diferencial. La opti-mización de los diferentes pasos críticos parael éxito de esta técnica puede llevar a la ob-tención de una alta cantidad de plantas ver-des con menores costos y esfuerzos.

Entre los factores determinantes de laeficiencia del método podemos citar:

(a) Genotipo: se han citado cultivares decebada con una alta respuesta al cultivo demicrósporas, en contraste con otros menosrespondedores.

(b) Albinismo: al igual que en el cultivode anteras el número de plantas albinas de-pende del genotipo, y también se ve influi-do por la densidad de cultivo de lasmicrósporas.

(c) Condiciones de crecimiento de laplanta donadora: el mantenimiento de las

plantas en condiciones con-troladas de fotoperíodo ytemperatura es esencial ydebe ser ajustado en funciónde la especie. Se han citadoresultados en cebada cuan-do las plantas son cultivadasen ambientes libres depatógenos, con alta hume-dad relativa (60-80%),fotoperíodo de 16 hs. de luz,y adecuado régimen de fer-tilización y riego. Cuando lasplantas crecen estresadas,sea por riego excesivo, se-quía, enfermedades, o la apli-cación de algún plaguicida, larespuesta al cultivo demicrósporas es menor.

(d) Estadío: Como se ci-tara anteriormente para el cultivo de anteras,es imprescindible el chequeo del estadio co-rrecto para que conserven su capacidadandrogé-nica.

(e) Pretratamientos: los pretratamientosmás utilizados consisten en el uso de frío,estrés osmótico, presencia o ausencia de de-terminados nutrientes, etc. Se ha demostra-do que los nutrientes disponibles durante elpretratamiento constituyen un factor decisi-vo que determina la calidad de los embrio-nes originados.

(f) Densidad de cultivo: La densidad delas micrósporas en cultivo afecta el desarro-llo de las mismas y el número que entraránen división. Existe una concentración mínimapara el desarrollo de las micrósporas, y unadensidad óptima para una mayor regenera-ción. Las condiciones más favorables debenser ajustadas en cada caso y para cadagenotipo en particular.

(g) Medio de inducción: Se han estudia-do diferentes concentraciones de azúcares,distintas fuentes de nitrógeno orgánico, y laadición de diferentes auxinas al medio. Engeneral se sugiere la sustitución de sacarosapor maltosa como fuente de carbohidratos,la disminución de la concentración de nitra-

Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras yde micrósporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas apartir de anteras hasta la obtención de las plantas haploides pueden describirsecomo sigue: a) yema floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras encultivo, 1d) y 1e) proliferación de las anteras, 1f) callo haploide, 1g)diferenciación de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de micrósporasaisladas: a) yema floral previo a la antesis, 3b) micrósporas aisladas de unaantera, 3c) cultivo de micrósporas, 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embriónen desarrollo.


to de amonio, el agregado deglutamina, y el empleo de APA (áci-do fenil acético) como auxina para fa-vorecer la inducción (Kasha y col.,2001).

(h) Medio de regeneración: lacomposición del medio de regenera-ción puede afectar el vigor y supervi-vencia de las plántulas.

Kasha et al. (2001), trabajandocon cebada, encontraron en estemétodo una manera eficiente de pro-ducción de DH, con una mejor res-puesta y una menor dependencia delgenotipo que en el caso del cultivode anteras. A esto se le suma la ven-taja de contar con una elevada canti-dad de micrósporas haploides en unestado fisiológico uniforme, que cons-tituyen excelentes blancos para lamutagénesis, la selección y la trans-formación.

- Hibridación interespecífica eintergenérica: en este caso loshaploides se originan a través de laeliminación del genoma delpolinizador. El sistema de hibridaciónde trigo x Hordeum bulbosum, ini-cialmente descubierto y empleadocon éxito en cebada, ha sido consi-derado superior al cultivo de anteraspor tres razones:

(a) La producción de haploides esmás fácil.

(b) El tiempo requerido para la re-generación de plantas es menor.

(c) La eficiencia en la regeneraciónde plantas parece ser mayor.

La gran limitante de este sistema lo cons-tituye el hecho de que la mayoría de loscultivares de trigo no pueden cruzarse conH. bulbosum debido a la presencia de losgenes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al des-conocimiento del estado de estos genes enlos genotipos de trigo y de H. bulbosuminvolucrados en los cruzamientos, debido aque los genotipos se seleccionan sobre labase de criterios agronómicos y no a un sis-tema de compatibilidad de cruzamientos conH. bulbosum. Para sortear estos inconvenien-tes se ha sugerido como alternativa realizar

los cruzamientos, en el caso de trigo, utilizan-do maíz como polinizador (Fig. 6). Luego dela fertilización del óvulo de trigo por el polende maíz, durante las primeras mitosis delcigoto, los cromosomas del maíz son elimi-nados. Esto se debe a una incompatibilidadentre los cinetocoros de estos cromosomasy las fibras de los husos acromáticos que haceque en las primeras anafases los cromosomasde maíz vayan quedando rezagados en elcitoplasma, donde finalmente son degrada-dos. El resultado de este proceso es un em-

Figura 6. Producción de haploides de Triticum aestivum porcruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz). A. Espigas de trigocortadas en el campo y castradas en el laboratorio. B. Plantas demaíz (donantes de polen) crecidas en invernáculo. C. Desgrane deespigas para realizar la desinfección de los granos y posterior rescatede embriones. D. Grano con dos embriones haploides(poliembrionía). E. Embriones inmaduros rescatados y creciendoin vitro. F. Planta rusticada. G y H. Plantas con 3-5 macollos con susraíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicacióncromosómica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetascon tierra en cámara de crecimiento.


brión haploide de trigo. Seguidamente, losembriones inmaduros deben ser rescatadosen un medio de cultivo apropiado.

A través de las cruzas con maíz se hanobtenido haploides de trigo de cultivares tan-to compatibles como incompatibles con H.bulbosum, lo cual sugiere que el sistema deincompatibilidad no afecta al método de tri-go x maíz, por lo que sería menos dependien-te del genotipo.

4 Duplicación cromosómica

Después de la duplicación cromosómica,ya sea espontánea o inducida, se logra lahomocigosis y se restaura la fertilidad. La plan-ta haploide, sin duplicar, es estéril por lo queno podría producir semillas.

Entre las técnicas que han sido utilizadaspara la duplicación de haploides cabe men-cionar:

(a) Duplicación espontánea durante laetapa de callo o de rescate de embriones.

(b) Regeneración de plantas dobleha-ploides a partir de callos de médula de plan-tas haploides de tabaco (Kasperbauer yCollins, 1972).

(c) Sustancias químicas: aunque se cono-cen casos mediante agentes químicos talescomo acenafteno, hidrato de cloral, sulfanila-mida, etc., la mayor eficacia se ha logrado conla colchicina y el óxido nitroso.

La aplicación del óxido nitroso bajo pre-sión (2-6 atmósferas) resulta de especial in-terés por su fácil penetración en los tejidos yla rápida desaparición de los mismos cuandocesa la presión. Puede utilizarse en flores re-cién polinizadas. La ventaja que presentaeste tratamiento es que, al poder ser aplica-do durante la primera división mitótica delóvulo fecundado, se ve reducida la apariciónde quimeras. Por otro lado, los residuos deeste agente resultan menos tóxicos para laplanta que otros que se aplican en forma lí-quida, aunque la frecuencia de aneuploidespuede ser muy elevada.

· La acción de la colchicina fue descubier-ta en 1937 y desde entonces ha pasado aser prácticamente el agente diploidizantemás importante Esta droga actúa impidien-do el autoensamblaje de la tubulina,inhibiendo así la formación de losmicrotúbulos del huso y, en consecuencia, la

segregación anafásica de las cromátides. Afec-ta por lo tanto sólo a las células que se en-cuentran en división. Puede aplicarse aplántulas, plantas adultas, semillas,micrósporas y anteras.

El tratamiento puede realizarse utilizan-do una solución acuosa donde se sumergenlas raíces, dejando fuera la parte aérea. Tam-bién se puede hacer llegar la solución al inte-rior de la planta utilizando una jeringa con ladosis deseada (microinyección), o por absor-ción de la solución a través de los tallitos de-capitados, sobre los que se vierte.

Otra forma de hacerlo es tratar los calloscon colchicina antes de trasladarlos al mediode regeneración. Este último método permi-te la obtención de gran número dedoblehaploides, pero presenta la desventa-ja de que la mayoría de las plantas así obte-nidas son mosaicos cromosómicos.

Otra alternativa, para micrósporas yanteras, es la adición del agente duplicadordirectamente en el medio de inducción, an-tes de la primer mitosis. La diploidización eneste momento requiere menos tiempo y es-fuerzo y ha sido utilizada en programas demejoramiento de trigo, maíz, Tritordeum yarroz. El problema de la suplementación delmedio de inducción con colchicina es que re-duce la embriogénesis en trigo, si bien enOryza sativa y Brassica la puede incremen-tar. La duración del tratamiento y la concen-tración de la solución varían para cada espe-cie.

Cualquiera que sea el método con que seduplique la planta, un macollo o sólo unayema floral, lo importante es lograr que lassemillas que éstas produzcan sean viables.

5 Consideraciones finales

La elección de los progenitores y la selec-ción son etapas decisivas en un programa demejoramiento que avanzará luego genera-ción tras generación, hacia una homocigosisque permita entrar en las etapas de evalua-ción. Ganar tiempo en estos casos puede sig-nificar una reducción de costos muy impor-tante y una más temprana entrada en elmercado de la nueva variedad. En el caso deuna especie autógama como el trigo es posi-ble ganar generaciones haciendo dos cose-chas en un año, especialmente en aquelloscultivares de corto ciclo vegetativo. Esto, sin


embargo, dificulta la observación de algunascaracterísticas agronómicas importantes, queno pueden ser observadas en los genotiposen esas condiciones, atentando contra unaselección eficiente. Para los trigos de tipo in-vernal y facultativos, con ligeros requerimien-tos de vernalización, esta ganancia de genera-ciones no es posible o es difícil.

La producción de individuos dobleha-ploides que puedan participar anticipada-mente en la etapa de evaluación agronómicase plantea como una solución promisoria aeste problema, reduciendo los tiempos y pre-supuestos.

Muchos interrogantes, sin embargo, que-dan aún sin resolver, limitando la aplicaciónextensiva de esta tecnología a algunos mo-dernos programas de mejoramiento vegetal.

Algunas preguntas a las que debemosencontrar respuestas son:

¿En que generación segregante se aplicael método de doblehaploides?

¿Cuál es el número de individuos doble-haploides derivados de un cruzamiento, re-presentativo de la variabilidad gamética crea-da en la cruza, que permita un aprovecha-miento integral, comparable al logrado conel método convencional de selección a cam-po?

¿Cómo superar la escasa cantidad de se-milla producida?

¿Es una técnica alternativa, o complemen-taria del mejoramiento tradicional?

¿La eficiencia en la producción dedoblehaploides justifica su alto costo dentrode un plan de mejoramiento?

De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998), lasgeneraciones segregantes adecuadas paraproducir doblehaploides son la F2 y F3. Si eli-giéramos individuos F3, que ya cuentan conun año de selección a campo durante la F2 -generación que ha mostrado la mayorvarianza genética entre los dos padres- esta-ríamos evitando producir un gran número deplantas doblehaploides que no seránagronómicamente promisorias. No obstan-te, debemos considerar que serían necesa-rios varios cientos de individuos DH para queel proceso tenga posibilidades de éxito agro-nómico.

En general, la producción de dobleha-ploides resulta en un gasto excesivo en com-

paración a los métodos tradicionales de me-joramiento, por lo cual en la mayoría de losprogramas sólo genotipos élite son someti-dos a este sistema. Si bien el costo de pro-ducción de los DH depende directamente delmétodo elegido y la eficiencia lograda, la apli-cación de esta metodología al mejoramien-to vegetal se vislumbra más bien como unaherramienta complementaria al mejoramien-to tradicional, y que en ningún modo inten-taría reemplazarlo.


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IV.-Capítulo 2

Aplicaciones de los marcadoresmoleculares

Carrera, Alicia; Tranquilli, Gabriela;Helguera, Marcelo

Las herramientas descriptas en II.-4 seutilizan en numerosas áreas relacionadas conel mejoramiento vegetal y el análisis de labiodiversidad. A continuación se describenalgunas de esas aplicaciones. Cada uno deestos campos posee una base teórica en oca-siones compleja y muchos de ellos requierendel uso de programas de estadística avanza-da. De este modo, el presente capítulo debeser considerado como una introducción a lostemas considerados.

1 Identificación de genotipos – Purezavarietal

El control de la pureza varietal y la discri-minación de variedades protegidas (es decir,registradas) requieren de una adecuada iden-tificación de los materiales. Esta identificaciónse basa tradicionalmente en el uso dedescriptores morfológicos y fisiológicos. En lamayoría de los cultivos, la utilización de re-cursos genéticos similares en diferentes pro-gramas de mejoramiento ha reducido la efi-ciencia de discriminación por marcadoresfenotípicos. Por otro lado, varios de los ca-racteres usados como descriptores presentanlimitaciones en cuanto al número restringidode variantes, influencia ambiental y depen-dencia del estadio de desarrollo de planta.Como alternativa para resolver estos proble-mas, los polimorfismos moleculares de pro-teínas y ADN resultan de utilidad en la de-terminación de los criterios DUS (distinción,uniformidad y estabilidad). Se utilizan local-mente como datos complementarios de losdescriptores morfológicos y fisiológicos parael registro de los cultivares, en aquellos casosen que las diferencias entre materiales no sonconspicuas. ISTA (International Seed TestingAssociation) y UPOV (Union Pour LaProtection Des Obtenions Vegétales) son

entidades internacionales que han desarro-llado protocolos para estandarizar los análi-sis de laboratorio para identificación decultivares y reglamentar la utilización de dife-rencias moleculares en el control de la pure-za varietal, la discriminación de variedadesprotegidas y en el otorgamiento de nuevaspatentes. Con el objeto de evitar el registrode variedades esencialmente equivalentes,UPOV ha establecido umbrales mínimos dediferencias moleculares sobre la base de dis-tancias genéticas obtenidas a partir de ca-racteres tradicionales. En la actualidad se dis-pone de patrones moleculares varietales parauna extensa lista de especies. Como ejem-plo podemos mencionar al trigo pan(Triticum aestivum L.), para el que se desa-rrolló una matriz de identificación varietalsobre la base de marcadores microsatélitesde ADN, que permite la individualización devariedades argentinas. (Manifesto y col.,1998). A partir de datos moleculares es posi-ble obtener distintos índices de distanciagenética y generar esquemas ramificados odendrogramas, que ponen en evidencia lasimilitud genética de los materiales (Ver VI.-1).

La pureza varietal es uno de los principa-les requisitos de la semilla comercial. En laproducción de semilla híbrida la heterogenei-dad intralote puede originarse por falta deuniformidad en las líneas parentales, polini-zación cruzada espontánea o mezcla de se-millas durante la cosecha o embolsado. Losindividuos fuera de tipo pueden identificar-se mediante el patrón molecular. Del mismomodo pueden establecerse las relaciones dedescendencia entre una serie de líneasparentales y sus híbridos.

Se ha observado que aún después de 5-6generaciones de autofecundación, una líneapuede no haber alcanzado completa unifor-midad para ciertos marcadores moleculares.Esto puede interpretarse como una porciónresidual del genoma que permanece segre-gando. Cuando la evaluación de estos lotesmuestra uniformidad morfológica, fisiológicay de caracteres agronómicos, pueden acep-tarse ciertos niveles de variación molecular sinexpresión fenotípica evidente. El mejoradorconsiderará en cada caso los niveles máximosde variación admisibles. Sin embargo, la ocu-rrencia de polimorfismos moleculares

150 CARRERA, Alicia; TRANQUILLI, Gabriela; HELGUERA, Marcelo

intravarietales puede representar unalimitante para el uso de marcadores comodescriptores complementarios en la inscrip-ción de nuevos cultivares.

2 Uso en bancos de germoplasma

Las prácticas de la agricultura modernahan generado una pérdida de diversidad enla mayoría de las especies cultivadas. El re-emplazo paulatino de las variedades primiti-vas por los cultivares híbridos de indudablesventajas económicas ha producido una re-ducción en el número de genotipos que secultivan. La erosión genética puede tener gra-ves consecuencias para el cultivo, principal-mente en relación a su vulnerabilidad sanita-ria. Este proceso puede ser atenuado me-diante la creación de bancos degermoplasma, que constituyen un compo-nente vital de los programas de mejora. Lascolecciones pueden mantenerse como ban-cos de semilla, a campo o in vitro.

Los recursos genéticos de una especie cul-tivada comprenden i) cultivares antiguos y dereciente obtención ii) poblaciones localesmantenidas por los productores, «landraces»iii) poblaciones silvestres de la misma especieo formas maleza y iv) especies relacionadas.Los marcadores moleculares permiten carac-terizar las accesiones o muestras a ser inclui-das en las colecciones, estudiar el proceso dedomesticación, establecer relacionesfilogenéticas y colaborar en la elección de lasestrategias de conservación. El procedimien-to consiste básicamente en analizar los ma-teriales mediante marcadores proteicos o deADN y calcular medidas de diversidad (nivelde polimorfismo, riqueza alélica, presencia dealelos únicos) y de similitud genética. Esta in-formación luego se complementa con datosgeográficos (procedencia de las accesiones,distribución), pedigrí y datos históricos deobtención.

La información generada por los marca-dores resulta de inmediata aplicación en losprocesos de acopio (dónde colectar, qué in-tercambios realizar), conservación (identifica-ción de duplicados en las colecciones,monitoreo de los cambios en la composicióngenética que puedan ocurrir durante la mul-tiplicación o conservación de los materiales),caracterización (diversidad genética de la co-

lección) y distribución eficiente de los recur-sos genéticos hacia los usuarios.

Veamos algunos ejemplos. En casos comoel girasol (Helianthus annuus), el análisis dediversidad molecular ha demostrado que elproceso de domesticación ha reducido con-siderablemente la base genética de los ma-teriales cultivados con relación a las pobla-ciones silvestres. Por el contrario, en poroto(Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea),las formas cultivadas conservan gran partede la variabilidad presente en las poblacio-nes de los centros de origen en América yEuropa, respectivamente. La comparaciónentre los materiales silvestres y cultivados deuna especie permite además identificar loslugares de origen del cultivo, conocidos comocentros de domesticación. Una vez que losrecursos genéticos disponibles han sido ca-racterizados, es posible decidir cuáles seríanlos cruzamientos que más contribuirían a laexpansión de la base genética.

Frecuentemente, limitaciones en cuantoa espacio físico y presupuesto, hacen que loscentros nacionales e internacionales de re-cursos genéticos deban restringir el númerode entradas a conservar en el banco degermoplasma. La información reunida a par-tir de datos moleculares y morfológicos pue-de contribuir a establecer una colección nú-cleo o representativa de la variabilidad to-tal. Esta colección central debería incluir loscaracteres que están presentes en numero-sas accesiones o comunes, pero también losdenominados componentes raros y aque-llos presentes en pocas accesiones de mane-ra bastante frecuente.

La mayor parte de los polimorfismosmoleculares carecen de expresión fenotípicay son selectivamente neutros, siendo la deri-va génica el proceso más importante para elcambio de frecuencia en las poblaciones. Unagran parte de ellos se encuentran en regio-nes no codificantes del genoma. En contras-te, los genes que codifican los rasgosmorfológicos poseen un fuerte efectofenotípico y han estado sometidos a inten-sas presiones de selección en las distintasetapas del mejoramiento; podrían, por lotanto, constituir una muestra de genesatípica con respecto a la mayoría de genesde una especie. Estos caracteres representangrupos de genes sometidos a diferentes fuer-


zas de selección a lo largo del proceso dedomesticación. Los marcadores molecularescombinados con datos morfológicos,agronómicos y de origen, conforman unabase de datos integral que permite describirla variación genética en colecciones degermoplasma.

3 Mapeo genético

Un mapa genético de una especie ani-mal o vegetal muestra la distribución linearde un grupo de genes y marcadores en cadauno de los cromosomas que constituyen elgenoma de un organismo. Este mapa estabasado en el concepto clásico de ligamiento:si dos o más genes o marcadores están físi-camente cercanos sobre el mismo cromo-soma, sus alelos se heredan usualmente jun-tos a través de la meiosis. Las proporcionesen que estos genes segregan en una pobla-ción se apartan de las esperadas bajo la leyde Mendel de segregación independiente. Lamayor parte de los gametos contendrán lasmismas combinaciones alélicas que los pa-dres; sólo aquellos meiocitos que experimen-ten un intercambio entre cromátides no her-manas o crossover generarán gametos concombinaciones alélicas diferentes de lasparentales (recombinantes). El fundamen-to del mapeo genético reside en la relacióndirecta entre la frecuencia derecombinación y la distancia física entre losloci. Es así como determinando la frecuenciade recombinación entre dos genes, uno pue-de estimar la distancia de mapa entre los mis-mos, siendo la unidad de mapeo equivalen-te a una frecuencia de recombinación del 1%.Usualmente esta distancia se expresa encentimorgan (cM). La relación entre frecuen-cia de recombinación y distancia física esdistorsionada por factores tales como la dis-tribución no al azar de los entrecruzamientos,las diferencias entre organismos, la presen-cia de «hot spots» o sitios de alta frecuenciade recombinación y la evidencia de controlgenético de la recombinación. No obstante,el uso de la intensidad de ligamiento comoestimador de la distancia genética genera unmodelo de la disposición linear de genes ymarcadores de gran utilidad en múltiplesáreas del estudio genómico.

Recordemos que el grado de recombinacióngenética (r), también conocido como fracciónde recombinación, es la proporción degametos recombinantes, n

r sobre el total de

gametos.r = nr / n

Para tres loci, ABC, ligados en ese orden,las fracciones de recombinación entre los tresse relacionan a través de la siguiente expre-sión:

rAC

= rAB

+ rBC

– 2C rAB

rBC

donde 2rAB rBC representa la frecuencia

esperada de entrecruzamientos dobles y C,

el coeficiente de coincidencia, una medidade la independencia con la que ocurrenquiasmas (entrecruzamientos) en regionescercanas.

La fracción de recombinación no es aditivaa lo largo del cromosoma y la desviación res-pecto de la aditividad aumenta con la dis-tancia entre los loci. De este modo se handesarrollado «funciones» de mapa talescomo Haldane o Kosambi que tornan aditivala fracción de recombinación.

Función de Haldane : m = - 0.5ln (1-2r),donde m representa unidades de mapagenético.

Si un marcador resulta estar genética-mente ligado a un gen que controla un ca-rácter de interés agronómico, la selección deeste marcador resulta en la selección indirec-ta del gen de interés. Este hecho constituyeel fundamento del proceso denominado se-lección asistida por marcadores molecu-lares, aplicado en el mejoramiento genéticovegetal y animal (ver sección correspondien-te en este capítulo). La eficiencia del procesode selección indirecta basado en lacosegregación del marcador y del gen, es unafunción de distancia, expresada como la pro-babilidad de recombinación genética entreel marcador y el gen; por lo tanto, cuantomás próximos estén el marcador y el gen encuestión, más eficiente será la selección.

Este análisis puede aplicarse tanto en ca-racteres cualitativos como cuantitativos. Ladiferencia entre un carácter cuantitativo y unocualitativo se basa en la magnificación del


efecto de sustitución de un alelo por otro enun determinado locus (Falconer, 1988). Si elefecto de la sustitución alélica sobre la va-riación fenotípica total del carácter es peque-ño, se considera el carácter como cuantitati-vo o QTL (quantitative trait loci). Si el efectode la sustitución de un alelo por otro es gran-de en relación con la variación fenotípica to-tal, el carácter es cualitativo (genes de he-rencia simple). En general, la mayoría de loscaracteres de importancia económica y/oagronómica, principalmente aquellos relacio-nados con la productividad, poseen heren-cia cuantitativa o fenotipos complejos.

Para incorporar un carácter de interésagronómico en un mapa genético es necesa-rio cumplir con una serie de premisas:

1- Desarrollar una población segregantepara el carácter agronómico en cuestión.

2- Caracterizar la población segreganteutilizando marcadores moleculares polimór-ficos (con diferencias en la secuencia de ADNentre los parentales). Para construir un mapamínimo es deseable disponer de al menoscuatro marcadores moleculares por cadacromosoma del genoma en estudio. Cuantomayor sea el número de marcadores incor-porados al mapa, mayor será su resolución yla probabilidad de identificar algún marcadorligado al carácter agronómico de interés.

3- Evaluar fenotípicamente el carácteragronómico, sobre los individuos de la po-blación segregante. Este punto es crucial, yaque si la evaluación del carácter en la pobla-ción de mapeo no es clara, es imposible in-corporarlo al mapa genético.

4- Identificar marcadores ligados al ca-rácter agronómico (cosegregación entrefenotipo del carácter y fenotipo del marca-dor). Para esta instancia, al igual que para laconstrucción del mapa genético, se puedenutilizar herramientas informáticas específicastales como los programas Mapmaker,MapmakerQTL, Genemap, etcétera.

Cuanto mayor sea la distancia genéticaentre los parentales que darán origen a lapoblación de mapeo, mayor será la proba-bilidad de detectar marcadores polimór-ficos, que es un punto crítico para identificarmarcadores ligados al carácter en estudio.

En el contexto del mejoramiento vegetallos mapas genéticos posibilitan:

La cobertura y análisis de genomascompletos

La descomposición de caracteresgenéticos complejos (QTL) en componen-tes mendelianos

La localización de regionesgenómicas que controlan caracteres deimportancia agronómica

La cuantificación del efecto de estasregiones en la característica estudiada

La canalización de esta informaciónen programas de mejoramiento

La construcción de un mapa genético ge-nera información básica sobre la estructura yorganización de un genoma tal comoreordenamientos cromosómicos (inversiones,translocaciones, duplicaciones) e identifica-ción de regiones con alta densidad de genes.Por otro lado un mapa genético constituyeel punto de partida para proyectos declonado posicional de genes (ver sección 6de este capítulo).

4 Selección asistida por marcadores

El advenimiento de nuevas técnicasmoleculares ha facilitado el análisis genéticode caracteres de interés agronómico y la se-lección asistida por marcadores moleculares.Un argumento frecuentemente utilizado encontra de la selección asistida por marcado-res es que el mejoramiento de caracteres deherencia simple no necesita de marcadorespara selección si los fenotipos son fácilmen-te identificables. Si bien esto es correcto, enestos casos, la utilización de marcadores enun programa de mejoramiento puede apor-tar una ventaja muy importante basada ensu naturaleza molecular y es que la selecciónse independiza del fenotipo y el ambiente.Estas características permiten identificar rá-pidamente genotipos únicos en poblacionessegregantes e incorporar varios genes de in-terés en un fondo genético, proceso tambiéndenominado «piramidización» o «apila-miento» de genes.

Los ejemplos más claros para ilustrar lautilidad de la selección asistida por marcado-res moleculares en la piramidización de genesse observan en los casos en que interacciones


génicas como la epistasis (efectos de ciertosgenes sobre la función de otros) «enmasca-ran» la presencia de un gen, dificultando suseguimiento mediante el fenotipo. Esta situa-ción se presenta con los genes de resistenciaa enfermedades, cuando se desea sumar enun genotipo resistente a una determinadaenfermedad otros genes de resistencia almismo patógeno, como estrategia de resis-tencia durable.

Otro impacto de la selección asistida pormarcadores moleculares es el menor tama-ño de las progenies mantenidas en un pro-grama. Con la selección asistida, el númerode generaciones necesarias para la estabili-zación de los genotipos es menor, ya que laheredabilidad de los caracteres es próxima a100%, aumentando la ganancia genética.También es posible incrementar la velocidadde un programa de mejoramiento, ya que alindependizarse la selección del ambiente yde la expresión del fenotipo, se logra ade-lantar el número de generaciones por año.

En la Figura 1 se representa un programa deretrocruzas asistida por marcadoresmoleculares como ejemplo de la utilizaciónde esta herramienta en el mejoramiento ve-getal.

La utilidad potencial que los marcadoresmoleculares presentan en el proceso de me-joramiento genético resulta clara. Sin embar-go, a pesar de ello, el uso actual de estas he-rramientas en algunos casos es limitado. Di-versos son los factores que determinan estasituación. Por un lado podríamos considerarlos de orden técnico y por otro los de índoleeconómico. Dentro de los primeros, ademásde lo mencionado en párrafos anteriores res-pecto de la necesidad de contar con el mapagenético, con alta resolución y de una pobla-ción segregante, debemos tener en cuentael paso siguiente que es la validación de losmarcadores que se identifiquen comopromisorios para el seguimiento de caracte-res de interés, es decir, la confirmación dedeterminados marcadores como herramien-

Figura 1. Esquema de un programa de retrocruzas, asistido por un marcador específico para el gen de resistenciaa roya de la hoja del trigo Lr47. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. PI Gaucho: variedadsusceptible recurrente. BC: generación de retrocruza.


ta efectiva de seguimiento o selección de ungen particular. La validación es un aspectofundamental previo a la implementación deestas herramientas en programas de mejo-ramiento, y su importancia reside en que lamayoría de los marcadores disponibles has-ta el momento derivan de regiones delgenoma que, como ya fuera indicado, sonneutras y en que la asociación con caracteresde interés está determinada por ligamientogenético en la población evaluada. Dado queese ligamiento puede no mantenerse en otrogermoplasma, es necesario confirmar en losmateriales de mejoramiento que el carácterdeseado está determinado por gen/es pre-sentes en el locus marcado. Desde este pun-to de vista, el mejor marcador es aquel quereconoce sitios polimórficos que estandodentro del gen son los determinantes de lavariación fenotípica observada. Estos marca-dores, también llamados diagnóstico o fun-cionales, pueden ser usados en formaconfiable en poblaciones en los que no sehayan mapeado previamente, sin correr elriesgo de que la información de interés sepierda por recombinación. (Andersen yLübberstedt, 2003). Como ejemplo podemosmencionar al marcador desarrollado para elgen denominado Pinb-D1. Este gen codificapara una de las proteínas relacionada contextura de grano en trigo y se ha observadoque la mutación de una base específica den-tro de su secuencia implica el cambio de unaminoácido (de glicina a serina) en la proteí-na codificada y que esto es suficiente paradeterminar un mayor grado de dureza degrano. Para este gen, se ha desarrollado unmarcador cuyo polimorfismo esta dado pordicha mutación, y esto asegura que su usosea válido para identificar la presencia de estacaracterística, sea en poblaciones de mejora-miento como en la caracterización degermoplasma.

Sin dudas, la disponibilidad de marcado-res diagnóstico aumentará progresivamentea partir de nuevos conocimientos que surjande los proyectos genómicos emprendidos endiversos cultivos de interés económico.

Dentro de los factores de índole econó-mico, la limitante en la adopción de esta tec-nología ha sido la relación entre el costo dela misma y el valor comercial de la semillamejorada. En los programas de mejoramien-

to de aquellas especies donde el material decultivo es híbrido, en general se observa ma-yor uso de selección asistida por marcadoresmoleculares. Es esperable que esta tenden-cia se modifique con el tiempo, ya que el per-manente avance tecnológico ha permitidosimplificar las metodologías a aplicar, porejemplo, sustituyendo marcadores basadosen hibridación (RFLP, por ejemplo) por mar-cadores basados en amplificación (RAPD,AFLP), reduciendo costos y también aumen-tando la eficiencia en el proceso de selección.

5 Mapeo comparativo

La comparación de mapas de ligamientoentre diferentes especies se denominamapeo comparativo. Si un grupo de marca-dores moleculares mantiene el orden y susrelaciones de ligamiento entre dos especiesse dice que son colineares o que muestransintenia.

Los mapas comparativos en vegetalescomenzaron a realizarse a partir del desarro-llo de los marcadores RFLP y de la posibilidadde obtener hibridación entre las secuenciasde ADN utilizadas como sondas congenomas distintos a los utilizados para laobtención de las mismas. Es decir, a partir delos RFLP fue posible identificar sitios comu-nes en distintas especies que servían comopuntos de referencia para la comparación desus genomas. Es así que los mapas compara-tivos dieron las primeras evidencias de que elligamiento de grupos de genes podría haber-se conservado a través de largos períodosevolutivos. Estudios en diversos grupostaxonómicos han revelado una estrecha re-lación entre los genomas de las especies com-prendidas dentro de cada grupo. Esto se haobservado, por ejemplo, entre especies per-tenecientes a las Solanáceas (tomate, papa,pimiento), entre Arabidopsis y cultivos delgénero Brassica, y dentro de las gramíneasentre especies pertenecientes a la tribuTriticeas (trigo, cebada, centeno) así comoentre especies pertenecientes a distintassubfamilias taxonómicas, tal el caso de arroz,maíz y sorgo. Es importante señalar que lostamaños de los genomas de las especies com-paradas, en general, son significativamentediferentes. Sin embargo, a pesar de esa granvariación en el tamaño del genoma, el orden


linear de los genes se encuentra altamenteconservado.

La utilidad de los mapas comparativospuede apreciarse desde distintos puntos devista. Por un lado, aportan información muyvaliosa para conocer los cambios producidosen la estructura cromosómica (inversiones,translocaciones, duplicaciones, deleciones)durante el proceso evolutivo que lleva a ladiferenciación de especies a partir de un an-tecesor común, así como también permitenevaluar niveles de ploidía. Por ejemplo, a par-tir de la comparación de mapas moleculares,ciertas especies consideradas inicialmentediploides han modificado su estatus. Sobrela base de estudios citogenéticos, el maízposee un comportamiento meiótico que co-rresponde al de una especie diploide típica.Sin embargo, numerosos loci RFLP de arrozestán representados dos veces en el genomade maíz por lo que actualmente se consideraque el maíz desciende de un poliploide an-cestral.

Por otro lado, los mapas comparativosposibilitan la transferencia de informaciónentre especies con genomas simples y biencaracterizados, tales como Arabidopsis yarroz, a especies con genomas más comple-jos tales como trigo, cebada y avena. Esteha sido tal vez el objetivo principal para im-pulsar el desarrollo de estos mapas. Las no-tables similitudes observadas entre genomasfue la base sobre la que se postuló el uso deespecies modelos, como arroz o Arabidopsis,a partir de las cuales estudiar y avanzar en elconocimiento de genomas más complejos.Asimismo, partiendo del supuesto de que losgenes que gobiernan aspectos fundamenta-les de la biología vegetal muy probablemen-te están conservados entre distintas espe-cies, y el hecho de que la variación en el ta-maño de los genomas de especies relaciona-das se debe fundamentalmente a variaciónen la cantidad de ADN no codificante y no auna variación en el número de genes, la ideade llegar a la identificación, clonado y estu-dio de genes en las especies modelo se viofortalecida. De este modo la informacióngenerada podría hacerse extensiva a unaamplia gama de especies, incluyendo las cul-tivadas, facilitando así el estudio en estosorganismos.

6 Clonado posicional

El clonado posicional de un gen es unclaro ejemplo de la utilización de informacióngenética (disposición espacial de genes),molecular (secuencia nucleotídica de genes)y del funcionamiento (expresión de losgenes) de un genoma (conjunto de genes)para identificar al gen responsable de un ca-rácter particular.

El primer paso para lograr esto es selec-cionar parentales que sean contrastantespara el gen en cuestión; por ejemplo, unavariedad de trigo susceptible y otra resisten-te a la roya de la hoja, para desarrollar unapoblación de mapeo segregante para el gende resistencia (Stein y col., 2000). Una vezseleccionados los parentales se desarrolla unapoblación segregante para el carácter, la mássencilla es una F2.

Posteriormente, se caracteriza esta pobla-ción utilizando marcadores moleculares(microsatélites, RFLP, AFLP, RAPD) que cubrantodo el genoma del organismo en estudio(en este caso trigo).

El siguiente paso es determinar elfenotipo de los individuos que constituyenla población de mapeo (en este caso plantasresistentes o susceptibles a roya de la hoja).Una vez obtenida la información fenotípicay molecular de la población de mapeo, conla ayuda de programas específicos de com-putación (por ejemplo, Mapmaker QTL), seidentificarán marcadores ligados gené-ticamente al carácter en una región espe-cífica del genoma.

Una vez identificada la región cromosó-mica portadora del gen responsable del ca-rácter, se satura dicha región con nuevosmarcadores moleculares. El objetivo es deli-mitar el intervalo del genoma al fragmentomínimo posible que contenga al gen de inte-rés. Muchos de estos marcadores puedenobtenerse del mapeo comparativo, identifi-cando las regiones cromosómicas colinearesde las especies más estudiadas, por ejemploen plantas, arroz, Arabidopsis, maíz, sorgo,tabaco, etcétera.

Una vez reducido al mínimo el intervalode genoma portador del gen de interés, elpaso siguiente es obtener la secuencianucleotídica del mismo. Una forma de hacer-lo es mediante una caminata cromosómica.


La caminata se inicia seleccionando clones deuna genoteca de trigo («BAC library», VerCapítulo II.-3) con los marcadores queflanquean al intervalo portador del gen. Losdos grupos de BAC (uno para cada marca-dor) son digeridos con enzimas de restricciónpara identificar en cada grupo fragmentoscompartidos y no compartidos. Se estimaque, en cada grupo los BAC seleccionadosdeben tener en común al menos un fragmen-to de digestión (el fragmento que posee lasecuencia del marcador). Los fragmentos nocompartidos corresponden a los extremos deestos BAC parcialmente solapados entre sí.Estos extremos se utilizan como nuevos mar-cadores para extender la caminatacromosómica en ambos sentidos. Este pro-ceso se hace simultáneamente con ambosgrupos de BAC hasta que se superpongan yse forme un continuo o «contig» de BAC. Estecontig contiene la secuencia del gen en estu-dio. El paso siguiente consiste en lasecuenciación del contig. A partir de esta in-formación, y por análisis de secuencia, se de-terminan los genes presentes, posibles can-didatos del carácter en estudio. La pruebadefinitiva para establecer el hallazgo del genen cuestión es la prueba de complemen-tación. Esto consiste en transformar una plan-ta que carece del carácter en estudio (porejemplo es susceptible a un patógeno) concada uno de los genes candidatos y determi-nar cuál de ellos le confiere el carácter (eneste caso resistencia al patógeno).

En algunos genomas (por ejemplo, arroz),la región cromosómica colinear a trigo pue-de estar secuenciada, y a partir de esta infor-mación se puede tener una primera estima-ción del número de genes candidatos parala resistencia al patógeno en la regióncromosómica homóloga a trigo en arroz. Enel caso del trigo pan, que posee un genomaextremadamente grande (16000Mb/genoma haploide) es crítico obtener un in-tervalo genómico lo más pequeño posible,ya que si bien posee aproximadamente elmismo número de genes que arroz, sugenoma haploide es diez veces mayor, y ladiferencia está constituida principalmentepor ADN repetitivo no codificante que difi-culta el clonado posicional. Como ejemplo,para el clonado posicional del gen Vrn-1 quecontrola el momento de floración del trigo

se utilizó una población de trigo diploide(Triticum monococcum) de 3095 individuosF2, para llegar a delimitar un intervalo de 0.03cM que contenía dos genes candidatos paraVrn-1 (Yan et al. 2003). Esta región presen-tó una densidad de genes de uno cada 70000pares de bases, la mitad del valor promediode fragmentos contenidos en un BAC.

7 Distribución de la variabilidad genéticaen poblaciones naturales

Las especies están constituidas por uni-dades o demos más o menos aislados deno-minados poblaciones. Una especie vegetalraramente se extiende en forma continua eininterrumpida. En general adopta una dis-tribución en parches. El número de indivi-duos en cada población, el modo repro-ductivo (autogamia-alogamia), las distanciasinter-demos, el tipo de polinización (grave-dad-anemófila-entomófila), la acción delhombre en la fragmentación del hábitat y elorigen histórico (especies nativas-especiesintroducidas) determinan en conjunto unadistribución de la variación genética propiade cada especie.

Los programas de conservación utilizan amenudo información acerca de la distribuciónde la variación genética para establecer prio-ridades y estrategias de manejo. El estudiode los componentes de la variación dentroy entre poblaciones colaboran en la defini-ción de las unidades a conservar y se convier-ten en elementos importantes para la tomade decisiones relacionadas con la protecciónde la biodiversidad. Es deseable que las po-blaciones seleccionadas para formar parte delas áreas protegidas, contengan la mayor di-versidad genética posible de modo de ase-gurar el mayor potencial evolutivo.

A partir de marcadores codominantescomo las isoenzimas pueden ser obtenidosparámetros de diversidad:

P: número de loci polimórficos/númerototal de loci analizados.

A: número promedio de alelos por locusHe: heterocigocidad esperada promedio

(1- Σfi2, fi : frecuencia alélica)

Ho: heterocigocidad observada

También se calculan coeficientes deendogamia (F) a partir de la heterocigocidadobservada y esperada, e índices de simili-


tud (I) o distancia genética (D) que cuantifi-can la semejanza o diferencia genética entrepoblaciones a partir de las frecuencias alélicas(Ver VI.-1 ).

La diversidad genética cuantificada pormarcadores moleculares puede mostrar porejemplo, que en una especie nativa de inte-rés forestal todas las poblaciones presentanaltos niveles de variabilidad genética y sonbastante similares entre sí. En este caso ladecisión de cuáles poblaciones formarán par-te del programa de conservación podría ba-sarse en consideraciones exclusivamente prác-ticas ya que las poblaciones son genéti-camente equivalentes. Por el contrario, unaespecie compuesta de poblaciones con nive-les bajos de variabilidad en cada unidad perocon alto grado de diferenciación entre po-blaciones, requerirá que los esfuerzos de pro-tección sean dirigidos hacia tantas poblacio-nes como sea posible, ya que cada una deellas posee una identidad genética diferen-te. Poblaciones de especies endémicas, conniveles de diversidad genética extremada-mente bajos y un reducido número de indivi-duos, son normalmente ingresadas a la ca-tegoría de especies en peligro de extinción.

En este punto, es importante recordarque los marcadores moleculares representanvariación genética esencialmente neutra, esdecir se encuentran sometidos a la acción defuerzas evolutivas no selectivas tales comoderiva o flujo génico. Las decisiones finalesde un programa de conservación deberíanpor lo tanto combinar los datos obtenidos apartir de marcadores moleculares junto conla evaluación de ciertos rasgos morfológicos,fisiológicos o reproductivos, que son críticosen el proceso de adaptación y supervivenciade las poblaciones en su hábitat.

El conocimiento de los componentes devariación entre y dentro de las poblacionesnaturales puede utilizarse además en situa-ciones de repoblamiento, es decir, la intro-ducción de individuos en áreas en procesode declinación. De acuerdo a la informaciónobtenida por la caracterización molecular, esposible seleccionar la ó las poblacionesdonadoras sobre la base de la similitudgenética con la receptora, de modo de evi-tar los efectos indeseables de la depresiónpor exogamia.

Las malezas de mayor impacto en la agri-

cultura mundial son en general especies in-troducidas. En el nuevo territorio, libre depresiones selectivas tales como especies com-petidoras o patógenos características delecosistema de origen, la especie introducidaes capaces de establecerse y colonizar todoslos territorios que reúnan determinadas con-diciones ambientales. La caracterizacióngenética de las poblaciones de malezas pue-de aportar información de utilidad en los pro-gramas de control. Mediante diferentes mar-cadores moleculares puede establecerse si laspoblaciones actuales provienen de un soloevento de introducción, con unos pocos in-dividuos iniciales o por el contrario, ocurrie-ron múltiples eventos de introducción. Ade-más, determinados marcadores informativospueden establecer con bastante precisióncuál es el lugar de origen de las poblacionesintroducidas, y en este caso rastrear «enemi-gos naturales» que pudieran ser útiles comocontrol biológico de la especie invasora. Delmismo modo puede ser analizada la variabi-lidad genética de patógenos o parásitos ve-getales tales como razas de royas, virus,nematodos, etc. y a partir de esta informa-ción diseñar programas de control más efica-ces.

El tipo de reproducción de una especievegetal determina en gran parte la distribu-ción de variabilidad genética entre poblacio-nes. Los mecanismos reproductivos puedenclasificarse en los tres tipos básicos: alogamia,autofecundación y apomixis (ver CapítuloVIII.-3). En realidad existen combinaciones deestos tipos básicos, con porcentajes variablesde cada uno de ellos, según las especies, yaun dentro de las poblaciones, con formasobligadas o facultativas. El estudio de marca-dores moleculares en diferentes plantas deuna población y su progenie ha contribuidoa determinar el tipo de reproducción de nu-merosas especies vegetales.

8 Estimación del flujo génico

El flujo génico entre poblaciones vegeta-les ocurre mediante el movimiento de poleno de semillas. La morfología de semilla y po-len, los mecanismos de dispersión, el tipo depolinización, etc., hacen que la contribuciónde estas dos vías al flujo total varíe de acuer-do a la especie. Los marcadores moleculares


permiten cuantificar cada uno de estos pro-cesos. Si el flujo génico se produce básicamen-te a través de polen, los marcadores de ADNde organelas, como por ejemplo cloroplastos,no serán transferidos de una población a otraporque este tipo de información es sólo he-redada por vía materna. En contraste, si elflujo génico se realiza principalmente a tra-vés de semillas, tanto los marcadores de he-rencia materna como los de herenciabiparental o nuclear, serán transmitidos en-tre poblaciones. Mediante el uso de marca-dores altamente polimórficos como losmicrosatélites es posible determinar cuál hasido la planta donadora del polen de cadasemilla por ejemplo, en especies arbóreas. Eneste caso, por un lado se obtiene informa-ción acerca de la distancia de transporte depolen y además constituye un test de «pa-ternidad».

La estimación del flujo génico ha cobra-do especial relevancia en los estudios ten-dientes a evaluar el efecto sobre el ambien-te de los materiales genéticamente modifi-cados. Dicho efecto comprende diferentesfacetas. Por un lado la posibilidad de quepoblaciones silvestres cercanas a las formascultivadas, adquieran el transgen mediantefecundación cruzada, generando cambios enla dinámica poblacional, competitividad orelación con otro miembros de la comunidadbiótica tales como polinizadores, patógenos,etc.. Esta potencial transferencia de genes setorna preocupante cuando se trata de flujogénico hacia poblaciones silvestres cataloga-das como malezas. En este escenario losmarcadores moleculares de ADN oisoenzimas constituyen herramientas muyútiles. Los individuos de una determinadapoblación pueden ser analizados y compara-dos con su progenie, producto de una polini-zación libre. Los alelos que no estaban pre-sentes en la población materna son atribui-dos al ingreso externo de polen del cultivo.Evaluando poblaciones a distancias crecien-tes desde una determinada fuente de po-len, el flujo génico puede ser cuantificado, ycuando esta información se complementacon datos de compatibilidad sexual,polinizadores y clima se arriba a una serie deconclusiones que pueden aplicarse al cultivoen gran escala de variedades transgénicas. Amodo de ejemplo, con el objeto de estable-

cer el riesgo ambiental de la liberación degirasol genéticamente modificado en la Ar-gentina, se está realizando un estudio quecomprende el relevamiento de las especiessilvestres del género Helianthus, su distribu-ción y el grado de intercambio genético enlas zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX.-2).

Se trate de variedades transgénicas o no,los procesos de hibridación de formas culti-vadas de base genética estrecha con silves-tres alteran los niveles de diversidad genéticade las poblaciones naturales, produciendouna erosión de los recursos genéticos vege-tales, con potencial aplicación en mejora.Nuevamente la estimación del flujo génico yla determinación de la variabilidad genéticamediante marcadores pueden contribuir aatenuar los procesos de «homogenización»genética y dar tiempo a la evaluación de laspoblaciones naturales en cuanto a rasgoscomo resistencia a enfermedades oparámetros de calidad.

9 Filogenia

La filogenia intenta reconstruir las rela-ciones jerárquicas de descendencia entre es-pecies o grupos de especies y utiliza esta in-formación como criterio de clasificación bio-lógica. El conocimiento de la filogenia y di-versidad genética de los recursos silvestrespermite optimizar los procesos de hibridacióncon los materiales cultivados. Cultivos impor-tantes como trigo, girasol, tomate, poroto,arroz cuentan con numerosas especies y gé-neros silvestres relacionados, con potencialuso en el mejoramiento genético mediantecruzamientos.

Los marcadores RFLP son particularmen-te útiles dado que están basados en reaccio-nes de hibridización, lo que garantiza lahomología de los segmentos que se compa-ran entre los diferentes taxa. RAPD no re-quiere un conocimiento previo del genomaen estudio y puede ser aplicado a diferentesespecies pero la interpretación de los datosparte de asumir que los productos de ampli-ficación de iguales tamaños son homólogos.

El procedimiento consiste básicamenteen calcular un índice de distancia genéticasobre la base del número de bandas en co-mún y luego realizar un análisis de agrupa-


miento (UPGMA) o árbol filogenético(Neighbour Joining), que refleje las relacio-nes entre los taxa. Establecer cuál es el árbolcorrecto entre todos los posibles es una ta-rea difícil que en parte es resuelta medianteel uso de métodos estadísticos, como técni-cas de re-muestreo, que generan índices deconsistencia o confiabilidad para cada árbol.Las relaciones establecidas de este modo secomparan luego con vías filogenéticas pro-puestas a partir de datos citogenéticos,morfológicos, ecológicos, cruzamientos, etcé-tera.

Los polimorfismos en los fragmentos derestricción de ADN de cloroplasto resultanútiles para establecer relaciones filogenéticasen el ámbito de familias y géneros debido asu tasa de evolución más lenta y a su modode herencia uniparental. Para los niveles deespecie e infraespecíficos es conveniente com-plementar con marcadores de origen nuclear,entre los cuales las sondas para ARNribosómico 45S y ADNc son frecuentementeusadas.

El mapeo comparativo ha permitido co-nocer el tipo de reorganización genómicaque ha operado durante el proceso deespeciación. Cuando se compara el orden delos marcadores moleculares del girasol,Helianthus annuus, y especies relacionadascomo H. petiolaris y H. anomalus se obser-va que las especies poseen zonas colinearesy zonas no colineares, originadas estas últi-mas en cambios estructurales como inversio-nes y translocaciones. Además se ha compro-bado que H. anomalus es una especie resul-tante de la hibridación entre las dos espe-cies mencionadas, que conserva el mismonúmero cromosómico de las especiesparentales.

Mediante marcadores isoenzimáticos esposible dilucidar las especies parentalesancestrales de una especie alopoliploide,como ocurrió con el tabaco y el algodón. Bas-ta con examinar las variantes moleculares delas especies candidatas diploides y comparar-las con las de la especie poliploide derivada.El modo de herencia de un locusisoenzimático, es decir, disómico vs. poli-sómico, permite además caracterizar unaespecie en cuanto a su origen alo- oautopoliploide, respectivamente.

En la evolución del género Citrus ha ope-rado la hibridación natural a través de repro-ducción sexual pero también están presen-tes mecanismos apomícticos que constituyenbarreras al intercambio de genes. La taxono-mía de este grupo resulta particularmentecompleja ya que no puede ser aplicado elconcepto biológico de especie. Marcadoresde ADN han permitido esclarecer las relacio-nes de este polimórfico grupo que incluyenaranjas, limones, limas y mandarinas.

Los estudios moleculares más recienteshan colocado al tomate, previamente deno-minado Lycopersicon esculentum, dentrodel género Solanum, pasándose a denomi-nar Solanum lycopersicon. Los estudios so-bre ADN de cloroplasto y la similitud de losmapas de ligamiento constituyen evidenciasde que el tomate y la papa comparten unantecesor común muy reciente. Esta informa-ción resulta de gran aplicación en el mejora-miento de estos cultivos así como en la com-prensión de la evolución de los genomas.


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PARTE VMétodos de propagación y

conservación de germoplasma

162 OLMOS, Sofía; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina


V.-Capítulo 1

Micropropagación

Olmos, Sofía; Luciani, Gabriela;Galdeano, Ernestina

1 Introducción

La micropropagación consiste en la pro-pagación de un genotipo a gran escala a tra-vés del empleo de técnicas de cultivo de teji-dos. El cultivo es así una herramienta muy útilen los programas de mejoramiento, ya quetiene el potencial de producir plantas de cali-dad uniforme a escala comercial, a partir deun genotipo selecto y con una tasa de multi-plicación ilimitada.

Esto es posible gracias a la propiedad detotipotencia que tienen las células vegeta-les; esto es la capacidad de regenerar unaplanta completa cuando están sujetas a losestímulos adecuados. Así, las célulassomáticas de cualquier tejido podrían formartallos, raíces o embriones somáticos de acuer-do con la competencia que posean y al estí-mulo que reciban.

Esta regeneración ocurre en fases conse-cutivas: la fase de desdiferenciación, dondelas células se vuelven competentes para res-ponder ante cualquier estímulo organogénicoo embriogénico; la fase de inducción, don-de las células se determinan para formar unórgano o embrión, y la fase de realización,donde se forma el órgano o embrión pro-piamente dicho. Estas fases están directa-mente afectadas por el balance hormonal delmedio de cultivo, por lo cual la optimizaciónde los protocolos de regeneración debe rea-lizarse teniendo en cuenta los requerimien-tos intrínsecos de cada genotipo en cada fasedel cultivo. Así, en general, puede decirse queel proceso de desdiferenciación generalmen-te es promovido por una auxina, la fase deinducción por un balance hormonal específi-co del órgano o embrión a formarse y la fasede realización, por una disminución de la con-centración hormonal en el medio de cultivo.

2 Etapas de la micropropagación

La regeneración de plantas in vitro pre-senta cuatro etapas principales: 1) estableci-

miento del cultivo, 2) desarrollo y multiplica-ción de vástagos, 3) enraizamiento y 4) acli-matación de las plántulas. Generalmente, lasetapas de enraizamiento y aclimatación pue-den combinarse en condiciones ex vitro. Enalgunos casos tiene importancia consideraruna etapa previa (Etapa 0), que es la etapade preparación de los explantos para el es-tablecimiento.

• Etapa 0: Preparación del material ve-getal

El empleo de explantos que se encuen-tran expuestos a bajos niveles de patógenospuede resolver el problema de la contamina-ción por hongos y bacterias durante el esta-blecimiento del cultivo in vitro. Los factoresque influyen sobre la calidad del explanto son:1) El tipo de órgano que sirve como explanto,2) la edad ontogénica y fisiológica del mis-mo, 3) la estación en la cual se colecta elmaterial vegetal, 4) el tamaño y 5) el estadosanitario general de la planta donante.

La planta donante debe elegirse sobre labase de una selección masal positiva para lascaracterísticas agronómicas deseables. Unavez seleccionados los individuos, es precisodefinir el tipo de explanto a establecer encondiciones in vitro. En general, los órganosjóvenes o bien rejuvenecidos son los que tie-nen mejor respuesta en el establecimientoque los obtenidos a partir de materiales adul-tos.

Se recomienda colectar explantos prima-rios a campo durante la estación primaveraly estival, cuando existe una brotación activade las yemas, ya que el empleo de yemas enestado de dormición ocasiona serios proble-mas de contaminación.

A fin de lograr explantos de óptima cali-dad es conveniente hacer crecer las plantasdonantes por un tiempo mínimo en condi-ciones de invernáculo. De esta forma es posi-ble incidir directamente sobre el estado sani-tario y la calidad de los explantos medianteel control de la intensidad lumínica, tempe-ratura y reguladores de crecimiento. Para es-pecies ornamentales tropicales ysubtropicales se recomienda mantener lasplantas donantes en condiciones de alta tem-peratura (25ºC) y baja humedad relativa(75%), a fin de reducir la proliferación depatógenos.


Los procesos morfogénicos de floración,dormición y bulbificación son controlados porel fotoperíodo y la temperatura. Controlan-do estos factores también es posible obte-ner plantas donantes y explantos más ho-mogéneos durante todo el año. Pueden apli-carse además pretratamientos con regulado-res de crecimiento a las plantas donantes,así como también a los explantos mismos.En especies leñosas suele utilizarse comopretratamiento la inmersión de los explantosprimarios en soluciones con citocininas a finde inducir la brotación de yemas.

• Etapa 1: Establecimiento del cultivoEl objetivo de esta etapa es establecer

cultivos viables y axénicos. El éxito está de-terminado por la edad de la planta donan-te, la edad fisiológica, el estado de desarro-llo y el tamaño del explanto. En esta etapalos principales procesos a controlar son laselección, el aislamiento y la esterilización delos explantos.

Los materiales que demuestran tenermayor capacidad regenerativa son los obte-nidos de tejidos meristemáticos jóvenes, seanyemas axilares o adventicias, embriones osemillas en plantas herbáceas y aquellos teji-dos meristemáticos que determinan el creci-miento en grosor, como el cambium en lasplantas leñosas. En este sentido, es impor-tante señalar que el empleo de yemas ad-venticias (también llamadas yemas formadasde novo) está asociado con una mayor pro-babilidad de ocurrencia de variantessomaclonales respecto de los sistemas depropagación, basados en la regeneración apartir de yemas axilares o embrionessomáticos.

La obtención de cultivos axénicos puedelograrse trabajando tanto sobre aspectospreventivos como curativos. Una acción pre-ventiva la constituye el empleo de métodosde verificación de patógenos en losexplantos. Esto puede realizarse medianteanálisis específicos para las enfermedades delcultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, análisisgenerales para patógenos cultivables comoel empleo de medios de cultivo para el creci-miento de bacterias y hongos y métodosespecíficos para la detección e identificaciónde patógenos intracelulares como virus,viroides y bacterias. La realización de estos

análisis directamente sobre las plantas do-nantes, previo establecimiento, presenta dosventajas. En primer lugar, el empleo de teji-dos maduros permite visualizar los síntomasmás marcados de la enfermedad; en segun-do lugar, la carga de patógenos es mayor ypor lo tanto la precisión del sistema de de-tección aumenta. Por otro lado, las plantasenfermas pueden tratarse con técnicas ade-cuadas para la eliminación de patógenoscomo la termoterapia, la quimioterapia a tra-vés de la aplicación de antibióticos, desinfec-tantes, antivirales y el cultivo de meristemas.

La desinfección superficial incluye variospasos: el lavado de los explantos con aguacorriente, el empleo de etanol al 70% por 1minuto, seguido de concentraciones variablesde hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloroactivo) con unas gotas de tensoactivos parafavorecer su penetración y actividad. Poste-riormente, los explantos deben ser enjuaga-dos al menos tres veces con agua destiladaestéril.

Algunos patógenos permanecen latentesy se expresan cuando son transferidos a unmedio de cultivo nuevo. En general, estospatógenos incluyen los patógenos superficia-les del material vegetal, los patógenosendógenos y los patógenos propios del ma-nejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambiénpueden observarse infecciones por bacteriasy hongos asociados a trips que sobreviven alos tratamientos de esterilización y porpatógenos endógenos latentes dentro delsistema vascular, resultado de una esteriliza-ción inefectiva de los explantos. Estospatógenos latentes podrían manejarse me-diante el empleo de bacteriostáticos oantibióticos en el medio de cultivo.

• Etapa 2: MultiplicaciónEl objetivo de esta etapa es mantener y

aumentar la cantidad de brotes para los nue-vos ciclos de multiplicación sucesivos y poderdestinar parte de ellos a la siguiente etapade producción (enraizamiento, bulbificación,etc.). Es importante señalar que en esta eta-pa, cualquiera que sea la vía de regeneraciónempleada, es conveniente evitar la formaciónde callo para disminuir el riesgo de variaciónsomaclonal. En esta etapa, los medios decultivo, los reguladores de crecimiento comoauxinas, citocininas y ácido giberélico y las


condiciones de crecimiento juegan un papelcrítico sobre la multiplicación clonal de losexplantos.

Ambas vías de regeneración, organogé-nesis y embriogénesis, pueden darse en for-ma directa o indirecta. Esta última implica laformación de callo. En general, la organo-génesis conduce a la producción de vástagosunipolares que enraízan en etapas sucesivas,mientras que por embriogénesis somática seforman embriones bipolaresa través de etapas ontogé-nicas similares a la embriogé-nesis cigótica.

La organogénesis puededarse por inducción de yemasaxilares o adventicias. La in-ducción de yemas axilarescomprende la multiplicaciónde yemas preformadas, usual-mente sin formación de callo.La inducción de yemas adven-ticias comprende la inducciónde tejido meristemático loca-lizado mediante un trata-miento con reguladores decrecimiento, conduciendo a ladiferenciación del primordio ydesarrollo del vástago, estoúltimo generalmente en au-sencia del regulador de creci-miento que indujo laorganogénesis.

La principal desventaja delprimer método es que el número de yemasaxilares por explanto limita la cantidad devástagos. Esto se ve compensado, sin embar-go, por un aumento en la tasa de multiplica-ción con los sucesivos subcultivos. La forma-ción de yemas adventicias ofrece mayor po-tencial para la producción de vástagos, yaque la inducción de vástagos ocurre en sitiosdistintos al de los meristemas.

La embriogénesis somática es una vía másconveniente porque permite saltar las eta-pas de formación de yemas y enraizamientoregenerando plantas en una forma muchomás rápida y eficiente, disminuyendo ademásel riesgo de variación somaclonal. A su vez, ladisponibilidad de protocolos para la obten-ción de embriones somáticos es clave para laautomatización de la micropropagación y laconsecuente reducción de costos para su

implementación a escala comercial. Losbiorreactores son equipos que contienenaproximadamente 2 litros de medio de culti-vo líquido estéril y donde los embrionessomáticos pueden regenerar y madurar apartir de suspensiones celulares, sustentadospor la circulación permanente de nutrientesy de aire (Fig.1). Hoy en día, el empleo debiorreactores para la micropropagación a granescala está limitado por dos motivos críticos.

En primer lugar, el declinamiento de las líneascelulares (clones) por efecto de la variaciónsomaclonal y segundo, por los altos costosasociados con la conversión de estos embrio-nes somáticos en plántulas.

Las condiciones culturales en las cualescrece el explanto son el resultado de lainteracción de tres factores: el estado delexplanto o material vegetal, determinado enparte por el medio de cultivo, el recipientede cultivo y el ambiente externo o condicio-nes de crecimiento del cuarto de cultivo. Lacapacidad de respuesta de los explantos aun mismo medio de cultivo cambia con elnúmero de subcultivos, el tipo de explantosubcultivado y el método del repique. Poresto mismo, el medio de cultivo debeoptimizarse a fin de lograr la mayor tasa demultiplicación vegetativa. Comúnmente se

Figura 1: Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de células del floemase obtienen los embriones somáticos que son un excelente sistema depropagación clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala delos mismos.(Gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra)


emplea como medio basal el medio MS com-pleto sugerido por Murashige & Skoog (1962)suplementado con 3% de sacarosa comofuente de carbono. A este medio se le adi-cionan además reguladores de crecimiento,tanto del tipo de auxinas como de citocininas.

La etapa de multiplicación generalmentecomprende dos períodos, la fase de induc-ción y la fase de multiplicación propiamentedicha. La primera implica, generalmente, elempleo de concentraciones elevadas de re-guladores de crecimiento (generalmente deauxinas más que citocininas) para favorecerla desdiferenciación. La segunda etapa re-quiere del empleo de un balance hormonaladecuado para favorecer los procesos de di-ferenciación y multiplicación celular. En estecaso, el sistema es más dependiente de re-guladores del tipo de las citocininas. En algu-nos casos, como ocurre en la formación deembriones somáticos, se requiere de una ter-cera y cuarta etapa, denominadas de madu-ración y de germinación respectivamente,cuya duración varía entre 1 a 2 semanas. Parala etapa de maduración se adiciona ABA (áci-do abscícico) al medio basal en rangos de 5 a20 micromolar, seguido del subcultivo a unmedio basal conteniendo AG (ácidogiberélico) en concentraciones de 0,1-1micromolar, cuyo fin es lograr la germinaciónde los embriones obtenidos.

Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) ylos rangos de concentración más empleadosse mencionan a continuación: a) IBA (ácido3-indolbutírico): 0,1-2 µM; 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético): 4-35 µM; AIA (ácido 3-indolacético): 0,1-2 µM ; ANA (ácidonaftalenacético): 1-5 µM; y, picloram: 1-10µM; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 µM; CIN(cinetina): 0,1-1 µM; ZEA (zeatina): 1-10 µM;2ip (isopentiladenina): 1-5 µM; y, TDZ(tidizuron): 0,01-1 µM.

Los tipos de reguladores, sus combinacio-nes y rangos de concentraciones deben seroptimizados para cada especie, genotipo yetapa de multiplicación determinada. Loscultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14horas de fotoperíodo e intensidad lumínicamoderada (100 µmol m-2 s-1).

La presencia de compuestos fenólicosoxidados se encuentra asociada con tejidosvegetales sometidos a situaciones de estrés,tales como aquel provocado por el dañomecánico producido durante el aislamientodel explanto de la planta madre.

Estos compuestos se encuentran en ge-

neral en las plantas en estado reducido y elataque de patógenos produciría su oxidacióny liberación. Esto inhibiría el crecimiento delos mismos, dañando, indirectamente, a losexplantos. Estas sustancias (quinonas,fitoalexinas y protectores de auxinas) sonmuy lábiles y fácilmente oxidables. Por estomismo, durante el establecimiento y multi-plicación in vitro es necesario emplear estra-tegias tendientes a disminuir el estrés de lasplantas y limitar al mínimo la producción yoxidación de los compuestos fenólicos. Paraello se emplean agentes absorbentes defenoles en el medio de cultivo, tales como elcarbón activado y la polivinilpirrolidona oantioxidantes como el ácido ascórbico, lamodificación del potencial redox con agen-tes reductores, la inactivación de lasfenoloxidasas con agentes quelantes o la re-ducción de su actividad o afinidad por elsustrato utilizando un bajo pH, o bien culti-vando in vitro en condiciones de oscuridad.Es recomendable además lograr que la tasade intercambio gaseoso entre los ambientesdel recipiente y externo sea óptima,evitándose la acumulación de CO2 y deetileno.

En este sentido, el sellado del recipientees importante, el intercambio gaseoso esmás limitado con el empleo de una tapa deplástico que con un film de polietileno exten-sible. La utilización de una tapa perforada contapón de gomaespuma es altamente reco-mendable (Fig. 2).

Los principales problemas que puedenpresentarse durante los sucesivos subcultivosin vitro son la vitrificación y la producciónde compuestos fenólicos por los explantos.

La vitrificación consiste en un proceso demorfogénesis anormal con cambios anató-micos, morfológicos y fisiológicos que produ-cen hojas de una apariencia vidriosa. Este fe-nómeno está regulado por dos factores cla-ve que son la humedad relativa y el poten-cial agua, y afecta a dos procesos fisiológicosfundamentales: la fotosíntesis y la transpira-ción. Debido a la disfunción metabólica aso-ciada, las plantas se vuelven heterótrofas ytranspiran excesivamente debido a un malfuncionamiento estomático y a cambios es-tructurales en las paredes celulares. La princi-pal consecuencia de la vitrificación es la bajasupervivencia de las plántulas obtenida du-


rante la aclimatación ex vitro. Por ello, es fun-damental conocer el rol de los distintos fac-tores que inciden negativamente sobre eldesarrollo morfogénico normal (autótrofo) invitro. Estos factores son el ambiente de cul-tivo, los componentes orgánicos einorgánicos del medio, los reguladores de cre-cimiento, la luz y la temperatura. Una bajahumedad relativa, elevada irradiación, la re-moción de la fuente de carbohidratos delmedio de cultivo y la defoliación de las plan-tas para estimular la formación de hojas nue-vas estimulan la fotosíntesis y otras activida-des metabólicas de las hojas en forma nor-mal. Otras estrategias para lograr un óptimocrecimiento implican el empleo de retar-dantes del crecimiento para estimular la for-mación de hojas nuevas después deltransplante. O bien, el empleo de altos nive-les de CO2 (antagonista del etileno) para es-tabilizar la vía de lignificación y prevenir lavitrificación a través de la inhibición de lahiperhidratación, la hipolignificación y la for-mación de aerénquima.

• Etapa 3: Enraizamiento y aclimataciónEn esta etapa se produce la formación de

raíces adventicias. En las especies herbáceases relativamente fácil mientras que en las

especies leñosas es complicado por su limita-da capacidad rizogénica.

El enraizamiento puede realizarse tantoen condiciones in vitro como ex vitro. En elprimer caso pueden emplearse varios tiposde sustratos y reguladores de crecimiento(auxinas) para promover la rizogénesis. Lossustratos incluyen: medio solidificado conagar, perlita y/o vermiculita humedecidas conmedio nutritivo o agua. En un medio solidifi-cado con agar, los nutrientes se reducen de1/2 a 1/4 de la composición original, y la sa-carosa se reduce a una concentración finalde 1-2%. Medios con baja concentración sa-lina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) yGD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan elporcentaje de enraizamiento de vástagosaxilares en plantas latifoliadas. El empleo deagar presenta ventajas y desventajas sobrela rizogénesis. Por un lado, el enraizamientode especies forestales en agar se favoreceríaal producirse una rizogénesis más sincrónicacomo resultado del contacto íntimo de lasestacas con el medio de cultivo. Sin embar-go, las raíces producidas por este método sonusualmente delgadas y no se forman raícescabellera. Adicionalmente, el empleo de agarestá asociado con la formación de callo en labase de las estacas, que conduce al estable-cimiento de conexiones vasculares interrum-pidas entre raíces y vástagos.

Comúnmente, a fin de proceder a suenraizamiento, los vástagos de buen tama-ño provenientes de la etapa de multiplica-ción y provistos de al menos 4-5 yemas, secolocan durante períodos cortos en solucio-nes con concentraciones elevadas de auxinas.La auxina más utilizada es el IBA (ácido 3-indolbutírico), que puede utilizarse a concen-traciones de 1-10 µM durante pocas horas.Alternativamente se pueden emplear nive-les más bajos de auxinas (0.1 a 1µM ), peromanteniendo la inducción por un períodomás prolongado (3 a 7 días). Luego los vás-tagos se transfieren a un medio de cultivobasal desprovisto de reguladores de creci-miento para permitir el desarrollo de las raí-ces. Aproximadamente 20 días después deltratamiento de inducción es posible la ob-tención de una adecuada cantidad de raícesfuncionales que permitan continuar hacia laetapa de aclimatación.

Es importante acentuar que el uso de

Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en unrecipiente de vidrio con tapa metálica perforada y tapónde gomaespuma, que evita la acumulación de CO2, etilenoy excesiva humedad en el ambiente de cultivo.


auxinas a elevadas concentraciones es con-traproducente porque induce la formación decallo en la base de las estacas. Por ello, paracada cultivo es necesario optimizar un proto-colo de rizogénesis que minimice la forma-ción de callo y maximice la tasa de rizogénesisy supervivencia de las plantas.

El enraizamiento ex vitro permite que elenraizamiento y aclimatación se logren simul-táneamente y que raramente se forme calloen la base de las estacas, asegurando así unaconexión vascular continua entre el vástagoy la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a laevapotranspiración acelerada de las plantasdurante las etapas iniciales del trasplantepuede reducir considerablemente la tasa desupervivencia. Por ello, es conveniente con-tar con instalaciones de invernadero o cáma-ras de crecimiento adecuadas para brindartemperatura y humedad relativa moderadas,que permitan lograr la rusticación de las plan-tas en forma progresiva. Bajo condiciones exvitro se utilizan diferentes sustratos, mezclasde tierra y arena y/o abonos, los cuales con-viene que estén debidamente esterilizados.

3 Propagación de especies leñosas

El empleo de clones en programas dereforestación genera al menos un 10 % deincremento en ganancia genética en relacióncon el empleo de plantas regeneradas porsemillas de árboles selectos. Sin embargo, lamáxima ganancia genética puede ser obte-nida mediante el empleo conjunto de pro-pagación sexual y agámica. La reproducciónsexual es importante para la introducción degenes nuevos, prevenir los efectos de laendogamia y el mejoramiento de caracterís-ticas controladas por efectos aditivos degenes. La reproducción asexual, por otrolado, permite la multiplicación de individuoso grupos de individuos seleccionados de unapoblación élite, que exhiben una significati-va ganancia genética debida a efectos noaditivos de genes.

Tradicionalmente, las especies forestalesfueron propagadas vegetativamente me-diante el enraizamiento de estacas, debraquiblastos en coníferas, así como tambiénpor injertos. La propagación por estacas deCryptomeria japonica (kiri), Populus (álamo)y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran-

te siglos en Asia y Europa. Sin embargo, parala mayoría de los árboles propagados por es-tacas se observa una rápida pérdida de ca-pacidad de rizogénesis al aumentar la edadde la planta donante de las estacas. En estesentido, una de las principales ventajas de lamicropropagación es la capacidad potencialde desarrollar protocolos de multiplicaciónoptimizados para multiplicar árboles adultosque han demostrado ser fenotípicamentesuperiores.

3.1 Métodos de Micropropagación

Los trabajos pioneros en el cultivo de te-jidos cambiales de especies forestales condu-jeron, en el año 1940, a la formación de ye-mas adventicias en Ulmus campestris. Duran-te la década del 40 se publicaron logros adi-cionales en al producción separada de vásta-gos y raíces en especies latifoliadas. En 1950se publicó por primera vez la obtención deorganogénesis en coníferas, con la formaciónde vástagos a partir de callos de Sequoiasempervirens. En la década 1970-80 se ob-tuvieron las primeras plantas de álamo(Populus tremuloides) y Pinus palustris. Enambos casos la formación de plántulas se lo-gró vía organogénesis. Luego del año 1975la micropropagación de especies latifoliadasse realizó a través de la regeneración indirec-ta, pasando por una etapa de callo.

Actualmente, la multiplicación in vitro deconíferas y latifoliadas se logra a través detres vías, 1) brotación de yemas adventicias,2) producción de yemas adventicias y 3)embriogénesis somática.

La brotación de yemas adventicias em-plea ápices de vástagos, yemas laterales ymicroestacas. Es el principal método utiliza-do para especies latifoliadas. En las conífe-ras, la elongación de las yemas axilares a par-tir de braquiblastos de plantas adultas no hasido muy exitosa. En latifoliadas de clima tem-plado los mejores explantos los constituyenlas yemas y vástagos en activo crecimientomás que las yemas en estado de dormición.Los vástagos se colectan en primavera y aprincipios del verano a fin de obtener mate-rial con reducido nivel de contaminación. Al-ternativamente, las yemas en dormición pue-den ser colectadas y brotadas en condicio-nes ambientales controladas.


Para la inducción de vástagos, tanto engimnospermas como en angiospermas, serequiere el empleo de citocininas. Las másusadas son la N6-benciladenina (BA) y eltidiazurón (TDZ).

Los medios basales más usados paraangiospermas son el MS (Murashige & Skoog,1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Parael caso de gimnospermas, el empleo de me-dios reducidos en sales minerales y baja can-tidad de nitrógeno resulta mucho mejor queel empleo de un medio altamente salino ynitrogenado como el MS.

La inducción de yemas adventicias es elmétodo más empleado para gimnospermasy angiospermas. En este caso, las yemas seinducen directamente sobre el explanto engeneral sin previo pasaje por una etapa decallo. En general, cuanto más joven es el teji-do, tanto mayor es la respuesta a los trata-mientos que conducen a la organogénesis denovo. Los explantos más frecuentes sonembriones cigóticos maduros, seguidos decotiledones y epicótilos de plántulas. Gene-ralmente se utiliza BA a concentracionesmayores o iguales a 5 ppm como única fuen-te de inducción o en combinación con otrascitocininas. La adición de auxinas puede serbeneficiosa, aunque en coníferas se ha en-contrado que promueve la formación de ca-llo y reduce el proceso de organogénesis.

En algunos casos, como en Populus spp.,la formación de yemas adventicias se logra apartir de un callo originado a partir de tejidocambial.

El método llamado multiplicación median-te nódulos meristemáticos es un métodotambién utilizado para pino radiata y álamo.En este caso se obtiene básicamente un teji-do meristemático (no un verdadero callo)usando relaciones altas de auxina/citocininapara luego inducir la producción de vástagos.

La disponibilidad de protocolos víaembriogénesis somática para especies fores-tales es aún limitada. En las angiospermas losprimeros embriones somáticos se obtuvieronde Santalum album, donde sin embargo nofue posible la obtención de plantas comple-tas. Veinte años después pudieron lograrseplantas completas de abeto (Picea abies),una gimnosperma. En las gimnospermas losmayores éxitos se lograron empleando comoexplantos embriones cigóticos maduros e

inmaduros. En la mayoría de los casos losembriones se originan en forma indirecta apartir de callos embriogénicos o bien, direc-tamente, desde el explanto. En las coníferaspuede ocurrir un proceso de poliembrionía,previa formación de callo que conduce a unaalta tasa de multiplicación inicial. En general,los medios de cultivo más efectivos para es-tos fines contienen elevados niveles de salesy suministran nitrógeno tanto como NH4

+ yNO3

-. Las auxinas más comúnmente emplea-das en el medio de inducción son el 2,4-D(ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y el ANA (áci-do naftalenacético), en concentraciones ma-yores de 2 µM. En algunos casos es necesarioademás el empleo de alguna citocinina, ge-neralmente en concentraciones mayores a 1µM si se trata de BA y entre 0,1-1 µM en elcaso del TDZ.

3.2 Condiciones de cultivo

Los explantos jóvenes de especies leño-sas, particularmente angiospermas, a menu-do secretan al medio de cultivo polifenolesoxidados, visibles como pigmentos marronesy/o negros. Se observa también que en losexplantos de árboles adultos el problema seacentúa. Por ello se recomienda el empleode explantos primarios juveniles.

Los tipos de explantos más utilizadospara el establecimiento in vitro son los seg-mentos nodales de explantos juveniles, lasyemas axilares obtenidas por rejuvenecimien-to de plantas adultas, y los embrionescigóticos y plántulas obtenidas de semillas deorigen sexual.

La desinfección de los mismos se logramediante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2minutos) seguido de una solución delavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4% de hipoclorito de sodio durante 5-30 mi-nutos. En la mayoría de los casos se empleanagentes tensoactivos, tales como TritónÒ yTween20Ò, adicionados en la solución delavandina. En todos los casos los explantosson lavados finalmente varias veces con aguadestilada estéril.

Los medios basales más empleados sonel MS, formulado por Murashige & Skoog(1962), diluído a la mitad o a un cuarto de suformulación original o el WPM, formulado porLloyd & McCown (1981). Como medios de


multiplicación se emplean además el BTM(broadleaved tree medium, Chalupa, 1983)y el medio de Périnet y Lalonde (1983). Losreguladores de crecimiento más utilizados sonel ácido naftale-nacético (ANA) y labenciladenina (BA). También han sido efec-tivas auxinas como el ácido indol-butírico (IBA)y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ycitocininas como la 2- isopentil amino purina(2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurón(TDZ).

En general, los cultivos se incuban a 27±2ºC con 14 horas de fotoperíodo e intensida-

des lumí-nicas moderadas.En la Fig. 3 se muestran las etapas de la

micropropagación de plantas de paraíso gi-gante, Melia azedarach var. gigantea L. (Ol-mos et al., 2002).

3.3 Problemas asociados a lamicropropagación de especie leñosas

Es mucho más difícil propagar materialadulto que juvenil ya que los primeros sonrecalcitrantes, es decir, difíciles de regenerar.Sin embargo, aún en estos casos es posible

Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmoset al., 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provincia de Misiones,Danzer Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblaciónde plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 mesesde edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimientodel cultivo: vástagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Mediobasal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 µM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 µM ácidogiberélico (GA3) + 0,25 µM ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobremedio de multiplicación (medio MS suplementado con 2,22 µM BAP, estos vástagos fueron empleados comoexplantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de laetapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicaciónpara los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0,44 µM. F) Vástago enraizadoen medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 µM IBA durante 2 días,seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatación.

blanco y negro


extraer ex-plantos de mayor capacidadregenerativa mediante dos formas: 1) selec-cionando los tejidos más juveniles dentro deun árbol o 2) induciendo el rejuvenecimien-to del árbol donante antes de aislar losexplantos.

Para seleccionar el material más juvenil enuna planta adulta hay que considerar el fe-nómeno de topófisis. Este es un proceso porel cual el tipo de crecimiento de un nuevoindividuo está determinado por la posiciónque ocupaba en la planta adulta. Esto es oca-sionado por efecto del envejecimiento fisio-lógico e implica que los explantos másreactivos in vitro se encuentran en las yemasde las áreas basales del tronco y raíces.

A su vez, el rejuvenecimiento es un pro-ceso de reversión temporaria de las caracte-rísticas adultas que permite lograr materialvegetal en estado de juvenilidad. En gene-ral, a fin de contrarrestar los efectos debidosa la topófisis, se recomienda emplear tejidosjuveniles y un tamaño de explanto muy pe-queño.

La juvenilidad puede lograrse por dosmétodos. En primer lugar, mediante el em-pleo de órganos juveniles separados de plan-tas adultas, la utilización de estacasenraizadas o bien de brotes epicórmicos. Ensegundo lugar, mediante el rejuvenecimien-to de partes adultas, la iniciación de yemasadventicias y embriones (en este caso se lo-gra un rejuvenecimiento total por el inicio deun nuevo ciclo ontogénico), del injerto deyemas adultas sobre pies juveniles, de trata-mientos con reguladores de crecimiento(como citocininas como el BA), por la podasevera (recepado de árboles adultos) y a tra-vés del cultivo in vitro de meristemas.

Tanto los atributos de supervivencia acampo, como la tasa de crecimiento, elplagiotropismo y la susceptibilidad a enfer-medades de las plantas, tienen una correla-ción directa con la calidad de los vástagosdurante el cultivo in vitro. Un problema cruciala resolver en cada sistema de propagaciónes la calidad diferencial de las raíces de lasplantas regeneradas en relación con aque-llas obtenidas por semillas. Por ejemplo, lasplantas regeneradas de Pinus elliotti suelentener una raíz principal no ramificada y grue-sa. En cambio, las plantas obtenidas a travésde semillas tienen raíces más delgadas y de

mayor crecimiento lateral que permiten com-parativamente un mejor anclaje y una ma-yor resistencia a los vientos.

4 Propagación de especies herbáceas

La micropropagación de especies herbá-ceas está orientada a proveer material librede patógenos, propagar material selecciona-do por su mayor rendimiento o por su ma-yor resistencia a enfermedades y estresesambientales, conservar la diversidad especí-fica en bancos de germoplasma, obtenermaterial para estudios fisiológicos y genéticosy sentar las bases para la aplicación de técni-cas de ingeniería genética.

Existe una gran variedad de protocolos,desarrollados en función de la especie y delos objetivos de la propagación. Existen pro-tocolos generales para monocotiledóneascomo en el caso ciertos cereales (trigo, maíz,cebada, avena, arroz), pasturas (pastobermuda, festuca alta, raigrás, pasto llorón)y hortícolas (cebolla, ajo, puerro); protoco-los generales para dicotiledóneas que inclu-yen especies hortícolas (tomate, papa, pi-miento y zanahoria) y leguminosas forrajeras(alfalfa, maní, trébol blanco) y protocolospara especies modelo como Arabidopsis ytabaco.

En todos los casos, las formas de propa-gación son las mismas. Se emplean vías deregeneración por formación de yemasaxilares, yemas adventicias y embriogénesissomática. En los dos primeros casos, el siste-ma de propagación a través de la organo-génesis directa asegura la estabilidad genéticade las plantas regeneradas y se empleancuando el objetivo es la propagación clonala gran escala. La embriogénesis u organo-génesis indirecta, con formación de callo, seemplea en cambio para generar variabilidaden programas de mejoramiento.

En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo,las etapas de la micropropagación incluyentanto la multiplicación de yemas axilares porel cultivo de meristemas, la formación direc-ta de yemas adventicias en explantos obte-nidos a partir de placas basales o umbelasinmaduras y la formación indirecta de yemasadventicias y/o embriones somáticos obte-nidos a partir de callos que provienen de dis-tintos tipos de explantos (meristemas, bro-


tes, placa basal ó raíces). En el caso de alfalfay otras leguminosas como soja y maní, lamicropropagación es llevada a cabo por la víade la embriogénesis somática, donde losembriones se obtienen utilizando tejidos ju-veniles (embriones, cotiledones y pecíolos)como explantos. En algunos casos como pas-to llorón (Eragrostis curvula) es posible laregeneración de plantas mediante embriogé-nesis, organogénesis y regeneración directaa partir de los explantos.


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V.-Capítulo 2

Semilla sintética

Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A.

1 Concepto

Resulta difícil determinar como se originóla idea de producir semillas sintéticas o artifi-ciales. Estas son el resultado de la aplicaciónen agricultura del fenómeno de embriogé-nesis somática, descripto por primera vez en1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y cola-boradores. Sin embargo, un gran propulsorde su utilización para la propagación a granescala de plantas fue Toshio Murashige, quienen un simposio realizado en 1977 en Ghent(Bélgica) presentó formalmente la idea de laproducción de las semillas sintéticas, enten-diendo como tal a un simple embrión somá-tico encapsulado. Esta semilla se diferenciade la semilla verdadera en que el embrión essomático (producido por el fenómeno cono-cido como embriogénesis somática) y nocigótico, y que si tiene endosperma y cubier-ta, éstos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta se-milla, puesta en condiciones adecuadas, ger-mina (Fig.1 c) y se convierte en una planta(Fig.1 d). Muchos grupos de investigación hancontribuido al desarrollo de tales semillas.Entre ellos se deben destacar el grupoliderado por Keith Walker de la CompañíaMonsanto, quien a partir de mediados de ladécada que va de 1970 a 1980 trabajó espe-cialmente con alfalfa. También hay que men-cionar la labor de Robert Lawrence de laUnion Carbide, quienes comenzaron los tra-bajos con especies forestales, lechuga y apio.Otros investigadores como Drew, Kitto yJanick realizaron sus trabajos con zanahoria.El aporte del grupo liderado por KeithRedenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muyimportante, especialmente por su descubri-miento de que hidrogeles como el alginatode sodio podían utilizarse para producir se-millas artificiales que podían germinar en con-diciones de invernadero.

Existe otro tipo de semilla sintética, dife-rente del definido más arriba, donde, en lu-

gar de encapsular embriones somáticos seencapsulan yemas. Este tipo de «semillas sin-téticas» –de una utilización muy restringida–no será tratado en este capítulo.

2 Tipos de semillas sintéticas

Las semillas sintéticas pueden fabricarsede diferentes maneras (Fig. 2). Básicamentepueden utilizarse embriones hidratados, talcomo resultan del proceso de embriogénesissomática, o bien pueden ser desecados. Enalgunos casos estos embriones están prote-gidos por cubiertas protectoras. De esta ma-nera se pueden distinguir 5 tipos básicos desemillas sintéticas:

1) Semillas sintéticas con embrionesdesecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se

Figura 1: a) Partes de una semilla sintética. b, c y d)Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)mediante semillas sintéticas (las barras verticales indican3 mm).

174 REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

trata de un sistema muy simple donde losembriones son desecados hasta alcanzarporcentajes de humedad del 8 al 20% y noestán provistos de ningún tipo de cubiertaprotectora. En el caso de alfalfa, embrionessometidos a la desecación mostraron porcen-tajes de conversión en plantas de hasta el95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabili-

dad de este tipo de embriones por un año,aproximadamente, en condiciones de labo-ratorio.

2) Semillas sintéticas con embrionessomáticos desecados y provistos de cubier-ta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta técnica hasido utilizada en zanahoria y apio, donde losembriones fueron recubiertos conpolyoxietileno y luego desecados. Los resul-tados han mostrado que es factible lograruna buena supervivencia de éstos; sin embar-go, la conversión en plantas es realmentebaja.

3) Semillas sintéticas con embrioneshidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es elsistema más simple; consiste en la utilización

de los embriones somáticos tal como resul-tan del proceso de embriogénesis somática,sin ningún tipo de cubierta protectora. Estesistema ha sido desechado en la práctica porla escasa conversión de embriones en plan-tas.

4) Semillas sintéticas con embrionessomáticos hidratados suspendidos en un gel

viscoso («fluid drilling»)(Tipo 4,Fig. 2). Inicialmente fue desarrolla-do en zanahoria y más reciente-mente en batata; consiste en lainclusión de varios embriones enuna especie de tubo que contie-ne un gel viscoso.

5) Semillas sintéticas conembriones somáticos hidratados y provis-tos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig.2). Es el sistema más usado. Por esta razón,de aquí en adelante, cuando se mencione«semilla sintética» se referirá a este tipo. Tie-ne la ventaja de que los embriones no estánsujetos a la desecación, que constituye la prin-cipal causa de los bajos valores de conversiónen plantas. Si bien se han ensayado nume-rosas sustancias para encapsular a los embrio-nes somáticos (agar, gelrite, gomas), una dela técnicas más utilizadas consiste en lograrla formación de una cubierta protectora dealginato de calcio, compuesto que no es tóxi-co para el embrión y permite una rápidaencapsulación. El proceso es muy simple y

consiste básicamente en sumergir a losembriones somáticos en una solución dealginato de sodio al 2%, pasándolos lue-go a una solución acomplejante de, porejemplo, 100 mM de Ca (NO

3)

2 (Fig. 3).

Con esta técnica se genera una semillasintética consistente en un embrión so-mático recubierto con una cubiertaseminal y provisto de un endospermaartificial (Fig.1 a y b). Eventualmente es-tas cápsulas pueden ser recubiertas porsustancias tales como polioxieti-lenglicol,que sirve para mantener una adecuadahidratación de las cápsulas y embriones.Este procedimiento ha posibilitado laobtención de semillas sintéticas de nu-merosas especies de interés económico,entre las que pueden mencionarse alfal-fa, zanahoria, apio y especies forestalescomo Picea abies, Pinus radiata,Santalum album y Pseudotsuga

Tabla 1: Ejemplos de semillas sintéticas basadas en la desecación deembriones sin cubierta protectora.

Explante

Cultivo e inducción de laembriogénesis somática

Embriones somáticos

HidratadosDesecados

Gel ViscosoEncapsulado

Siembra en el suelo

1 2 3 4 5

Encapsulado

Figura 2: Tipos de semillas sintéticas.

Especie % humedad en la semilla % conversión en plantas

Apium graveolens 10-13 35-85Dactylis glomerata 13 5-30

Medicago sativa 8-20 33-95


menziesii.

3 Producción de semillas sintéticas

En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectosque deben tenerse en cuenta para la pro-ducción y manipulación de las semillas sinté-ticas.

En primera instancia es necesario contarcon un sistema eficiente de inducción deembriogénesis somática in vitro, es decir, laproducción de embriones sin la necesidad dela fusión de gametas. Estos embriones de-ben ser estructuras bipolares perfectas (conun polo que genere el vástago y el otro laraíz) capaces de convertirse («germinar») enplantas enteras (ver II.-2).

Si bien la existencia de embriogénesissomática ha sido informada en centenaresde especies de angiospermas y gimnos-permas, en muchos casos no es de utilidadpara iniciar la producción de semillas sintéti-cas debido a la baja tasa de producción deembriones aptos para la encapsulación.

En los últimos años se han hecho nota-bles avances en el conocimiento de los fac-

tores que re-gulan laembriogénesissomática. Sinembargo, enmuchos ca-sos, la basegenética deeste fenóme-no no estác o m p l e t a -mente diluci-dado. En al-falfa es un ca-rácter here-dable, codifi-cado por dosgenes domi-nantes de se-gregación in-dependien-te.

Una vezinducida laembriogénesissomática, els e g u n d o

Figura 3: A-D) Inducción de la embriogénesis somática,E))))) selección de embriones somáticos, F)inmersión de los embriones en alginato de sodio,G) acomplejamiento con nitrato de calcio, H)lavado, I) semilla sintética (i)

Inducción de la embriogénesis somática

Producción sincronizada y en gran escala de losembriones somáticos

Encapsulamiento mecanizado

Almacenamiento de las semillas sintéticas

Siembra en invernadero o a campo

Maduración de los embriones somáticos

Figura 4: Etapas en la producción de las semillassintéticas.

A B CD

E

FGH

I


paso consiste en lograr una producciónsincronizada, a gran escala, de los embriones.Es fundamental contar con embriones sim-ples, en estado cotiledonar, que no se fusio-nen entre sí y que no generen embriones se-cundarios. A fin de seccionarlos se han desa-rrollado diferentes procedimientos basadosen filtros y equipos clasificadores automáti-cos. Para la producción a gran escala se handiseñado biorreactores y sistemas mecaniza-dos de encapsulamiento adaptados a lasparticularidades de cada especie.

Gran parte de la investigación se hallacentrada en lograr una adecuada maduraciónde los embriones, que es un factor esencialpara la obtención de altos valores de con-versión en el suelo. En alfalfa se ha demos-trado la necesidad del empleo de tratamien-tos con ácido abscísico, maltosa y depretratamientos con temperaturas bajas(4ºC).

El almacenamiento de las semillas sintéti-cas es otro aspecto importante a tener encuenta. Lo ideal sería que las semillas sintéti-cas tuvieran un comportamiento similar al dela mayoría de las semillas verdaderas y per-manecieran viables por mucho tiempo. Losresultados obtenidos con semillas sintéticasde muchas especies muestran que aún hayque trabajar arduamente para que ello ocu-rra. La criopreservación con nitrógeno líqui-do (ver V.3) podría resolver este punto.

Por último, si bien muchos factores inci-den negativamente para que ello ocurra, loideal sería que la semilla sintética fuera sem-brada directamente en el suelo, rindiendoelevados porcentajes de conversión en plan-tas. Actualmente, en la mayoría de los casos,las semillas sintéticas son sembradas prime-ramente en cámaras climatizadas o en inver-naderos para luego ser llevadas al campo.

4 Calidad de la semilla sintética

Otro aspecto de gran importancia tecno-lógica es el contar con semillas sintéticas que,además de no generar variantes somaclo-nales, tengan un alto porcentaje de conver-sión en plantas cuando éstas son sembradasen el suelo. Este aspecto se ve afectado porvarios factores, entre los que figuran el tipode embrión, la calidad del endosperma sin-tético, la dureza de la cápsula y la protección

contra agentes patógenos.Generalmente, la carencia de embriones

de calidad es el factor limitante para la pro-ducción de semillas sintéticas. Los mismosdeben poder generarse rápidamente, engrandes cantidades, sin fusionarse entre sí niformar callos. Deben desarrollarse de mane-ra sincronizada y convertirse rápidamente enplantas. Es además altamente deseable queconserven su viabilidad por largo tiempo encondiciones de laboratorio o preservados enrefrigeradores comerciales.

El endosperma sintético tiene que prote-ger y nutrir al embrión hasta que germine ypueda crecer autotróficamente. En este pun-to es preciso recordar que si bien los embrio-nes somáticos son muy similares a los embrio-nes cigóticos, carecen de las sustancias dereserva necesarias para su conversión enplántulas. El endosperma sintético general-mente está compuesto de los mismos me-dios de cultivo que se usan para inducir lagerminación in vitro de los embriones. Estosmedios contienen macro y micronutrientes,vitaminas, sacarosa y sustancias reguladorasde crecimiento. La composición de esteendosperma lo hace susceptible al ataque depatógenos, por lo que también se incorpo-ran compuestos de acción fungicida ybactericida. Es común el agregado de 1-5 mg/L de benomyl y de algunos antibióticos comocefotaxina o ampicilina.

La dureza de la cápsula puede afectar, poracción mecánica o por dificultar la respiración,la conversión de los embriones en plantas.En general, la dureza debe ser del orden de0,2 y 2 Kg/cm2 de presión, y puede obtenersemediante una adecuada manipulación de laconcentración de alginato y de los tiemposde la reacción de acomplejamiento.

5 Ventajas del empleo de semillassintéticas

La mayoría de las plantas de interés eco-nómico son propagadas mediante semillasverdaderas. Estas constituyen excelentespropágulos que pueden ser producidos a bajocosto, en forma rápida, y pueden ser sem-brados mecánicamente. Además, la mayoríade ellas pueden ser conservadas fácilmentepor mucho tiempo. Sin embargo, existenmuchas plantas que no se propagan median-


te semillas verdaderas y lo hacen a través desus partes vegetativas, como es el caso, en-tre otras, de la caña de azúcar, mandioca,ajo, frutilla, papa, batata, varios árboles yplantas ornamentales. Otras especies tienensemillas de baja calidad (muchas coníferas) opresentan dificultades para la germinación(como, por ejemplo, la yerba mate). En otrasun alto grado de heterocigosis hace que laspoblaciones derivadas de semillas sean muyheterogéneas (té, yerba mate, paraíso), loque hace muy recomendable su propagaciónasexual. También es el caso de muchoshíbridos y de plantas que no producen semi-llas verdaderas o bien el caso de ciertas plan-tas transgénicas. En todas estas situacionesel uso de semillas sintéticas resultaría venta-joso. Las plantas podrán ser clonadas y sem-bradas en el campo utilizando sembradorassimilares a las que hoy se emplean con las

semillas verdaderas. Adicionalmente las se-millas sintéticas podrán actuar como trans-portadoras de reguladores de crecimiento,microorganismos y pesticidas que se quieranincorporar durante la siembra. De esta ma-nera, los costos de los transplantes se veránreducidos, las poblaciones serán gené-ticamente uniformes y podrán ser comercia-lizados ciertos híbridos resultantes de costo-sas manipulaciones manuales.

En la Tabla 2 se señalan algunas especiespara las cuales sería necesario contar con unsistema de semilla sintética.

La falta de una difusión masiva de estatecnología en la actualidad obedece a razo-nes técnicas, ya que en muchas especies aúnno se ha logrado inducir eficientes sistemasque permitan la generación de grandes can-tidades de embriones somáticos de calidad,y económicas. Los cálculos realizados en rela-

Especie Interés en contar consemillas sintéticas

Estado de desarrollode la inducción de la

EmbriogénesisSomática

Estado dedesarrollo de la

producción de lasemilla sintética

Aguaí(Chrysophyllumgonocarpum )

XXX X ---

Araucarias(Araucaria spp.)

XXX XX ---

Algarrobo(Prosopis spp)

XXX --- ---

Cítricos *(Citrus spp.)

XX XXX X

Eucaliptos*(Eucalyptus spp.)

XXX X ---

Mango(Mangifera indica)

XX X ---

Paraíso(Melia azedarach)

XXX XX X

Pinos* (Pinus spp.) XXX XX X

Quebracho(Schinopsisbalansae)

XX --- ---

Té(Camellia sinensis)

XXX XXX ---

Toona (Toonaciliata)

XXX --- ---

Yerba mate (Ilexparaguariensis)

XXX X ---

Ref.:* depende de la especie --- Nulo, X escaso, XX regular, XXX elevado

Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosassubtropicales de interés para la Argentina y estado actual de su desarrollo.


ción a alfalfa indican que su costo de produc-ción supera en casi cien veces el costo de pro-ducción de la semilla verdadera. Sin embar-go, este costo es casi similar o incluso inferioral de la producción de semillas verdaderaspara algunos híbridos de alcaucil, geranio ygerbera.

6 ConclusionesSi bien el uso de semilla sintética en la

agricultura es aún incipiente y sólo es utiliza-da en ciertos grupos de árboles forestales,las perspectivas para esta tecnología son al-tamente promisorias, pudiendo llegar a con-vertirse, en un futuro cercano, en el principalmétodo de propagación de plantas. Si bienlos progresos logrados en los últimos 20 añoshan sido notables, existe aún la necesidadde realizar estudios básicos sobre embriogé-nesis somática para luego abordar los aspec-tos «industriales» de la producción a gran es-cala de semillas sintéticas, tanto deangiospermas como de gimnospermas. En laArgentina, la mayor demanda proviene delsector de productores de plantas leñosas,donde el desarrollo de esta tecnología es aúnincipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, lacapacidad técnica y humana para encarareste desafío.


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V.-Capítulo 3

Conservación de germoplasma in vitro

Scocchi, Adriana; Rey, Hebe

1 Introducción

Desde sus inicios, el hombre ha dependi-do básicamente de los vegetales como fuen-te de energía. Al aumentar rápidamente eltamaño de la población, se han idoimplementando técnicas de explotación, enparticular agropecuarias, que han contribui-do a la destrucción de las poblaciones vege-tales pioneras, que fueron el producto de si-glos de evolución. Por otro lado, las técnicasmodernas de producción de variedadesmejoradas, altamente homogéneas, hanprovocado la reducción de la variabilidadgenética de las especies cultivadas, ocasionan-do una verdadera «erosión genética».

Es en este contexto en que se recurre alas fuentes genéticas originales de variabili-dad, las que se deben preservar adecuada-mente. Cuando se habla de preservación degermoplasma hay que subrayar que el obje-tivo es conservar, con la mayor integridadposible, la variabilidad genética de las pobla-ciones seleccionadas.

2 Métodos empleados para laconservación de germoplasma

La estrategia a seguir para la conservaciónde germoplasma depende de la naturalezadel material vegetal, y está definida por laduración de su ciclo de vida, el modo de re-producción y el tamaño de sus individuos. Deacuerdo con estas características se han in-tentado diversas alternativas de conserva-ción, que van desde el tradicional banco desemillas hasta el mantenimiento de áreas dereserva. Sin embargo, en muchos casos elmantenimiento no es posible y en otros re-sulta sumamente costoso, siendo muy ele-vados los riesgos de pérdidas por manipula-ción o desastres naturales. Por ello se ha bus-cado implantar nuevas estrategias para con-servar los recursos genéticos en una formamás eficiente.

Los métodos de conservación degermoplasma pueden dividirse en métodosin situ y métodos ex situ.

Los primeros se basan en la conservaciónde las plantas en sus hábitat naturales e in-cluyen la conservación en parques naciona-les y en reservas ecológicas, lo cual requierede un considerable espacio físico e implicaaltos costos, asociados a la necesidad demano de obra especializada, control perma-nente de enfermedades y malezas, a la parque las plantas están expuestas a las incle-mencias del clima y de los incendios. Por otraparte, los métodos de conservación ex situse basan en el mantenimiento del materialbiológico en bancos de semillas, bancos decultivo in vitro, colecciones de plantas (encampo, viveros o jardines botánicos).

En general, los bancos de semillas consti-tuyen uno de los métodos más convenien-tes para la conservación de germoplasma exsitu, porque permiten almacenar una granvariabilidad genética en forma económica ypráctica. Para la conservación de semillas elInternational Plant Genetic ResoucesInstitute (IPGRI) recomienda su desecaciónhasta un 3-7% de humedad y su almacena-miento a bajas temperaturas (-18ºC). Esteprotocolo de conservación es, en general, elmás recomendado para la mayoría de lasespecies que se propagan por semillas y cu-yas semillas resisten la desecación sin que elloimplique pérdida de viabilidad. A las semillasque presentan estas características se las de-nominan «semillas ortodoxas», como porejemplo las semillas de arroz, trigo, avena,tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, enciertos casos este método de conservaciónno es aplicable porque la especie se propa-ga, en la práctica, vegetativamente, (comola mandioca, papa, caña de azúcar, plátanosy bananos), o bien porque sus semillas pier-den rápidamente la viabilidad cuando son so-metidas a procesos de desecación. A estassemillas se las denominan «semillas recalci-trantes». Las semillas de numerosas especiesque viven en zonas tropicales o subtropicalesse incluyen en esta categoría, como por ejem-plo las de coco, cacao, frutales tropicales pe-rennes y diversas palmeras.

Otro método de conservación degermoplasma ex situ, es mediante el cultivoin vitro de tejidos. El descubrimiento de la

180 SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

totipotencialidad de las células vegetales y laposibilidad de desarrollar plantas normales ycompletas a partir de diferentes explantesha permitido pensar en el establecimientode bancos de germoplasma utilizando el cul-tivo de tejidos vegetales. Algunos de los pri-meros estudios sobre el mantenimiento invitro del germoplasma fueron realizados enmandioca en el Centro Internacional de Agri-cultura Tropical (CIAT) y en papa en el Cen-tro Internacional de la Papa (CIP). En 1980se reconoció el potencial de los métodos delcultivo in vitro para la conservación de espe-cies de plantas consideradas «difíciles» (estetérmino se refiere a las especies propagadasvegetativamente en forma obligada o quetienen semillas recalcitrantes). En estos casos,la conservación de los genotipos se realizamediante el mantenimiento de plantas vivaso mediante el cultivo in vitro de ápicescaulinares o de nudos.

El mantenimiento de los recursosfitogenéticos mediante los métodos de cul-tivo in vitro se logra generando cambios enel ambiente de cultivo que permitendesacelerar el crecimiento de las células y delos tejidos. El objetivo es aumentar al máxi-mo el período de transferencia del cultivo. Esesta necesidad la que estimuló algunos delos primeros estudios sobre el mantenimien-to in vitro del germoplasma de diversas es-pecies. Este método cubre un amplio espec-tro de técnicas que implican el cultivo, bajocondiciones de asepsia, de órganos o frag-mentos de órganos (meristemas, semillas,embriones somáticos, embriones cigóticos,hojas, tallos, raíces, yemas, polen, anteras,callos o protoplastos), en un medio de culti-vo artificial definido, bajo condiciones am-bientales controladas.

Esta técnica ha sido utilizada para man-tener colecciones en crecimiento mínimo,para lo cual se requiere: reducir la tempera-tura, reducir las condiciones de luminosidad,modificar el medio de cultivo, adicionar almismo inhibidores osmóticos o retardantesdel crecimiento, deshidratadores de tejido omodificar la fase gaseosa del recipiente decultivo. La modificación de uno o más de es-tos factores es usada para la conservación denumerosas especies, como por ejemplo parala conservación de microestacas de Manihotesculenta; de vástagos de especies de

Fragaria, Ipomoea, Rubus, Musa,Saccharum, Zingiber, Ananas, Coffea,Dioscorea y de microtubérculos de Solanum.Estas técnicas de almacenamiento se realizana mediano plazo, es decir, se basan en redu-cir el metabolismo celular y con ello reducir elcrecimiento y el número de subcultivos du-rante meses hasta un año, sin que ello afec-te la viabilidad de los cultivos.

Desde hace varios años en el Laboratoriode Cultivo in vitro del Instituto de Botánicadel Nordeste (IBONE), en la Facultad de Cien-cias Agrarias de la UNNE, se llevan a caboexperimentos referidos a la conservación degermoplasma de paraíso (Melia azedarach).Utilizando como explantes meristemas declones selectos de paraíso mantenidos duran-te 12 meses a tasas de crecimiento reducidas(medios de cultivo subóptimos o empobreci-dos y en condiciones de oscuridad) se logrómantener con éxito y regenerar plantas deparaíso que actualmente se encuentran enla etapa de evaluación a campo (Fig. 1).

En el IBONE también se realizan experi-mentos tendientes a optimizar las técnicasde conservación in vitro a largo plazo, queconsisten en el almacenamiento a la tempe-ratura del nitrógeno líquido (-196ºC) –crioconservación–, con lo cual se consigue lasupresión del crecimiento hasta llegar a unestado de «suspensión animada». En el men-cionado Instituto se ha logrado lacrioconservación de meristemas de paraísomediante la técnica de encapsulación-deshi-dratación (Fig. 1).

El uso de la crioconservación para el al-macenamiento de germoplasma ofrecen va-rias ventajas en relación con las técnicas tra-dicionales, pues permiten la conservación alargo plazo (años), con bajos costos de man-tenimiento, fácil manipulación de las mues-tras y no dependen del suministro eléctrico.

Luego del informe, en 1968, acerca de lacrioconservación de células de lino y de losresultados satisfactorios que se obtuvieroncon la crioconservación de meristemas defrutilla en el Instituto de Biotecnología dePlantas en Saskatoon, Canadá, en 1985 seiniciaron algunas investigaciones colabora-tivas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollaresta técnica para meristemas de mandioca.A partir de estos estudios numerosos traba-jos han dado muestras de la importancia deesta técnica, de sus usos y aplicaciones.


La crioconservación consta de seis pasos:

• Selección del material a crioconservarCuando se realiza la selección del mate-

rial a crioconservar se debe tener la absolutaseguridad de que a partir del mismo se ob-tendrán plantas completas. El explante se-leccionado dependerá del objetivo de con-servación y está estrechamente relacionado

con el tipo de pro-pagación de la es-pecie. Por ejem-plo, en el caso dela mandioca, es-pecie que se pro-paga principal-mente por víaasexual (medianteestacas), en elCIAT se conservasu germoplasmain vitro medianteel cultivo de micro-estacas y tambiénde meristemas,con lo cual parale-lamente a la con-servación se consi-gue el saneamien-to de los culti-vares. Actualmen-te se están reali-zando estudiostendientes a desa-rrollar protocolospara la crio-conser-vación de meris-temas.

•Deshidrata-ción

La deshidrata-ción del explantees un paso crucialpara el éxito de lacrio-conservación,ya que es necesa-rio eliminar toda elagua libre presen-te en el tejido ve-getal, minimizan-do así posibles da-ños debidos a con-

gelación. La deshidratación del tejido puederealizarse en una cámara a 0ºC o en cámarasherméticamente cerradas utilizando sustan-cias higroscópicas como silica gel o glicerol (5- 20%), o sometiendo al explante a una co-rriente de aire en un flujo laminar de aire es-téril.

• Aclimatación

Figura 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarachL.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE.Facultad de Ciencias Agrarias. UNNE.


La aclimatación puede realizarse en for-ma rápida o lenta. La aclimatación rápidaconsiste en colocar el explante directamenteen nitrógeno líquido, con o sin la adiciónexógena de crioprotectores. La aclimataciónlenta se realiza bajando gradualmente la tem-peratura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe sermanejado cuidadosamente, pues una deshi-dratación excesiva de las células puede expo-nerlas a una alta concentración interna desolutos. Por esta razón, el material general-mente se congela lentamente, a una veloci-dad adecuada, hasta alcanzar una tempera-tura próxima a los -40 ºC. Luego se lleva di-rectamente a la temperatura del nitrógenolíquido (-196 ºC).

A fin de preparar (aclimatar) el explantepara enfrentar las bajas temperaturas a lasque será sometido, se utilizan sustanciascrioprotectoras como azúcares (sacarosa, glu-cosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitoly sorbitol), dimetilsulfóxido (DMSO) ypolivinilpirrolidona (PVP). También puedenutilizarse soluciones de vitrificación, que sonuna combinación de varios crioprotectorestales como el PVS2, que está compuesto por30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% deDMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto loscrioprotectores como las soluciones devitrificación actúan fundamentalmente comoagentes anticongelantes, aumentando la vis-cosidad del tejido vegetal y reduciendo lapermeabilidad de las células.

• AlmacenamientoDe acuerdo al material vegetal que se uti-

lice, se presentan dos grandes sistemas:

- Sistemas secos: comprenden todosaquellos tejidos vegetales endógenamenteresistentes y tolerantes a las bajas tempera-turas y a la deshidratación.

- Sistemas hidratados: son todos aque-llos tejidos vegetales no tolerantes a las ba-jas temperaturas y a la deshidratación, porlo cual se requiere de una protecciónexógena. Esta protección puede lograrse através del uso de crioprotectores o bien porla utilización de soluciones de vitrificación.

Los sistemas secos, por tratarse de teji-dos más resistentes, necesitan de una me-

nor preparación para el almacenamiento ycomprenden aquellas especies que habitanzonas frías y/o templadas. En cambio, los sis-temas hidratados son más susceptibles a lasbajas temperaturas y están representadospor todas aquellas especies que habitan zo-nas tropicales y subtropicales, las cuales noestán adaptadas para soportar temperatu-ras inferiores a 0ºC. Por este motivo estos te-jidos deben ser protegidos exógenamentemediante el uso de crioprotectores.

• Descongelamiento y rehidrataciónCuando se desea recuperar el explante

mantenido en nitrógeno líquido se puederealizar un descongelamiento rápido en bañode agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 ºC)o en forma lenta, sometiendo al explante ala temperatura del laboratorio o a una co-rriente de aire en el flujo laminar de aire es-téril.

• Tests de viabilidadLos tests de viabilidad nos permiten com-

probar la/s zona/s del tejido que ha/n muer-to y cuál/es ha/n sobrevivido al frío. La eva-luación de la viabilidad puede llevarse a caboen forma visual, realizando el re-cultivo y de-terminando la capacidad de regeneración,utilizando TTC (cloruro de 2,3,5–Trifenil-Tetrazolio) que colorea el tejido que ha so-brevivido a la crioconservación o midiendo laconductividad eléctrica, que permite estimarel daño producido en las membranas celula-res.

• Técnicas de almacenamiento del ma-terial a preservar

En la última década han surgido numero-sas técnicas que combinan el uso decrioprotectores y de soluciones de vitrificacióncon técnicas de deshidratación yencapsulación, las cuales básicamente pue-den resumirse en técnicas de:

- Encapsulación-deshidratación- Vitrificación- Encapsulación-vitrificación- Desecación- Precultivo- Precultivo-desecación- Gotita congelada.

En la Tabla 1 se detallan las especies y


GotitaCongelada

Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum.

TécnicaEmpleada

Explante y Especie

Suspensiones celulares de Catharanthus roseus.Meristemas de 125 variedades de Solanum spp.Meristemas de Dioscorea alata, Malus domestica, Pyrus spp. yMorus spp.Apices de Pyrus spp., Malus spp., Saccharum spp. y SolanumtuberosumApices caulinares de Camellia japonica, Coffea racemosa xCoffea sessiliflora, Citrus spp, y de Saccharum spp.

Encapsulación-Deshidratación

Embriones somáticos de Elaeis guineensis.Células nucelares de Citrus sinensis.Líneas celulares embriogénicas de Pinus silvestris.Suspensiones celulares y callos embriogénicos de Gossypiumhirsutum.Meristemas de Pyrus communis, Malus spp y de Pyrusspp., Ipomoea batata, Manihot esculenta (15 genotipos),Prunus spp., y de Solanum spp.Meristemas, polen y anteras de Arachis hypogaea.Ápices de Ananas comosus, Colocasia esculenta.Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart., Populus alba.Semillas de Bletilla striataSemillas y protocormos de Dendrobium candidum.Suspensiones celulares embriogénicas de Oryza sativa.Embriones somáticos de Abies cephalonica

Vitrificación

Semillas, embriones cigóticos, polen, anteras y suspensionescelularesde Triticum spp.Meristemas, segmentos nodales, segmentos de raíz y yemasadventicias de Guazuma crinita, y de Fragaria x ananassa .Encapsulación-

Vitrificación Apices de Dyanthus cariophyllus, Armoracia rusticana,Lilium spp. y de Wasabia japonicaMeristemas de Morus spp.Embriones somáticos de Cucumis melo, y de Elaeis guineensisEmbriones somáticos y ejes embriogénicos de Camellia japonica.Ejes embriogénicos de Junglans cinerea.Ejes embriogénicos y semillas de Gossypium hirsutum.

Desecación

Semillas de Pinus silvestris, y de Apium graveolens.Meristemas de Musa spp.Embriones cigóticos de Triticum aestivum, Phaseolus vulgarisy Oryza spp.Polen y anteras de Oryza spp

Precultivo

Líneas celulares y callos de Oryza sativa.

Precultivo-Desecación

Embriones somáticos de Phoenix dactylifera, Coffea spp.,Pyrus spp., Cucurbita spp., Cocos nucifera, y de Elaeisguineensis (aplicada como rutina a 80 clones).

Tabla 1: Utilización de técnicas de crioconservación en diferentes explantes de algunas especies de interés agronómico.

explantes en los cuales cada una de estastécnicas ha sido empleada con resultadossatisfactorios.

-Encapsulación-DeshidrataciónLa técnica de encapsulación-deshidrata-

ción se basa en la metodología aplicada a las

semillas sintéticas, en la cual un explante esrecubierto por una matriz de alginato desodio y polimerizado en una solución de clo-ruro de calcio, formando un gel de alginatode calcio alrededor del explante. Una vezencapsulados, los explantes son pretratados,generalmente con sacarosa (desde 0.3 has-


ta 1.5M), que actúa como crioprotector. Enespecies tolerantes al frío la exposición de lasplantas madres a bajas temperaturas duran-te varias semanas, previo a lacriopreservación, incrementa la supervivencia.

La deshidratación puede llevarse a cabosometiendo las cápsulas de alginato (conte-niendo a los explantes) a una corriente deaire en el flujo laminar o exponiéndolas encámaras herméticamente cerradas con silicagel. Las cápsulas, así deshidratadas, puedensumergirse directamente en nitrógeno líqui-do o bien pueden ser llevadas a un descensolento de temperatura.

- VitrificaciónEsta técnica involucra el pretratamiento

de las muestras con soluciones de vitrificación,como el PVS2, ya mencionado, o bien otra,compuesta por 40% de etilenglicol, 15% desorbitol y 6% de albúmina sérica bovina.

Luego de la exposición a las soluciones devitrificación (generalmente a una temperatu-ra de 0ºC, a fin de disminuir los riesgos defitotoxicidad), las muestras pueden ser sumer-gidas directamente en nitrógeno líquido o através de un descenso lento de la tempera-tura. Las soluciones crioprotectoras recomen-dadas en los protocolos de vitrificación songeneralmente tóxicas para las células. El tiem-po de exposición a la solución debe estar re-lacionado con el tamaño del explante y lamisma debe ser removida rápidamente lue-go del descongelado.

- Encapsulación-VitrificaciónLa técnica de encapsulación-vitrificación es

una combinación de las técnicas deencapsulación-deshidratación y vitrificación.Las muestras son encapsuladas en alginatode calcio y sometidas a vitrificación duranteel enfriamiento. La supervivencia del mate-rial vegetal cuando se utiliza esta técnica esun 30% mejor que cuando se usa la deencapsulación-deshidratación. Esto puedeexplicarse debido a que las cápsulas dealginato de calcio reducen la toxicidad de lassoluciones de vitrificación.

- DesecaciónLa técnica de desecación es un proceso

muy simple que sólo requiere la deshidrata-ción del material vegetal, la cual es crucial para

el éxito de la crioconservación. Esta técnicaconsiste en someter al explante a una corrien-te de aire en un flujo laminar o en cámarasherméticamente cerradas, que contienensilica gel, luego de lo cual se realiza un enfria-do rápido sumergiendo el material directa-mente en nitrógeno líquido.

- PrecultivoLa técnica del precultivo involucra la incor-

poración de crioprotectores (durante distin-tos tiempos que dependen del explante)antes del congelamiento. Como ejemplospueden citarse la adición de altas dosis desacarosa para la crioconservación demeristemas de Musa spp.; la utilización depolietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso deembriones cigóticos de Triticum aestivum yPhaseolus vulgaris; la utilización de sacarosay DMSO o glicerol en semillas, embrionescigóticos, polen y anteras de Oryza spp., y lautilización de ácido abscísico para la conser-vación de líneas celulares y de callos de Oryzasativa.

- Precultivo-DesecaciónEsta técnica es una combinación de dos

de las técnicas descriptas anteriormente. Lasmuestras son tratadas con crioprotectores,parcialmente desecadas y luego sometidas aenfriamiento rápido o lento. Generalmenteen el precultivo se emplean azúcares comosacarosa o glucosa. La duración del tratamien-to es variable, desde horas, como en el casode la conservación de embriones maduros deCocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20hs., hasta días, como en el caso de embrio-nes somáticos de Elaeis guineensis, que dura7 días.

- Gotita congeladaEsta técnica ha sido aplicada con éxito en

ápices de Solanum tuberosum. Consiste enpretratar el material con DMSO por 2-3 hs.en medio líquido y formar una microgota (2.5ml), la cual se suspende sobre papel de alu-minio y luego se sumerge directamente ennitrógeno líquido. Este procedimiento es unaadaptación de la técnica clásica desarrolladapara meristemas de mandioca.

Esta técnica ha sido satisfactoriamenteaplicada en 150 variedades de Solanumtuberosum, con un porcentaje de superviven-cia del 40%.


3 Conclusiones

Los recursos fitogenéticos constituyen unreservorio de información genética imprescin-dible para la solución de muchos de los pro-blemas a los que se enfrenta la agricultura.Los métodos para asegurar su conservaciónson diversos y cada uno de ellos posee susventajas e inconvenientes. Por ello, se consi-dera que el conjunto de técnicas de conser-vación in situ y ex situ son métodos comple-mentarios, no excluyentes, para lograr elobjetivo común de preservar los recursosfitogenéticos, como parte esencial de unaestrategia global para la conservación de labiodiversidad.

En la última década se han producidoavances significativos en el desarrollo de téc-nicas in vitro de conservación. La disponibili-dad de bancos de germoplasma in vitro, tan-to en condiciones de crecimiento lento comola conservación a temperaturas ultrabajas(crioconservación), han contribuido a dichoavance. Las ténicas de crecimiento lento sonutilizadas como rutina en centros internacio-nales tales como el CIAT (Cali, Colombia),donde se aplican a la conservación degermoplasma de mandioca y para la conser-vación de germoplasma de papa en el CIP(Centro Internacional de la Papa, Perú). Las

técnicas de crioconservación ofrecen una al-ternativa muy valiosa cuando se piensa enconservar los recursos fitogenéticos por tiem-po ilimitado (años), si bien hasta el momen-to sólo se aplica como rutina para la conser-vación de líneas celulares en laboratorios deinvestigación y para la conservación de algu-nos genotipos pertenecientes a los génerosRubus spp., Pyrus spp., Solamun spp. yElaeis guineensis.


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PARTE VIMétodos de análisis de la

variabilidad

188 OLMOS, Sofía y DI RENZO, Miguel


VI.-Capítulo 1

Consideraciones estadísticas ybiológicas para estimar variabilidadgenética

Olmos, Sofía; Di Renzo, Miguel

1 La variación biológica

La variabilidad genética es un hecho uni-versal en las poblaciones reproductivas y unacondición preliminar necesaria para el cam-bio evolutivo y para la respuesta al mejora-miento genético mediante selección o hibri-dación. Por otra parte son conocidos los pe-ligros que implica la uniformidad y la falta dediversidad en las especies cultivadas y en losanimales domésticos, como consecuencia dela erosión genética.

La variación que presentan los individuosde una población puede ser discontinua ocontinua. Los caracteres cualitativos de va-riación discontinua, como los marcadoresmoleculares, permiten clasificar a los indivi-duos sin ambigüedades, ya que estos carac-teres están regidos por uno o por pocosgenes y el ambiente no tiene efecto en sumanifestación fenotípica. En cambio, los ca-racteres cuantitativos, representados por lamayoría de los caracteres de interés agronó-mico, presentan variación continua y losfenotipos, que están determinados porpoligenes y por efectos ambientales, son di-fíciles de clasificar en categorías discretas. Parasu análisis deben emplearse métodosbiométricos, que no miden el efecto de genesindividuales o de segmentos cromosómicosespecíficos, sino de todo el genoma.

Durante los últimos años ha surgido unconsenso entre los mejoradores y genetistasmoleculares sobre la conveniencia del uso demarcadores moleculares para asistir a la se-lección de caracteres cuantitativos (MAS,Marker Assisted Selection). La biotecnologíaha colaborado mediante la construcción demapas genéticos saturados, esto es, con in-numerables marcadores moleculares a lo lar-go de los cromosomas, que permiten ubicarregiones de actividad cuantitativa (QTL,Quantitative Trait Loci). De esta manera, un

carácter de variación contínua puede sermanejado como si se tratara de un carácterde herencia mendeliana mediante laintrogresión de un fragmento de cromosomaconteniendo un QTL por retrocruzamientossucesivos en las variedades comerciales. LosQTL representan un nuevo sistema de enfo-car el estudio básico y el manejo práctico delos sistemas poligénicos y de la genética cuan-titativa.

2 Experimento científico

La ciencia, que tiene como objetivo laexplicación y la predicción de los hechos, cuen-ta con el método científico como un proce-dimiento que contempla un proceso en flu-jo desde los hechos observados hasta laproposición de hipótesis explicatorias. Unrequisito fundamental en toda ciencia fácticaes la contrastación de las hipótesis plan-teadas, poniendo a prueba las mismas me-diante una confrontación con la experiencia.El diseño experimental crea artificialmentelas condiciones para la contrastación de la hi-pótesis y brinda la metodología estadísticacorrespondiente para el análisis de los datos.

El experimento científico, que como que-da dicho es un ensayo destinado a probar lavalidez de una hipótesis, se basa en la repro-ducción de ciertos fenómenos bajo condicio-nes controladas con el objeto de medir elefecto que produce la modificación de uno ovarios factores en estudio (tratamientos) so-bre la variable dependiente.

El ensayo, cuidadosamente diseñado,deberá ser lo más simple posible, evitandolos errores tendenciosos y sistemáticos(biass=sesgo) de manera tal que los datosrecavados provean conclusiones con un am-plio rango de validez. Por otra parte, paramagnificar el efecto de los tratamientos ydisminuir el error experimental, se procuraminimizar el efecto de otros factores no con-trolados que ejercen influencia en las obser-vaciones. Esto se logra utilizando materialesy condiciones experimentales lo más homo-géneas posibles. De esta manera, las varia-ciones observadas se deberán casi exclusiva-mente a los tratamientos.

Para conocer el efecto de los factorescontrolados y el de los factores no contro-lados (error experimental) sobre el material


experimental es necesario formular claramen-te una hipótesis, utilizar un diseño experi-mental apropiado y analizar e interpretar losresultados obtenidos.

Por ejemplo, la aplicación de distintos tra-tamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante= causa), producen variaciones sobre una ca-racterística de interés (ej. rendimiento = efec-to):

Terminología

- Factor: es la causa cuyo efecto se quieremedir (ej. fertilizante, competencia, medio decultivo)

- Nivel: es cada una de las categorías oalternativas del factor en estudio (ej. dosisde un fertilizante, densidades de siembra, pHde los medios de cultivo).

- Tratamiento: Es cada nivel del factor enestudio. Si se estudia el factor fertilizante,cada dosis (o nivel) es un tratamiento distin-to. Si se prueba el efecto de concentracionescrecientes de un fertilizante los tratamientostendrían un orden natural (discreto ordinal);pero si se prueban distintas combinacionesde fertilizantes (NPK), no habría un ordenentre los tratamientos (discreto categórica).Cuando se estudian dos (o más) factores si-multáneamente, los distintos tratamientosresultan de la combinación de cada nivel deun factor con cada nivel del otro factor. Porejemplo, si se estudia el efecto de fertilizan-te y competencia, cada tratamiento resultade la combinación de una dosis de fertilizan-te y una densidad de siembra determinada.

- Variable independiente: es la causa queafecta los resultados del experimento y estárepresentada por los distintos niveles del fac-tor cuyo efecto se quiere medir (tratamien-tos) o que se quiere controlar (bloques).

- Variable dependiente: variable respues-ta o simplemente «variable» es el rasgo ocarácter de interés cuyas mediciones consti-tuyen los datos u observaciones del experi-mento. Ej. rendimiento (kg./ha), diámetrode colonia (mm); (variables continuas), tiem-po a panojamiento (días), tamaño de cama-da, número de colonias (número), grado derespuesta a un patógeno (tolerante, inter-medio, susceptible), (variables discretas). Lavariación de estos datos permite cuantificarel efecto del factor al que está sometido elmaterial.

3 Hipótesis estadística

Como se indicara previamente, el experi-mento científico es un ensayo destinado aprobar la validez de una hipótesis. Las hipó-tesis estadísticas plantean supuestos referen-tes a algún parámetro poblacional. Por logeneral se utiliza la hipótesis nula (Ho), quese refiere a la igualdad entre los parámetrosprobados. Frente a la Ho se plantea una hi-pótesis alternativa (Ha).

Para determinar si un tratamiento tuvoalgún efecto, se considera a la Ho como laausencia de efectos, lo que equivale probarla igualdad entre las medias de los tratamien-tos. La Ha plantea que al menos una de lasmedias difiere significativamente del resto, osea que al menos uno de los niveles del fac-tor probado tiene efecto sobre la variable deinterés. Las hipótesis estadísticas tambiénprueban otras características poblacionales,como por ejemplo la igualdad entre varianzaso entre coeficientes de regresión.

El ensayo y las pruebas de significanciapermiten calcular la probabilidad a favor dela hipótesis nula. Es decir que P es la probabi-lidad que la Ho sea verdadera. Si la probabili-dad calculada es igual o mayor que un nivelde significancia preestablecido (de 0,05 porejemplo), la Ho no se rechaza y se infiere queno hay diferencias significativas entre lasmedias de los tratamientos. Se concluye quelos tratamientos no tienen efecto significati-


vo en la variabilidad del carácter estudiado ylas diferencias observadas no son mayoresque las que se producirían por azar. En cam-bio si la probabilidad calculada es pequeña(P≤0,05) se rechaza la Ho y se infiere, deacuerdo con la Ha, que hay diferencias signi-ficativas entre los tratamientos. Si P≤0,01 sedice que las diferencias son altamente signi-ficativas.

El nivel de significancia, generalmentedesignado por α, representa hasta qué pun-to, en términos de probabilidad, estamosdispuestos a aceptar un error de tipo I, esdecir, rechazar una Ho que sea verdadera.Esto conlleva a que aceptemos una Ho comoverdadera con una probabilidad 1-α. Si se fijaα = 0,05 estamos dispuestos a aceptar el errortipo I aproximadamente una de cada 20 ve-ces.

4 Análisis univariado

Los análisis univariados emplean una va-riable dependiente, mientras que los análisismultivariados comparan muestras sobre labase de dos o más variables que están rela-cionadas.

La significancia estadística de una diferen-cia entre dos medias puede verificarse me-diante una prueba t o mediante una pruebaF. Ambas son equivalentes, t2 = F. La pruebaF, que es un cociente de varianzas, es unageneralización de la prueba t, especialmenteútil cuando se comparan más de dos trata-mientos. En el análisis de la varianza (ANOVA),por ejemplo, se utiliza la prueba F para verifi-car la igualdad de medias.

Prueba FUna prueba F consiste en un cociente

entre dos varianzas:F = s2

entre / s2dentro

Para realizar la prueba F resulta necesariodescomponer la varianza total (s2

total) en doscomponentes: s2

entre y s2dentro

El análisis de la varianza es un procedi-miento aritmético que permite la descompo-sición de la varianza total en varianzas par-ciales. El cociente entre las varianzas permiteobtener un valor de F calculado (Fc), el cualse compara con un F de tabla (Ft) para undeterminado nivel de significación (por ejem-plo α = 0,05) y los grados de libertad de lostratamientos y del error. Los programas decomputación calculan directamente el P (laprobabilidad) del test.

Varianza totalSe puede considerar a la variación total

como la resultante de dos fuentes de varia-ción: una fuente de variación debida a lasdiferencias entre grupos o tratamientos, se-ñaladas por los promedios de éstos y otradebida a la diferencia dentro de los trata-mientos, que se calcula sobre la base de lasdiferencias entre las observaciones de cadatratamiento.

Varianza entre tratamientosPara aislar la variación entre los grupos

necesitamos suprimir la variación dentro delos tratamientos. Podemos obtener este re-sultado haciendo a todos los individuos deun mismo grupo iguales entre sí e iguales a lamedia del grupo. Mediante esta operación,la variación entre los grupos no se modificamientras que toda la variación dentro delgrupo queda anulada.

Varianza dentro de tratamientosPara obtener la varianza dentro de los

grupos debemos tener en cuenta solamen-te la variación entre las observaciones de unmismo tratamiento. La variación dentro deun tratamiento se debe a las desviacionesque presentan los valores individuales en esegrupo en relación con la media de ese grupo.

5 Análisis multivariado

El análisis multivariado brinda los méto-dos estadísticos para el análisis conjunto dedos o más variables que pueden estarinterrelacionadas. Esta rama de la estadísti-ca comprende procedimientos y técnicaspara la síntesis, la presentación y el análisismultidimensional de caracteres, tanto cuali-tativos como cuantitativos, obtenidos a par-


tir de un número de individuos, una OTU«Operational Taxonomic Unit», objetos otratamientos.

Debido a que las variables se consideranen forma simultánea, estas técnicas permi-ten realizar interpretaciones más complejasa las que surgen mediante la utilización demétodos univariados. El análisis multivariadocolabora en la comprensión más adecuada ycompleta de las ciencias biológicas; por talmotivo, en este capítulo se brindará un pa-norama simplificado y algunos comentariossobre las técnicas más usuales con la finali-dad de poder discernir y elegir la metodolo-gía más apropiada para analizar la informa-ción que se disponga.

Hay algunas razones que justifican el aná-lisis conjunto de diferentes variables en lugarde analizar cada variable separadamente pormétodos univariados. Por ejemplo, cuandose trata de probar hipótesis mediante pro-cedimientos de inferencia estadística. En estecaso, la aplicación del análisis univariado acada una de las variables aumenta el errorTipo I mientras que la aplicación del análisismultivariado preserva el valor de α y aumen-ta en muchos casos el poder del test (1-β). Elanálisis multivariado utiliza las relaciones (co-rrelaciones) entre las variables o entre losobjetos que el método univariado directa-mente no considera. El análisis multivariadoaprovecha estas relaciones para buscar en losdatos patrones o estructuras enriqueciendoasí la descripción de los mismos. En el capítu-lo siguiente (VI.2) se desarrollarán en más de-talle algunas metodologías multivariadas,seleccionandose aquellas que se utilizan conmucha frecuencia y que no requieren dema-siados conocimientos previos.

Análisis exploratorio y confirmatorioCon los datos provenientes de observa-

ciones realizadas sobre un hecho en particu-lar es necesario, en primer lugar, realizar unanálisis exploratorio. Posteriormente, me-diante las inferencias realizadas a partir deeste análisis y con la información que se pue-da disponer acerca de los mecanismos queoriginan el proceso biológico, es posible de-sarrollar un análisis confirmatorio y así plan-tear un modelo descriptivo de causalidad, elque, a su vez, es confirmado mediante unaprueba de bondad de ajuste.

En otras palabras, toda investigación lle-vada a cabo especialmente en áreas nuevas,donde existen pocos antecedentes, comien-za con una exploración de los datos con elobjeto de reconocer cualquier estructura opatrón no aleatorio que requiera una expli-cación. En una segunda etapa, es posible quesurja la necesidad de formular la pregunta,lo cual es a menudo más interesante que bus-car la respuesta subsiguiente, ya que el ob-jetivo primordial es, en primer lugar, generarhipótesis interesantes que promuevan estu-dios más avanzados. En este caso, los méto-dos que están diseñados para responder apreguntas específicas no serían necesarios. Encambio resultarían apropiados aquellos mé-todos que puedan detectar un patrón decomportamiento no previsto en los datos yque, además, abran un amplio campo de po-sibles explicaciones del proceso. Estas técni-cas generalmente se caracterizan por el én-fasis puesto en la utilización de representa-ciones visuales y gráficas y por la carencia demodelos estocásticos, donde la significaciónestadística de los resultados pierde importan-cia.

La aplicación de los análisis confirmatoriosse vuelve más apropiada cuando el investi-gador tiene en mente hipótesis bien defini-das. Es aquí donde son necesarias las prue-bas de significación estadística. Sin embargo,no existe una división muy estricta entre téc-nicas exploratorias y confirmatorias. Por ellosería importante que el investigador tengauna perspectiva flexible y pragmática paraanalizar sus datos y una experiencia suficien-te que le permita elegir la herramienta analí-tica adecuada. El error más grave que se po-dría realizar en este sentido sería arribar aconclusiones que expliquen causas a partir dedatos exploratorios y descriptivos sin haberrealizado ningún tipo de diseño experimen-tal para probarlos. Se plantea como causaprobable de esta tendencia generalizada elmal uso semántico entre las terminologías es-tadísticas y las biológicas. El uso estadísticode términos como «efectos» o «variable in-dependiente» no implica causalidad.

Síntesis de métodos: objetivos y limita-ciones

Los análisis multivariados más comúnmen-te adoptados, en orden decreciente, son:


análisis de componentes principales, análisisde funciones discriminantes, análisis deagrupamientos o clusters, regresión múltiple,análisis multivariado de la varianza, análisisde correspondencia, coordenadas principa-les, análisis factorial, correlación canónica,modelos logarítmicos lineales, escalamientomultidimensional, y la regresión logística múl-tiple.

En la Tabla 1 se mencionan los objetivosgenerales de los métodos de análisismultivariado más utilizados. Los procedimien-tos enumerados del 1 al 7 utilizan combina-ciones lineales de las variables, estos méto-dos son más eficientes con datos continuos,mientras que aquellos mé-todos enumerados del 8 al12, comprenden métodosno lineales y son más apro-piados cuando se cuentacon datos binarios.

Los métodos linealesson apropiados cuando sequiere interpretar combi-naciones óptimas de varia-bles (por ejemplo, compo-nentes principales en ACP(análisis de componentesprincipales), factores en AF(análisis factorial, funcionesdiscriminantes en AD (aná-lisis discriminante). Quienesaplican métodos lineales,usualmente asumen quelos valores de las variablesincrementan o decrecenregularmente y que entreellas no hay interacciones.Estas relaciones no linealesen el MANOVA aparecenen los términos de lasinteracciones y pueden re-velar efectos no lineales im-portantes en el análisis dedatos experimentales.Para examinar con mayoreficiencia datos binarios(presencia/ausencia) y da-tos en rangos, se puedenusar otros modelos dondelas variables se combinanacordes con funciones no

lineales. Cuando se utilizan combinaciones devariables hay que considerar que el coeficien-te que afecta a una variable representa lacontribución de esta variable a la combina-ción lineal y que este valor depende de lasotras variables incluidas en el análisis. No seconsidera correcto el empleo de estos coefi-cientes individuales para la interpretación dedichas correlaciones.

Antes de aplicar cualquier técnica de aná-lisis resulta imprescindible realizar un exameninicial de los datos. El examen inicial, básica-mente, consiste en la evaluación de datosfaltantes, identificación de «outliers» (fueradel rango o fuera de tipo) y cuando el análi-

Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de análisis multivariados máscomúnmente utilizados.


sis multivariado a emplear así lo requiera, ve-rificar si se cumplen los supuestos básicos denormalidad, homogeneidad de varianzas,independencia de error y linealidad.

Por otro lado, y al igual que en el análisisunivariado, hay que tener precauciones conel uso del nivel de significancia (α) que seadopte, de las subsiguientes inferencias es-

tadísticas y de las conclu-siones a que se arriba lue-go del análisis. Las conclu-siones confirmatorias sola-mente se justifican si losestudios estuvieron basa-dos en un muestro apro-piado. Esto significa que lainferencia está justificadaen relación a la forma enque los datos fueron to-mados y en que el experi-mento fue realizado, másque en la técnica de análi-sis en sí misma.

Las inferencias sólo es-tán justificadas cuando losdatos son tomados deuna muestra grande y biendefinida. Cuando esto noocurre, los valores de pro-babilidad directamenteno se deberían informar ylas conclusiones a las quese arriba sólo deberían li-mitarse a los datos utiliza-dos y a las condiciones enlas que se desarrolló el ex-perimento. De la mismamanera resulta poco acon-sejable elaborar generali-zaciones demasiado am-plias cuando los estudiosse realizan sobre casosparticulares o específicosque no son representati-vos.

A menudo sucede queel investigador prefiere onecesita interpretar las va-riables en forma separadacuando maneja un grupode variables correlaciona-das. En estos casos seríamás apropiado utilizar mé-

todos univariados, con el complemento depruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embar-go, cuando sea posible, la consideración con-junta de las variables, mediante la aplicacióndel análisis multivariado, puede brindar con-clusiones más fuertes que las logradas a tra-vés de un grupo de comparaciones simples.Si se tiene cuidado durante el proceso de in-


terpretación de resultados, las combinacio-nes de variables (componentes, factores, etc.)podrían ser de significativa importancia paraestudiar un proceso. El uso racional de la es-tadística multivariada, el modelamiento y elconocimiento biológico pueden ayudar al in-vestigador a diseñar con criterio un experi-mento crucial y a llegar a conclusiones consis-tentes.

Como dijimos anteriormente, el análisismultivariado aprovecha las relaciones entrelas variables para buscar patrones o estruc-turas en los datos. En este sentido, podríaencontrarse un origen de patrones cuandose realizan mediciones sobre grupos de ob-jetos similares. Pueden existir casos donde nose conoce a priori si los grupos están ya for-mados, cuántos son, o cuáles objetos perte-necen a cada grupo; es allí donde habría quever qué tipo de análisis es más apropiado.

En general, en esta etapa se podrían usarmétodos como los de ordenamiento de ob-jetos (donde se logra la reducción de dimen-siones entre las variables o entre objetos auna o pocas dimensiones). Otra posibilidades hacer análisis de agrupamientos donde losobjetos se clasifican en categorías jerárqui-cas sobre la base de matrices de similitudentre los mismos. En el primer caso, los obje-tos son representados en un espacio gráficoen los cuales los ejes constituyen gradientesde combinaciones de variables. El método deanálisis de componentes principales (ACP),que es un ejemplo de análisis por ordena-miento, utiliza para tal fin las estructuras delos autovectores (también llamados eigensó raíces latentes) de la matriz de correlacióno bien de una matriz de varianza-covarianzaentre las variables originales.

El ACP y el análisis factorial (AF) tienencomo objetivo encontrar una estructura mássimple reduciendo la dimensionalidad de lasvariables sin perder información. Para simpli-ficar el análisis de los datos se reduce el nú-mero de variables a un pequeño número deíndices o factores. Algunas diferencias entreestas dos técnicas son que las componentesprincipales están definidas como una combi-nación lineal de la variables originales y noestán basadas en un modelo estadístico par-ticular y por lo tanto no se requiere el cumpli-miento de supuestos previos. En el AF lasvariables están expresadas como una combi-

nación de factores, está basado en un mo-delo especial y requiere el cumplimiento dedistintos supuestos. Por otra parte median-te el ACP se busca explicar una gran parte dela varianza total, mientras que con el AF seenfatiza el estudio en las relaciones entre lasvariables explicadas con las covarianzas o co-rrelaciones. El AF resulta apropiado cuandoel objetivo consiste en encontrar un grupode variables similares, altamente correla-cionadas, y postular que esas similitudes pro-vienen del hecho de que éstas son variables«latentes o factores» que actúan en formaparticular sobre el proceso estudiado.

Cuando el investigador está interesadoen definir grupos homogéneos de objetos yestudiar la estructura natural de las observa-ciones puede aplicar el análisis de clusters. Elobjetivo consiste en descomponer un con-junto de objetos en dos o más grupos basa-dos en la similitud de los objetos debido auna serie de características especificadas. Eluso tradicional de clusters ha sido para pro-pósitos exploratorios. Dado que no es unatécnica de inferencia estadística, para que losclusters de objetos exhiban la mayor homo-geneidad interna y la mayor diferenciaciónentre clusters sólo se requiere que la mues-tra sea representativa y que las variables nosean multicolineales. En este análisis, además,sólo se deben incluir aquellas variables quecontribuyan a caracterizar los objetos y quese encuentren relacionadas con los objetivosdel análisis. Este análisis es similar al AF, ladiferencia es que éste agrupa a variables,mientras que el análisis de clusters agrupa aobjetos. Se recomienda que un análisis declusters sea posteriormente complementadocon un análisis de funciones discriminantes(AD) sobre los grupos previamente identifi-cados.

El escalamiento multidimensional (EMD),involucra una serie de técnicas que ayudan alanalista a identificar dimensiones subyacen-tes en la evaluación de objetos. Es especial-mente utilizado en ciencias del comporta-miento, ya que permite identificar dimensio-nes no conocidas que afectan el comporta-miento. Se basa en evaluaciones comparati-vas de objetos cuando las bases de compa-ración son desconocidas o indefinibles. Setransforma el comportamiento de quienesperciben los objetos en distancias, las que fi-


nalmente se representan en un espaciomultidimensional. Si bien mediante el análi-sis de clusters los objetos se agrupan de acuer-do con sus características, con el EMD no seenfoca el interés en los objetos en sí sino másbien, en cómo éstos son percibidos. Esta téc-nica mide la correlación o covarianza de losestímulos derivados de las características delos objetos a ser evaluados. Así, las represen-taciones gráficas enfatizan las relaciones en-tre los estímulos que se estudian.

El análisis de correspondencia (AC) es unprocedimiento de ordenación apropiadopara datos de frecuencias (tablas de contin-gencia). En este caso, la distinción entre ob-jeto y variable es menos relevante porqueéstos son ordenados en forma simultánea.

Cuando los objetos o individuos se reúnenen dos o más grupos, definidos a priori, fre-cuentemente se plantea el problema decómo describir las diferencias entre grupossobre la base de un conjunto de variables. Elpropósito básico del AD es estimar la rela-ción que existe entre una variable dependien-te cualitativa (machos vs. hembras ogenotipos resistentes vs. genotipos suscep-tibles) y entre un grupo de variables indepen-dientes cuantitativas con distribución normal.Lo mismo que en el caso de ACP y AF, el ADse basa en la posibilidad de encontrar unacombinación lineal de las variables originales.Como característica, el AD permite identifi-car aquellos grupos ya formados a los cualespueden ser asignados nuevos objetos en es-tudio (individuos, genotipos). Posibilita ade-más la identificación de cuál o cuáles de lasvariables independientes contribuye más ala diferenciación entre grupos.

El análisis multivariado de la varianza(MANOVA) es un procedimiento de inferen-cia estadística usado para evaluar lasignificancia de la diferencia entre los grupos,que se hallan delimitados sobre la base delas distintas variables independientes discre-tas o tratamientos. Es una extensión delANOVA, sólo que las diferencias se estable-cen teniendo en cuenta simultáneamentedos o más variables dependientes cuantita-tivas de distribución normal. Por ello esteanálisis es particularmente útil cuando losdatos provienen de diseños experimentales.También pude ser considerado como unaextensión del AD, aunque en éste la única

variable dependiente es categórica y las va-riables independientes son cuantitativas,mientras que el MANOVA involucra un gru-po de variables dependientes cuantitativasy las variables independientes son cualitati-vas.

Las correlaciones canónicas (CC) reducenlas dimensiones de dos grupos de variablesprovenientes de un mismo conjunto de ob-jetos o individuos de manera que se puedanestudiar las relaciones conjuntas entre losgrupos. Es similar al AD sólo que en las CC lasvariables (no los objetos o individuos) sondivididas en grupos, por lo que el interés secentra sobre las relaciones entre los gruposde variables. Por ejemplo, las CC se puedenutilizar cuando interesa conocer la relaciónexistente entre los patrones de marcadoresmoleculares, que representan diferentesgenotipos, y algunas características ambien-tales donde viven los individuos mues-treados.

La regresión múltiple (RM) se considerael método apropiado cuando se presumeque los valores de una variable continua de-penden de los valores que tomen las otrasvariables. Esta técnica, que explora todo tipode relaciones dependientes, tiene como ob-jetivo predecir los cambios en una variabledependiente cuantitativa en respuesta a loscambios en las distintas variables indepen-dientes o predictoras. Los modelos de RMconstituyen la base para la estimación deparámetros en genética cuantitativa. Sonejemplos de su aplicación la descomposicióndel valor genotípico en el efecto medio decada alelo y las interacciones debidas a do-minancia y epistasis, el cálculo de la estabili-dad de los genotipos mediante la descom-posición de la interacción genotipo ambien-te, el parecido entre parientes, la ubicación yla utilización de QTL mediante marcadoresmoleculares.

La ecuación de regresión es una combi-nación lineal de las variables independientesque mejor predicen la variable dependiente.La selección de las variables con mayor po-der de predicción se realiza mediante aproxi-maciones secuenciales, llamadas estimaciones«stepwise» (pasos inteligentes). Mediantelos coeficientes de regresión estandarizadoses posible determinar la importancia relativade cada variable predictora. Las variables in-


dependiente y dependiente deben ser cuan-titativas si bien, mediante transformacionesprevias, es posible incluir variables indepen-dientes no métricas. La aplicación del análisisde RL permite predecir una variable depen-diente binaria (0,1). Es importante tener encuenta que para asignar causalidad en for-ma justificada es necesario disponer de unacantidad adecuada de datos biológicos ex-perimentales.

Si se cumplen los supuestos básicos, enespecial la normalidad de las variables, no haymayores diferencias entre la RL y el AD, sóloque en el caso que sea posible formar másde dos grupos, este último resulta el másapropiado. Los modelos logarítmicos linea-les (LOGL) comprenden a otros análisis quepermiten mostrar las relaciones que existenentre variables categóricas.

Lecturas recomendadas

EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. AppliedMultivariate Data Analysis. E. Arnold,London.

HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.;BLACK, W.C. 1995. Multivariate Data Analysis.4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River,New Jersery.

MANLY, B.F. 1986. Multivariate StatisticalMethods. A Primer. Chapman and Hall,London.

RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multiva-riate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York.


VI.-Capítulo 2

Métodos para estimar variabilidadgenética

Winzer, Nélida; Di Renzo, Miguel; Olmos, Sofía

1 Introducción

La información procesada a partir de lastécnicas que se desarrollan en este libro pue-den ser de diversos tipos y puede tratarse,por otro lado, del análisis de una sola varia-ble o de varias variables evaluadas en cadaindividuo o muestra.

Los análisis estadísticos a utilizar depen-den de estos dos aspectos, tipo de datos ynúmero de variables, y, además, de qué ob-jetivo se haya planteado el investigador.

Si se trata de una sola variable se podránaplicar las técnicas aprendidas en un cursobásico de estadística (comparación de dosmedias, análisis de la varianza, análisis de re-gresión, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bienalguna de sus generalizaciones.

En este capítulo se desarrollarán en másdetalle algunas metodologías multivariadas.Se han seleccionado aquellas que se utilizancon mucha frecuencia y que no requierendemasiados conocimientos previos.

Los datos multivariados se ordenan enuna matriz. A efectos de unificar el lenguajese considerará que cada fila de la matriz re-presentará un individuo, una muestra, unaespecie; en definitiva, una OTU (OperationalTaxonomic Unit). Las columnas representa-rán los caracteres o variables que se obser-van en cada OTU.

2 Tipo de datos

DATOS DOBLE ESTAD: Son los también llama-dos datos binarios o dicotómicos. Estos da-tos se presentan cuando el carácter puedetomar sólo dos estados posibles. Habitual-mente se codifican como «0» ó «1».

Hay que reconocer dos tipos de situacio-nes donde pueden aparecer datos binarios.

a) Datos de presencia o ausencia. Sólo seregistra la presencia ó ausencia del carácter.

Ejemplo: Presencia o no de una bandaen una corrida electroforética de isoenzimaso marcadores moleculares.

b) Datos doble estado excluyentes. El ca-rácter tiene sólo dos estados posibles y laasignación del «0» ó el «1» es indistinta.

Ejemplos: Carácter: Sexo. Codificación:Hembra = 0, Macho = 1, óHembra = 1, Macho = 0.Tipo de Fruto: dehiscente ó indehiscente.Clasificación de hojas: paripinadas ó

imparipinadas.

La distinción entre uno u otro tipo de datobinario es importante al momento de selec-cionar la medida de asociación.

DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carácterpuede tomar un conjunto finito de estados.

Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado,lobulado, entero.

Color de la flor: blanca, roja o rosada.Disposición de folíolos en el raquis:

alternos, subopuestos, opuestos.Identificación de los nucleótidos presen-

tes en una determinada secuencia de ADN:A,C, T, G.

Identificación de los aminoácidos esencia-les presentes en una proteína: Gly, Ala, Ser,Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp,Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg.

Clases de embriones somáticos: globular,acorazonado, torpedo, cotiledonar.

DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: es-tán asociados a valores de conteo.

Ejemplos: Número de hileras por espiga,número de macollos por planta, número deinflorescencias.

DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTÍNUOS:Representan propiedades que se puedenexpresar en una escala contínua.

Ejemplos: Biomasa de plantas, peso desemillas, longitud de partes verdes, concen-tración de proteína del grano, frecuencia re-lativa de un alelo.

3 Medidas de asociación y distancia

Un objetivo frecuente suele ser la descrip-ción del grado de parecido que hay entre las

200 WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

OTUs,. Para ello será necesario medir ese gra-do de similitud.

Se describirán a continuación algunas delas medidas que aparecen con mayor frecuen-cia en la literatura.

Hay dos tipos de medidas: los índices deasociación y las distancias. Los primeros mi-den el grado de similitud: Cuanto más pare-cidas sean 2 muestras, mayor será su asocia-ción. Las segundas miden el grado de disimi-litud: cuanto más parecidas son 2 muestrasmenor será su distancia.

Para datos binarios es usual trabajar conmedidas de asociación. Entonces, para carac-terizar a dos OTUS existen 4 valores a consi-derar:

a = Nº de caracteres donde ambas mues-tras coinciden en el «1»;

b = Nº de caracteres donde la primeramuestra tiene un «1» y la otra un «0»;

c = Nº de caracteres donde la primeramuestra tiene un «0» y la otra un «1»;

d = Nº de caracteres donde ambas mues-tras coinciden en el «0».

La suma de estos 4 valores dará el totalde caracteres medidos.

Es la proporción de caracteres presentesque comparten, respecto al total de caracte-res presentes en las 2 OTUs.

DICE

Es la proporción de caracteres copre-sentes respecto al promedio de los caracte-res presentes en cada OTU.

Se puede probar que Jaccard siempredará un valor de asociación menor que Dice,salvo cuando toman el valor 0 ó 1, caso enque siempre coinciden. Más aún, ambos es-tán relacionados mediante la ecuación J = D/(2-D) ó D = 2J/(1+J). Esta relación tiene comoconsecuencia, entre otras, que en un Análisisde Cluster, cuando se usa ligamiento simpleo completo, den los mismos grupos, sólo quecon distintos valores de asociación.

Ejemplo: Como resultado de la aplicaciónde la técnica RAPD sobre 6 muestras se regis-tró la siguiente información sobre la presen-cia o ausencia de 8 bandas generadas por uncebador:

Este es un proceso típico en el análisis dela información a partir de bandas. Primerose codifica la información, se construye lamatriz de datos y, en este caso, se calcularon

1 0

1 a b

0 c d

OTU 1

OTU 2

Si los datos son de presencia/au-sencia, un criterio válido es considerarque dos muestras son más parecidascuantos más «unos» compartan. Lacoincidencia de «ceros» no aporta ala similitud porque puede estar gene-rado por falta de información (la noamplificación de un fragmento RAPDno informa si esto es producido porla carencia del sitio de hibridación delcebador o bien como consecuenciade una mutación de punto en dichositio, por ejemplo).

Dos de los índices que comparteneste criterio son Jaccard y Dice.

JACCARD

12

aJ

a b c�

� �

12

2a aD

(a b) (a c)2a b c

2

� ��

1 2 3 4 5 6 7 8

A 1 1 0 1 1 0 1 0

B 0 1 1 1 1 0 0 0

C 0 0 1 0 0 1 0 1

D 1 1 1 0 0 0 0 0

E 1 1 0 1 1 0 1 0

F 0 1 1 1 1 1 1 1

Bandas

A B C D E F

A 1 0.5 0 0.333 1 0.5

B 0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571

C 0 0.167 1 0.2 0 0.429

D 0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25

E 1 0.5 0 0.333 1 0.5

F 0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1

A B C D E F

A 1 0.667 0 0.5 1 0.667

B 0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727

C 0 0.286 1 0.333 0 0.6

D 0.5 0.571 0.333 1 0.5 0.4

E 1 0.667 0 0.5 1 0.667

F 0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1

A B C D E F

1

2

3

4

5

6

7

8

A B C D E F

1 1 0 0 1 1 0

2 1 1 0 1 1 1

3 0 1 1 1 0 1

4 1 1 0 0 1 1

5 1 1 0 0 1 1

6 0 0 1 0 0 1

7 1 0 0 0 1 1

8 0 0 1 0 0 1

Codificación

Asociación de Jaccard

Matriz de Datos

Asociación de Dice


las matrices de asociación de Jaccard y Dice aefectos de observar las características men-cionadas más arriba.

Entre las muestras A y C no se observa-ron bandas en común, por lo tanto a = 0 ytanto Jaccard como Dice dan 0.

Por otro lado, A y E comparten la presen-cia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0.Tanto Jaccard como Dice dan 1.

Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tan-to, de las 6 bandas presentes en una u otramuestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. Eltotal de bandas de B es 4 y el total de ban-das detectadas en E es 5. El promedio deestos totales da 4,.5 por lo que la asociaciónde Dice da (3/4,5) = 2/3 = 0,667.

Se observa también que, salvo los 0 y los1, todos los valores de Jaccard son menoresque los de Dice.

Además, ambas matrices son simétricas:la asociación entre A y E es la misma que laque se da entre E y A. Por eso, basta mostrarla mitad de la matriz de asociación.

Esta observación será válida para todaslas medidas que se presenten en este capí-tulo.

Si los datos son binarios pero de estadosequivalentes, 2 muestran deberán consi-derarse más asociadas tanto cuando compar-ten «unos» como «ceros», ya que la codifica-ción que se les asigna es indistinta.

Un índice recomendable por su simplici-dad es el de Simple Matching o de Concor-dancia Simple:

SIMPLE MATCHING

Simplemente es la proporción de carac-teres que comparten las dos muestras.

Si se piensa que la matriz de datos ante-rior corresponde a 8 caracteres binarios deestados equivalentes la matriz de asociacióncon el índice de Simple Matching dará:

Se observa que A y E comparten todoslos caracteres, por lo tanto tienen la máximaasociación. En cambio C y E no coinciden enninguno, su asociación es 0. La asociaciónentre C y D y entre D y E es 0,5, lo que signi-fica que coinciden en la mitad de los caracte-res evaluados.

Además de las que se han definido hastaahora, existen muchas otras medidas paradatos binarios. También se pueden definirmedidas de distancia o asociación para dis-tintos tipos de datos multiestado. Para noextender en demasía esta sección se presen-tarán algunas distancias definidas específi-camente para frecuencias alélicas.

4 Distancias genéticas

Se pueden clasificar en 2 grupos: las basa-das en un modelo geométrico (Cavalli-Sforzay Rogers) y las basadas en modelos conside-raciones biológicas (Nei).

Para n poblaciones, hay n(n-1)/2 pares, ysi en cada una de ellas se tiene la informa-ción sobre los loci para m alelos, y tambiénsus frecuencias correspondientes, éstas pue-den expresarse de la siguiente manera:

Pob. 1: p1, p

2, ... , p

mPob. 2: q

1, q

2, ... , q

m

Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA yEDWARDS (1967)

12

a dSM

a b c d

��

� � �

A B C D E F

A 1 0.625 0 0.5 1 0.5

B 1 0.375 0.625 0.625 0.625

C 1 0.5 0 0.5

D 1 0.5 0.250

E 1 0.5

F 1

m

12 i i

i 1

d 2 1 p q )�

� ��

�

Los puntos P* = 1 2 m( p , p ,..., p ) yQ*= 1 2 m( q , q ,..., q ) están sobre una es-fera de radio 1. La distancia Cuerda es, preci-samente, la longitud de la cuerda que uneesos 2 puntos.

Para el caso m = 2, se ve en el gráfico ladistancia cuerda entre los puntos P = (0.3,0.7) y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales sonllevados a la esfera (círculo) de radio 1 y lue-go se calcula la distancia entre esos 2 pun-tos: d = 0.5324


Distancia de ROGERS (1972)

Los dos últimos términos equivalen a unestado de homocigosis en la población 1 y 2,respectivamente.

Nei define primero la Identidad normali-zada (varía entre 0 y 1) :

1

P*

Q*

Q

P

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Si se consideran simultáneamente variosloci la distancia Cuerda se calcula así:

imr

12 ij ij

i 1 j 1

d 2 1 p q )� �

� ��

�

imr2

12 ij ij

i 1 j 1

1R (p q )

r � �

� �

En el gráfico, ésta es la distancia habitualentre los puntos P y Q.

Distancia Estándar de NEI (1972):Esta distancia tiene una base biológica.

Expresa la probabilidad de que dos alelostomados al azar de dos poblaciones diferen-tes sean idénticos (con respecto a la proba-bilidad de que lo sean dos alelos tomados alazar de la misma población). Sean, como an-tes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuenciasalélicas de un solo locus:

i ip q∑ se puede interpretar como la pro-babilidad que 2 alelos sean iguales si uno hasido elegido al azar de la población 1 y el otrode la población 2.

∑

sería la probabilidad que 2 aleloselegidos al azar de la población 1 sean igua-les;

∑

sería la probabilidad que 2 aleloselegidos al azar de la población 2 sean igua-les.

m

i i

i 1

m m2 2

i i

i 1 i 1

p q

I

p q

�

� �

�

y luego la Distancia Estándar: D12

= - ln I.

Si se usan varios loci se trabaja con el pro-medio aritmético de las probabilidades defi-nidas anteriormente resultando:

En las poblaciones naturales una de lasformas de realizar el agrupamiento jerárqui-co de las mismas en razas, es mediante elempleo de medidas de divergencia genética.Aquí, las llamadas distancias genéticas tienensu mayor aplicación. Las medidas de distan-cias genéticas basadas en modelos biológi-cos son las más empleadas en estudio degenética poblacional, debido a que resumenlos conocimientos obtenidos de las fuerzasevolutivas que conllevan a los cambiosgenéticos es decir, mediante mutaciones yderiva genética.

La medida de distancia genética estándarde Nei es más confiable cuando se utilizan

Ejemplo: Para la información de la tabla, enel caso de las frecuencias de cinco alelosprovenientes de dos loci, se tiene: I =0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.

i

i i

mr

ij ij

i 1 j 1

12m mr r

2 2

ij ij

i 1 j 1 i 1 j 1

p q

D ln

p q

� �

� � � �

� �


datos provenientes de muchos alelos. La dis-tancia de Nei está formulada para un mode-lo donde se asume que las mutaciones ocu-rren en forma infinita, con la misma probabi-lidad para todos los alelos a una tasa demutación neutral, y que la variabilidadgenética inicial en la población está en equili-brio entre la variabilidad producida por mu-taciones y por deriva genética, siendo el ta-maño efectivo de la población, en cada una,constante. Basándose en estos supuestos, yde que todos los loci sean equivalentes en-tre sí, se espera que la Distancia de Neiincremente linealmente con el tiempo. Si lasfrecuencias alélicas en cada población hansido estimadas con pocas muestras se pue-den utilizar en cambio algunas modificacio-nes a la Distancia Estándar de Nei como laspropuestas por Nei, (1978) y Hillis, (1984). Ladistancia de Cavalli-Sforza y Edwards, por elcontrario, asume que las diferencias entre laspoblaciones no provienen de mutacionessino solamente como consecuencia de la de-riva genética. Además, no asume que el ta-maño poblacional ha permanecido constan-te en todas las poblaciones. Considera queel tamaño de la población cambia en formalineal pero no con el tiempo sino con 1/N,donde N es el tamaño efectivo de la pobla-ción. Así en estos casos, los conocimientosbásicos de genética poblacional brindarán lasherramientas necesarias en el momento dela elección del método más apropiado parael análisis de nuestros datos.

5 Análisis de coordenadas principales

Si se tiene una matriz de distancias entreN muestras ¿será posible representar cadamuestra mediante un punto de manera talque las distancias resultantes reproduzcan lasde la matriz?

Veamos dos ejemplos:(i) Si se tiene la siguiente matriz D de dis-

tancias entre las muestras A, B y C:

se podrían hacer algunos de los siguien-tes gráficos:

Si se calcula la distancia euclídea entre lospuntos en uno cualquiera de estos gráficosse ve que se han reproducido exactamentelos valores de la matriz D. Por ejemplo:

en el gráfico I.

(ii) Si se tuviera la matriz de distanciasentre las muestras P

1, P

2 y P

3:

� ��

� � ��

0 1 .447

D 1 0 .707

.447 .707 0

II

A

C

B

-0.5

-0.3

-0.1

0.1

0.3

0.5

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

III

B

C

A

-0.5

-0.3

-0.1

0.1

0.3

0.5

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

I

B

C

A

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Coordenadas de A, B y C:I:(1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179)II:(0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111,0.179)III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,-0.179)

2 2

Ed (A,B) (1.444 0.445) (0.881 0.94) 1� � � � �

#

0 0.9 0.5

D 0.9 0 0.3

0.5 0.3 0

� ��

� � ��

Es fácil ver que esimposible representaren un plano puntosseparados por estasdistancias porque si

P1 y P

2 se ubican como extremos de un seg-

mento de longitud 0.9, no hay manera deubicar un punto P

3 que esté a 0.5 de P

1 y a

0.3 de P2.


Se van a considerar, por ahora, distanciascomo las del ejemplo i). Esto es, distanciaspara las que se puedan encontrar puntos quereproduzcan esas distancias.

Otro aspecto a considerar es el númerode coordenadas necesarias para esos puntos.Es intuitivo que si sólo hay 2 muestras a unadistancia dada se pueden graficar en una rec-ta (dimensión =1); si hay 3 muestras ya se vióque se pueden graficar en un plano (dimen-sión = 2); si se tuvieran 4 muestras ya sonnecesarias 3 coordenadas (dimensión = 3);... y si se tienen N muestras se necesitarán,en general, N-1 coordenadas. Con lo cual sise quieren graficar 40 muestras serán nece-sarias 39 coordenadas!!!

Es evidente que esto no es cómodo si elobjetivo es obtener una representación grá-fica de los puntos o muestras. Lo ideal seríaobtener dos coordenadas pues se podríangraficar en un plano, o bien tres para graficaren 3 dimensiones.

El problema, entonces, es encontrar las 2mejores coordenadas (ó las 3 mejores) paraobtener esta representación. Ese es el obje-tivo del Análisis de Coordenadas Principales(ACOOP): encontrar las k mejores coordena-das para las muestras de manera tal que sise calculan las distancias euclídeas entre ellasreproduzcan lo mejor posible una matriz dedistancias dada. Habitualmente k = 2 ó 3, aéstas, se las llama Coordenadas Principales.

Naturalmente se perderá la informaciónde las restantes coordenadas.

Como se vió en el ejemplo (i) hay muchasrepresentaciones posibles. Ahí se han dado3 pero se podrían haber dado muchas más.Una manera de reducir las opciones es obte-ner coordenadas de manera tal que los pun-tos estén centrados en el origen, como en IIó III.

Se explicará el método de obtención delas Coordenadas Principales partiendo de unamatriz de Asociación S. En este caso las dis-tancias que se van a reproducir son las defi-nidas por:

d2(i, j) = Sii+ S

jj- 2 S

ij( 1 )

donde Sij es la asociación entre la muestra i y

la j. Si la asociación de una muestra consigomisma es 1, es decir S

ii = 1, como ocurre con

la mayoría de los índices, la ecuación se redu-ce a:

d2(i, j) = 2(1- Sij ). ( 2 )

Se detallarán los pasos que se deberíanrealizar para hacer este análisis al simple efectode poder manejar con idoneidad los progra-mas estadísticos de que se dispongan. Lospasos 1) a 3) son responsabilidad de esosprogramas. El usuario deberá, fundamental-mente, indicarle qué asociación o distanciadesea calcular y cuántas coordenadas quie-re.

PASO 1) Centrar doblemente la matriz S→S0 .

PASO 2) Calcular los autovalores yautovectores de S0.

PASO 3) Calcular las coordenadas de lospuntos representativos de las muestras.

PASO 4) Graficarlos.

El PASO 1 tiene como fin hacer que los pun-tos resultantes estén centrados. Cada ele-mento de la matriz de asociación S se centrapor filas y por columnas:

0ijS

(3)

donde iS • es el promedio de la fila i de S,jS• es el promedio de la columna j y S•• es el

promedio de todos los elementos de S.

En el PASO 2 se encuentran:a) una matriz NxN donde cada columna

es un vector de longitud uno. Son losautovectores.

b) N números ordenados en forma de-creciente: los autovalores.

Estos elementos son característicos decada matriz S0. Por eso también se los cono-ce como vectores y valores característicos.Cada autovector está asociado a unautovalor.

Si la matriz de distancias es «represen-table» (como la del ejemplo (i)) losautovalores serán positivos o ceros (el máschico es siempre cero para estas matrices«representables»).

P1 P2

P1 P3? P3? P 2


En el PASO 3 , si se desean k coorde-nadas, se toman los k primeros autovectoresy se multiplican por la raiz del autovalorrespectivo. El primer autovector da la primeracoordenada de todas las muestras, elsegundo la segunda coordenada y asísiguiendo hasta la k-ésima. Si sólo se desean2 coordenadas para graficar los puntos enun plano se toman los 2 primeros auto-vectores (k=2).Veamos un ejemplo sencillo:

1 0.5 0.9

S 0.5 1 0.75

0.9 0.75 1

� ��

Doble centrado 0

0.21110.2390.028

S 0.239 0.3111 0.072

0.0280.0720.0444

��

Autovalores de S0: �1 = 0.5167 �2 = 0.05 �3 = 0

v1 v2 v3

Autovectores de S0

: Columnas de

0.6173 0.5344 0.57735

V 0.7716 0.2674 0.57735

0.1543 0.8019 0.57735

��

Primeras 2 Coordenadas: 11 v� 22 v�

Muestra 1 0.4437 -0.1195

Muestra 2 -0.5546 -0.0598

Muestra 3 0.1109 0.1793

Gráfico: Es el Gráfico II que se vió más arri-ba donde A es la muestra 1, B la 2 y C lamuestra 3.

Las distancias ( 2 ) calculadas a partir dela matriz de asociación S dan la matriz de Dis-tancias D. Por esa razón ambas matrices tie-nen la misma representación.

OBSERVACIÓN 1: Como en el ejemplosólo hay 3 muestras los autovectores tienen3 componentes. Si se trabajara con una ma-triz de asociación entre 40 muestras, losautovectores tendrían 40 componentes, unapor cada muestra.

OBSERVACIÓN 2: Para la matriz S se hanreconstruído totalmente las distancias por-que sólo son 3 muestras. Si hubiera más(N=40, por ejemplo) sólo se reconstruiríantotalmente las distancias si se usan 39 coor-denadas. Si se usan sólo las dos primeras sereconstruye, en general, sólo un porcentaje

de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajesque se pueden calcular:

Porcentaje de Dispersión:

si sólo se usan 2 coordenadas.Este porcentaje se interpreta teniendo en

cuenta que: 2N (λ1 + ...+ λ

N) = 2

ijd∑∑ , su-mando sobre todos los pares de muestras.

En cambio, la suma del cuadradode las distancias reconstruidascon las dos coordenadas es iguala 2N (λ

1 + λ

2). Por lo tanto, este

porcentaje mide cuánto se re-construye del cuadrado de todaslas distancias.

Si se usan más de 2 coorde-nadas se van sumando losautovalores correspondientes enel numerador.

En nuestro ejemplo:α

1 = 100% .

Porcentaje de Distorsión:

Este valor mide cuánto se acercan los va-lores de la matriz de asociación reconstruídarespecto de la matriz de asociación originalS0. Más exactamente:

En este algoritmo se ve que lo que se estácomparando son las asociaciones originales,

0ijs

,con las reconstruidas, 0*ijs , una a una. Para

el cálculo de ααααα2 se usa la primera fórmula porlo que el lector no debe traumatizarse con lasegunda.

OBSERVACIÓN 3: Si se hubieran obteni-do autovalores negativos la primera medidano es recomendable. Hasta podría darse elcaso que ααααα1 fuera mayor al 100%. La segun-da, en cambio, sigue teniendo sentido. Por

2

12 12 12d 2(1 S ) 2(1 0.5) 1 d 1� � � � � � �

2

13 13 13d 2(1 S ) 2(1 0.9) 0.2 d 0.447� � � � � � �

2

23 23 23d 2(1 S ) 2(1 0.75) 0.5 d 0.707� � � � � � �

1= x 100%� �

� � �1 2

1 2 n

+

+ +...+

1= x 100%� �

� � �

2 2

2 2 2

1 2

1 2 n

+

+ +...+

2= 1- x 100%= 1- x 100%S - S

S

0 0* 2

0 2

(S - S )

(S )

0 0* 2

0 2

ij ij

ij


otro lado, no se podrían calcular coordena-das asociadas a ese autovalor porque no sepuede calcular iλ .

La aparición de autovalores negativos noes necesariamente un problema grave parala representación siempre que los autovaloresnegativos sean pocos y pequeños. Por ejem-plo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO

2 se obtendrán 50 autovalores, de los cualesuno, seguramente, es cero. Para la represen-tación en el plano se usan sólo los 2 prime-ros. Si los últimos 10 son negativos no se ve-rán afectados los cálculos de las coordena-das.

Hay asociaciones y distancias que nuncadan autovalores negativos, entre ellos seencuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Sim-ple Matching, y distancia euclídea.

Si en lugar de tener una matriz de asocia-ciones se tiene una matriz de distancias elprocedimiento consiste en calcular una ma-triz S cuyos elementos son:

(4)

y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores.

OBSERVACIÓN 4: Cada autovector de S0

es un vector de longitud 1 en una cierta di-rección. Pero por cada dirección podemostener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo:

Cualquiera de estos dos vectorespueden usarse como segundoautovector y, más aún, algunos pro-gramas pueden dar como resultado elprimero y otros el segundo. Como con-secuencia de esta selección se obten-drá el gráfico II ó el III. Se ve que elúnico efecto de usar uno u otro vectores una reflexión del gráfico respectodel primer eje. Si se cambia el signo dev

1 se obtendrá una reflexión respecto

del segundo eje. Ninguno de estoscambios modifica la distancia entre lospuntos.

No debe causar sorpresa, entonces, quecon un programa se obtenga un gráfico y conotro el mismo gráfico pero con una reflexiónsobre uno u otro eje, o sobre los dos.

Por otro lado, también es lícito cambiar,por alguna razón, el signo de una coordena-da. Por ejemplo, esto puede ser útil cuandose quieren comparar Análisis de Coordena-das Principales realizados con distintas aso-ciaciones o distancias sobre el mismo conjun-to de muestras.

Ejemplo:Presentamos la caracterización de 8

cultivares comerciales y 35 cultivares en expe-rimentación mediante análisis isoenzimáticode semillas de Amaranthus. Estas accesionespertenecen a siete especies: A. caudatus, A.cruentus, A. hypochondriacus, A.mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A.hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fue-ron polimórficas con 7 sistemas isoenzi-máticos. Se aplicó análisis de coordenadasprincipales el cual, estuvo basado en la pre-sencia o ausencia de las 23 bandas poli-mórficas. En la figura puede observarse el ni-vel de diversidad genética dentro de estegermoplasma representado por las coorde-nadas 1 y 2. Este análisis agrupó la mayoríade los cultivares de acuerdo a su clasificacióntaxonómica así como mostró que existen re-laciones entre diferentes accesiones. Se con-cluye que el análisis isoenzimático de semillasfue efectivo para caracterizar los cultivaresdestinados a los programas de mejoramien-to de Amaranthus.

2

ij

ij

ds

2� �

2 2

0.5344 0.5344

v 0.2674 y v 0.2674

0.8019 0.8019

��

13

15

7

8

12

514

6-9-10-11

17

252618-22

24

2321

1619

20

4

1

3

227

28

29-30

3132-33

3734

36

35

41

42

38-39

40-43

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6

A.cruen. A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0

2 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1

3 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0

4 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

5 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

6 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

7 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1

8 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0

9 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

10 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

11 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

12 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

13 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1

14 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

15 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0

16 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1

17 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1

18 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1

19 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1

20 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1

21 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

22 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1

23 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0

24 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0

25 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1

26 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1

27 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

28 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0

29 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0

30 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0

31 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0

32 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0

33 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0

34 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1

35 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

36 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1

37 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

38 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

39 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

40 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

41 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1

42 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1

43 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

Matriz de datos


Al sólo efecto de que el lector pueda re-pasar algunos cálculos se dan los primeros 10elementos de los 2 primeros autovectores ylas 2 primeras coordenadas Principales.

6 Análisis de agrupamientos (cluster)

Esta técnica tiene como objetivo formargrupos de muestras, poblaciones, individuosu OTUs que sean similares entre sí y diferen-tes a los elementos de los otros grupos.

El primer problema es fijar el criterio paradecidir cuándo dos elementos son similares.Si se tuviera un mazo de cartas, ¿cómo for-mar grupos? ¿por el valor de la carta?, ¿por-que comparten el palo?. Según el criterio quese aplique los grupos que se formen serándistintos.

En la sección anterior hemos visto distin-tas maneras de definir la similitud o disimili-tud entre OTUs. Cada una de ellas, u otrasque no se han presentado aquí, planteandistintas formas de medir la similitud entrelos elementos a agrupar.

Existen, además, muchos métodos paraformar los grupos. Uno de los más usadosson los agrupamientos jerárquicos que pue-den, a su vez, ser divisivos o aglomerativos.Los primeros comienzan con todos los ele-mentos en un solo grupo y en sucesivas divi-siones se van formando grupos cada vez máspequeños. Los aglomerativos, por el contra-rio, empiezan considerando tantos gruposcomo elementos se tienen y se van agrupan-do según su grado de parecido. Los sucesi-vos pasos de uno y otro método se puedenrepresentar en un gráfico denominadodendrograma.

En esta sección se tratarán solamente losmétodos jerárquicos divisivos.

Aquí se plantea un segundo problema:¿Qué tipo de ligamiento se va a utilizar? Estoes, una vez realizado el primer agrupamien-to, cómo se define la distancia entre ese gru-po y los restantes elementos?

Supongamos que en un primer paso sehan agrupado los elementos A y B porqueson los que presentan la menor distanciaentre sí. La distancia entre el nuevo grupoAB y otro elemento C se puede definir segúnel criterio empleado para incorporar al nue-vo elemento:

LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mín {d(A, C), d(B,C)},

LIGAMIENTO COMPLETO: d(AB,C) = máx {d(A, C),d(B, C)},

LIGAMIENTO PROMEDIO:

d({A,B},C) =

En el caso del ligamiento simple, la incor-poración del nuevo elemento está basada enla extracción de los menores valores de dis-tancias entre el nuevo elemento y el grupopreformado, y entre el nuevo elemento y lasrestantes OTUs que se consideren. En cam-bio, el ligamiento completo lo que hace esextraer los mayores valores de distancia, res-pectivamente. Si A, B y C son grupos forma-dos en pasos anteriores, se usan los mismosalgoritmos en el caso del ligamiento simple ocompleto. Para el ligamiento promedio hayque promediar todas las distancias entre ele-

V1 V2 CP1 CP2

1 -0.12709 0.03060 -0.27881 0.05495

2 -0.10710 0.13683 -0.23496 0.24570

3 -0.12311 0.09085 -0.27007 0.16313

4 -0.00462 0.07441 -0.01014 0.13362

5 -0.22005 0.07043 -0.48274 0.12647

6 -0.23182 0.16179 -0.50856 0.29052

7 -0.12459 -0.11226 -0.27331 -0.20157

8 -0.12472 -0.09717 -0.27360 -0.17448

9 -0.23182 0.16179 -0.50856 0.29052

10 -0.23182 0.16179 -0.50856 0.29052

... ... ... ...

Autovalores:4.81258 3.22431

α1 = 46.85 α

2 = 78.2

d(A,C) d(B,C)

2

�


ij

i, j

AB C

d

d(AB,C)n n

�

donde dij es la distancia entre

el elemento i del grupo AB y el j deC; n

AB y n

C son los números de ele-

mentos en el grupo AB y C, respec-tivamente.

Este ligamiento promedio seconoce también por las siglasUPGMA (Unweighted Pair GroupsMethod with ArithmeticAverages).

Consideremos la matriz de dis-tancias de la tabla. Se realizará unagrupamiento aplicandoligamiento simple.

En primer lugar se agrupan loselementos A y E porque están amenor distancia (son iguales). For-mado ese primer grupo habría quecalcular las nuevas distancias delgrupo AE a los restantes elemen-tos pero como d(A, U) = d(E, U) paratodos los restantes elementos U semantienen esas distancias.

En el segundo paso se observaque la menor distancia es la de B aF; se forma ese grupo y serecalculan las distancias del nuevogrupo a los restantes. Y así hastaque se han agrupado todos. Tam-bién se puede detener el procesofijando algún otro criterio para ello.Por ejemplo, cuando se ha alcan-zado una distancia máxima fijadapreviamente.

A continuación se aplica el ligamientocompleto. Los 2 primeros agrupamientos co-inciden en este ejemplo, por lo que sólo semuestran los tres últimos pasos.

El ligamiento promedio conduce a las si-guientes agrupaciones:

Los mismos métodos se pueden aplicarsobre matrices de asociación cambiando losconceptos de «menor distancia» por el de«menor asociación».

En general, el ligamiento simple produceagrupamientos en cadena: a los grupos for-

AE BF C D

AE 0 1.1 1.41 1.15

BF 1.1 0 1.29 1.22

C 1.41 1.29 0 1.26

D 1.15 1.22 1.26 0

AEBFD C

AEBFD 0 1.41

C 1.41 0

AEBF C D

AEBF 0 1.41 1.22

C 1.41 0 1.26

D 1.22 1.26 0

AE BF C D

AE 0 1.05 1.41 1.15

BF 1.05 0 1.18 1.16

C 1.41 1.18 0 1.26

D 1.15 1.16 1.26 0

AEBF C D

AEBF 0 1.295 1.155

C 1.295 0 1.26

D 1.155 1.26 0

AEBFD C

AEBFD 0 1.277

C 1.277 0

A B C D E F

A 0 1 1.41 1.15 0 1.1

B 1 0 1.29 1.10 1 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.41 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.15 1.22

E 0 1 1.41 1.15 0 1

F 1.1 0.93 1.07 1.22 1 0

AE B C D F

AE 0 1 1.41 1.15 1.1

B 1 0 1.29 1.10 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.22

F 1.1 0.93 1.07 1.22 0

AE BF C D

AE 0 1 1.41 1.15

BF 1 0 1.07 1.10

C 1.41 1.07 0 1.26

D 1.15 1.10 1.26 0

AEBF C D

AEBF 0 1.07 1.10

C 1.07 0 1.26

D 1.10 1.26 0

AEBFC D

AEBFC 0 1.10

D 1.10 0

mentos de AB y de C:

mados inicialmente se van acoplando los res-tantes elementos. En cambio, el ligamientocompleto tiende a generar muchos gruposchicos que se reunirán en los últimos pasos.

El análisis de Agrupamientos sólo debetomarse como un método exploratorio. Sioriginalmente los datos forman grupos bienseparados cualquier método de agrupamien-to dará, aproximadamente, los mismos re-sultados. Pero si las muestras forman uncontínuo, cada método y cada medida dedistancia pueden conducir a resultados muy


dispares. En este caso las conclusiones debenrealizarse con cautela.

A veces es conveniente realizar un Análi-sis de Coordenadas Principales para determi-nar si existen grupos claramente definidos ono.


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PARTE VIIGenómica

212 ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.


VII.-Capítulo 1

Genómica

Echenique,Viviana; Schrauf, Gustavo;Selva, Juan P.

1 Introducción

La «genómica» se desarrolló en los últi-mos 10 años como consecuencia de los avan-ces realizados en biología molecular e Infor-mática, dos áreas de la ciencia que han teni-do un desarrollo tecnólogico enorme, gene-rando una revolución en el conocimiento yen la comprensión de los procesos biológi-cos. El término fue acuñado en 1986 porThomas Roderick para referirse a lasubdisciplina de la genética que se ocupadel mapeo, secuenciación y análisis de lasfunciones de genomas completos y sirvió denombre para una revista especializada en lapublicación de los mencionados temas,Genomics. Consiste en la caracterizaciónmolecular de genomas enteros y aporta in-formación acerca de la secuencia y de la fun-ción de cada sector del genoma en diferen-tes situaciones de desarrollo y bajo dife-rentes condiciones ambientales, así comode los mecanismos implicados en la regula-ción de la expresión e interacción génica.Para ello, las herramientas que se utilizan parael análisis individual de genes o pequeñasregiones cromosómicas, se aplican al análisisglobal de genomas completos, estudiandoen conjunto los miles de genes, proteínas ymetabolitos que constituyen un organismo,así como las complicadas redes deinteracciones que operan entre ellos. La in-formación generada es enorme y es clave parala identificación y el aislamiento de genes deinterés y permitirá interpretar, en términosmoleculares, los procesos biológicos. Paraayudar en este proceso han surgido podero-sas herramientas bioinformáticas que per-miten almacenar e interpretar esta informa-ción.

Las aplicaciones de la genómica alcanzana todos los ámbitos de la actividad humanarelacionados con la biología, como la salud,la alimentación y el medio ambiente. En po-cos años estarán disponibles las secuencias

de nucleótidos y aminoácidos de todos losgenes y productos génicos codificados por losgenomas de varios organismos complejos.Estas servirán para el estudio de enfermeda-des humanas complejas y para comprenderfenómenos tales como la fisiología celular, eldesarrollo, la conducta, la evolución, etc. Tam-bién aportarán información acerca de todoslos aspectos del crecimiento y desarrollo ve-getal, diferenciación y respuesta a estresesbióticos y abióticos. Gracias al potencial derelacionar fenotipos biológica y económica-mente importantes con los genes responsa-bles de los mismos será posible identificargenes de interés que puedan ser transferi-dos a otros organismos por medio de tecno-logía génica. Por otro lado, el conocimientode la secuencia de los genes posibilitará eldesarrollo de marcadores perfectos, basa-dos en la secuencia del mismo gen, lo cualfacilitará la selección y la transferencia de losmismos a variedades de interés. La conjun-ción entre tecnología génica, marcadoresmoleculares, genómica y bioinformática revo-lucionará el mejoramiento genético vegetal,dando origen a lo que se denomina mejora-miento molecular y conducirá al desarrollode nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1).

La genómica se divide en dos grandesáreas:

- Genómica estructural, que se ocupa dela caracterización física de genomas enteros.

- Genómica funcional, que caracteriza eltranscriptoma, que está constituído por elconjunto completo de transcriptos, produci-dos por un organismo, el proteoma o con-junto de proteínas codificadas por ungenoma, y el metaboloma o conjunto totalde metabolitos de una célula, consecuenciade la función de los RNA y proteínas.

El objetivo de la genómica es la dilucida-ción completa y exacta de la secuencia deADN de un genoma haploide representati-vo de una especie. Cuando esta secuenciase conoce, abre la puerta a numerosas posi-bilidades. Por análisis computacional de lamisma y utilizando principios conocidos degenética y el análisis molecular de lostranscriptos y proteínas es posible:

- Comparar secuencias similares presen-tes en diferentes entidades biológicas y com-prender el papel de dichas secuencias.


- Realizar predicciones acerca de todaslas proteínas codificadas por una especie.

- Establecer las variaciones genéticasentre distintas poblaciones deuna misma especie.

- Comparar secuencias dediferentes especies y entenderprocesos evolutivos.

Esto ha dado origen a la genómicacomparativa y ha demostrado queexiste considerable sintenia es deciruna localización conservada de genesen posiciones equivalentes en especiesrelacionadas (Fig. 2). También ha sidouna excelente herramienta para iden-tificar motivos de secuencia altamen-te conservados y, por lo tanto,funcionalmente importantes en regio-nes codificantes y no codificantes delgenoma. Catalogar las variacionesgenéticas entre individuos ayudará aidentificar aquellos cambios que con-ducen a enfermedades genéticas, in-vestigar nuevas terapias y estable-cer la resistencia o susceptibilidad a di-ferentes factores.

En Febrero de 2001, coincidiendocon el cincuenta aniversario de la pu-blicación del modelo estructural delDNA por Watson y Crick, la revistaNature publicó el primer borrador delgenoma humano, que ha sidosecuenciado completamente. Tam-bién se han secuenciadoexitosamente en los últimos años los

genomas completos de más de 30 bacteriasy de varios eucariotas, entre los que se en-cuentran la levadura, Saccharomycescerevisiae, el nematodo Caenorhabitis

Figura 1: La conjunción entre tecnología génica, marcadoresmoleculares, genómica y bioinformática revolucionarán elmejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevoscultivares. Los nuevos genes hallados serán introducidos enplantas por tecnología génica. Esto a su vez permitirá establecerla funcionalidad de los mismos. El conocimiento de la secuenciapermitirá la obtención de mapas, marcadores perfectos y realizarselección asistida por marcadores moleculares (MAS), así comoel fenotipeado molecular. Gentileza de G. Spangenberg.

Figura 2:Figura 2:Figura 2:Figura 2:Figura 2: Sintenia entre los genomasde varias gramíneas. El genoma de arrozcontiene grupos de marcadores que sehallan altamente conservados enmuchos cereales, por lo cual dichosgenomas pueden sintetizarsebásicamente como compuestos por«bloques de ligamiento de arroz». En lafigura se muestra el alineamiento de loscromosomas y segmentos decromosomas (identificados con letrasmayúsculas) de varias gramíneas con losdel arroz (centro). El genoma del maíztiene dos copias semejantes de cadabloque de genes por lo que estárepresentado por dos anillos del círculo.Las líneas externas punteadas conectansectores adyacentes de los cromosomasde trigo. Modificado de Gale y Devos(1998) y de Snustad et al. (2003)


elegans, la mosca del vinagre Drosophilamelanogaster y una planta, Arabidopsisthaliana. Actualmente se encuentran en mar-cha proyectos de secuenciación de losgenomas de diferentes modelos animalescomo rata, ratón, perro, gato, cerdo, etc. yvegetales como arroz, maíz, colza, soja, tré-bol, raigrás, etc.

A continuación se brinda un panoramaglobal acerca de la forma en que se articulanlos proyectos de genómica, algunos resulta-dos relevantes, las aplicaciones en agricultu-ra y el estado de la investigación enSudamérica.

2 Genómica estructural

Como su nombre lo indica, el objetivo dela misma es caracterizar la estructura delgenoma. Conocer la estructura de ungenoma individual puede ser de utilidad paramanipular genes y segmentos de ADN enuna especie particular. El análisis comparati-vo de diferentes genomas posibilitará dedu-cir reglas generales que gobiernan la estruc-tura de todos los genomas.

La genómica estructural procede a travésde niveles incrementales de resolución analí-tica, comenzando con la asignación de genesy marcadores a cromosomas individuales,mapeando estos genes y marcadores den-tro de los cromosomas, finalizando con lapreparación de un mapa físico a través de lasecuenciación. Es decir, que se procede des-

de un mapeo genéticode baja resolución, ba-sado en el análisis der e c o m b i n a c i ó nmeiótica, hacia uno dealta resolución, basadoen marcadoresmoleculares, llegando ala realización de unmapa físico, basado enla secuencia de frag-mentos clonados par-cialmente solapantes(Fig. 3).

Los pasos serían:- Mapeo

cromosómico de bajaresolución (ubicación degenes que producenfenotipos mutantes co-nocidos y algunos mar-cadores). Las distanciasgenéticas se basan enfrecuencias deentrecruzamientos(«crossing overs») y sonmedidas como porcen-taje de recombinaciónen centiMorgans (cM).

- Mapeo genético dealta resolución de cadacromosoma (con marca-dores moleculares ubica-dos muy próximos entresí).

Figura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómicaestructural procede desde un mapeo genético de baja resolución, basado en elanálisis de recombinación meiótica, a uno de alta resolución, basado enmarcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en lasecuencia de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al.(2000).


- Mapeo físico, basado en distanciasmoleculares, resultantes de mapas de frag-mentos de restricción parcialmente super-puestos. La distancia entre dos marcadorespuede ser medida determinando el tamañode los fragmentos de restricción que los con-tienen, siendo el fragmento más pequeñoque lleva ambos marcadores una estimaciónde la distancia entre ellos. Utilizando combi-naciones de sondas y enzimas de restricciónpuede construirse un mapa físico determinan-do qué fragmentos poseen marcadores encomún. Las distancias físicas se miden enkilobases (Kb) o megabases (Mb).

- Anclado del mapa genético en el mapafísico.

- Secuenciación de ADN a gran escala,que brinda un mapa completo de cadacromosoma.

- Anclado del mapa genético y del mapafísico en el de secuencia.

Las distancias físicas generalmente no secorrelacionan directamente con las distanciasgenéticas porque las frecuencias de recom-binación no son siempre proporcionales a lasdistancias moleculares. Sin embargo, a menu-do las dos correlacionan razonablemente bienen las regiones eucromáticas de los cro-mosomas (aquellas menos condensadas, quese colorean de manera más difusa ). En hu-manos, un cM es equivalente, en promedio,a aproximadamente 1 Mb de ADN.

2.1 Asignación de loci a cromosomasespecíficos

Se utilizan los siguientes métodos:

- Ligamiento a loci conocidos: análisistradicional basado en cruzamientos, en es-pecies en las que es factible hacerlo.

- Electroforesis de campo pulsátil: se usaen el caso de especies que poseencromosomas pequeños, separables por estatécnica, como sucede con los de levaduras.Las bandas en el gel corresponderían acromosomas individuales y pueden utilizarsepara localizar nuevos genes por hibrida-ción. Primero, utilizando sondas de localiza-ción conocida se establece que banda corres-ponde a cada cromosoma. Luego, un nuevogen clonado de ubicación desconocida seutiliza como sonda para asignarle una posi-

ción en un cromosoma determinado.- Híbridos celulares interespecíficos, por

ejemplo humano-ratón. Se utiliza exclusiva-mente en mapeo del genoma humano o deespecies animales. Se establecen bancos delíneas celulares que contengan todos loscromosomas del roedor y un cromosomahumano particular. Siempre incluye uncromosoma humano que lleva un alelo sal-vaje defectivo para una función bioquímicadeterminada en el genoma del ratón. Si so-breviven en un cultivo deficiente para el fac-tor que no sintetizan es porque llevan el alelohumano equivalente, que complementa lafunción faltante .

2.2 Ubicación de los genes a lo largo delcromosoma

El próximo nivel de resolución consiste endeterminar la posición de un gen o marca-dor molecular sobre el cromosoma. Este pasoes importante porque los mapas genéticospueden alinearse con los mapas físicos y utili-zarse para validar los mismos.

- Mapeo por recombinación: en los ca-sos en que ha sido factible hacerlo -organis-mos experimentales como levaduras, la moscade la fruta, ratón, Arabidopsis, etc- ha posi-bilitado la construcción de mapas que a lolargo de los años aparecen repletos de genescon efectos fenotípicos determinados. Sinembargo, los intervalos recombinacionalesentre genes conocidos contienen cantidadesmuy grandes de ADN. Estos intervalos o«gaps» no pueden ser completados utilizan-do análisis de ligamiento debido a la ausen-cia de marcadores en esas regiones. Para lle-narlos y construir mapas de alta resoluciónsurgieron los marcadores moleculares, entrelos que se encuentran los RFLP y los SSLP (miniy microsatélites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos mar-cadores permiten la construcción de mapasgenéticos con una densidad de un marcador/centimorgan (cM). Aunque tal resolución esun logro muy importante, un centimorganrepresenta, en humanos, una megabase, loque equivale a un millón de pares de baseso 1000 kb. Para lograr mayor resolución ac-tualmente existen los SNP, que son marca-dores basados en el polimorfismo de un solonucleótido.

- Hibridación in situ: cuando se dispone


de un gen clonado éste puede ser utilizadocomo sonda para hibridar con los cromo-somas in situ, para lo cual se lo marcaradiactivamente o por fluorescencia. Puede,de ese modo, identificarse a los cromosomasportadores de la secuencia, determinar si sonsecuencias específicas de un cromosoma ydeterminar la posición del gen en el mismo.En el caso de fluorescencia, la técnica se de-nomina FISH («fluorescence in situhybridization»). La localización del fragmen-to en el cromosoma se visualiza como unpunto brillante (ver II.-5).

- Mapeo físico de los cromosomas: apor-ta un nivel de resolución mayor. Se trata deidentificar un conjunto de fragmentos deADN clonados superpuestos que juntos re-presenten un cromosoma o un genoma com-pleto. Los mapas así obtenidos se llamanmapas físicos, porque el ADN es el materialfísico del genoma.

El mapa físico es útil en tres aspectos:

1- Los marcadores genéticos ubicados enlos clones pueden ordenarse y contribuir alproceso general de mapeo.

2- Cuando se han obtenido los clonescontiguos, ellos representan una genotecaordenada de secuencias de DNA que pue-de utilizarse para futuros análisis genéticos,como, por ejemplo, correlacionar fenotiposmutantes con disrupciones en regionesmoleculares específicas.

3- Estos clones constituyen la materia pri-ma para secuenciar en proyectos genómicosa gran escala.

2.3 Secuenciación a gran escala delgenoma

- Generación de bancos de EST (etique-tas de secuencias expresadas)

La complejidad de los genomas euca-riotas hace aconsejable, como primeraaproximación, no abordar el estudio delgenoma completo. Es preferible estudiar sólouna fracción del mismo, es decir, aquellosgenes que se están expresando en un mo-mento determinado de la vida del organis-mo. Para ello se obtienen poblaciones deADNc (que reflejan sólo secuencias expresa-das) que se secuencian de forma masiva para

generar miles de secuencias parciales conoci-das como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuenciasde entre 300-500 pb suelen ser suficientespara la identificación de los genes mediantecomparación con las secuencias existentes enlas bases de datos públicas (ej. Genbank,EMBL), utilizando para ello programas deanálisis informático. Si la información conte-nida en la secuencia parcial no es suficiente,habría que determinar la estructura del ADNccompleto para estudiar su función por otrosmétodos.

- Secuenciación genómicaLa aproximación anterior no permite

identificar genes que se expresan a bajo ni-vel o en situaciones fisiológicas no considera-das o regiones no representadas en el ARNm.Para obtener esta información debesecuenciarse el genoma completo. Para ello,el ADN genómico total se digiere con enzimasde restricción apropiadas o se fragmentamecánicamente para generar fragmentos degran tamaño (100-300 kb), que se clonan envectores apropiados, para construirgenotecas que contienen, al menos, una re-presentación completa del genoma, quepuede estudiarse en detalle y secuenciarse(ver II.-3). A fin de distinguir las regionescodificantes para genes, que en muchos or-ganismos representan un porcentaje bastan-te pequeño del genoma, de las nocodificantes, las secuencias se comparan conlas secuencias de ESTs y ADNc previamenteestudiadas.

a) Secuenciación de los clones y ensam-blado de los fragmentos

El clonado comienza obteniendo un nú-mero elevado de fragmentos al azar quese clonan en un vector apropiado. En la pre-paración de mapas físicos de genomas seutilizan vectores como los cósmidos, los YAC,los BAC y los PAC, que aceptan insertos degran tamaño (ver II.-3). El contenido de es-tos clones se caracteriza y se ordenan, bus-cando los puntos de solapamiento o super-posición. Un conjunto de clones solapantesse llama contiguo (contig). Para establecerel solapamiento de clones al azar sesecuencian regiones cortas del insertoproximales al sitio de clonado utilizandoprimers posicionados en el vector. Los vacíos(gaps) se completan utilizando el final de un


fragmento clonado para llegar al siguien-te (primer walking). A medida que se vancaracterizando los clones, los contiguos sealargan y van convergiendo unos con otros.El proyecto termina cuando se tiene un con-junto de contiguos que equivale al núme-ro de cromosomas de la especie en estu-dio. En la Fig. 4 se resume una estrategia desecuenciación jerárquica (hierarchicalshotgun sequencing). Esta se usa paragenomas grandes. Para genomas más peque-ños se utiliza otra, llamada secuenciación degenomas completos (whole genomeshotgun sequencing).

Todos los estadíos del análisis genómicocomo la preparación de clones, el aislamien-to de ADN, la electroforesis y la secuenciaciónhan sido bien adaptados a diferentes má-quinas o robots, automatizando el trabajo.

b) Ordenamiento de los clones

Se utilizan va-rias técnicas paraordenar los clonesen contiguos. Entreellas:

- FISH: para lo-calizar las posicio-nes aproximadasde insertos gran-des.

- Fenotipifica-ción (finger-printing): se cortael clon con enzimasde restricción quegeneran un grupode bandas que re-presentan un«fingerprint» o«huella digital» delclon. Las bandasgeneradas por va-rios clones puedenalinearse visual-mente o por unprograma de com-putación para de-terminar si se super-ponen o solapan.

- STS («sequen-ce tag sites» o si-tios de secuenciamarcada): son se-

cuencias cortas de insertos grandes clonados.Se reúne un conjunto de clones al azar y secortan en fragmentos más pequeños que seclonan en λ y se secuencian pequeñas regio-nes de cada uno. Para ello se diseñan primersque amplifican una secuencia corta de ADN(STS).

3 Utilización de mapas genómicos para elanálisis genético

Los mapas genéticos y los mapas físicosson un importante punto de partida para va-rios tipos de análisis genético, incluyendo elaislamiento de genes y genómica funcional.Por ejemplo:

- Aislamiento de genes por clonadoposicional: para ubicar un gen cuya secuen-cia se desconoce se puede partir de un mar-cador conocido que esté estrechamente li-gado al mismo. Este marcador actúa como

Figura 4:Figura 4:Figura 4:Figura 4:Figura 4: Estrategia de secuenciado jerárquico («hierarchical shotgunsequencing strategy»). El primer paso consiste en construir unagenoteca por fragmentación del ADN e introducción del mismo envectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Losfragmentos de ADN representados en la misma son organizados enun mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciadospara lo cual se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños(«shotgun library»). La secuencia de los clones se ensambla finalmentepara reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicacióndel International Human Genome Sequencing Consortium, 2001.


punto de partida para el procedimiento decaminado cromosómico (chromosomewalking), por el cual los fragmentos finalesdel marcador ligado son utilizados comosondas para seleccionar otros clones de lagenoteca. Del segundo grupo de clones (losque solapan con el inicial) se hacen mapasde restricción y los fragmentos obtenidos sonutilizados para hacer una nueva ronda deselección de clones superpuestos. Así el pro-ceso de «caminado» se mueve hacia amboslados a partir del sitio inicial, que culminacuando se llega al gen de interés. Existe otratécnica relacionada llamada saltocromosómico, que permite saltar a través deáreas distantes y potencialmente noclonables del ADN y genera «marcas», am-pliamente espaciadas a lo largo de la secuen-cia, que pueden utilizarse como puntos deinicio para múltiples caminatas cromosómicasbidireccionales. Esta técnica consiste en crearfragmentos grandes (entre 80-150 kb) porrestricción del ADN en la región que se creecontiene al gen de interés. Cada fragmentode ADN es luego circularizado, poniendo encontacto los extremos libres. Este procedi-miento acerca puntos relativamente distan-tes de la región de genoma en estudio. Setrata de generar en esa unión un sitio queno sea cortado en una posterior restricción,de manera que esas dos regiones que esta-ban distantes en el genoma ahora estenunidas en un fragmento. El círculo se cortacon una nueva enzima de restricción y los frag-mentos obtenidos, entre los que se encuen-tran los sitios de unión, se clonan en fagos.Esto es lo que se llama una «genoteca desaltos». Una sonda del sector de comienzode la región que contiene al gen de interéspuede utilizarse como punta de partida paracomenzar a «saltar» por el genoma. Un sal-to puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kbhacia el locus de interés. Una vez allí, el otroextremo de la unión del fragmento inicial secorta y se usa para buscar el siguiente puntode salto en la genoteca. O sea que a travésde las uniones se va avanzando hacia el pun-to donde se encuentra el locus. Cada posi-ción de salto es un punto de partida parauna caminata cromosómica. Estas regionesse van secuenciando. Allí comienza la búsque-da de genes utilizando programas de predic-ción y se seleccionan las secuencias

candidatas. Esta estrategia de saltos se utili-zó para clonar el gen de la fibrosis quística,que es una enfermedad humana que resultafatal y es causada por mutaciones en gen degran tamaño localizado en el cromosoma 7.

- Estrategia del gen candidato: la carac-terización de una región cromosómica haceque aparezcan varios genes de función des-conocida. Si un gen de interés es mapeadoen esa región, estas secuencias pasan a ser«candidatas». Para cada una de ellas, o parala más probable de acuerdo al análisis de se-cuencia, se diseñan experimentos tendientesa determinar en cuales tejidos se expresa, enqué condiciones, etc., utilizando Northernblot o RT-PCR. Si el patrón de expresión en-contrado coincide con el patrón esperado esaltamente probable que hayamos encontra-do el gen de interés. El experimento idealpara confirmar esto, sería la transformaciónde un individuo mutante para esta funcióncon el gen normal. Si se produce la reversióndel fenotipo mutante (complementación),tendremos la prueba irrefutable de que es-tamos frente al gen buscado.

- Genes con patrones complejos deherencia: no todos los genes muestran pa-trones simples de herencia. Puede sucederque:

- La variación fenotípica sea cuantita-tiva, como peso o altura. Este tipo de varia-ción se debe a la interacción acumulativaentre alelos + y – de varios genes y el am-biente. La disponibilidad de miles de marca-dores moleculares como los SSLP, dispuestosa lo largo del cromosoma, ha posibilitado elmapeo de algunos de estos genes que con-tribuyen a la variación cuantitativa cuyos locison llamados QTL (quantitative trait loci).

Para abordar este problema, se buscandos tipos de líneas que muestren fenotiposcontrastantes para un carácter cuantitativoy se cruzan para generar descendenciahomocigota que contenga solo un segmen-to o un pequeño número de segmentos deuna de las líneas. Se realizan cruzas yretrocuzas y se obtienen líneas endocriadasrecombinantes (RIL). Estos individuos pue-den caracterizarse por su fenotipo y puedeestimarse la contribución de los segmentosespecíficos a la variación observada. (ver IV.2)

En el futuro, el análisis de SNP (polimor-fismos de un nucleótido simple) promete ace-


lerar el mapeo de caracteres complejos. Nue-vos enfoques de mapeo de QTL y QTN(quantitative trait nucleotide) están dispo-nibles. El concepto emergente es la posibili-dad de explorar directamente la variacióndentro de genes y no a través de marcado-res anónimos.

4 Análisis funcional de los genes

Una vez secuenciado el genoma comple-to pueden identificarse la mayoría de losgenes de una especie. Restaría entonces de-terminar cuál es la función de cada uno deellos y cómo interaccionan para definir unfenotipo determinado. La genómica funcio-nal intenta resolver esta cuestión a través delestudio de:

- El transcriptoma: se refiere al estudiode los perfiles de expresión de todos losgenes presentes en el genoma. El métodomás utilizado es el de micromatrices de ADN,que permite analizar simultáneamente laexpresión de miles de genes, pudiéndose dis-poner 5000-6000 genes (ESTs, ADNc,oligonucleótidos) sobre un portaobjetos uti-lizando un sistema robotizado. Sobre estechip de ADN se realizan experimentos de hi-bridación con muestras marcadas radioacti-vamente o con fluoróforos apropiados, y losresultados se cuantifican mediante análisiscon phosphorimager o microscopía confocal(ver VII.-2). De esta manera se pueden iden-tificar, de forma simultánea, los patronesde expresión de miles de genes en un mo-mento del desarrollo o en respuesta a dife-rentes estímulos ambientales. El análisisbioinformático de estos datos permite aso-ciar grupos de genes que se expresan de for-ma coordinada y proporciona informaciónimportante sobre la función de los mismos,ver (VII.3).

- El proteoma: comprende el conjuntototal de proteínas expresadas por ungenoma completo, incluyendo las modifica-das después de la traducción. El estudio deltranscriptoma debe ser complementado conel análisis de expresión de las proteínas codi-ficadas por los transcriptos, puesto que es-tas macromoléculas están al final de la rutade expresión génica. El método más utiliza-do para estudiar la abundancia relativa decientos de proteínas es la electroforesis

bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE), que permite separar con gran resolu-ción, la mayoría de los polipéptidos celularescombinando de forma secuencial diferenciasen carga y en masa molecular. Utilizando sis-temas computarizados de análisis de imagense seleccionan las proteínas cuya abundan-cia relativa cambia durante el desarrollo o enrespuesta a diferentes estímulos ambienta-les. Los polipéptidos se purifican y digierencon proteasas para generar una colecciónde péptidos que se analizan porespectrometría de masas o se secuencian apartir del extremo amino. Para identificar laproteína, los perfiles de masa molecular osecuencias de aminoácidos obtenidos se com-paran con las bases de datos de proteínasexistentes.

- El metaboloma: comprende el conjun-to total de metabolitos de una célula. Enplantas, el metabolismo secundario (con-junto de reacciones que no son vitales parael individuo y que conducen a la produciónde compuestos que no tienen una funciónreconocida en el manteniento de los proce-sos fisiológicos fundamentales de los orga-nismos que los sintetizan pero que a vecesayudan a la supervivencia, como por ejem-plo antraquinonas, alcaloides, digoxina,taumatina, vainillina, menta, etc.) produceuna enorme variedad de compuestos dife-rentes de los que se han identificado 40.000y se estima que aún quedan por descubriralrededor de 100.000. Los investigadores quetrabajan en este nuevo campo de la químicaaplicada a la biología (metabolómica) consi-deran que sólo de esta forma se podría defi-nir, en términos moleculares, un fenotipoconcreto. En metabolómica se emplean he-rramientas analíticas muy sensibles (talescomo espectrometría de masa, cromatrogra-fía líquida o gaseosa y resonancia magnéticanuclear) para analizar los cambiosmetabólicos provocados por mutacionesgénicas o por la expresión de transgenes.La metabolómica puede ser aplicada almonitoreo de estreses inducidos, para iden-tificar pasos metabólicos limitantes, para elanálisis de mutantes y hasta para realizar laevaluación de manejos agronómicos, talescomo el efecto de fertilizantes sobre el me-tabolismo, etc.

- La bioinformática intenta dar sentido


a la información derivada de las técnicas an-teriormente descritas. La importancia de estaciencia resulta obvia cuando se considera quelos genomas poseen miles de millones depares de bases (ver VII.-3).

5 Modelos

El mapeo comparativo ha demostradoque la organización de los genes dentro delos genomas ha permanecido muy conser-vada a través de la evolución, existiendo es-trechas relaciones de colinearidad entre losgenomas de casi todas las gramíneas cultiva-das, entre las solanáceas, entre lasbrasicaceas cultivadas y Arabidopsis, entrelos pinos, rosáceas y varias leguminosas. Porello, teniendo en cuenta la envergadura deun proyecto de secuenciado de un organis-mo, los emprendimientos genómicos toma-ron especies modelo, representativas de ungenoma vegetal. El primer modelo vegetalfue una dicotiledónea, Arabidopsis thaliana.Le siguió una monocotiledónea, el arroz, cuyogenoma es seis veces menor que el del maízy 37 veces menor que el del trigo. El estudiode estas dos especies permitirá arribar a co-nocimientos clave para el mejoramiento ve-getal.

Arabidopsis thaliana es una dicotile-dónea que posee uno de los genomas ve-getales más pequeños. Carece de importan-cia económica pero resulta ser un excelenteorganismo para la investigación puesto quees fácil de transformar y su ciclo de vida tar-da sólo 7 semanas, de semilla a semilla. Alre-dedor de 12.000 científicos trabajan coordi-nadamente en Arabidopsis, conformando elmás avanzado sistema de experimentos enbiología de plantas del mundo. Su secuenciagenética es de libre acceso en el sitio Webwww.arabidopsis.org, así como también lasexperiencias biotecnológicas que se están ose han realizado con esta planta. En un artí-culo publicado en Nature (2000) se analiza elgenoma de esta planta a partir de las115.4 megabases secuenciadas (de un totalde 125). Pudo establecerse que la evoluciónde Arabidopsis involucró una duplicacióncompleta del genoma, seguida por una sub-secuente pérdida y duplicación de genes,

lo cual dio origen a un genoma dinámico,enriquecido por una transferencia lateral degenes de cianobacterias. El genoma contie-ne 25.498 genes que codifican para 11.000familias de proteínas, con una diversidad fun-cional similar a la encontrada en Drosophilay Caenorhabditis elegans. Arabidopsis po-see varias familias de proteínas nuevas perocarece de otras comunes, indicando que losconjuntos de proteínas en común han expe-rimentado una expansión y contracción enestos tres grupos eucariotas.

6 Algunas generalizaciones acerca de losgenomas

Los estudios en especies modelo han per-mitido arribar a varias generalizaciones. Unade ellas es que el número de genes no es labase de la complejidad. La mosca de la fru-ta tiene unos 13000 genes, Caenorhabitiselegans 18000, Arabidopsis 26000 y los hu-manos 31000. Si el número de genes nos esmuy diferente entre estas especies, ¿cuál esla base de la mayor complejidad en los hu-manos?

La explicación estaría en el proteoma, másque en el genoma. Las proteínas codificadaspor los genes pueden agruparse en familiasen base a su similitud y muchas de estas fa-milias proteicas son compartidas por todoslos grupos mencionados, aunque el númerode miembros por familia es mayor en huma-nos. Esto es particularmente evidente enaquellos genes involucrados en el desarro-llo. Los humanos tenemos 30 genes parafactores de crecimiento del fribroblasto, mien-tras que Drosophila y Caenorhabitis eleganstienen 2. Las nuevas proteínas surgen a tra-vés de cortes y empalmes alternativos deun mismo ARN (alternative splicing), lo quepermite aumentar considerablemente la di-versidad proteica a partir de los mismos men-sajes. Las predicciones indican que el 60 %de los genes humanos tiene dos o más alter-nativas de splicing. En Caenorhabitis el 22%.Un elevado número de factores de trans-cripción y modificaciones postraduccio-nales también conducen a una mayor com-plejidad.

En el caso de Arabidopsis, cerca del 9 %de los genes son factores de transcripción


(FT). Si se compara la proporción con losgenomas de otras especies, se observa queArabidopsis no sólo tiene más genes que al-gunos animales pequeños, sino que la pro-porción de FT es más alta que en cualquierclase de organismo estudiado. Esto parecereflejar el hecho de que las plantas debenadaptarse a una amplia variedad de condi-ciones medioambientales, a diferencia de losanimales, que pueden movilizarse y cambiarde lugar si este no les resulta propicio.

En humanos, los genes ocupan unacuarta parte del genoma, y sólo el 1,5%codifica para proteínas. Las secuencias co-rrespondientes a los exones (secuencias delmensajero que se encuentran representa-das en la proteína, las secuencias corres-pondientes a los intrones no lo están) com-prenden un porcentaje bajo del genoma,mientras que los intrones comprenden el24%. Los genes no están distribuídos enforma pareja. Algunos se encuentran agru-pados en ciertas regiones del genoma mien-tras que otros se encuentran aislados. En lamosca, el nematodo y Arabidopsis la dispo-sición de los genes es mucho más regular.

Aproximadamente la mitad del genomahumano consiste de secuencias repetitivas,siendo la mayoría de ellas secuencias «pará-sitas» de elementos transponibles que sepropagan replicándose e insertando una co-pia de sí mismos en otras regiones delgenoma. En la actualidad solo dos tipos deelementos son activos, Alu y LINE1. La ma-yoría de los mismos se encuentran en regio-nes ricas en A y T, mientras que los genes seencuentran en áreas con elevado contenidode G y C. Fragmentos de estos elementostambién se encontraron en las secuenciasregulatorias que controlan la expresión devarios genes, por lo que se ha sugerido que,de alguna manera, podrían afectar positiva-mente su expresión y evolución.

Los genomas vegetales también estánplagados de estas secuencias repetitivas.Haciendo uso de la posibilidad que nos brin-dan las bases de datos de llevar a cabo«Northerns electrónicos» fue posible encon-trar elementos repetitivos en las bases de ESTde trigo, cebada y centeno, siendo 0.15 %de las EST similares a retrotransposones (ele-mentos genéticos transponibles, es decir quepueden movilizarse de un sector del genoma

a otro y cuyo movimiento depende de latranscripción reversa . Son secuencias sin fun-ción aparente que han contribuído a lo largode la evolución a la expansión de losgenomas de plantas y animales superiores).

Ejemplo aplicado al mapeo y caracteri-zación de los genes de vernalización de loscereales

Un ejemplo interesante para aplicar va-rios de estos conceptos ha sido la investiga-ción que llevó al mapeo y caracterización delos genes de vernalización de trigo (Yang ycol., 2004).

El descubrimiento de estos genes es unbuen ejemplo de cómo se encaran algunosproyectos de genómica. Se utilizó trigodiploide (2n=2x=14 AA) debido a la menorcomplejidad de su genoma que los del trigopan y candeal y se confeccionaron detalla-dos mapas genéticos y físicos para la regióncromosómica que los contenía en trigo, arrozy sorgo. Haciendo uso de las herramientasde la genómica comparativa se determinóque uno de estos genes, VRN1, estáinvolucrado en la transición de los ápices des-de un estado de crecimiento vegetativo auno reproductivo. Este gen es similar a unohallado en Arabidopsis llamado APETALA1,que no está involucrado en la respuesta a lavernalización.

El otro gen involucrado en el proceso,VRN2 es un represor dominante de la flora-ción en cereales de invierno. Por mapeogenético de alta densidad, utilizando unapoblación de trigo diploide obtenida decruzar progenitores con hábitoscontrastantes de crecimiento, uno primave-ral y el otro invernal, se determinó que estegen se encuentra ubicado en el brazo lar-go del cromosoma 5A. A partir de aquí serealizó el clonado posicional del mismo. Estosignifica que a partir de marcadores conoci-dos ubicados en el genoma se comenzó unacaminata cromosómica. De esta manera seconstruyó un mapa físico o de secuencia dela región que contenía el gen. Para ello seutilizaron marcadores moleculares distruibuí-dos en la región, genotecas de BAC ygenotecas de ADNc. La comparación de lasecuencia de esta región con regiones equi-valentes de cebada y de arroz permitió esta-blecer que esta región contenía ocho genes,


cinco de los cuales se encontraron en el mis-mo orden y orientación que en la cebada ytres como en el arroz. La función de algunosde estos genes es aún desconocida. La re-gión también contenía elementos repetitivoso retrotransposones.

Dos de los genes allí ubicados, denomi-nados ZCCT1 y ZCCT2, codificaban para pro-teínas muy similares, lo cual permitió inferirque los mismos provienen de un evento deduplicación que ocurrió millones de añosatrás. Estas proteínas resultaron ser simila-res a una proteína de Arabidopsis y de arrozque está involucrada en la regulación del tiem-po de floración. Por ello, este gen era uncandidato atractivo para ser el represor defloración, es decir VRN2.

Los transcriptos de este gen son muypoco abundantes en las hojas y desapare-

cen durante el proceso de vernalización, noobstante ello, el análisis de su expresiónpermitió determinar que junto con la desapa-rición de los transcriptos de VRN2 se produ-ce un incremento de los transcriptos deVRN1, lo cual resultaba coherente con lainteracción epistática entre los dos genes ycon el hecho de que VRN2 actúe como unrepresor de la floración, que directa o indi-rectamente reprime la transcripción de VRN1.Todas las pruebas de localización de lostranscriptos y niveles de expresión conduje-ron a concluir que ZCCT1 era VRN2.

También se estableció que las diferenciasentre variedades invernales y primaverales detrigo estarían dadas por diferencias en laregión codificante de este gen (es decir enaquella región que está representada en elARN mensajero). En una accesión de hábitoprimaveral se encontró una mutación de pun-to que redundaba en un cambio de unaminoácido arginina por un triptofano enuna región crítica del gen, lo cual afectaría sufunción. La arginina se encuentra en todaslas proteínas del tipo ZCCT de Arabidopsis,arroz y cebada. Esta mutación de punto se-ría la causante del hábito primaveral.

El análisis de este sitio en variedades cul-tivadas de trigo diploide permitió verificar quela mutación está ausente en todas las varie-dades de trigo invernal. Lo mismo ocurrió encebada. Todo esto llevó a sugerir que la granadaptabilidad de los cereales de clima tem-plado fue favorecida por un sistema muy flexi-ble de regulación de la iniciación de la flora-ción. El hábito ancestral de crecimiento in-vernal, esencial para la adaptación a climafrío, poseería el potencial para generar for-mas primaverales por mutaciones de pérdi-da de función en los dos principales loci devernalización.

Para validar la hipótesis de que ZCCT1era VRN2 se transformó trigo pan invernalcon una construcción que inactivaba los men-sajeros del mismo, técnica denominada deARN de interferencia (ver III.3). Estas plan-tas transformadas, donde estaba inhibida laexpresión del gen (efecto que semejaba lainhibición del mismo por frío) mostraron unaaceleración en el tiempo de floración (23 días)en relación a los controles no transformados(Fig.5). Esto confirmó que la disminución enlos niveles de los transcriptos de VRN2

Figura 5: La inhibición de la expresióndel gen VRN2 portransgénesis acelera la floración en aproximadamenteun mes en comparación con la misma variedad de trigono modificada. De Yan et al. (2004), gentileza Dr. JorgeDubcovsky.


(ZCCT1) está directamente relacionada conla aceleración del tiempo de floración. Esteexperimento demostró, además, que estatecnología puede ser utilizada para manipu-lar el tiempo de floración del trigo y confir-mó que VRN2, un factor de transcripción,juega un rol central en la regulación de la flo-ración. Este sería entonces un nuevo tipo degen involucrado en la regulación de otros

genes de floración. En variedades invernalesde trigo, VRN2 evita la floración. Cuando laplanta se expone a un período de frío du-rante la vernalización, la actividad del mismodisminuye y permite que la planta florezca.

A diferencia del gen VRN1, VRN2 es dife-rente de un gen de Arabidopsis que tieneuna función similar. Esto permitió sugerir queen su evolución, Arabidopsis y los cereales ypastos de clima templado desarrollaron di-ferentes mecanismos de vernalización, queincluyen genes similares y genes muy diferen-tes.

De ello también se concluye que si bienlos modelos son importantes, no siempre seadaptan a todos los casos y hay que analizartodos los detalles antes de extrapolar infor-mación para aplicarla a la comprensión de losfenómenos biológicos.

7 Genómica y Agricultura

Especialistas en varias disciplinas han lle-gado a la conclusión de que el alcance de lagenómica será mayor en lo que se refiere a la

economía y la calidad de vida que en el ám-bito de la salud humana. Gracias al aportede grupos de investigación de todo el mun-do se dispone de bases de datos públicas coninformación genómica de utilidad para losmejoradores. El conocimiento de cómo ac-túan los genes en una especie puede ayudara los mejoradores a perfeccionar su funciónen otra especie. La secuencia de los genomas

de Arabidopsis y de arroz pro-porcionarán información relevan-te acerca de otros cultivos, comoel maíz y el trigo. Dado que es-tos tres cereales representan másde la mitad de la producciónalimentaria mundial y que el arrozes el alimento básico de más dela mitad de la población del pla-neta, la trascendencia de lagenómica en la agricultura es in-discutible. La similitud entre lasespecies de cereales también im-plica que cuando se trasladangenes de una especie de cerea-les a otra, tenderán a funcionarbien y en la misma forma con unamínima manipulación genética.

A través de esfuerzos públi-cos y privados podrán identificar-se conjuntos de genes asociados

con caracteres como rendimiento, resisten-cia a la sequía, calidad de los alimentos, resis-tencia a insectos y tolerancia a herbicidas. Deesta manera se acelerará significativamenteel aporte de nuevas variedades al mercado,ya sea por modificación genética o por se-lección con marcadores moleculares o uti-lizando criterios de selección a partir de lainformación molecular.

La genómica comparativa, basada en elanálisis de ESTs de diferentes plantas tole-rantes a estreses abióticos, permitirá la iden-tificación de redes de genes comunes aso-ciados con estreses ambientales, tales comosalinidad, sequía, bajas y altas temperaturas.El análisis de especies tolerantes a situa-ciones extremas permitirá localizar genesinvolucrados en los mecanismos que las ha-cen tolerantes. Dichos genes podrán enton-ces ser transferidos a especies de cultivo.Como ejemplos pueden citarse Agrostisadamsonii y Agrostis robusta, tolerantes asalinidad, Microlaena stipoides, tolerante aaluminio y Deschampsia antarctica, toleran-

Figura 6: Categorización funcional de ESTs de Deschampsiaantarctica. El objetivo de este proyecto es encontrar genesinvolucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos,por tecnología génica, a especies de cultivo. Gentileza de G.Spangenberg.


te a bajas temperaturas (la única gramíneaque crece en la Antártida) (Fig. 6).

También se ha mencionado que los fac-tores de transcripción serían las llaves paradesbloquear funciones génicas que aprove-chen la diversidad de la naturaleza para pro-ducir mejores cultivos. Estos son genes quevirtualmente controlan todo carácter im-portante, desde el punto de vista agrícola,en las plantas, incluyendo rendimiento, re-sistencia a las enfermedades, proteccióncontra las heladas y sequía, producción dequímicos, proteínas usadas en farmacéuti-ca, etc. La mayoría de los caracteres vegeta-les a los que interesa aplicar la ingenieríagenética son multigénicos (ej. tolerancia alestrés hídrico) y los genes involucrados seexpresan en cascadas de forma tal que genesprimarios activan a genes secundarios que asu vez activan a genes terciarios. Los factoresde transcripción serían los responsables dehacer funcionar a los genes primarios,obteniéndose largas cascadas de expresiónde genes por la manipulación de un solo gen.Durante los últimos años se ha obtenido unagran colección de FT de plantas,funcionalmente caracterizados, no sólo enArabidopsis, sino también en especies comotomate, maíz y soja. En total hay cerca de1900 FT en Arabidopsis pero en el contextode la genómica funcional el interés recae enunas 60 familias que tienen funciones reco-nocidas. La herramienta primaria que se utili-za para conocer la función de los FT consisteen sobre-expresarlos y/o detener la expre-sión de algunos de ellos por disrupcióngénica o knock out. Se puede, por ejemplo,medir el efecto de cada FT en la composiciónde los lípidos en las semillas aceiteras y la com-posición de lípidos en las hojas, la composi-ción de azúcares, de esteroides, etc., estudiarprocesos básicos, a través de la dilucidaciónde sus efectos en el desarrollo vegetal y laresistencia a las enfermedades, o tratar deidentificar el FT que regula el consumo de ni-trógeno (N). El N es uno de los insumos máscostosos para la agricultura, por lo que iden-tificar los genes que controlan y modifican larespuesta al N sería de gran valor.

En este sentido también existen proyec-tos genómicos sobre leguminosas y sussimbiontes fijadores de nitrógeno. Recien-temente se han secuenciado los genomas de

las especies de Mesorhizobium ySinorhizobium y se han producido cientosde miles de EST de Medicago truncatula,Lotus corniculatus y soja. En el caso de M.truncatula no sólo se han disectado los pa-sos que controlan las señales entre la bacte-ria fijadora y la planta sino también entre laplanta y otro simbionte, las micorrizas (aso-ciación de un hongo con la raíz de una plan-ta superior. Esta asociación no es específi-ca de especie como el caso de Rhizobium ylas leguminosas. El hongo puede ser devarios géneros y aportan fósforo a la plan-ta,). Recientemente se logró la identificación,en alfalfa, de un receptor requerido para elreconocimiento de señales bacterianas denodulación, los llamados factores NOD.

Las plantas medicinales aportan el 25%de los compuestos activos utilizados actual-mente por la industria farmacéutica. Entreestos compuestos se encuentran loscitocromos P450, que participan en labiosíntesis de muchos compuestosanticancerígenos, alcaloides, fitoesteroides,antioxidantes y antimicrobianos. Tambiéntienen un rol muy importante en ladetoxificación de xenobióticos (herbicidas ypesticidas). Se han identificado 1052citocromos P450 y el objetivo actual es, utili-zando herramientas de metabolómica, de-terminar su función bioquímica precisa.

Otro de los objetivos de la metabolómicaes el estudio de la síntesis de las esenciasque confieren perfume a las flores y el mejo-ramiento del sabor de algunas plantas utili-zadas en alimentación humana, como porejemplo Cassava, donde el objetivo sería laeliminación de los glicósidos cianogénicosque le confieren sabor amargo.

La devastación de los bosques es motivosuficiente para invertir en proyectos degenómica tendientes a la identificación degenes involucrados en perennidad, desarro-llo, interacción con herbívoros, respuesta aestrés y síntesis de metabolitos secundarioscomo lignina y celulosa. Se han comenzadoa colectar EST de álamo, abedul, abeto, pinoy eucaliptus. El álamo se utiliza como sistemamodelo para el análisis de los genesinvolucrados en la formación de madera. Otroobjetivo en este campo es la búsqueda deestrategias para inducir floración temprana,


que es un factor crítico en el mejoramientode forestales.

La secuenciación de los genes y la dilu-cidación de las vías que controlan la flora-ción en los cereales, que difiere en varios as-pectos con los corresponientes enArabidospsis, ha sido otro de los logros dela genómica. Como se mencionara anterior-mente en este capítulo, recientemente selocalizaron y caracterizaron, en trigo y ceba-da, los genes VRN1 y VRN2, que son los genescentrales en la vía de vernalización en trigo,cebada y otros cereales invernales. Este co-nocimiento es clave en agricultura, ya quepermitiría, potencialmente, controlar la flo-ración en cultivos de gran importancia eco-nómica, como los cereales y los forrajes.

8 Aportes de la genómica almejoramiento de trigo

El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x=42; AABBDD) es uno de los principales culti-vos alimenticios ya que provee cerca del 55%de los carbohidratos consumidos por el hom-bre. La genética de este cultivo resulta com-pleja, es de naturaleza hexaploide, con tresgenomas homeólogos denominados A, B yD, que aportan 7 pares de cromosomas cadauno. Los genes redundantes son una nor-ma, con sets homoalélicos triplicados en lamayoría de ellos. Dentro de los cereales, elgenoma de trigo pan es el de mayor tama-ño (17000 Mb trigo, 2800 Mb maíz, 800 Mbsorgo, 450 Mb arroz). Más del 80% delgenoma de trigo lo constituyen secuenciasde ADN altamente repetitivo. El restante 20%está compuesto por ADN de bajo númerode copias o copia única, donde se encuen-tran la mayoría de los genes. Si bien las se-cuencias del ADN altamente repetitivo varíande especie en especie, las secuencias de losgenes en general son conservadas. Esta ca-racterística permite el uso de sondasheterólogas (de otros genomas) en experi-mentos de hibridación de tipo RFLP (ver II.4)para identificar secuencias conservadas enespecies diferentes dentro de una misma fa-milia taxonómica (Devos y Gale, 2000).

En 1989 se publicó el primer mapagenético molecular de trigo correspondien-te a los cromosomas homeólogos del grupo

7, observándose que en gran parte de lostres genomas de trigo hexaploide se conser-vaba el orden de los genes y marcadores. Estafue la primera prueba de colinearidad engramíneas y posibilita el desarrollo de lagenética comparativa en cereales.

En trabajos posteriores pudo comprobar-se que largos segmentos de los cromosomasde maíz, sorgo, arroz, trigo y cebada conser-van la presencia y el orden de marcadores ygenes, aunque en algunos casos la correspon-dencia cromosómica ha sido modificada porduplicaciones, inversiones o translocacio-nes. En la actualidad se ha logradoconsensuar un mapa unificado degramíneas en el que se detallan secuencias ygenes conservados en diferentes genomas(Fig. 2). A partir de esta herramienta es posi-ble transferir información proveniente deplantas de genomas pequeños (arroz, sor-go) a plantas de genomas más complejoscomo el trigo. Esto facilita la ubicación másprecisa de genes para tolerancia a estrésbiótico y abiótico, prebrotado, dormición,vernalización, etc. y el desarrollo de marca-dores útiles para el mejoramiento.

La información generada a partir de losproyectos genómicos de Arabidopsis, arrozy maíz con el descubrimiento de nuevos genesy QTLs permitirá el desarrollo de marcadoresperfectos, generados a partir de la informa-ción de la secuencia del gen a seleccionar, enlugar de marcadores genéticamente ligados.Actualmente el acceso a los principales genesque afectan la calidad ha abierto nuevas víaspara el desarrollo comercial de diferentes pro-ductos derivados del trigo. Es posible obte-ner variedades con diferente calidad de al-midón, diferente textura de grano, diferen-te composición de gluteninas y gliadinas enfunción del uso industrial. Por otro lado, eldescubrimiento de nuevos genes valiosos deotros genomas y la posibilidad de incorpo-rarlos al trigo a través de la transformaciónpermitirá resolver problemas del cultivo, comopueden ser limitantes debido a estresesbióticos y abiótico o desarrollar nuevas ge-neraciones de transgénicos en función de lasnecesidades del consumidor con mayor con-tenido de aminoácidos esenciales como lalisina, vitaminas, etc.

La complejidad del genoma del trigo hahecho aconsejable abordar los estudiosgenómicos a través del transcriptoma. Paraello, se han establecido consorcios interna-


cionales. Las bases de datos de EST han cre-cido exponencialmente en la última década,de manera que en el National Center forBiotechnology Information dbEST database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) enMarzo de 2004 había 20 millones de ESTs.Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de tri-go hexaploide y sus parientes más cercanosde la tribu Triticeae, que son Hordeumvulgare L., especies diploides y tetraploidesde Triticum, Secale cereale L. y Aegilopsspeltoides Tausch.

Toda esta información permite inferir quela biotecnología puede cambiar el escenariodel trigo en dos áreas principales: (1) prote-giendo al cultivo de estreses bióticos yabióticos y (2) modificando el concepto deproducción de «commodities» por el deproducción de «specialities» derivadas detrigo, de mayor valor agregado, comonoodles (tipo de fideo muy utilizado por losasiáticos), galletitas dulces, crackers (un tipode galletita que se rompe fácilmente), masacongelada, pan de molde, pasta, almidones,plásticos biodegradables, etc.

9 Genomas trabajadores

La genómica aplicada a dilucidar los me-canismos por los cuales funcionan losmicroorganismos puede conducir al aislamien-to de sus componentes para desarrollarnanoestructuras que lleven a cabo comple-jas funciones. Como ejemplos pueden citar-se:

Methanococcus jannaschii: es una bac-teria que produce metano, una importantefuente de energía. Contiene enzimas quesoportan temperaturas y presiones elevadaspor lo que son potencialmente útiles para fi-nes industriales

.Deinococcus radiodurans: soporta nive-les de radiación extremadamente elevadospor lo cual tiene un alto potencial para lim-piar desechos radiactivos.

Thalassiosira pseudonana: se trata deuna diatomea marina que es la principal par-ticipante en el bombeado biológico de car-bono hacia las profundidades de los océa-nos, por lo que posee un elevado potencialpara mitigar los cambios climáticos del pla-neta

10 Proyectos de Genómica en Sudamérica

En Sudamérica se han desarrollado y seencuentran en ejecución algunos proyectosgenómicos. Frente al estado del desarrollode estas áreas en el mundo, existen en laregión serias carencias, tanto de recursoshumanos entrenados como de infraestruc-tura y equipamiento. En Brasil se establecióuna red de cooperación que secuenció com-pletamente el genoma de Xylella fastidio-sa, bacteria que ataca a los cítricos causandoimportantes pérdidas económicas. Tambiénincursionó en el estudio de genómica fun-cional de células cancerosas y desecuenciación del genoma de caña de azú-car, Saccharum oficinalis. En Argentina seha trabajado en la secuenciación de Brucellaabortus, agente causal de la brucelosis bo-vina. Investigadores argentinos participantambién en proyectos de genómica en co-operaciones internacionales, como el consor-cio involucrado en la secuenciación delgenoma de Trypanosoma cruzzi, el proyec-to que llevó a la clonación y caracterizaciónde los genes de vernalización en trigo o elproyecto de búsqueda de genes de toleran-cia a frío en Deschampsia antarctica. EnChile se ha completado recientemente lasecuenciación de Piscirickettsia salmonis,patógeno intracelular de salmones que cau-sa importantes pérdidas en esta industria.Otros ejemplos son el desarrollo de marca-dores de microsatélites (ver II.4) de diver-sas especies, como girasol (colaboración deINTA-Argentina con empresas semilleras lo-cales), vides (INIA-Chile como parte de unconsorcio internacional), alpacas y otroscamélidos sudamericanos (INIA-Chile), entreotros. Actualmente se está desarrollando enChile un programa de genómica funcionalcoordinado por diversos ministerios, destina-do a enfrentar problemas de postcosecha yenfermedades en plantas de interés agríco-la. En varios países se han secuenciado frag-mentos de genomas de virus, y viroides (Ar-gentina, Chile, Uruguay).

Los objetivos para programas degenómica sudamericanos deberían enfocar-se hacia el aumento de la productividad y lamejora de la calidad de los productos, desa-rrollando capacidades para identificar genes


propios del germoplasma regional, de mane-ra de disminuir la dependencia de varieda-des y genes desarrollados y aislados por paí-ses del primer mundo y buscar solucionespara problemas propios de la región, que di-fícilmente pueden ser enfrentados por pro-gramas de mejoramiento genético ajenos ala misma.


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VII.-Capítulo 2

Métodos para el estudio de laexpresión de genes

Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G.

1 Introducción

La capacidad de secuenciar genomas com-pletos desarrollada en la última década haimpulsado a la investigación científica en ladirección de definir la función de cada unode los genes identificados. Para contribuircon ese objetivo se han diseñado técnicasque permiten estudiar la expresión génicaglobal en un determinado tejido y en unmomento particular del desarrollo, posibili-tando la identificación inicial y el agrupamien-to en clases funcionales de secuencias nue-vas con una actividad asociada.

Los procedimientos para esta evaluaciónhan progresado desde los métodos desarro-llados para el análisis de genes únicos especí-ficos (como el Northern slot y dot blotting,la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y losensayos de protección de nucleasas) haciaotros enfocados en la identificación de múl-tiples transcriptos que difieren en su repre-sentación entre las diversas muestras experi-mentales (como la hibridación substractiva,el display diferencial, el ADNc-AFLP®, lasecuenciación de etiquetas expresadas o EST,el análisis serial de la expresión de genes oSAGE y la hibridación de microarreglos). Laorganización de las secuencias dentro de gru-pos funcionales basada en los datos de ex-presión y de homología proporciona un mar-co básico para conducir nuevos estudios diri-gidos a definir la actividad precisa de cadaproducto génico.

2 Hibridación substractiva

Los métodos de hibridación substractivafueron creados a principios de la década quecomenzó en 1980 con el propósito de cons-truir bibliotecas de ADNc para obtener son-das de genes expresados diferencialmente.Fueron los primeros que se utilizaron de ma-nera amplia con el propósito de identificargenes regulados positiva o negativamente en

una escala global. Sus ventajas incluyen lahabilidad de aislar genes de función relacio-nada sin tener conocimientos previos de susecuencia o identidad y el uso de técnicascomunes de biología molecular que no requie-ren equipos especializados de detección yanálisis.

El procedimiento general consiste en lahibridación de ADNc provenientes de unamuestra prueba (tester) con un exceso deARNm proveniente de una muestra control(driver). Los transcriptos expresados en am-bas muestras (tester y driver) forman molé-culas de ARNm/ADNc híbridas, mientras quelas secuencias de ADNc que están presentesúnicamente en la muestra tester permane-cen como hebras simples. Las moléculas dehebras simples y dobles se separan usandocromatografía en hidroxilapatita. Los ADNcexpresados diferencialmente pueden enton-ces ser recuperados y clonados o usados di-rectamente como sondas para analizar unabiblioteca.

Dos limitaciones importantes del proto-colo original son: i) el requerimiento de gran-des cantidades de ARNm y ii) la tendencia auna menor eficiencia en la identificación detranscriptos poco abundantes.

La hibridación substractiva es aplicablesólo a comparaciones de pares de muestrasy debe ser realizada por duplicado con eltester y el driver invertidos para detectar tan-to aumentos como disminuciones en los ni-veles de expresión. Además no genera unamedida cuantitativa y aunque es eficiente enla identificación de genes que están comple-tamente ausentes en el driver no revela fácil-mente a aquellos que están presentes enambas muestras en distinta proporción.

A fin de mejorar el protocolo original serealizaron modificaciones que incluyen la pro-ducción de ADNc con marcas de biotina uoligo(dT)30-látex de manera de refinar la se-paración de las moléculas de cadena simpley doble. También se incorporó la amplifica-ción de ADNc selectos por PCR para dismi-nuir la cantidad inicial de mARN requerido yaumentar la eficiencia de clonado de lostranscriptos seleccionados. En la actualidadse utiliza más comúnmente un protocolo in-genioso conocido como hibridaciónsubstractiva de supresión (SSH) que fue di-señado para favorecer la detección de

230 PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

transcriptos raros expresados diferencial-mente. Este incluye una normalización en larepresentación de los transcriptos diferencia-les basada en la inhibición de la amplificaciónde aquellos que son más abundantes, elimi-nando también la necesidad de separar mo-léculas de cadena doble y simple (Fig.1).

3 Display diferencial y RAP-PCR

Las técnicas conocidas en general como«huellas digitales genéticas de ARN» (ARNfingerprinting) incluyen al display diferencial(DD) y al fingerprinting de ARN con una PCRcebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos

métodos están basados en unaamplificación por PCR desubgrupos al azar de transcriptosa partir de dos o más muestras.

La primera etapa de ambosprocedimientos es común y con-siste en generar ADNc haciendouna transcripción reversa de unafracción de las moléculas deARNm de una muestra. En el dis-play diferencial esto se logra uti-lizando como cebador de latranscripción reversa a un poliTanclado con una o más bases adi-cionales al extremo 3´ del ARNmensajero (por ejemplo (T)12AC).Estos oligonucleótidos se fijan alARN mensajero a través de launión de las bases adicionales,impidiendo que el poliT «resba-le» sobre distintas zonas del poliA. El único grupo de ARNm quees transcripto en forma reversaes el integrado por las moléculasque llevan las bases complemen-tarias a las bases adicionales delpoliT en el extremo del mensaje-ro adyacente al poliA. En con-traste, la RAP-PCR utilizaoligonucleótidos de secuencia ar-bitraria para la transcripciónreversa. Estos cebadores tienennormalmente 10 bases de largoy se unen a sus secuencias com-

Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridización substractiva de supresión (SSH). ElADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadaspor separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formación de los productosde tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia deun exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de lashebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a losadaptadores. El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c puedenunir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificación de b está suprimida debido a lacomplementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptadorque promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios deunión a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente enel tester y ausentes en el driver y además su representación estará normalizada ya que los fragmentos diferencialesabundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenkoet al. 1996.


plementarias permitiendo formar una hebrade ADNc desde este sitio. En este caso elsubgrupo de ARNms que sufre transcripciónreversa estará integrado por aquellas molé-culas que presenten la secuencia complemen-taria a la del cebador orientada en el senti-do adecuado.

Luego de haberse realizado la síntesis dela primer hebra del ADNc, se amplifican seg-mentos de los transcriptos usando pares múl-tiples de cebadores de PCR. Tanto para eldisplay diferencial como para la RAP-PCR, elcebador superior es un oligonucleótido arbi-trario de 10 pares de bases. El cebador infe-rior es el mismo oligonucleótido poliTanclado (para el caso del display dife-rencial) o el decámero arbitrario (parael caso de RAP-PCR) que se usaron al-ternativamente para hacer la trans-cripción reversa.

Se ha estimado que los productosde PCR de 240 combinaciones parti-culares de pares de cebadores de dis-play diferencial (por ejemplo todas lascombinaciones de 20 oligonu-cleótidos arbitrarios y 12 oligonu-cleótidos anclados) representanestadísticamente a todos los ARNmoriginalmente presentes en la mues-tra.

Los productos de PCR pueden sermarcados por incorporación de unnucleótido radiactivo o de una molé-cula que pueda ser detectada a tra-vés de su interacción con un anticuer-po conjugado a un sistema de detec-ción (por ejemplo digoxigenina). Tam-bién puede usarse un cebador unidoa un fluoróforo u optarse por no mar-car los fragmentos amplificados y usarluego una tinción con nitrato de pla-ta para revelar los geles. La visualiza-ción de los productos de PCR se lograluego de la electroforesis en geles depoliacrilamida seguida de la apropia-da generación y detección de imáge-nes, que son evaluadas comparandola intensidad relativa de las bandasproducidas a partir de diferentesmuestras experimentales.

Los fragmentos que están presen-tes en una muestra y ausentes en laotra o aquellos que están presentescon diferentes intensidades relativas

en los distintos tratamientos experimenta-les representan potenciales transcriptos deARNm de expresión diferencial. Típicamen-te, las bandas son evaluadas sólo si amplifi-can en forma consistente en reacciones dePCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2).

La fase final del display diferencial consis-te en la identificación de la secuencia deltranscripto representado por el producto dePCR y la confirmación de que este realmentese expresa en forma contrastante. Estas eta-pas se logran localizando físicamente yescindiendo la sección del gel depoliacrilamida que contiene al producto de

Figura 2: Representación gráfica del método de display diferencial.Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usandocomo cebador un oligonucleótido poliT de secuencia 5´T(T)nTXY3´ (donde 10 Í n Í 12) que se fija en forma estable al extremo 3´delos transcriptos a través de la unión de las bases adicionales desecuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra delADNc, ésta se usa como molde para una reacción de PCR queutiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decámero desecuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decámerosgeneran numerosos perfiles de amplificación a partir de diversassubpoblaciones de ARN mensajeros. El patrón de bandas de lasmuestras experimentales se compara en busca de diferencias detipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de lasbandas.


interés. En la mayoría de los casos debe rea-lizarse un alineamiento de las imágenes delos fragmentos de amplificación con el gel depoliacrilamida seco. En los casos en que seutiliza tinción con nitrato de plata no es ne-cesario realizar este paso, por lo cual la recu-peración de la banda es mucho más eficien-te. Los productos de PCR son purificados delgel y reamplificados.

Se han utilizado varias estrategias paraconfirmar la expresión diferencial de lostranscriptos, que incluyen el uso de los frag-mentos como sondas de Northern, la siem-bra de los fragmentos en membranas parasometerlos a análisis de Northern inverso yel clonado y secuenciación de los productospara diseñar cebadores específicos que per-mitan realizar PCR semicuantitativas. Inde-pendientemente de cuál sea la táctica usadapara confirmar la expresión diferencial, lassecuencias de los fragmentos de los genesexpresados diferencialmente se requierensiempre para comenzar a entender la fun-ción del gen. El aislamiento de la secuenciacompleta de los genes involucrados puedelograrse usando los clones diferenciales enestudios de bibliotecas de ADNc o realizan-do experimentos de 5´RACE.

Dos ventajas importantes de los méto-dos de fingerprinting de ARN con respecto alos de hibridización substractiva son la capa-cidad de comparar muestras experimentalesmúltiples en forma simultánea y la de identi-ficar genes que están regulados tanto positi-va como negativamente en una muestra res-pecto de las otras. Sin embargo, los méto-dos de fingerprinting de ARN comparten conel SSH la limitación de que no son cuantitati-vos. Además suelen aparecer numerosos fal-sos positivos, es decir, fragmentos de genesque parecen estar diferencialmente expresa-dos pero son artefactos de PCR. Otro pro-blema es que estas técnicas deben aplicarseen general a muestras provenientes del mis-mo individuo sometido a distintas condicio-nes o sobre individuos genéticamente idén-ticos (por ejemplo, isolíneas). Cuando se com-paran los perfiles de ARNm de individuos di-ferentes genéticamente, pueden aparecer fal-sos positivos que son resultado de una am-plificación diferencial debida a una variaciónen la secuencia de los transcriptos más que a

diferencias en su representación. Ese proble-ma puede ser evitado utilizando estrategiasde análisis de segregantes en grupo (BSA)aplicadas al estudio de perfiles de ARN.

Finalmente, la investigación de todos losgenes que potencialmente se expresan enforma diferencial requiere el uso deequipamiento de última generación y unainversión extensiva de tiempo y trabajo paradetectar y confirmar la expresión diferencialde cada uno de los genes individuales.

4 Polimorfismos en la longitud de losfragmentos de ADNc amplificados(ADNc-AFLP®)

La tecnología de AFLPÒ, generalmenteutilizada para producir huellas genéticas deADN genómico, puede ser aplicada tambiéna preparaciones de ADNc de doble hebra paraobtener un perfil del transcriptoma. Los pa-trones obtenidos por esta técnica son unaherramienta confiable y eficiente para la iden-tificación de los ARNm expresados diferen-cialmente.

La técnica de ADNc-AFLPÒ detecta frag-mentos de restricción de ADN por medio deamplificación por PCR. Comprende las siguien-tes etapas: i) generación de ADNc, ii) restric-ción del ADNc con dos endonucleasas espe-cíficas, preferiblemente una que reconoce si-tios de 6 bases y otra que reconoce sitios de4 bases, iii) ligación de adaptadores de cade-na doble a los extremos de los fragmentosde restricción, iv) amplificación de unsubgrupo de los fragmentos de restricciónusando dos cebadores complementarios aladaptador que llevan bases selectivas adicio-nales en el extremo 3´ v) electroforesis delos fragmentos de restricción amplificados engeles de poliacrilamida, vi) visualización de lashuellas digitales genéticas mediante el uso deautorradiografías, fosfoimágenes y otrosmétodos (Fig. 3, ver pág.7).

Las mayores ventaja del uso de la tecno-logía de ADNc-AFLPÒ son: i) no se requiereinformación previa de secuencia; ii) se puedeestudiar una fracción muy grande de todoslos genes expresados, iii) es una técnica muysensible que permite la detección detranscriptos de baja abundancia, iv) los frag-mentos son extraídos fácilmente de los geles


y las secuencias correspondientes pueden de-terminarse sin necesidad de clonados previos.

5 Etiquetas de secuencia expresadas(«Expressed sequence tags, EST»)

Los avances tecnológicos que facilitan lasecuenciación masiva condujeron a principiosde los años 90 a idear el concepto de las bi-bliotecas de etiquetas de secuencia expresa-das (bibliotecas de ESTs). Las secuencias ESTson generadas tomando clones al azar de unabiblioteca de ADNc y realizando una sola re-acción de secuenciación que abarca 300-500pb del clon. Las diferencias en la expresiónde genes pueden ser identificadas conside-rando el número de veces en que aparecerepresentada una secuencia en particular. Sinembargo, las secuencias EST a menudo se ge-neran a partir de bibliotecas de ADNc quehan sido normalizadas para ecualizar la abun-dancia de clones que corresponden a los di-ferentes transcriptos. Los EST secuenciadosa partir de estas últimas pueden ser compa-rados para identificar transcriptos que se ex-presan en una biblioteca y están completa-mente ausentes en otra, pero si se pretendeobtener datos cuantitativos exactos que des-criban abundancia relativa se debe recurririndefectiblemente a bibliotecas de ADNc nonormalizadas. La posibilidad de detectar di-ferencias en la expresión de genes a travésde la comparación de la abundancia de se-cuencias en las bases de datos de EST seincrementa con el crecimiento de estas ba-ses.

La combinación de la información gene-rada por los EST (nivel y localización espacio/temporal de la expresión génica) y la de losproyectos de secuenciación de genomas (se-cuencias completas de los genes y sus pro-motores) permite realizar asociaciones deexpresión y homología estructural que enmuchos casos facilitan la inferencia de la po-sible función de los genes identificados. Porsupuesto, esto constituye una instancia ini-cial en la identificación de la función de cadagen. Para determinar su actividad precisadeben hacerse estudios particulares en ge-neral dirigidos a bloquear o aumentar su ex-presión por ingeniería genética y a modificarestructuralmente la molécula de manera de

alterar la actividad de los diferentes dominiosde la proteína que codifica.

6 Análisis serial de la expresión de genes

El análisis serial de la expresión de genes(SAGE) consiste esencialmente en una ver-sión acelerada de la secuenciación de EST.Está basada en el concepto de que una eti-queta corta de unas pocas bases es suficien-te para identificar inequívocamente a untranscripto, siempre y cuando esté ubicadaen una posición definida dentro de la secuen-cia del mensajero. Una etiqueta SAGE con-siste típicamente en 9 bases de secuenciaubicadas por debajo del último sitio de reco-nocimiento de una endonucleasa específicaen el transcripto blanco. Múltiples etiquetasSAGE se ligan juntas en un vector de clonadode manera que una reacción de secuencia de300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, verpág.7). Como cada etiqueta SAGE represen-ta un único transcripto de ARNm, es posibleobtener una visión general de todos losgenes expresados en la muestra original. Lasdiferencias en la expresión de genes entremuestras experimentales pueden entoncesser identificadas comparando la abundanciarelativa de etiquetas SAGE específicas en di-ferentes bibliotecas. Los genes o las secuen-cias EST representados por las etiquetas SAGEson localizados en las bases de datos detec-tando aquellos transcriptos que tengan la eti-queta SAGE en la posición adecuada.

Una limitación del SAGE es la identifica-ción de los genes representados por las se-cuencias de etiquetas. Este proceso está enprimer lugar restringido a secuencias que es-tén accesibles en las bases de datos. Sin em-bargo, esta limitación se tornará menos pro-blemática a medida que se generen más se-cuencias EST y que a las secuencias existen-tes se les asignen asociaciones y función. Otralimitación potencial es la identificación erró-nea de las etiquetas. Esto puede resultar deerrores de secuenciación y de la identificaciónfallida de la región que corresponde al SAGEen la base de datos de secuencia. Además,ciertos transcriptos pueden estar ausentes enla muestra, dependiendo de cuál sea la enzi-ma específica usada para generar la bibliote-ca de SAGE. Otros ARNm por el contrario


pueden estar representados por múltiplesetiquetas SAGE a causa de la existencia depolimorfismos en un sólo nucleótido o el pro-cesamiento alternativo de los transcriptos. Seespera que muchos de esos problemas afec-ten a una porción relativamente pequeña delos genes representados, pero no deberíanser dejados de lado en la interpretación delos resultados.

Por otra parte, dos ventajas importantesdel SAGE sobre la hibridación substractiva yel display diferencial es que los datos obteni-dos son cuantitativos y acumulativos. Si segenera la suficiente cantidad de informaciónde secuencia se obtienen perfiles exactos dela expresión de los transcriptos, que descri-ben la abundancia de todos los genes expre-sados en una célula o tejido. Existe una basede datos pública de expresión génica que hasido creada para el almacenamiento y análi-sis de secuencias de SAGE cuyo poder conti-nuará creciendo a medida que se contribuyacon más información. Otra característica delos datos de SAGE es que pueden comple-mentar datos de ESTs generados a partir debibliotecas de ADNc normalizadas osubstraídas. Los EST brindan información desecuencia mientras que el SAGE provee da-tos cuantitativos describiendo la abundanciade los transcriptos.

Finalmente, a pesar de que el SAGE re-quiere capacidad de secuenciación de últimageneración, la cantidad de datos que aportapuede ser 20 veces mayor que el que posibi-lita la misma cantidad de secuenciación EST.

7 Hibridación de microarreglos omicromatrices

La evaluación de la expresión de genesusando la tecnología de micromatrices hademostrado ser un procedimiento muy efec-tivo para una variedad de aplicaciones. Lostres tipos generales de micromatrices inclu-yen: i) «chips» de oligonucleótidos,construídos realizando la reacción de síntesisde cebadores cortos directamente sobre unamatriz de vidrio, ii) arreglos de oligonu-cleótidos, construídos depositando oligonu-cleótidos sobre placas de vidrio o membra-nas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obteni-dos depositando insertos amplificados porPCR a partir de una biblioteca sobre placas

de vidrio o membranas de nylon.Uno de los aspectos más importantes de

la experimentación con micromatrices es laselección de los fragmentos de ADN quecontendrá. Aún cuando el número de genesrepresentado suele ser grande (3000 a10000), pueden faltar algunos que sean im-portantes para una cuestión experimentalparticular. La selección de la biblioteca másadecuada para una aplicación en particular yla elección de los clones son factores críticosque determinan el éxito de estos experimen-tos.

En algunas situaciones, puede ser másefectivo enfocar los experimentos en un gru-po pequeño de genes seleccionados por cri-terios más específicos como, por ejemplo,perfiles de distribución de tejidos, clasificaciónfuncional o cambio de expresión conocidos.Se pueden adquirir clones de fuentes comer-ciales u otras fuentes y/o clonar secuenciasespecíficas usando técnicas estándar de bio-logía molecular.

Después de que los clones han sido selec-cionados deben ser ensamblados y organi-zados para generar el arreglo de ADNc juntocon los controles apropiados. Típicamente,el largo de los insertos será mayor a 500 ba-ses, pero esto depende de los clones selec-cionados.

Los productos de PCR son purificados yluego depositados (o «impresos») en luga-res precisos sobre una placa de vidrio o unamembrana de nylon. Los instrumentos usa-dos para la producción de micromatrices hanmejorado en los últimos años. Las opcionesvarían desde la construcción de un arreglo porraspado hasta la compra del sistema com-pleto.

Independientemente de cuál sea el ori-gen de los clones, es esencial saber con segu-ridad la secuencia de cada sonda que estásiendo ubicada sobre la matriz para aseguraruna interpretación exacta de los datos resul-tantes. Por la tanto, puede ser necesariosecuenciar por duplicado todos o una por-ción de los fragmentos organizados (Fig. 5,ver pág.8).

El ARNm que representa las muestrasexperimentales se prepara para la hibridacióncon las micromatrices de ADNc por transcrip-ción reversa y marcado con nucleótidosfluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) oradiactivos ([33P] dCTP). Las moléculas


Figura 4: Procedimiento general para la obtención de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero estranscripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima derestricción ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la

mayoría de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algún sector de su secuencia. Los extremos 3´de lasmoléculas son recuperados por unión a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales quese ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuación son digeridas con una segundaenzima de restricción (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero

corta al transcripto unos 20 pares de base más abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan,se ligan y amplifican con dos oligonucleótidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los

amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatémeros y seclonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.

Figura 3: Generación de una huella digital de ARN porla técnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero setranscribe en forma reversa utilizando un poliT comocebador. Las hebras de ADNc se digieren con dosenzimas de restricción, una de corte raro y otra de cortefrecuente. Se ligan adaptadores complementarios aambos extremos y se preamplifican por PCR losfragmentos utilizando cebadores que reconocen lasecuencia de los adaptadores. Los fragmentos quecontienen adaptadores diferentes en los extremos sonamplificados preferentemente a causa de que engeneral tienen un tamaño intermedio. Luego se realizauna segunda amplificación utilizando cebadoresanclados con una o dos bases adicionales en el extremo3´que amplifican una subpoblación de fragmentos. Elcebador correspondiente al adaptador para la enzimade corte raro está marcado radiactivamente. Lacombinación de diferentes cebadores anclados generaperfiles provenientes de distintos subgrupos deARNms.


Figura 5: Expresión de genes controlada a través del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados porPCR se imprimen sobre un soporte sólido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluoróforos y se

hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisión de cada fluoróforo. La intensidad dela señal de hibridización será proporcional al contenido de cada molécula particular de ARN en la muestra. Los

patrones de emisión de ambas muestras son comparados para detectar expresión diferencial.


fluorescentes generalmente se usan paramarcar sondas con las que se hibridarán pla-cas de vidrio, mientras que las radiactivas seincorporan a sondas que se usarán sobremembranas de nylon. Los fluoróforos Cye3 yCye5 presentan diferentes espectros de emi-sión, por lo tanto dos muestras experimen-tales pueden ser marcadas alternativamen-te con cada uno de ellos, hibridadas juntasen una reacción única competitiva y luegoevaluadas en forma separada con un detec-tor de fluorescencia. Por el contrario, las mues-tras radiactivas deben ser hibridadas indivi-dualmente en reacciones seriales y puedenser detectadas usando un sistema defosfoimágenes.

Independientemente del diseño experi-mental, el análisis de micromatrices se basaen la premisa de que la intensidad de la se-ñal de hibridación resultante para una secuen-cia es proporcional a la cantidad de ARNmque corresponde a esa secuencia en la mues-tra original. La expresión relativa de cada se-cuencia representada en el microarreglo esevaluada comparando las señales de intensi-dad de hibridación generadas por las dife-rentes muestras experimentales.

Cada experimento de micromatrices ge-nera una gran cantidad de datos y es críticorealizar un procesamiento apropiado de losmismos. El análisis de la información obteni-da puede ser dividido en tres componentes:i) identificación y cuantificación de las inten-sidades de hibridación; ii) visualización de losdatos; iii) técnicas de agrupamiento.

El primer componente incluye la identifi-cación exacta de los puntos de la imagen, lanormalización según el fondo, la cuantifi-cación de las intensidades de hibridación y lasalida de los datos en una forma utilizable.La visualización de los datos incluye su clasifi-cación y presentación en una forma lógica ysu organización en diferentes formatos paraapuntar a la resolución de cuestiones múlti-ples. Finalmente, los algoritmos de agrupa-miento permiten identificar conjuntos degenes con patrones de expresión similar através de distintas muestras experimentales.En base a la presunción de que la expresiónde los genes con funciones relacionadas es-tán regulada en forma coordinada, el agru-pamiento de datos de microarreglos se con-vierte en un método poderoso para asignar

posibles clasificaciones funcionales a genesnuevos.

8 Conclusión

Los métodos descriptos en este capítuloson tecnologías eficaces que expanden losestudios de expresión desde los genes úni-cos hasta el nivel genómico. Ninguno de es-tos procedimientos per se es óptimo paratodas las aplicaciones y la mejor estrategiapara situaciones específicas puede ser crearcombinaciones de varios de ellos. El continuorefinamiento de las técnicas genómicas y dela bioinformática relacionada proporcionaráa los investigadores nuevas herramientaspara estudiar la expresión de la informaciónhereditaria y lograr un mejor entendimientosobre el control genético de los procesos fi-siológicos.

9 Lecuras Recomendadas

ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M.DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R.MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO. 1991.Complementary DNA sequencing: expressed se-quencetags and human genome project. Science (Wash DC)252:1651–1666.

DAVIS, M. M.; D. I. COHEN, E. A. NIELSEN, M.STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD. 1984. Cell-type-specific ADNc probes and the murine 1 region: thelocalization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:2194–2198.

DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A.CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S.LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D.SVERDLOV, P. D. SIEBERT. 1996. Suppression subtractivehybridization: A method for generating differentiallyregulated or tissue-specific ADNc probes and libraries.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6025–6030.

GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P.D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L.VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D.SVERDLOV. 1996. Equalizing ADNc subtraction basedon selective suppression of polymerase chain reaction:cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohem-aglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal.Biochem. 240:90–97.

LIANG, P.; A. B. PARDEE. 1992. Differential display ofeukaryotic messenger ARN by means of the polymerasechain reaction. Science (Wash DC) 257:967–971.

MOODY D. E. 2001. Genomics techniques: an overviewof methods for the study of gene expression. J. Anim.Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.


OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A.FUKUSHIMA, Y. KOJIMA, K. MATSUBARA. 1992. Largescale ADNc sequencing for analysis of quantitative andqualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173–179.SARGENT, T. D.; I. B. DAWID. 1983. Differential Geneexpression in the gastrula of Xenopus laevis. Science(Wash DC) 222: 135-139.

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VELCULESCU, V. E.; L. ZHANG, B. VOGELSTEIN, K. W.KINZLER. 1995. Serial analysis of gene expression. Science(Wash DC)270:484–487.

WELSH, J.; K. CHADA, S. S. DALAL, R. CHENG, D.RALPH, M. McCLELLAND. 1992. Arbitrarily primed PCRfingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20:4965–4970.


VII.- Capítulo 3

Análisis informático de secuenciasmoleculares

Paniego, Norma; Heinz, Ruth;Fernández, Paula; Lew, Sergio;Hopp, Esteban

1 Introducción

La Bioinformática es el área de las cien-cias de la computación que aborda la bús-queda de soluciones a los problemas biológi-cos con herramientas computacionales. Tan-to el análisis genómico como sus disciplinasrelacionadas pueden ser abordados desdeuna perspectiva diferente a partir de la enor-me disponibilidad de secuencias molecularesacumuladas en las bases de datos interna-cionales como GenBank [1], EMBL [2], DDBJ[3] y SwissProt [4]. El impacto de los proyec-tos genómicos durante los últimos 10 años,ha sido por un lado la creciente disponibili-dad de secuencias, y por el otro la gran diver-sidad de datos biológicos acumulados. Esto,junto con el desarrollo de las tecnologíasinformáticas y el arribo de Internet transfor-mando la estructura de almacenamiento yacceso de los datos, ha permitido el desarro-llo de aspectos fundamentales para el avan-ce de los conocimientos sobre los sistemasbiológicos, como lo son la búsqueda de si-militud en secuencias moleculares, el aná-lisis comparativo (filogenético, taxonómicoy sinténico) de las especies, el análisis demacromoléculas, la ingeniería y diseño deestructuras proteicas, entre otros [5].

El propósito de este capítulo es introdu-cir los conceptos y las herramientas básicasde la Bioinformática a los estudiantes de uncurso de biotecnología vegetal o de biologíamolecular de plantas. De ninguna maneraeste material pretende cubrir la totalidad delos recursos existentes para la materia, por elcontrario el objetivo es guiar el interés de losestudiantes en la exploración y el uso demétodos computacionales decisivos para eldesarrollo de su actividad científica o profe-sional futura. Por lo cual, en primer lugar des-cribiremos las bases de datos generales parasecuencias de ADN y proteínas y las bases

de datos específicas de plantas remitiendoen cada caso al estudiante a visitar las pagi-nas principales de los sitios mencionados paraampliar el conocimiento de los mismos. Pos-teriormente, con la misma orientación abor-daremos aspectos relacionados a la búsque-da, el análisis y la interpretación de secuen-cias biológicas.

2 Bases de datos moleculares

Un proyecto típico de análisis genómicogenera secuencias nucleotídicas las cuales sehacen públicas enviándolas a las bases dedatos internacionales. No sólo lo hacen losproyectos dedicados a la secuenciación a granescala. También lo hacen los investigadoresinvolucrados en proyectos más específicos debiología molecular, dado que el depósito dela secuencia es una condición frecuentemen-te exigida por las revistas internacionales quepublican estos trabajos. Así, las bases de da-tos moleculares se alimentan constantemen-te y contienen una enorme y heterogéneacantidad de datos que incluyen secuencias deácidos nucleicos, proteínas, estructurasmacromoleculares, etc., asociados a recursosinformáticos que asisten el acceso, el envío,la actualización, y la extracción de datos. Exis-ten varios cientos de bases de datos accesi-bles desde la Web, pero la dinámica enuncia-da no asegura tener el máximo provechosustentable de las mismas, empezando pormantener una actualización constante. Coneste fin, se pueden revisar catálogos comoDBCAT [6], o el componente DATABANK dela plataforma SRS (Sequence Retrieval System[7]) de integración de datos del EuropeanMolecular Biology Laboratory (EMBL). Otrafuente de actualización exhaustiva la consti-tuye el primer número de cada año de larevista Nucleic Acid Research [8] de accesolibre a través de Internet, que presenta unacolección actualizada de artículos de los sitiosmás importantes como son las bases de da-tos generales National Center forBiotechnology Information (NCBI, USA),European Bioinformatics Institute (EBI, EU)y DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Japón) ybases de datos más específicas.

Otro punto de interés es que la calidadde las secuencias varía notablemente: des-de secuencias obtenidas a partir de un pasa-

240 PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

je por amplificación por PCR por secuen-ciación única (es decir, con posibles artefac-tos técnicos y sin rechequeos) hasta secuen-cias obtenidas de clones independientes yque han sido secuenciadas en ambas he-bras. Lo mismo pasa con la función hipotéti-ca de los genes representados.

Típicamente los proyectos de biologíamolecular básica generan datos muy biencaracterizados en cuando a la función de losgenes estudiados, mientras que los proyec-tos genómicos generan secuencias anónimascuya funcionalidad es primero hipotética, esdecir, deducida a partir de su similitud conotros genes de función conocida (ver predic-ción de genes, más abajo) y debe ser corro-borada funcionalmente, por ejemplo, me-diante experimentos de complementacióngenética.

Incluso los perfiles de usuarios que atien-den estas bases de datos pueden ser bas-tante heterogéneos: desde el típico biólogomolecular que clonó y secuenció un geninvolucrado en su tema de estudio (por ejem-plo, genes que se activan a partir de una apli-cación hormonal) hasta evolucionistas inte-resados en redefinir la taxonomía tradicional-mente basada en características fenotípicas.

A pesar de esta heterogeneidad de inte-reses y de recursos disponibles, lo más comúnes que los usuarios frecuenten las tres basesde datos generales de acceso público. Estossitios colaboran desde 1982 manteniendo lasbases de datos de nucleótidos de Genbank(NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database(EMBL-Bank, EBI), y DDBJ [8]. Estos gruposcoleccionan una porción del total de las se-cuencias producidas y reportadas en el mun-do, e intercambian diariamente todas las se-cuencias nuevas o actualizadas. Las bases dedatos de proteínas incluyen aquellas quederivan de las bases de datos de nucleótidoscomo Swissprot, TrEMBL [4] y PIR [9], y lasbases de datos estructurales como PDB(Protein Data Bank [10]) que contiene masde 21.000 estructuras resueltas porcristalografía o resonancia magnética nucleary Macromolecular Structure Database (MSD)[11] que es una base de datos de EBI deriva-da en parte de PDB.

El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen deotros recursos como bases de datos detranscriptos (dbEST), polimorfismos de un

solo nucleótido (dbSNP), sitios de secuen-cia específica (dbSTS), genomas completos,taxonomía, literatura, vectores, etc. por locual recomendamos explorar estos recursosvisitando la página «About NCBI» [12] y«2CAN» [13] del EBI.

En general, las bases de datos archivan lainformación a partir de una organización oestructura lógica, cada entrada en la basede datos se identifica con un código únicoque es una cadena de números y letras. Esteidentificador o número de acceso de la se-cuencia nunca cambia y es la forma en quese cita la secuencia en las publicaciones. Aeste identificador se le suma otro código queda cuenta de la versión de la secuencia de-positada (seq.versión, geninfo identifier, GI).A medida que la secuencia se va actualizan-do, el número de acceso incorpora un puntoseguido de un valor incremental que corres-ponde a la versión actualizada, mientras queel GI toma un valor diferente en cada ac-tualización. Las proteínas también poseenidentificadores o números de acceso(protein_ids) (Fig. 1).

2.1 Sistemas de búsqueda de las bases dedatos: ENTREZ, SRS y DBGET

Las bases de datos no solo proveen lainformación molecular, sino también los me-dios adecuados para acceder fácilmente a esainformación. Las interfases de búsquedaprincipales son ENTREZ [14], SRS [7] y DBGET[15]. La más usada probablemente sea el sis-tema ENTREZ del NCBI, una de las caracterís-ticas únicas del mismo es que fue el primeroen incorporar relaciones lógicas o nexos en-tre las entradas individuales de datos en dis-tintas bases de datos públicas (Fig. 2).

La interfase SRS reúne unas 400 basesde datos (Fig. 3), en el último año se desa-rrolló como un sistema integrado de búsque-da y recuperación de datos asociados y apli-caciones para análisis de secuencias [16].

DBGET es un sistema simple de acceso dedatos a un grupo diverso de bases de datosmoleculares (Fig. 4).

2.1.1 Uso avanzado de ENTREZ y SRS

NCBI desarrolló Entrez como una herra-mienta para permitir a los usuarios interac-


cionar o consultar estas bases de datos. Des-de el punto de vista informático, Entrez es

una interfase de usuario. Es decir, constituyeel nexo entre el usuario y las bases de datos

subyacentes. Esto le permite alusuario realizar consultas simples yobtener resultados, aún descono-ciendo la arquitectura de las basesde datos. Sin embargo, para reali-zar consultas más poderosas (enselectividad y eficiencia), es necesa-rio conocer dicha arquitectura u or-denamiento de la estructura de labase de datos, al menos en parte,y saber como restringir las búsque-das a ciertas áreas de la base dedatos. Para profundizar en los al-cances y la operabilidad de Entrezse recomienda visitar el documen-to de ayuda en la página del NCBI[17].

Sin embargo, desde el punto devista de la facilidad de uso, tal vezSRS sea una mejor opción, dadoque los formularios de búsquedasavanzados son un tanto más ex-plícitos que en el caso de Entrez.SRS es un paquete de manejo debases de datos desarrollado porEBI y accesible desde distintos si-

Figura 1: La Figura muestra los códigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. A) Número deacceso y gi de una secuencia nucleotídica. B) Número de acceso y gi de la secuencia de aminoácidos correspondiente.

Figura 2: Representación gráfica de las relaciones del sistema Entrezpara la búsqueda y la recuperación de datos depositados en el sitioNCBI. Entrez es una plataforma dinámica, en la cual se agreganconstantemente nuevos componentes o cambian de manera dinámicalas vínculos establecidas entre los elementos.


tios, que a diferencia de Entrez, puede ser ope-rado de manera local.

2.1.2 Uso de PubMed (ENTREZ)

Otra forma muy popular de acceso es através del PubMed, usualmente utilizadopara el relevamiento bibliográfico por la ma-yoría de los científicos. Se basa en el mapeoautomático de términos (automatic termmapping): cuando se ingresa un términopara realizar una búsqueda en PubMed, elservidor que recibe el requerimiento intentaidentificar el tipo de búsqueda que se estáintentando hacer: ¿está el usuario intentan-do buscar un autor, o una revista, o un áreade conocimiento? Entonces el servidor filtralos términos de búsqueda a través de listassucesivas para intentar responder dicha pre-gunta y usar los términos en forma eficiente.

Este proceso utiliza las siguientes listas

Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS.

MeSH (Medical Subject Headings):vocabulario controlado utilizado para indexarartículos en PubMed.

Journals: nombre completo de la revis-ta, abreviaturas usadas en MedLine y núme-ros ISSN.

Lista de frases: cientos de miles de fra-ses generadas a partir de MeSH y otros voca-bularios controlados similares.

Índice de autores: apellido e iniciales.Si el término ingresado está presente en

alguna de estas listas, la búsqueda se limita-rá a ese campo de la base de datos. En casocontrario, el término será utilizado para bus-car sobre todos los campos de la base dedatos. Es evidente que si uno sólo está inte-resado en buscar publicaciones en determi-nada revista (por ejemplo «Cell»), es inefi-ciente utilizar el término «Cell» como pala-bra clave, ya que muy probablemente existaalgún autor llamado así, y la palabra «Cell»se encuentre presente en varios títulos oresúmenes.


El mapeo automático de términos pue-de evitarse en primer lugar encerrando el tér-mino o frase entre comillas. Esto evitará elfiltrado a través de listas, realizando una bús-queda sobre todos los campos de la base dedatos en forma directa. Además, en caso deuna búsqueda con una frase (más de una pa-labra), esto fuerza la búsqueda usando la fra-se tal como fue ingresada (con las palabrasen ese orden), lo cual puede resultar útil enalgunos casos.

Los términos de una búsqueda puedenproporcionarse truncados (truncation), uti-lizando un asterisco (*). Por ejemplo, unabúsqueda con el término enzym* retornarácitas conteniendo la palabra enzyme, perotambién enzymes, enzymology, enzymatic,etc. La búsqueda con términos truncadosdesactiva el mapeo automático, por lo cual

las búsquedas utilizando este método van adiferir de las que no lo usan.

PubMed ignora ciertas palabras en lasbúsquedas, estas son llamadas stopwords ycorresponden a palabras muy comunes, pre-sentes en la gran mayoría de las citas de labase de datos: artículos, proposiciones, ad-verbios, etc. La lista de stopwords se encuen-tra en la documentación de PubMed.

Entrez permite combinar términos uti-lizando operadores lógicos (AND, OR,NOT). Los operadores lógicos, también lla-mados operadores voléanos (booleanoperators), deben ser ingresados en mayús-culas para ser reconocidos como tales porEntrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc, DNAAND Crick AND 1993). Entrez lee los opera-dores lógicos de izquierda a derecha. Es posi-ble cambiar el orden de evaluación de los ope-

Figura 4: Representación gráfica de las relaciones del sistema DBGET para la búsqueda y la recuperación de datos


radores usando paréntesis.Para focalizar las búsquedas es recomen-

dable utilizar códigos de calificación de tér-minos (search field qualification). Esto es,describir qué tipo de término se está usan-do: si se busca por nombre de un autor, deuna revista, o por fecha, etc. La calificaciónde términos se realiza agregando una eti-queta entre corchetes al lado del términoa calificar. Es muy poco intuitivo el criteriode uso de estos calificadores, por lo que serecomienda leer el manual como fue sugeri-do al inicio del capítulo.

Entrez realiza las búsquedas sobre ciertotipo de campos de la base de datos. Estoscampos se encuentran indexados, y es posi-ble acceder a los índices para evaluar la efica-cia de nuestra estrategia de búsqueda. Cuan-do se realiza una búsqueda, se selecciona enPreview/Index, esto permite acceder a unformulario para ver los índices y eventualmen-te agregar un término a la búsqueda.

2.1.3 Uso de SRS

El SRS ofrece a los usuarios la posibilidadde buscar datos y analizarlos a través dedistintos paquetes de software en el mis-mo sitio. La página de inicio de este servidorpresenta distintas opciones:

Comenzar un proyecto temporario o per-manente.

Correr una aplicación.Acceder a información disponible sobre

las bases de datos.Acceder a la documentación en línea.

Para realizar una búsqueda hay que se-leccionar sobre Start a Temporary Project,con lo que se abre una página que muestralas bases de datos disponibles en el sitio. Unavez allí deberá seleccionarse la(s) base(s) dedatos sobre la cual(es) buscar. Es posible se-leccionar todas las bases de datos seleccio-nando sobre el botón all.

Luego se accede a la solapa de búsquedaestándar (denominada QUERY) donde sedefinen las opciones de búsqueda y se ingre-san las palabras clave. Dentro de las opcio-nes de búsqueda, si seleccionamos Appendwildcards to words la búsqueda se realizarásobre las palabras claves ingresadas y tam-bién sobre todas aquellas posibles termina-

ciones de dichas palabras. Combine searcheswith permite relacionar los términos de labúsqueda mediante los conectores & AND,OR y BUTNOT. Number of entries to dis-play per page permite definir el númeromáximo de registros listados en cada pági-na.

Pueden hacerse búsquedas extendidaspara lo cual hay que ingresar al sitio seleccio-nando sobre el botón Extended, habiendoseleccionado primero una base de datos. Eneste formulario se pueden definir los mismosparámetros que en el formulario estándar(wildcards, número de registros por página,etc.), pero a su vez contiene una lista de áreasde datos (que varían de acuerdo con el tipode base de datos utilizada) sobre la cual pue-den realizarse búsquedas. Una vez elegido elcampo sobre el cual se quiere buscar, simple-mente hay que ingresar la(s) palabra(s) claveen el cuadro de texto de la derecha.

3 Otras bases de datos moleculares

Aparte de las bases de datos generalesexiste un gran número de bases de datosespecializadas de gran importancia parafocalizar proyectos y obtener informaciónadicional generalmente no accesible desdelas bases generales como son fenotipos,datos experimentales, datos de mapeo,etc.; bases de datos derivadas del análisis delas bases de datos generales (bases de da-tos de motivos funcionales y estructura-les) y bases de datos de interacciones.

Un área de estas bases especializadas porespecies la constituye el área de proyectosgenómicos de plantas. Aquí las iniciativascentrales la constituyen la secuenciacióncompleta de especies modelo comoArabidopsis thaliana [18] y el arroz, Oryzasativa var. indica [19] y Oryza sativa var.japonica [20]. Sin embargo, están en marchamuchos proyectos de secuenciación parcial degenomas en gramíneas, crucíferas,solanáceas, compuestas, etc., que aportan in-formación para sustentar el análisis compa-rativo de regiones de interés entre genomasampliando los conocimientos sobre laestructuración de genes y genomas de lasplantas.

La identificación de regiones sinténicas(conservación de las posiciones cromosómi-


cas relativas de secuencias marcadorashomólogas en especies relacionadas, es de-cir, conservación de mapas genéticos a esca-la evolutiva) hará posible el aislamiento degenes en especies con genoma complejo,usando la información de genes homólogosen especies con genomas más pequeños ymás profusamente estudiados (los así llama-dos clonados posicionales en base a mapas)[21].

Desde lo académico, el análisis compa-rativo de los genomas usando una estrate-gia bioinformática persigue entender cualesson los mecanismos esenciales para el fun-cionamiento mínimo de una planta, su creci-miento normal, su desarrollo y metabolismo,entender las bases de la especiación y ladiversidad, los mecanismos básicos de laadaptación y la enorme diversidad quími-ca [22].

3.1 Bases de datos de motivos

Existe otro conjunto de bases de datosdenominadas secundarias porque derivan

de las bases de datos generales, son las lla-madas de motivos estructurales y funcio-nales. Estas bases de datos introducen elconcepto de patrones y perfiles de secuen-cias. Los patrones definen secuencias cortasde aminoácidos conservados que correspon-den a sitios activos, sitios de unión, etc. Alser regiones acotadas, no dan cuenta del res-to de la secuencia adyacente y son muy pocosensibles al momento de encontrar secuen-cias relacionadas que presenten una diver-gencia mínima en la región definida por elpatrón [23, 24, 25]. Los perfiles compensanesta debilidad dado que cubren áreas máslargas de la secuencia a través de la repre-sentación numérica de las posiciones con-servadas en un alineamiento múltiple. Enotras palabras, los perfiles representan lasposiciones comunes y características deaminoácidos de una colección particular desecuencias, frecuentemente de una familiade proteínas. Usando perfiles es posible en-contrar miembros muy divergentes de fami-lias de proteínas que presenten muy bajaidentidad de secuencia [23, 24, 25].

Tabla 1: Bases de datos y recursos para el análisis de datos de familias de proteínas, dominios y motivos [25].

Base deDatos Descripción URL

Blocks Database of protein alignment blocks http://blocks.fhcrc.org/

CDD Conserved domain database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml

CluSTr Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins http://www.ebi.ac.uk/clustr/

DOMO Protein-domain database based on sequence alignments http://www.infobiogen.fr/services/domo/

InterProIntegrated documentation resource for protein families,

domains and functional siteshttp://www.ebi.ac.uk/interpro/

IproClass Integrated protein classification database http://pir.georgetown.edu/iproclass/

MetaFam Database of protein family information http://metafam.ahc.umn.edu/

PfamCollection of multiple sequence alignments and hidden Markov

modelshttp://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/

PIR Protein Information Resource http://pir.georgetown.edu/

PIR-ALN Curated database of protein sequence alignments http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/piraln.html

PRINTS-S Compendium of protein fingerprints http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/

ProClass Non-redundant protein database organized by family relationships http://pir.georgetown.edu/gfserver/proclass.html

ProDom Automatic compilation of homologous domains http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html

PROSITEDatabase of patterns and profiles describing protein families and

domainshttp://www.expasy.ch/prosite/

ProtoMap Automatic hierarchical classification of SWISS-PROT proteins http://www.protomap.cs.huji.ac.il/

SBASE Curated protein domain library based on sequence clustering http://www3.icgeb.trieste.it/~sbasesrv/

SMARTSimple Modular Architecture Research Tool

- a collection of protein families and domainshttp://smart.embl-heidelberg.de/

SWISS-

PROT

and TrEMBL

Protein sequence databaseshttp://www.ebi.ac.uk/swissprot/ or

http://www.expasy.org/sprot/

SYSTERSSystematic re-searching method for sequence searching and

clusteringhttp://systers.molgen.mpg.de/

TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models http://www.tigr.org/TIGRFAMs/


Dentro de este grupo de bases de datosque proveen información para la búsquedade secuencias homólogas remotas y para lapredicción de función se incluyen Prosite,PRINT-S, Pfam, SMART, TIGRfam y Blocksentre otras listadas en la Tabla 1.

4 Alineamiento de Secuencias:Fundamentos

4.1 Alineamiento de pares de secuencias

Una de las maneras mas frecuentes deobtener información sobre una o un grupode secuencias incógnitas, es mediante la bús-queda comparativa utilizando la informacióndepositada en distintas bases de datos. Unode los métodos comparativos más comuneses el alineamiento de pares de secuencias,la descripción del resultado del mismo traeaparejado el uso (o mal uso) de los térmi-nos: identidad, similitud y homología. Laidentidad significa que existe exactamenteel mismo nucleótido o aminoácido en la mis-ma posición de las secuencias alineadas. Si-militud expresa una medida observable queconsidera por un lado las identidades y porotro lado, le da valor a las sustituciones fa-voreciendo aquellas que sean conservativasrespecto de las que no lo son. Finalmente,homología significa que las secuencias no sólose parecen mucho entre sí, sino que tambiéncomparten una historia evolutiva [26, 27].Los algoritmos de comparación de secuen-cias más comunes tales como BLAST [28],FASTA [29] y SSEARCH [30, 31] miden simili-tud o identidad entre secuencias pero nomiden homología.

La forma que estos algoritmos empleanpara darle significado a cada uno de losalineamientos posibles es asignándole unvalor (score) a cada uno de ellos, el score másalto corresponde al mejor alineamiento. Lamanera más común de asignar este valor es,a través de una suma simple de scores espe-cificados para cada alineamiento de pares deletras (que representan igualdades o sustitu-ciones), y de letras con caracteres nulos (querepresentan deleciones o inserciones). El con-junto de estos scores mencionados represen-ta una matriz de scores, las más popularesson las matrices de bloques de sustituciónBLOSUM [32] y las matrices de mutaciones

puntuales aceptables PAM [33, 34]. La cons-trucción de estas matrices se basa en el mo-delo de Dayhoff [33], que establece que re-laciones lejanas entre secuencias puedenmodelarse con suficiente precisión usando lainformación de secuencias estrechamenterelacionadas. Ambas matrices se basan engrupos de alineamientos altamenteconfiables de proteínas homólogas, a partirdel cual miden la frecuencia de todas las sus-tituciones a través de métodos diferentes[26].

Las matrices PAM fueron calculadas sobrela base de un modelo de distancia evolutivasobre alineamientos de secuencias muy rela-cionadas, así PAM1 define una unidad decambio evolutivo y representa la probabili-dad de que 1 aminoácido en 100 haya expe-rimentado una sustitución. MultiplicandoPAM1 por sí mismo se obtiene una familiade matrices de sustitución arbitrarias que re-presentan distintos grados de parentesco. Lamatriz PAM120 es considerada una buenamatriz de sustitución para analizar secuenciasevolutivamente más cercanas, mientras quePAM250 es más apropiada para comparar se-cuencias más distantes [26, 27].

Las matrices BLOSUM son calculadas demanera similar pero usando una estrategiadiferente para estimar las frecuencias de sus-titución [27, 32]. Los bloques representanalineamientos múltiples de secuencias relacio-nadas (a diferencia de PAM, que usa secuen-cias estrechamente relacionadas). Los núme-ros asociados a estas matrices indican el va-lor de corte del porcentaje de identidad quedefine el grupo. Por lo tanto, las matricescon valores de corte más bajo (ej.BLOSUM62) admiten una mayor diversidadde secuencias en los grupos y son óptimaspara comparar secuencias más distantes.

No obstante, los eventos de mutaciónno sólo incluyen sustituciones sino tam-bién inserciones y deleciones, por lo cualtambién se asigna un score a los intervalosvacíos o gaps observables en los alinea-mientos.

Una vez definido el score para un alinea-miento arbitrario, surge la necesidad de en-contrar el alineamiento óptimo entre losmuchos alineamientos posibles. Dado que lomás común entre secuencias de ADN o pro-teínas es que sean similares en algunos seg-


mentos y no en toda la extensión de las se-cuencias involucradas, lo más frecuente esusar en esta instancia programas basados enel algoritmo de Smith-Waterman que bus-ca óptimos en alineamientos locales de pa-res de secuencias [35]. No obstante, tratán-

dose de métodos de programación dinámi-ca, para los cuales el tiempo de cálculo es pro-porcional al cuadrado del tamaño de las se-cuencias que se comparan [23], son extrema-damente lentos para realizar búsquedas ex-haustivas en las bases de datos de mayor

Figura 5: Resultado de una búsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incógnita y elnombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seismarcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr («non redundant»}de proteínas mantenidapor NCBI. B) muestra una representación gráfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientosmas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades


referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cam-bio, tanto FASTA como BLAST emplean otrotipo de desarrollo llamado heurístico, quefavorecen la velocidad a cambio de la sen-sibilidad y la selectividad [26]. Ambos pro-gramas operan de manera similar pero usan-do distintas estrategias para localizar las po-siciones donde es más probable que ocurrael mejor alineamiento. FASTA busca cadenasde letras exactamente iguales de un tamañofijo establecido (words). BLAST, en cambio,usa matrices de sustitución (tomando debase BLOSUM62 para secuencias deaminoácidos) para encontrar words que sinser exactamente iguales muestren el scoremás alto, en este nivel de búsqueda ambosalgoritmos no admiten gaps. BLAST realizaalgunas otras operaciones como filtrar lasregiones de baja complejidad (regionesrepetitivas), y elimina words con baja proba-bilidad de producir un score alto. Una vez quese identifican estas regiones de alto score,se aplican algoritmos más sofisticados de pro-gramación dinámica, ahora sí permitiendo laexistencia de gaps. En esta segunda etapaBLAST busca segmentos similares a la lista dewords establecidos en toda la base de da-tos y cuando encuentra un alineamientoposible trata de extenderlo hacia ambas di-recciones, hasta tanto el score continúeincrementándose. Luego BLAST evalúa si elvalor E de los alineamientos obtenidos sa-tisface el umbral seleccionado por el usuario(normalmente entre 0,1-0,001) para final-mente informar la lista de los seleccionados.

La Figura 5 muestra un resultado obteni-do a partir de BLAST. El encabezado cita laversión del algoritmo empleado y su referen-cia, el nombre y la longitud de la secuenciaanalizada y la base de datos que se usó comoblanco. La segunda parte del informe presen-ta un resumen de todas las secuencias queprodujeron alineamientos significativosjunto con un valor de score normalizado y elvalor E. La tercera parte muestra losalineamientos detallando los valores de losscores, identidad y valor E obtenidos y la úl-tima parte del informe muestra losparámetros utilizados en la búsqueda.

Para interpretar los resultados obtenidosde la búsqueda de similitud en bases de da-tos moleculares usando cualquiera de losalgoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), elvalor más representativo es el valor E [26, 35].

Este depende del valor de score, del largode la secuencia incógnita y del tamaño de labase de datos analizada y mide las chancesde que el alineamiento obtenido sea sola-mente causa del azar. Así un valor E de 0.001(que es el valor de corte más usado par lasbúsquedas con BLAST) significa que hasta 1de cada 1000 alineamientos puede haber-se dado por azar. Un valor cercano o menora 1 e-50 es menos frecuente de encontrar, yresulta muy confiable en cuanto a que lassecuencias alineadas estén evolutivamenterelacionadas, no obstante esta apreciaciónexige una confirmación mediada por un aná-lisis filogenético.

4.2 Alineamiento múltiple de secuencias

Como se mencionó más arriba, el adveni-miento de proyectos genómicos a gran esca-la ha llevado a la acumulación de un enormey heterogéneo número de secuencias depo-sitadas en bases de datos públicas. El alinea-miento múltiple de secuencias juega un pa-pel importante en la biología molecular ac-tual. Tanto la anotación (edición por correc-ción e interpretación de hipotéticas funcio-nes por homología) de dichas secuenciascomo las herramientas de análisis dependende alineamientos múltiples adecuados. Elobjetivo de la aplicación ha pasado de unasimple transferencia de anotación funcionalde una secuencia a otra, a un enfoquegenómico más amplio. El análisis de fami-lias proteicas, la predicción de su estructu-ra secundaria, la estimación de los diferen-tes tipos de plegamientos así como la de-tección de homólogos entre especies dis-tantes como pasos intermedios en la cons-trucción de árboles filogenéticos, se han cons-tituido en los principales objetivos de estetipo de alineamiento [37, 23].

El alineamiento múltiple de secuenciaspuede ser visto como una generalización delalineamiento de pares de secuencias, dondela complejidad de esta aproximación creceexponencialmente con el número de secuen-cias que intervienen. La posibilidad de resol-ver el problema por métodos manuales [38]debe quedar descartada por la enorme com-plejidad del problema, limitándose su uso acasos con pequeños grupos. Por analogía conla comparación de pares de secuencias, es


posible aplicar la misma técnica de progra-mación dinámica al caso exhaustivomultidimensional, pero el crecimientoexponencial de la complejidad de método li-mitó su aplicación práctica [39, 40, 41]. Intro-dujeron un esquema de acotamiento queutiliza alineamientos de parejas de secuen-cias para limitar el volumen del espacio N di-mensional que se necesita para el alineamien-to exhaustivo, resultando en importantesmejoras en la velocidad, que posibilitaron suimplementación en el programa MSA [42] yla aplicación del método a pequeños gruposde secuencias. Por lo general tampoco esposible alinear más de 10 secuencias usandoel riguroso modelo del programa MSA. Deesta forma es fácilmente entendible la proli-feración de métodos aproximados para con-juntos más grandes de secuencias. Los pro-gramas desarrollados abarcan una ampliagama, desde aquellos que utilizan métodosprogresivos tradicionales [43, 44, 45] a aque-llos iterativos y con mayores requerimientoscomputacionales [40, 46, 47, 48]. Los méto-dos iterativos tienden a una optimizaciónde la función de puntajes. El objetivo bus-cado es que la función de puntaje reflejeuna función biológica tal que suoptimización lleve a un alineamientobiológicamente correcto. El alineamientomúltiple puede dividirse en dos categoríasprincipales: aquellos métodos de alineamien-to de secuencias en toda su extensión(globales) y aquellos métodos que alineanregiones con alta similitud. Tradicionalmen-te se ha focalizado en los métodos globalestales como el método CLUSTAL W, que sonaplicables a casos en los que las secuenciascomparadas tienen extensiones similares.Sin embargo más recientemente se ha pues-to mayor interés en los métodos de alinea-miento múltiple local para el alineamientode secuencias derivadas de proyectosgenómicos que sólo alinean parcialmente[37].

En los métodos de alineamiento global,la solución clásica se basa en la formación deagrupamientos (clusters) de secuencias, loscuales se resuelven progresivamente [48].Para ello, dada una medida del parecido osemejanza entre dos secuencias, se eligeaquel par correspondiente al valor más altoy se alinean y agrupan entre sí para formar

un único grupo o cluster de secuencias. Apartir de este momento este cluster será tra-tado como una sola secuencia, y el procesose repetirá hasta tener un solo cluster contodas las secuencias que intervenían en elalineamiento múltiple. Posiblemente, losprogramas más difundidos de este tipo seanCLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su últimaversión [49], y PILEUP, el cual utiliza el méto-do heurístico para el cálculo de los niveles desemejanza entre las secuencias [50]. La apli-cación de esta estrategia no garantiza resul-tados óptimos (en una primera etapa eva-lúa por coincidencias de residuos, por lo quesí utilizará esquemas de puntuación, aunquepodrían existir otras soluciones posibles conpuntuación mayor). Sin embargo, la calidadde los alineamientos es bastante aceptable,y permiten alinear algunos pocos cientos desecuencias [51, 52]. Otro algoritmo de com-paración múltiple global progresivo es elPOA que no generaliza perfiles sino que em-plea gráficos parcialmente ordenados par-tiendo de las secuencias más similares y vaadicionando otras secuencias progresivamen-te. Este programa permite comparar no sólosecuencias relacionadas originadas por me-canismos de deleción, inserción o mutaciónsino secuencias más distantes [53]. Losalgoritmos de comparación múltiple local,como el DIALIGN, alinean segmentos com-pletos en vez de residuos simples. Inicialmen-te realiza alineamientos de pares, seleccio-nando luego las regiones sin intervalos noapareados que aparecen como diagonales deuna matriz, para progresar en una compara-ción iterativa [46]. Otros programas como elT-Coffee combinan alineamientos múltiplesglobales y locales, realizando primero unacomparación de a pares global utilizando elalgoritmo CLUSTAL W y luego una compara-ción local utilizando FASTA [47]. Tanto elDIALIGN como el T-Coffee arrojan mejoresresultados con grupos de secuencias más di-versas pero tienen altos requerimientoscomputacionales.

Con la idea de mejorar la sensibilidad deestos resultados, también se han propuestonumerosas posibilidades híbridas, tales comola representada por el programa MACAW[54] basado tanto en información estadísti-ca sobre alineamientos de segmentos de lassecuencias como en la posibilidad deinteracción con el usuario. Así mismo, se ha


propuesto la utilización de matrices de con-senso [55] para describir la preferencia decada aminoácido, o de cada deleción, parasituarse en el alineamiento. También se harecurrido a información sobre las estructurassecundarias [56, 57], o a la localización demotivos y/o dominios conservados en lassecuencias [58], o a la utilización de las carac-terísticas físico-químicas de los aminoácidosen cada posición [59].

5 Búsqueda por perfiles para localizarhomólogos remotos

Existe una tercera generación de méto-dos más elaborados para realizar búsquedasde similitud con mayor sensibilidad [60]. Losmás exitosos son PSI-BLAST y los métodosbasados en los modelos ocultos de Markov(HMM, [61]). El primero es un método extre-madamente sensible para detectar similitu-des débiles basándose en un procesoiterativo mediante el cual el algoritmo deBLAST puede ser generalizado para utilizarun perfil en vez de una secuencia [5], se reco-mienda usar este algoritmo cuando no seencuentran resultados significativos a partirde una búsqueda estándar a través deBLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienzacon una secuencia provista por el usuario, lacual es alineada mediante el algoritmoBLASTP contra una base de datos seleccio-nada. A partir de los alineamientos más sig-nificativos, el programa usa de base aquellosalineamientos que presentan un valor E me-nor que 0.005, construye una matriz descores específicos de posición o perfil(position-specific scoring matrix, PSSM oprofile). En la segunda ronda, la versiónadaptada del algoritmo BLAST usa la matrizcomo entrada para realizar una búsquedamás refinada.

De una manera similar, HMMs generaperfiles a partir de alineamientos múltiplesde secuencias, tales como los obtenidos usan-do Clustal W o X [49, 62] y calcula scores es-pecíficos de posición que guarda en un archi-vo de formato compatible que luego se usapara analizar una base de datos.

Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan eldesarrollo de bases de datos secundariascomo las bases de datos de dominios de pro-teínas [63, 64] que permiten el análisis de la

arquitectura modular de las proteínas y susunidades funcionales. Hoy en día se prefie-re usar estas bases de datos para predecir oconfirmar la función de genes o proteínas,dado que resultan más confiables que lasbases de datos primarias que reciben gran-des cantidades de información regularmen-te lo cual hace difícil controlar que las anota-ciones de los datos sean correctas.

6 Predicción de Genes

La expansión de los proyectos genómicosen los últimos años ha sido tal que al día dehoy existen 717 iniciativas de este tipo en elmundo, 140 de los cuales corresponden agenomas completos, entre ellos el genomahumano, el genoma de Arabidopsis thaliana[18], Oryza sativa variedad indica [19] yOryza sativa variedad japonica [20], 235 co-rresponden a organismos eucariotas, 38 delos cuales son genomas vegetales y 342 co-rresponden a organismos procariotas (GOLD[65]). La gran cantidad de datos generadospor estos, y otros proyectos de análisisgenómico parcial fuerzan las necesidades dedisponer de las herramientas adecuadas paradarle interpretación biológica a estos datos.Una de las etapas más críticas de este proce-so es la de identificar todos lo genes y susproteínas asociadas. La manera más direc-ta de abordar esta tarea es mediante méto-dos comparativos como los descriptos ante-riormente basados en encontrar una secuen-cia altamente similar a la secuencia incógnitaen otro organismo usando generalmentebases de datos de proteínas. Sin embargo,sólo un 50-70% de los genes nuevos sue-len encontrar homología con genes o pro-teínas conocidas [66]. La caracterización delresto de las secuencias requiere la aplicaciónde métodos predictivos, los mismos tratande identificar secuencias codificantes a partirde patrones característicos, usualmente se-cuencias cortas sobre el ADN genómico querepresentan sitios claves para procesoscomo la transcripción (sitios de unión a fac-tores de transcripción, cajas TATA), el proce-samiento postranscripcional del ARN (sitiosde splicing) y la traducción (codones de ini-ciación y terminación) [67]. Existen muchosprogramas para predecir genes, la mayoríade los cuales son accesibles desde la Web, el


sitio Computational Gene Recognition man-tenido por W Li [68] ofrece una lista comple-ta y actualizada de publicaciones y softwarededicado a este tema. Sin embargo, aunquelos recursos son vastos y los algoritmos depredicción han ido avanzando junto con losdesarrollos en informática y el avance de losconocimientos, cimentados en una mayordisponibilidad de información biológica carac-terizada, actualmente no existen métodosprecisos para identificar estas señales en lassecuencias moleculares. Este problema seacentúa cuando se trata de predecir geneseucarióticos que tienen una organización yuna estructura más compleja que la de losgenes de organismos procarióticos. Engenomas complejos los genes no están dis-puestos en forma continua, están separadospor distancias intergénicas enormes y a suvez están estructurados en fragmentoscodificantes (exones) separados por regio-nes no codificantes (intrones), los cualesademás varían en tamaño y número dentroy, más aún, entre especies.

Algunos programas, además de recono-cer y modelar las señales de patrones especí-ficos, tratan de incorporar un modelo esta-dístico de las propiedades que definen demanera más global exones, intrones y regio-nes intergénicas, aprovechando los sesgosde composición de bases (en regionescodificantes es más alto el porcentaje deG+C) [69], el uso de codones, la frecuenciade hexámeros o dicodones [70, 71, 72, 73],la periodicidad de aparición de bases [74],etc. Sin embargo, todas estas consideracio-nes no son suficientes para reconocer conexactitud exones e intrones cuando éstos soncortos.

En la mayoría de los casos, los programasmás promisorios para reconocer genes en laespecie bajo estudio deben ser analizadosparticularmente, a partir de lo cual muchosson redefinidos o diseñados específicamente[67]. Dado que los algoritmos usan distintasmedidas y scores para predecir regionescodificantes, lo recomendable es combinar elresultado de algunos o varios de ellos paraconstruir el mejor modelo, en este sentidoexisten distintas herramientas de acceso li-bre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine[77, 78], GenMark [79], entre muchos otros.

7 Conclusiones

La biología moderna ha generado unaexplosión de información en el área desecuenciación de genomas completos, laproteómica, la transcriptómica, lagenómica funcional, la interactómica, lametabolómica, etc. Todo esto genera la ne-cesidad constante de actualizar esta informa-ción y aplicarla en beneficio de los proyectosparticulares. Para ello, es necesario entendercómo se genera esa información, cuánconfiable es, cómo se maneja y cómo se ana-liza. En este proceso juega un papel clave eldesarrollo de la bioinformática, que se defi-ne como un área de fusión entre la biolo-gía, la matemática avanzada y la computa-ción cuyo objetivo discurre en observar la bio-logía en términos de macromoléculas, con elfin de ordenar y entender la información con-tenida en las mismas a partir de recursos dela informática. En este sentido, labioinformática enfoca tres áreas básicas, laprimera tiene que ver con el desarrollo de unsistema simple de organización de los da-tos biológicos de manera de favorecer elacceso y el ingreso de nuevas entradas a lasbases de datos compartidas. La segunda áreatiene que ver con el desarrollo de recursos yherramientas para analizar la informacióncoleccionada en las bases de datos, lo cualimplica conocimientos sólidos en las teoríascomputacionales y biológicas.El tercer área,implica el uso de estas herramientas paraanalizar los datos e interpretar los resulta-dos de manera biológicamente significati-va.

En este capítulo hemos intentado daruna visión amplia de la bioinformáticafocalizando dos elementos fundamentalescomo son las secuencias y los alinea-mientos, familiarizando a los lectores con losrecursos básicos disponibles para el acceso ala información y su análisis, e instalando elconcepto de que existen diferentes caminospara resolver un problema. Sin dejar de te-ner en cuenta que la mayoría de los méto-dos computacionales se basan en conoci-mientos limitados sobre genes, proteínas ycaminos biosintéticos por lo cual todos losresultados obtenidos a través de estos me-dios exigen una verificación experimental.En su defecto, es recomendable explorar dis-


tintos programas que aborden el problemadesde perspectivas diferentes. En este senti-do, también es aconsejable no confiar enlos parámetros de base (defaults) de losprogramas sino experimentar valores diferen-tes (tales como valor E, enmascarado de re-giones de baja complejidad, matriz de score,etc.) para lo cual es crucial leer la documenta-ción asociada a los programas o bases dedatos usadas.


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PARTE VIIIAplicaciones

256 ESCANDÓN, Alejandro S.


VIII.-Capítulo 1

Biotecnología en el Cultivo de EspeciesOrnamentales

Escandón, Alejandro S.

1 Introducción

La industria florícola es de una importan-cia más que relevante a escala mundial, yaque representa un negociode alrededor de 30.000millones de dólares.

Tradicionalmente se haempleado el mejoramien-to clásico para obtener va-riedades exitosas que satis-fagan las demandas de unmercado ávido de noveda-des, que busca nuevas ca-racterísticas en cuanto a co-lores, formas, aromas, etc.Sin embargo, las tenden-cias actuales hacia la mejo-ra ecológica de los cultivosy la necesidad de incorpo-rar caracteres tales comoresistencia a herbicidas, in-sectos, enfermedades,mayor vida en postcose-cha, modificar la arquitec-tura de las flores, etc., haconducido a la industria dela floricultura a adoptar lasnuevas biotécnicas.

El presente capítulo tie-ne como objetivo brindarun panorama sobre la si-tuación actual de la Bio-tecnología en relación alcultivo de plantas orna-mentales. No se profundi-zará en los detalles de lastécnicas involucradas, queya han sido tratadas enotros capítulos de este vo-lumen.

2 El cultivo de tejidos en ornamentales

Una de las técnicas biotecnológicas quese emplean en ornamentales es el cultivo detejidos. Esta técnica no sólo permite la pro-ducción masal de plantas, sino que tambiénposibilita el estudio y caracterización de labiología del desarrollo de las mismas.

Dependiendo del objetivo planteado esposible clonar individuos utilizando cultivo deápices o meristemas, o bien buscar aumen-tar la variabilidad genética por medio del cul-tivo de callos, suspensiones celulares oprotoplastos.

La técnica de micropropagación (Fig.1) esuna excelente herramienta que ha sido am-

Figura 1. Cultivo de tejidos de Santa Rita. A: Desarrollo de la yema principal y debrotes subsidiarios en la base de la misma que serán cultivados in vitro. B: Brotessubsidiarios aislados. C: La flecha señala la yema principal, los restantes sonbrotes subsidiarios cultivados en forma aislada. D: Estadío previo a la transferenciade los brotes al medio de enraizamiento. E: Plantas ex vitro enraizando ensustrado artificial. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernáculo.Modificado de Escandón et al. RIA 32 (1):11-122. Abril 2003.


pliamente utilizada para la propagación agran escala de especies ornamentales, ya queno sólo permite la obtención de miles de in-dividuos a partir de un genotipo «elite» se-leccionado, sino que también permite lamultiplicación de plantas raras o en peligrode extinción, resguardando la estabilidadgenética de las mismas.

Algunos géneros y especies de plantasque se pueden cultivar in vitro a partir dediferentes explantos son:

- Cultivo de meristemas: Ghypsophyla,Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Irissp., Pelargonium, Saintpaulia spp.

- Apices: Diphaenbachia, Daphne L.,Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp.,Rosa L. , Iris sp.

- Yemas o segmentos nodales: Dianthus,Bignoniaceae, Nierembergia, Jacarandamimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp.,Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp.,Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp.,Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactuscoccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Garde-nia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens,Iris sp. , Saintpaulia spp.

- Segmentos de médula: Chrysantemum,Orchidea, Saintpaulia spp.

- Pecíolos: Rhododendron sp., Anthu-rium sp., Gerbera sp., Chrysantemum.

- Discos de hojas: Rhododendron sp.,Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia.Chrysantemum, Saintpaulia spp.

- Lámina: Saintpaulia spp.- Escamas: Lilium- Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily,

Narcissus- Rizomas: Cymbidium- Cotiledones: Zinnia elegans.- Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp.,

Orchidea, Saintpaulia spp.- Embriones maduros: Alstroemeria sp.,

Zinnia elegans, Impatiens , Iris sp.- Embriones inmaduros: Alstroemeria sp.,

Orchidea spp.- Secciones de flores: Iris sp.- Anteras: Saintpaulia spp.- Segmentos de pétalos: Chrysantemum.- Segmentos de inflorescencia: Chrysan-

temum, Saintpaulia spp..- Capítulos: Gerbera sp.- Ovulos: Impatiens

- Callos: Chrysantemum, Iris sp.- Protoplastos: Chrysantemum.- A partir de plántulas in vitro:

Bromeliaceae, Gerbera sp., Cyclamenpersicum, Gardenia, Scoparia sp.

La lista precedente es apenas una mues-tra de la gran diversidad de explantos que seutilizan para la multiplicación in vitro de plan-tas y, como tal, está muy lejos de abarcar eltotal de las especies ornamentales que semultiplican por este método.

Además de la micropropagación, la posi-bilidad de obtener plantas libres de virus pormedio del cultivo de meristemas también hasido explotada en ornamentales. Hace másde 50 años Morel y Martín informaron la re-generación de plantas de dalia libres de viruspor escisión y cultivo del domo meristemáticode ápices de plantas infectadas. Este descu-brimiento dio un gran impulso al cultivo detipo intensivo en general. El cultivo demeristemas es uno de los métodos más efi-caces para la eliminación de virus, más aún sise lo combina con termoterapia y/o méto-dos químicos; es de gran aplicación en el cam-po de los cultivos intensivos tanto ornamen-tales como hortícolas. Como la mayoría delos cultivos ornamentales se multiplicanasexualmente, estas enfermedades viralessuelen ser un problema importante. La elec-ción errónea de un material, por error o des-conocimiento, provocaría la diseminación deestas enfermedades, con las consecuentespérdidas económicas

Gerbera representa un claro ejemplo dela necesidad de la aplicación de estas técni-cas en la industria florícola. En Europa la de-manda anual del mercado de plantas de estegénero oscila entre 15 y 20 millones de uni-dades. Con el método convencional (semi-llas o división de la corona sobre sustrato ar-tificial e inerte) se logra una tasa de multipli-cación de 30 plantas por año. Por otro lado,se hace necesario eliminar de los cultivos deesta especie los virus que los afectan normal-mente, entre ellos el del mosaico del coliflor(CMV). Si bien existe una dependencia delgenotipo, por medio de la multiplicación deyemas apicales in vitro es posible obteneruna tasa de multiplicación de hasta 300 ye-mas por ápice cultivado en 90 días, libres devirus. En general, con todos los genotipos,


estas técnicas de producción superaron lar-gamente los rendimientos del método con-vencional, por lo que fueron adoptadas comométodo de rutina para la multiplicación co-mercial de este género.

El cultivo in vitro también puede ser fuen-te de variabilidad genética. La producción deplántulas por regeneración a partir de callos,suspensiones celulares o protoplastos, pue-de dar origen a individuos que presentan al-gún rasgo diferente respecto de la plantamadre. Esto también puede lograrse utilizan-do mutágenos durante el cultivo in vitro aso-ciados con una presión de selección conferi-da por factores tales como pH, salinidad, toxi-nas y baja temperatura. Las plantas regene-radas luego de estos tratamientos puedenmostrar características que difícilmente sepuedan obtener por otra vía. La inducciónde variantes somaclonales tiene especial sig-nificado en la floricultura debido a la cons-tante búsqueda de nuevas variedades,seleccionándose las variantes prometedorasy estables e incorporándolas a los programasde mejoramiento. En la actualidad se cono-ce un importante número de variantes enornamentales. Se han obtenido individuoscon diferencias en la forma, el color y el ta-maño de la flor (en Chrysantemum, Zinnia,Geranium y Saintpaulia).

En Chrysantemum, se han obtenido in-dividuos con resistencia al estrés salino y concambios interesantes en la forma de las ho-jas. Otro ejemplo de variación somaclonal esel caso de Zinnia. Los somaclones en estegénero se obtuvieron a través del desarrollode yemas adventicias a partir de cotiledonescultivados con diferentes concentraciones detidiazuron (TDZ). Este fue un avance impor-tante para la especie Z. marylindica, que esun híbrido estéril. A partir de este tratamien-to se recuperó una gran cantidad de varian-tes, plantas con diferentes tamaños, hábi-tos de floración, color de pétalos y, lo que esmás interesante, en algunos casos se restau-ró la fertilidad. Aquellas variantes cuyos nue-vos caracteres mostraron ser heredables seseleccionaron para incorporar en el progra-ma de mejoramiento.

Asimismo, la variación somaclonal tam-bién se ha utilizado a fin de seleccionargenotipos resistentes a enfermedadesfúngicas en el género Rosa, lo mismo que la

fusión de protoplastos. En este caso se ob-tuvieron yemas a partir de callos originadosde protoplastos interespecíficos fusionadosque habían sido pretratados con antimeta-bolitos como iodoacetato o rodamina-6G o,alternativamente, con rayos X. La obtenciónde plantas completas y fértiles a partir deestos materiales hace a esta estrategia muypromisoria para incorporar nuevos caracte-res.

Una técnica tradicional para la obtenciónde mutantes in vitro que también se utilizaen especies ornamentales es la aplicación deinductores de poliploidía, como la colchicinay los herbicidas orizalina y trifluralina, que hasido aplicada en Rhododendron y Lilium.

Esta técnica se está utilizando en el Cen-tro Tecnológico en Flori, Fruti y Horticultura(CETEFFHO) con el objetivo de obtener cru-zamientos interespecíficos viables en especiesde los géneros Calibrachoa y Scoparia. Paraello, una vez efectuado el cruzamiento, se du-plican los cromosomas del híbrido a fin deque sea fértil. Las plantas de Calibrachoa quesobrevivieron al tratamiento demostraron serquimeras diploides/tetraploides. Se multipli-caron las tetraploides y se espera la floracióna fin de establecer la posibilidad de cruzarloscon otras especies del género.

3 Marcadores moleculares para elmejoramiento y la selección deornamentales

Los marcadores moleculares como herra-mienta para la caracterización y diferencia-ción entre genotipos fueron rápidamente uti-lizados por genetistas y mejoradores de plan-tas. Su neutralidad en relación al proceso deselección, su poder de resolución y la celeri-dad con que se obtiene la información, sonalgunas de las ventajas que ofrece esta he-rramienta.

A pesar de que diferentes clases de mar-cadores moleculares fueron probados en or-namentales, los AFLPs y los microsatélites sonlos más frecuentemente utilizados por su altareproducibilidad y la gran cantidad de infor-mación que brindan. Estos marcadoresmoleculares aplicados a la diferenciación degenotipos son un arma muy poderosa parala protección de los derechos de losmejoradores y productores. Para detectar la


propagación fraudulenta de un cultivar elmétodo tradicional se basa en el análisis y lacomparación de los caracteres fenotípicos deplantas crecidas y en período de floración.Esta estrategia tiene la desventaja de querequiere mucho tiempo y depende de facto-res ambientales. Esto se soluciona utilizandomarcadores moleculares de manera más rá-pida y precisa.

La genómica también está realizandoaportes en el área de las plantas ornamen-tales. La rosa, que como flor de corte es unode los cultivos ornamentales más importan-tes del mundo, es un ejemplo interesante. Amediados de la década de 1990, se inició unproyecto conjunto entre las Universidades deClemson y Texas a fin de obtener el mapagenético de esta especie. El mismo tienecomo objetivos, a largo plazo, ubicar losgenes involucrados en la producción de la fra-gancia y los de la resistencia a la enfermedadde la mancha negra, causada por el hongoDiplocarpon rosae. Esta enfermedad es lade mayor incidencia en el producción de ro-sas. Se caracteriza por la presencia en las ho-jas de manchas negras de contorno irregu-lar, defoliación, pérdida del vigor de la plan-ta, y disminución en la producción de flores.La enfermedad se controla con aplicacionesde fungicidas. Un hecho de importancia esque se han detectado variedades de rosasque manifiestan resistencia a la enfermedady se están buscando los genes que la confie-ren. Con este fin los investigadores texanosestán analizando la F2 de un cruzamiento se-leccionado entre una variedad susceptible yuna resistente, donde la progenie segregóademás para varios caracteres de interés parala industria florícola, como color de la flor(rosa vs blanco), número de pétalos (5 vs. 10o más), presencia o ausencia de espinas enel tallo, floración una vez al año o siempreflorecida.

A partir del análisis de esta F2 se estáconstruyendo un mapa de alta densidad condistintos marcadores moleculares, entre losque se encuentran los AFLPs. Una vezconstruído este mapa, se procederá al análi-sis de los perfiles detectados a fin de esta-blecer la asociación entre los marcadores uti-lizados y los caracteres de interés. Esto per-mitiría llevar a cabo en el género Rosa un pro-grama de mejoramiento asistido por marca-

dores moleculares.Como el resto de las técnicas biotecno-

lógicas, la de marcadores moleculares estásiendo intensamente aplicada en especiesornamentales, sobre todo por la relevancia

Género I. V. D. G. A. G.

Alstroemeria X X X

Calladium X

Cephalotaxus X

Cymbidium X

Dahlia X

Dedrathema X X

Dianthus X X

Euphorbia X X

Geranium X

Gerbera X

Heliconia X

Jacaranda X

Junipers X X

Lilium X

Osteospermum X

Ozothamnus X

Pelargonium X

Petunia X X X

Rhododendron X X X

Rosa X X X

Scaevola X

Syringa X

Viola X

Tabla 1: Aplicación de marcadores moleculares paradeterminar la distancia genética (DG), identificaciónvarietal (I.V) y análisis genético (A.G), en algunos génerosornamentales.

que estos están adquiriendo en la verifica-ción de los criterios de distinguibilidad, esta-bilidad y uniformidad de las nuevas varieda-des que año a año ingresan al mercado.

En la Tabla 1 se mencionan los cultivosornamentales en los cuales se han aplicadomarcadores moleculares.4 Mejorando la ecología de los cultivos ymodificando las formas y los colores delas flores

La tecnología génica es otra de las estra-


tegias que se ha aplicado exitosamente enel mejoramiento y se ha difundido en formasostenida entre los principales cultivos orna-mentales. Varios factores han contribuído aeste importante desarrollo, entre los que sepuede considerar un profundo conocimien-to de la bioquímica de las plantas (sobre todoen lo que hace a la síntesis de pigmentos),un notable manejo del cultivo de tejidos enlas especies de interés, el alto valor agrega-do que implica la aplicación de la técnica,además de las ventajas adicionales que sepueden lograr en la incorporación de uncaracter determinado (por ejemplo: ahorrode insumos, incremento en el rendimiento,etc.). Asimismo, y desde un punto de vistatotalmente ligado el mercado, los organismosgenéticamente modificados (OGMs) orna-mentales, no generan el mismo tenor decontroversias que provocan los OGMs ligadosal consumo alimentario humano como loscereales y las oleaginosas.

Para el mejoramiento de ornamentalespor transgénesis existe un considerable inte-rés en la incorporación de características ta-les como: resistencia a insectos, a enferme-dades fúngicas y virales, tolerancia a herbici-das, androesterilidad, etc., que son los deaplicación en la mayoría de los cultivos. A es-tas se suman los caracteres específicos parala floricultura, como son la modificación delcolor y la forma de las flores, el incrementode la vida post cosecha, la modificación de lafragancia, el control de la floración y el mejo-ramiento de la eficiencia de enraizamiento.

En el tema donde más se ha avanzadoes en la modificación de los pigmentos delos pétalos. El color de las flores se debe atres tipos de pigmentos. De los colores ama-rillo y naranja son responsables loscarotenoides. Del rojo y del rosa son respon-sables los flavonoides (cianidina ypelargonidina, flavonoides, se encuentran enlas flores rosas y rojas respectivamente). Elcolor azul se debe a un pigmento denomina-do delfinidina.

La modificación del color de las flores seplanteó como objetivo por los grupos demejoradores de ornamentales. El primer in-forme acerca de la modificación de los colo-res de flores por ingeniería genética lo efec-tuó en 1987 el Instituto Max Planck de Colo-nia, Alemania. Desde mediados de la déca-da que comenzó en 1990 se sucedieron una

serie de publicaciones acerca de la alteraciónde la pigmentación de flores de crisantemopor aplicación de la tecnología antisentidopara el gen de la chalcona sintetasa (chs). Enclavel se utilizó la secuencia antisentido de laflavonona 3-hidroxilasa (Fht), para bloquearla vía metabólica de las antocianinas. De estamanera se logró la modificación del color ori-ginal y se obtuvieron nuevos genotipos de lavariedad utilizada en el ensayo. Asimismo, seencontró que los genotipos transgénicos quetenían reprimida la expresión de Fht resulta-ron tener mucho más fragancia que los con-troles. Estudios de cromatografía gaseosamostraron incrementos de 10 a 100 veces enlos niveles de los derivados del ácido benzoico,por lo que a partir de la alteración de la ex-presión de un transgen, se logró la modifica-ción de dos caracteres.

La introducción de la secuencia en senti-do del gen de la chalcona sintetasa enpetunia permitió redireccionar la víametabólica de los flavonoides hacia la pro-ducción de chalconas, lo que derivó en laobtención de flores amarillas en el géneropor acumulación de pigmentos comochalconas, auronas y algunos flavonoles enlos pétalos.

El color azul no es muy frecuente en lasflores. Sólo en petunia el azul tiene la inten-sidad que los mejoradores pretenden. Estecolor depende de tres factores: la síntesis deun pigmento denominado delfinidina (3’,5’-hidroxiantocianina), la presencia de co-pigmentos como flavonas y un pH alcalinoen las vacuolas de las células de los pétalos.

La obtención de flores dentro de la gamadel azul se constituyó un desafío para las se-milleros. Una idea de la relevancia de estetema lo indica el hecho que en el año 1986se fundó en Melbourne, Australia, la compa-ñía Florigene cuyo principal objetivo era eldesarrollo de claveles, crisantemos y rosas decolor azul (las tres especies abarcan el 50%del mercado mundial de flores de corte). Estaempresa aisló el gen que codifica para la en-zima clave para la biosíntesis de delfidina, laflavonoide 3',5'-hidroxilasa, el Blue Gene. Amediados de la década que comenzó en 1990se obtuvieron claveles azules. Otro geninvolucrado en la producción de delfinidinafue identificado en 1999. Este gen codificapara un citocromo del tipo b5. La expresión


del mismo incrementa la producción de laantocianina 3’,5’ sustituída. El silenciamientode este gen en plantas de petunia redundaen un 60% menos de acumulación dedelfinidina en relación a plantas no tratadas.

En la actualidad existen en el mercado sie-te variedades de claveles cuya pigmentaciónfue modificada por ingeniería genética porincorporación del Blue Gene.

En cuanto a la obtención de rosas azules,un inconveniente a resolver es que la víametabólica de producción de pigmentos enestas plantas es muy diferentes a la petunia,ya que la rosa es deficiente en la enzimaflavonoide 3',5' hidroxilasa. En consecuenciano puede sintetizar los pigmentos adecua-dos. Otro inconveniente es el pH vacuolar,que en las rosas es ácido y bajo estas condi-ciones la delfidina se torna de color rosa. Losdatos indican que el microambiente de lascélulas del pétalo de la rosa no sería el máspropicio para la producción de pigmentosazules vía flavonoides, por lo que esta estra-tegia no sería la más adecuada para la pro-ducción de una rosa de color azul.

En la actualidad Florigene está probandoel citocromo P450 (responsable de ladetoxificación hepática en mamíferos), comoalternativa para la obtención de rosas decolor azul. Experimentos efectuados en laUniversidad de Queensland demostraronque bacterias transformadas con el gen quecodifica para el P450 son capaces de generarun color azul intenso usando como sustratocompuestos con grupos indólicos, que seencuentran normalmente presentes en losvegetales. Si bien presenta la ventaja de quese trata de una vía metabólica directa (de unsolo paso), habría que determinar si los pro-ductos de la conversión de grupos indol no

presentan fitotoxicidad. Todavía no se hanobtenido resultados concluyentes con la apli-cación de esta estrategia para la obtenciónde rosas azules.

Otro importante avance tecnológico, de-sarrollado y patentado por la misma empre-sa, es la producción de claveles «larga vida»(«long vessel life», LVL) por bloqueo de la sín-tesis de etileno. La vía metabólica de produc-ción de esta hormona es bien conocida, laenzima ACC (ácido 1 amino ciclo propano-1-carboxílico) sintetasa, convierte a la S-adenosilmetionina en ACC que, por acciónde la ACC oxidasa se transforma en etileno.Aplicando tecnología antisentido se logrósuprimir la expresión de ambas enzimas, porlo que se bloqueó la producción de etilenoen los claveles transgénicos. La falta de pro-ducción de etileno impide el deterioro pre-maturo de las flores una vez cortadas (princi-palmente, el enrollamiento de los pétalos),retrasando su envejecimiento. La tecnologíaofrece una importante ventaja tanto en locomercial como en lo ecológico, ya que losproductores podrán abandonar el uso de lassales de plata, muy contaminantes, paraprevenir la producción de etileno en el perío-do post-cosecha.

En otros laboratorios se ha modificado laforma de las flores de crisantemo por la in-troducción del gen rol C de Agrobacteriumrhizogenes, obteniéndose plantas de menortamaño, flores de menor diámetro y pétalosy hojas modificados. En clavel la incorpora-ción de este transgén produjo una serie demodificaciones morfológicas muy ventajosascomo ser disminución de la dominancia apical,mayor capacidad de enraizamiento, mejorincorporación de metabolitos y mayor pro-ducción de varas (se incrementó tres veces

Tabla 2: Algunosavances logrados en el

mejoramiento deornamentales por

ingeniería genética


en relación al producto no transgénico). Entérminos prácticos estas modificaciones im-plican una sensible mejora en el rendimien-to del cultivo.

La Tabla 2 resume algunos avances logra-dos en el mejoramiento de ornamentales poringeniería genética.

5 La situación en la Argentina

La revisión de los libros de resúmenes delPrimer Congreso Argentino de Floricultura ydel V Simposio de Redbio Argentina 2002muestra que en nuestropaís son muy pocos los la-boratorios que trabajan enbiotecnología de ornamen-tales. La lista alcanza a 5 ins-tituciones trabajando en elárea.

En el Dpto. de Agrono-mía de la Universidad Na-cional del Sur y en el Cen-tro de Recursos NaturalesRenovables de la ZonaSemiárida (CERZOS) se tra-baja en multiplicación invitro de Lilium.

En el laboratorio de Cul-tivo de Tejidos del Institu-to de Botánica del Noreste(IBONE) y Universidad Na-cional del Noreste (UNNE)se multiplican orquídeas invitro. Este Instituto en co-laboración con el Dpto. deAgronomía de la Universi-dad Nacional del Sur estu-dia la variabilidad genéticaen la micropropagación deparaíso (Melia azaderach).Sobre esta misma especieen el IBONE se efectúan es-tudios de crioconservación.

En el Laboratorio de Propagación y Pro-ducción Vegetal del Centro Austral de Inves-tigaciones Científicas de Usuahia se trabajaen Berberis sp.

En el Centro de Producción Vegetal(CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agra-rias de la Universidad Nacional de La Plata seestá trabajando en la micropropagación dePelargonium.

En la Cátedra de Producción Vegetal dela Facultad de Agronomía de la UBA se hanrealizado experiencias en la micropro-pagación de Pelargonium, Lupinus,Jasminum mensyi y Gerbera.

En el CETEFFHO, futuro Instituto deFloricultura de INTA-Castelar, se trabaja des-de hace algunos años en micropropagaciónde especies ornamentales como, entre otras,alstroemeria, clavel, rosa, orquídeas,Poinsetia, Ghypsophylla, Gerbera, etc. Den-tro del mismo Instituto y en el marco del pro-yecto INTA-JICA: «Desarrollo de la Floricultura

en la Argentina» se está trabajando en floranativa de importancia ornamental, entreotros con los géneros: Tabebuia, Jacaranda,Tecoma, Nierembergia, Lilium, Calibrachoa,Bougainvillea y Scoparia (Fig.2).

Además de importantes avances en elestablecimiento in vitro de Tabebuia yTecoma, se han logrado interesantes resul-tados en la micropropagación de J.

Figura 2. A) Individuos tetraploides del género Scoparia (izq.) obtenidos apartir de un diploide (der.) tratado con colchicina en condiciones in vitro,comparados con el correspondiente control. B). Comparación entre las floresde ambas plantas, tetraploide (izq.) y control (der.). C) Hojas de la plantatetraploide (arr.) y de la planta control (ab.). D) Planta tetraploide florecida.

A B

C D


mimosifolia, Bougainvillea sp, Lilium sp,Calibrachoa sp y Scoparia spp. En algunoscasos con el objetivo de micropropagaciónen sí misma, y en otros, para aplicarmutagénesis in vitro. Otra de las áreas enlas que se trabaja en el CETEFFHO es la pues-ta a punto de técnicas de marcadoresmoleculares para la identificación, vía«fingerprinting» (fenotipeado), de los indivi-duos que se obtienen por mejoramiento. Sehan obtenido resultados promisorios en laaplicación de microsatélites anclados en lacaracterización molecular de clones deJacarandá, siendo la primera vez que se in-forma un resultado de esta índole para elgénero.

De esta revisión se desprende que ennuestro país la herramienta biotecnológicade aplicación en cultivos de interés ornamen-tal es la multiplicación in vitro.

Si bien a partir del desarrollo del proyec-to INTA-JICA «Desarrollo de la Floricultura enla Argentina» se dieron pasos sustanciales enla formación de recursos humanos, nuestropaís debería potenciar el desarrollo y aplica-ción de las nuevas tecnologías en el área delmejoramiento de cultivos ornamentales. Es-tos dos aspectos son fundamentales paraque el país pueda intervenir en el mercadomundial de ornamentales, aprovechando losinmensos e interesante recursos naturales delos cuales dispone. Se espera que la incorpo-ración de nuevas variedades al mercado inci-dirá en forma positiva sobre el desarrollo dela industria local y permitirá el ingreso de laArgentina en el mercado florícola mundialcomo generador de germoplasma mejorado.

6 Perspectivas

El advenimiento de la genómica yproteómica y el desarrollo de la bioinformá-tica han aportado herramientas de utilidadque podrían aplicarse en el mejoramiento deespecies ornamentales.

Los estudios sobre el genoma deArabidopsis facilitarán la comprensión de laestructura y función del genoma de los culti-vos ornamentales, en especial a través de laidentificación de genes involucrados en estrésabiótico, síntesis de hormonas, resistencia apatógenos, etc. También será sustancial elaporte que se haga acerca de los mecanis-

mos que intervienen en el establecimientode la arquitectura de la planta, en el funcio-namiento de los meristemas (en especial delas flores), o en los componentes de la resis-tencia a enfermedades. La identificación y elaislamiento de estos genes posibilitará su in-corporación, vía transgénesis, a los cultivosornamentales a fin de lograr un mejoramien-to sustancial que involucre todos los aspec-tos del cultivo.

Los avances efectuados en fotobiologíay en el conocimiento de los ritmos circadianosvegetales permitirán ajustar finamente elcontrol de procesos tan importantes comola floración.

También se abren nuevas y muy intere-santes perspectivas para la creación, seleccióny uso de la variabilidad genética.


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VIII.-Capítulo 10

Estrategias para el control de insectosplaga

Ferrero, Adriana A.; Descamps, Lilian;Reviriego, María

1. Introducción

La categorización de un organismo comopeste o plaga está determinada por el hom-bre, es decir, tiene carácter antropocéntrico,considerándose éste como el factor principalen el sistema. Así, insectos que se alimentande plantas y granos, que actúan comovectores de agentes patógenos en los vege-tales o que alteran la salud humana son con-siderados plagas.

La población humana está sumergida enun mar de insectos. Si se considera su núme-ro solamente, la tasa estimada de insectosen relación con los humanos en nuestro pla-neta es de 200 millones a 1, existiendo alre-dedor de 160 millones de insectos por hec-tárea. Basados en su biomasa y abundancia,los insectos son los organismos más exitososen la tierra, siendo el 1% de ellos los que caenen la categoría de plagas.

Se supone que las formas más primitivasde insectos conocidas eranconsumidores de detritus. Elhábito de alimentarse deplantas parece, en algunoscasos, haber evolucionadoindependientemente. Los in-sectos han atravesado un lar-go y variado período decoevolución y coadaptacióncon sus plantas huéspedesestableciendo modelos deasociación con distintas estra-tegias en el ciclo biológico yen los mecanismosalimentarios necesarios parala explotación de éstas.

La producción primarianeta de las 300.000 especiesde plantas vasculares, quehabitan las zonas secas de lasuperficie de la tierra, ha sidoestimada en unas 115 x10 9

toneladas por año. Esto representa un re-curso potencialmente disponible para serexplotado por los insectos fitófagos.

El impacto de los insectos sobre las cose-chas es conocido desde los tiempos bíblicos,cuando las plagas de langostas se extendie-ron por el territorio egipcio. Sin embargo, elestudio global de la interacción y del impac-to de los insectos sobre la vegetación natu-ral se ha desarrollado en los últimos cienaños. En la actualidad, los insectos plaga ylos organismos patógenos (hongos, bacte-rias y virus) son responsables del 14 % de laspérdidas en cosechas en el mundo (Fig. 1).

Las actividades agrícolas incrementan lasoportunidades para el surgimiento de las pla-gas a través del desarrollo de monocultivos,del cultivo en áreas donde no existen enemi-gos naturales de la plaga, del uso de fertili-zantes y herbicidas, del desarrollo del cultivoen un área nueva permitiendo así que lasespecies nativas de insectos se alimenten deéste y se conviertan en plagas, de la elimina-ción de los enemigos naturales de la plagapor cambios en el manejo del cultivo y deluso continuo del mismo producto químico,generando adaptación a éste y posibilitan-do la aparición de resistencia.

En los agroecosistemas modernos la evi-dencia experimental sugiere que labiodiversidad puede ser utilizada para mejo-

Figura 1: Principales destinos de la agricultura mundial. El hombre debecompetir por las cosechas con insectos plaga, malezas y enfermedadesque reducen el rendimiento de los cultivos. Gentileza del Prof. GermánSpangenberg.

336 FERRERO, Adriana A.; DESCAMPS, Lilian; REVIRIEGO, María

rar el manejo de las plagas. Varios estudiosmuestran que es posible estabilizar las comu-nidades de insectos en un agroecosistemaconstituyendo arquitecturas vegetales quesoporten a las poblaciones de enemigos na-turales y/o inhiban el ataque de las plagas.

Es difícil imaginar una tecnología que pro-duzca la cantidad necesaria de alimento parala humanidad y el mantenimiento adecuadode la salud pública sin recurrir al uso deplaguicidas, adquiriendo particular relevanciadentro de este grupo los insecticidas desti-nados a combatir y/o reducir una poblaciónde insectos plaga.

2 Insecticidas

El uso de insecticidas en el mundo es muygeneralizado. Su aplicación para mantener alos cultivos libres de insectos representa cuan-tiosas inversiones económicas (Fig.2). Laspérdidas en cosechas debidas a los insectossumado al costo de los herbicidas represen-tan una inversión mundial de unos 3 billonesde dólares anuales.

El método más preciso de clasificación delos insecticidas es de acuerdo con su compo-sición química. Los grupos más importantesson los organoclorados, organofosforados,carbamatos y piretroides.

Los organoclorados constituyen el grupomás antiguo y más utilizado de insecticidas

orgánicos. Estos contienen cloro, hidrógenoy carbono en su molécula y, ocasionalmente,oxígeno y azufre. Aunque son muy efectivos,estables y persistentes, se acumulan en gra-sas y dan origen al conocido fenómeno debiomagnificación. Sus efectos sobre la vidasilvestre, el medio ambiente y la salud huma-na están muy bien documentados en el libroLa primavera silenciosa, escrito en el año1962 por la bióloga Raquel Carlson. A partirde 1950/1960 los organoclorados fueron re-emplazados por los organofosforados y loscarbamatos.

Los organofosforados se desarrollaron enAlemania durante la Segunda Guerra Mun-dial; químicamente derivan del ácido fosfóri-co, son menos estables en presencia de laluz y se descomponen rápidamente en com-puestos no tóxicos. La ruptura de estos com-puestos se produce en horas o días en com-paración con los organoclorados, que demo-ran meses o años. Los carbamatos son insec-ticidas de amplio espectro muy utilizados enla agricultura, desarrollados por la corpora-ción Geigy. Son derivados del ácido carbámicoy similares en la persistencia en el ambientea los organofosforados. Entre 1970 y 1980siguieron los insecticidas piretroides, deriva-dos del ácido crisantémico. Sufotodegradación es rápida y en la actualidadson los más utilizados por ser más segurospara la vida silvestre y el ambiente.

Como grupo, los com-puestos sintéticos menciona-dos son los más potentespara el control de las plagas.Debido a su amplio espectrode acción en la naturaleza,pueden resultar perjudicialesal hombre tanto en losagroecosistemas como en losecosistemas naturales, nosólo destruyendo a la plagasino también a otros insectosque actúan como enemigosnaturales o favoreciendo elresurgimiento de plagas se-cundarias. A menudo, algu-nas de las causas de estosefectos indeseables están re-lacionadas con la elección delproducto, la dosis y el modoen que éstos se aplican.

Figura 2: Uso de insecticidas en los principales cultivos agrícolas y el montode las inversiones realizadas.


Continuamente se buscan compuestosmás selectivos, más específicos y con blancospara accionar específicos de los insectos.Muchos insecticidas convencionales afectanel sistema nervioso del insecto, que tiene fun-ciones similares a las del hombre o al de otrosanimales. Esto hace que el interés en ellos sereduzca por los potenciales riesgos para lasalud humana y animal.

En las últimas tres décadas se han logra-do avances tecnológicos significativos quehan permitido descubrir, identificar y sinteti-zar químicos específicos que regulan o me-dian el crecimiento, comportamiento y de-sarrollo del insecto. En este grupo se encuen-tran los llamados reguladores del crecimien-to, que se caracterizan por causar muerteprematura y metamorfosis anormales. Dadosu modo de acción su uso es seguro.

Otro grupo de insecticidas son los natu-rales, que pueden ser aceites minerales ob-tenidos del refinamiento del petróleo o bo-tánicos. Los aceites refinados de petróleopresentan ventajas como bajo costo, buenacobertura de las superficies a tratar y facili-dad en su formulación. Se los ha utilizadocomo coadyuvantes de otros insecticidas yson seguros para el ambiente. Sin embargo,son inestables en almacenaje, inefectivoscontra ciertas plagas y algunos insectos pre-sentan resistencia a los mismos.

Los insecticidas botánicos son derivadosde las plantas o de parte de ellas y han sidoutilizados durante mucho tiempo antes quecualquier otro insecticida. Las plantas produ-cen una diversidad de compuestos, sin un rolaparente en los procesos fisiológicos básicosde las mismas, y a los que se conoce con elnombre de metabolitos secundarios. Un con-siderable número de ellos son tóxicos paralos insectos ocasionándoles lesiones o lamuerte, dependiendo de las circunstancias yde la cantidad ingerida. Los más conocidosson los alcaloides. Además de éstos, existenanálogos químicos de las hormonas de losinsectos, que pueden actuar interrumpiendosu ciclo biológico. También existen proteínas,dentro de las cuales están incluidas enzimastales como quitinasas, lectinas e inhibidoresde enzimas digestivas, con la misma función.

Actualmente es posible introducir en plan-tas genes que confieren resistencia a insec-tos para reducir su susceptibilidad a los mis-

mos. Estos genes pueden tener diversos orí-genes y constituyen una herramienta impor-tante en el desarrollo de variedades resisten-tes. Su importancia radica en su efectividad,selectividad contra la plaga, baja estabilidadrelativa y compatibilidad con otras tácticas.Además, las variedades resistentes puedenser introducidas fácilmente y en forma eco-nómica resultando en ganancias en cortotiempo. Sin embargo, el tiempo requeridopara su desarrollo, los problemas de biotiposy que, a veces, las características agronómicasde un cultivar puedan ser beneficiosas paraotra plaga son algunas de sus desventajas.

Las barreras químicas de las plantas pue-den ser interpretadas como un mecanismode defensa contra los insectos que se alimen-tan de ellas y que la planta ha adquirido porselección natural. Sin embargo, es difícil de-mostrar esta afirmación. Los metabolitossecundarios tienen funciones alternativas,muchos son considerados como agentesantimicrobianos que protegen las plantas deposibles enfermedades. De todas manerasexisten ejemplos que demuestran que duran-te la alimentación de los insectos con unaplanta puede inducirse en la misma un incre-mento en la concentración de algunosmetabolitos secundarios, que serán efectivoscontra sucesivos ataques.

La relación entre el estímulo químico dela planta y la respuesta del insecto es unaforma de comunicación química entre estosorganismos. Esta comunicación se realizamediante compuestos conocidos comosemioquímicos, que suelen llamarse agentesantiinsectos y que pertenecen al grupo delos biorracionales. Los semioquímicos inclu-yen a las feromonas, sustancias producidaspor insectos que permiten la comunicaciónentre individuos de la misma especie y a losaleloquímicos, que permiten la comunicaciónentre individuos de diferentes especies. Esnecesario destacar que en la última décadase han investigado intensamente las posibi-l idades de aplicar comercialmente lasferomonas con fines de control. En la prácti-ca sólo el 5% de las mismas se ha logradosintetizar. Hasta el momento no se encuen-tran en la bibliografía casos instalados de re-sistencia a feromonas, pero poco uso se hahecho de ellas.

Los aleloquímicos pueden subdividirse en


allomonas y kairomonas. Las allomonascumplen función defensiva, produciendo res-puestas negativas en los insectos y reducien-do el contacto y la utilización de la planta.Entre ellas se encuentran los repelentes y loscompuestos que alteran la oviposición y laalimentación. Las kairomonas provocan res-puestas positivas en el insecto favoreciendola localización del huesped, la oviposición y laalimentación. Estas incluyen atractantes,excitantes y estimulantes.

El estudio de la interacción entre la plagay los compuestos presentes en las plantasofrecen un potencial importante para mejo-rar, en el futuro, el control de las plagas enmuchos cultivos.

Dentro del grupo de los biorracionalestambién resultan de interés los productos defermentación bacteriana y las proteínascristalinas. Entre los primeros se encuentranlas avermectinas, que son una mezcla deproductos naturales producidos por unactinomicete del suelo, Streptomycesavermectilis. Este moderno insecticida y tam-bién acaricida debe su mecanismo de accióna la actividad como agonista del ácido gamaamino butírico (GABA), que es unaneurohormona del sistema nervioso de losinvertebrados. Las avermectinas actuarían enlos mismos receptores específicos para GABAprovocando la parálisis y muerte del insecto.

Entre los segundos se encuentran lasendotoxinas de Bacillus thuringiensis, tam-bién conocidas como Bt. Los productos ba-sados en Bacillus thuringiensis (Bt) son losmás difundidos entre los llamados «insecti-cidas biológicos» porque poseen bajo ries-go ambiental y humano. No obstante, suaplicación ha sido muy restringida. En la ac-tualidad, debido a los avances logrados ensu formulación y a la biotecnología se handescubierto cepas de Bt. con mayor poten-cia y espectro de acción. Las Bt son bacteriasGram positivas que producen, durante laesporulación, una inclusión cristalinaparasporal proteica. Esta inclusión es disuel-ta por ingestión en el intestino medio de losinsectos, donde se libera la llamada deltaendotoxina. Los cristales de las diferentescepas de Bt contienen más de un tipo deproteína con poder insecticida. Sonbioactivas frente a lepidópteros, dípteroso coleópteros. La estructura de las delta

endotoxinas varía según el gen que las codi-fica. Se identificaron y clasificaron numerososgenes que las codifican, que son de dos ti-pos, denominados cry (por cristal), y cyt (toxi-nas citolíticas). Ya hay más de 100 genes iden-tificados pertenecientes a estas familias. Elmodelo actualmente vigente para el meca-nismo de acción sugiere que por unión de latoxina a su receptor específico se induce laformación de poros en la membrana celularque generan un desbalance iónico que con-duce finalmente a la muerte del insecto. Unanueva clase de insecticidas que surgieron apartir de las bacterias mencionadas es la quecorresponde a la llamada clase VIP (vegetativeinsecticidal protein). Estas moléculas se sin-tetizan durante el ciclo vegetativo de las bac-terias y actúan como exotoxina que al seringerida por la plaga, cesa la alimentación ymuere rápidamente.

Gracias a los avances de la tecnología delADN recombinante se pudieron aislar losgenes de las deltas endotoxinas de Bacillusthuringiensis y expresarlos en plantas y bac-terias del suelo. Esta biotecnología condujoa nuevas formas de liberación de las toxinaspara controlar insectos plaga. Los genes Btque más comúnmente se utilizan, en la ac-tualidad en algodón tienen dos orígenes, unoes el CryAc utilizado por Monsanto en susvariedades Bollgard y el otro es un gen híbri-do que fue desarrollado por el sector público(Academia de Ciencias Agrarias de China,CAAS). Se trata de un gen Cry1Ab/Cry1Ac.Existe otro gen CpTi («cowpea trypsyngene») que se emplea unido a Bt en algunavariedades chinas. Otro gen dual es el CryAc/Cry1F. La utilización de dos genes simultá-neamente es una importante herramientapara demorar el comienzo de la resistencia.Las dos toxinas juntas resultan en un controlredundante que conferiría una resistenciamás duradera e incrementa el espectro deinsectos que permite controlar. En la actuali-dad se han informado 1.326 especies de in-sectos que atacan al algodón, de los cuáles10 producen pérdidas importantes desde elpunto de vista económico, la mayoría de loscuales son lepidópteros.

Cabe mencionar que las toxinas expresa-das en la plantas Bt son idénticas o similaresa las encontradas en la naturaleza y a las quese encuentran en el microorganismo que se


utiliza en las aplicaciones convencionales deBt. Esta toxina es inocua para insectos quenaturalmente no son sensibles al Bt, paraaves, peces y mamíferos, entre los que se in-cluye el hombre. En cuanto a la evaluacióndel impacto ambiental ver IX.2 y 3.

El cultivo a gran escala de variedades Bt,comenzó en 1996 y se incrementó rápida-mente, alcanzando los 14 millones de has.en el 2002. En el 2001 variedades comercia-les de maíz, algodón y papa fueron planta-das en 5 millones de hectáreas en EE.UU.,Argentina, Canadá, China, Australia,Sudáfrica, México, España, Francia, Portugal,Rumania y Ucrania

En el 2003 el maíz Bt ocupó el segundolugar en importancia en el mundo, con unasuperficie de 12,3 millones de has, lo queequivale al 13 % del área total de cultivostransgénicos (67,7 millones de has). Los paí-ses que lo han adoptado son Estados Uni-dos, Canadá, Argentina, Sudafrica, España,Filipinas, Honduras, Uruguay y Alemania. Enun año la superficie sembrada aumentó de9,9 millones de has a 12,3 millones. El maíztolerante a herbicidas e insectos (eventoscombinados por cruzamiento convencional)con 3,2 millones de has representa el 5 % dela superficie y el algodon Bt tiene una super-ficie equivalente. El algodón tolerante a her-bicidas e insectos ocupa 2,6 millones de has(4%)

Este tipo de biotecnología tiene muchaimportancia en los países en vías de desarro-llo. Los beneficios que otorgan estos produc-tos son la reducción en el uso de insecticidasconvencionales, en algunos casos de más del50 %, el incremento del valor del cultivo, mejorcontrol natural de la plaga, protección de losenemigos naturales, reducción en la conta-minación ambiental y posibilidad de combi-nar esta tecnología con otras tácticas para elcontrol de la plaga. También se han registra-do incrementos en el rendimiento y meno-res costos de producción, ya que el gen seexpresa en todos los estadios de crecimien-to y en todos los órganos de la planta, evi-tando tener que aplicar insecticida en tiem-pos determinados; no existe riesgo de lava-do por la lluvia ni pérdida de actividad debi-da a la luz del sol, como sucede cuando seaplican las formulaciones derivadas del micro-organismo directamente. (Fig.3 y 4).

Como un efecto indirecto de la protec-ción contra insectos del maiz Bt, se ha podi-do determinar una reducción en la presenciade fumonisinas (micotoxinas producidas pordiferentes especies de Fusarium sp). Estasmicotoxinas son toxicas y cancerigenas paraun número de especies animales y se hanrelacionado con los altos indices de canceresofágico observados en agricultores de Afri-ca y China. Los niveles de reducción defumonisinas en maices protegidos del dañode los insectos (que constituyen vías de en-trada del hongo), varían entre 3 y 8 veces endiferentes países y años.

Otra ventaja es el ahorro en consumo deagua que implica la menor utilización de in-secticidas, que, como se sabe es uno de losrecursos más limitantes del planeta (verVIII.12). El volumen de agua utilizada en una

Figura 3: Cañas de maíz convencional (arriba) yprotegido de insectos (abajo) con el gen cry1Abespecífico para el barrenador del tallo, Diatraeasaccharalis. (Gentileza Monsanto Argentina).

Figura 4: Ensayo experimental de soja tolerante ainsectos lepidópteros. En primer plano, variedadconvencional (Gentileza Monsanto Argentina).


simple aplicación de insecticida es de 40 a 80litros por ha. El ahorro en consumo de aguadebido a la utilización de tecnologías comoBt puede estimarse de la siguiente manera:durante 2001, 81 millones de kg de insectici-das fueron aplicados en el cultivo de algodónen el mundo, a un promedio de 0,45 kg/ha/aplicación en el 2001. Esto representa 180millones de has. fumigadas, lo que es consis-tente con un promedio global de 5,5 aplica-ciones sobre 33,5 millones de has. La canti-dad de agua utilizada para aplicar 81 millo-nes de kg de insecticida es de 12,6 billonesde litros. El ahorro en consumo de agua conesta tecnología podría ser del 50%, es decir6.3 billones de litros anuales. También signi-fica una reducción de 5,6 millones de litrosde combustible y de un millón de kg de des-hechos industriales generados en la fabrica-ción de insecticidas convencionales.

Dados los recientes avances enbiotecnología, se podría esperar que las plan-tas transgénicas resistentes jueguen a futu-ro un importante rol en el control de insec-tos plaga. Hasta donde se conoce, no haevolucionado una plaga que exprese a cam-po resistencia a los cultivos Bt. No obstante,el Bt aplicado como «spray» ha generadomoderados a elevados niveles de resistenciaen poblaciones de polilla de las coles y enalgunos ensayos se observó resistencia a plan-tas Bt en experimentación, como por ejem-plo a plantas transgénicas de bróccoli. Exis-ten al menos 7 cepas resistentes de 3 insec-tos plaga que sobreviven sobre cultivos Bt.

A fin de contrarrestar la aparición de re-sistencia se desarrolló la estrategia de refu-gio, basada en la teoría desarrollada en do-cenas de publicaciones durante los últimos25 años y en la limitada experiencia de tra-bajos experimentales a pequeña escala. Setrata de plantar refugios de plantas no Bten áreas próximas a los cultivos Bt para per-mitir la supervivencia de los insectos suscep-tibles. De manera ideal, la resistencia es con-ferida por alelos raros, recesivos y los adultosmás resistentes de los cultivos Bt seaparearán con los adultos susceptibles de losrefugios. Si esto es así, la teoría predice quela aparición de resistencia se verá demoradasustancialmente. Aunque no existen informesdetallados acerca de las evaluaciones a granescala de esta estrategia de refugio, los ex-

perimentos muestran que pueden ocurrir al-gunas violaciones a algunas de las asuncio-nes clave (baja frecuencia de alelos de resis-tencia y herencia recesiva de la resistencia aBt) en algunos sistemas. De esta manera,dado el difundido uso de los cultivos Bt con-tra varios insectos plaga, la resistencia podríaevolucionar rápidamente en algunas situacio-nes a pesar de la presencia de refugios. Con-trariamente a esto, no se han documenta-do hasta la fecha incrementos en la frecuen-cia de resistencia a las toxinas Bt en pobla-ciones de insectos a campo a causa de la ex-posición a cultivos comerciales que expresanBt.

Los factores clave para la demora en laaparición de resistencia son probablemente:los refugios, las bajas frecuencias iniciales delos genes de resistencia, la herencia recesivade la misma, los costos asociados con el de-sarrollo de la resistencia, que reducen la apti-tud de los individuos resistentes en relacióna los individuos susceptibles sobre los culti-vos Bt y las desventajas sufridas por las ce-pas resistentes sobre los huéspedes Bt enrelación a su desempeño sobre cultivos noBt. La importancia relativa de estos factoresvaría entre los sistemas de las plagas y loscultivos Bt.

Una lección que nos brindan estos pocosaños de cultivos Bt es que debemos ser cau-telosos y reconocer que la habilidad para pre-decir tasas de evolución de la resistencia enel campo es limitada. El éxito de los cultivosBt hasta la fecha excede las expectativas demuchos, pero no previene los problemas deresistencia en el futuro. El monitoreo cons-tante y las estrategias biotecnológicas encontinuo desarrollo serán fundamentalespara conservar este recurso de control bio-lógico.

2.1. Insecticidas naturales vs insecticidassintéticos

La pregunta que nos deberíamos haceres: ¿son los insecticidas naturales más segu-ros que los sintéticos? Los científicos respon-den que puede ser que sean, dependiendodel insecticida natural o sintético que se estécomparando. Cuando se evalúa el riesgo o laseguridad de cualquier plaguicida se debe re-cordar que 1) la toxicidad es una función de


la estructura química y no de su origen, 2) laseguridad de un plaguicida depende del tiem-po y frecuencia con que el individuo estuvoexpuesto y de la dosis de exposición y que 3)la percepción del riesgo a veces no es coinci-dente con el riesgo real o actual de unplaguicida.

En algunas plagas, no se puede detenerla aparición de resistencia a insecticidas con-vencionales, biopesticidas o nuevos cultivostransgénicos.

La resistencia en insectos es un caso detoxicidad selectiva intraespecie. Según unadefinición, el fenómeno de resistencia con-siste en la habilidad desarrollada en una cepade insectos para tolerar dosis de tóxicos queserían letales para la mayoría de los indivi-duos de una población normal de la mismaespecie, siendo esta habilidad de caráctergenético y heredable. Los insecticidas creanuna presión de selección que elimina progre-sivamente los individuos sensibles dejandoun nicho vacío que pasan a ocupar los indivi-duos resistentes. La resistencia es un caso deevolución preadaptativa. Los insecticidasnaturales y/o sintéticos no inducen sino queseleccionan cepas resistentes. El mecanismomás común por el cual una cepa resulta resis-tente a un insecticida es por la modificaciónde la toxicocinética o toxicodinámica. Latoxicocinética de los insecticidas naturales osintéticos tienen que ver con las etapas depenetración, distribución, acumulación,biotransformación y excreción en el insecto.La llegada al sitio de acción se denominatoxicodinámica y tiene que ver con la reac-ción fundamental del insecticida o sumetabolito activado con una enzima o recep-tor vital. Estas etapas dependen críticamentede las propiedades fisicoquímicas de los com-puestos antiinsectos.

3. Consideraciones finales

Sin duda, varias tácticas pueden serimplementadas para evitar la pérdida de lascosechas por acción de los insectos plaga. Asíprogramas de Manejo Integrado de la Plaga(MIP) deben ser desarrollados para cada cul-tivo y en cada región, manteniendo la po-blación de la plaga debajo del nivel de dañoeconómico. Se debe entender al MIP comouna filosofía y una metodología que enfatizan

la necesidad de utilizar estrategias de mane-jo de la plaga para minimizar el resurgimien-to de la misma. A pesar de todo, los insectici-das han sido y probablemente continuaránsiendo los métodos más efectivos para con-trolar el desarrollo de las plagas. Decía el Dr.Edgardo Wood, en una conferencia relacio-nada con la resistencia a insecticidas: «El hom-bre contemporáneo debería comprenderque las tácticas químicas eficaces para con-trolar las plagas como asimismo los blancossensibles y viables deben protegerse como‘patrimonio de la humanidad’, porque de lairracionalidad en el uso de la química contrala naturaleza podrá sobrevenir una crisis de-bida a resistencia generalizada en la que nocontaremos con moléculas naturales o sinté-ticas efectivas ni con blancos viables. Entre-tanto la esperanza radica en el conocimien-to cada vez mayor del problema y su poten-cialidad para ser cuidadosos en el aporte yutilización de las soluciones. El primer granpaso ya está dado: el no desconocer el fenó-meno.»

4. Lecturas Recomendadas

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VIII.-Capítulo 11

Estrategias para el manejo integradode malezas: problemática, resistencia aherbicidas y aportes de labiotecnología.

Sabbatini, M.R.; Irigoyen, J.H.; Vernavá, M.N.

1 Definiciones, características y dañosocasionados por las malezas

Se define a las malezas como plantas quecrecen en sitios no deseados por el hombre,por lo que puede ser considerada malezatoda planta que disminuye el rendimiento deun cultivo, resulta tóxica para el ganado, in-vade el césped de un jardín o la que crece enel techo de una casa dificultando el desagüede sus tuberías. Este concepto de maleza ode planta indeseable causa por lo general unrechazo especialmente por parte de botáni-cos que no admiten que se catalogue de estamanera a una especie vegetal. Contrariamen-te, para un productor agropecuario, las ma-lezas constituyen plantas nocivas que debenser eliminadas de los campos en producción,debido a que en la mayoría de los cultivos ypasturas su presencia ocasiona perjuicios eco-nómicos de mayor o menor grado de severi-dad. La referencia negativa a estas plantasse traslada a otros países; así, por ejemplo,en España se las denomina «malas hierbas»y en Brasil «plantas dañinas». El concepto demaleza tiene por ello un origenantropocéntrico, ya que en realidad no exis-te ninguna característica morfológica o fisio-lógica que permita caracterizar a una especievegetal como maleza. Así, existen algunasespecies que de acuerdo con el lugar dondecrecen pueden ser consideradas cultivos omalezas. Un buen ejemplo de ello lo consti-tuye el «raigrás» (Lolium multiflorum), en laprovincia de Buenos Aires, que es una male-za importante del cultivo de trigo pero para-lelamente es una forrajera ganadera muydeseable.

Las malezas conforman una pequeña pro-porción del mundo vegetal: de las 200.000especies de angiospermas, sólo cerca de30.000 se comportan como malezas y no más

de 250 representan serios problemas para lasactividades humanas. En agroecosistemas, lamayoría de las malezas tienen algunas carac-terísticas claves que aseguran su éxito y lesotorgan la habilidad de invadir, dominar ypersistir. Entre ellas se encontrarían una altadispersión por semillas u otros disemínulos,que les asegura una asociación cercana ahábitat manejados por el hombre; un altopotencial de colonización que les permiteincrementar la población rápidamente e in-tegrarse a la comunidad vegetal, y una altacapacidad de persistencia en el sitio, fun-damentalmente a través de comportarsecomo hábiles competidoras frente a los culti-vos y presentar un banco de semillas opropágulos abundante y longevo. El bancode semillas del suelo es la reserva de simien-tes que se encuentra enterrada en los suelosagrícolas y constituye la única fuente de re-posición de las especies anuales, que sonaquellas que se reproducen únicamente porsemillas. Las especies perennes presentan enel banco, además de semillas, propágulosvegetativos (tubérculos, rizomas, estolones,bulbos) que originan plantas genéticamenteidénticas a las plantas madres. La eficienciareproductiva a través de la vía sexual (semi-llas) permite la formación de nuevosgenotipos capaces de colonizar y dominarnuevos ambientes. Por otro lado, la víaasexual (propágulos vegetativos) les permiteperpetuarse en los ambientes ya colonizados.

Los principales inconvenientes ocasiona-dos por las malezas a los agricultores, que setraducen generalmente en un perjuicio eco-nómico, son los siguientes:

- Compiten con los cultivos por nutrientes,agua y luz, disminuyendo el rendimiento delos productos cosechados (granos, tubércu-los, frutos, etc.).

- Interfieren en las labores de cosecha ydisminuyen la calidad de los productos cose-chados.

- Causan toxicidad directa al ganado y dis-minuyen la calidad de las pasturas.

- Interfieren con el manejo del agua ensistemas de agricultura bajo riego.

- Actúan como huéspedes de insectos,enfermedades y otras plagas de la agricultu-ra.

344 SABBATINI, M.R.; IRIGOYEN, J.H. y M.N. VERNAVÁ

- Liberan sustancias alelopáticas, que afec-tan el normal desarrollo de los cultivos.

El problema no es menor. Debemos porejemplo considerar que algunas malezas dis-minuyen el valor de la tierra, ya que limitanla posibilidad de producir determinados cul-tivos. Por ejemplo, la abundancia de male-zas invasoras perennes como el «gramón»(Cynodon dactylon) o el «sorgo de alepo»(Sorghum halepense) reducen el valor de loscampos en la provincia de Buenos Aires, yaque es necesario implementar un intenso ycostoso programa de control si se desearaimplantar la mayoría de los cultivosprimavero-estivales, producidos normalmen-te en esa zona. Otro ejemplo lo constituyela zona bajo riego del valle inferior del RíoNegro, en la cual algunas chacras no son cul-tivadas cuando existe la presencia en abun-dancia de Centaurea repens, una malezaperenne de muy difícil erradicación y que im-pide la producción rentable de cultivoshortícolas. El problema lo podríamos cuanti-ficar indicando que es mayor la inversión querealizan los agricultores para controlar dichasmalezas (labores mecánicas, aplicaciones deherbicidas) que la que realizan para contro-lar otras plagas como insectos, hongos,nematodos, etc. Así, por ejemplo, se ha cal-culado que cerca del 50% del mercado mun-dial de plaguicidas corresponde a herbicidas.

2 Estrategias en el manejo de las malezas

Desde que el hombre comenzó a cultivarvegetales necesitó extirpar las plantas nodeseadas que crecían junto a ellos, de formatal que el manejo y control de malezas estan antiguo como el desarrollo mismo de laagricultura. Por miles de años el control ma-nual y el uso de cultivadores arrastrados poranimales constituyeron la principal prácticadisponible para solucionar el problema de lasmalezas. Posteriormente, el control mecáni-co sustituyó dichas prácticas hasta que amediados del siglo XX, comenzó a generali-zarse el uso de compuestos químicos (herbi-cidas) para el control de malezas.

El manejo de las especies consideradasmaleza puede ser enfocado a través de dife-rentes estrategias. Todo programa de con-trol deberá inexorablemente responder con

tácticas de manejo en concordancia con losciclos de vida, tasa de crecimiento y otrosatributos de las malezas. El enfoque tácticoes diferente si se trata de malezas de cicloanual o perenne. Como regla general, sepuede aseverar que las especies anuales sonvulnerables a los métodos de control en losestadios de plántula y vegetativo, aunquecierto grado de éxito también puedaalcanzarse en el estadio de floración. Lasmalezas perennes, que cuentan con sistemasde propagación vegetativa, requieren de unprograma a largo plazo que combine diferen-tes medidas de control previo y durante eldesarrollo del cultivo.

Existen cuatro estrategias básicas de con-trol relacionadas con la problemática de lasmalezas:

a) El control cultural involucra todas lasmedidas tendientes a generar condicionesfavorables o ventajas competitivas que be-neficien al cultivo frente a las malezas. Así, lasiembra de un cultivo con semillas de ade-cuada sanidad, valor cultural y vigor, puedegenerar condiciones para el rápido estableci-miento y desarrollo del cultivo en relación conlas malezas.

b) Los controles manual y mecánico im-plican la remoción de las malezas emergidasdirectamente por el hombre o mediante lautilización de diferentes implementos comocultivadores, escarificadores, rastras, arados,etc. La topografía y el tipo de suelo, la pro-fundidad de la napa freática, el tipo de ma-leza y el estadio fenológico del cultivo sonfactores determinantes de su factibilidad deimplementación. Es una de las prácticas decontrol más utilizada debido fundamental-mente a su practicidad.

c) El control biológico de malezas con-siste en la utilización de organismos, agen-tes biológicos o enemigos naturales que seencuentran en el ambiente y que a través desu interacción (parasitismo, predación oherbivoría, acción patogénica, alelopatía)afectan negativamente el desarrollo de unapoblación de malezas. Esta táctica de con-trol representa la máxima aspiración en elmanejo de malezas, fundamentalmente entérminos ecológicos y de preservación delambiente. Una condición necesaria en el con-trol biológico es la especificidad que debe


tener el agente controlador, para evitar queafecte a los cultivos o la flora natural. De estaforma, su operatividad potencial se ve res-tringida debido a la diversidad de la flora demalezas generalmente presente. Además, elaislamiento y comercialización de organismosde control biológico específicos frente a unamplio espectro de malezas determina queesta táctica se adapte, en mayor medida, asituaciones donde una especie de malezaconstituye el problema dominante. Un ejem-plo en desarrollo en nuestro país es el delcontrol de «yuyo esqueleto» (Chondrillajuncea) en la zona del sudoeste de la provin-cia de Buenos Aires, mediante la liberacióndel ácaro exótico (Eriophyes chondrillae) queforma agallas en los tallos de la maleza redu-ciendo su producción de flores y semillas.

d) El control químico constituye en laactualidad la estrategia más difundida en elmanejo de malezas. Las principales ventajasson su rápida acción, su versatilidad y adap-tación a diferentes equipos de aplicación ysistemas de cultivo y su potencialidad de apli-cación en grandes extensiones. Como con-trapartida, pueden contaminar suelos,acuíferos y alimentos, afectar organismosbenéficos, disminuir la biodiversidad, causarcambios en las comunidades de malezas, con-duciendo al reemplazo de malezas suscepti-bles por tolerantes y, además, desencadenarproblemas de resistencia, como se verá másadelante.

3 Características de los herbicidas y sumodo de acción

Los herbicidas son sustancias químicasque ocasionan la muerte de plantas o queinhiben su normal crecimiento. Así, existenherbicidas selectivos o específicos, que per-miten controlar malezas sin afectar a los cul-tivos y herbicidas no selectivos o de accióntotal, que se utilizan generalmente en losbarbechos, previo a la implantación del culti-vo. Reemplazan las tareas de labranza tradi-cional y constituyen la herramienta funda-mental de manejo en los cultivos resistentesa herbicidas.

La selectividad es la propiedad que pre-sentan algunos herbicidas de ejercer su ac-ción fitotóxica sobre algunas especies vege-tales (malezas) pero sin afectar a otras plan-

tas (cultivos). Así, por ejemplo, el 2,4-D (áci-do 2,4-dicloro-fenoxi-acético) es un herbicidaselectivo para cultivos de cereales o gramíneasen general (trigo, avena, maíz, etc.), ya quecontrola malezas de hoja ancha o latifoliadas.Sin embargo, el carácter de selectividad ge-neralmente se restringe a determinados es-tadios fenológicos dentro del ciclo de desa-rrollo del cultivo y a una dosis determinadadel herbicida. Efectivamente, el 2,4-D pierdesu selectividad en el cultivo de trigo cuandose lo aplica fuera del estadio de macollaje delcultivo (período en que emite tallos secun-darios) y también cuando se aplica en dosissuperiores a las recomendadas.

El herbicida puede ser pulverizado en co-bertura total o en forma parcial (sobre lasbandas del cultivo) por lo que se adapta adiferentes tecnologías de aplicación. A su vez,los mismos pueden ser aplicados sobre lacanopia de malezas emergidas denominán-dose herbicidas postemergentes, o puedenejercer su acción desde el suelo, denominán-dose entonces preemergentes. Una de laspropiedades más relevantes de algunos her-bicidas llamados sistémicos lo constituye sucapacidad de transportarse dentro de los sis-temas de conducción de las plantas hastaalcanzar el sitio o blanco de acción biológica.Existen algunos herbicidas postemergentescuya movilidad es reducida o nula, ejercien-do su acción solamente en las áreas que al-canza cuando es pulverizado. Estos herbici-das se denominan de contacto. Un ejemplolo constituye el paraquat, herbicidadesecante de contacto que ejerce su acciónsólo sobre el sistema aéreo de la planta, sinafectar el sistema subterráneo del vegetal.

Para que un herbicida sea efectivo debetomar contacto con la maleza, ser absorbi-do, transportarse hacia el sitio de acción sinser desactivado y alcanzar niveles tóxicos enel sitio de acción biológica. Se puede definircomo modo de acción de un herbicida a lasecuencia de eventos que ocurren en la plan-ta desde que la sustancia herbicida es absor-bida hasta la ocurrencia de la muerte del ve-getal. Asimismo, se define como mecanismode acción a la interferencia bioquímica obiofísica primaria impuesta por la presenciade moléculas del herbicida que conduce alefecto letal en el vegetal. Algunas plantas soncapaces de desactivar o degradar rápidamen-


te a un determinado herbicida, logrando so-brevivir a su efecto tóxico. El maíz, por ejem-plo, es tolerante a los herbicidas de la familiade las triazinas debido a que puede conjugaro enlazar dichas sustancias tóxicas con com-puestos químicos naturales dentro de la plan-ta de maíz.

Existe un gran número de herbicidas enel mercado. En la Argentina, actualmente secomercializan aproximadamente 100 ingre-dientes activos, agrupados en familias deherbicidas, que a su vez pueden asociarse deacuerdo con su mecanismo de acción (Tabla1).

Una de las vías de desarrollo del controlquímico es el continuo mejoramiento detécnicas de aplicación de los herbicidas. Así,para que una sustancia alcance su máximapotencialidad biológica debe garantizarse sutraslado desde el equipo aplicador hasta elsitio de acción en el vegetal, donde ejercerásu efecto letal. Para ello se han diseñadoequipos de aplicación muy precisos y la indus-tria química ha perfeccionado la formulaciónde los principios activos con el agregado dedistintos vehículos, coadyuvantes, diluyentes,etc., que los acondicionan para su mejor des-empeño biológico.

En los últimos años, debe destacarse elimportante avance en el uso de protectoresde herbicidas, mal denominados antídotos.Un protector de herbicidas es un compues-to que protege a las plantas de un cultivo delos daños de una sustancia herbicida dirigidaal control de malezas. Estos compuestos pro-tectores actúan únicamente sobre el cultivo,reduciendo la habilidad de las sustancias her-bicidas para alcanzar o interferir el sitio deacción donde actúan. En la actualidad existemás de una decena de protectores disponi-bles para uso comercial en cultivos de maíz,trigo, arroz, sorgo y otros cereales. El alcancede estos protectores ha permitido que her-bicidas de acción específica sobre malezas dela familia de las gramíneas puedan ser utiliza-dos selectivamente en cultivos de gramíneas,como por ejemplo el trigo o el maíz. El desa-rrollo de esta tecnología se inició con la apa-rición del NA (1,8-naftalen-anhídrico),patentado en 1971, para uso en tratamien-tos de semillas de maíz con el objeto de pro-tegerlo de los daños ocasionados por losherbicidas tiocarbamatos y actualmente se

encuentran registrados protectores para ungran número de herbicidas disponibles en elmercado.

4 Resistencia de las malezas a losherbicidas

El desarrollo de resistencia a herbicidas enmalezas es un proceso evolutivo. Se definecomo resistencia a herbicidas a la habilidadhereditaria de una población de malezas desobrevivir y reproducirse luego de ser expues-ta a una dosis de herbicida a la cual era origi-nalmente susceptible. La resistencia de ma-lezas a herbicidas es un proceso por el cual, através de una alta intensidad de selección,escasos biotipos resistentes -presentes enuna población susceptible- se vuelven mayo-ritarios, convirtiéndose la población en resis-tente. Se asume que la existencia o no deresistencia en una maleza se limita a la «do-sis agronómica», o sea la dosis normalmenteutilizada a campo para el control de male-zas. Algunas plantas (ya sean cultivadas omalezas) son «naturalmente» resistentes aalgunos herbicidas aplicados en la dosisagronómica, característica denominada tole-rancia a herbicidas. Lo anterior implica queno hubo selección o manipulación genéticapara hacer tolerante a la especie.

El reiterado uso de herbicidas en un mis-mo predio hace que la presión de selecciónactúe como un filtro que elimina a las plan-tas susceptibles, dejando que sobrevivan sólolas resistentes. Se dice que existe resistenciacruzada cuando un biotipo ha desarrolladouno o varios mecanismos de resistencia a unherbicida que le permite ser también resis-tente a otros herbicidas. Este fenómeno seobserva frecuentemente con herbicidas quepertenecen a una misma familia y que pue-den tener o no el mismo sitio de acción. Paraejemplificar lo anterior, se daría resistenciacruzada cuando luego de un intenso empleodel herbicida A en un lote se encuentra quelos biotipos resistentes a este herbicida lo sontambién a un herbicida B, que nunca habíasido aplicado antes. La resistencia múltiplese refiere a biotipos que evolutivamente handesarrollado resistencia a varios herbicidaspor procesos diferentes de selección. Porejemplo, un biotipo que desarrolló resisten-cia a un herbicida A es tratado con un her-


Tabla 1. Mecanismo y sitio de acción de las principales familias de herbicidas, frecuentemente utilizadas en elcontrol de malezas en la República Argentina y su riesgo potencial de ocasionar resistencia en las especies demalezas controladas.

bicida B, hacia el cual es inicialmente suscep-tible; luego de un tiempo de intenso uso delherbicida B la población se torna resistentea éste, por lo cual ahora es resistente a am-bos herbicidas.

Los mecanismos más comunes de resis-tencia son:

(i) Modificaciones en los sitios de acción,

o sea en los sitios bioquímicos dentro de laplanta con los cuales el herbicida interactúadirectamente. Cuando el herbicida actúa so-bre un solo sitio de acción, este tipo de me-canismo normalmente deriva en una resisten-cia completa, es decir que el biotipo resisten-te no manifestará ningún síntoma como con-secuencia de la aplicación del herbicida.


El grupo de los herbicidas que presentanun riesgo mediano a adquirir resistencia in-cluye algunos productos muy utilizados ennuestro país, como por ejemplo atrazina,trifluralina y paraquat. Entre los que tienenbajo riesgo a adquirir resistencia se incluye elglifosato, herbicida intensamente utilizado enlos planos tanto nacional como internacio-nal. El desarrollo de cultivos resistentes a her-bicidas (CRH) se ha basado principalmenteen el uso de este herbicida, ya que permitecontrolar un amplio espectro de malezas, esde bajo costo y reducido impacto ambien-tal.

Entre los factores que conducen a acele-rar el proceso de resistencia se encuentran:

a) Frecuencia inicial de mutaciones enel pool génico: las mutaciones siempre ocu-rren, se usen o no herbicidas, siendo letalesla mayoría de los genes mutantes. Los queno son letales se encuentran en bajas fre-cuencias porque son competidores débilesfrente a los tipos salvajes, dominantes. Lafrecuencia de los genes que confieren a laplanta resistencia a varios herbicidas es va-riable en la naturaleza. Por ejemplo, los alelosque confieren resistencia a los herbicidas consitio de acción en la enzima ALS (caso de lassulfonilureas, por ejemplo) aparecen con unafrecuencia de uno en un millón, se heredan através del núcleo y se comportanfenotípicamente como dominantes en lamayoría de las dosis de aplicación del herbici-da. Contrariamente, las mutaciones que con-fieren resistencia al afectar la proteína D1quinona del fotosistema II (por ejemplo lastriazinas) se heredan recesivamente y ocurrenen el genoma de los cloroplastos. Debido aque las mutaciones en los cloroplastos ocu-rren a frecuencias muy inferiores a las nuclea-res, la resistencia a ALS evoluciona más rápi-damente que la resistencia a la proteína D1quinona. Así, mientras que las malezas resis-tentes a sulfonilureas se hacen evidentes acampo en un período medio de tres a cincoaños, las resistentes a triazinas lo hacen en-tre 7 a 10 años, y como consecuencia de unuso continuo y a gran escala de herbicidasde dicha familia.

b) Presión de selección: cuanto mayorsea el efecto letal del herbicida sobre el

(ii) Cambios en el metabolismo de losherbicidas, referido al proceso bioquímicodentro de la planta que generalmente mo-difica los herbicidas hacia compuestos menostóxicos. Diferencias en la tasa demetabolización de herbicidas entre malezasy cultivos es la causa principal de selectividadde los cultivos. En este caso, generalmentela resistencia es parcial (no completa), con-duciendo a un control poco efectivo delbiotipo resistente.

La resistencia de insectos a insecticidas esun hecho ampliamente documentado des-de mediados del siglo XX, pero la de male-zas a herbicidas fue considerada hasta prin-cipios de los ’90 más como una curiosidad queun problema que afecte la producción agrí-cola. Sin embargo, la aparición en el merca-do agropecuario, entre 1980 y 1990, de her-bicidas que actúan en un único sitio de ac-ción, condujo a que la resistencia de malezasa herbicidas sea actualmente el tema demayor interés en el manejo de malezas entodo el mundo. Se han identificado aproxi-madamente 260 biotipos de malezas resis-tentes a herbicidas, que incluyen 160 espe-cies diferentes. El país con mayores casos re-gistrados es Estados Unidos, seguido porAustralia y Canadá. En la Argentina no se hainformado acerca de regiones severamenteafectadas con poblaciones de malezas resis-tentes, aunque en el centro y norte del paísse han aislado biotipos de la malezaAmaranthus quitensis («yuyo colorado»), re-sistentes a herbicidas de la familia de lasimidazolinonas.

La Tabla 1 indica con cuáles familias deherbicidas existe un riesgo alto, mediano obajo de desarrollar poblaciones de malezasresistentes. Las familias que en la actualidadocasionan mayores perjuicios en la agricultu-ra son aquellas cuyo modo de acción se basaen la inhibición de la enzima ALS(acetolactato sintetasa) y ACCasa (acetilcoenzima A carboxilasa), que afectan en lasplantas la biosíntesis de aminoácidos y delípidos, respectivamente. Varios herbicidasincluidos en dichas familias son intensamen-te utilizados en la actualidad en la Argenti-na, por lo que la resistencia representa unaamenaza para los agricultores en el corto pla-zo, especialmente en cultivos extensivoscomo trigo, soja, girasol y maíz.


biotipo susceptible y mayor la supervivenciade los biotipos resistentes, más rápido seráel proceso. Además, la presión de selecciónserá máxima con herbicidas persistentes, conlarga acción residual en el suelo. Cuanto ma-yor sea el éxito reproductivo del biotipo re-sistente, mayor será su potencial para domi-nar en la población. Asimismo, el tamaño delbanco de semillas será crucial para retardarla aparición de resistencia al «diluir» las semi-llas resistentes entre las semillas producidaspor las plantas susceptibles.

c) Adaptación del biotipo resistente: sibien en ausencia del herbicida los individuosresistentes poseen en general una capacidadadaptativa menor que los individuos suscep-tibles, existe una notable variación de acuer-do con el herbicida. Retomando el ejemploanterior, los biotipos resistentes a las triazinasse adaptan bastante menos al ambiente quelos biotipos susceptibles, lo que implica unarápida vuelta a la situación previa (es decir,mayoría de biotipos susceptibles en la pobla-ción) una vez que el herbicida deja de apli-carse. Contrariamente, las diferencias deadaptación entre biotipos resistentes y sus-ceptibles a las sulfonilureas son mínimas, loque implica un problema mucho más prolon-gado en los cultivos enmalezados.

Si bien en estos últimos años se ha acre-centado la importancia de la resistenciamonogénica, derivada de herbicidas que ac-túan en un solo sitio de acción, existen casosrecientes de malezas que han desarrolladoresistencia multigénica. En este último casola resistencia se desarrolla como consecuen-cia de muchas y diferentes mutaciones en losalelos, cuya acumulación en la población porrepetida selección confiere cada vez mayo-res niveles de resistencia, especialmente cuan-do la dosis es gradualmente incrementada.Este tipo de resistencia se ha encontradorecientemente en Lolium rigidum en Aus-tralia al aplicarse en forma reiterada el herbi-cida diclofop-metil y se produce como conse-cuencia del mal uso del herbicida (bajas do-sis, herbicidas adulterados, baja calidad enlas aplicaciones, etc.).

De lo expuesto se desprende que el temade la resistencia de las malezas a los herbici-das es realmente complejo y si bien la resis-

tencia puede ser demorada, su desarrollo esprácticamente inevitable.

Como estrategia general para demorar laaparición de resistencia podría recomendar-se el empleo de los herbicidas en las situacio-nes en las que sea estrictamente necesario,la combinación en lo posible del control quí-mico con métodos mecánicos y/o biológicosde control de malezas, la rotación y mezclade herbicidas con diferentes sitios de accióny la rotación de cultivos de verano e invier-no, que permitirán ampliar el espectro demalezas controladas y las medidas de con-trol utilizadas.

5 La biotecnología y su inserción en elmanejo de malezas

Las malezas han ido adaptándose a loscambios impuestos por el hombre desde losinicios de la agricultura, constituyéndose enun claro ejemplo de la teoría Darwiniana dela selección natural. La reciente introduccióndel sistema de siembra directa en la pampahúmeda de la Argentina es un buen ejemplode cómo modificaciones introducidas en elambiente se traducen en cambios en la co-munidad de malezas.

La siembra directa es un tipo de labran-za conservacionista que acumula residuos decosecha en superficie e implica una menorremoción del suelo que el sistema de labran-za convencional. Como consecuencia, enpocos años se han producido cambios impor-tantes en predios cultivados con soja, comopor ejemplo un aumento en las poblacionesde malezas gramíneas anuales en detrimen-to de las latifoliadas y una notable disminu-ción de la riqueza florística natural.

La evolución de las malezas dentro delos hábitat creados por el hombre fue logra-da por diferentes vías: a partir de formas sil-vestres colonizadoras que se adaptaron aldisturbio continuo del ambiente debido a lasactividades del hombre; como consecuenciade la hibridación natural entre formas silves-tres y cultivadas; y, aunque menos frecuen-te, a partir de cultivos que se convirtieron enmalezas. De esta forma, actualmente muchasespecies de malezas presentan morfologíamuy similar a la de los cultivos, mimetizándosecon ellos de tal manera que en muchas oca-siones plantas cultivadas y malezas presen-


génicos. Un ejemplo lo constituye la obten-ción de resistencia al glifosato por la transfe-rencia de un gen, que codifica para un pro-ducto que inhibe la actividad de la enzimaEPSP sintetasa (Tabla 1), desde una especiede Agrobacterium al genoma de la soja.

Este proceso de transferencia génica diocomo resultado la obtención de la denomi-nada soja RR (soja Roundup Ready®) resis-tente a la acción herbicida del glifosato (Fig.1). Posteriormente, dicho gen también fueintroducido en el maíz, generando el híbridode maíz RR (maíz Roundup Ready®), tam-bién resistente a glifosato. En este cultivo seha obtenido también la variedad LibertyLink®, resistente a glufosinato de amonio,herbicida no selectivo conocido comercial-mente como Liberty®. En este último ejem-plo, el gen incorporado codifica una enzima(fosfinotricin-N-acetil transferasa) que es laresponsable de convertir al glufosinato en unmetabolito inocuo para maíz.

El desarrollo de CRH ha generado un im-pacto económico y biológico de magnitudsobre la producción agrícola, pudiéndose

tan los mismos requerimientos fisiológicos ynutricionales. Un ejemplo lo constituye lacolza cultivada (Brassica napus), que crecejunto a malezas del mismo género, como porejemplo Brassica campestris. Esto implica unriesgo potencial por la posible hibridaciónentre ambas. Sin embargo, muchas malezasconsideradas como altamente nocivas noson necesariamente las más exitosas desdeel punto de vista evolutivo. Su carácter noci-vo está asociado a una dificultad para sumanejo o control y a una fuerte tendencia adeprimir el crecimiento y la producción de loscultivos.

El flujo génico, en sus variadas formas,ha sido clave en la evolución de las malezas.El accionar del hombre ha acelerado este pro-ceso de transferencia genética, principalmen-te como consecuencia de la aproximación deespecies distantes geográficamente y de lasmodificaciones producidas en el hábitat, quedeterminaron la creación de nuevos nichospara la sobrevivencia, persistencia y disemi-nación de nuevos genotipos, productos dehibridación.

El desarrollo de cultivos resistentes aherbicidas (CRH) es otra de las vías que con-tribuyó en el avance del control químico delas malezas, debido a que ha generado unanueva estrategia de manejo. Un CRH es unavariedad o biotipo de un cultivo que es resis-tente a la acción de un herbicida que nor-malmente resulta letal para las variedadestradicionales del mismo cultivo.

La obtención de CRH ha sido lograda através de procesos de selección o a travésde la inserción de genes en el genoma delvegetal que le confieren la propiedad de al-terar o bloquear el sitio de acción donde ac-túa el herbicida. Cultivos resistentes obteni-dos por las dos vías mencionadas se empleancomercialmente en la Argentina.

Un ejemplo del primer proceso es la ob-tención de CRH de la familia de lasimidazolinonas como el girasol Clearfield®,resistente al herbicida imazapir (Clearsol®).La selección de esta variedad se produjo enKansas, Estados Unidos, donde los girasolescon tolerancia al herbicida fueron descubier-tos bajo condiciones naturales del cultivo.

El segundo proceso implica la obtenciónde organismos genéticamente modifica-dos, en este caso particular, cultivos trans-

Figura 1: Soja «RR»(surcos a derecha e izquierda) yconvencional (surco central) en ensayos de eficacia deaplicación de herbicida a base de glifosato.


destacar los siguientes beneficios:- Amplían el espectro de malezas contro-

ladas, ya que se utilizan herbicidas no selecti-vos, como glifosato y glufosinato de amonio,que permiten el control de un extenso es-pectro de malezas, tanto anuales como pe-rennes.

- Reducen los daños al cultivo, dada sualta tolerancia a estos herbicidas y al no usode otros herbicidas normalmente utilizadosen cultivos no resistentes, que pueden oca-sionar fitotoxicidad.

- Un menor costo, debido al bajo preciode los herbicidas empleados y a la reducciónen el número de labores culturales y mecáni-cas, previas o durante el ciclo de crecimientodel cultivo.

- Los herbicidas utilizados tienen bajaresidualidad en suelos y aguas, por lo quepresentan escasas restricciones para la rota-ción de cultivos, y además baja toxicidad parael hombre y animales.

- Las malezas controladas tienen bajo ries-go de adquirir resistencia, ya que tanto elglifosato como el glufosinato de amonio evi-tan el empleo de otros herbicidas de alto ries-go, como por ejemplo los inhibidores de ALS(Tabla 1).

- Simplifican y flexibilizan el manejo delcultivo. La tecnología asociada a los CRH norequiere de un entrenamiento especial porparte del productor y asimismo facilitan al-gunas de las prácticas relacionadas con el cul-tivo. Un ejemplo de ello es la prolongacióndel período crítico para la aplicación del her-bicida en comparación al de los herbicidasselectivos frecuentemente empleados en cul-tivos no resistentes, en el que dicho períodosuele ser muy limitado.

Una prueba de las ventajas de esta técni-ca la constituye el hecho de que el 92% de latotalidad de soja cultivada en la Argentinacorresponde a soja RR. El uso de este cultivoresistente permite realizar tres o cuatro apli-caciones por año del herbicida, lo cual elimi-na casi por completo la competencia de lasmalezas.

No obstante, existen riesgos o amenazaspotenciales que es importante considerar enel momento de decidir acerca del uso de losCRH, ellos son:

- La aparición de especies de malezas re-sistentes como consecuencia del uso conti-

nuo y repetido de un mismo herbicida, asícomo cambios en las poblaciones de male-zas por el incremento de especies natural-mente tolerantes al herbicida. Si bien tantoel glifosato como el glufosinato de amoniotienen bajo riesgo de seleccionar biotipos demalezas resistentes (Tabla 1), existen casosprobados en el mundo de la aparición deresistencia. Asimismo, las especies natural-mente tolerantes encuentran nuevos nichospara su crecimiento y desarrollo y por lo tan-to incrementan su frecuencia y abundancia.Un ejemplo de esto último lo constituye lamaleza «iresine» (Iresine difusa) informadapor el INTA Oliveros como tolerante aglifosato y que surge como un nuevo proble-ma en esta zona.

- El uso de CRH y de los herbicidas asocia-dos a ellos implica un impacto significativosobre la composición florística de las male-zas, ya que disminuyen la diversidad genéticade la comunidad (erosión genética).

- La aparición de las denominadas«supermalezas» por la transferencia de losgenes de resistencia desde los CRH a sus es-pecies salvajes emparentadas a través delpolen. El fenómeno de hibridación, por poli-nización cruzada, no es raro en la naturalezay la probabilidad resulta mayor para las es-pecies emparentadas. Ejemplos de cultivosconsiderados con riesgo de hibridarse conmalezas cercanas son: el sorgo cultivado(Sorghum saccharatum) con la maleza «sor-go de alepo» (Sorghum halepense) y el gira-sol (Helianthus annus) con el «girasol silves-tre» (Helianthus petiolaris). Aquí es impor-tante destacar que la transferencia horizon-tal de genes entre organismos taxonómi-camente muy distantes es poco frecuente enla naturaleza pero muy relevante en térmi-nos evolutivos. La producción de plantastransgénicas acelera en ciertos aspectos laevolución de las malezas, ya que la hibrida-ción representa un riesgo potencial de trans-ferencia de la resistencia a herbicidas desdeel cultivo hacia la maleza.

La aparición de CRH ‘voluntarios’ en unpredio donde no fueron sembrados y que,por lo tanto, se comportan como una male-za. El problema grave radica en su resistenciaal herbicida empleado para el control.

- Reducción en el rendimiento (5 - 10 %)de algunas variedades o híbridos de CRH


6 Manejo Integrado de Malezas: únicasolución sustentable

Debido a que las malezas continuaránadaptándose a las diferentes metodologíasde control, los agricultores siempre necesita-rán de nuevas tácticas y estrategias. Labiotecnología ha realizado un valioso aporteal suministrar nuevas herramientas para elcontrol de malezas, siendo los CRH la másimportante. Sin embargo, sería un grave errorsuponer que esta técnica permitirá anular elproblema de las malezas en el futuro, ya quedebemos enfatizar que todas estas técnicasson sólo herramientas de las que puede va-lerse el hombre en su afán y esfuerzo paracontrolar las malezas y que no existe unaúnica y fácil solución.

Un programa de Manejo Integrado deMalezas es un sistema de manejo que enfo-ca el problema de las malezas de una mane-ra compatible con la preservación de la cali-dad del ambiente, utilizando todas las tácti-cas y estrategias de control (técnicas adecua-das y conocimientos existentes) con el obje-to de reducir una población de plantas inde-seables a niveles tales que los perjuicios eco-nómicos producidos se hallen por debajo deun umbral económico aceptable para el sis-tema general de producción.

Este programa puede involucrar, en mu-chos casos, métodos de control físicos, quí-micos, mecánicos, genéticos y biológicos jun-tamente con medidas preventivas y estudiosbásicos sobre la biología y ecología de male-zas. Es un sistema interdisciplinario, ya queno consiste simplemente en la aplicación deuna o dos medidas de control sino que abar-ca estrategias de control provenientes devarias disciplinas así como también involucrael entrenamiento de técnicos y la extensióna los productores.

Tanto la teoría ecológica como la expe-riencia práctica acumulada durante más de50 años de intentar disminuir los daños oca-sionados por las plagas indican que una úni-ca herramienta de control (por ejemplo losCRH) es una solución sólo temporal para elproblema de las malezas. Un manejo inte-grado de malezas, en el que múltiples estra-tegias son implementadas de una maneraracional, es la única solución en el marco deun manejo sustentable del sistema producti-vo.

como consecuencia fundamentalmente de laadición de genes extraños. Esto ha sido in-formado en algunos casos puntuales.

- La contaminación de cultivos por flujogénico, especialmente los orgánicos, que seencuentran en predios aledaños mediantela polinización cruzada desde los cultivostransgénicos a los no transgénicos.

- Riesgos ambientales por la persistenciade algunos de los herbicidas utilizados, comopor ejemplo los pertenecientes a la familiade las imidazolinonas, que pueden acumu-larse en el ambiente y afectar la productivi-dad y sustentabilidad del sistema agrícola.

- Riesgo de reducción en la exportaciónde productos de origen transgénico comoconsecuencia del sentimiento anti-biotecnología que existe en los consumido-res de varios países de Europa. Hasta el mo-mento, Argentina no ha tenido ninguna di-ficultad de acceso a los mercados de destinopara sus exportaciones de soja transgénica ya pesar de las percepciones negativas de al-gunos consumidores, los diferenciales de pre-cios entre la soja convencional y transgénicaen el mercado mundial no penalizan a estaúltima, por lo que no es sorprendente queprácticamente toda la soja cultivada en el paíssea transgénica.

Si consideramos los principales cultivostransgénicos en el mundo encontramos queen la actualidad la soja transgénica resisten-te a herbicidas es el mayoritario en 7 países(Estados Unidos, Argentina, Canadá, Méxi-co, Rumania, Uruguay y Sudáfrica), ocupan-do una superficie de 41,4 millones de has enel mundo, lo que representa el 61 % del áreatotal ocupada por cultivos transgénicos quecomprende 67,7 millones de has. Le sigue elmaíz Bt con 12,3 millones de has (13 % delárea total). El tercer cultivo de mayor impor-tancia es la canola tolerante a herbicidas, con3,6 millones de has (5 % del área total) y sesiembra en dos países, Canadá y EstadosUnidos. Otros tres cultivos ocupan, cada uno,un 5 % de la superficie total y son maíz tole-rante a herbicidas e insectos (3,2 millones dehas), maíz tolerante a herbicidas (3,2 millo-nes de has) y algodón Bt (3,1 millones de has).El algodón, tolerante a herbicidas e insectos,ocupa 2,6 millones de has (4%) y el algodóntolerante a herbicidas 1,5 millón (2%).


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VIII.-Capítulo 12

Tolerancia a factores abióticos

Puebla, Andrea F.; Del Viso, Florencia

1 Introducción

La radiación, la temperatura, el agua y losnutrientes son factores del medio ambienteque afectan el crecimiento y el desarrollo delas especies vegetales. La distribución de lasplantas sobre la tierra depende, por lo tan-to, de la existencia e intensidad de estos fac-tores. Para alimentar a una población futurade 8 billones de habitantes con las prácticasagrícolas actuales se requeriría de un incre-mento del 12 % en la cantidad de tierras cul-tivables (Fig. 1), lo cual será imposible dadala densidad demográfica esperada.

Por otro lado la agricultura es la principalconsumidora de agua en el mundo, uno delos recursos más limitantes para el futuro. Lasreservas de agua del planeta han ido dismi-nuyendo a medida que los consumos han idoaumentado con el crecimiento de la humani-dad y las prácticas agrícolas (Fig. 2). Un infor-me reciente de IIPRI (2002) «Global Water

Outlook to 2005: an impending crisis» predi-ce que si la crisis del agua continúa, cabríaesperar para el 2025 una reducción de 350millones de toneladas métricas en la produc-ción de granos, lo cual representa un pocomás de la producción actual de Estados Uni-dos. Como resultado, el precio del arrozincrementaría en un 40%, el del trigo en un80% y el del maíz en un 120 % si se considerala demanda actual. Dado que la agriculturaconsume el 70 % de toda el agua utilizadapor el hombre, resulta obvio que la mejorforma de ahorrar agua es a través de laimplementación de prácticas agrícolas quetiendan a reducir el consumo. Una forma esla reducción del riego mediante la creaciónde plantas resistentes a sequía, otra es la dis-minución en el uso de insecticidas mediantela utilización de estrategias de control bioló-gico contra insectos (ver VIII.10) y plantastolerantes a herbicidas (ver VIII.11). Estas dosúltimas estrategias también reducen el ries-

go de contaminación de las fuentesde agua potable disponibles

Levitt (1980) define a los estresesambientales como cambios en lascondiciones del medio que reduceno cambian desfavorablemente el cre-cimiento o desarrollo de las plantas.

Los estreses ambientales provo-can en las plantas respuestas comple-jas y constituyen un problema funda-mental para la agricultura, ya que in-fluyen sobre la supervivencia y la pro-ductividad de los cultivos. Estas res-puestas se manifiestan a nivel celu-lar, fisiológico y del desarrollo (Levitt,1980) y son caracteres de variacióncontinua («cuantitativos»), controla-dos por un importante número degenes aditivos y probablementesinérgicos (Bohnert y col., 1995). Seha visto, por ejemplo, en estudioscitogenéticos, que al menos diez delos veintiún pares cromosómicos enel trigo están comprometidos en la

respuesta a las bajas temperaturas (Sutka yVesz, 1988).

Los genes inducidos bajo condiciones deestreses abióticos, tales como las bajas tem-peraturas, la salinidad y la sequía, codificanproteínas que tienen funciones de señaliza-ción, transducción de señales y proteccióncelular, como por ejemplo, proteínas consti-tuyentes de canales de agua que alteran el

Fig. 1: La cantidad de tierra destinada a la agricultura, calculada enacres/persona ha ido disminuyendo paulativamente. Se estima quepara alimentar a una población futura de 8 billones de habitantes,con las tecnologías actualmente en uso, se requeriría de unincremento de un 12 % en la cantidad de tierra cultivables. GentilezaProf. Germán Spangenberg.

356 PUEBLA, Andrea F.; DEL VISO, Florencia

potencial agua celular, enzimas requeridaspara la síntesis de sustancias protectoras(azúcares, prolina y betaína), desaturasaslipídicas para modificar la composición de lasmembranas celulares, proteínas protectorascomo las de tipo LEA («Late EmbryogenesisAbundant» o proteínas abundantes en laembriogénesis tardía), proteínas anticonge-lantes, chaperonas, proteasas y enzimasdetoxificantes como la catalasa y la ascorbatoperoxidasa.

2 Señales para la respuesta a estresesabióticos

La hipótesis de señalización actual postu-la que las señales ambientales son percibidasprimero por receptores específicos, que consu activación inician o suprimen una cascadade transducción de señales intracelularesy, en muchos casos, activan factores de trans-cripción nucleares, que inducen la expresiónde grupos específicos de genes.

Una forma común de señal de iniciaciónes la fosforilación de proteínas acoplada areceptores. Aunque todavía no se han de-terminado con certeza en plantas ningunode los receptores de respuesta al frío, sequíao de ABA (ácido abscísico, la hormona rela-cionada al estrés), el conocimiento recientede una vía de señalización de estrés salino

indica que los receptores con ca-racterísticas de proteín-kinasas ylas histidin-kinasas de dos compo-nentes serían buenos candidatospara cumplir la función desensores potenciales de estas se-ñales de estrés (Xiong y Zhu,2001).

Receptores tipo proteín-kinasas (RTK): se encuentran tan-to en animales como en plantasy están estructuralmente com-puestos por un dominioextracelular, que funciona porunión a un ligando o porinteracción proteína-proteína, porun dominio transmembrana ypor un dominio kinasa intrace-lular. Las RTK de plantas son tam-bién responsables de respuestasa patógenos estando ademásinvolucradas en el desarrollo. Es-

tas kinasas deberían ser constitutivas, consi-derando las rápidas respuestas celulares(como las respuestas a inositol-P y Ca 2+) cuan-do las plantas son expuestas a un estrés(Hong y col., 1997).

Sistema de dos componentes tipohistidin-kinasas: en estos sistemas cuando elsensor extracelular percibe la señal, unahistidina del dominio citoplasmático seautofosforila y el residuo fosfato es pasadoa un aspartato aceptor, en una respuestaregulatoria que se acopla a una cascada de-pendiente de MAP kinasas (Mitogenactivated), o por fosforilación directa de blan-cos específicos que inician la respuesta celu-lar. Se ha demostrado que, en cianobacterias,la fluidez de la membrana podría actuar comoel primer sensor para las bajas temperaturasy es el disparador de histidin-kinasas que mo-dulan la expresión de genes de desaturasas(Murata y Los, 1997; Suzuki y col., 2000).

2.1 Segundos mensajeros

Numerosos estudios sugieren que el Ca2+

forma parte de varios procesos de señaliza-ción intracelular (revisión de Sanders y col.,1999; Örvar y col., 200; Sangwan y col., 2001).La concentración intracelular de Ca2+ se en-cuentra firmemente controlada: el Ca2+

citosólico se encuentra en bajas concentra-

Fig. 2: Las reservas de agua del planeta son limitadas, siendo laagricultura la principal consumidora de agua en el mundo. Los consumoshan ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prácticasagrícolas. Gentileza Prof. Germán Spangengenberg.


ciones, aunque luego de la estimulación selibera de las reservas intracelulares o entraen la célula a través de varios canales. El Ca2+

extracelular puede entrar en la célula porcambios de voltaje, operado por receptores,o a través de canales específicos. El Ca2+

intracelular puede liberarse a través de cana-les sensibles a mensajeros ligandos o a se-gundos mensajeros, entre los que se inclu-yen a los inositol polifosfatos y la ADP-ribosacíclica (cADPR) (Fig. 3).

3 Inducción de genes en respuesta alestrés

Los genes inducidos por estrés incluyen

genes de respuesta temprana y genes derespuesta tardía. Los primeros son inducidosen pocos minutos y a menudo transitoria-mente. Su inducción no requiere de síntesisde nuevas proteínas, ya que estos compo-nentes de señalización serían constitutivos.En contraste, los genes de respuestas tardíasson activados más lentamente (en horas) ysu expresión es generalmente sostenida du-rante el tiempo en que el estrés se encuen-tra actuando. Los genes tempranos codificanfactores de transcripción que activan a losgenes de respuesta tardía, que constituyenla vasta mayoría de los genes inducidos porestrés (Figura 3).

Figura 3: Vías principales de señalización en plantas en respuesta a estreses abióticos (Frío, Sequía y Salinidad).La vía I de señalización involucra la producción de antioxidantes y osmolitos involucrando la transducción deseñales a través de MAP kinasas. La vía II involucra la producción de diferentes tipos de proteínas (tipo LEA y otras)y está mediada por CDPK. La vía III involucra a la vía SOS, específica del estrés iónico. No se detallan las moléculas deseñalización o segundos mensajeros.


4 Genómica de la tolerancia a estresesambientales

Los recientes avances en el estudiomolecular y genético de las respuestas aestreses abióticos llevaron a la identificaciónde un gran número de loci cualitativos úni-cos, QTL, y genes relacionados con la tole-rancia a estreses abióticos. Estos nuevos co-nocimientos posibilitarán modificar la formade seleccionar en el mejoramiento de culti-vos importantes, desde una selecciónfenotípica a una genotípica (a través de se-lección asistida por marcadores), aumentan-do así las posibilidades de mejoras genéticasen los cultivos.

Como se mencionó anteriormente, latolerancia a estreses ambientales no depen-de de un único gen sino que es un carácterpoligénico, de variación continua. Reciente-mente se construyeron mapas que contienenlos determinantes que afectan la toleranciaa estreses abióticos en las Triticeae (Cattivelliy col., 2002). Se demostró que el grupo decromosomas 5 en trigo contiene la concen-tración más alta de loci que controlan laadaptación de la planta al ambiente, parti-cularmente los relacionados con la toleran-cia a las heladas y a la salinidad, mientras queuna región del cromosoma 7 es crucial en latolerancia a la sequía (Cattivelli y col., 2002).Se identificó un locus en el cromosoma 5Ade trigo, Vrn-Fr1, que tiene un importanteefecto en la tolerancia a las heladas (Galiba ycol., 1995). Las variedades de invierno poseenel alelo vrn1, y son más tolerantes a las bajastemperaturas que las variedades de prima-vera que poseen el alelo Vrn1. También sedemostró que las diferencias en la toleranciaa las bajas temperaturas encontradas entredistintas variedades de invierno pueden serexplicadas, en algunos casos, por las diferen-cias en este locus (Storlie y col., 1998). Ac-tualmente se conocen dos genes, VRN1 yVRN2 presentes en este intervalo, los cualesestán directamente involucrados en la res-puesta a la vernalización en el trigo diploide(Triticum monoccocum) (Law y col., 1975;Dubcovsky y col., 1998: Tranquilli y col., 2000).

En sorgo se construyeron varios mapasde ligamiento utilizando RFLP y otros marca-dores moleculares (Xu y col., 1994; Taraminoy col., 1997; Kong y col., 2000) y se identifica-

ron también varios QTLs con efectos signifi-cativos en la tolerancia a la sequía (Tunistra ycol., 1997).

Las nuevas tecnologías para el análisisgenómico (microarreglos de ADN, genéticadirecta y reversa) produjeron una revoluciónen el análisis genético de las especies y per-mitieron cambiar el enfoque en el análisis,yendo desde estudios de un solo gen a estu-dios que abarcan todo el genoma. Utilizan-do tanto macro como microarreglos de ADN(Lin y col., 2003; Seki y col., 2001, 2002a,2002b; Kawasaki y col., 2001; Oono y col.,2003) se estudiaron genes inducidos o supri-midos en condiciones de estrés abiótico (frío,sequía, salinidad). La mayor parte de estosestudios se realizaron en Arabidopsis debi-do al hecho, entre otros factores, de que sugenoma ha sido completamente secuen-ciado, facilitando así la construcción de losmicroarreglos y el análisis de las secuenciasobtenidas.

Los resultados de estos trabajos indica-rían la existencia de una mayor intersecciónentre las vías de señalización de ABA, sequíay salinidad, comparada con las vías en comúnentre ABA y frío (Seki y col., 2002b). A partirde estos estudios también se identificaronnumerosos genes que son inducidos por unosolo de los tratamientos, los cuales se clasifi-caron como específicos de cada respuesta.

Los resultados obtenidos hasta el mo-mento permiten sugerir que la tecnología demicroarreglos será de mucha utilidad para elaislamiento de nuevos genes, para el estu-dio de perfiles generales de expresión teji-do-específico ante distintas condiciones deestrés abiótico y también para la identifica-ción de genes y potenciales elementos en cisde factores de transcripción.

4.1 Tolerancia a las bajas temperaturas

Las especies vegetales adaptadas a regio-nes templadas del planeta varían durantetranscurso del año en su habilidad para so-brevivir a las bajas temperaturas. Las plantascapaces de aclimatarse al frío perciben lasbajas temperaturas sobre cero durante elavance del invierno y disparan procesosbioquímicos específicos que resultan en latolerancia, aún, de temperaturas decongelamiento (Thomashow, 1999).


La aclimatación al frío está asociada ala expresión de novo de genes, síntesis deproteínas y varios cambios fisiológicos(Guy, 1990). Los mecanismos que contribu-yen a la tolerancia incluyen la prevención dela desnaturalización de proteínas inducidapor bajas temperaturas, la prevención de laprecipitación de moléculas y la atenuación delas consecuencias de la formación de hielointercelular.

Muchos estudios indican que en las plan-tas los sistemas de membranas de la célulason los primeros sitios dañados por elcongelamiento (Levitt, 1980; Steponkus,1984). Entre estos daños se incluyen la lisiscelular inducida por expansión, las transicio-nes de los lípidos de membrana (de laminaresa fase hexagonal II) y las lesiones por fractu-ras.

Los mecanismos involucrados en la esta-bilización de las membranas celulares en res-puesta al frío son múltiples. Los más impor-tantes serían los cambios en la composiciónde lípidos, aunque también se ha observadola acumulación de solutos compatibles (mo-léculas que pueden acumularse en la célulasin modificar el metabolismo central) en cé-lulas de plantas sometidas tanto a estrés porfrío como por sequía. La acumulación de sa-carosa y otros azúcares, que típicamente ocu-rre en plantas tolerantes durante la aclima-tación, parece contribuir a la estabilización delas membranas. Estas moléculas demostra-ron proteger in vitro a las membranas du-rante el congelamiento (Strauss y Hauser,1986; Anchordoguy y col., 1987).

En muchas especies de gramíneas de cli-ma templado se ha observado la acumula-ción de fructanos, polímeros de fructosa,cuando las plantas son expuestas a bajastemperaturas sobre cero. El incremento enel contenido de estos polímeros parece es-tar relacionado al proceso de aclimatación alas bajas temperaturas (Pontis, 1989;Tognetti y col., 1989; Santoiani y col., 1993;Puebla y col., 1997,1999a).

El metabolismo de los fructanos engramíneas ha sido estudiado en su mayorparte en cereales de importancia agronómicay se lo ha señalado como uno de los meca-nismos de tolerancia a bajas temperaturas.En la Argentina existen especies nativas queestán adaptadas a ambientes de climas rigu-

rosos y son tolerantes a condiciones severasde estrés abióticos. Bromus pictus, por ejem-plo, es una especie distribuida en las estepasáridas de la meseta patagónica, donde lasbajas temperaturas imperan en la mayoríade los días del año (la temperatura media enjulio es de 1,9ºC) y las precipitaciones prome-dio sólo llegan a los 168 mm anuales. Estaespecie contiene elevados niveles defructanos en sus tejidos y una creciente acti-vidad de fructosil-transferasas, enzimas res-ponsables de la síntesis de estos azúcares,cuando las plantas son tratadas con bajastemperaturas. Los genes que codifican estasenzimas fueron aislados recientemente y, através de la transformación de tejidosheterólogos con los mismos, fue posible es-tudiar la función de estos azúcares en la tole-rancia a frío (Puebla y col., 1999b).

4.1.1 Identificación y caracterización degenes de tolerancia a frío

Numerosos genes inducibles por bajastemperaturas y sus promotores han sido ais-lados y caracterizados en varias especies ve-getales, incluyendo alfalfa, Arabidopsis, ce-bada y trigo. Una gran parte de estos genescodifican proteínas de función conocida, quecontribuyen a la tolerancia a las bajas tem-peraturas. Por ejemplo, el gen de ArabidopsisFAD8 codifica una desaturasa de ácidos grasosque alteraría la composición lipídica de lasmembranas. También se conocen genes dechaperonas en espinaca y Brassica napus queresponden a las bajas temperaturas y genesregulados por frío que intervienen en latransducción de señales (Fig. 3).

Sin embargo, muchos genes inducidosdurante la aclimatación a bajas temperatu-ras codifican proteínas de función descono-cida. Muchas de éstas presentan homologíacon las proteínas LEA, ya mencionadas. Lospolipéptidos LEA son sintetizados en la se-milla durante la embriogénesis tardía antesde la desecación y también en plántulas, enrespuesta a la deshidratación. Estas proteí-nas son altamente hidrofílicas, tienen unacomposición simple de aminoácidos y enmuchas se predicen regiones capaces de for-mar α-hélices anfipáticas.

Otras proteínas, de función desconocida,que no se encuentran agrupadas con las LEA,


son las codificadas por genes COR («coldresistant» o resistente a frío), también de-signados LT1, KIN, RD y ERD, de Arabidopsis.Estas proteínas también presentan regionescon capacidad para formar α-hélicesanfipáticas que podrían tener roles en la es-tabilización de las membranas durante lasbajas temperaturas.

Algunos de estos genes, bajo promoto-res constitutivos (35S CaMV), han sido utili-zados para transformar plantas susceptiblesa frío y se han realizado estudios de adquisi-ción de tolerancia a estrés con las plantastransgénicas obtenidas. Los resultados su-gieren que la tolerancia a bajas tempera-turas depende de varios genes de toleran-cia y no de un gen particular.

4.2 Regulación de la respuesta a laaclimatación: el regulón CBF

Los estudios iniciales de la expresión degenes regulados por frío establecieron quealgunos promotores de estos genes eran ac-tivados en respuesta a bajas temperaturas ysequía. Los análisis posteriores determinaronque en Arabidopsis existen elementosregulatorios en los promotores de estosgenes: las repeticiones C (CRT) en el elemen-to DRE (elemento que responde a sequía)que estimulan la expresión de genes en res-puesta a las bajas temperaturas, a la sequíay a la salinidad. Se identificaron poco despuésactivadores transcripcionales que se unen aestos elementos CRT/DRE. Las proteínas quecodifican contienen un dominio de unión alADN tipo AP2/EREBP y están codificadas porgenes que se encuentran en tandem sobreel cromosoma 4 de esta especie. La expre-sión constitutiva de estos activadorestranscripcionales bajo el promotor 35S delCaMV en plantas transgénicas deArabidopsis induce la expresión de múltiplesgenes regulados por bajas temperaturas queposeen los elementos CRT/DRE, sin mediarningún estímulo de frío.

5 Tolerancia al estrés hídrico

La disponibilidad de agua es el factor abióticomás importante que modela la evolución delas plantas. El estrés hídrico, en su sentidomás amplio, incluye tanto a la sequía como a

la salinidad. Estos estreses, junto al frío,constituyen problemas cruciales para laagricultura, ya que impiden a los cultivosdesarrollar su máximo potencial genético.

El estrés hídrico generalmente inhibe elcrecimiento celular y las evidencias indirectassugieren que existen señales de división celu-lar y expansión relacionadas con las kinasasdependientes de ciclinas (CDPK) (Zhu, 2002).

Las plantas sufren deshidratación o estréshídrico, no sólo durante la sequía o las altasconcentraciones de sales sino también duran-te condiciones de bajas temperaturas. Duran-te la exposición de las plantas a temperatu-ras de congelamiento la formación de hieloextracelular impone una fuerza deshidra-tadora a la solución no congelada intracelular.La formación de hielo lleva a una rápida con-centración de los solutos extracelulares y elcambio de potencial químico y osmótico pro-voca que el agua líquida se mueva hacia fue-ra de la célula.

Tanto la sequía como la salinidad afectanvirtualmente cada aspecto de la fisiología deuna planta y su metabolismo. Considerandola complejidad de las respuestas encontra-das bajo estos estreses, no es sorprendenteque una gran proporción del genoma estésujeto a regulación, como lo demuestran al-gunos trabajos de microarreglos de ADN. Porejemplo, en la levadura unicelularSaccharomyces cerevisiae, la tolerancia aestrés salino afecta aproximadamente al 8%de los genes de todo el genoma (Posas y col.,2000; Rep y col., 2000).

Las respuestas adaptativas al estrés pue-den clasificarse de la siguiente manera:

a) El control de la homeostasis, que inclu-ye homeostasis iónica y la osmótica.

b)El control del daño y la reparación odetoxificación.

c) El control del crecimiento.

La señal de homeostasis regula negativa-mente la respuesta de detoxificación y estasdos inducen la tolerancia al estrés, que regu-la negativamente la inhibición del crecimien-to provocada por la aparición de las condi-ciones ambientales adversas.

La respuesta de las plantas a la altasalinidad se dispara cuando se produce unaumento intracelular de Na+. La señal de


estrés hídrico incluiría posiblemente un cam-bio de turgencia que provoca el cierre de losestomas, la expresión y/o activación deenzimas de síntesis de osmolitos y la de sis-temas transportadores de éstos y de agua.

Los genes involucrados en la homeostasishídrica incluyen los genes de acuaporinas, losgenes de enzimas de biosíntesis de osmolitos,de cotransportadores de sentido contrario(«antiporters») de Na+/H+ asociados a mem-brana plasmática para la extrusión de Na+,de antiporters de Na+/H+ para la comparti-mentalización de Na+ en la vacuola y de trans-portadores de K+ con alta afinidad para laadquisición de K+.

La señal de detoxificación se dispararíaante la desnaturalización proteica y la pre-sencia de especies reactivas de oxígeno. Larespuesta incluye la hidrólisis de fosfolípidos,cambios en la expresión de proteínas tipoLEA/dehidrinas, de chaperonas molecularesy proteasas que remueven las proteínas des-naturalizadas, así como la activación deenzimas responsables de la remoción de es-pecies reactivas de oxígeno, de proteínas re-lacionadas con la ubiquitinación y de otrasproteínas detoxificantes.

6 La vía SOS (Salt Overly Sensitive osensible al exceso de salinidad) detolerancia a la salinidad

El estrés salino quiebra la homeostasisiónica de las plantas provocando un excesotóxico de Na+ en el citoplasma y una deficien-cia de iones esenciales como el K+.

El clonado y la caracterización bioquímicade varios genes y productos de genes SOS(Salt Overly Sensitive) ha permitido estable-cer recientemente una vía de señalizaciónpara la regulación de la homeostasis iónica yla tolerancia a la salinidad en Arabidopsis.Esta vía se dispara por un aumento intra oextracelular de Na+ y provoca una señalcitoplasmática de calcio que induce la expre-sión y cambios de actividad de transporta-dores de iones como el Na+, K+ y H+. La víacontiene tres genes principales llamadosSOS1, 2 y 3 (Zhu, 2000) (Fig. 3).

El estrés salino provoca una señalcitosólica de Ca 2+. Una proteína que se unea Ca 2+, codificada por SOS3 percibepresumiblemente esta señal y desencadena

la respuesta. SOS3 interactúa y activa a SOS2,una serin-treonin kinasa y estas dos a su vezregulan la expresión y la actividad de SOS1,un efector de la tolerancia a la salinidad, quecodifica un cotransportador de sentido con-trario («antiporter») Na+/H+ de la membra-na plasmática. SOS3 es una proteínamiristoilada, lo que facilita que ésta y sus pro-teínas asociadas (tipo SOS2) interactúen conla membrana, donde se encuentran ubica-dos sus transportadores blanco. SOS3 tam-bién parece interactuar con proteínas quemedian la inducción de la biosíntesis de ABA.SOS2 representa una nueva familia deproteín-kinasas sólo encontradas en plantasque contienen un dominio catalítico y otroregulatorio que interactúa con SOS3. SOS1 esun cotransportador de sentido contrario(«antiporter») Na+/H+ de la membranaplasmática con una larga cola que estaríainmersa en el lado citoplasmático y que po-dría funcionar como sensor de los solutos quetransporta.

7 El ácido abscísico (ABA) y la tolerancia aestrés

El ABA posee muchas funciones duranteel crecimiento y desarrollo de las plantas, perola principal función es la de regular el ba-lance de agua y la tolerancia a estrésosmótico.

Los patrones de expresión de los genesinducibles por estreses abióticos son comple-jos y muchos de ellos son inducidos tambiénpor la aplicación exógena de ABA. Existen,sin embargo, algunos genes inducibles porestreses abióticos que no responden a estahormona. Esto sugiere que entre la señal ini-cial de sequía, salinidad o estrés por frío y laexpresión de genes específicos existen casca-das de señales de transducción dependien-tes e independientes de ABA.

La acumulación de ABA inducida porestrés osmótico es una combinación de laactivación de su síntesis y de la inhibición ensu degradación. Aunque nada se sabe de laseñalización entre la percepción del estrés yla inducción de los genes de biosíntesis, elconocimiento actual sugiere que estáninvolucradas señales de Ca 2+ y cascadas defosforilación de proteínas (Zhu, 2003).

En girasol fue descripta una familia de fac-tores de transcripción característicos de plan-


tas que contienen un homeodominio«leucine-zipper» (cremallera de leucina) (Chany González, 1994; Chan y col., 1998). Estasproteínas pueden unirse al ADN debido a lapresencia de una secuencia altamente con-servada, conocida como homeodominio, quese encuentra en muchos genes de eucariotasque se expresan durante el desarrollo (Valley col., 1997). La familia de factores de trans-cripción descripta en girasol incluye proteínas

involucradas en el desarrollo temprano de lasplántulas y otras que participan en la respues-ta a sequía. Hahb-4 es un gen de esta familiaque mostró estar fuerte y reversiblementeinducido por estrés hídrico y por ABA. La re-gión promotora de Hahb-4 contiene secuen-cias consenso presentes en elementos derespuesta a ABA (ABRE), sugiriendo que estegen funciona en la cascada de señalizaciónque controla en girasol la respuesta al estréshídrico mediada por ABA (Gago, 2002). Plan-tas de Arabidopsis transformadas con estegen mostraron un aumento importante enla tolerancia a estrés hídrico (Chan, comuni-cación personal).

Estudios de la expresión de genes induci-dos por frío en mutantes de Arabidopsis de-ficientes en ABA (aba) e insensibles a ABA(abi) demostraron que la expresión de genesde frío se encuentra mediada por vías depen-dientes e independientes de ABA (Ingam yBartels, 1996; Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 1997). Los genes que contienenlos elementos CRT/DRE estan relacionadoscon la vía independiente de ABA. Algunosde los genes que responden a bajas tempe-

raturas revelaron la presencia de un elemen-to ABRE. Estos genes se expresan en respues-ta a ABA, demostrando que las víasregulatorias de frío y las dependientes deABA se cruzan en algún punto de la señal detransducción (Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 1997).

8 Plantas transgénicas tolerantes aestreses abióticos

En muchos países se in-vestiga activamente la ad-quisición de tolerancia a fac-tores ambientales adversosen especies agronómi-camente importantes trans-formadas con genes que co-difican para proteínas de to-lerancia a estreses abióticos,muchas de las cuales ya se en-cuentran en etapa de expe-rimentación a campo (Tabla1).

9 Conclusiones finales

Las investigaciones en el campo de la to-lerancia a factores ambientales adversos tu-vieron un desarrollo importante en la últimadécada. Se identificaron genes y proteínascon roles en la tolerancia a frío, sequía ysalinidad, se determinaron muchos de susmecanismos de acción y se avanzó en el co-nocimiento de cómo se desencadenan y ac-tivan las respuestas de las células vegetalesante estos estreses y sus interrelaciones.

Las nuevas tecnologías (micro ymacroarreglos de ADN, transformacióngenética de plantas) prometen brindar nue-vos descubrimientos, fundamentales paraentender cómo las especies vegetales soncapaces de adaptarse a un ambiente siem-pre cambiante.

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Tolerancia a estreses abióticos Especie Países

Bajas temperaturas Papa Bolivia

Tomate China

Trigo India

Salinidad Arroz Bangladesh, Brasil, China,India, Pakistán, Tailandia

Maíz China

Sorgo China

Tabaco Argentina

Trigo Egipto

Sequía Arroz China, Indonesia, Sudáfrica,Tailandia

Caña de azúcar Indonesia

Trigo Croacia

Tabla 1: Plantas transgénicas conteniendo genes de tolerancia a estresesabióticos (frío, sequía, salinidad) en etapa de experimentación o de pruebasexperimentales a campo en países en vías de desarrollo. (fuente:http://www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp)


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VIII.- Capítulo 13

Aproximación biotecnológicaintegrada para un manejo sustentabledel estrés biótico en frutilla

Castagnaro, Atilio Pedro;Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan CarlosDíaz Ricci, Juan Carlos

Introducción

La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa:2n=8x=56) es un poliploide con 56cromosomas resultante de la hibridacióninterespecífica entre dos especies de frutillassilvestres, también octoploides. Una de es-tas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis:2n=8x=56) y la otra del norte de América (F.virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombrecientífico hace referencia a su condición dehíbrido. Se trata de un importante fruto quese consume en fresco o industrializado y quees muy apreciado en prácticamente todo elmundo. Su cultivo involucra dos actividadesagronómicas bien diferenciadas: la produc-ción de frutas y la viverística, las cuales gene-ran una gran demanda de mano de obra(alrededor de 500 jornales /Ha /año), por locual en muchos países es considerado tam-bién como un cultivo social.

Si bien se realiza mejoramiento genéticoen distintos lugares de Asia, Europa y NorteAmérica, el mercado de variedades está do-minado por empresas estadounidenses. EnArgentina, a partir de 1996 comenzó a fun-cionar, en forma organizada, el ProgramaNacional de Mejoramiento Genético de laFrutilla (Pro\Frutilla) a través de una iniciativainterinstitucional (sectores público y privado)e interdisciplinaria (combina el mejoramien-to genético convencional con los métodossurgidos de la biotecnología molecular), queen 1999 representó a nuestro país en la ex-posición «Flanders Technology International-Technoland», en Gante, Bélgica.

El objetivo general del Pro\Frutilla es ob-tener cultivares argentinos adaptados a porlo menos dos agroecosistemas o ambientesde selección (el subtropical de Lules enTucumán y el templado del cinturón hortícoladel Gran La Plata, en Buenos Aires), con re-sistencia incrementada a estrés de origen

biótico que permita evolucionar hacia unaagronomía menos reñida con la salud huma-na y ambiental (principalmente sin bromurode metilo) y para que empresas viveristas lo-cales puedan aprovechar las ventajas com-parativas de exportación de plantines degenética nacional en contraestación con lospaíses del hemisferio norte.

Reconocimientos

En este capítulo se describen en formaresumida los trabajos realizados y los logrosobtenidos con este programa donde, ade-más de los autores, participaron los siguien-tes investigadores (en orden alfabético):Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun,Paula Filippone, Gabriela García, Hugo Lázaro,Cecilia Lemme, Alicia Inés Mamaní, GustavoMartínez Zamora, Luis Mroginski, MartaOntivero, Graciela Terada, Ursula Tonello yGabriel Vellicce.

1 Mejoramiento genético

El Pro\Frutilla se basa en un esquema deselección recurrente (Fig. 1) delimitado portres niveles de domesticación:

1) Poblaciones Comerciales, representa-das en la Figura 1;

2) Poblaciones Intermedias o Tampones,donde se intenta llevar a cabo hibridacionesinterespecíficas;

3) Poblaciones Silvestres, en las cuales serealizan cruzamientos dentro de cada espe-cie y/o nivel de ploidía.

En una primera etapa, se realizaron reco-lecciones y se estableció un Banco deGermoplasma activo, constituido porgenotipos de especies silvestres (Fragariavesca: 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56;Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y10x=56 y 70, respectivamente) y de la culti-vada F. x ananassa. Estudiando caracterescitogenéticos, morfológicos y anatómicospudo identificarse una nueva especie silves-tre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), quees endémica del Noroeste Argentino y seencuentra en peligro de extinción. Esta es-pecie fue clasificada de manera errónea aprincipios del siglo XX como Potentilla

368 CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.

norvegica, especie decaploide típica de lospaíses nórdicos.

Paralelamente a la caracterización botá-

nica, en el marco de las mencionadas Pobla-ciones Intermedias (2) y siguiendo un esque-ma dialélico incompleto, se realizaron 500 cru-zamientos interespecíficos entre accesionessilvestres de Fragaria vesca, Duchesnea in-dica, Potentilla tucumanensis y 9 genotiposde la cultivada F. x ananassa. Este estudiopermitió detectar barreras pre y poscigóticasde aislamiento reproductivo entre estas es-pecies. A fin de conocer la naturaleza de lasbarreras, se investigó el crecimiento del tubopolínico en el pistilo utilizando microscopiade fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estu-dios histológicos de aquenios. Este conoci-miento permitirá diseñar estrategias queposibiliten la transferencia de genes de inte-rés agronómico desde los genotipos silves-tres a los domesticados.

En la actualidad, se dispone de dosgenotipos promisorios en etapas avanzadasde evaluación y selección clonal, llamados 96/

6-5 y 96/6-6, donde el número anterior a labarra, indica el año de cruzamiento (en estecaso 1996), el que le sigue indica la familia ocruza, en este caso cv. Chandler x cv. OsoGrande) y el último número es arbitrario yresponde a un ordenamiento interno delprograma.

2 Cultivo in vitro de meristemas,micropropagación y evaluación de lavariación somaclonal

Debido a que el cultivo de meristemas po-sibilitaría sanear la mayor parte de las virosis,no se ha profundizado demasiado en el es-tudio y caracterización de los virus que afec-tan a la frutilla y desde un punto de vista agro-nómico estas enfermedades no están den-

tro de los principales pro-blemas del cultivo. Estemismo razonamientopodría aplicarse para laenfermedad sistémica(bacteriosis) provocadapor Xanthomonasfragariae.

Se estudiaron las condiciones de cultivoin vitro para sanear y multiplicar diferentesgenotipos de frutilla, entre ellos el cultivarCamarosa, que es la variedad más cultivadaen el mundo. A su vez y mediante caracteri-

Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible:el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.).Compatible: varios granos de polen crecen a través delestilo (centro). Medianamente compatible: Sólo unospocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.).

Figura1. Esquema de selección recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticación)


zación fenotípica y marcadores genotípicosdel tipo RAPD (del inglés Randomly AmplifiedPolymorphic DNA), se investigó la eventualinducción de variación somaclonal en ciclossucesivos de multiplicación de este cultivar.La tasa de multiplicación de las plantas invitro fue evaluada utilizando dos formu-laciones salinas en el medio de cultivo (N

30K

y MS) y diferentes concentraciones decinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/L). La mejor tasade multiplicación se obtuvo en el medio N

30K

suplementado con 0,25 mg/L de cinetina, sinque se detectara variación somaclonal des-pués de tres ciclos sucesivos multiplicación.Este resultado nos permitió proponer porprimera vez el uso de un procedimiento parael saneamiento y la micropropagación comer-cial de la variedad Camarosa.

3 Interacción planta-patógeno

A diferencia de otros productos agroa-limentarios, las hortalizas se consumenmayoritariamente en fresco, lo que implicaque no pueden llevar residuos de pesticidas.Por otro lado, la práctica agronómica deberáevolucionar, indefectiblemente, hacia nuevossistemas productivos que minimicen la utili-zación de agroquímicos sintéticos. El proble-ma principal del cultivo de la frutilla sonlas enfermedades fúngicas. El manejo deestas enfermedades, donde una de las másimportantes es la antracnosis(Colletotrichum sp.), involucra el uso masivode pesticidas contaminantes como elbromuro de metilo, que además de ser tóxi-co destruye la capa de ozono, y cuya elimina-ción ya fue pautada desde Naciones Unidas.

En este contexto el Pro\Frutilla está lle-vando a cabo una investigación básica quepermita desarrollar estrategias de biocontrol.Para ello:

1) En primer lugar, se aislaron los agentesetiológicos locales de las enfermedades másimportantes (especies pertenecientes a losgéneros: Colletotrichum, Botrytis,Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y seoptimizaron metodologías de infección con-trolada que posibilitaron la evaluaciónfenotípica certera de la resistencia/ suscepti-bilidad de los materiales fitotécnicos del Ban-co de Germoplasma del Pro\Frutilla.

2) Se caracterizaron los hongospatógenos del género Colletotrichum rela-cionados con la enfermedad de laantracnosis. Esto permitió detectar una res-puesta sistémica de protección cruzada des-encadenada por un patógeno avirulento,que además puede ser inducida por el mi-croorganismo (patógeno) inactivado y/o porextractos del mismo, lo que puede tener tan-to implicancias conceptuales como biotecno-lógicas (Fig. 3). Los estudios histopatológicos

Figura 3. La previa inoculación con un patógenoavirulento desencadena una respuesta defensivade protección cruzada contra el patógeno virulento(izda.). Planta control infectada con un patógenovirulento (dcha.).

Tabla1:

en plantas que manifiestan la respuesta dedefensa revelaron la presencia de cristales nocaracterísticos de la especie F. x ananassa, unincremento en la síntesis de almidón (activi-

ESPECIE EC50 (uM)

BacteriasGram positivasClavibacter michiganensis 0.07

Staphylus aureus 0.14Enterococcum faescium CRL 35 0.20

Bacillus subtilis 0.25

Listeria monocytogenes 0.28

Gram negativasXanthomonas fragariae 0.06

Xanthomonas axonopodis pv citri 0.07

Pseudomona auruginosa 0.12Pseudomona siringae pv. gladiolii 0.27

Erwinia carotovora 0.95

Salmonella newport 3.25E.coli D21 4.00HongosColletotrichum fragariae 8.92

Colletotricum acutatum 7.91Colletotrichum gloeosporioides 9.37

EC50 = concentración efectiva para el 50 % de inhibición


dad metabólica), un mayor número decloroplastos y un engrosamiento de las pa-redes celulares, lo que contribuye a aumen-tar el espesor de la semilámina.

Por otra parte, se purificaron y caracteri-zaron compuestos antimicrobianos prefor-mados (fitoanticipinas, para diferenciarlosde las fitoalexinas, cuya formación en laplanta es inducida por un microorganismo)que fueron llamados Fragarinas. Uno de és-tos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicadoen forma exógena, desencadena ademásuna respuesta defensiva en la planta. Estoimplicaría que más allá de su efecto como an-tibiótico (Tabla 1), que permeabiliza la mem-brana plasmática, estaría de alguna maneraparticipando en la señalización de la respues-ta de defensa. Actualmente, se analiza la po-tencialidad de extractos o compuestos deeste tipo como principios activos en la for-mulación de agroquímicos naturales de bajoimpacto ambiental.

4 Marcadores moleculares

Aprovechando la versatilidad de la técni-ca de RAPD lo primero que se planteó fueinvestigar la similitud genética entre las es-pecies silvestres relacionadas con la frutillacultivada y se desarrollaron los primeros mar-cadores moleculares específicos de especie,que permitieran la detección de híbridosinterespecíficos putativos. Del mismo modo,pero usando electroforesis en geles depoliacrilamida de alta resolución, se genera-ron 37 marcadores genotípicos actualmente

disponibles para la identificación inequívocade las 8 principales variedades de frutilla cul-tivadas en la Argentina. Utilizando estaaproximación pudieron diferenciarse tres ac-cesiones distintas del cultivar Pájaro, que ha-bían sido multiplicadas en forma indepen-diente, confirmando la importancia del aná-lisis del ADN para evitar errores en la identifi-cación de cultivares (Fig. 4a).

Sobre la base de la información obtenidaen los experimentos donde se evaluó la re-sistencia/ susceptibilidad de los genotipos delBanco de Germoplasma frente a diversospatógenos fúngicos, se diseñaron cruzamien-tos para obtener poblaciones segregantesque posibilitaran investigar el control genéticode la resistencia. Así, para la principal enfer-medad del cultivo, la antracnosis, se propu-so un modelo basado en una interacción gena gen en un fondo genético octoploide, queasume que la resistencia está determinadapor diferentes variantes alélicas de un gen R,donde la susceptibilidad es parcialmente do-minante sobre la resistencia y la respuestadefensiva sería modulada por la dosis alélicay por otros genes que interactuaríanepistáticamente con el gen R. Mediante BSA(del inglés Bulked Segregant Analysis) se de-tectaron marcadores AFLP (del inglésAmplification Fragment Length Polymor-phisms) ligados a la resistencia que puedencontribuir a hacer más eficiente la selecciónen el Pro\Frutilla (Fig. 4b).

5 Transgénesis

En virtud de las ventajasque ofrece la transformacióngenética mediada porAgrobacterium tumefaciens,preliminarmente se desarrollóun protocolo de regeneraciónde brotes a partir de discos dehojas, con el que se conseguíaque el 70% de los explantoscultivados regeneraran plantasde frutilla. Este sistema de re-generación fue utilizado paraoptimizar una metodología detransformación con la cepa deAgrobac-terium tumefaciensLBA 4404, portadora delplásmido binario pBI121,

Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPDindican diversidad genética entre distintas accesiones de un mismocultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C.acutatum, presente en Progenitor (PR) e híbridos resistentes (HR) yausente en progenitor (PS) e híbridos susceptibles (HS).


lográndose una eficiencia del 6,6 plantastransgénicas por cada 100 discos de hojasinfectados con la bacteria.

Basados en este procedimiento, se obtu-vieron 16 líneas transgénicas de frutilla cvPájaro, que expresaban uno o una combina-ción de dos de los siguientes genesheterólogos (Fig. 5a) que codifican proteínasantifúngicas del grupo de las PR (proteínasrelacionadas con la patogénesis vegetal):ch5B (codifica para una quitinasa dePhaseolus vulgaris), gln2 (codifica para unaglucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (co-difica para una proteína del tipo de lastaumatinas de Nicotiana tabacum). Sola-mente dos de estas líneas transgénicas, am-bas portadoras de una copia simple del gench5B, mostraron resistencia incrementada ala enfermedad del moho gris (causada porBotrytis cinerea, de gran incidencia enagrosistemas subtropicales), aunque ningu-na de las 16 evidenció cambios en su com-portamiento frente a Colletotrichumacutatum, una de las especies más agresivascausante de la antracnosis.

De este modo, queda demostrada la uti-lidad del gen ch5B para introducir resistenciaa Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patógenopara el cual todavía no se han encontradofuentes de resistencia genética en la especieF. x ananassa.

6 Caracterización molecular de genes deinterés

Actualmente se está aprovechando elconocimiento que se tiene, tanto de los ma-teriales fitotécnicos como de los sistemas decompatibilidad, incompatibilidad y de protec-ción cruzada caracterizados, para aislar genesimplicados en los mecanismos defensivos, si-

guiendo al menos dos aproximaciones distin-tas:

i) Mediante la técnica de visualización dela expresión diferencial de ARNms y la cons-trucción (y posterior análisis) de genotecasde ADNc por hibridación sustractiva.

ii) El clonado y caracterización de análo-gos de genes de resistencia (RGA).

En el primer caso (i), se clonaron numero-sos fragmentos de ADNc que codifican pro-teínas relacionadas con la defensa vegetalcomo quitinasas de tipo III o PR 8, proteínasquinasas con un dominio de unión a calcio,reguladores transcripcionales con dominioshomeóticos, miembros de la familia de lasenoil-CoA-hidratasa /isomerasa, etc. De es-tos genes que están siendo analizados almomento de escribir este capítulo, se desta-ca uno que presenta una alta homología conuna glutation S tranferasa (GST) de zapallo(Cucurbita maxima). Esta familia génica queactúa en la detoxificación de compuestos al-tamente oxidantes (especies reactivas de oxí-geno) generados durante estrés tanto bióticocomo abiótico, en Arabidopsis presentamiembros que sólo se expresan en interac-ciones planta /patógeno de tipo incompati-bles (cuando no se produce enfermedad).

Respecto de la segunda aproximación (ii),se utilizaron oligonucleótidos cebadores de-generados diseñados a partir de secuenciasconservadas de la región NBS (del inglés«Nucleotide Binding Site») de genes de resis-tencia (R) clonados de otras plantas, paraamplificar por PCR, análogos de genes de re-sistencia en genotipos silvestres y cultivadosde frutilla. Se identificaron al menos siete fa-milias distintas de RGAs, de las cuales la ma-yoría pertenecía a genes R de tipo TIR (delinglés «Toll Interleukin Receptor»), similaresa los ya caracterizados en Arabidopsis, taba-co y lino.

Figura 5. Transgénesis: A, Construcciones génicas portadoras de genes quecodifican proteínas antifúngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojasdesprendidas de frutilla no transgénica (izda.) y transgénica resistente a Botrytis(dcha.).


7 Conclusiones

En general, se podría decir que el caso delPro\Frutilla es un claro ejemplo decomplementación, interacción, integración ycoordinación, entre el mejoramientogenético convencional y la biotecnologíamolecular, para buscar soluciones a proble-mas de estrés biótico asociados a un cultivode interés comercial, en un marco desustentabilidad y competitividad agronó-mica.


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VIII.-Capítulo 2

Mejoramiento de Plantas Forrajeras enla Era Genómica

Spangenberg, Germán

1 Introducción

La agricultura de pastizales depende engran medida de la disponibilidad de fuentesadecuadas de forraje como base primariapara la alimentación del ganado. En la ma-yoría de las regiones agrícolas del planeta laproducción de forraje es un sistema de bajainversión donde el mejoramiento genéticode plantas es la forma más económica deaportar tecnología de avanzada a los produc-tores. El mejoramiento convencional se basaen el uso de la variación genética natural exis-tente entre ecotipos o aquella creada a tra-vés de recombinación sexual. La biotecnologíapermite generar nueva variabilidad y utilizarde manera más eficiente la variabilidadgenética existente. Esto incrementa la fuen-te de genes útiles para el desarrollo de nue-vos cultivares, acelerando los programas demejoramiento genético.

En los últimos años se han desarrolladonumerosas técnicas biotecnológicas ymoleculares para el mejoramiento degramíneas y leguminosas forrajeras(Spangenberg 1999; Forster et al. 2000). En-tre estas técnicas cabe mencionar el estable-cimiento de sistemas eficientes de regenera-ción de plantas a partir de células competen-tes para la transformación genética, la com-binación total o parcial de genomas por hi-bridación somática y cibridación a través dela fusión de protoplastos, la producción deplantas forrajeras transgénicas utilizandoAgrobacterium y biolística, y el establecimien-to de sistemas altamente informativos demarcadores moleculares codominantespara ser utilizados en el proceso de seleccióny en el desarrollo de mapas genéticos.

En este capítulo se describen las aplica-ciones actuales y futuras y el impacto de labiotecnología en el mejoramiento de espe-cies forrajeras.

2 Transgénesis

La tecnología génica y la obtención deplantas transgénicas brindan la posibilidad de

generar variación genética cuando esta esinexistente o tiene una heredabilidad muybaja. En la actualidad se dispone demetodologías eficientes para la transforma-ción de forrajeras, ya sean gramíneas o legu-minosas (Fig. 1, ver pág.9), estando en la eta-pa de evaluación a campo las primeras plan-tas forrajeras transgénicas con caracteres sim-ples modificados. Si bien algunos aspectos dela genética, fisiología y bioquímica de muchosprocesos vegetales complejos no han sido aúncompletamente dilucidados -lo cual podríademorar algunas de las aplicaciones de latransgénesis en el mejoramiento vegetal- latecnología génica es una poderosa herra-mienta para ampliar los conocimientos engenética molecular.

En consecuencia, las aplicaciones de latransgénesis en el mejoramiento de especiesforrajeras están orientadas hacia el desarro-llo de eventos de transformación con va-riación genética única y a la diseccióngenética de vías metabólicas y procesos dedesarrollo relevantes para la producción deforrajes.

Los mejores candidatos en cuanto a ca-racteres para la aplicación de transgénesis enplantas forrajeras son: calidad del forraje,resistencia a plagas y enfermedades, toleran-cia a estreses abióticos y la manipulación delcrecimiento y desarrollo.

2.1 Calidad del forraje

El mejoramiento molecular basado entransgénesis para sortear limitaciones en lacalidad del forraje está dirigido al tratamien-to de los subcaracteres involucrados, a sa-ber: digestibilidad de la materia seca, conte-nido de carbohidratos solubles, contenido deproteínas, metabolitos secundarios, alca-loides, etc. El enfoque molecular puede in-cluir la modificación del perfil de ligninaspara mejorar la digestibilidad de la materiaseca, la manipulación genética del conteni-do de fructanos para incrementar el conte-nido de carbohidratos no estructurales, de lasíntesis de taninos condensados para desa-rrollar forrajeras libres de meteorismo y laexpresión de proteínas resistentes al rumen(«rumen by-pass») para mejorar el aporte deproteínas y aminoácidos esenciales. La ma-yoría de los parámetros de calidad están aso-

268 SPANGENBERG, Germán

ciados con vías metabólicas o con la produc-ción de proteínas específicas. La tecnologíagénica permite identificar las proteínasinvolucradas y las enzimas clave a ser mani-puladas, el aislamiento de los genes corres-pondientes y la manipulación de su expre-sión en plantas transgénicas.

2.1.1 Manipulación de la biosíntesis delignina

El principal objetivo tendiente mejorar elvalor nutritivo de las gramíneas forrajeraspara la industria lechera es el incremento dela digestibilidad de la materia seca, la cualdeclina marcadamente (> 10%) a medida queestas crecen y maduran, reduciendo el valornutritivo del forraje. Dado que la hereda-bilidad de este caracter es baja y el mismoestá controlado por un gran número degenes, el potencial para un mejoramientorápido por métodos tradicionales es reduci-do.

Se calcula que pequeños incrementos enla digestibilidad tendrán un efecto significa-tivo en la calidad del forraje y concomitan-temente, en la producción animal. Incremen-tos del 1% en la digestibilidad de la materiaseca in vitro conducen a incrementos pro-medio del 3,2% en ganancia media de pesovivo.

El principal factor involucrado en la dismi-nución de la digestibilidad de los tejidos amedida que maduran es la lignificación delas paredes celulares. Los efectos negativosde la lignina sobre la digestibilidad dependende su contenido, composición demonómeros y grupos funcionales y del gra-do de entrecruzamiento con los polisacáridosde la pared celular. La lignificación es un pro-ceso altamente coordinado y regulado porun conjunto de eventos metabólicos que re-sultan en la biosíntesis de precursores de lalignina (monolignoles). Una de las estrategiasexploradas para mejorar la digestibilidad dela lignina es la regulación negativa, en sen-tido o anti-sentido, de las enzimasinvolucradas en la biosíntesis de monolignolesen plantas transgénicas. Las principalesenzimas blanco para la aplicación de esta tec-nología son la O-metiltransferasa del ácidocafeico (COMT), la 4-cumarato: CoA ligasa(4CL), cinamoil CoA reductasa (CCR) y cinamil

alcohol deshidrogenasa (CAD)(Fig. 2 A).Las investigaciones realizadas utilizando

plantas modelo como tabaco y álamo de-mostraron que la regulación negativa de laexpresión de COMT, CAD y 4CL conduce auna alteración en la composición de la ligninao a una disminución de su contenido con in-crementos significativos en la digestibilidadde la materia seca. En algunos de estos ca-sos la lignina resultó más fácil de extraer quí-micamente, en otros esta tecnología trajoaparejadas alteraciones en el desarrollo dela planta, como reducido tamaño y colapsode las células del xilema. No obstante ello,estos resultados indican que la introducciónde genes de esta vía metabólica en sentidoo antisentido permite mejorar la digestibi-lidad de la materia seca sin alterar el desarro-llo normal de la planta.

Los efectos observados en plantas conregulación negativa de alguna de estasenzimas son similares a aquellos encontradosen la naturaleza en un tipo particular de mu-tantes de maíz llamados «brown midrib»(bmr), cuyos genes codifican para enzimasmenos activas. El enfoque transgénico brin-da la posibilidad de obtener plantas conligninas diferentes, logrando una mayor va-riedad de fenotipos que la existente en lanaturaleza, a través de la regulación negati-va de varias enzimas y a la utilización de pro-motores específicos.

Estudios tendientes a mejorar la calidaddel forraje por esta tecnología están siendoexplorados en leguminosas comoStylosanthes humilis y Medicago sativa ygramíneas como Lolium perenne y Festucaarundinacea. Se cuenta con los genes (ADNcy clones genómicos) que codifican para COMT,4CL, CCR y CAD de L. perenne. Estos han sidoaislados, secuenciados, caracterizados y utili-zados para la disección genética de esta víabiosintética en gramíneas (Fig.2 A). Los genescorrespondientes han sido mapeados enraigrás perenne (Fig. 2 B).

A fin de producir cultivares con mayordigestibilidad, aptos para el mercado, es ne-cesario contar con varios eventos de trans-formación con regulación negativa paraenzimas individuales o múltiples enzimasinvolucradas en el metabolismo de losmonolignoles, realizar ensayos a campo deestas plantas, evaluando particularmente el


vigor, la tolerancia a estreses y por último lle-var a cabo la hibridación y selección para ob-tener germoplasma elite.

2.1.2 Manipulación del metabolismo defructanos

Figura 2: A) Disección de la vía metabólica de la biosíntesis de monolignoles. Lasenzimas son: PAL = fenilalanina amonio liasa, C4H = 4-cumarato-3-hidroxilasa, COMT =O-metil transferasa del ácido cafeico, F5H = ferulato-5-hidroxilasa, 4CL =hidroxicinamato:CoA ligasa, CC3H = cumaroil CoA hidroxilasa, CCOMT = Cafeoil CoA 3-O-metil transferasa, CCR = cinamoil CoA reductasa, CAD = cinamil alcohol deshidrogenasa.Las flechas punteadas indican reacciones que no han sido experimentalmenteverificadas. B) Mapeo de los genes correspondientes a la vía en los grupos de ligamentoLG2 y LG7 de raigrás perenne.

Los fructanos son moléculas depolifructosa producidas por varias especiesde gramíneas para las cuales constituyen laprincipal forma de almacenamiento decarbohidratos solubles. Observaciones reali-zadas en líneas de raigrás que almacenan con-

centraciones elevadasde carbohidratos so-lubles indicaron queestas no sufren dismi-nuciones en ladigestibilidad duranteel verano, debido aque estos carbohi-dratos parecen con-trarrestar las disminu-ciones en digesti-bilidad debidas alignificación, favore-ciendo además la asi-milación del forraje yde proteínas en elrumen y, concomi-tantemen-te, condu-ciendo a incrementosen el peso vivo.

La síntesis defructosa en gramí-neas involucra la ac-ción concertada de almenos tres enzimas:sacarosa:sacarosa 1-fructosil-transferasa(1-SST), fructano:fructano 1-fructosil-transferasa (1-FFT) ysacarosa: fructano 6-fructosiltransferasa(6-SFT) que sintetizanla mezcla más com-pleja de fructa-nos li-gados que se encuen-tra en pastos y cerea-les. Varios de losgenes involucradosen esta víametabólica han sidoaislados y caracteriza-dos, como el 6-SFT decebada, el 6G-FFT decebolla y el 1-SST dealcaucil. Su introduc-ción en plantas des-provistas de fruc-

L-fenil-alanine

L-tirosina

ácido cinámico

ácidop-cumárico

p-cumaroil-CoA

p-cumaraldehído

alcohol p-cumarílico

ácidocafeico

ácidoferúlico

5-hidroxi-Á

ácido ferúlico

ácidosinápico

cafeoil-CoA

feruloil-CoA

5-hydroxy-feruloyl-CoA

sinapoil-CoA

coniferaldehyde sinapaldehído

alcohol coniferílico Alcohol sinapílicol

PAL

TAL

PAL

C4H

C3H

5-hidroxi-coniferaldehído

OMT F5H

4CL 4CL 4CL 4CL 4CL

CCR CCR CCR CCR

CAD CAD CAD

OMT

CCoA-3H CCoA-OMT ? CCoA-OMT

LIGNINALAC PER

(H) (G) (S)

A

LG7

10 cM

e41t47520

e38t50244

e33t62760

Xpsr154, Xpsr690

e33t50120

e41t50144

Xc30.1,Xbcd147

LpCAD2.1LpOMT1LpCCR1

LG2

e41t50240, Xcdo1417

Xbcd1823

e33t62340

Xbcd135, Xc600.1

e33t62620

Xpsr540.1

e40t50334

e40t49173, Xcdo36Xpsr546Xpsr1316Xc472Xr738Xc556, Xc498, Xpsr10 (Gli-2)

Xc847

LpCAD2.2

LpCAD1

B


tanos nativos conduce a la acumulación deoligofructanos, y en plantas que los produ-cen, a la acumulación de nuevas variedadesde los mismos.

La introducción de un gen microbianopara la fructosiltransferasa (gen SacB) deBacilus subtilis en plantas de tabaco y papaque carecen de fructanos y acumulan almi-dón condujo a la acumulación de cantidadesconsiderables de fructanos de elevado pesomolecular, del tipo de los levanos, que lesconfierieron un mejor rendimiento en situa-ciones de estrés. Esto demuestra que la sa-carosa, el sustrato para la fructosiltransferasa,puede ser redireccionada en especies que noacumulan fructanos.

La manipulación de la biosíntesis defructanos en plantas transgénicas para me-jorar la calidad del forraje y la tolerancia aestreses abióticos está siendo explorada enleguminosas como Trifolium repens yMedicago sativa y gramíneas como Loliumperenne y Festuca arundinacea.

En trabajos previos se obtuvieron plan-tas de L. multiflorum con alteraciones en elmetabolismo de fructanos por la introducciónde genes quiméricos de levansucrasabacteriana. Actualmente se dispone de ADNcde genes de homólogos de la fructosiltrans-ferasa de raigrás perenne. Estos han sido ais-lados, caracterizados y utilizados para la di-sección genética de la biosíntesis defructanos en gramíneas transgénicas. Tam-bién se han aislado y caracterizado otrosgenes de la vía que han sido introducidos yexpresados en leguminosas y gramíneas.

La disección molecular de la biosíntesis defructanos en forrajeras clave incrementaránuestro conocimiento del metabolismo delos fructanos y de la distribución de loscarbohidratos en gramíneas, aportando in-formación acerca de su rol funcional en latolerancia al frío y la sequía. Este conocimientoes clave para el diseño de experimentos ten-dientes a la obtención de plantastransgénicas con mejor calidad de forraje ytolerancia a estreses abióticos.

2.1.3 Expresión transgénica de proteínasrumen by-pass

Los aminoácidos azufrados metionina ycisteína son los más limitantes en la nutri-ción animal. Estos influyen en el crecimientode la lana de las ovejas y su aporte es reduci-do en condiciones naturales de pastoreo. A

esto se suma el problema de la fermentaciónen el rumen, ya que la microflora degrada lasproteínas y en algunas circunstanciasresintetiza proteínas de menor valor nutriti-vo. Los suplementos postruminales demetionina y cisteína resultan en incrementosdel 16 al 130% en la tasa de crecimiento dela lana. Estos efectos positivos también sehan observado en bovinos, donde han re-dundado en una mayor producción de lechey una mayor tasa de crecimiento en anima-les para carne. Por lo tanto la ingestión deforrajeras que contengan proteínas ricas enaminoácidos azufrados, relativamente esta-bles en el rumen, incrementará el aporte deaminoácidos esenciales para la nutrición delos rumiantes, conduciendo a una mayor pro-ducción animal, particularmente en lo que alana se refiere.

Se ha informado la obtención de plantasforrajeras transgénicas que expresan genesque codifican para diferentes proteínas ricasen aminoácidos azufrados, resistentes a laacción del rumen, como la ovoalbúmina degallina y la albúmina de arveja y de semillade girasol. Como ejemplo puede citarse elcaso de plantas transgénicas de Festucaarundinacea (Festuca alta) que expresangenes quiméricos constituídos por secuenciasde ADNc de la albúmina de girasol (SFA8) conla señal KDEL del retículo endoplásmico bajoel control de diferentes promotores. Estasplantas expresan el transcripto esperado yacumulan la proteína SFA8 a niveles superio-res al 0,2% del total de proteína soluble. Des-de el punto de vista nutricional los valoresobtenidos aún están lejos del óptimo, quedeberá ser del 2 al 5 % del total de proteínasoluble. Es crucial, por lo tanto, desarrollarestrategias que permitan alcanzar estos ni-veles a fin de explotar el máximo potencialde la técnica.

2.1.4 Manipulación de la biosíntesis detaninos condensados

Los taninos condensados (proantocianas)son compuestos poliméricos derivados delmetabolismo fenilpropanoide, sintetizadospor la vía metabólica de los flavonoides.Desde el punto de vista agronómico son im-portantes en las leguminosas forrajeras don-de pueden considerarse beneficiosos o per-


judiciales de acuerdo a los niveles encontra-dos en la planta. Niveles de taninos conden-sados superiores al 4-5% del peso seco sonperjudiciales, actuando como factoresantinutritivos y generando rechazo por par-te del animal. En cantidades moderadas (1-3%) mejoran la calidad del forraje, ya quereducen el meteorismo («empaste») pordisrupción de la espuma causada por las pro-teínas en el rumen, disminuyen la pérdida deproteínas debidas a desaminación micro-biana y reduciendo la carga de parásitos enel animal.

Las estrategias moleculares utilizadas parala manipulación de la biosíntesis de taninosse han orientado hacia la introducción detaninos condensados en alfalfa y trébol blan-co y a su reducción en leguminosas que tie-nen altos contenidos (ver Morris y Robbins1997 y Gruber et al., 2000). Estas se basanen la disponibilidad de genes involucrados enla biosíntesis de antocianas, que afectan lasetapas comunes en la biosíntesis deflavonoides y la suposición de que estos fun-cionarán en la biosíntesis de taninos.

El estudio de mutantes de la víametabólica de los flavonoides en Arabidopsisha proporcionado abundante informaciónacerca de la identidad de las enzimasinvolucradas en la síntesis de taninos en estaespecie. Esto permitió el clonado, entre otros,de los genes CHS, CHI, F3H y DFR. Se identi-ficó y clonó también el gen BAN (BANYULS),que parece ser específico de la vía debiosíntesis de los taninos.

Se ha intentado la regulación negativa opositiva de enzimas clave en la biosíntesis,como es el caso de chalcona sintetasa (CHS)y leucoantocianina-4 reductasa (LAR) respec-tivamente, o la activación de la rutabiosintética mediante la expresión de genesreguladores apropiados que gobiernen la víaa través de un accionar pleiotrópico (conefectos a varios niveles fenotípicos). El aná-lisis de los promotores de algunos genes es-tructurales de esta vía demostró la presenciade motivos de secuencia específicos parala interacción con factores de transcripciónde tipo MYB, bZIP y bHLH. Un ejemplo deesto lo constituye la transformación de plan-tas de Lotus corniculatus con el genregulatorio Sn de maíz, que resultó en unadisminución del contenido de taninos enhojas, conjuntamente con un aumento del

nivel de los mismos en raíz. El pastoreo directo de alfalfa presenta el

riego de causar meteorismo en los rumian-tes que la consumen debido a la ausencia detaninos condensados en hojas y tallos. Sinembargo, la presencia de estos flavonoidesen las semillas demuestra que esta especiecontiene todos los genes necesarios para lasíntesis de taninos condensados. La identifi-cación y aislamiento de los genes involucradosen la biosíntesis de taninos en semillas dealfalfa permitirían manipular su expresión enhojas. Candidatos adecuados podrían ser losgenes de leucoantocianina-4 reductasa (LAR)y de CHS.

2.2 Resistencia a plagas y enfermedades

Los patógenos y las plagas pueden dis-minuir considerablemente la producción, lapersistencia, el valor nutritivo y lapalatabilidad de las plantas forrajeras. En losúltimos diez años se han desarrollado variasestrategias para manipular la resistencia a losmismos. Estas incluyen la expresión dequitinasas, glucanasas, defensinas,fitoalexinas, proteínas inactivadoras delribosoma, proteínas de la cápside viral,replicasa viral, proteína del movimiento viral,toxinas Bt, inhibidores de proteasas einhibidores de α-amilasa.

2.2.1 Transgénesis para incrementar laresistencia a enfermedades fúngicas

El ataque de hongos a las hojas y siste-mas radicales de las plantas provocan dañosque resultan en un pobre establecimiento,disminución en el rendimiento y calidad y unalimitada persistencia. La expresión constitu-tiva en plantas transgénicas -específica deórgano o inducida por el patógeno- de genesque codifican para proteínas antifúngicas(AFPs), puede conferir nuevas formas de re-sistencia a enfermedades fúngicas. Estas es-trategias, utilizando genes que actúan indivi-dual o concertadamente, se han intentadoprincipalmente en leguminosas, como alfal-fa y trébol blanco. Como ejemplo puede ci-tarse la obtención de plantas de alfalfa queexpresan una quitinasa I de arroz, que po-dría hacerlas resistentes al ataque deRhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii.


Hongos como Phytophthora clandesti-na, Kabatiella caulivora, Rhizoctonia solaniy Fusarium spp., que atacan a varias espe-cies de tréboles, donde no existen fuentesde resistencia natural, provocan cuantiosaspérdidas económicas en Australia. Se hanidentificado cuatro proteínas antifúngicas di-ferentes que en ensayos in vitro demostra-ron ser efectivas contra estos patógenos yse han utilizado los correspondientes genesquiméricos que las expresan para producirplantas fenotípicamente normales de trébolsubterráneo. Mientras se trata de determi-nar la resistencia lograda utilizando estosgenes AFPs de manera individual también seintenta «piramidizar» diferentes transgenesa fin de brindar una mayor protección con-tra un amplio espectro de hongos patóge-nos.

2.2.2 Transgénesis para incrementar laresistencia a enfermedades virales

Virus tales como el del mosaico de la al-falfa (alfamovirus,AMV), el del mosaico deltrébol blanco (potexvirus,WCMV) y el delamarillamiento de las nervaduras(potyvirus,CYVV) afectan negativamente elcrecimiento y desarrollo de las leguminosas.Cada uno de ellos infecta individualmente aun gran número de especies distribuidas portodo el mundo, causando pérdidas significa-tivas en leguminosas utilizadas para distintosfines. El control de estos tres virus podría in-crementar la rentabilidad de las industriasrurales australianas en más de 860 millonesde dólares. La mayoría de los métodos clási-cos utilizados para prevenir las infeccionesvirales son laboriosos y económicamenteinviables. Se han identificado fuentes poten-ciales de tolerancia o resistencia en alfalfa yen unas pocas especies de Trifolium, perono existe una resistencia natural a estos virusque sea transferible, efectiva y durable quepueda ser incorporada a cultivares de legu-minosas forrajeras. La tecnología génica esuna opción atractiva para lograr este objeti-vo, ya que permite sortear barrerasinterespecíficas, desarrollar resistenciasmultigénicas y manipular niveles y sitios deexpresión. La transgénesis se ha usadoexitosamente para desarrollar resistenciaefectiva y durable en un amplio rango de es-

pecies vegetales. En este sentido se han uti-lizado resistencias derivadas de distintospatógenos para la obtención de legumino-sas transgénicas con resistencia a AMV,WCMV y CYVV. La estrategia utilizada fue lade expresión de proteínas de la cápside viralu otras propias del patógeno como versio-nes mutadas de distintas proteínas. (verVIII.4).

En las gramíneas forrajeras dos virus quese encuentran con frecuencia son el delenanismo y amarillamiento de la cebada(BIDV) y el del mosaico del raigrás (RMV).Estos provocan disminuciones en el rendi-miento del raigrás de hasta un 24% (BIDV) yde un 5 al 50% (RMV). La infección con RMVtambién reduce la competitividad del raigrásperenne como resultado de un mal estable-cimiento y una reducida persistencia.

2.2.3 Transgénesis para incrementar laresistencia a plagas

Las plagas pueden dañar a las plantasdirectamente, por consumo del follaje y raí-ces o indirectamente, por transmisión depatógenos a estas durante su accionar so-bre la planta. En pasturas infectadas por den-sas poblaciones de insectos plaga se produ-cen disminuciones en la producción de ma-teria seca que van del 20 al 40%.

Varios insectos como Wiseana spp,Costelytra zealandica, Teleogrylluscommodus, Sminthurus viridis, Sitona spp,Coleophora spp, Inopus rubriceps yAcyrthosiphon spp pueden causar daños sig-nificativos a leguminosas y gramíneas. A finde incrementar la resistencia a los mismos sehan utilizado distintos enfoques transgénicos.Uno de ellos es la utilización de la proteínacristalina e inhibidores de proteasas deBacillus thuringiensis (Bt). Para una revisióndel tema pueden consultarse a Voisey et al.(1994), Strizhov et al. (1996) y Voisey et al.(2000).

Como ejemplo cabe citar la obtención deplantas de trébol blanco que expresan ungen quimérico Bt cry1Ba modificado y acu-mulan en las hojas la delta-endotoxinaCry1Ba a niveles del 0,1% de proteína solu-ble. La alimentación de larvas de Wiseana conhojas de estas plantas promueve una inhibi-ción en la ingesta, reducción en el crecimien-


to de la larva y una mayor mortalidad de es-tas cuando se la compara en la misma situa-ción utilizando plantas control .

Otro ejemplo lo constituye la utilizaciónde inhibidores de proteasas, tales como elinhibidor de tripsina pancreática bovina oaprotinina en trébol blanco, donde la expre-sión en hoja de aprotinina a niveles de 0,07%de proteína soluble reduce el ataque por laslarvas de Wiseana.

Otra estrategia para proteger contra in-sectos plaga sería la transformación indirec-ta en gramíneas, utilizando un endófito (mi-croorganismo que vive y se desarrolla dentrode los tejidos de la planta) transformado,como Neotyphodium. Esto permitiría obte-ner cepas del endófito seguras para los ru-miantes que las consuman, que expresen ysecreten proteínas insecticidas tales comotoxinas Bt e inhibidores de proteasas queprotejan a las gramíneas forrajeras de las pla-gas.

2.3 Crecimiento y desarrollo

2.3.1 Manipulación de alérgenos delpolen

La fiebre del heno y el asma alérgicoestacional debido al polen de las gramíneasson enfermedades ambientales que afectanhasta el 25% de la población en climas tem-plado-fríos. El polen de raigrás es uno de losmás abundantes en estas regiones, siendoel principal alérgeno para el 49-67% de lospacientes alérgicos. Este polen contiene porlo menos 4 clases principales de proteínasalergénicas, cada una de las cuales estáconstituída por múltiples isoformasinmunológicamente indistinguibles queinvolucran 17 alérgenos que tienen un tama-ño que va de 12 a 89 kDa. Al menos una pro-teína de cada una de estas clases ha sido ais-lada y caracterizada en detalle. Se han aisla-do clones de ADNc para el principal alérgenodel raigras Lolp1, Lolp2 y Lolp5. En 1997 seobtuvieron las primeras plantas transgénicasde raigrás perenne (Lolium perenne) y deraigrás Italiano (Lolium multiflorum) que lle-van genes para Lolp1 y Lolp2 en antisentido,bajo el control de un promotor específico delpolen a fin de regular negativamente losalérgenos del mismo. Estas plantas permiti-rán estudiar el rol funcional in planta de es-

tos alérgenos y permitirán explorar el poten-cial para la obtención de cultivares de raigráshipoalergénico.

Más recientemente se obtuvieron plan-tas de raigrás anual (Lolium rigidum) queportan en antisentido un gen quiméricoLolp5.

2.3.2 Manipulación de cambio de fase yfloración

La disminución del valor nutritivo en al-gunas forrajeras perennes se encuentra aso-ciada con el comienzo del crecimiento de lascañas florales, la floración y la senescencia.La calidad del forraje podría mejorarse, porlo tanto, inhibiendo la producción de cañasflorales, que son poco digeribles, o retardan-do la senescencia.

Se han informado modificaciones en eltiempo de floración en plantas transgénicasa través de la regulación de la expresión degenes involucrados en la iniciación delmeristema floral. La expresión constitutiva degenes de Arabidopsis thaliana como LEAFYo APETALA1 conducen a un desarrollo pre-coz, como se ha observado en plantastransgénicas de álamo. En A. thaliana, mu-taciones en uno o más de los genesinvolucrados en la determinación de identi-dad del meristema floral conducen a un de-sarrollo floral incompleto o nulo. Esto ha lle-vado a pensar en la posibilidad de controlaro inhibir la floración en forrajeras transgé-nicas regulando negativamente la expresiónde este tipo de genes, tales como losortólogos (genes que tienen la misma estruc-tura y función y un origen común) de LEAFYo APETALA1.

Otro blanco para la manipulación del de-sarrollo reproductivo en forrajeras es el genINDETERMINATE1 (ID1). Este gen desempe-ña un rol importante en el control de la ini-ciación floral y en el mantenimiento de unestado floral determinado en maíz. Su mu-tación es la única conocida en monocotile-dóneas que bloquea específica y severamen-te la transición hacia un crecimiento repro-ductivo. Recientemente fue aislado y carac-terizado un ADNc de plantas de raigrás pe-renne homólogo de este gen. Se espera quela inhibición de la transición de un estadovegetativo a la formación de cañas florales einflorescencias en gramíneas incremente la


calidad del forraje y, en consecuencia tam-bién disminuya la cantidad de alergenos delpolen.

La inhibición o el control de la floraciónen forrajeras transgénicas a través de la su-presión antisentido de ortólogos de ID1 oLEAFY y APETALA1 podría conducir a incre-mentos en la calidad y a una mejora en lospatrones de crecimiento estacional. Por otrolado, representaría una vía para la conten-ción de transgenes. Para la producción desemilla este bloqueo de la floración deberíaser revertido. Una posibilidad para lograr estefin sería la utilización de un promotorinducible por cobre, por ejemplo, que con-trolara la supresión de ortólogos de estosgenes.

Se han utilizado diferentes enfoques parala manipulación del desarrollo reproductivoque podrían conducir a un bloqueo de la flo-ración, al desarrollo de la apomixis (tipo dereproducción agámica común en ciertas es-pecies de gramíneas, ver VIII.3) y a laandroesterilidad (esterilidad de la partemasculina de la planta), que además posibili-tarían el mantenimiento de los transgenes.Esto es de particular importancia paraforrajeras transgénicas de polinización abier-ta, mediada por el viento, ya que la disper-sión del polen es un factor importante en laevaluación de riesgo de las gramíneasgenéticamente modificadas.

2.3.3 Manipulación de la senescencia

Se ha observado en plantas transgénicasque la producción autorregulada decitocininas conduce a la inhibición de lasenescencia foliar (envejecimiento de la hojaque culmina en la muerte de la misma). Estesistema se basa en la utilización de un pro-motor específico de senescencia de A.thaliana, el SAG12, que controla la expresióntransgénica de un gen para la isopenteniltransferasa (ipt) de Agrobacteriumtumefaciens, que cataliza un paso en labiosíntesis de citocininas. Las plantas queexpresan este gen presentan un retraso enla senescencia foliar y no presentan anoma-lías de ningún tipo. En trébol blanco genesanálogos de ipt quiméricos, bajo el controlde promotores regulados por desarrollo, aso-ciados a senescencia, provocan un retardo

significativos en la senescencia y su aspectoes completamente normal.

2.4 Agricultura molecular

Las plantas transgénicas pueden ser utili-zadas para expresar proteínas recombinan-tes heterólogas, siendo esta una alternati-va atractiva para la producción de biomo-léculas en reemplazo de los sistemasmicrobianos. La perennidad, la producciónpotencial de biomasa, la capacidad de fijar elnitrógeno biológico y la habilidad para cre-cer en áreas marginales que poseen lasforrajeras, en particular las leguminosas, lashace atractivas para este fin. La disponibili-dad de tecnologías que permitan elevadosniveles de expresión y contención de lostransgenes permitirían utilizar a las forrajerascomo biorreactores para la obtención deenzimas industriales, productos farmacéuti-cos, vacunas, anticuerpos y plásticosbiodegradables. La alfalfa tiene ciertas carac-terísticas que la convierten en un interesan-te biorreactor. Entre ellas se destacan la pe-rennidad y la capacidad de producir dos ótres cosechas en el año, existiendo ademásla tecnología adecuada para extraer las pro-teínas de interés dejando un residuo utiliza-ble para la alimentación del ganado. Se handesarrollado y evaluado plantas de alfalfatransgénicas productoras de enzimasmicrobianas involucradas en la degradaciónindustrial de lignina y celulosa, entre otros.Este cultivo también ha sido utilizado para laproducción de polímeros biodegradablescomo el polihidroxibutirato (PHB) mediantela introducción de tres genes de Ralstoniaeutropha.

2.5 Evaluación a campo de plantasforrajeras transgénicas

A fin de determinar la estabilidad en laexpresión de los transgenes, evaluar los nue-vos fenotipos e identificar los eventos detransformación adecuados para el desarro-llo de germoplasma y cultivares transgénicoses necesario realizar ensayos de campo pla-nificados, en principio en pequeña escala.Solo después de haber realizado estas eva-luaciones se pueden integrar estos materia-les en programas de mejoramientomolecular para el desarrollo de cultivares


transgénicos. Un ejemplo ilustrativo de undiseño para ensayos de campo en escala re-ducida es el de plantas transgénicas de tré-bol blanco inmunes al virus del mosaico de laalfalfa. En este ensayo se tuvieron en cuentaimportantes características de bioseguridad,como por ejemplo la presencia de una zonade dos hectáreas sembradas con legumino-sas forrajeras que se sabe que no se cruzancon el trébol blanco. El uso de leguminosasforrajeras como el trébol rojo, trébol de Persiay alfalfa en esta zona «buffer», sembradasen bandas alternadas, asegura que haya unelevado número de leguminosas notransgénicas floreciendo en el ensayo en elperíodo crítico en que están floreciendo lasplantas transgénicas motivo del experimen-to. Las dimensiones de esta zona «buffer»

Figura 1: Transformación de trébol blanco pararesistencia virus. A-H) Sistema prolífico de

regeneración de plantas resistentes al virus delmosaico de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del

trébol blanco (WCMV) a partir de explantoscotiledonales. La transformación se llevó a cabo

utilizando Agrobacterium tumefaciens, utilizandonpt2 como marcador de selección. I) T-ADN del vector

binario conteniendo el gen quimérico npt2 y el gen dela proteína de la cápside del wcmv4 (wcmv4) J)

Análisis por PCR para la identificación preliminar de lasplantas transformadas utilizando cebadores (primers)

para el gen npt2. K) Idem anterior pero utilizandocebadores para el gen wcmv. L) Análisis por el métodode Southern utilizando el gen wcmv

4 como sonda. M)

Análisis por el método de Northern de plantastransgénicas de trébol blanco expresando el gen

quimérico wcmv4.


fueron diseñadas teniendo en cuenta consi-deraciones tales como la conducta de lasabejas como polinizadoras del trébol blan-co, la dispersión del polen, y determinacio-nes de flujo génico utilizando un gen mar-cador de fácil trazabilidad, denominadoFeathermark. A fin de determinar el flujogénico, dos hileras de trébol blanco notransgénico se incluyeron en el diseño rodean-do el perímetro del ensayo y las parcelas cen-trales con las plantas transgénicas. Las semi-

Figura 3: A) Esquema de la liberación a campo, a pequeña escala, de plantas transgénicas de trébol blanco inmunesa AMV. B) Estrategia para el desarrollo de germoplasma elite transgénico de trébol blanco inmune a AMV, basadaen la utilización de PCR cuantitativa para detectar las plantas homocigotas para los transgenes (npt2 y AMV4).

llas cosechadas de las plantas de trébol blan-co no transgénico de estas dos hileras seanalizaron utilizando una combinación deresistencia a antibiótico (resistencia a G418mediada por un gen npt2 ubicado en el ADN-T integrado en el genoma de las plantastransgénicas) y PCR para detectar la presen-cia del gen marcador de selección. Los resul-tados de este análisis confirmaron que estediseño de campo es adecuado para la eva-luación de plantas transgénicas (Fig. 3 A).


2.6 Integración de plantas forrajerastransgénicas en programas demejoramiento y desarrollo de cultivarestransgénicos

Los ejemplos citados más arriba acerca deldesarrollo de una serie de eventos de trans-formación en leguminosas y gramíneasforrajeras constituyen una prueba fehacien-te de la funcionalidad de esta tecnología. Eldesafío actual es utilizar esta tecnología y lasherramientas moleculares actuales para trans-ferir genes valiosos de manera múltiple o in-dividual a fin de obtener nueva variabilidadgenética y nuevo germoplasma transgénicoélite e incorporar eficientemente estos fac-tores en programas de mejoramiento parala obtención de cultivares. Se han desarrolla-do estrategias eficientes para la introgresiónde transgenes en parentales élite para laobtención subsecuente de cultivares sinté-ticos (polihíbridos), asegurando la expresiónestable y uniforme del transgén en todas lasplantas de la población (Fig. 3B).

En la Fig. 3B se muestra la estrategia utili-zada para la obtención de plantas de trébolblanco elite inmunes a AMV, homocigotaspara los transgenes. Involucra cruzas inicialesde los eventos de transformación elegidosluego de su evaluación a campo con plantaselite no transgénicas (Estadío 1); selección porresistencia a antibiótico de la progenie quelleva el transgen y está ligado al gen marca-dor npt2, o análisis por PCR, seguido por cru-zas dialélicas entre la progenie T

1 (Estadío

2). Identificación por PCR cuantitativa o cru-za de prueba de las plantas T

2 que son

homocigotas para los transgenes (Estadío 3).Las plantas élite de trébol blanco homoci-góticas para los transgenes son entoncessembradas para su selección en un criaderojunto con líneas parentales élite no trans-génicas. De esta manera se identificarán losnuevos parentales de los cultivares sintéticostransgénicos experimentales, que posterior-mente serán evaluados en distintos ambien-tes.

3 Genómica

El mejoramiento de la plantas forrajerasha entrado en la era genómica, lo cual signi-fica que se cuenta con gran cantidad de nue-vas herramientas y tecnologías para el des-cubrimiento de genes y para el análisis glo-

bal de los genomas. Todo esto aportará in-formación acerca de todos los aspectos delcrecimiento vegetal, desarrollo, diferenciacióny respuestas a estreses bióticos y abióticos,revolucionando el mejoramiento vegetal y laproducción. Cientos de miles de etiquetas desecuencias expresadas (ESTs) han sido elpunto de partida para dilucidar la función demiles de genes vegetales y se han creadobases de datos de las mismas provenientesde los principales cultivos. Esto posibilitará laidentificación, caracterización funcional y usode genes valiosos para los sistemas de pro-ducción de forraje.

3.1 Descubrimiento de genes ymicromatrices (microarrays) para elanálisis de la expresión de genes enplantas forrajeras

Las especies modelo para las cuales se hanencarado proyectos de genómica basadosfundamentalmente en el descubrimiento deESTs son Lotus japonicus y Medicagotruncatula. Aproximadamente 80.000 ESTsde la última han sido generados por consor-cios internacionales financiados por el FrenchCentre National de Sequencage, laInternational Human Frontier ScienceProgram Organization, la Samuel RobertsNoble Foundation, Stanford University, el USNational Science Foundation Plant GenomeProgram y el US Deparment of EnergyBiosciences Program.

Un programa asociado entre AgricultureVictoria-DNRE (Australia) y AgResearchLimited (Nueva Zelanda) generó aproxima-damente 100.000 ESTs de cultivos forrajerosclave para la agricultura de clima templado,como son el raigrás perenne (L. perenne) yel trébol blanco (T. repens). Para ello sesecuenciaron a gran escala clones selecciona-dos al azar de genotecas de ADNc que re-presentaban un amplio rango de órganos,estados de desarrollo y tratamientos experi-mentales. Fueron generadas, 49503 secuen-cias de ADN de raigrás perenne, analizadaspor búsqueda de BLAST (Ver VII-3) ycategorizadas funcionalmente .

Dentro de este programa se realizaronmicromatrices de ADNc de alta densidad (con4000-5000 gotas/arreglo) para su utilizaciónen la identificación de secuencias de trébolesy raigrases (Fig. 4, ver pág. 13).


Dentro de las aplicaciones de estosmicromatrices basados en ESTs de plantasforrajeras se encuentra la fenotipificaciónmolecular. Esto comprende el análisis de pa-trones de expresión global o patrones deexpresión específicos utilizando hibridacióncon sondas complejas de genotiposcontrastantes o poblaciones y ambientescontrastantes. Todo esto puede utilizarsepara integrar los datos de micromatrices conaquellos de selección fenotípica convencional.

El análisis comparativo de secuencias ydatos de micromatrices de raigrás y trébolescon aquellos de Arabidopsis y arroz, conjun-tamente con los programas de descubrimien-to de ESTs en M. truncatula, aportarán in-formación acerca de los aspectos conserva-dos y divergentes en la organización y fun-ción del genoma gramíneas y leguminosas.

3.2 Simbio y patogenómica

Las leguminosas y gramíneas ofrecen laposibilidad de estudiar a nivel genómicointeracciones de distinto tipo, como porejemplo planta-patógeno, simbiosis legu-minosa/bacteria fijadora de nitrógeno, aso-ciaciones leguminosa/microrriza y endo-simbiosis gramínea/endófito. La informa-ción obtenida en estos estudios será de granvalor para desarrollar resistencia a patógenosy mejorar las asociaciones beneficiosas en lasforrajeras.

El trabajo de descubrimiento de genes enM. truncatula está orientado a estudiar larespuesta de la planta ante los patógenos ya caracterizar diferentes sistemas patogé-nicos que incluyen patógenos fúngicos talescomo Colletotrichum trifolii y Phytophthoramedicaginis y patógenos bacterianos comoXylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae.Para mediados del 2000 el US M. truncatulaFunctional Genomics Project generó 27.000secuencias de DNA que incluían 2.828 ESTsde hojas infectadas con Colletotrichum,2.462 ESTs de hojas infectadas conPhytophthora, 3.259 ESTs de micorrizas deraíz y aproximadamente 9.500 secuencias deraíz en diferentes tiempos después de la ino-culación con Sinorhizobium meliloti y denódulos maduros y senescentes.

Existe un proyecto de genómica funcio-nal integrado tendiente a dilucidar los even-

tos conducentes a la nodulación en las legu-minosas utilizando L. japonicus como mode-lo. Este proceso de nodulación involucra lainteracción compleja entre genes bacterianosy sus productos con procesos de desarrolloen la planta que involucran percepción ytransmisión de señales y morfogénesis. Elobjetivo es comprender mecanismosgenéticos de la planta involucrados en estasimbiosis a fin de mejorar las asociaciones na-turales beneficiosas para la agricultura y el am-biente. Este y otros recursos genéticos de M.truncatula y L. japonicus contribuiránsignificativamente a conocer y comprenderlas respuestas a patógenos y estrés y lasinteracciones de la rizósfera con las legumi-nosas forrajeras.

Agriculture Victioria-DNRE también haencarado un programa de genómica deendófitos de gramíneas focalizado en el des-cubrimiento de genes gramínea-endófito enla asociación Festuca arundinacea/Neotyphodium coenophialum. A través deeste programa se han generado aproxima-damente 8.000 secuencias del hongo que seanalizaron por búsqueda de BLAST y se ca-racterizaron funcionalmente. El principal in-terés está dirigido al descubrimiento degenes involucrados en la colonización delhuésped, en el aporte de nutrientes para elhongo endofítico y en la biosíntesis demetabolitos secundarios activos depirrolopirazina y pirrolizidina (los repelentesde insectos peramina y N-formilolina respec-tivamente) y su regulación. Este proyectotambién aportará información acerca de lainteracción endófito-huésped así como de losmecanismos fisiológicos conducentes a unincremento en el vigor de la planta y a unamayor tolerancia a estreses. Estas herramien-tas genómicas y el conocimiento generadoposibilitarán el desarrollo de tecnologías paramanipular las asociaciones gramínea-endófitoa fin de incrementar el rendimiento de la plan-ta, mejorar la tolerancia a estreses bióticos yabióticos y alterar la especificidad endófito-huésped a fin de beneficiar a las industriassemilleras de pasto para césped y forrajes.

En otro proyecto similar se ha tratado deaislar y caracterizar genes involucrados en labiosíntesis de indol-diterpenos y ergopepti-nas responsables de la toxicosis animal enla asociación Lolium perenne-N. Lolii. La pro-


Figura 4: A) Perfiles de expresión a través de micromatrices de ADN utilizando dos colorantes fluorescentes (Cy5 yCy3) para marcar dos muestras de RNA total provenientes de distintas situaciones de crecimiento o desarrollo, porejemplo plantas creciendo en luz (Cy3) y plantas creciendo en oscuridad (Cy5). Luego de la hibridación, los puntosmarcados en verde indican los genes que se encuentran regulados positivamente cuando las plantas se encuentranen condiciones de luz, aquellos marcados en rojo corresponden a los regulados positivamente cuando se hallan enoscuridad y los que están en amarillo corresponderían a aquellos genes que están regulados positivamente enambas situaciones. C) Micromatrices de ADNc de trébol blanco utilizando RNA de hojas y raíz. Confirmación porNorthern de la expresión de los genes para la dihidroflavonol reductasa y una proteína embriónica.

tección de los meristemas de Lolium de unexceso de herbivoría es vital para el éxitoreproductivo y la distribución de esta y otrasespecies de gramíneas. El desarrollo de aso-ciaciones simbióticas entre gramíneas yendófitos del grupo Epichloë/Neotyphodiumrepresenta una forma única de protección

donde los genomas del huésped y elsimbionte han co-evolucionado para benefi-cio mutuo. El hongo le aporta protección alhuésped a través de la producción demetabolitos bioprotectores en retribuciónpor los nutrientes para su crecimiento. Estoscompuestos son tóxicos para los mamíferos.


El clonado de los genes de estas víasmetabólicas es un objetivo importante yaque se conoce poco acerca de la enzimología,de la biosíntesis de toxinas y de las condicio-nes para la síntesis endofítica de estosmetabolitos ex planta. En este sentido sehan logrado avances al clonar un conjuntode genes responsables de la síntesis deergopeptina y ergotamina de Clavicepspurpurea y de paxilina, un indol-diterpenoestrechamente relacionado al lolitremo B dePenicillum paxilli.

3.3 Xeno-genómica

La genómica comparativa basada en elanálisis de ESTs de varias plantas tolerantes

a estreses abióticos permitirá laidentificación de redes de genesasociados con estreses ambienta-les tales como alta salinidad, se-quía y bajas temperaturas, asícomo la determinación de víasbioquímicas conserva-das.B) Aná-lisis de la imágen de micromatricesde etiquetas expresadas de ADN(ESTs) (ImaGene Software).involucradas en las respuestas aestreses.

La investigación genómica uti-lizando especies vegetales exóti-cas, conocida como xenogenó-mica, incluye el descubrimiento degenes a través del secuenciado deESTs a gran escala y el análisis dela expresión global de genes conmicromatrices basados en las mis-mas. Esto posibilitará la obtenciónde genes clave y variantes degenes de plantas tolerantes aestreses abióticos extremos, mu-chos de ellos nuevos, y la deter-minación de sus patrones de ex-presión en respuesta a estresesabióticos específicos.

Un programa de xeno-genómica llevado a cabo porAgriculture Victioria-DNRE se en-cuentra abocado a seleccionargramíneas y leguminosas austra-lianas nativas y exóticas, adapta-das a estreses ambientales extre-

mos. En este marco se están aislando y ca-racterizando aquellos genes que permiten aestas especies tolerar estreses abióticos comosequía, salinidad y suelos de baja fertilidad.Entre las especies estudiadas se incluyengramíneas australianas nativas, tales comolas halotolerantes Agrostis adamsonii y A.robusta y la especie tolerante a aluminioMicrolaena stipoides. También incluye espe-cies exóticas como Deschampsia antarctica,una de las dos únicas plantas vasculares nati-vas de la Antártida.

Estos descubrimientos facilitarán el desa-rrollo de estrategias efectivas de mejoramien-to molecular que permitirán incrementar latolerancia a estreses abióticos en forrajerasy otros cultivos.

.B) Análisis de la imágen de micromatrices de etiquetas expresadasde ADN (ESTs) (ImaGene Software).D) Perfiles de expresión de genesde raigrás, comparando genes que se expresan en tallo y raíz.


4 Resumen y conclusiones

En los últimos años se ha realizado unconsiderable progreso en el establecimientode las metodologías requeridas para el me-joramiento molecular de plantas forrajeras.Numerosas estrategias biotecnológicas estánsiendo consideradas en relación al mejora-miento de la calidad nutritiva a través de laalteración de la biosíntesis de lignina,carbohidratos solubles y protoantocianas yde la expresión regulada de proteínas ricasen aminoácidos esenciales, resistentes alrumen. También se pretende incrementar laresistencia a patógenos y plagas, manipularel crecimiento y desarrollo a fin de incremen-tar la persistencia y demorar la senescencia,impedir la floración y regular negativamentelos alérgenos del polen. Las primeras plantasforrajeras transgénicas han sido evaluadas acampo y eventos de transformación seleccio-nados se han utilizado para el desarrollo decultivares.

Las herramientas genómicas permitiráncomprender mejor la genética, fisiología ybioquímica de varios procesos vegetales com-plejos y acelerar la aplicación de estrategiasde tecnología génica para el mejoramientode plantas forrajeras.

La aplicación de herramientas ymetodologías moleculares para el mejora-miento de estas especies reemplazará engran medida la selección empírica basada enel fenotipo por otra más directa y predecible,basada en el genotipo. Sin embargo, estasestrategias son promisorias solamente cuan-do se las considera dentro de un programade mejoramiento. Los programas másexitosos serán aquellos que incluyan un equi-po multidisciplinario conformado pormejoradores, biólogos moleculares y celula-res, bioquímicos, patólogos, agrónomos, ex-pertos en nutrición animal y que adopten lasnuevas tecnologías génicas, de genómica fun-cional, bioinformática y de fenotipificación yque las apliquen de manera apropiada pararesolver problemas específicos. El esfuerzo detales equipos integrados será crítico para eldesarrollo de cultivares destinados al merca-do y para el desarrollo de plantas forrajerasdestinadas a otros usos.

La genómica vegetal tendrá un rol vital alacelerar la aplicación de la biotecnología parala agricultura de forrajes y pastizales. La in-

vestigación genómica en las plantas forrajeraspermitirá el desarrollo de tecnologías que vanmás allá de los sistemas de producción deforrajes, incrementando significativamente elvalor de las semillas y de los productos agrí-colas. Infinidad de genes vegetales serán unrecurso invalorable para ser insertados enmuchas plantas de cultivo utilizando tecno-logía génica y para ser utilizados como mar-cadores en selección asistida. Esto incremen-tará la eficiencia y la eficacia de los progra-mas de mejoramiento vegetal.


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VIII.-Capítulo 3

Manipulación de la Apomixis y suAplicación en la Agricultura

Ortiz, Juan Pablo A.; Pessino, Silvina C.;Quarin, Camilo L.

1 ¿Qué es la apomixis?

Algunas plantas con flores presentan unmodo asexual de reproducción llamadoapomixis. Éste consiste en la formación desemillas que contienen embrionesgenéticamente idénticos a la planta madre,generados sin que intervengan los procesosde meiosis y fecundación. La apomixis fuedescripta por primera vez en 1841 en la plantaaustraliana Alchornea ilicifolia por J. Smith.Cuando un ejemplar femenino de esta espe-cie dioica fue llevado a los Kew Gardens deLondres desde Asia, la planta aislada florecióy produjo semillas en abundancia, poniendoal carácter en evidencia. Paradójicamente, losprimeros experimentos con plantasapomícticas fueron realizados en formainvoluntaria por Gregor Mendel, quien utili-zó cruzas entre especies del géneroHieracium para intentar confirmar los resul-tados obtenidos en sus famosos estudiossobre la herencia de las arvejas de jardín.Mendel atribuyó erróneamente a una su-puesta «frecuente autopolinización» la faltade segregación observada. Hoy sabemos quemuchas especies de este género sonapomícticas.

Se considera que la apomixis ha evolucio-nado como un sistema de reproducción al-ternativo a la sexualidad a través de lareformulación de sus programas de desarro-llo. Por lo tanto, para comprender su funcio-namiento es necesario compararlo con el dela reproducción sexual. La sexualidad en lasangiospermas comprende la alternancia cícli-ca entre los estados de esporófíto (la plantamisma, 2n) y gametófito (el grano de poleny el saco embrionario, n). La meiosis que ocu-rre en las flores posibilita la recombinación yreducción del contenido genético y da lugara la formación de las esporas femeninas(megásporas) en el ovario y masculinas(micrósporas) en las anteras. La megaspo-

rogénesis genera cuatro células haploides,tres de las cuales degeneran. La restanteconstituye la megáspora funcional, que porel proceso de megagametogénesis desarro-lla un megagametófito conocido como «sacoembrionario». El tipo de saco embrionariomás común entre las angiospermas (conoci-do como Polygonum) está formado por 8núcleos haploides (n) contenidos en sietecélulas, a saber: la ovocélula, dos sinérgidas,una célula central binucleada, y tres antípo-das. Por otra parte, las micrósporas desarro-llan los granos de polen mediante un proce-so de microgametogénesis. El polen maduroestá típicamente integrado por tres célulashaploides (n), dos de las cuales constituyenlos gametos masculinos. La otra tiene unafunción relacionada con el crecimiento deltubo polínico.

La formación de la semilla requiere pre-viamente de un proceso de doble fecunda-ción: un gameto masculino (n) se fusiona conla ovocélula (n) para originar al cigoto (2n). Apartir de este cigoto se desarrolla el embrión.La célula central del saco embrionario con susdos núcleos (n + n) se fusiona con el otrogameto masculino para originar elendospermo. Así, la fusión de dos gametoshaploides únicos derivados de la distribuciónal azar del material genético durante lasmeiosis masculina y femenina resulta en lageneración de progenies genéticamente di-versas. En resumen, en la reproducción sexualla meiosis produce la recombinación génicade los caracteres de ambos progenitores ygenera gametos haploides. La fecundaciónfusiona de manera aleatoria un gameto mas-culino con uno femenino para originar unnuevo individuo con una constitucióngenética única.

La apomixis elude la ruta sexual evitandola reducción meiótica y la fecundación. El óvu-lo desarrolla una semilla cuyo embrión con-tiene exactamente el mismo genotipo quela planta que lo origina. Por lo tanto estecarácter (también llamado agamospermia)ha sido definido como reproducción asexuala través de semillas. Fue descripto en másde 400 especies de plantas pertenecientes a35 familias diferentes, entre las que se des-tacan las Gramíneas, las Compuestas, lasRosáceas y las Rutáceas. Presenta formas di-ferentes y parece haber surgido varias veces

284 ORTIZ, J.P.A.; PESSINO, S.C.; QUARIN, C.L.

en forma independiente durante la evolu-ción. Brevemente, los embriones apomícticospueden formarse a través de una rutaesporofítica o gametofítica. En la primera,también llamada embrionía adventicia, losembriones surgen directamente de una célu-la somática de la nucela o de los tegumentosdel óvulo. Comúnmente se forman embrio-nes múltiples a partir de células nucelares(esporofíticas) que comparten el óvulo juntocon el embrión de origen sexual y utilizan suendospermo para desarrollarse. Esta formade apomixis aparece comúnmente en los cí-tricos, los cuales se convirtieron en un siste-ma modelo para estudiar el proceso. En laapomixis gametofítica se forman siempresacos embrionarios que difieren en algunosaspectos del gametófito femenino haploide(n) generado a partir de la megáspora fun-cional. Su principal diferencia es precisamen-te el hecho de ser diploides (2n) ya que losnúcleos que los conforman no han pasadopor el proceso meiótico y por lo tanto no hanreducido su contenido de ADN. Por eso sedice que estos sacos embrionarios o

megagametófitos surgen por un proceso deapomeiosis (apo: prefijo griego de significa-ción negativa). De acuerdo con el origen dela célula que genera al saco embrionario y alembrión, la apomixis gametofítica puede serclasificada como: diplosporía, cuando el sacoembrionario se origina a partir de la célulamadre de la megáspora misma ya sea pormitosis o luego de una falla en la meiosis oaposporía, cuando el saco embrionario seorigina directamente por mitosis a partir deuna célula somática, usualmente una célulade la nucela. Los sacos embrionarios, seanéstos apospóricos o diplospóricos, contienenun gameto femenino 2n, la ovocélula, a par-tir de la cual se desarrolla directamente elembrión por partenogénesis sin que existafecundación. Así, mientras en el procesosexual la reducción meiótica se complemen-ta con la fecundación que restaura el nivelde ploidía 2n, en la apomixis gametofítica laausencia de reducción se complementa conla partenogénesis. La apomixis gametofíticafue estudiada más profundamente que laapomixis esporofítica, principalmente por

Figura 1: La rutas biológicas de la reproducción sexual y apomíctica. Durante la sexualidad una célula de lanucela del óvulo se diferencia como célula madre de la megáspora y luego de sufrir un proceso de meiosis da origena cuatro megásporas haploides. Tres de estas megásporas degeneran y la cuarta da origen a la formación de un sacoembrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los núcleos celulares están reducidos (n). La ovocélula y losnúcleos polares del saco son fecundados por los núcleos generativos del polen para generar el cigoto y el núcleoprimario del endosperma, respectivamente. El cigoto da origen al embrión a través de sucesivas mitosis. La apomixisconsiste en la formación de un embrión a partir de una célula no reducida (que no ha sufrido mitosis). En algunoscasos hay formación de un megagametofito con células no reducidas, cuya ovocélula (2n) genera un embrión porpartenogénesis (apomixis gametofítica). En otros casos el embrión es generado directamente a partir de una célulade la nucela en un proceso similar a la embriogénesis somática (embrionía adventicia).

Célula madre de la megáspora

Células somáticas

Meiosis

Mitosis o meiosis modificadaMitosis

Megagametofitono reducido (2n)

División autónoma ofe

cund

ació

n

Mitosissin

fecu

ndació

n

Megasporashaploides (n)

Megagametofito reducido (n)

Doble fecundación

Granode polen

Endosperma

Embrión

Mito

sisso

mática

Esporofito (2n)

Mitosis

Mitosis


ser el tipo presente en las gramíneas, dondemuchas especies con valor agronómico pre-sentan este modo de reproducción. Un es-quema de las diferentes rutas posibles quepuede tomar la apomixis se muestra en laFigura 1.

Recordemos que en las angiospermasexiste una doble fecundación. En la apomixisgametofítica la partenogénesis excluye unode los procesos de la doble fecundación: launión de los gametos masculinos con los fe-meninos. Sin embargo no necesariamente seanula la fecundación de los núcleos polares.Aunque en algunos casos el endospermopuede desarrollarse en forma autónoma (sinla unión de un gameto masculino con losnúcleos polares del saco embrionarioapospórico o diplospórico) en muchas espe-cies apomícticas, como en la mayoría de lasgramíneas tropicales, es necesario que ungameto masculino se fusione con el o losnúcleos polares de la célula central del sacoembrionario para formar el endospermo. Aeste proceso se lo llama pseudogamia.

Los sacos embrionarios diplospóricos con-servan la típica estructura de los sacosembrionarios de origen meiótico, general-

mente con siete células y ocho núcleos. Sinembargo, en la aposporia por lo general tie-nen una constitución distinta y muy variable,tanto en taxones diferentes como dentro deun mismo taxón. Por ejemplo, en gramíneastropicales o subtropicales, el saco apospóricose forma por dos mitosis consecutivas, conpermanencia de los cuatro núcleos en un solopolo celular. Así se organiza un megagame-tófito con una ovocélula flanqueada por dossinérgidas y una célula central uninucleada yextensamente vacuolizada. Esta estructurade saco apospórico fue descripta por prime-ra vez para Panicum maximum y por esa ra-zón a los megagametófitos con esta morfo-logía se los conoce como sacos apospóricosde tipo Panicum. Sin embargo, en las espe-cies apospóricas de Paspalum, un génerotambién perteneciente a la tribu Paníceasigual que Panicum, existe una característicaen la constitución de los sacos apospóricosque los diferencia netamente del tipoPanicum: en Paspalum los sacos generalmen-te tienen una célula central con dos núcleospolares y a veces tres. Esta característica esimportante porque debido a la pseudo-gamia, a veces la relación genómica mater-na/paterna del endospermo es distinta en

Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante los procesos de sexualidad y de apomixisgametofítica. En la sexualidad, la célula madre de la megáspora realiza un proceso de meiosis y genera cuatromegásporas haploides, tres de las cuales degeneran. La cuarta megáspora lleva a cabo una serie de tres divisionesmitóticas para formar un saco embrionario reducido y octanucleado. En el proceso de apomixis diplospórica lacélula madre de la megáspora realiza una serie de mitosis para generar un saco embrionario no reducido y octanucleado(tipo Antennaria) o inicia un proceso de meiosis que falla para generar un saco embrionario no reducido yoctanucleado (tipo Taraxacum). En la apomixis apospórica células de la nucela cercanas a la célula madre de lamegáspora realizan varias mitosis consecutivas para generar un saco embrionario no reducido que puede serpentanucleado (tipo Paspalum) y cuya característica más notable es la ausencia de antípodas.

Esporófito

Célulasnucelares

Célula madrede la megáspora

Esporogénesis Gametogénesis

2n

2n

2n

n

n

2n

2n

AposporíaDiplosporíaSexualidad

Gametófito

Meiosis

Meiosis modificada

Mitosis

Mitosis (tipo Paspalum)

Mitosis (tipo Taraxacum)

Mitosis (tipo Antennaria)


las plantas sexuales y en las apospóricas. Enlas sexuales, hay una relación 2/1 materno/paterno (madre n + n; padre n), mientras queen las apospóricas esa relación es general-mente 4/1 (madre 2n + 2n; padre n). EnPanicum la relación es 2/1 tanto en las sexua-les como en las apospóricas (n + n/n en lassexuales y 2n/n en las apospóricas) (Fig. 2).

2 Otros aspectos substanciales delcarácter apomixis

Hay varias características particulares deeste modo de reproducción que merecen serremarcadas. Por una parte la apomixis usual-mente no altera la formación del microga-metófito y la meiosis ocurre normalmente enlas anteras generando polen perfectamenteviable y reducido. Además, apomixis y sexua-lidad no son procesos mutuamenteexcluyentes ya que pueden aparecer simul-táneamente sacos reducidos (meióticos) y noreducidos (provenientes de apomixis) en unamisma planta, en una misma inflorescencia yaún en un mismo óvulo (Fig. 3). Una plantaapomíctica capaz de generar al menos unaparte de su progenie por medios sexuales seconoce como facultativa. Por lo tanto, en losgenotipos apomícticos facultativos las proge-

nies segregan como clases maternas (2n + 0)y no-maternas o aberrantes. Hay tres tiposdiferentes de individuos aberrantes que pue-den encontrarse en la progenie de una plan-ta apomíctica: 1) híbridos BIII (2n + n) queresultan de la fecundación de una ovocélulano reducida, 2) híbridos BII (n + n) que resul-tan de la fecundación de una ovocélula redu-cida y 3) haploides (n + 0) generados por par-tenogénesis a partir de una célula huevo re-ducida.

Por otra parte, la apomixis gametofíticase relaciona siempre con la poliploidía. Engeneral aparece en especies que presentanrazas de bajos niveles de ploidía (usualmen-te diploides) que se reproducen por sexuali-dad y otras de mayor nivel de ploidía (porejemplo tri, tetra o pentaploides) que se re-producen por apomixis. Estos complejos in-tegrados por individuos sexuales yapomícticos de distinto nivel de ploidía seconocen como «complejos agámicos» y seconsideran estructuras reproductivas comple-jas y evolucionadas donde la sexualidad per-mite la generación de nuevos genotipos y laapomixis la propagación clonal muy eficientede las combinaciones genéticas superiores.

Existen evidencias que sugieren que la di-versidad generada a niveles menores deploidía puede ser impulsada hacia los niveles

Figura 3:Microfotografías desecciones de óvulos

de razastetraploides de

Paspalum notatum.A: óvulo

conteniendo unsaco embrionariomeiótico (las dos

sinérgidas yalgunas de las

antípodas no seobservan porque

están en unasección adyacente

del corte delóvulo). B: óvulo

conteniendo dossacos embrionarios

apospóricos.Referencias: a,

antípodas; e, célulahuevo, p, núcleospolares; barra = 30

micras


poliploides por medio de eventos sucesivosde hibridización 2n + n.

3 Mejoramiento genético de especiesnaturalmente apomícticas

Algunas especies apomícticas tienen unvalor agronómico muy importante, como esel caso de varias gramíneas forrajeras, loscitrus, el mango y las fresas. Hasta el presen-te, sólo se dispone de programas de mejora-miento avanzados en algunas gramíneasforrajeras entre las que se encuentran espe-cies de los géneros Brachiaria, Cenchrus,Eragrostis, Panicum, Paspalum, Pennisetumy Poa. En principio, las plantas apomícticasfacultativas pueden ser mejoradas pormetodologías de cruzamiento convenciona-les, ya que producen al menos algunos sacosembrionarios meióticos que posibilitan la hi-bridación y selección. En cambio en losapomícticos obligados, que se reproducencompletamente o casi completamente enforma clonal, la hibridación y el análisis desegregación son impracticables. Las progeniesde tales plantas exhiben siempre el fenotipomaterno o pueden ocasionalmente aparecervariantes que probablemente surjan de mu-taciones más que de segregación sexual. Porello, la disponibilidad de individuos sexualeso con algún grado de sexualidad (apomícticosfacultativos) es un requisito fundamental parael mejoramiento de estas especies. Estos in-dividuos presentan un cierto grado de varia-bilidad como para aumentar las posibilidadesde supervivencia de la especie frente a cam-bios ambientales y aportan asimismogermoplasma útil para el mejoramiento.

Uno de los principales requisitos para lle-var adelante un programa de mejoramientode una especie apomíctica es la colección degermoplasma diverso desde las fuentes deorigen para ampliar la base genética disponi-ble e identificar introducciones sexuales o al-tamente sexuales (apomícticas facultativascon alta expresión de sexualidad). La evalua-ción de especies relacionadas es también unaalternativa importante cuando no se dispo-ne de plantas sexuales de la especie de inte-rés. Ejemplos de cruzamientos interespecí-ficos e incluso intergenéricos empleadoscomo punto de partida en programas demejoramiento se encuentran en Brachiaria,

Zea x Tripsacum y Pennisetum, entre otros.El adecuado conocimiento de la biología,

citología y modo de reproducción de los ma-teriales disponibles es asimismo un requisitofundamental para cualquier estrategia demejoramiento. Como se verá mas adelante,los estudios realizados para determinar labase genética de la apomixis en varias espe-cies de gramíneas indican que el carácter pre-senta un tipo de herencia simple, haciendoposible entonces su manipulación en progra-mas de mejoramiento una vez que son de-tectados individuos sexuales o apomícticosfacultativos. En estos casos los genotiposapomícticos obligados con características de-seables pueden ser usados como dadores depolen. Debido a que los gametos masculinosson completamente normales (reducidos) yque la mayoría de las especies apomícticasson altamente heterocigotas, los cruzamien-tos entre individuos sexuales (utilizados comoprogenitores femeninos) y apomícticos (em-pleados como dadores de polen) puedenconducir a la generación de progenies F

1 va-

riables donde es posible seleccionar. Hay quetener en cuenta que si bien son necesariosindividuos sexuales o con adecuada expresiónde sexualidad para realizar las cruzas, en elmomento de la selección habrá que usar elcriterio contrario, es decir, seleccionar por unalto grado de expresión de la apomixis. Estoconducirá a la obtención de variedades esta-bles. El objetivo final de un programa demejoramiento de una especie apomíctica enel cual ha sido posible obtener recombinacióngenética es la identificación en la poblaciónsegregante de los genotipos superiores, conreproducción completamente (o casi comple-tamente) apomíctica que puedan ser trans-formados en cultivares mediante su multipli-cación por semillas. El camino no es sencilloporque en cada generación es necesario dis-tinguir en la progenie, cuáles son los indivi-duos generados por sexualidad y cuales porapomixis. Dentro de los generados por sexua-lidad, habrá que seleccionar los que al mis-mo tiempo posean las mejores característi-cas agronómicas y presenten un alto gradode expresión de la apomixis. Otro aspecto atener en cuenta es el nivel de ploidía de losprogenitores que serán empleados en los cru-zamientos. Los primeros estudios de hibrida-ción indicaron la necesidad de realizar cruzas


entre especies sexuales y apomícticas con elmismo nivel de ploidía ya que varios inten-tos realizados entre diploides sexuales ypoliploides (en general tetraploides)apomícticos condujeron a la generación deprogenies estériles.

En las gramíneas tropicales y subtropicalesse ha hecho un buen uso del carácter en elmejoramiento, especialmente en la domes-ticación de algunas especies. Dos grandes lí-neas de trabajo han sido llevadas adelanteen estos programas: 1) la selección de losmejores genotipos naturales partiendo deuna amplia colección de germoplasma y es-tudiando características como la productivi-dad de materia seca, calidad, adaptabilidadal cultivo y a distintas condiciones ambienta-les, capacidad de producción de semilla ypersistencia al pastoreo. Esta selección pue-de llevarse a cabo entre diferentes especieso dentro de la misma especie, considerandocuáles son los mejores genotipos entre dis-tintas poblaciones apomícticas disponibles.Hay numerosos ejemplos de cultivares depastos forrajeros apomícticos que se mejo-raron usando este tipo de selección. Así seobtuvieron todas las variedades apomícticascultivadas de Paspalum, Brachiaria, Panicum,Themeda y Melinis. Tomando como ejem-plo a Paspalum, en primer lugar se seleccio-naron algunas especies como P. notatum(apomíctico, 4X), P. dilatatum (apomíctico,5X), P. plicatulum, P. atratum, y luego se eli-gieron algunos ecotipos por sus cualidadesagronómicas y su adaptabilidad al cultivo. Enel sur de los Estados Unidos se han populari-zado algunas variedades tetraploidesapomícticas de P. notatum (Argentine, Para-guay, Wilmington, Tifton 7 y otras). Tambiénse cultivan algunas variedades apomícticas deDallisgrass (P. dilatatum) seleccionadas de lamisma manera. En nuestro país se cultivarondurante mucho tiempo dos variedadesapomícticas de P. guenoarum: el Pasto Ro-jas y el Pasto Ramírez, seleccionadas por estemismo método en Paraguay. Recientemen-te se han inscripto otras dos variedades quehan sido seleccionadas en la Facultad de Cien-cias Agrarias de la Universidad Nacional delNordeste: el Pasto Cambá (P. atratum) y elPasto Chané (P. guenoarum); 2) la segundaposibilidad de mejoramiento (en la que aúnse ha avanzado poco) consiste en realizar

cruzamiento con genotipos sexualespoliploides naturales, que son muy raros. Unbuen ejemplo de esto es son las variedadesNueces y Llano de Buffelgrass (Pennisetumciliaris) desarrolladas en USA en la décadadel 70 a partir de cruzamientos entre una raraplanta tetraploide sexual (natural) con plan-tas apomícticas tetraploides (que son las co-munes en esta especie). También se han con-seguido obtener plantas tetraploides sexua-les por duplicación cromosómica de una plan-ta sexual diploide. Mediante este tipo de tra-tamientos se han generado tetraploidessexuales en B. ruziziensis y P simplex, P.notatum y P. hexastachium. La disponibili-dad de estas plantas, además de facilitar losplanes de cruzamientos, permitió la realiza-ción de estudios detallados de la herencia delcarácter apomixis en ambos géneros. Actual-mente se están llevando a cabo programasde mejoramiento que utilizan esta estrate-gia para Paspalum y Brachiaria, aunque aúnno se ha inscripto ninguna variedad nueva.

4 Usos potenciales de la apomixis en elmejoramiento de plantas naturalmentesexuales

La ausencia de recombinación durante lamegagametogénesis y de fecundación de laovocélula por un gameto masculino posibili-ta la generación de embriones que presen-tan una constitución genética idéntica a lade la planta madre. La apomixis es un carác-ter utilizable en el mejoramiento de plantasy la producción de alimentos, ya que puedeser percibida como una herramienta venta-josa para la estabilización de genotipos su-periores y la fijación combinaciones híbridas.En teoría cualquier combinación genética quelleve los factores determinantes de laapomixis podría ser mantenida y multiplica-da como una réplica exacta por innumera-bles generaciones vía semillas. La perspecti-va de clonar genotipos superiores híbridospodría representar una ayuda importantepara los productores agropecuarios de lospaíses en desarrollo, permitiéndoles sosteneraltos rendimientos año tras año usando par-te de las semillas cosechadas sin pérdidas enla producción debidas a la segregación. En-tre otras ventajas, la expresión de la apomixisreduciría al mínimo el aislamiento físico reque-


rido para preservar líneas genéticashomocigotas. Podrían ser obtenidos y pro-pagados fácilmente nuevos híbridos interes-pecíficos e intergenéricos, permitiendo eldesarrollo de genotipos mejor adaptados alos distintos ambientes. Asimismo podríafacilitarse el uso de transformantes conside-rando que una planta transgénica apomícticafijaría inmediatamente el nuevo carácter y seconvertiría en un cultivar luego de su multipli-cación.

5 El control genético de la apomixis

La apomixis es un carácter heredable,pero su control genético no fue aún comple-tamente esclarecido. Tradicionalmente seconsideró que sus determinantes básicospodrían haberse originado por mutación yque la mayoría de los otros genes invo-lucrados son similares a los de la sexualidad.A pesar de su amplia distribución en lasangiospermas, el carácter no es muy comúnen los cultivos mayores o en sistemas mode-los. Esta condición forzó a que los estudiosen este campo deban ser realizados en es-pecies silvestres que son poliploides, altamen-te heterocigotas y con una pobre caracteri-zación genética. La disección de las basesgenéticas del carácter es por lo tanto dificul-tosa y compleja. Los estudios deherencia sólo son posibles si pue-den cruzarse progenitores comple-tamente sexuales y apomíc-ticos yla progenie F

1 segregante puede

ser examinada por métodoscitoembriológicos. Alternativamen-te, el análisis de progenies usandomarcadores moleculares, puede serempleado como un indicador de latasa de plantas con genotipo ma-terno formadas por cada uno delos híbridos F

1. En las cruzas de este

tipo (que pueden ser intra ointeres-pecíficas) se utiliza unpoliploide sexual natural o genera-do artificialmente como planta ma-dre, mientras que un genotipoapomíctico contribuye como dadorde polen. Los diferentes estudiosdesarrollados en las gramíneas co-inciden en señalar que tanto laaposporía como la diplosporía pa-

recen estar controladas por un único locusen donde un gen mayor dominante o un gru-po de genes ligados y coadaptados, que fun-cionan como una sola unidad genética a cau-sa de una fuerte supresión de larecombinación, son los responsables de laexpresión del carácter. El modelo genéticomás simple propuesto para especiestetraploides de Panicum y Brachiaria, supo-ne que la constitución genética de las plan-tas sexuales sería del tipo nuliplexo (aaaa)mientras que los individuos apomícticos se-rían uniplexos (Aaaa), siendo A el alelo do-minante responsable de la apomixis. Los cru-zamientos de individuos de este tipo gene-ran progenies F

1 que segregan en una rela-

ción 1:1 (sexuales vs. apomícticos). Sin em-bargo, en este modelo existen ciertas cues-tiones que no han sido resueltas. Por ejem-plo en el caso de Panicum maximum (que esuna especie apomíctica facultativa) si bien sepostula que las plantas apomícticas sonuniplexas (Aaaa) hasta ahora no se han en-contrado en la naturaleza plantas completa-mente sexuales (aaaa). Esta situación se re-pite en otras especies apomícticas. Tampocose puede explicar el hecho de que siempreque se utilizó como polinizador a una plantaapomíctica ésta resultó ser un genotipo Aaaa.¿Cómo es posible que el genotipo uniplexo

Figura 4: Los estudios con marcadores moleculares permiten lalocalización del locus que controla la apomixis. A la izquierda semuestra un gel de AFLP obtenido durante la construcción del mapagenético de Paspalum notatum. A la derecha vemos la regióngenómica que contiene al locus responsable de la apomixis (apo-locus) definida por marcadores moleculares, varios de los cualessegregan completamente ligados al apo-locus y evidencian una fuerterestricción de la recombinación (tomado de Martínez et al 2003).


sea el único existente en las poblacionesapomíc-ticas, cuando la especie no es com-pletamente apomíctica?. El modelo tampo-co es aplicable a otras especies como las in-cluidas en el género Paspalum, en donde laregión genómica involucrada parece estarasociada con algún factor letal que afectaparte de los gametos masculinos (Fig. 4).

6 Transferencia del carácter apomixis aespecies de interés agronómico

Aunque desde el punto de vista del me-joramiento genético la apomixis puede con-siderarse como un sistema que restringe larecombinación genética, esta forma de repro-ducción constituye una herramienta únicapara desarrollar cultivares superiores y preser-var combinaciones híbridas indefinidamente.Por ello la transferencia del carácter a las es-pecies cultivadas ha sido perseguida desdehace tiempo. Básicamente se consideran tresgrupos generales de procedimientos para latransferencia potencial de la apomixis a es-pecies sexuales: i) hibridización clásica entreuna planta sexual y un pariente apomícticonatural; ii) iniciación de la expresión de laapomixis por experimentos de bloqueo degenes (mutantes T, etiquetado transpo-sicional, mutagénesis); iii) transformación decultivares sexuales con genes que controlanla expresión del carácter. Las dos primerasaproximaciones ya fueron intentadas, aun-que los proyectos no han sido exitosos has-ta el momento, mientras que la tercera op-ción todavía continúa siendo hipotética. Losprimeros experimentos dirigidos a introducirla apomixis a través de cruzamientos fueronrealizadas cerca de 40 años atrás por D. F.Petrov, quien realizó hibridaciones entre maízy razas tetraploides de Tripsacumdactiloydes (una especie diplospórica tam-bién perteneciente a la tribu de laAndropogóneas igual que el maíz). Posterior-mente otros grupos de investigación produ-jeron híbridos interespecíficos de maíz-Tripsacum que se reproducen por apomixis.Sin embargo, como los genotipos obtenidosluego de una serie de retrocruzas con maízson completamente macho-estériles, el pro-greso en la recuperación del genoma de estaespecie está fuertemente asociado con laposibilidad de generar híbridos con algún gra-

do de reproducción sexual (apomícticos fa-cultativos). La imposibilidad de generar estetipo de individuos es la principal dificultad queenfrenta este sistema. Una dificultad adicio-nal es el fuerte requerimiento de una rela-ción 2:1 en el número de genomas haploidesmaternos y paternos que contribuyen a laformación del endospermo en maíz. Estosproblemas han demorado el progreso de laintroducción de la apomixis en maíz en losúltimos años. La transferencia de la apomixisal mijo perla (Pennisetum glaucum) desdeP. squamulatum por un programa de mejo-ramiento iniciado al final de los 70 es consi-derado el más avanzado de su clase. En esteesquema las retrocruzas con Pennisetumglaucum han avanzado hasta la generaciónBC

7, mediante la selección de grandes pro-

genies para identificar individuos apomícticosparcialmente macho fértiles. Estas plantasson morfológicamente muy parecidas al mijoperla, aunque producen un bajo número desemillas viables. Este hecho estaría vinculadoa la formación del endospermo y es un in-conveniente que aún resta resolver.

En resumen, la factibilidad de la transfe-rencia está aún por demostrarse. Los princi-pales obstáculos son: equilibrar el balanceendospérmico y lograr la expresión de laapomixis a nivel diploide. Aquí se debería lo-grar, seguramente a través de un esfuerzomultidiciplinario internacional, un conoci-miento profundo de la relación entre la ex-presión de la apomixis y la poliploidía, espe-cialmente de la autopoliploidía. En gramíneasde la subfamilia Panicoideas (Paspalum,Panicum, Tripsacum, Brachiaria, Melinis yotras) es posible que el sistema apomícticodifiera del que existe en Pooideas (Poa,Elymus y otras). Son necesarios conocimien-tos básicos más profundos de la embriologíade especies silvestres con sistemasapomícticos, para determinar qué género oqué especie son los más adecuados comofuente para obtener los genes que podríanutilizarse hipotéticas transformacionesgenéticas que permitan usar la apomixis enlos cereales.

Los intentos para generar mutantesapomícticas inactivando genes de la sexuali-dad por etiquetado transposicional omutagénesis no han tenido éxito aún en re-


crear el carácter pero permitieron la identifi-cación de varios genes involucrados en el con-trol de etapas particulares de su desarrollo,como la proliferación del endospermo enausencia de fertilización. La transformacióngenética de cultivares sexuales con genes quecontrolan el inicio del carácter es aún hipoté-tica, ya que la identificación de esos genesno se ha logrado.

7 Caracterización molecular de laapomixis

En los últimos años la tecnología de mar-cadores moleculares y los procedimientos debiología molecular han generado una canti-dad considerable de conocimientos nuevossobre las bases moleculares de la apomixisque pueden ser útiles para el futuro aislamien-to del/los genes que controlan el carácter.Han sido identificados varios marcadores quecosegregan con la apomixis en distintos gé-neros de gramíneas como Tripsacum,Pennisetum, Brachiaria y Paspalum. Estosmarcadores ligados al carácter pueden em-plearse en el estudio de la transmisión delmismo en los programas de mejoramientode especies apomícticas y eventualmente in-tentar cualquiera de las estrategias declonado basadas en el mapeo genético paraaislar el/los disparadores del fenómeno. Elanálisis molecular posibilitó la identificaciónde una región genómica específica de laaposporía (ASGR) en Pennisetumsquamulantum que está ausente en indivi-duos sexuales y donde la recombinación estáseveramente restringida. En Tripsacumdactyloides, Paspalum simplex y Paspalumnotatum se detectaron regiones similares endonde numerosos marcadores aparecencompletamente ligados al carácter (ver figu-ra 4). La ausencia de recombinación bien po-dría estar asociada a una estrategia para evi-tar la dispersión de los factores que necesi-tan cosegregar estrictamente para determi-nar la apomixis. La existencia de una regiónASGR de baja recombinación puede enmas-carar la presencia de varios genes que gobier-nan al carácter, haciéndolos aparecer y fun-cionar como una sola unidad genética. Unacaracterización molecular detallada de estesegmento cromosómico revelará en el futu-ro la variedad y el número de genes

involucrados. Dado que varios elementos di-ferencian a la apomixis de la sexualidad(apomeiosis, partenogénesis, pseudogamiay a veces desarrollo autónomo delendospermo) la cuestión de si la apomixis esconsecuencia de la expresión de un solo genmayor o de un grupo de factores ligados ycoadaptados es uno de los problemas a re-solver en el futuro cercano.

Varios trabajos recientes enfocados enestudios de expresión han informado el ais-lamiento de transcriptos de mRNA específi-cos del desarrollo apomíctico en variasgramíneas La mayoría de los transcriptos ais-lados hasta el momento no muestran simili-tudes con genes de función conocida. EnPaspalum notatum se identificó una familiagénica de expresión aumentada en flores deplantas apospóricas cuyo producto proteicopresenta sitios de control por el complejo decdc2 ciclinas típicos de proteínas delcitoesqueleto. Asimismo, por comparacionesde los perfiles proteicos en geles de dos di-mensiones se identificó una a tubulina carac-terística de líneas partenogenéticas. Análisisde expresión de este tipo pueden conduciren el futuro a la identificación y el clonadode genes involucrados en las primeras eta-pas del desarrollo apomíctico y al eventual-mente al aislamiento del disparador mismode la apomixis.

8 Perspectivas

A pesar de que aún necesitan ser respon-didas numerosas cuestiones sobre la acciónde genes, la función y la regulación de laapomixis, se vislumbra para el futuro un es-cenario promisorio. Nuestro entendimientode las bases moleculares de la apomixis se haincrementado a causa del desarrollo de téc-nicas poderosas de biología molecular y alcreciente interés en el tema despertado enlas instituciones científicas e investigadores.Por otra parte, con el advenimiento del aná-lisis genómico a gran escala se dispone denuevas herramientas para el descubrimientode genes y los análisis de expresión. Los re-sultados obtenidos hasta ahora han contri-buido al mejoramiento de las especiesapomícticas, muchas de las cuales son recur-sos naturales importantes y al uso de las ven-tajas intrínsecas de este modo de reproduc-


ción en la generación de variedadesmejoradas, como es el caso de las gramíneasforrajeras tropicales y subtropicales. Es deesperar que en los próximos años el conoci-miento de las bases genéticas y molecularesdel carácter se incremente considerablemen-te. Esto hará posible la comprensión delmecanismo biológico responsable de laapomixis, así como su transferencia a las es-pecies de gran cultivo. Para esto se requeriráun fuerte apoyo financiero a los estudiosbásicos sobre el tema. Por otra parte, dadoque la problemática del carácter es muy com-pleja será indispensable fortalecer la coope-ración internacional ya existente para man-tener un espacio de discusión y de intercam-bio de materiales e información.


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293

VIII.-Capítulo 4

Técnicas de ingeniería genética paraconferir resistencia a virus en plantas

del Vas, M.; Distéfano, A.J.; Vazquez Rovere,C.; Hopp, H.E.

1 Introducción

Las enfermedades de las plantas causanla pérdida de aproximadamente el 15% dela producción agrícola mundial. En particular,las infecciones virales producen perjuicioseconómicos significativos de manera directa,a través de una disminución del rendimientopor efecto de la enfermedad e indirecta, através de un incremento en los costos debi-do a la utilización de semilla libre de virus(por ejemplo, en plantas de propagaciónclonal como papa, ajo y batata). Por otrolado, la exportación de ciertos productos seve restringida debido a las limitaciones inter-nacionales impuestas a la exportación demateriales fuera de la calidad y toleranciafitosanitaria permitidas.

Clásicamente, las enfermedades virales enplantas se controlan mediante distintas es-trategias como el mejoramiento genético,el uso de semillas libres de virus, la rota-ción de cultivos y la técnica de proteccióncruzada (que se describe brevemente másadelante).

A partir de 1983, cuando Fraley y col. ob-tuvieron plantas de tabaco y petuniatransgénicas, se publicó un gran número detrabajos detallando la transferencia de genesforáneos a una cantidad creciente de espe-cies de plantas. La ingeniería genética permi-te incorporar en las plantas nuevos caracte-res de interés agrícola en forma horizontal,evitando así el traspaso de caracteres inde-seables. De esta forma, la variedadtransgénica adquiere un carácter nuevo altiempo que mantiene intactos el fondogenético y el potencial productivo original, loque permite encarar el mejoramiento rápi-do de cultivares ya utilizados por el agricul-tor. Los transgenes introducidos pueden pro-venir de otras variedades de la misma espe-cie vegetal, de plantas de otras especies

sexualmente incompatibles e incluso de or-ganismos pertenecientes a otros reinos in-cluyendo animales y microorganismos.

En sentido amplio existen dos formas demodificar plantas por ingeniería genética demanera de conferirles resistencia al virus: des-encadenar resistencia mediante la expresiónde secuencias genómicas derivadas del pro-pio virus al que se desea combatir (llamadaresistencia derivada del patógeno o PDR)o desencadenar resistencia mediante la ex-presión de genes no-virales que poseenactividad antiviral.

2 Resistencia a virus conferida por genesvirales

La prevención del desarrollo de enferme-dades virales utilizando genes derivados delpatógeno fue propuesta por primera vez acomienzos del siglo XX, cuando se demostróque las plantas de tabaco podían ser prote-gidas frente a la infección con una cepa seve-ra del virus del mosaico del tabaco (Tobaccomosaic virus o TMV) si, previamente, se lashabía inoculado con una cepa menos virulen-ta del mismo virus (McKinney, 1929). Estetipo de estrategia, comúnmente denomina-da «protección cruzada», ha sido emplea-da para varios cultivos de importancia eco-nómica, incluyendo tomate, papaya, cítricos,etc. (Gadani y col., 1990). En 1985, Sanford yJohnston propusieron que la expresión deciertos genes del patógeno en un hospe-dante alteraría el balance normal de los com-ponentes virales y predijeron que esto con-duciría al impedimento de la replicación o delmovimiento del virus dentro de la planta másallá de la primera célula infectada (Sanford &Johnston, 1985).

Las primeras plantas transgénicas conresistencia a virus se obtuvieron en 1986mediante la expresión del gen que codificapara la cápside del TMV (Abel y col., 1986).Utilizando esta estrategia se logró obtenerplantas resistentes a virus pertenecientes acasi todos los géneros de virus de plantas,principalmente en tobamo-, potex- yalfamovirus (Tabla 1).

En general, las plantas protegidas mues-tran un retardo temporal del desarrollo desíntomas, una atenuación en la sintoma-tología característica de cada virus en parti-

294

cular, una menor cantidad de sitios de infec-ción y un menor título viral. Se demostró quehay una correlación entre la resistencia y elnivel de expresión de la proteína de lacápside, que la protección actúa en el pla-no celular y es superada por altas dosis deinóculo (viriones). En algunos casos es su-perada por inoculación con ARN viral.

La protección es más efectiva para el vi-rus homólogo al que dio origen al transgén.Sin embargo, abarca también a virus y cepasrelacionadas aunque la eficiencia se va redu-ciendo a medida que la relación filogenéticase hace más lejana.

Además, se logró obtener resistencia avirus mediante la expresión de otras proteí-nas virales tales como las proteínas respon-sables de la multiplicación viral (por ejem-plo ARN polimerasas dependientes de ARN)y las proteínas responsables del movimien-to viral de célula a célula disfuncionales. Es-

tas estrategias no sedetallarán debido aque actualmente hayevidencias de que envarios casos su efecti-vidad se debe a la in-ducción del mecanis-mo de resistenciamediada por ARNque se describe a con-tinuación.

En 1992 se de-mostró, por primeravez, que se podíaobtener resistencia avirus mediante la ex-presión de un ARNmde cápside viral notraducible, es decir,no era necesaria laexpresión de la pro-teína codificada porel transgén (Lindbo& Dougherty, 1992).A partir de entoncesse publicaron nume-rosos trabajos pro-fundizando la carac-terización de estetipo de resistencia avirus, llamada en sen-tido amplio «resis-tencia mediada por

ARN». Las plantas que muestran este tipode resistencia presentan un fenotipo de in-munidad que se caracteriza porque no hayreplicación viral detectable, no hay disemina-ción viral dentro de la planta y no hay sínto-mas debido a la enfermedad, o un fenotipode recuperación que se caracteriza por unainfección inicial (con producción de síntomas)que es seguida por un crecimiento posteriorresistente a la infección y asin-tomático. Encualquiera de los dos casos, las plantas sonsolamente resistentes a la infección produci-da por virus mucho más estrechamente rela-cionados con el virus que dio origen altransgén que en el caso de protección me-diada por cápside. El análisis de estas plan-tas en el plano molecular demostró que engeneral contienen copias múltiples deltransgén y que si bien presentan un alto ni-vel de transcripción en el núcleo, los nivelesestables del ARNm del transgén en el cito-plasma son muy bajos. Usualmente se ob-

Géneros devirus

transgén Virus Especies vegetales

Tobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate

Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco

Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV;MDMV; SMV; WMV II;

ZYMV

tabaco; papa; papaya;maíz

Carlavirus CP PVS tabaco; papa

Luteovirus CP PLRV papa

Comovirus CP SLRSV tabaco

Nepovirus CP ArMV tabaco

Tobravirus CP TRV tabaco

Ilavirus CP TSV tabaco

Geminivirus CP TYLCV tomate

Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco

Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresión de la proteína de cápside(CP) o nucleocápside (Gen N) viral en plantas transgénicas.

Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV:Arabis mosaic virus; CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus;GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV: Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maizedwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum pox virus; PRV: Papayaringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV:Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomatochlorotic spot virus; TEV: Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV:Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus; TSV: Tobacco streak virus; TSWV:Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV: Whiteclover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellowmosaic virus.

295

serva además metilación de la regióncodificante del transgén.

2.1 Mecanismo de protección debida a laexpresión de la proteína de cápside viral(CP)

Como se mencionó, las primeras plantastransgénicas con resistencia a virus se obtu-vieron mediante la expresión del gen quecodifica para la cápside del TMV. Estas plan-tas resultaron resistentes a la inoculación conpartículas virales de TMV pero la resistenciaera sobrepasada si se las inoculaba con ARNviral infectivo. Se postuló entonces que laprotección se debía a la inhibición deldesnudamiento viral en las células infectadasinicialmente. Varias líneas de evidencia apo-yan esta hipótesis. Por ejemplo si se inocu-lan protoplastos derivados de plantastransgénicas que expresan la CP de TMV oplantas no transformadas con pseudo-viriones (partículas formadas por la CP viralque contienen en su interior un ARNm noviral) de TMV que contienen ARNm que co-difica para la enzima indicadora glucu-ronidasa (GUS), se observa que hay una mar-cada disminución de la actividad GUS en losprotoplastos derivados de las plantastransgénicas. Esto se debe probablementea la falla en el desnudamiento de los viriones(Osbourn y col., 1989). Más adelante se de-mostró que las proteínas de cápsidemutagenizadas para anular la habilidad deautoagregarse no son capaces de conferirprotección frente a TMV, y que las proteínasmutantes capaces de interactuar entre ellascon afinidad más alta conferían mayor pro-tección que la proteína de cápside salvaje. Esdecir que se estableció una relación directaentre el nivel de agregación de la proteínade cápside y el nivel de protección frente aTMV (Bendahmane y col., 1997). Si bien es-tos trabajos apoyan la hipótesis de que enlas plantas transgénicas para CP hay una in-hibición en una etapa temprana de la infec-ción, no se puede descartar que, además, laexpresión de proteína de cápside impida omodifique etapas más tardías de la infección.Si se injerta una porción de plantatransgénica que muestra protección media-da por cápside entre una base y un ápice notransgénicos y se inocula la planta injertada

en la base no transgénica, se observa que elvirus no puede moverse hacia el ápice, es decirque no puede atravesar la zona transgénicaprotegida (Wisniewski y col., 1990). Sin em-bargo, la supresión del movimiento vascularinvolucra también el empaquetamiento ydesnudamiento viral, y cabe la posibilidad deque la supresión del movimiento vascular seauna consecuencia secundaria de la inhibicióndel desnudamiento viral en las plantas expre-sando proteína de cápside.

Otro caso muy estudiado es el del virusPVX de la papa. Las plantas transgénicas parala cápside de PVX resultan protegidas antela inoculación con virus o con ARN viral(Hemenway y col., 1988). Se postula que laproteína de cápside se une al origen de en-samblado localizado en el extremo 5´ delARN viral, suprimiendo de esta manera la tra-ducción de la replicasa viral (cuyo gen estálocalizado en el mismo extremo). Tambiénes posible que inhiba el movimiento de PVXde célula a célula, ya que la proteína decápside es un cofactor esencial de latraslocación sistémica (Chapman y col., 1992).

Como se desprende de los dos ejemplosdescriptos, el mecanismo de protección me-diado por la proteína de cápside no es úni-co, y es particular para cada sistema virus-plan-ta.

2.2 Mecanismo de protección debida aldesencadenamiento de resistenciamediada por ARN

Es conocido que distintos eventos detransformación obtenidos con la mismaconstrucción genética pueden dar lugar a unavariada gama de expresión del gen de inte-rés (efecto de posición). Hay muchos ejem-plos en los que la característica que uno de-sea expresar no se expresa o su expresióndesaparece a lo largo de las distintas genera-ciones. Esta pérdida de la característica de-seada (pero no del transgén correspondien-te) se denomina silenciamiento génico y elprimer ejemplo se describió en petunias parael gen de la chalcona sintetasa (Napoli y col.,1990). Dependiendo del nivel de acción en elcual ocurre el silenciamiento génico, se pue-den distinguir el silenciamiento trans-cripcional (TGS) y el silenciamiento pos-transcripcional de genes (PTGS). El TGS se

296

manifiesta por una falta de expresión delgen en cuestión debido a la metilación de laregión promotora, lo cual impide la normaltranscripción del gen. Este tipo de silencia-miento se hereda meióticamente y se des-encadena por interacción entre varias co-pias de un transgén que tienen homologíaen sus regiones promotoras. El PTGS semanifiesta por una supresión del efecto delgen en cuestión ocasionado por una degra-dación inducible y específica del ARNmtranscripto. Para desencadenar este tipo demecanismo se requiere de homología en laregión transcripcional entre los genes queinteractúan y puede estar acompañado demetilación de la secuencia de ADN codificante.Este mecanismo de degradación de ARN es-pecífico de secuencia evolucionó como unmecanismo de defensa antiviral en plantas.Si bien se describió por primera vez en plan-tas, se lo ha encontrado también en hon-

gos (donde se denomina «quelling») y ani-males como nematodos, moscas o mamí-feros (donde se lo denomina interferenciamediada por ARN). El PTGS puede ser des-encadenado eficientemente por transgenesnucleares que dan lugar a transcriptos conestructura de ARN de doble cadena (ARNdc)o que expresan altos niveles o nivelesaberrantes de transcriptos. En plantas tam-bién puede ser desencadenado por lareplicación de virus que generalmente pro-duce intermediarios replicativos de ARNdc.Una vez desencadenado el proceso, los in-termediarios que contienen ARNdc son re-conocidos por una nucleasa específica deARNdc que los procesa en fragmentos deARNs pequeños (llamados pequeñosinterferentes -«small interfering»- ARNs oARNsi) de ambas polaridades y de 21 a 25nucleótidos de longitud (Hamilton &Baulcombe, 1999). A su vez, se postula que

Figura 1: Mecanismo propuesto para la iniciación, diseminación de la señal móvil y degradación del ARNm blancodurante el proceso de silenciamiento génico postranscipcional (PTGS) dentro de una planta. RdRP: ARN polimerasadependiente de ARN.

297

los ARNsi actúan como guías para dirigir lamaquinaria de degradación de ARN contratodo aquel ARN con homología a la secuen-cia desencadenante. Un aspecto a destacares que el silenciamiento mediado por ARNes desencadenado localmente y luego trans-mitido a toda la planta vía una señal de si-lencia-miento móvil (Palauqui y col., 1997,Voinnet & Baulcombe, 1997). Si bien se des-conoce por el momento la naturaleza de laseñal, se postula que ésta contiene un com-ponente de ácido nucleico que explicaría laespecificidad de secuencia del mecanismo dedegradación y un componente proteico. Asi-mismo, por prospección genética demutantes de Arabidopsis se han identifica-do numerosos genes que codifican para unaserie de factores que intervienen en el pro-ceso de PTGS, como por ejemplo ARNpolimerasas dependientes de ARN que sin-tetizan ARNdc, proteínas que forman partede los complejos de degradación del ARNblanco, etc. Las plantas mutantes para estosgenes no son capaces de desencadenar PTGS.Recientemente se han publicado numerosasrecopilaciones del tema (Vázquez Rovere ycol., 2002, Voinnet, 2001, Waterhouse y col.,2001). En la Figura 1 se esquematiza el meca-nismo subyacente al PTGS.

Dado que el PTGS es un mecanismo dedefensa antiviral en plantas, resultaesperable que se haya seleccionado en losvirus de plantas la capacidad de contrarres-tar a este mecanismo. Congruentemente conesta especulación, se encontró que varios vi-rus de plantas codifican para proteínassupresoras del PTGS (Anandalakshmi y col.,1998, Beclin y col., 1998, Brigneti y col., 1998).Luego de una búsqueda exhaustiva de su-presores de silenciamiento en una gran can-tidad de virus de plantas, Voinnet y col., con-cluyeron que prácticamente todos los virusllevan supresores de silenciamiento, que losgenes que los codifican tienen secuencias yorigen evolutivo diversos, y que los distintossupresores actúan inhibiendo el silenciamien-to a distintos niveles (Voinnet y col., 1999).Algunos, como la proteína HC-Pro codificadapor los potyvirus previenen la acumulación delos ARNsi, pero no eliminan la señal móvil quepropaga el silenciamiento (Llave y col., 2000).Otros supresores, como la proteína p25 delvirus PVX interfieren con la señal de propa-

gación sistémica (Voinnet y col., 2000), y fi-nalmente otros, como el codificado por elvirus del achaparramiento del tomate(Tomato bushy stunt virus o TBSV), supri-men el silenciamiento sólo en las nervaduras(Voinnet y col., 1999). Incluso se han encon-trado en virus animales supresores desilenciamiento que son funcionales en plan-tas (Li y col., 2002). Es interesante destacarque varios de los supresores de silenciamientovirales descriptos habían sido previamentecaracterizados como proteínas responsablesde la sintomatología, del movimiento viral y/o del fenómeno de sinergismo en la virulen-cia combinada de dos o más virus.

La posibilidad de la supresión delsilenciamiento por parte de un virus que co-exista con las plantas transgénicas protegi-das por el mecanismo de silenciamientogénico debe ser tomada en cuenta ya que lainfección de una planta silenciada con un vi-rus heterólogo que lleva un supresor desilenciamiento puede dar lugar a la reversióndel silenciamiento tornándola susceptible ala infección viral (Beclin y col., 1998). Resultaimportante entonces estudiar qué viruscoinfectan un mismo hospedador en condi-ciones naturales y en lo posible utilizar plan-tas transgénicas con resistencia a ambos vi-rus.

Un aspecto interesante a recalcar es que,debido a que el mecanismo de PTGS implicauna muy baja acumulación del ARN derivadodel transgén y una nula acumulación de pro-teínas, la estrategia de obtener resistencia avirus mediante el desencadenamiento deeste fenómeno en plantas transgénicas esmás atractiva desde el punto de vista de laevaluación de riesgos en cuanto a labioseguridad de estos organismos genéti-camente modificados u OGMs, que la so-breexpresión de genes que interfieran con elciclo de multiplicación viral, como es el casode la cápside u otras proteínas virales. Estose debe a que la baja acumulación de ARNtransgénico minimiza las posibilidades de unapotencial recombinación homóloga con ARNde origen viral infectante. Por otro lado, laausencia de la proteína codificada por eltransgén minimiza drásticamente el análisisde riesgo alimentario del OGM y evita el ries-go de transcapsidación (la encapsidación delmaterial genético de otros virus) en el caso

298

en que el transgén codifique para la proteí-na de cápside viral funcional.

3 Resistencia a virus conferida por genesno virales

Además de la resistencia derivada delpatógeno (PDR), en los últimos años se hanexplorado estrategias alternativas para laobtención de plantas transgénicas con resis-tencia a enfermedades virales. Entre ellas sedestaca el uso de inhibidores naturales y es-pecíficos de la replicación viral como la pro-teína antiviral «pokeweed» (PAP), la expre-sión de anticuerpos en plantas o «planti-bodies», la expresión antisentido de genesde plantas esenciales para el ciclo de vida viraly la expresión de la enzima 2’-5’-oligoadenilato sintetasa de mamíferos enplantas (Truve y col., 1993). A continuaciónse describirán brevemente las dos primerasestrategias debido a que son las considera-das más promisorias.

3.1 Expresión de proteínas antivirales deorigen vegetal

Las proteínas antivirales de la plantaP h y t o l a c c aamericana (lla-mada «poke-weed» en in-glés) (PAP) con-forman uno delos grupos másimpor tante sde proteínasusadas comoinhibidores na-turales de lar e p l i c a c i ó nviral. Las pro-teínas PAPinactivan losr i b o s o m a s(pertenecen ala familia de lasRIP o proteínasinactivadorasde ribosomas)y su aplicaciónexógena pro-tege a plantas

heterólogas de infecciones virales. Se demos-tró que la expresión de esta proteína en plan-tas de papa y tabaco transgénicas las prote-gía frente a una variedad de viruses, sea queéstos fueran inoculados mecánicamente opor áfidos vectores (Lodge y col., 1993). Elestudio de esta resistencia demostró que laproteína PAP inhibía un paso temprano dela infección. Estas proteínas son potencial-mente tóxicas para la planta huésped (Wang& Tumer, 2000).

En los últimos años se encontraron orediseñaron variantes menos tóxicas o notóxicas de estas proteínas las que, expresa-das en plantas transgénicas, confieren resis-tencia a virus sin producir el efecto de lainactivación de los ribosomas (Wang y col.,1998, Zoubenko y col., 2000).

Por otro lado, se estudió la actividadantiviral de la proteína IRIP (proteína RIP ob-tenida de bulbos de iris) en plantastransgénicas de tabaco. Esta proteína es unaARN-N-glicosidasa y su expresión en plantastransgénicas no produjo cambios fenotípicosobservándose una reducción significativa delas lesiones producidas por el virus TMV conrespecto a las plantas control (Desmyter ycol., 2003).

Tabla 2: Plantas transgénicas con resistencia a virus autorizadas para su comercialización.(fuente AGBios: http://www.agbios.com/dbase.php)

299

Cultivo Virus País

ú

moscada

Los acrónimos utilizados fueron: BGMV: Bean golden yellow mosaic virus; BYDV: Barley yellow dwarf virus;CLCV: Cotton leaf curl virus; CMV: Cucumber mosaic cucumovirus; CPsV: Citrus psorosis virus; CVBMV: Chillivein-banding mottle virus; MSV: Maize streak virus; PAMV: Potato aucuba mosaic virus; PLRV: Potato leafrollluteovirus; PMV: Papaya mosaic virus; PRSV: Papaya ringspot virus; PStV: Peanut stripe virus; PVX: Potato virusX; PVY: Potato virus Y; RDV: Rice dwarf virus; RRSV: Rice ragged stunt virus; SCMV: Sugarcane mosaic virus;SMV2: Soybean mosaic virus; SPMFV: Sweet potato feathery mottle virus; TMV: Tabaco mosaic virus; TSWV:Tomato spotted wilt virus; TuMV: Turnip mosaic virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; ZAMV: Zantedeschiamosaic potyvirus. ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.

Tabla 3: Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentación en laboratorio (e) o depruebas piloto a campo (c) en países en vías de desarrollo (fuente: FAO.Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp).

300

La ventaja de expresar proteínas de tipoPAP en plantas transgénicas es que se lograresistencia a un amplio espectro de virusmediante la expresión de un único gen a di-ferencia de los métodos descriptos previa-mente que son específicos para un tipo devirus o virus cercanamente relacionados.

3.2 Expresión de anticuerpos en plantastransgénicas

Una estrategia alternativa que se comen-zó a utilizar en los últimos años es la expre-sión de anticuerpos completos o fragmentosde los mismos en plantas transgé-nicas paraobtener resistencia a virus.

En 1993 se demostró que la expresiónconstitutiva de un anticuerpo de cadenaúnica (scFv) dirigido contra la proteína decápside del virus del moteado crujiente de laachicoria (Artichoke mottled crinkle virus)causaba una reducción en la susceptibilidadal virus, que se ponía de manifiesto por unabaja en la incidencia de la infección y un re-traso en la aparición de los síntomas(Tavladoraki y col., 1993). En 1996 se expre-só un anticuerpo monoclonal de cadenaúnica (scFv) contra la proteína de cápside delvirus de la vena necrótica amarillenta de laremolacha (Beet necrotic yellow vein virus)en Nicotiana benthamiana (Fecker y col.,1996) y en el 2000, Schillberg y col. mostra-ron que la expresión de la cadena Fv contrala proteína de cápside del virus TMV en lamembrana plasmática de plantas de tabacotransgénicas confería resistencia al virus(Schillberg y col., 2000). Hasta el momentose desconoce el mecanismo por el cual la ex-presión de anticuerpos o fragmentos de losmismos confiere resistencia a virus, pero sedemostró que para que la estrategia seaefectiva es indispensable lograr altos nivelesde expresión y que los anticuerpos se expre-sen en el compartimento celular donde ocu-rre la replicación viral para que ésta seainhibida en forma efectiva. Por último, losanticuerpos deben seleccionarse correcta-mente para que bloqueen los pasos crucialesen la replicación o transmisión del virus. Enlos últimos años se han desarrollado proto-colos sencillos para mejorar los anticuerpos autilizar, que incluyen la selección deanticuerpos monoclonales usando las tec-

nologías de hibridoma y construcción degenotecas utilizando la técnica de exhibiciónde epitopes en bacteriófagos o «phage dis-play» (Schillberg y col., 2001). Es importantedestacar que los anticuerpos monoclonalesque reconocen a la polimerasa viral o algunaotra proteína viral con actividad catalítica, sonmás promisorios que los que reconocen pro-teínas estructurales como es el caso de lacápside viral. Por lo tanto, la expresión deanticuerpos dirigidos contra proteínas viralesesenciales podría proveer una alternativa in-teresante para obtener resistencia a virus.

4 Plantas transgénicas con resistencia avirus cultivadas comercialmente o enetapas avanzadas de experimentación

En los últimos años se ha autorizado elcultivo comercial y consumo de una variedadde plantas transgénicas con resistencia a vi-rus basada en alguno de los mecanismosdescriptos (Tabla 2).

Existe otro grupo muy importante deplantas transgénicas con resistencia a virusque se encuentran en etapas avanzadas deexperimentación o de pruebas piloto a cam-po. Es interesante constatar que los paísesen vías de desarrollo han adoptado esta tec-nología y trabajan activamente en la obten-ción de plantas de cultivos de interés localcon resistencia a virus (Tabla 3).


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VIII-Capítulo 5

Obtención de plantas libres de virus

Conci, Vilma C.

1 Eliminación de virus

Los virus de plantas son responsables deimportantes pérdidas en los rendimientos,llegando en algunos casos a ser limitantespara el cultivo.

La mayoría de los virus no se transmitenpor semilla, por lo tanto, las especies que semultiplican por esta vía tienen la posibilidadde liberarse de ellos en forma natural.

Por otra parte, cuando las especies quese propagan exclusivamente en formaagámica son infectadas sistémicamente porvirus ellos son transmitidos, con alta eficien-cia, desde la planta madre a la descenden-cia. Esta situación. que es normal en especiesque se multiplican por bulbos, tubérculos,esquejes o estacas permite que la infeccióncontinúe de generación en generación y sedisemine a diferentes regiones a través delcomercio de estos propágulos. Ejemplo deello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pe-pita, yuca, papa, batata y numerosas espe-cies ornamentales. En estos casos, la obten-ción y multiplicación de plantas libres de vi-rus por medios artificiales juega un papel im-portante para mejorar la producción y cali-dad de estas especies. Existen numerososejemplos respecto a los beneficios obtenidoscomo consecuencia del empleo de plantas li-bres de virus, no sólo por los incrementos enla producción sino que además ha permitidola recuperación de áreas de cultivo que ha-bían sido prácticamente abandonadas.

Una larga lista de especies han sido libe-radas de virus a través de la regeneración deplantas in vitro. El sistema más frecuente-mente utilizado y con mayores éxitos es elcultivo de meristema, suplementado en mu-chos casos por tratamientos de termoterapiao quimioterapia.

1.2 Cultivo de meristemas

Esta técnica consiste en aislar elmeristema y sembrarlo en un medio de culti-vo adecuado que posibilite el desarrollo de

una planta completa.El término cultivo de meristema, por lo

general, no es correctamente empleado, yaque en la mayoría de los casos se siembra eldomo meristemático acompañado por unoo dos primordios foliares. El domo es unaestructura de menos de 0,1 mm de diáme-tro muy difícil de extraer con éxito en formaaislada, y de la cual resulta con frecuencia com-plicado obtener plantas completas. Para elloes necesario un medio de cultivo con unaconcentración de nutrientes muy equilibra-da y condiciones ambientales muy estrictas.Por consiguiente los resultados en ese senti-do han sido muy pobres. Por esta razón, enla mayoría de los casos, se utiliza el domoacompañado de uno ó más primordiosfoliares. Tal vez lo más aconsejable sería utili-zar el término cultivo de «yema», o «brote»,o «tallo». A pesar de ello, en este capítuloutilizaremos la denominación cultivo demeristema por ser esta la terminología másdifundida, aunque no sea estrictamente co-rrecta.

En general se considera que las plantasprovenientes del cultivo de meristema sonidénticas u homólogas a la planta madre dedonde se extrajo el explanto. Por el contra-rio, las plantas derivadas de otros tejidoscomo callos, nucela, primordios florales oprotoplastos, usualmente presentan distin-tos grados de variabilidad. Esto último no esdeseable para la producción de plantas libresde virus, donde el objetivo que se persiguees mejorar la sanidad de la planta pero con-servar el resto de sus característicasagronómicas.

Sin embargo, es importante aclarar quehan sido señaladas ciertas mutaciones enplantas provenientes de cultivo demeristema, pero con mucha menos frecuen-cia y menos importantes que las detectadascon otros sistemas de obtención de plantasin vitro.

El cultivo de meristema ha sido utilizadocon éxito para distintos objetivos, entre elloslos más frecuentes son la rápida clonación dematerial deseable (micropropagación), con-servación de germoplasma a baja tempera-tura o criopreservación y para la obtenciónde plantas libres de patógenos sistémicos,entre ellos los virus, que son el objetivo deeste capítulo.

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2 Distribución de los virus en la planta

Los virus en la planta no están uniforme-mente distribuídos. En las infeccionessistémicas algunos están limitados al floemao a pocas células parenquimáticas adyacen-tes; otros involucran a todas, o casi todas,las células de la planta. Existen otros virus quedejan sectores de tejidos sin infectar y sólounos pocos invaden los nuevos tejidosmeristemáticos.

Los meristemas suelen tener pocos o nin-gún virus. Las razones para que ello ocurrano están esclarecidas completamente perose mencionan como posibles las siguientes:

1.- Sistema vascular poco diferenciado. Losvirus son rápidamente transportados a lo lar-go de toda la planta por el floema y así sedistribuyen sistémicamente. Los meristemasno tienen tejido vascular formado, por lotanto, el avance es solamente a través delmovimiento célula a célula. Se comprobó queel Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potatovirus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el teji-do vascular y 5 a 15 µ/h de célula a célula. Poresta razón se supone que las célulasmeristemáticas no están completamente in-vadidas por virus cuando están en activo cre-cimiento.

2.- Elevada actividad metabólica.Presumiblemente es más difícil para un virusinvadir células con elevada actividadmetabólica, como es el caso de las célulasmeristemáticas, donde tiene lugar una acti-va mitosis.

3.- Elevadas concentraciones de auxinas.Se ha observado que elevadas concentracio-nes de 2,4-D en el medio de cultivo inhibenla multiplicación de los virus. Por lo tanto sepuede suponer que las altas concentracionesde auxinas endógenas existentes en los ápi-ces meristemáticos pueden producir un efec-to similar.

3 Meristema apical

El meristema apical incluye las célulasmeristemáticas iniciales y sus derivadas inme-diatas del ápice de la raíz o del brote. El nú-mero de células iniciales es variable y puedenpresentarse en una o más filas.

Dentro del meristema apical se distinguendos zonas de tejido: la túnica, que consta deuna o más capas periféricas de células, y elcuerpo, masa celular rodeada por la túnica.La demarcación entre ambas zonas se dedu-ce de las diferencias en la división de las célu-las. Las capas de la túnica presentan predo-minantemente divisiones anticlinales, es de-cir, experimentan un crecimiento en superfi-cie. Las células del cuerpo se dividen segúnvarios planos y la masa crece en volumen. Elconcepto de túnica-cuerpo fue desarrolladorefiriéndose a las angiospermas pero resultapoco apropiado para la caracterización delmeristema apical de las gimnospermas. Eneste grupo se presentan comúnmente variaszonas de crecimiento derivadas de un grupode células iniciales superficiales.

El diámetro de los ápices oscila entre 90µen algunas angiospermas a 3,5mm en el casode Cyca revoluta. La forma y el tamaño delápice cambian notoriamente durante el de-sarrollo de la planta.

Las hojas se inician mediante divisionespericlinales de un pequeño grupo de célulassituadas al lado del meristema y su situaciónen relación al meristema apical varía en lasdiferentes especies (Fig. 1).

Primordiosfoliares

Nudos

Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciación de la hojaen el ápice del brote de dicotiledónea de hojas opuestas(Esau, 1959).

4 Factores que pueden afectar laproducción de plantas libres de virus

Varios factores pueden afectar el buendesarrollo in vitro de una planta a partir deun meristema: el medio de cultivo emplea-do, el estado fisiológico del explanto, la con-centración de hormonas endógenas del


explanto, las contaminaciones internas oexternas producidas durante el desarrollo delcultivo, el tamaño y localización del explanto,etc. Mencionaremos aquí algunas considera-ciones haciendo especial referencia a aque-llas que afectan la obtención de plantas li-bres de virus.

- Localización del explanto: frecuente-mente se utilizan meristemas apicales yaxilares con buenos resultados. Sin embargoes aconsejable el uso de yemas terminalesya que tienen un mayor crecimiento poten-cial que las yemas laterales. En general, losmeristemas más jóvenes se desarrollan me-jor que los viejos y producen mayores canti-dades de plantas libres de virus que las ye-mas laterales, probablemente porque tienenun crecimiento más activo que las axilares. Noobstante, también es posible la obtenciónde plantas sanas a partir de yemas axilares.

- Estación o momento de la extracción:los meristemas en activo crecimiento son losmás recomendados por su alto potencial dedesarrollo, situación que favorece las posibili-dades de obtener plantas libres de virus. Paraespecies vegetales con períodos dedormancia definidos los mejores resultadosse obtienen cuando los meristemas estándespiertos y comienzan a brotar. En el casode ser necesario se recomienda despertar elmaterial. Los tratamientos más usados con-sisten en someterlo a períodos de frío (varia-ble según la especie) y/o el uso de ácidogiberélico.

- Tamaño del explanto utilizado: elmeristema tiene una serie de requerimientosnutricionales para cumplir sus funciones deautoperpetuación y de generar células paraformar tejidos definidos. Por lo tanto, al serretirado de la planta debe ser sembrado enun medio de cultivo apropiado, así rápida-mente desarrolla en una planta completa.Cuanto más pequeño sea el meristema(explanto) más difícil será encontrar el me-dio de cultivo adecuado que permita un buendesarrollo. Se ha observado que sembrar sóloel domo meristemático, en general no dabuenos resultados. En la mayoría de los ca-sos no se desarrolla una planta, sólo produ-ce callo que luego puede, o no, regenerar

plantas. Como se mencionó anteriormente,la diferenciación a partir de callo implica unincremento en la posibilidad de aparición demutaciones y de variabilidad no deseadacuando se intenta obtener plantasgenéticamente iguales a las donantes deexplantos. Por esta razón generalmente secultiva el domo, con uno o dos primordiosfoliares, a partir del cual se obtiene con fre-cuencia una planta completa.

El tamaño del explanto, así como el nú-mero de primordios que deba poseer, de-penderá, en cada caso, del objetivo que sepersiga, la especie vegetal que se trate y el olos virus involucrados. En términos generales,cuanto más grande sea el explanto, mayorserá la posibilidad de regenerar plantas, peromenor la posibilidad de obtener plantas li-bres de virus. Si por el contrario se parte deplantas ya saneadas, o lo que se desea essólo la multiplicación del material in vitro, sepodrán usar yemas o brotes de mayor tama-ño y asegurar así el desarrollo de una plantasin mayores requerimientos nutricionales.

Existe un gradiente de incremento en laconcentración de virus desde el domomeristemático hacia los sucesivos primordiosfoliares coincidiendo con el grado de diferen-ciación. Esto significa que la probabilidad deobtener plantas libres de virus es inver-samente proporcional al tamaño delexplanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y0,5 mm son los que más frecuentemente pro-ducen plantas libres de virus. También se haninformado, sin embargo, buenos resultadoscon el empleo de meristemas más grandes.El tamaño recomendado es variable y depen-de del hospedante, de tratamientos previos(termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (olos) virus involucrados. En algunos casos nosólo es importante considerar la especiehospedante sino también el cultivar, ya quese han detectado notables diferencias entreellos.

Por otra parte, es probable que el tama-ño del meristema por si solo no sea el factorque determina el éxito en la obtención deplantas libres de virus. Se han detectado nu-merosos virus en meristemas apicales de 0,1-0,5mm en diferentes especies (clavel, poro-to, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sinembargo se ha logrado la obtención de plan-tas sanas con explantos de esos tamaños o

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mayores, por lo que se podría suponer quela eliminación de virus ocurre también duran-te el proceso de cultivo in vitro o por algunaotra razón no aclarada todavía.

5 Desarrollo del cultivo

El primer paso es la extracción delmeristema o explanto. Para ello se corta unaporción de tejido de aproximadamente 1cmque incluye el meristema y se desinfecta. Estofrecuentemente se realiza mediante la inmer-sión en alcohol seguida de inmersión enhipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cá-mara de flujo laminar y con la ayuda de ins-trumental estéril y bajo microscopioestereoscópico se procede a la escisión delexplanto. Una vez extraído se coloca en unmedio de cultivo adecuado en el cual es man-tenido, para su desarrollo, bajo condicionesapropiadas de luz, temperatura y humedad.

- Fase I: Etapa de iniciación: el objetivode esta primera etapa es iniciar el desarrollodel explanto cultivado en forma aséptica. Engeneral ocurre primero un aumento del ta-maño y luego el tejido puede ir adquiriendolentamente pigmentación verde. Posterior-mente irán desarrollándose brotes o plantascompletas a partir de las cuales puedenobtenerse yemas axilares.

- Fase II: Etapa de multiplicación: en estaetapa el objetivo es la multiplicación activadel explanto para la producción de numero-sas plantas a partir de una, constituyendoasí un clon proveniente de un solo meristema,denominado en este caso «mericlon». Lamultiplicación o micropropagación puedeefectuarse por proliferación de brotes axilares,brotes adventicios, formación de embrionessomáticos, etc., tratando siempre de evitarla formación de callo como paso previo a ladiferenciación. La etapa de multiplicaciónpuede involucrar varios repiques del materiala medio de cultivo fresco. Se ha visto con fre-cuencia que la tasa de multiplicación varía conel tiempo de permanencia del explanto enel medio de cultivo. Es frecuente que despuésde 2 o más subcultivos aumente el númerode yemas que se producen a partir de unexplanto. Sin embargo no es aconsejablemantener el material indefinidamente en

esta etapa, ya que se ha observado un au-mento de la variabilidad cuando las plantasson mantenidas por largos períodos en es-tas condiciones. En general, se considera que10-12 subcultivos es lo máximo que deberíamantenerse el material en esta etapa.

- Fase III: Etapa de acondicionamientopara el transplante a tierra: frecuentemen-te las plantas desarrolladas in vitro no po-seen raíces o, si las tienen, muchas veces noson funcionales. En general tienen malas co-nexiones vasculares entre la raíz y el tallo. Anivel foliar puede estar alterada la produc-ción de clorofila. Los estomas no funcionano lo hacen muy lentamente y la capa de ceraepicuticular es muy reducida.

La formación de raíces adventicias es re-lativamente fácil de conseguir en plantasherbáceas, y dificultosa en leñosas. Existe unaetapa de inducción de raíces, de iniciación delcrecimiento y de elongación de las mismas.

En esta fase del crecimiento se suele in-crementar la intensidad de luz para favore-cer la rusticación de las plantas pero hay quetratar de que la misma no afecte a las raíces.Esto puede mejorarse cubriendo la base delos tubos con papel de aluminio o usando0,3% de carbón activado en el medio de cul-tivo para proporcionar sombra a las raíces.

Las plantas que se propagan por bulbos,tubérculos, rizomas, etc., pueden ser induci-das a formarlos in vitro para mejorar la efi-ciencia en el transplante, ya que éstos pue-den ser cosechados del tubo de ensayo ysembrados directamente en tierra sin mayo-res dificultades.

-Transplante: en el momento del trans-plante es importante no dañar las raíces. Esnecesario lavarlas cuidadosamente para reti-rar los restos de agar, debido a que los me-dios de cultivo ofrecen un buen sustrato parael desarrollo de hongos y bacterias que pue-den afectar el desarrollo de la planta en elsuelo.

El mayor problema en esta etapa es ladeshidratación debida a algunas característi-cas anatómicas que presentan las plantascreciendo in vitro (reducida cera epicuticular,lentitud de movimiento estomático, abun-


dantes espacios intercelulares, dificultades enla conexiones entre el tallo y la raíz). Convie-ne transferir las plantas a macetas y mante-nerlas con alta humedad relativa durante losprimeros 15 días. Se han observado buenosresultados con el uso de rocío artificial o ne-blina. Otra práctica frecuente es cubrir lasplantas con polietileno o recipientes de vi-drio transparente, a modo de cámara húme-da, y descubrirlas progresivamente hastadestaparlas completamente al cabo de 3 ó 4semanas.

6 Multiplicación del material libre devirus ex vitro

Las plantas libres de virus deben ser mul-tiplicadas bajo condiciones controladas paraevitar su recontaminación. Una vez rusticadasy adaptadas nuevamente a las condicionesex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajojaulas antivectores todo el tiempo que seconsidere necesario. En esta etapa es impor-tante evitar que las plantas se reinfecten. Esrecomendable la esterilización del suelo paraevitar la contaminación con nematodes yhongos, que en algunos casos son transmi-sores de virus. Las jaulas deben estar revesti-das de una malla muy fina para evitar la en-trada de los vectores. Es recomendable, paraevitar la entrada de los vectores, utilizar unadoble puerta que permita abrir una de lashojas y recién cuando está cerrada, abrir laotra. Periódicamente la malla debe ser con-trolada para detectar inmediatamente lapresencia de roturas que dejen expuestas alas plantas. A pesar de estos cuidados, es re-comendable aplicar insecticidas y mantenerlibre de malezas dentro y fuera de la jaula,ya que las mismas pueden actuar comoreservorios de vectores. Si bien la sanidad delmaterial introducido a las jaulas debe ser pre-viamente controlada, es conveniente, en estaetapa, repetir los análisis para detectar rápi-damente la presencia de una infección a finde eliminarla antes de que se propague. Enestas condiciones es posible mantener como«plantas madres», por mucho tiempo, unstock de material libre de virus a partir delcual se pueden hacer las sucesivas multiplica-ciones.

La etapa de multiplicación masiva, o agran escala, se realiza a campo en áreas ais-

ladas de focos de contaminación. Esta eta-pa se extiende todo el tiempo necesario has-ta la obtención del número requerido de in-dividuos para realizar la producción a nivelcomercial. Si el área protegida está lo suficien-temente alejada de plantas infectadas y seevita el acceso de los vectores, es posiblemantener las plantas libres de virus por mu-chos ciclos de cultivo. Son fundamentales losanálisis periódicos que permitan llevar un re-gistro del estado sanitario del material.

7 Algunas alternativas para mejorar laeficiencia en la producción de plantaslibres de virus

- Termoterapia: es la técnica más antiguautilizada para la liberación de patógenos enplantas. No obstante, es difícil la obtenciónde plantas libres de virus con el empleo dealtas temperaturas solamente. Mantener lasplantas enfermas por períodos prolongadosen termoterapia disminuye la concentraciónde virus, pero al llevar las plantas nuevamen-te a condiciones normales, en poco tiemporecuperan la concentración original.

Una práctica muy usada es la combina-ción de la termoterapia y el cultivo demeristemas. Esto implica mantener las plan-tas en termoterapia por un período variablede tiempo y temperatura (generalmenteentre 34° y 38°C desde una a varias sema-nas), luego se realiza la extracción delmeristema, se siembra en el medio de culti-vo y se continúa con los pasos convenciona-les para su desarrollo.

Esta práctica no es efectiva para todoslos virus por igual, depende del virus y delhospedante. Se ha observado que un mis-mo virus en distintas especies se inactiva enforma diferente. Generalmente, esta prácti-ca ha resultado más efectiva en virus de par-tículas alargadas, y menos eficiente para vi-rus poliédricos.

Podría suponerse que cuanto más largoes el tratamiento de calor, resulta más efec-tivo; sin embargo, no siempre es así. En cri-santemo y en ajo se ha mencionado, porejemplo, que tratamientos de 10-30 díaspueden ser efectivos para la liberación de al-gunos virus; en cambio, tratamientos másprolongados no siempre producen mayorporcentaje de plantas sanas. Estos tratamien-

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tos prolongados, por otra parte, dificultanla implantación in vitro del tejido, lo cual setraduce en un número más reducido de plan-tas obtenidas.

En algunos casos las bajas temperaturas(5°C) seguidas del cultivo de meristemas fue-ron utilizadas con éxito para la eliminaciónde virus. Esta práctica fue aplicada principal-mente en el caso de viroides, los cuales sedesarrollan bien con altas temperaturas.

- Quimioterapia: el uso de antivirales se-ría la solución definitiva para estas enferme-dades; sin embargo, hasta ahora no se haencontrado un producto que por sí solo cum-pla esta función. Algunas sustancias químicasocasionan una disminución en la concentra-ción de virus existentes en la planta y ate-núan, o suprimen, los síntomas típicos de losvirus, pero, una vez suspendido el tratamien-to se recupera la concentración original. Hansido evaluadas diferentes sustancias pero lamás utilizada es el Ribavirin o Virazole (1-β-D-ribofuranosyl-1, 2, 4 – triazole –3- carboxami-de).

Un modo adecuado de emplear los anti-virales es combinándolos con el cultivo demeristemas. También han sido aplicados di-rectamente a los meristemas in vitro. En estecaso, el antiviral es colocado en medio delcultivo en concentraciones variables, que vandesde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajola acción del antiviral por largos períodos queincluyen varios subcultivos.

Un problema importante con el Virasolees su fitotoxicidad, que a su vez depende dela dosis empleada y de la especie de plantautilizada. El éxito del proceso en muchos ca-sos requiere de varios meses de tratamientoy la fitotoxicidad del antiviral constituye unadificultad.

También se han obtenido plantas libresde virus a partir de callos a los que previa-mente se les aplicó Virasole, aunque estapráctica no ha sido eficiente en todos los ca-sos.

- Electroterapia: el método consiste enaplicar corriente eléctrica a yemas por unperíodo variable de tiempo para obtenerplantas libres de patógenos. Se mencionaque la aplicación de electricidad produce de-

gradación de las partículas y pérdida deinfectividad. Esta técnica ha sido citada paraliberar del mosaico al almendro cvCaetanuccia. Para ello los brotes fueron so-metidos a 500V por tiempos variables y lue-go injertados sobre pies sanos (obtenidospor semilla). Se señaló que con 5 minutos detratamiento los resultados fueron buenos ycon 20 minutos se obtuvo completainactivación. El método también ha sidoempleado para eliminar bacterias de caña deazúcar, Potato leaf roll virus de papa,Dasheen mosaic virus de araceas y Bananastreak virus de banana, entre otras, aplican-do 5-30V a las yemas por un período de 5minutos. En este caso se obtuvo una eficien-cia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y elpatógeno.

- Cultivo de domos proveniente del dis-co basal (stem-disc dome culture): el pro-cedimiento consiste en la obtención de plan-tas libres de virus a partir del cultivo de es-tructuras con forma de domo, diferenciadasa partir del cultivo del disco basal de dientesde ajo.

Se ha informado la diferenciación de 20-30 brotes a partir del cultivo del disco basalde dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Estemétodo fue designado por los autores(Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del discobasal (¨stem-disc culture¨). Una modificaciónposterior de esta técnica consiste en la ex-tracción de las estructuras con forma dedomo y su posterior cultivo en un medio ade-cuado para la obtención de plantas.

- Microinjerto de ápices caulinares invitro para obtención de plantas de naran-jo libres de virus: consiste en extraer el ápi-ce caulinar de la variedad a injertar,constituído por el domo apical y primordiosfoliares, y luego sembrarlo sobre la superficiedecapitada del epicótilo de una plántula de2 semanas de edad (patrón) proveniente desemilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas cí-tricas libres de enfermedades)

8 Análisis de las plantas obtenidas oindexing

De lo expuesto previamente surge queexisten varias alternativas para obtener plan-tas libres de virus a partir del cultivo demeristemas. Si bien existen algunos


lineamientos, o consideraciones generalespara tener más probabilidades de éxito, nohay proceso que ofrezca total seguridad. Laetapa decisiva en este sistema es el análisisque permite comprobar si realmente se haproducido la total erradicación de los virus.En la bibliografía se señalan distintos porcen-tajes de éxito en el proceso. Esto significa queempleando el mismo protocolo, en el mis-mo momento, con el mismo material, se con-siguen plantas sanas y plantas que aún per-manecen infectadas. Por lo tanto, la únicaforma de separar las plantas sanas de lasenfermas es un análisis que permita distin-guirlas para luego multiplicar solo aquellas quefueron liberadas de los virus. El éxito de unprograma de producción de plantas libres devirus no depende de la obtención de un altoporcentaje de plantas sanas en al primeraetapa, sino en la obtención de al menos unaspocas plantas madres realmente libres depatógenos. Si el número es escaso puedenser multiplicadas por diferentes sistemas,pero si alguna de ellas está contaminada,todo el trabajo será inútil, porque al final,después de las multiplicaciones a campo, lomás probable es que tengamos todas lasplantas enfermas.

Las plantas deben ser analizadas una poruna para hacer una buena selección de «plan-tas madres» a partir de las cuales se iniciaránlos procesos de multiplicación del material.Es recomendable hacerle más de un análisispara asegurar su sanidad, es preferible quesea en etapas diferentes a lo largo del proce-so, y en lo posible por técnicas distintas.

Para realizar un análisis confiable hay quetener en cuenta varios factores que son es-pecíficos para cada combinación planta-pa-tógeno. Es importante el empleo de siste-mas de alta sensibilidad que nos permitandetectar los virus aun en bajas concentracio-nes; sin embargo, no existe un sistema quesea infalible, siempre hay un límite de con-centración por debajo del cual el virus nopuede ser detectado. Para evitar errores eneste sentido es recomendable tener en cuen-ta algunos factores. Como ya se ha mencio-nado, la concentración de virus no es igualen todas las partes de una planta; por lo tan-to, si queremos hacer un análisis confiable hayque establecer qué tejidos y órganos son losque concentran más el patógeno y realizar

la prueba a partir de ellos. Del mismo modotambién se ha comprobado que existen fluc-tuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lotanto, es conveniente realizar el análisis cuan-do la concentración de virus es mayor. Estoes importante cuando se prueba el materiala campo.

La elección de la técnica de análisis de-penderá del patógeno que se desea elimi-nar y de las posibilidades para realizarla.

Cuanto más temprano se descarten lasplantas contaminadas más seguro será el sis-tema. Una planta infectada siempre es unfoco de contaminación. Por más cuidadosque se tengan siempre se corren riesgos.Cuando las plantas están in vitro, en gene-ral, la concentración de virus es muy baja,probablemente debido a las condiciones decultivo, la concentración de hormonas en elmedio, u otros factores no bien establecidos.Sin embargo, es recomendable hacer un aná-lisis riguroso antes de empezar con lamicropropagación para hacer el primer des-carte de individuos enfermos.

Frecuentemente se menciona en estaetapa el empleo de la técnica inmuno-enzimática de doble sándwich de anticuerpos(DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en unaplaca de poliestireno con 96 celdillas en la cualse lleva a cabo una prueba por celdilla. En elprimer paso cada celda es tapizada por elanticuerpo específico para el patógeno quese está analizando. Luego se coloca el extrac-to de la planta a probar. Si los virus están enel mismo serán atrapados por el anticuerpopreviamente colocado. En el tercer paso seaplica un anticuerpo combinado con unaenzima y en el último paso se coloca elsustrato específico para la enzima. Si el virusestá presente en la muestra se produce elsándwich anticuerpo-virus-anticuerpo conju-gado con la enzima, el sustrato es desdobla-do y la reacción vira al color amarillo (respues-ta positiva, planta enferma). (Fig. 2).

Esta técnica tiene varias ventajas, ya quepermite el análisis simultáneo de muchasmuestras (96 celdillas por placa y se puedenhacer varias placas simultáneamente). Es re-lativamente fácil de usar y de bajo costo. Sinembargo, nuestra experiencia nos indica queesta prueba no es lo suficientemente sensi-ble para detectar los virus en algunos casos.Muchas de las plantas in vitro que dan resul-

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tados negativos mediante DAS-ELISA resul-tan positivas cuando se prueban por otratécnica. Algunas variantes, como ELISA enmembrana de nitrocelulosa o Dot Blot, hansido empleadas con resultados más satisfac-torios; sin embargo, estas técnicas por sí so-las permiten el escape de muchas plantasinfectadas.

Mejores resultados se han obtenido conel empleo de técnicas que combinan la

Las técnicas basadas en la detección delos ácidos nucleicos han mostrado un grandesarrollo y evolución en la última década, yson utilizadas con frecuencia debido a su altasensibilidad y especificidad. El uso de sondasmoleculares ha dado buenos resultados. Con-siste en dar condiciones para que el ácidonucleico del patógeno, fijado sobre un sopor-te sólido (membrana de nylon), se una conun fragmento de ácido nucleico complemen-tario, marcado con moléculas radioactivas, ocon un antígeno que luego será reconocidopor un anticuerpo específico que será detec-tado por colorimetría o fluorescencia. La re-acción en cadena de la polimerasa (PCR) ysus variantes son las técnicas de mayor sensi-bilidad con que se cuenta actualmente. En-tre ellas se mencionan: PCR anidado, trans-cripción reversa (RT), inmuno captura (IC) PCRpost. transcripción reversa (RT-PCR), entreotras. La PCR consiste en amplificar un frag-mento del genoma del virus mediante la uti-lización de dos iniciadores que hibridanespecíficamente en el genoma del patóge-no. La técnica permite producir, en cortotiempo, muchas copias del segmento delgenoma comprendido entre los 2 iniciado-res, de tal forma que luego es posible obser-varlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Estoposibilita la detección de los virus, aun enbajísimas concentraciones. Esta técnica ade-más puede ser combinada con la serología yser realizada en placas como las de ELISA, loque permite el análisis simultáneo de muchasplantas. Estas pruebas, si bien son altamen-te sensibles, no son aún de uso masivo por-que tienen un costo muy elevado.

Para obtener resultados en forma prácti-ca y confiable es posible también la combi-

Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultadospositivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras).

serología con la microscopia electrónica comoson la inmunoelectromicroscopía con o sindecoración (ISEM o ISEM-D). En esta técnicase tapiza una grilla porta especimen con an-ticuerpo y luego se coloca sobre ella el extrac-to de la planta a probar. Si las partículas viralesestán presentes quedarán atrapadas al anti-cuerpo. Luego se contrasta y se observa porel microscopio electrónico (ME), donde sepueden ver las partículas de virus que han sidoselectivamente atrapadas. Esto es lo que sellama ISEM. Si antes de contrastar se aplicaotra vez el antisuero y éste es atrapado porlas partículas virales las mismas se verán másoscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y seránmás fáciles de detectar (Fig. 3). Estas técni-cas son altamente sensibles, permiten la ob-servación directa del virus por lo cual no hayfalsos positivos y no se requiere un antisuerode alta calidad para su desarrollo. El graveinconveniente con ellas es que no son de usomasivo, porque es engorroso analizar grancantidad de muestras, y por otra parte, serequiere de un ME, que es un equipo alta-mente costoso.

Figura 3: Extracto vegetalconteniendo una mezcla

de virus probado porISEM-D con antisuero para

Garlic virus A. Izq.,partícula viral decorada

con el antisuero utilizado.Der., partícula viral no

decorada de una especieviral diferente.


nación de varias pruebas, pudiendo, porejemplo, aprovechar la practicidad del ELISAy la sensibilidad de las técnicas moleculares,o de ISEM u otras. En este caso, las plantasque resultan negativas para el test de ELISApueden ser luego analizadas por una técnicamás sensible y disminuir así el número de prue-bas complicadas o costosas. Esto dependede la cantidad de plantas que ELISA sea ca-paz de detectar, porque si no es lo suficien-temente sensible tendremos que repetir laprueba con todas, o casi todas las muestras.

Como se mencionó anteriormente, laconcentración de virus en las plantas in vitroen general es baja, por lo tanto, se corre elgrave riesgo de considerar como sanas plan-tas que, en realidad, están infectadas. Poresta razón se hace casi obligatorio repetir losanálisis cuando las plantas son transferidasal suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiem-po antes de hacer el análisis, para que si elvirus está presente, tenga la posibilidad deincrementar su concentración y ser entoncesfácilmente detectado. En esta etapa se utili-za con frecuencia el test de ELISA en cualquie-ra de sus variantes, que generalmente con-duce a resultados confiables.

En algunos casos el sistema que resultamás eficiente para hacer el indexing es elempleo de plantas indicadoras. El injerto esla forma más segura de transmitir un virus yesto es lo que se emplea como sistema dediagnóstico. Se realiza un injerto desde laplanta que se desea probar a plantas queson susceptibles al virus (planta indicadora) yque desarrollan síntomas claros y evidentesde la presencia del patógeno. El inconvenien-te, en este tipo de análisis, es que hay que

esperar que la planta obtenida in vitro seatransferida al suelo, luego que se desarrollelo suficiente como para extraer una porciónde tejido (hoja, yema, brote, etc., según eltipo de injerto). Se requiere además de unoperador con habilidad para realizar el injer-to con éxito y luego mantener las plantasinjertadas en condiciones adecuadas hastala aparición de los síntomas. En algunos ca-sos, este tiempo puede ser muy prolonga-do. A pesar de los inconvenientes que se men-cionan, para algunas especies este sigue sien-do el método más seguro. Por ejemplo lafrutilla, que es afectada por más de 20 enfer-medades diferentes y que en muchos casosni siquiera ha sido todavía caracterizado elagente causal, la transmisión del virus a plan-tas indicadoras resulta la prueba más efecti-va. En este caso se injerta el folíolo medio deuna hoja perteneciente a la planta que sedesea probar en plantas indicadoras en lascuales los patógenos van a dar síntomas cla-ros. Algunos virus se van a manifestar des-pués de 2 ó 3 semanas de realizado el injer-to; en otros casos, la bibliografía mencionaque los síntomas aparecen entre los 6 y 12meses. Con frecuencia, no es posible identifi-car que virus es el que está presente, pero esposible determinar si la planta está infecta-da.

En vid, parte de los virus son analizadosmediante ELISA. Pero otros son probados porinjerto a plantas indicadoras. Algunos de losvirus pueden ser detectados en pocas sema-nas, pero para el stem pitting/groovingsindrome, por ejemplo, es necesario esperarentre 8 y 12 meses.

9 Algunas consideraciones respecto a losanálisis de virus

En general, cuando se habla de las plan-tas liberadas de virus se emplean términoscomo «plantas libres de virus» «planta sana»o «saneada» sin que se defina qué virus fue-ron eliminados ni qué pruebas se emplearonpara comprobar su eliminación. El conceptode plantas libres de virus debería estar aco-tado al, o a los virus, analizados. En el casode plantas que son afectadas por un conjun-to de virus diferentes sería necesario realizarun análisis independiente para cada uno de

Figura 4: Fragmentosamplificados por IC-RT-PCR. Líneas 1-4,segmentos de 489pbcorrespondientes aOnion yellow dwarfvirus; líneas 4-5,segmentos de 566pbcorrespondientes aLeek yellow stripevirus; línea 6, marcadorde peso molecular.

312 CONCI, Vilma C.

ellos y señalar el o los virus de los cuales hasido liberada o probada. Por otra parte debedefinirse la técnica de análisis empleada.Como se mencionó previamente puedenemplearse diferentes métodos de diagnósti-co con distintos grados de sensibilidad. Así,por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISAcalibrado para detectar hasta 10 ng/ml y unRT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y seanaliza una planta con 50 pg/ml; la técnicade DAS-ELISA no va a detectar el patógeno yel resultado será negativo, mientras que elRT-PCR arrojará un resultado positivo. Todaslas técnicas tienen un límite de sensibilidadpor debajo del cual no son capaces de de-tectar la presencia del patógeno. Por consi-guiente, dependiendo de la sensibilidad dela técnica que se use, el porcentaje de plan-tas supuestamente «libres de virus» puedevariar. Lo correcto sería entonces hablar deplantas negativas a un virus probado me-diante una técnica determinada. Por ejem-plo, «plantas negativas a Onion yellowdwarf virus mediante DAS-ELISA», lo que nosignifica que realmente está libre de virus sinoque la técnica no lo detectó. Por esa razónse aconseja evaluar las plantas en más de unaoportunidad y repetir los análisis cuando lasplantas están a campo, para darle al pató-geno, si está presente, la posibilidad de mul-tiplicarse.

10 Agradecimientos

A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, SergioNome y al Dr. Luis Conci por la revisión delpresente manuscrito; y a la Ing. Agr. EvaCafrune por su colaboración en la búsquedade información.


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VIII.-Capítulo 6

Producción de plantas de ajo libres devirus

Conci, Vilma C.; Cafrune, Eva E.;Lunello, Pablo; Nome; Sergio; Perotto, Cecilia

1 Introducción

De los cultivos de Alliaceae, el ajo (Alliumsativum L.) es considerado como una espe-cie valiosa por muchas culturas diferentes.Además de su conocida utilización en el arteculinario, hoy es un producto apreciado porsus beneficios medicinales, especialmente enEuropa y Asia. Algunos de sus productos de-rivados, poseen actividades biológicas talescomo antibióticas, antiparasitario, reductoresde riesgo de enfermedades cardiovascularesy como potenciales agentes anticancerígenos.

El ajo es la principal hortaliza exportablede Argentina desde el punto de vista de laentrada de divisas, siendo este país el segun-do exportador mundial después de China.Las exigencias cada vez mayores del merca-do y la aparición permanente de nuevos com-petidores obligan a replantear las estrategiasde producción nacional.

Entre las enfermedades que afectan aeste cultivo, los virus son los responsables delas mayores pérdidas (entre un 20 y 80% dedisminución en el peso de los bulbos). Lasinfecciones son causadas por un complejoviral que incluye Potyvirus (Onion yellowdwarf virus, OYDV, y Leek yellow stripe vi-rus, LYSV); Carlavirus (Garlic common latentvirus, GCLV y Shallot lantent virus, SLV), yAllexivirus (Garlic virus-A, -B, -C, -D, -E, -X,GarV-A –B –C- D- E -X; Garlic mite-bornefilamentous virus, GarMbFV). Este conjun-to causa un mosaico que si bien no mata laplanta produce una infección crónica. Debi-do a la exclusiva propagación agámica deesta especie, la totalidad de las plantas es-tán infectadas por virus, por lo tanto es evi-dente la importancia que tiene la obtenciónde propágulo libre de virus como salida decontrol. En Argentina se ha detectado la pre-sencia de OYDV y LYSV, GCLV, GarMbFV,GarV-C y otros Allexivirus todavía no carac-terizados completamente.

A modo de ejemplo se detalla a conti-nuación un protocolo de producción de ajolibre de virus.

2 Procedimiento para la obtención de ajolibre de virus

A) Termoterapia: en trabajos realizadosen la Argentina se ensayaron tratamientosde termoterapia con agua y con aire calien-te, antes de la extracción del meristema. Losmejores resultados se obtuvieron con aire ca-liente. Para ello dientes de ajo fueron sem-brados en terrinas con una mezcla de tierra/mantillo/arena (1/1/1) y mantenidos en unacámara a 36ºC. Cuando plantas de ajo Blan-co fueron sometidas 60 días a 36°C y luegose hizo el cultivo de meristema, se regenera-ron pocas plantas, pero las que se obtuvie-ron resultaron «libres de virus». Cuando seprobaron 5 cultivares de ajo durante 40 díasa 36°C se pudo observar valores de supervi-vencia del cultivo de meristema que variaronentre 40 y 82%, resultando «libres de virus»entre 30 y 100% de las plantas obtenidas,dependiendo del cultivar. Los controles enlos cuales se obtuvieron plantas sólo por cul-tivo de meristema, sin termoterapia, el por-centaje de plantas desarrolladas varió entre70 y 100%, y de ellas, en algunos cultivares,no se obtuvieron plantas «libres de virus» yen otros llegó hasta el 21%.

Trabajos realizados posteriormente pusie-ron en evidencia que la posibilidad de liberarde virus por termoterapia es muy variable.En algunos monoclones de ajo Blanco y Co-lorado se observó que a pesar de ser someti-dos a períodos prolongados (más de 60 días)a 36°C, no fue posible eliminar todos los vi-rus integrantes del complejo; paralelamente,otros genotipos fueron «liberados de virus»sólo con el empleo del cultivo de meristema.

B) Cultivo de meristema, primer análisisy micropropagación: para la extracción delmeristema se corta un trozo de tejido enforma cúbica, incluyendo el disco basal don-de está el meristema. Este se desinfecta me-diante una inmersión en alcohol 70% y luegocon hipoclorito de Na al 5 % durante 10-15min. Posteriormente, el trozo de tejido es co-locado sobre papel estéril bajo una lupaestereoscópica dentro de una cámara de flu-

314 CONCI, Vilma C.; CAFRUNE, Eva E.; LUNELLO, Pablo; NOME, Sergio; PEROTTO, Cecilia

jo laminar y con laayuda de instrumen-tal estéril se procedea la extracción delexplanto constitui-do por el domo más1 primordio foliar(0,3 mm aproxima-damente). Luego dela escisión es rápida-mente sembradoen medio de inicia-ción donde se desa-rrollará una plantacompleta (Fig. 1, A).

Las plantas ob-tenidas son analiza-das mediante ISEM-D con un antisueroproducido a partirde plantas de ajoenfermas con lamezcla de virus quenaturalmente infec-tan al cultivo. Aque-llas plantas que re-sultan negativas aesta prueba sonevaluadas conantisueros específi-cos para OYDV,LYSV, GCLV, SLV,GarMbFV y con unantisuero que detec-ta fundamental-mente una mezclade diferentesAllexivirus. Lasplantas negativas atodos ellos sontransferidas a unmedio de micropro-pagación. En estemedio es posibleuna tasa de multipli-cación de 1:2-1:8 de-pendiendo del culti-var (Fig. 1, B).. Estatasa varía con el número de repiques en elmedio de cultivo, siendo baja en los prime-ros y aumenta a partir del segundo o tercerrepique, además se detectaron diferenciasentre los distintos meristemas.

C) Rusticación y transplante a tierra bajocondiciones controladas: después de variosciclos in vitro, muchas plantas bulbifican es-pontáneamente y otras deben ser inducidas(Fig. 1, C). Repicando los plantines a un me-

Figura 1: Producción de ajo libres de virus. A: planta en medio de iniciación. B:micropropagación. C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos). D: planta transferidaa tierra y mantenida en cámara húmeda. E: planta adaptada a las condiciones ex vitro.F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos. G: multiplicación a gran escala bajo jaulaantiáfidos. H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).


dio sin hormonas, con alto contenido de sa-carosa y luz continua se consigue mejorar elporcentaje de bulbificación en algunos clones,o bien, se obtienen plantas más robustas quesoportan mejor el transplante a suelo.

Los minibulbillos obtenidos in vitro soncosechados y sembrados en suelo estéril com-puesto por una mezcla de tierra/mantillo/arena (1/1/1). Las plantas que no formanbulbos son transferidas a suelo y manteni-das en cámara húmeda por un tiempo varia-ble entre 15 y 20 días luego son paulatina-mente adaptadas a las condiciones natura-les de humedad y temperatura (Fig. 1, D y E).

Las plantas ex vitro son probadas me-diante DAS-ELISA para constatar su estadosanitario y mantenidas bajo jaulasantivectores. Los bulbos cosechados son con-servados en lugar fresco y seco hasta la épo-ca de siembra. Las sucesivas multiplicacionesse realizan en jaulas donde se continúa anali-

Líneas selectas

Cultivo de meristema (medio de iniciación)

Plantas in vitro

Multiplicación in vitro (en medio de multiplicación)

Bulbificación in vitro

(medio de bulbificación)

Termoterapia

2º ó mas generaciones en suelo(bajo jaula)

Planta in vitro

1º generación en suelo(bajo jaula)

ANALISIS por DAS-ELISA

(Potyvirus, Carlavirus y Allexivirus)

Multiplicación en áreas aisladas(productores, semilleros)



Transferencia a productores(producción comercial)

ANALISIS por ISEM-D(OYDV, LYSV, GCLV, SLV,

GarV -A, y otros Allexivirus



Figura 2: Esquema de producción de plantas de ajo libres de virus, IFFIVE-INTA,Argentina.

zando las plantas,una por una, median-te pruebas de DAS-ELISA (Fig. 1, F y G).

Los bulbos produ-cidos son entregadosa semilleros que reali-zan la multiplicaciónen áreas aisladas deotros cultivos deAlliaceae, hasta ob-tener el número debulbo-semilla suficien-te como para iniciaruna producción co-mercial. Cuando secomparan los bulbosproducidos por lasplantas libres de viruscon respecto a los pro-ducidos por plantasinfectadas las diferen-cias en peso y tama-ño son notablesFig.1, M. Esquema deproducción Fig.2.

3 Certificación

La implementa-ción de programastendientes a la pro-

ducción de plantas de ajo libre de virus y elcontrol de la enfermedad adquiere funda-mental importancia ya que han comenzadoa regir en Argentina normativas para la fisca-lización de semilla de ajo. Estas normas esta-blecen las categorías de Básica (subcategoríaPreinicial, Inicial y Fundación) Registrada(subcategoría A y B) y Certificada. Cada unade estas categorías contempla diferentes por-centajes de OYDV. Por ahora sólo se contro-la este virus; sin embargo, con el avance delos conocimientos respecto del daño que pro-ducen el resto de los integrantes del comple-jo, seguramente algunos otros serán consi-derados en el futuro.


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VIII.-Capítulo 7

Plantas cítricas libres de enfermedades

Costa, Norma; Plata, María Inés;Anderson, Catalina

1 Introducción

Para competir en un mercado citrícolaglobalizado se necesita de la máxima eficien-cia en todas las fases de la producción. Paralograrlo es primordial partir con material deexcelencia desde el vivero. La planta es el pri-mer escalón para iniciar una citriculturaexitosa.

Las exigencias de calidad en los cítricosproducidos en los viveros comerciales de todoel país aumentan día a día. El material demultiplicación para la producción de plantasde vivero debe provenir de un origen cierto ycertificado. El citricultor espera que la plantaque pondrá en sus explotaciones tenga unporte adecuado, un sistema radicular desa-rrollado y la garantía sanitaria y varietal co-rrespondiente para obtener una producciónrentable y duradera.

Las enfermedades producidas por virus,viroides y otros organismos similares produ-cen importantes pérdidas económicas en loscítricos de todo el mundo. Algunas enferme-dades provocan la muerte de las plantas yotras disminuyen la producción y la calidadde la fruta, causando pérdida de vigor y delongevidad de la planta.

Algunas de las principales enfermedadescausadas por este tipo de microorganismosson la psorosis, tristeza, exocortis ycachexia. Estas enfermedades se han exten-dido debido a la propagación vegetativa dematerial infectado. Es normal encontrar va-rias virosis en una misma planta y en muchospaíses como la Argentina casi la totalidad delas plantas adultas están afectadas por algu-na virosis.

La psorosis y otras enfermedades setransmiten mediante el injerto de yemas.Una vez hecho el injerto, la planta puedepermanecer con la enfermedad latente du-rante muchos años. Las yemas que se extrai-gan de una planta con enfermedad latenteoriginarán plantas enfermas.

Los países con citricultura de avanzadahan basado su éxito en el empleo de Progra-mas de Certificación utilizando plantas libresde enfermedades, especialmente las causa-das por virus u organismos similares.

Estas plantas libres de virus se obtienena partir de plantas de variedades cítricasagronómicamente ideales pero afectadas poruna o más enfermedades causadas por virusu organismos similares. Para esto se recurre atécnicas que permitan la obtención de plan-tas libres de virus a partir de individuos en-fermos. La termoterapia y la obtención deplantas nucleares han sido técnicas usadaspara conseguir aquel objetivo. Otra técnicaque cumple este objetivo es la técnica demicroinjerto de ápices caulinares in vitro.Dicha técnica es la que actualmente se utilizaen gran parte de los países citrícolas que tie-nen programas de eliminación de virus yviroides.

Con la combinación de las técnicas determoterapia y de microinjerto de ápicescaulinares in vitro es posible obtener un ele-vado porcentaje de plantas cítricas libres devirus, cosa que una técnica sola no permitelograr.

La técnica de microinjerto se basa en lahipótesis de que los virus vegetales no llegana infectar el meristema. Una vez obtenida laplanta por esta técnica debe ser sometida alas pruebas de comprobación sanitaria (prue-bas biológicas, químicas, inmunoquímicas,serológicas, moleculares, etc.) que determi-nen con certeza que esa planta esta «libre»de lo que se está analizando.

El PROCITRUS es un proyecto que el INTAdesarrolló para la obtención, producción,mantenimiento y distribución de material deportainjertos y cultivares de especies cítricascon identidad varietal y estado sanitario con-trolados y en su esquema básico (Tabla 1)emplea estas técnicas para cumplir dichosobjetivos.

2 Técnica de microinjerto de ápicescaulinares in vitro

La planta a microinjertar es seleccionadade las introducciones de variedades cítricasde copa y portainjerto que se realizan a losBancos de Germoplasma, de selecciones lo-cales y de variedades obtenidas en los Pro-

318 COSTA, Norma; PLATA, María Inés; ANDERSON, Catalina

gramas de Mejoramiento. Una vez obteni-da esta «planta candidata a planta madre»,es sometida a termoterapia y cultivo de teji-dos empleando la técnica de «microinjertode ápices caulinares in vitro».

Esta técnica comprende las siguientes eta-pas: preparación del portainjerto, prepara-ción del ápice, injerto, cultivo de plantas in-jertadas e injerto sobre un plantín vigoroso.Las plantas obtenidas por microinjerto nopresentan caracteres juveniles y en las mis-mas no se han observado anormalidades conrespecto a la planta madre.

El éxito de la técnica depende del tama-ño del tejido extraído (0.1-0.2 mm) y del pa-tógeno que se quiera eliminar. En el caso deexocortis, tristeza y cachexia, el porcentajede plantas libres es superior al 90%. El más

difícil de eliminar es el virus de la psorosis delos cítricos (CPsV).

Una vez obtenida la planta de microin-jerto y cuando tiene tamaño suficiente, serealizan las pruebas de diagnóstico para com-probar que estén libres de patógenos (Ta-bla 2).

Las técnicas de diagnóstico para cadaenfermedad pueden ser varias pero debenemplearse aquellas reconocidas interna-cionalmente por organismos de referencia.Para el PROCITRUS y para el Programa Nacio-nal de Certificación de Cítricos las técnicasempleadas son las recomendadas por las«Normas para la Producción, Comercializacióne Introducción de Plantas Cítricas de Vivero(RES N° 149/98)» y las «Normas de Funciona-miento de Laboratorios de Diagnóstico paraEnfermedades de Plantas Cítricas de Viveroy sus partes, aprobadas por el INASE y elSENASA dependientes de la SAGPyA (Secre-taría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Ali-mentación).

3 Lecturas recomendadas:

1- Enfermedades de los Cítricos. 2000 Monografía de laSEF (Sociedad Española de Fitopatología). EditoresCientíficos: Núria Duran-Vila y Pedro Moreno 165 pp

2-Proceedings of the IOCV (International Organizationof Citrus Virologists): 1957-2002 (15 Conferencias)

3-Improvements in serodiagnosis of Citrus Psorosis Virus(CPsV). 2000. Aliotto, D.,M. Gangemi,P. Sposato, S.Deaglio, E. Luisoni and R.G. Milne.14th Proceedings ofthe IOCV 353-356pp

4- Indexing of Citrus viroids by imprint hybridisation.1999.Palacio-Bielsa, A.,X. Foissac and N.Duran-Vila. European Journal of PlantPathology 105:897-903

5- Cancrosis de los Citrus en el LitoralArgentino.2001. Canteros, Blanca I. IDIA XXIAño I- Nro.1 23-27pp

6- Citrus Canker in Argentina- Control,Eradication, and Current Managment. 2000International Citrus Canker ResearchWorkshop. Ft. Pierce, Florida USA. 12-13pp

7- Manual para Productores de Naranja yMandarina de la Region del Río Uruguay.1996. INTA Manual Serie «A» Nro. 2 -Diversificación Productiva. Eds. A. Fabiani, R.Mika, L. Larocca y C. Anderson. 238 pp

8- Graft-Transmissible Diseases of Citrus.Handbook for detection and diagnosis. 1991.Roistacher, C.N. FAO and IOCV 286 pp.

- Introducciones.- Selecciones locales.

- Programas de Mejoramiento.

Planta candidata

Termoterapia32°C

Cultivo deTejidos

DiagnósticoSanitario

Planta Madre OriginalProtegida

Tabla 1: Esquema operativo del proyecto PROCITRUS:para la obtención de una planta libre de enfermedades

Enfermedad Metodología Duración Repetición

Tristeza

Inmunoimpresión ELISA

Plantas indicadoras

ELISA DAS

4 h

12 meses

48 h

1 año

PsorosisPlantas indicadoras

ELISA TAS

12 meses

48 h

3 años

Exocortis

Plantas indicadoras

Hibridación Molecular

Electroforesis

12-24

meses

3 meses

3 meses

6 años

Cachexia-xiloporosis

Plantas indicadoras

Hibridación Molecular

Electroforesis

12 meses

3 meses

3 meses

6 años

CVC ELISA DAS 48 hs 6 años

Cancrosis

Infiltración de tejido susceptible

Medio Selectivo

Inmunofluorescencia indirecta

ELISA DAS

10 días

7 días

7 días

48 hs

1 año

Tabla 2: Pruebas de Diagnóstico para Plantas Madres


VIII.-Capítulo 8

Certificación sanitaria de especiesfrutales de Prunus

Docampo, Delia M.

1 Introducción

Monitoreos realizados en especies fruta-les del género Prunus (durazneros, ciruelos,cerezos, guindos) del área frutícola templa-da (provincias de Mendoza, Córdoba y Bue-nos Aires) evidenciaron el deterioro de la con-dición sanitaria de las plantaciones en pro-ducción y de propagación. Los análisis pusie-ron de manifiesto que una de cada cuatroplantas analizadas se encontraba infectadapor uno o más virus.

Varios factores han sido decisivos para ladistribución de estos patógenos. La carenciade controles sanitarios, la ineficacia de losmétodos usados en los análisis, su dispersiónpor vectores y la diseminación de materialesinfectados a larga distancia, por el hombre através de la comercialización.

Un Sistema de Certificación Sanitaria dePlantas Perennes se fundamenta en produ-cir el número de plantas requeridas por elmercado a partir de una Planta Inicial. El Sis-tema contempla cuatro etapas básicas: 1)Elección de la Planta Inicial (selecta de varie-dades y de portainjertos) seleccionada sobrela base de sus caracteres agronómicos desea-bles, por su pureza varietal (deben coincidircon los Descriptores del Registro Nacional deCultivares) y su estado sanitario, (analizadopor las técnicas más rigurosas establecidas enel Sistema de Certificación). Constituye elmaterial fundacional de un Sistema de Certi-ficación del cual derivará todo el material cer-tificado; 2) Establecimiento de un Monte Fun-dación. Constituido generalmente por tresplantas de cada cultivar (de variedad y decada portainjerto) obtenidas por propaga-ción agámica de la Planta Inicial. Constituyeun monte de reserva y es donante de mate-riales de propagación; 3) Organización de unmonte de Plantas de Base que deberá man-tener al menos diez plantas por cultivar y/oportainjerto como «plantas madres» de lapropagación, sometidas a rigurosos contro-

les sanitarios y varietales anuales; 4) Produc-ción de Plantas Certificadas. Está destinadaa producir las plantas que demanda el mer-cado (viveros expendedores). Cada etapapuede tener subetapas. Todas están regla-mentadas y sometidas a estrictos controlessanitarios y varietales.

El Material Certificado producido por losSistemas de Certificación referidos al sanea-miento de virus puede considerar dos califi-caciones según su programación: «MaterialLibre de Virus» (virus free - VF) cuando losmateriales están exentos de todos los virusconocidos en esa especie y «Material Testa-do» (virus test - VT) cuando los materiales seencuentran exentos de los principales virus.

Por lo común ninguna planta selecciona-da como candidata a Planta Inicial resultalibre de patógenos sistémicos. El cultivo invitro de meristemas precedido por la aplica-ción de termoterapia ofrece la posibilidad derecuperar materiales contaminados para ob-tener una Planta Inicial. El cultivo in vitro es,además, una práctica de rutina para la rápi-da multiplicación de portainjertos en los cua-les injertar yemas para propagar cultivares.Una planta de un cultivar (variedad) puededonar numerosas yemas que requieren igualnúmero de portainjertos (Fig. 1). Estaclonación permite obviar el empleo de caro-zos como generadores de portainjertos y deesta manera uniformar su respuesta a estrésbiótico o abiótico.

2 Micropropagación de portainjertospara Prunus de Sanidad Certificada,mediante cultivo in vitro

Los Sistemas de Propagación dePortainjertos Certificados establecen proce-dimientos para su micropropagación median-te el cultivo in vitro que en general contem-plan el siguiente desarrollo: 1.- Tomarexplantos de Plantas Iniciales o de Plantasde Propagación (Monte Fundación, Plantasde Base) que hayan superado todos los con-troles sanitarios y de pureza varietal anuales.2.- El número de multiplicaciones in vitro nodeberá superar los diez ciclos una vez supe-rada la fase de adaptación. 3.- Iniciar lamicropropagación empleando meristemasde 0,3-0,5 mm (meristema con uno o dosprimordios foliares), e identificar el material

320 DOCAMPO, Delia M.

sembrado. 4.- Los meristemas generarán ye-mas (un yemario), en general, entre las 6 y12 semanas de implantado. 5.- Repicar lasyemas del yemario. La propagación de cadameristema se deberá identificar con una si-gla, de manera que cada ápice caulinar déorigen a un clon (una línea de descenden-cia). 6.- Control sanitario. Antes de la terce-ra multiplicación deberán tomarse al menos3 plantas de cada clon para realizar el análi-sis de los patógenos que se estableció elimi-nar. Las plántulas seleccionadas deberán per-manecer destapadas por al menos una se-mana, fuera de la cámara de cultivo, bajo luz,temperatura y humedad relativa controladasa fin de dar oportunidad a el o los patógenos,si los hubiera, de incrementar su poblaciónlo cual facilitará su detección. El control sani-tario deberá realizarse en plantas leñosas y

herbáceas por indexación, testado median-te técnicas inmunoenzimáticas (DAS-ELISA osus variantes), microscopía electrónica (dips,secciones ultrafinas, ISEM + D) y técnicasmoleculares (dsRNA viral, PCR, PCR anidado).La línea de descendencia que no supere estecontrol será eliminada. 7.- Los medios de cul-tivo no deben contener sustancias nocivasni antibióticos que puedan enmascarar lapresencia de microorganismos. 8.- Es motivode rechazo el material cultivado en medioscontaminados. 9.- Consignar en un Libro deRegistro las acciones realizadas durante lamicropropagación (ciclos de micropro-pagación, medios de cultivo, número de in-dividuos logrados, toma de muestras paraanálisis, tipo de análisis, resultados, depura-ciones, etc.) por cada línea de descendencia.10.- Trasplantar a suelo (mezcla de turba,

abcde fgh i j

Iniciación del cultivoCada ápice caulinar originará un clon

in vitro.

Cultivo de ápices caulinares

Termoterapia

Yema tratada

Desinfección superficialÁpice caulinar

Remoción de hojas

RIZOGÉNESIS

TRANSPLANTE A SUELO BAJOCONDICIONES CONTROLADAS

EN INVERNADERO

MICROPROPAGACIÓN“a” a1a2a3a4a5a6

a: explanto iniciala1, a2, ... a6: clon

MICROPROPAGACIÓN

Seccionado de yemas

Yemario generado porápice caulinar “a”

CONTROL SANITARIO

Toma de muestras

Seccionado de brotesClones libres

Micropropación(hasta 10 ciclos)

Estaca de plantaseleccionada enraizada

CONTROL SANITARIO

Figura 1: Esquema de micropropagación de Prunus


perlita, mantillo 1:1:1:) estéril las plantas re-generadas in vitro.

2.1 Aclimatación

1.- Descalzar del medio las plantas rege-neradas lavando cuidadosamente sus raícesbajo chorro de agua hasta retirar la totali-dad del agar. 2.- Plantar en terrinas plásticasdesinfectadas con NaOCl al 15% (Cl activo 80g/dm3), en una mezcla de turba, mantillo yperlita 1:1:1 esterilizada en autoclave duran-te 1 h sin presión. 3.- Colocar las terrinas encámaras con HR del 90-100%, con luz conti-nua de 4000 luxes provista por tubosfluorescentes de luz blanca fría, temperaturamínima 15°ºC, máxima 35°ºC. 4.- A los 30 díastransplantar a cestillos plásticos (6 cm de diá-metro) y mantenerlos bajo túneles depolietileno en invernadero con HR 70-90% y16 h de luz. 5.- Levantar el plástico por loscostados lentamente cada 2-3 días hasta suretiro definitivo. 6.- Control varietal: tomaral menos tres plantas por línea de descen-dencia clonal para el control varietal. Dentrode un Sistema de Certificación, el productorcultivará las plantas en sus instalaciones deaclimatación e informará al organismo oficialresponsable para que efectúe las correspon-dientes inspecciones. Toda planta fuera detipo y las afectadas por plagas serán elimina-das. Esta depuración debe ser anotada en elLibro de Registro. 7.- Control sanitario: reali-zar un segundo control sanitario (indexing ytestado serológico, microscopia electrónica,técnicas moleculares) al año de desarrolladaslas plantas en todos los clones. 8.- Identificarcon una clave, que debe figurar en el Librode Registro, cada línea de descendencia. Enlos recipientes de multiplicación figurará la cla-ve y el número de multiplicación que corres-ponda. 9.- En la etiqueta debe figurar «Pro-ducido in vitro».

3 Obtención de una Planta Inicial (cultivary/o portainjerto) libre de patógenosmediante cultivo in vitro asociado contermoterapia

1.- Seleccionar plantas (cultivares y/oprotainjertos) por su pureza varietal y condi-ciones agronómicas deseables (candidata aPlanta Inicial). 2.- Investigar su condición sa-

nitaria por indexación en plantas leñosas yherbáceas, testeado mediante técnicasinmunoenzimáticas (DAS-ELISA y/o sus va-riantes), microscopia electrónica (dips, seccio-nes ultrafinas, ISEM-D) y técnicas moleculares(dsRNA viral, PCR, PCR anidado). 3.- Si ningu-na de las plantas resultase libre de patógenossistémicos, aplicar termoterapia seguida decultivo de meristemas de las yemas tratadas.Los controles sanitarios de las plantas rege-neradas permitirán seleccionar las plantas li-bres de patógenos.

3.1 TermoterapiaSe aplica sobre materiales activos (barba-

dos con brotes, plantas jóvenes). 1.- Enrai-zar individualmente en suelo estéril estacasde la planta seleccionada para el tratamien-to o estacas de portainjertos de SanidadCertificadas para injertar yemas de las varie-dades seleccionadas. 2.- Colocar las plantasenraizadas y con brotes (en actividad) encámaras donde reciban una corriente de airecaliente. 3.- Temperatura: varía con la rela-ción cultivar-patógeno. Algunos patógenosson eliminados con facilidad por el calor mien-tras otros disminuyen su concentración peropermanecen en los tejidos. Los Prunus tie-nen intolerancia a los tratamientos prolon-gados con calor, pero pueden soportarlos sise utiliza calor moderado (34-38°ºC). 4.-Fotoperíodo: 16 h de luz suministrada portubos fluorescentes de luz blanca. Intensidadlumínica: 48.000µM S-1m-2 (3,5–4,0 klux). Rie-go: diario. Humedad relativa: entre 60 y 80%.5.- Tiempo: varía con la relación planta pató-geno. Oscila entre 3 y 7 semanas, aunque,por lo común, varía entre 3-4 semanas. 6.-Retirar las plantas de la termoterapia y a con-tinuación aislar y cultivar los meristemas delas yemas desarrolladas durante el tratamien-to. Evitar la recontaminación de los meris-temas prolongando el tiempo entre la finali-zación de la termoterapia y el cultivo de losmateriales. 7.- Continuar la micropro-pagación como se desarrolla desde el ítem 2en Micropropagación de portainjertos paraPrunus de Sanidad Certificada, mediante cul-tivo in vitro.

4 Obtención de variedades (cultivares)libres de patógenos mediante elmicroinjerto de ápices caulinares in vitro

322 DOCAMPO, Delia M.

La técnica es adecuada para injertarmeristemas de frutales de carozo infectadossometidos a termoterapia. 1.- Cultivar invitro explantos de un portainjerto libres deinfección. 2.- Colectar brotes de la variedadsometida a termoterapia y desinfectarlos. 3.-Extraer bajo lupa el meristema (0,2-0,4 mm).4.- Decapitar los portainjertos cultivados invitro. 5.- Colocar el meristema de la variedadsobre el extremo decapitado de la plántulaportainjerto cuidando que las zonasvasculares entren en contacto. 6.- Colocar losmicroinjertos en ambiente controlado (16 hde luz aportada por tubos fluorescentes deluz blanca. Intensidad lumínica: 3,5–4,0 klux,HR: 60 y 80%). 7.- Dejar desarrollar la plantainjertada en un medio adecuado durante 5a 15 semanas bajo luz. 8.- Transplantar a sue-lo estéril. Se inicia su aclimatación en inverna-dero bajo condiciones de luz, temperatura yhumedad controlada por varias semanas. 9.-Continuar con la aclimatación de las plantasgeneradas como se señalara previamente.


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VIII.-Capítulo 9

Biotecnología aplicada al control deenfermedades fúngicas y bacterianas

Zappacosta, Diego

1 Introducción

Desde la domesticación de las plantas porel hombre las enfermedades han causadoenormes pérdidas en la producción. El usointensivo de monocultivos con baja diversi-dad genética en la agricultura moderna haredundado en una elevada susceptibilidad aalgunas enfermedades y en un incrementode la agresividad de algunos patógenos. Conexcepción de las enfermedades epidémicas,que llegan a destruir cultivos completos, seestima que las pérdidas ocasionadas porpatógenos en el plano mundial representanun 12% del potencial de producción, tenien-do mayor incidencia en hortalizas, frutales yarroz. Además de causar pérdidas en la pro-ducción, algunos patógenos también redu-cen la calidad de los alimentos, como es elcaso de algunas especies de Fusarium yAspergillus, que dejan en los tejidos infec-tados toxinas que afectan la salud humanay animal.

Existen varias formas de controlar lasenfermedades, entre los que podemos men-cionar: a) las prácticas culturales, como la ro-tación, la sanidad del material inicial, el con-trol de restos vegetales, etc., b) la aplicaciónde agroquímicos y c) la resistencia genética.Aunque las tres alternativas son utilizadas,la última, por su mejor implementación ymenor impacto ambiental, es una de lasmejores opciones. Es frecuente, sin embar-go, encontrar inconvenientes para su aplica-ción, tales como la falta de genes de resis-tencia, la rápida evolución de nuevas razasvirulentas del patógeno, etcétera.

La incorporación de genes de resisten-cia es uno de los mayores desafíos para losmejoradores durante el desarrollo de nue-vos cultivares. Tradicionalmente se ha lleva-do a cabo a través de métodos convencio-nales de mejoramiento, que involucran se-lección y evaluación de grandes poblacionesderivadas de cruzamientos entre materiales

susceptibles y resistentes y la posterior selec-ción bajo condiciones propicias para la en-fermedad.

Si bien estos métodos convencionaleshan resultado exitosos en muchos casos, sonlentos y laboriosos, ya que involucran cruzas,retrocruzas y selección, siendo además difícilseguir la evolución de nuevas razas virulentasde los patógenos. Esto ha llevado a un usomasivo de agroquímicos a pesar de su altocosto y su alto impacto ambiental.

La biotecnología y la biología molecularofrecen nuevas herramientas a losmejoradores, aumentando las posibilidadesy la eficiencia en la obtención de variabilidadgenética y en la selección de caracteres de-seables, brindando además alternativas via-bles para identificar, seleccionar y transferirgenes de resistencia.

El cultivo in vitro fue una de las primerasherramientas de la biotecnología utilizadasen la búsqueda de resistencia a enfermeda-des. Desde sus distintas alternativas brindasoluciones para sortear barreras en los cruza-mientos, colaborando además en la selecciónde genotipos resistentes. En lo que respectaa la ingeniería genética, la resistencia a en-fermedades fúngicas y bacterianas no ha al-canzado el mismo nivel de desarrollo que laresistencia a insectos o virus. Sin embargoexisten numerosos proyectos de investiga-ción en curso y se prevé un gran desarrollocomercial en los próximos años.

En este capítulo se intentará ofrecer unpanorama actualizado de las herramientasque la biotecnología vegetal brinda almejorador para el estudio y control de lasenfermedades fúngicas y bacterianas.

2 Cultivo in vitro

Es posible encontrar genes de resistenciaen muchas de las especies cultivadas o enespecies muy cercanas filogenéticamente ytransferirlos por cruzamientos convenciona-les a especies susceptibles. Sin embargo, aveces, es necesario recurrir a especies no tancercanas filogenéticamente, pudiendo exis-tir barreras de incompatibilidad. En estos ca-sos es posible obtener híbridos viables con lautilización de técnicas tales como el rescatede embriones, la hibridización somática, la

324 ZAPPACOSTA, Diego

fusión de protoplastos, la polinización invitro, etc. Estas técnicas ya fueron descriptasen capítulos precedentes y son utilizadaspara la incorporación de diversas característi-cas entre las que encontramos la resistenciaa enfermedades.

Una técnica promisoria es la selección invitro de materiales resistentes utilizando alpatógeno vivo o algún metabolito purifi-cado o no del mismo u otras sustancias quí-micas como agente de selección. Esta técni-ca será tratada con más detalle a continua-ción.

2.1 Selección in vitro de genotiposresistentes

Los ensayos para la selección de resisten-cia a patógenos («screening») y el estudiode la interacción hospedador-patógeno bajocondiciones de campo se encuentran sujetosa una gran variación entre experimentos.Esto se debe principalmente a la distribuciónno uniforme de los patógenos y a la falta decontrol sobre las variables ambientales. Porejemplo, en el caso de enfermedades delsuelo, los períodos relativamente largos decrecimiento favorecen el desarrollo de otrasenfermedades que pueden interferir y afec-tar la validez de los resultados. Por esta ra-zón, queda claro que los ensayos de selec-ción por resistencia a enfermedades debenrealizarse, en lo posible, bajo condicionescontroladas. Estas condiciones raramentepueden encontrarse a campo. Se han plan-teado alternativas utilizando invernáculos oambientes controlados, lo cual soluciona al-gunos de los problemas mencionados ante-riormente. En estas situaciones, la selecciónde genotipos resistentes se basa en la ob-servación de la respuesta de genotipos indi-viduales en la población de plantas ante lapresencia del patógeno. Otras metodologíasplantean el uso de metabolitos producidospor el patógeno, que en algunos casos handemostrado tener el mismo efecto que elmicroorganismo mismo. Esto último se ob-serva principalmente cuando las toxinas pro-ducidas por el hongo son factores de virulen-cia importantes.

La selección in vitro se basa en exponerplantas, órganos, tejidos o células vegetales

a patógenos o sus metabolitos simulando lainteracción hospedador-patógeno que tienelugar en la naturaleza. Esta técnica permiteestandarizar la evaluación, haciéndola repe-tible y confiable, con la ventaja adicional deque en un espacio reducido y en un cortoperíodo se puede chequear la resistencia otolerancia de gran cantidad de individuos.Esto brinda además la posibilidad de poderensayar callos y plántulas, sin necesidad detrabajar con plantas adultas. Presenta, sinembargo, algunos inconvenientes, tales comola falta de correlación in vitro-in vivo y la po-sible aparición de modificaciones genéticas nodeseables originadas por el pasaje por culti-vo in vitro. No obstante, en algunos casos,la respuesta obtenida in vitro ha demostra-do tener una estrecha correlación con la re-sistencia-tolerancia obtenida in vivo (Yoder,1980).

Diferentes técnicas in vitro pueden serexplotadas para seleccionar o inducir varian-tes con mayor resistencia a enfermedades opara establecer modelos de estudio deinteracciones planta-patógeno. Sin embargo,la elección de la estrategia experimental de-pende del sistema hospedador-patógenoconsiderado. Las principales variables a teneren cuenta son (Daub, 1986):

§ La naturaleza y complejidad de las téc-nicas de cultivo in vitro requeridas (cultivo deembriones, regeneración de plantas desdesuspensiones celulares, callos, etc.).§ El nivel en que se realiza la selección o

«screening» (in vitro o en plantas regenera-das luego de realizar manipulaciones in vitro)§ Los agentes utilizados para la selección

de resistencia (el patógeno mismo, filtrados,toxinas específicas o toxinas de otro patóge-no muy relacionado, agentes químicos, etc.).§ El origen de la nueva resistencia busca-

da (recuperación de variación existente, cam-bios espontáneos, mutagénesis, etc.).

Muchos microorganismos patógenos deplantas producen fitotoxinas, que sonmetabolitos tóxicos, no enzimáticos, que, noobstante hallarse a bajas concentraciones,dañan a las plantas (Tabla 1). Una toxinaespecífica es un metabolito producido por elpatógeno que posee la misma especificidadpor el material vegetal que el patógeno mis-


mo. En cambio, las toxinas no específicas sonmetabolitos producidos por el patógeno quepueden tener alguna relevancia en el desa-rrollo de la enfermedad, pero no son respon-sables de todos los daños causados por elmismo. Sin embargo, en algunasinteracciones compatibles estas toxinas noespecíficas pueden ser necesarias para unainfección exitosa y en otros casos son sólodeterminantes secundarios de la enferme-dad. El mecanismo responsable de su toxici-dad varía con el patosistema y, en muchosde ellos, el(los) rol(es) de las toxinas en lapatogenicidad no está(n) claramenteestablecido(s), especialmente en los casos detoxinas no específicas, como por ejemplo elácido fusárico. En general se considera queactúan como factores de virulencia, debilitan-do al hospedador o inhibiendo o retardan-do las respuestas de defensa (Johal, 1995).Buscando resistencia a toxinas se puede ha-llar resistencia a patógenos, ya que la toxinapuede tener un rol decisivo en la patogénesis(McCormick y col., 1998).

En algunas especies de plantas se ha te-nido éxito en la selección de materiales resis-tentes a patógenos utilizando toxinas espe-cíficas como presión de selección in vitro.Entre las interacciones más estudiadas pode-mos mencionar el caso de avena-Cochliobolus victoriae, caña de azúcar-Drechslera sacchari y plátano-Mycosphaerella fijiensis.

También se pueden usar toxinas no es-pecíficas para la selección de materiales re-sistentes. Muchos patógenos producen es-

tos metabolitos tóxicosy la resistencia a algunode ellos puede mejorarla resistencia a la enfer-medad en forma cuali ycuantitativa. Ejemplosde selección usandotoxinas no específicasse encuentran en lasinteracciones: arroz-C.miyabeanus, tomate-Fusarium oxysporum,apio-Septoria apiicola,café-Colletotrichumkahawae, espárrago-F.o x y s p o r u m ,A r a b i d o p s i s - F .

moniliforme, cebolla-Phoma terrestris, en-tre otras.

Una de las principales limitaciones de estesistema de selección es precisamente el des-conocimiento del tipo de toxina(s) o la im-portancia de ellas en muchas enfermedades.También es de destacar que en algunasinteracciones donde se conocen toxinas es-pecíficas, las mismas no son activas en todoslos tejidos y células. Descifrar el fundamentobioquímico de la resistencia a una toxina fa-cilitaría el proceso de selección.

Aunque los comentarios anteriores seaplican fundamentalmente a patógenosfúngicos, las bacterias también producenfitotoxinas. En general, estas toxinas son noespecíficas y causan síntomas en muchas plan-tas que no son hospedadores del patógenoque las produce. Aunque las fitotoxinasbacterianas son generalmente no requeridaspara la patogénesis, ellas típicamente funcio-nan como factores de agresividad y su pro-ducción resulta en un incremento de la seve-ridad de la enfermedad (Bender, 1998).

Otra alternativa para la selección de ma-teriales resistentes es usar como presión deselección enzimas pectolíticas, cuando éstascumplen un rol importante en la patogénesis,como es el caso de los patógenos que pro-ducen la maceración de los tejidos que ata-can. Un ejemplo de ello lo constituye lainteracción entre Rhizoctonia fragariae yBotrytis cinerea con la frutilla, donde se lo-gró seleccionar plantas con mayor resisten-cia a los patógenos mencionados utilizando

Tabla 1: Principales toxinas de microorganismos patógenos de plantas


enzimas pectolíticas purificadas a partir decultivos líquidos de los mismos.

La falta de toxinas relevantes en la pato-génesis de muchas enfermedades y/o acti-vas a nivel celular, ha llevado a establecer yestudiar sistemas in vitro con el patógenomismo. Uno de los mayores problemas enestos sistemas es controlar el crecimientoexcesivo del patógeno, sea bacteria u hon-go, sobre el material vegetal y sobre el me-dio de cultivo y la dificultad para interpretarlos resultados. Otro inconveniente es la co-rrelación entre las interacciones hospedador-patógeno in vitro e in vivo (la resistencia invitro puede no ser expresada in vivo o la si-tuación recíproca). Un prerrequisito para unaeficiente selección in vitro utilizando al pa-tógeno es que el sistema invitro sea consistente con loseventos que suceden a nivelde planta (hay que tener encuenta cuáles son los tejidossusceptibles, el estado fisio-lógico de la planta, etc.). Enel caso de hongos biótrofosobligados y en muchosnecrótrofos las técnicas decocultivo han resultado seruna solución para cultivarlosen condiciones controladas.El cultivo dual de hongosnecrótrofos y tejidos vegeta-les puede resultar óptimopara estudios básicos y apli-cados, constituyendo un sis-tema simplificado en el cualfactores nutricionales y am-bientales pueden ser cuida-dosamente controlados. Seha establecido exitosamen-te este sistema de cultivopara las interacciones alfalfa-P h y t o p h t h o r amegasperma, tabaco-P.parasitica var. nicotianae,t a b a c o - P e r o n o s p o r atabacina, caña de azúcar-Sclerospora sacchari, abe-to-Ceratocystis polonica yLamium purpureum-Coniothyrium palmarum,entre otras (Miller, 1985).

3 Obtención de resistencia utilizandoherramientas de ingeniería genética

Una de las alternativas biotecnológicasmás promisorias para obtener resistencia aenfermedades es la incorporación de genesde resistencia mediante tecnología génica.Estas técnicas han sido descriptas previamen-te (ver III.-3), por lo que en esta sección sólose tratarán las situaciones específicas de re-sistencia a bacterias y hongos patógenos.

Como resultado de los estudios tendien-tes a la identificación, clonación y caracteri-zación de genes involucrados en la resisten-cia a enfermedades han sido identificadosmuchos mecanismos que las plantas utilizanpara responder a la infección de patógenos,

Figura 1: Principales mecanismos de defensa que presentan las plantasfrente al ataque de microorganismos (modificado de Kombrink y Somssich,1995).


lográndose avances en el conocimiento delos genes que participan en estas respuestas(Fig. 1). La identificación de estos genes per-mitió la evaluación de su rol específico y suforma de activación mediante el empleo deplantas transgénicas. Numerosos trabajosdetallan los distintos mecanismos de defen-sa que las plantas poseen para contrarrestar

el ataque de microorganismos y son reco-mendados como una lectura accesoria almaterial que sigue a continuación (Kombrinky Somssich, 1995; Durand-Tardif y Pelletier,2003).

3.1 Resistencia a hongos fitopatógenosLa selección de genes de resistencia para

ser introducidos en plantas por tecnologíagénica se basa, en parte, en la evaluación dela toxicidad de productos génicos sobre elcrecimiento y desarrollo de los patógenos invitro y del rol del gen en las respuestas deresistencia. Muchos productos génicos per-tenecen al grupo de las proteínas relaciona-das a la patogénesis (van Loon, 1999), mien-tras que otras pertenecen a las víasbiosintéticas de las fitoalexinas (compuestosantimicrobianos de bajo peso molecular pro-

ducto del metabolismo secundario) o forta-lecen las defensas estructurales (por ejemplofortificación de la pared celular). Algunas res-puestas normales de resistencia son relativa-mente lentas, detectándose, en algunos ca-sos la expresión 48 hs luego de la infección(Fig. 2).

En el caso de plantas transgénicas la ideasería lograr expresión temprana osobreexpresión del producto, general-mente a través de promotores cons-titutivos. Otros genes interesantesson aquellos que participan en las víasde inducción de los mecanismos na-turales de resistencia. Recientemen-te, la clonación de numerosos genesR (de resistencia) ha precipitado elinterés en el uso de estos genes paraobtener resistencias de amplio espec-tro.

Las principales estrategias de con-trol de enfermedades fúngicas me-diante el uso de plantas transgénicaspueden ser agrupadas en cinco cate-gorías (Punja, 2001):

• Expresión de productosgénicos que son directamente tóxi-cos para los patógenos o que redu-cen su crecimiento. Incluyen proteí-nas relacionadas a la patogénesis (pro-teínas PR), como enzimas hidrolíticas(quitinasas, 1,3-β-glucanasas), proteí-nas antifúngicas (osmotinas y tau-

matinas), péptidos antimicrobianos (tioninas,defensinas, lectinas), proteínas de transfe-rencia de lípidos (LPT), proteínas inactiva-doras de riboso-mas 28S rRNA fúngicos (RIP)y fitoalexinas.

• Expresión de productos génicos quedestruyen o neutralizan componentes deataque del patógeno. Por ejemplo:inhibidores de poligalacturonasas (enzimasque degradan algunos componentes de lapared celular vegetal), ácido oxálico o lipasas.

• Expresión de productos génicos quemejoran las defensas estructurales de laplanta. Consiste en la elevación de los nive-les de ligninas y peroxidasas asociadas a lapared celular.

• Expresión de productos génicos queparticipan en las vías de señales que regu-lan las defensas. Incluyen la producción de

Figura 2: Tiempo relativo de inducción de las principales defensascontra patógenos fúngicos (modificado de Kombrink y Somssich,1995).


elicitores específicos, peróxido de hidrógeno(H2O2), ácido salicílico o etileno.

• Expresión de productos de genes deresistencia (genes R). Participan en la reac-ción de hipersensibilidad y en la interaccióncon factores de avirulencia.

3.2 Enzimas hidrolíticas

La estrategia más ampliamente utilizadaes la sobreexpresión de enzimashidrolíticas tales como 1,3-β-glucanasas oquitinasas, que degradan la pared celular dehongos y han demostrado tener actividadantifúngica in vitro.

Con la expresión de diferentes tipos dequitinasas en varias especies vegetales se halogrado reducir el tamaño, el número y eldesarrollo de lesiones causadas por varioshongos patógenos, algunos de amplio ran-go de hospedadores, como por ejemploBotrytis cinerea y Rhizoctonia solani. La ex-presión de quitinasas ha sido inefectiva, sinembargo, para el control de Cercosporanicotianae, Colletotrichum lagenarium yPythium spp., indicando que en los hongosexisten diferencias en la sensibilidad a estetipo de enzimas. Las diferentes quitinasaspresentan variación en características talescomo especificidad de sustrato, pH óptimo ylocalización celular, lo cual trae aparejadasdiferencias en su actividad antifúngica. Aun-que los resultados de estos estudios no hansido espectaculares en términos de niveles decontrol de la enfermedad, la tasa de progre-sión y la severidad de la misma pudieron sersignificativamente reducidas, como se hademostrado en cultivos transgénicos evalua-dos a campo (Melchers y Stuiver, 2000).

Los resultados obtenidos utilizando 1,3-β-glucanasas son similares a los dequitinasas. La expresión combinada de am-bas enzimas en varias especies ha reveladoun comportamiento mucho más efectivo enla prevención del desarrollo de varias enfer-medades que la expresión de una sola deellas, corroborando los resultados obtenidosen los ensayos in vitro. Lo mismo sucede conotras proteínas PR con actividad antifúngicain vitro, tales como osmotina y taumatina(TLP), que en plantas transgénicas muestranuna disminución de los daños causados porenfermedad, pero los resultados más alen-

tadores aparecen cuando se expresan encombinación con quitinasas y 1,3-b-glucanasas.

Como regla general, el uso de estrategiasde ingeniería genética que involucren la ex-presión de dos o más productos de genesantifúngicos en un determinado cultivo de-bería proveer un control de la enfermedadmás efectivo y de más amplio espectro queel uso de estrategias con un solo gen (Shah,1997).

3.3 Péptidos antimicrobianos

Las defensinas y tioninas son péptidos debajo peso molecular, ricos en cisteína, queposeen actividad antimicrobiana. Lasobreexpresión de estas proteínas en plan-tas transgénicas reduce el desarrollo de va-rios patógenos como Fusarium y Alternariay confiere resistencia a Verticillium en papaen condiciones a campo.

También se han desarrollado plantastransgénicas que expresan pequeñospéptidos antimicrobianos sintéticos (10-20aminoácidos) que pueden afectar a las hifas,a la pared celular o aumentar la permeabili-dad de las membranas celulares fúngicas. Lahabilidad para crear recombinantes sintéti-cos o variantes combinadas de péptidos ofre-ce nuevas oportunidades para lograr resisten-cia a un amplio rango de patógenos de ma-nera simultánea, siendo alternativaspromisorias para mejorar la eficacia de lasplantas transgénicas en el futuro (Lassner yBedbrook, 2001).

3.4 Fitoalexinas

Son otro grupo de compuestosantimicrobianos, productos del metabolismosecundario, presentes en un amplio rango deespecies vegetales cuya expresión es induci-da por la infección de patógenos y elicitores.Son sintetizados a través de complejas víasbioquímicas, como la del shikimato. La mani-pulación genética para suprimir o mejorar laproducción de fitoalexinas no es sencilla, yaque se hallan involucradas varias enzimas.

Como en el caso de las enzimashidrolíticas, no se ha demostrado conclu-yentemente su rol en mejorar la resistenciaa enfermedades en muchas interacciones


hospedador-patógeno. En plantas transgé-nicas se ha demostrado que la sobreexpre-sión de genes que participan en la síntesisde ciertas fitoalexinas como el resveratrol yla medicarpina resulta en una demora en eldesarrollo de la enfermedad y en la apariciónde los síntomas producidos por variospatógenos en distintas especies vegetales.Sin embargo, hay que tener en cuenta quelas fitoalexinas son potencialmente tóxicaspara los animales y tienden a no ser específi-cas en su acción, por lo tanto es necesariorealizar más evaluaciones de los riesgos po-tenciales de su utilización, además de las re-lacionadas con sus características de conferirresistencia a enfermedades (Essenberg,2001).

3.5 Compuestos que mejoran lasdefensas estructurales de la planta

La pared celular vegetal es una barreraque los patógenos tienen que superar en suataque y lo logran a través de enzimas quela degradan (como las poligalacturonasas) omediante la acción de toxinas. Se han dise-ñado plantas transgénicas que expresaninhibidores de poligalacturonasas, pero losresultados por el momento no son conclu-yentes. Otra estrategia considerada ha sidola sobreexpresión de peroxidasas, enzimasque participan en la lignificación de la paredcelular. La lignificación alrededor de los sitiosde infección es un mecanismo natural quepresentan las plantas para restringir el ata-que de patógenos. Mediante esta estrate-gia se logró un aumento en los niveles delignina de la planta, que no brindó, sin em-bargo, una mejora en la resistencia a enfer-medades en varios sistemas hospedador-patógeno estudiados.

Una opción más reciente es la expresiónde enzimas que degradan toxinas fúngicas,como la expresión en tabaco de una enzimadegradadora de tricotecenos de Fusariumsporotrichloide, que reduce el daño a los te-jidos y mejora la emergencia de plántulas enpresencia de la toxina. La inactivación de fac-tores de virulencia específicos por productosgénicos expresados en plantas transgénicases una estrategia promisoria para reducir eldesarrollo de patógenos específicos.

3.6 Elicitores

Las vías de señales que coordinan las res-puestas de defensa en las plantas, que inclu-yen la reacción de hipersensibilidad (RH), laproducción de proteínas PR y de fitoalexinas,pueden ser activadas por moléculas llamadaselicitores. La inducción de RH y necrosis, queresulta en la activación de respuestas de de-fensa, podría resultar en una inducción deresistencia a un amplio espectro de enferme-dades. El uso de estas estrategias requeriría,sin embargo, de la cuidadosa manipulaciónde vías metabólicas complejas, cuya altera-ción podría tener efectos secundarios nodeseables sobre otros caracteres del cultivo,ya que intervienen en varios procesos vege-tales. Mediante el uso de plantastransgénicas se han disectado genéticamen-te muchas de estas vías, identificándose mu-chos de los compuestos intervinientes en lasrespuestas de defensa a patógenos.

El peróxido de hidrógeno (H2O2) inhibe elcrecimiento de patógenos y activa ciertas víasde trasmisión de señales que inducen res-puestas de defensa. La expresión de niveleselevados de H2O2 en plantas transgénicas através de la expresión de la glucosa oxidasareduce los efectos causados por patógenoscomo Rhizoctonia, Verticillium,Phytophthora y Alternaria en varias espe-cies cultivadas. Hay que tener en cuenta, sinembargo, que niveles elevados de H2O2 sonfitotóxicos.

Otros activadores de defensas son el áci-do salicílico, el etileno y el ácido jasmónico.La manipulación de los niveles de ácidosalicílico en plantas transgénicas tiene un granpotencial para mejorar la resistencia a enfer-medades, ya que no sólo inducen la expre-sión de proteínas PR, sino también la deotros productos de defensa, los cuales, enconjunto, han demostrado tener unainteracción sinérgica y conferir elevados nive-les de resistencia (Lawton, 1997).

3.7 Genes R

Estos genes son los más utilizados enmejoramiento convencional ya que son de-terminantes simples de una resistencia efec-tiva y específica. En su mayoría, los produc-tos de estos genes actúan reconociendo in-


directamente factores de avirulencia depatógenos a través de correceptores, perotambién hay casos de interacción directa (Fig.3). Existen varios ejemplos de plantastransgénicas que expresan genes R; sin em-bargo, debido a la complejidad de las vías deseñales involucradas en las respuestas dedefensa, es improbable que la expresión deun solo gen mejore la tolerancia a enferme-dades. Se dispone de una gran cantidad degenes R clonados cuyo análisis permitirá laobtención de genes R sintéticos con domi-nios funcionales adecuados que confieranresistencias de amplio espectro (Rommens yKishore, 2000).

4 Perspectivas

El desarrollo de plantas transgénicas conresistencia a enfermedades fúngicas no haalcanzado el éxito logrado en el desarrollode otras resistencias, como por ejemplo aherbicidas, insectos o virus. La mayoría de losestudios se han realizado sobre sistemasmodelo como tabaco, habiendo pocos estu-dios a campo, estimándose la aparición en elmercado de materiales transgénicos con re-sistencia a hongos en los próximos años.

En la mayoría de los casos mencionadosanteriormente, la expresión de lostransgenes ha sido constitutiva, lo cual espositivo para el control de patógenos que

afectan al mismo tiempo varios ti-pos de órganos como hojas, tallosy frutos. Sin embargo, cuando la ac-ción de los patógenos es específicade órganos o tejidos es recomenda-ble el uso de promotores específicos.En ciertos casos la actividadantifúngica de determinados com-puestos mejora cuando actúan enel espacio apoplástico o son volca-dos en la vacuola. En este aspectoes necesario orientar los esfuerzoshacia la búsqueda de promotoresespecíficos inducibles por patógenosy a la evaluación de los sitios másadecuados de expresión de lostransgenes a fin de desarrollar plan-tas transgénicas con elevados nive-les de resistencia a un amplio espec-tro de enfermedades.

Las expectativas puestas en eldesarrollo de plantas transgénicas son gran-des, ya que podrían brindar soluciones parael control de distintas enfermedades, comolas provocadas por patógenos de amplio ran-go de hospedadotes, entre los que se en-cuentran Rhizoctonia solani y Botrytiscinerea, para los cuales existen muy pocasfuentes convencionales de resistencia.

Las plantas transgénicas expresando re-sistencia a enfermedades podrían ser cues-tionadas porque:

§ Los productos génicos antimicrobianospodrían tener efectos adversos sobre lamicroflora no patogénica que habita sobreo en las inmediaciones de las plantas.§ Los productos antifúngicos expresados

podrían tener efectos indeseables en la sa-lud de los organismos que consumen dichasplantas, en particular el hombre.§ Una fuerte presión sobre los patógenos

podría llevar a la aparición de nuevas cepasresistentes y la ruptura de genes de resisten-cia nuevos o existentes.§ Algunos productos de genes de resis-

tencia, como las proteínas PR, los compues-tos antifúngicos y los inhibidores depoligalacturonasas (PGIP), reducen el desarro-llo de la enfermedad, pero no la previenentotalmente.§ La inducción de muerte celular y de RH

pueden ser peligrosas, ya que si no son co-

Figura 3: Modelos de interacción entre productos de avirulenciadel patógeno (Avr), sitio target de este producto en la célula vegetal(T) y productos de genes de resistencia R (R1 y R2). (modificado deHammond-Kosack y Parker, 2003).


rrectamente controladas pueden provocarimportantes alteraciones metabólicas.§ La existencia de un escudo general de

resistencia, que es lo que se busca con nive-les elevados de resistencia de amplio espec-tro, puede llevar a la pérdida de genes me-nores de resistencia en el cultivo y, si un pa-tógeno logra eludir esta barrera, no existiríanotras para detener su avance.

5 Resistencia a bacterias

Sólo una pequeña proporción de las bac-terias son fitopatogénicas y han desarrolla-do mecanismos para invadir y colonizar plan-tas hospedadoras y causar enfermedades. Porello los esfuerzos invertidos en lograr resis-tencia a bacterias por tecnología génica hansido escasos. La mayoría de los mismos se hancentrado en una bacteriosis importante enel ámbito mundial para la cual no se han ha-llado genes de resistencia potencialmentetransferibles por cruzamientos convenciona-les, como es el caso de la podredumbre blan-da y pie negro de la papa, causados porErwinia carotovora (During, 1996).

Las principales estrategias para lograr re-sistencia a bacterias fitopatógenas son lassiguientes:

• Expresión de péptidos bactericidas(cecropinas) provenientes de insectos y ra-nas, que actúan a nivel de la membranabacteriana.

• Expresión de tioninas, que sonpolipéptidos ricos en cisteína presentes enendosperma y hojas de los cereales, cuya ac-ción, no específica, se basa en la permea-bilización de las membranas celulares.

• Expresión de la lisozima delbacteriófago T4 y de huevo de gallina.

• Cambio de la enzima blanco de toxi-nas bacterianas o expresión de enzimasdetoxificantes provenientes del mismo pató-geno u otro organismo.

• Síntesis de fitoalexinas, que general-mente involucra la modificación de víasbiosintéticas complejas, las cuales no siem-pre son accesibles a la ingeniería genética.

Los resultados, en algunos casos, han sidopromisorios, aunque la estrategia más inten-

samente investigada, la expresión dececropinas, no ha producido resultados con-cluyentes, especialmente en los ensayos acampo. Este péptido es degradado porenzimas vegetales, por lo cual sería necesa-rio el desarrollo de análogos resistentes aproteasas.

La expresión de tioninas de cereales entabaco mejora la resistencia a Pseudomonassyringae. Estas proteínas poseen actividadantimicrobiana in vitro y su expresión cons-titutiva trae aparejada una disminución sig-nificativa del crecimiento de la bacteria y unareducción en el porcentaje de lesionesnecróticas.

Las lisozimas son enzimas que catalizanla hidrólisis de la mureína, constituyente dela pared celular bacteriana. Se localizan en lasvacuolas de varias especies vegetales y co-múnmente poseen fuerte actividadquitinasa. Antes del inicio de una enferme-dad las bacterias patógenas se acumulan engrandes cantidades en los espaciosintercelulares de la planta. Las lisozimas sóloentran en contacto con las mismas luego dela ruptura de la célula, cuando las bacteriasson demasiado numerosas como para serefectivamente controladas. Por ello, las es-trategias se han centrado en dirigir laslisozimas hacia el espacio intercelular. Pocaslisozimas vegetales han sido caracterizadas yclonadas, por lo que se han buscado lisozimasde otros orígenes para ser expresadas enplantas transgénicas, como la del bacteriófa-go T4 y la de huevo de gallina. Esta estrate-gia ha dado buenos resultados en varios ca-sos y es una de las más prometedoras.

Algunas bacterias producen toxinas queson clave en el desarrollo de la enfermedad,como por ejemplo la tabtoxina dePseudomonas syringae pv. tabaci, que ac-túa sobre la síntesis de glutamina, provocan-do clorosis. La expresión del gen trr que co-difica para una enzima bacteriana que pro-tege de la acción de la tabtoxina ha logradodisminuir los síntomas de la enfermedad, me-jorando la resistencia. Otra ejemplo es la ex-presión en plantas de tabaco de ornitiltranscarbamilasas insensibles a la toxina deP. syringae pv. phaseolicola, que inhibe laactividad de la misma en poroto.

Los hospedadores resistentes y algunosno hospedadores son capaces de reconocer


y combatir las bacterias fitopatógenas. Estasplantas resistentes reaccionan con una muer-te celular localizada en el sitio de infección(RH), que es inducida por compuestosbacterianos llamados elicitores, tales comoproteínas de avirulencia (proteínas Avr), queson reconocidos por proteínas receptoras delhospedador (Fig. 1). La dilucidación de losmecanismos de resistencia en hospedadoresresistentes posibilita la obtención de plantastransgénicas que expresen diferentes recep-tores que reconozcan una variada gama deelicitores bacterianos (harpinas, proteínasAvr, etc.) y que activen las respuestas de de-fensa.

Varias de las estrategias mencionadaspreviamente son potencialmente aplicablesen el control de bacterias fitopatógenas. Lasque implican la expresión de proteínasantibacterianas, tales como cecropinas ylisozimas, tienen la ventaja de implicar a unsolo gen y conferir resistencia amplia. Lainactivación de toxinas bacterianas o la mo-dificación del sitio blanco de dichas toxinaspuede brindar una estrategia mucho másespecífica y eficiente.

6 Genómica y enfermedades causadaspor bacterias

En este área también está incursionandola genómica. Xylella fastidiosa es una bac-teria que vive en el xilema de las plantas, cau-sando enfermedades que producen grandespérdidas económicas, incluyendo clorosisvariegada en cítricos. Un grupo debiotecnólogos brasileños seleccionó este pa-tógeno para secuen-ciación genómica debi-do a la gran importancia de los cítricos parala economía de Brasil. Los frutos de las plan-tas afectadas son más pequeños y no tienenvalor comercial. Utilizando programas de pre-dicción de secuencias se han encontrado enel genoma de esta bacteria, que consta demás de 2.5 millones de pares de bases, unos2.904 genes. A la mitad de los mismos se lesha asignado funciones sobre la base de com-paraciones realizadas con otros genomas. En-tre estos genes se encuentran algunos queestán involucrados en la patogenicidad, ge-nerando compuestos que actúan en diferen-tes procesos, como:

- Proteínas involucradas en la síntesis ysecreción de toxinas.

- Enzimas involucradas en la ruptura delas paredes celulares.

- Enzimas para detoxificar de compues-tos de defensa de la planta.

- Transportadores eficientes de azúcares,que permiten la existencia en el xilema, po-bre en nutrientes.

- Proteínas regulatorias, que ayudan aregular la expresión génica para mantener elcrecimiento en distintos ambientes.

- Síntesis y excreción de polisacáridosextracelulares.

- Genes involucrados en la eliminación deantibióticos, que podrían se producidos porla planta para matar a la bacteria.

- Captación y secuestro de hierro y otrosmetales.

7 Situación en la Argentina

La Comisión Nacional Asesora deBiotecnología Agropecuaria (CONABIA) havenido autorizando la realización de pruebasde laboratorio-invernáculo o a campo deplantas transgénicas que expresan resisten-cia a enfermedades. Del total de autorizacio-nes realizadas en el periodo 1998-2002, 39(aproximadamente el 10%) corresponden asolicitudes presentadas por distintas empre-sas o instituciones para la evaluación de dis-tintos materiales con resistencia a enferme-dades. En la tabla 2 se presenta una lista dealgunas de las liberaciones autorizadas.

8 Resumen

Los hongos y bacterias fitopatógenos sonresponsables de gran parte de las pérdidasque se producen sobre los cultivos. Una delas formas de control más eficiente es a tra-vés de la resistencia genética. Sin embargo,no siempre es posible incorporar genes deresistencia en plantas de cultivo por mejora-miento convencional. La biotecnología brin-da al mejorador nuevas herramientas parala búsqueda e incorporación de resistenciasa través del cultivo in vitro y la ingenieríagenética. Mediante el cultivo in vitro es posi-ble sortear barreras a la hibridización y selec-cionar rápida y eficientemente materialesresistentes a enfermedades. La selección invitro se basa en exponer plantas, órganos,tejidos o células vegetales a patógenos o susmetabolitos simulando la interacción


hospedador-patógeno que tiene lugar en lanaturaleza. Mediante tecnología génica esposible transferir genes que confieren resis-tencia a enfermedades. Las estrategias másutilizadas son la expresión de compuestosantimicrobianos (enzimas hidrolíticas, proteí-nas antimicrobianas), la expresión de enzimaso compuestos que neutralizan componentesde ataque del patógeno (inhibidores depoligalacturonasas, inactivadores de toxinas),fortalecimiento de las defensas estructurales(aumento en los niveles de ligninas operoxidasas) o la modificación de las vías deseñales que regulan las defensas por la pro-ducción de elicitores específicos (peróxido dehidrógeno, ácido salicílico o etileno). Lagenómica brinda nuevas herramientas parala detección de genes involucrados en lapatogénesis y, aunque actualmente no exis-ten en el mercado plantas transgénicas queexpresen resistencia a enfermedades fúngicaso bacterianas, el nivel de desarrollo alcanza-do indica que en un futuro muy próximo apa-recerán plantas resistentes a enfermedadeslogradas por ingeniería genética.


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Tabla 2: Lista de algunas de las liberaciones de plantas transgénicas con resistencia aenfermedades autorizadas por la CONABIA (recopilación de la página web de laCONABIA, http://www.sagpya.mecon.gov.ar)


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PARTE IXBioseguridad y regulación de

organismos vegetalesgenéticamente modificados

(OVGM)

374 RUBINSTEIN, Clara


IX.-Capítulo I

Criterios científicos para la evaluaciónde la bioseguridad de organismosgenéticamente modificados.

Rubinstein, Clara

Si bien las tecnologías de mejoramientode variedades tradicionalmente utilizadasintroducen modificaciones genéticas y produ-cen efectos no intencionales, las tecnologíasde ADN recombinante presentan caracterís-ticas propias que se han considerado lo sufi-cientemente novedosas a nivel de las orga-nizaciones internacionales que han recomen-dado su regulación. Las características de unorganismo vegetal genéticamente modifica-do (OVGM) son estudiadas y evaluadas des-de las etapas más tempranas desu desarrollo desde el punto devista de su bioseguridad. Paraello, se utiliza un enfoque com-parativo que ha sido desarrolla-do con anterioridad a la apari-ción de cultivos transgénicos osus derivados alimentarios en elmercado. Fue descripto por pri-mera vez en este contexto, enun documento de la OECD (Or-ganización para la Cooperacióny el Desarrollo Económico) de1993, que fue el resultado de dosaños de discusiones que reunie-ron a más de 60 expertos de 19países. Este enfoque, así comolos criterios científicos utilizadospara su implementación, son pre-sentados en este capítulo, con énfasis en lainocuidad para el consumo.

A lo largo de la historia, los mejoradoreshan apelado a todo tipo de tecnologías paragenerar diversidad genética, de la cual poderseleccionar aquellas características deseadas.En los capítulos y secciones anteriores se handescripto las más recientes, que se suman aotras, utilizadas durante siglos con el mismofin.

La aplicación de las técnicas de ADNrecombinante al mejoramiento vegetal enla década de 1980, sin embargo, marcan unpunto de inflexión, dada las preocupaciones

que han generado en diferentes ámbitos yposteriormente, también debido a su impac-to en la percepción pública, en especial en laUnión Europea.

El National Research Council de los EE.UU.,publicó en 1989 un informe en el cual analizalas diferencias entre el mejoramiento tradi-cional y las nuevas biotecnologías para lamodificación genética de plantas y microor-ganismos. En este informe, se incluye a lastecnologías de ADN recombinante comoparte integrante de la secuencia de los avan-ces del conocimiento y de la tecnología cien-tífica, a lo largo de 10.000 años de desarrollohumano (NRC, 1989, ver Fig 1). También con-cluyen en que «las mismas leyes físicas y bio-lógicas gobiernan la respuesta de los orga-nismos modificados por los modernos mé-todos moleculares y celulares y aquéllosproducidos por métodos clásicos».

Al mismo tiempo, organismos internacio-nales como FAO y OMS (la Organización parala Alimentación y la Agricultura y la Organiza-ción Mundial de la Salud, respectivamente)se han ocupado de la bioseguridad de lasnuevas tecnologías aplicadas a la producciónde alimentos. Un informe conjunto de 1991afirma que «la biotecnología tiene una lar-ga historia de uso en producción y proce-samiento de alimentos. Representa un con-tinuo abrazo entre las técnicas de repro-ducción tradicionales y las últimas técnicasbasadas en la biología molecular.» «El usode estas técnicas no resulta en alimentos

Figura 1: Aumento en la capacidad de modificación genética a través deltiempo Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adaptado de NRC,1989


inherentementes menos seguros que losproducidos por técnicas convencionales».

Se desprende de esto, así como de lo ex-puesto en capítulos anteriores, que todas lasespecies mejoradas por el hombre son, deun modo u otro, «genéticamente modifica-das». A pesar de esto, la aplicación de lastécnicas de ingeniería genética a la produc-ción de alimentos ha sido considerada losuficientemente nueva y diferente, comopara justificar el control de su desarrollo eimplementación.

Esto tiene sus antecedentes en las prime-ras etapas del desarrollo de la ingenieríagenética, en los años 70. En 1974 y 1975, losInstitutos Nacionales de Salud de los EE.UU.(NIH) convocan a las Conferencias deAsilomar (California), éste fue el primer pasopara la creación de políticas para el controlde la seguridad de organismos recombi-nantes. Desde allí, y en todo el mundo, hanevolucionado estas políticas y las regulacio-nes que controlan el desarrollo de nuevosorganismos y sus productos mediante técni-cas de ADN recombinante.

Estas regulaciones se basan en criterioscientíficos y también empíricos, en particular,en lo que hace a la seguridad de los alimen-tos. En efecto, muchos de nuestros conoci-mientos sobre la inocuidad de lo que co-memos, proviene de cientos o miles de añosde experiencia, ensayos y errores. Aunquelos alimentos tradicionalmente disponibles enlas diferentes culturas se aceptan como se-guros, se sabe que algunos pueden ser tóxi-cos, según la parte de la planta que se con-suma por ejemplo el tallo se puede consu-mir, pero no así las hojas o las raíces o elestadío de su desarrollo. También hay alimen-tos de origen vegetal que deben ser cocina-dos para ser seguros (por ej. porotos), asícomo sabemos que hay grupos de alimen-tos que pueden provocar alergias en indivi-duos sensibles (maní, leche, nueces, huevo,soja).

En 1986 la OECD (Organización para elDesarrollo y la Cooperación Económica)convoca a reuniones de expertos que reúnensus recomendaciones en el llamado «BlueBook». Más adelante, en 1993, OECD resu-mió estos conceptos: «La seguridad de losalimentos para consumo humano se basaen que debe existir una certeza razonable

de que no resultará daño alguno del usodebido bajo las condiciones de consumoanticipadas. Históricamente, los alimentospreparados y utilizados bajo las condicio-nes tradicionales han sido considerados se-guros, por su historia de uso y experiencia,aun cuando pudieran contener tóxicos na-turales o antinutrientes. En principio, losalimentos se han considerado seguros, amenos que un peligro significativo se hayapodido identificar».

En este capítulo se intentará dar un pa-norama de los criterios científicos que se uti-lizan internacionalmente para evaluar la se-guridad de los cultivos transgénicos, tambiénllamados genéricamente OGM (OrganismosGenéticamente Modificados).

1. El análisis de riesgos y la identificacióndel peligro

Se ha establecido que el análisis de ries-gos consta de tres etapas fundamentales:

La identificación del peligro: es la iden-tificación y cuantificación de un efecto adver-so, en general, a partir de ensayos experi-mentales; por ejemplo, de tipo toxicológicoen modelos animales.

Valoración de la exposición: estima y sies posible cuantifica la frecuencia y el tiempode exposición a dicho peligro.

Caracterización del riesgo: es la estima-ción que surge de evaluar el peligro en fun-ción de la exposición y evaluar diferentes es-cenarios de exposición máxima, para estable-cer qué grado de exposición es aceptable encuanto a la seguridad.

Este proceso se aplica a casos muy dife-rentes, y existe amplia experiencia en su apli-cación a la evaluación de riesgos para aditi-vos alimentarios, agroquímicos y compuestosespecíficos en general. En esos casos, es rela-tivamente simple someter cantidades exac-tas y conocidas de un compuesto a ensayostoxicológicos clásicos en modelos animales,o evaluaciones de residuos en alimentos,aguas, suelos, etc. De esta forma, se estable-cen parámetros como el NOAEL (por NoAdverse Effect Level), que es el nivel deexposición en el que no se observan efec-tos adversos. Este da una medida de la peli-grosidad del compuesto: cuanto mayor el


NOAEL, menor el potencial tóxico del com-puesto. Basándose en el NOAEL, es posibleestimar un nivel de exposición seguro, quedefine el ADI (dosis diaria aceptable, expre-sada por kg de peso corporal) y que depen-diendo del tipo de sustancia y otras variables,suele estar unas 100 veces por encima delNOAEL. Este factor de multiplicación se co-noce como margen de seguridad para laexposición.

Sin embargo, estos principios no son tandirectamente aplicables al análisis de riesgospara OVGM o sus derivados de usoalimentario, ya que constituyen mezclas com-plejas, que contienen miles de compuestos,macro y micro nutrientes, tóxicos naturales(compuestos tóxicos que están naturalmen-te presentes en la especie), antinutrientes(compuestos que inhiben la absorción obiodisponibilidad de algunos nutrientes),metabolitos secundarios, etcétera.

Por lo tanto, la evaluación de estos culti-vos es más una evaluación de seguridad oinocuidad más que un análisis de riesgos «clá-sico», ya que hasta ahora no se han deter-minado peligros cuantificables en los OGMestudiados. De hecho, en la práctica, en casode identificarse efectos adversos, estoscultivos no se autorizarían para su salidaal mercado.

Por todo lo anterior, se ha desarrolladopara los OGM un enfoque que ha sido utili-zado para otros casos de alimentos y que sebasa en la comparación del nuevo alimen-to o cultivo con el tradicionalmente utili-zado y considerado seguro. Este enfoquese ha desarrollado consensuadamente conla colaboración de diferentes organismos in-ternacionales (OECD, FAO ,OMS,International Life Sciences Institute o ILSI) queperiódicamente convocan a paneles de ex-pertos que revisan y actualizan las recomen-daciones de acuerdo con los avances tecno-lógicos y el estado del conocimiento.

Es en este contexto dinámico y cambian-te, que se ha desarrollado el sistema de eva-luación de la seguridad alimentaria de OGM,como resume el documento de OECD, 1993:

«Nuestra comprensión de la naturaleza ycomposición de los alimentos aumenta cadadía y estamos investigando y conociendo másacerca de la importante relación entre dietay efectos sobre la salud. En el futuro, segura-

mente descubriremos nueva informaciónimportante acerca de beneficios especiales yriesgos ocultos en los alimentos que come-mos, que nos podrán ayudar a conducirnoshacia dietas más saludables.»

2. El enfoque comparativo y laequivalencia sustancial

En 1993 la OECD formuló el concepto deEquivalencia Sustancial. Este concepto noconstituye en sí la evaluación de inocuidadsino que es un marco de referencia queorienta la evaluación, que sí se basa en unEnfoque Comparativo.

Este enfoque no hace otra cosa que to-mar como referencia los cultivos o alimentosconocidos y aceptados como seguros y com-pararlos con sus versiones mejoradas median-te ingeniería genética. Es oportuno aclararque estas técnicas no en todos los casos vana tener como resultado la introducción de untransgén, sino que hay otras estrategias ex-perimentales - antisentido, silenciamientopor regulación epigenética o anulación dela actividad de un gen por «knock out», quesi bien involucran manipulación in vitro ytransformación, no resultan en la adición deun gen y/o una proteína nuevos.

El Enfoque Comparativo fue evolucionan-do desde las primeras propuestas de reco-mendaciones que formularon OECD; FAO/OMS e ILSI desde 1988. La base de esta es-trategia para establecer inocuidad de nue-vos alimentos, es la historia de uso segurodel cultivo parental (es decir aquel que esla base de la modificación) .

- Qué se compara y por quéEs claro que toda modificación tiene un

objetivo, sea obtener una mejora de tipoagronómica (a esta categoría pertenecen losOVGM conocidos como de «primera gene-ración») como resistencia a plagas o enfer-medades, una mejora nutricional o de cali-dad («segunda generación») o bien la sín-tesis de un producto en particular («tercerageneración») desde un fármaco, hastabiocombustibles, pasando por vacunas co-mestibles. Es decir que la modificación tieneefectos intencionales medibles, que se tra-ducen en una característica fenotípica dada.

Por otro lado, es posible que se produz-can efectos no intencionales de la modifica-


ción, que pueden o no tener un impactonegativo en la seguridad de la planta modifi-cada, pero que es pertinente estimar. Y esaquí donde la comparación tiene un papelrelevante.

Los impactos no deseados de la introduc-ción de un gen o secuencia en el genoma deuna planta, comprenden diferentes aspectosque son examinados durante el proceso deevaluación:

• Toxicidad o alergenicidad de la(s) pro-teínas expresadas

• Influencia de los productos de expre-sión sobre el metabolismo de la planta, quelleve a cambios en el valor nutricional o la con-centración de tóxicos o alérgenos naturales.

• Inserción no intencional en otros genes(«knock out» no intencional) que sean esen-ciales o activación de otros, que no se expre-sen normalmente.

• Efectos pleiotrópicos de los genes in-sertados (efectos sobre la actividad de otrosgenes o vías metabólicas, que se manifies-ten a diferentes niveles en el fenotipo de laplanta).

Es importante tener en cuenta que estosefectos también pueden producirse duranteel mejoramiento convencional (definidocomo el que no utiliza ingeniería genética), sibien los cultivos mejorados mediante tecno-logías no recombinantes no se someten porel momento, a este tipo de evaluación, conla excepción de Canadá, que sí regula algu-nos casos especiales. La normativa canadien-se, evalúa aquellas variedades con rasgos su-ficientemente novedosos, independiente-mente del proceso utilizado para su obten-ción, si bien menciona particularmente cier-tas metodologías de mejoramiento, como lamutagénesis acelerada (inducida por agen-tes químicos o irradiación) o la fusión celular.

Como veremos en detalle a continuación,el proceso evaluativo recorre una serie depasos que se basan en evidencia experi-mental, y que van llevando a conclusionesque permiten tomar decisiones respecto dela inocuidad del OGM en cuestión (ver Figu-ra 3).

Las evaluaciones de seguridad, entonces,se concentran: a) en la característica intro-ducida: para ello, se caracteriza completa-mente el gen insertado en el cultivo GM y se

evalúa la seguridad de la/s proteína/s resul-tantes. Si bien esta evaluación la deben rea-lizar los obtentores previamente a la trans-formación , ya que no será aprobado un cul-tivo que pueda presentar algún problematoxicológico o de alergenicidad, las agenciasregulatorias encargadas del control de estosproductos efectúan un exhaustivo análisis deseguridad de los genes insertados y sus pro-ductos de expresión.

b) en el cultivo o alimento como untodo: sobre el cultivo GM, se analizan los ras-gos fenotípicos / agronómicos y la composi-ción y se los compara con los de sus contra-partes no-GM o convencionales. Las diferen-cias encontradas, sean intencionales o no, seconvierten en el centro de ulteriores evalua-ciones de seguridad. El objetivo de estasevaluaciones es demostrar que el cultivo oalimento GM es tan seguro como el alimen-to tradicional conocido, independientemen-te de su grado de equivalencia (Figura 2).

a. El rasgo introducido:Para caracterizar el gen introducido se

requiere conocer la secuencia completa delinserto o insertos, el número de copias y suestabilidad a lo largo de varias generaciones.

La seguridad (o inocuidad) de la/s pro-teína/s producidas por el inserto se evalúabasándose en información relativa a su fuen-te de origen (el organismo donante, histo-rial de uso seguro, etc.), su estructura (secuen-cia de aminoácidos, cambios pos-traduccionales, incluso su estructuratridimensional), su función / especificidad /modo de acción, su expresión en diferentestejidos de la planta, su toxicidad aguda, supotencial de alergenicidad, su digestibilidadin vitro y su estabilidad al procesamiento,que son indicadores de esta potencialidad.

Se utiliza la toxicidad aguda determina-da en ensayos estándares en ratones por víaoral, ya que la gran mayoría de las proteí-nas ejercen sus efectos tóxicos por esta vía,fundamentalmente debido a su naturaleza(que hace que se degraden rápidamente enel tracto intestinal). Para detectar otros efec-tos que podrían dejar fuera a algunos casosespeciales, se realizan estudios de alimen-tación en animales y toxicológicossubcrónicos (en general, estudios de 90 díasen rata, cuando se considera justificado por


las demás evidencias experimentales).En cuanto a la estimación del potencial

alergénico, la aproximación que se utiliza, esla del «peso de la evidencia». Este conceptose basa en el hecho de que no existe un soloparámetro que defina a un alérgeno, y queno es posible hoy contar con modelos quepredigan adecuadamente la alergenicidad enhumanos. Dado que existe una serie deparámetros fisicoquímicos que son com-partidos por los alérgenos proteicos cono-cidos (que son un grupo reducido de proteí-nas de origen animal y vegetal), éstos pue-den ser utilizados para estimar la posiblealergenicidad de la proteína introducida. Porejemplo, la resistencia a la digestión, la pre-valencia en el alimento (normalmente, losalérgenos proteicos son mayoritarios en lacomposición final) y la similitud con otrasproteínas alergénicas, son algunos de es-tos parámetros. En efecto, se realizan análi-sis bioinformáticos que comparan la secuen-cia de los productos de expresión presentesen los OGM, contra bases de datos de todoslos alérgenos conocidos.

En el caso de cultivos con actividadalergénica conocida, como la soja, es posible

comparar los patrones deproteínas del suero de pa-cientes sensibles, que seunen a inmuglobulinaE (laresponsable de las reaccionesalérgicas severas) en análisisde Western sobre gelesbidimensionales, para deter-minar si hay nuevas proteí-nas o si el patrón endógenose ha visto alterado por lamodificación.

Como ya se dijo, aún nose cuenta con modelos ani-males que se encuentren losuficientemente desarrolla-dos para ser validados a ni-vel internacional en cuantoa su capacidad predictiva dealergenicidad, pero numero-sos organismos e institucio-nes internacionales se en-cuentran trabajando en ello.

b) El cultivo o alimentoGM:

Sobre la base de los 50 años de experien-cia ganada en mejoramiento tradicional(breeding), y evaluación de seguridad deotros productos como medicamentos, ali-mentos, y químicos, las agencias internacio-nales recomiendan comparar los siguientesparámetros de los OGM respecto de contra-partes convencionales, para poder contarcon suficiente información que permita arri-bar a una certeza razonable de inocuidad:

- Parámetros fenotípicos: La caracteriza-ción fenotípica/agronómica del cultivo GM sehace tempranamente durante el proceso deselección. Los puntos evaluados ( por ej. mor-fología, rendimiento) son muy sensibles a loscambios genéticos y a las perturbaciones des-favorables en el metabolismo, por lo tantoson buenos indicadores de equivalencias en-tre el cultivo modificado y su contraparte tra-dicional.

Se observan y miden cuidadosamente lascaracterísticas morfológicas, fisiológicas, yreproductivas, la resistencia o susceptibilidada plagas y enfermedades, e incluso caracte-rísticas como perfume o sabor de los frutos.Este proceso, que dirige la selección de aque-

Figura 2. Enfoque comparativo


llas plantas transformadas (o«eventos») que tengan las ca-racterísticas deseadas, es críti-co para eliminar efectos nointencionales.

-Composición química:ésta es la evaluación en la quese fundamenta gran parte delanálisis comparativo. Se reali-za la determinación analíticade la composición en dife-rentes tejidos de la planta,sobre muestras de ensayos acampo controlados, realiza-dos en ambientes represen-tativos de aquellos dondeese cultivo va a ser sembra-do, a lo largo de varias cam-pañas de producción (años).Se determina la composiciónde macro y micronutrientes(proteínas, grasas, hidratos decarbono, aminoácidos y ácidos grasos, vita-minas, etc.), minerales, tóxicos naturales ycompuestos bioactivos y/o metabolitossecundarios, dependiendo del cultivo. Porejemplo, se miden niveles de fitoestrógenosy antinutrientes (inhibidores de tripsina,lectinas) en soja, glucosinolatos en colza,cumarinas en apio y solaninas en papa. Tam-bién se pueden medir alérgenos en soja(glicinina), beta carotenos en zapallo, ygosipol en algodón. La OECD ha publicadorecientemente recomendaciones que espe-cifican qué componentes son más apropia-dos analizar para cada cultivo en particular.

A parte de la comparación en compo-nentes específicos, se realizan, general-mente, ensayos de aptitud nutricional enmodelos animales. Estos apuntan a detec-tar cualquier efecto no intencional de la mo-dificación que pudiera haber afectado el va-lor nutricional del alimento o su inocuidad.Es común que se utilicen ensayos de alimen-tación de duración variable (entre 42 y 120días) dependiendo del modelo elegido. Unode los más utilizados y sensibles es el de po-llos parrilleros, ya que pasan de pesar 35 gra-mos a más de 2 kg en 42 días. Este crecimien-to rápido hace que se puedan detectar pe-queñas deficiencias nutricionales del alimen-to.

Mientras que la evaluación de seguri-dad de las proteínas introducidas se llevaa cabo con la proteína (s) purificadas y ge-neralmente sintetizadas en modelos bacte-rianos (por la cantidad que se necesita paralos ensayos toxicológicos), los estudios dealimentación se realizan con el alimentocompleto, por ejemplo, grano o forraje enel caso de maíz, harinas de soja tostadas , osemilla de algodón como suplementación dela dieta . (Ver Tabla 1).

Según los resultados de todos los pun-tos analizados, es posible clasificar al cultivoo alimento GM en una de estas tres catego-rías posibles (FAO/OMS/OECD):

* El producto GM es sustancialmenteequivalente a la contraparte tradicional, noexistiendo diferencias significativas. Esta situa-ción se da principalmente en productos alta-mente refinados. El aceite o la fructosa deri-vados de maíz GM, son totalmente equiva-lentes a los derivados de maíz convencional.

* El cultivo o alimento GM es sustancial-mente equivalente a su contraparte tradi-cional con la excepción de diferencias cla-ramente definidas (presencia de la/s proteí-nas introducidas y/o diferencias bien carac-terizadas en otros elementos individuales).Dentro de esta categoría caen la mayoría

Tabla 1: Ensayos de alimentación con OGM en modelos animales (adaptadode Kuiper y col., 2001, Faust and Glenn, 2002)


de los cultivos de primera generación, queexpresan un rasgo único, tal como la resis-tencia a herbicidas o la protección contrainsectos, y algunos de segunda generación,con mejoras nutricionales o de calidad. Parademostrar que los cultivos o alimentos GMson «tan seguros como» su contraparte tra-dicional, se debe mostrar que cada diferen-cia encontrada no tiene consecuenciastoxicológicas ni nutricionales. Esta evaluaciónse lleva a cabo caso por caso, y según se con-sidere necesario, pueden conducirse ensayosde toxicidad o estudios de alimentación enanimales grandes con el cultivo entero.

* El cultivo o alimento GM no essustancialmente equivalente a su contrapar-te tradicional o no existe un cultivo equiva-lente con el cual compararlo. Ejemplo de estoserían cultivos con ciertos rasgos combina-dos o cultivos con valor nutritivo aumen-tado que contienen nuevas víasmetabólicas o modifican las endógenas. Laevaluación de seguridad se va a enfocar enlas características de los nuevos productosexpresados. En cada caso en particular se

determinará el programa de estudios quecorresponda.

Actualmente, todos los cultivos modifica-dos y sus productos alimentarios derivadospresentes en el mercado han sido analiza-dos en profundidad para evaluar su seguri-dad, demostrándose que son sustancialmen-te equivalentes, con la excepción de la/s pro-teínas introducidas y son tan seguros comosu contraparte tradicional. En un futuro seintroducirá una segunda generación de culti-vos con rasgos de calidad y valor nutritivomejorado. Por definición, es menos proba-ble que sean sustancialmente equivalentes alas variedades tradicionales.

La evaluación de la seguridad en estoscasos requerirá enfocarse en los cambioscomposicionales intencionales que se hayanintroducido en cada caso, y en la evaluaciónde los efectos no intencionales (esperadoso no) que pudieran haberse producido pormodificación de las vías metabólicasinvolucradas.

Como ejemplo de este tipo de casos, sepuede mencionar el arroz conocido como

«arroz dorado», debido a la mo-dificación introducida para expre-sar altas concentraciones de beta-caroteno, precursor de vitamina A(que le da esta coloración particu-lar). Como efecto no esperado deesta modificación, se encontró quetambién se expresaban mayoresniveles de xantofilos, un cambioque fue detectado aplicando téc-nicas de croma-tografía de altapresión (HPLC) para carotenoides,y que no hubiera sido aparente enun análisis general de composi-ción. Este tipo de análisis, por lotanto, puede ser apropiado encasos de modificaciones nutricio-nales (de «segunda generación»)dirigidas a cambiar algún paso envías metabólicas específicas, peroque pueden tener efectos en elámbito de otros componentes.

Es en estos casos, en los quelas nuevas tecnologías analíticasque se están desarrollando pue-den aportar soluciones al análisisde riesgo (ver próxima sección).Asimismo, este tipo de modifica-

Tabla 2: componentes analizados en semillas enteras de soja yen varias fracciones de soja procesada (Tomado del CuadernilloTécnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (MonsantoAgricultura España, 2001)


ciones puede implicar un cambio significativoen la ingesta de ciertos nutrientes (por ejem-plo, vitamina A), y requerir un seguimientoluego de su comercialización para verificar elposible impacto nutricional (positivo o nega-tivo) que esto pueda tener en una determi-nada población.

En la Tabla 2 se resume como ejemplo eltipo de componentes analizados en diferen-tes fracciones, para la evaluación de seguri-dad alimentaria para el evento de soja GM40-3-2, tolerante a glifosato (ver Parte VIII,capítulo 6). En la Tabla 1 se listan los diferen-tes modelos animales utilizados para la eva-luación de aptitud nutricional de OGM y losparámetros que se analizan en cada caso.

3. Evaluación de impacto ambiental

Toda tecnología tiene un cierto riesgo quedebe ser evaluado 1) en función del benefi-cio o beneficios que aporta y 2) en el contex-to de las tecnologías que se utilizan con elmismo fin y de tecnologías alternativas, encaso de existir.

La evaluación del impacto ambiental denuevos cultivos GM es una parte funda-mental de su proceso de aprobación y con-trol y debe enfocarse dentro de losparámetros enunciados. En los capítulos 2 y3 se desarrolla este aspecto en mayor deta-lle, por lo que en este punto se enunciaránlos posibles impactos sobre el ambiente, queson evaluados antes de la introducción deun OGM en los agroecosistemas, y que se re-sumen en los siguientes puntos:

Capacidad de convertirse en maleza: encaso de que la planta GM tuviera característi-cas que la hicieran más resistente a las condi-ciones ambientales, o tuviera mayor poderreproductivo que su contraparte convencio-nal.

Posible impacto en especies benéficaso sobre la flora o fauna circundante: es eva-luado el impacto que el cultivo podría teneren especies propias del agroecosistema. Porejemplo, efectos sobre especies que no sonel blanco de su actividad en el caso de culti-vos GM protegidos de insectos.

Mayor capacidad de cruzarse con plan-tas de su entorno que la contraparte con-vencional. Incluso en caso de ser idéntica, seevalúa cuáles serían las consecuencias de di-

chos cruzamientos (debido al llamado flujogénico mediado por polen).

El flujo genético entre poblaciones es unfenómeno natural, responsable de una grandiversidad genética. Para estimar qué pesopuede tener un rasgo nuevo introducidopor ingeniería genética en el flujo génicogeneral, es importante tener en cuenta quéefecto en particular producirá ese gen sise establece en otra población. Todo estose examina en función de la existencia deparientes silvestres de ese cultivo en la zonadonde se lo quiere introducir. Por ejemplo,en el caso de la soja o el maíz, no existenparientes silvestres en la Argentina, pero síen México (en el caso de maíz) y en China(en el caso de la soja).

En el caso de cultivos resistentes a in-sectos, la aparición de insectos resistentes.Es conocida la plasticidad genética de los in-sectos para desarrollar estrategias adapta-tivas que les permiten sobrevivir a insectici-das químicos. De igual modo, es posible pen-sar que lo mismo ocurrirá con las proteínasde control biológico utilizadas en los cultivostransgénicos tolerantes a plagas. Por estemotivo, se han desarrollado procedimientosy estrategias para minimizar o prevenir eldesarrollo de estas resistencias en las plagasblanco.

Si bien no se han reportado casos de apa-rición de insectos resistentes por el uso de latecnología de protección de insectos en plan-tas desde 1996, es importante desarrollarestrategias que apunten a conservar el recur-so biológico. Estos programas se conocencomo de Manejo de Resistencia de Insec-tos o MRI (IRM en inglés: Insect ResistanceManagement) y se diseñan a medida de cadacultivo y plaga que se va a controlar,basandóse en el conocimiento del modo deacción de esta proteínas y la dinámica de laspoblaciones de los insectos plaga.

Es requisito presentar un plan de MRI,para que las agencias regulatorias evalúenel impacto ambiental antes de la introduc-ción comercial de un cultivo GM protegidode insectos. Todos estos puntos son anali-zados, del mismo modo que la inocuidadalimentaria, caso por caso. También se esti-ma el cambio que podría provocar en el ma-nejo agronómico, la introducción de un dadocultivo GM .


El objetivo de las evaluaciones de riesgoambiental, es identificar impactos en elambiente, cuantificarlos y proporcionarelementos para aquellos que deben mane-jar y minimizar estos riesgos, siempre enel contexto del balance riesgo-beneficio yde las tecnologías alternativas disponibles(por ejemplo, cultivos Bt evaluados en rela-ción con las aplicaciones tradicionales de in-secticidas químicos, y en el contexto del Ma-nejo Integrado de Plagas, como una herra-mienta más de control biológico).

4. Nuevas tecnologías potencialmenteaplicables a la evaluación de labioseguridad

Los avances en la tecnología científica delos últimos años han transformado profun-damente la forma en la que se hace ciencia yse obtiene información de los sistemas bio-lógicos. La enorme capacidad de secuen-ciación en combinación con la bioinfor-

mática han potenciado la identificación ycaracterización de genes (genómica) y elestudio de su función (genómica funcio-nal).

Otras tecnologías derivadas de las prime-ras y en constante evolución, se ocupan delestudio del transcriptoma, el proteoma, elmetaboloma, que abarcan todos los trans-criptos, proteinas o metabolitos de una es-pecie , respectivamente. Hoy se habla de lastecnologías «ómicas» en referencia global aeste tipo de aproximación.

Paralelamente, estas tecnologías permi-ten el desarrollo de nuevos campos de la cien-cia, como la farmacogenómica, la toxicoge-nómica y la nutrigenómica, que son versio-nes «ómicas» de las especialidades tradicio-nales que abordan el mismo problema.

Estas tecnologías hoy se encuentran enuna etapa inicial de generación de enormescantidades de datos; sin embargo, el poten-cial que presentan a corto y mediano plazopara el descubrimiento y la comprensión de

procesos biológicos, notiene precedentes.

En el campo del aná-lisis de riesgos, especial-mente en los aspectostoxicológico y nutricio-nal, será valioso contarcon tecnologías que per-mitan determinar losperfiles bioquímicos deOGM y sus contrapar-tes convencionales(profiling), ya que seráposible de «un vistazo»,detectar cambios en lospatrones de expresióngenética y en los pro-teicos o metabólicospor efecto de la modifi-cación.

El problema es queseguramente, al pene-trar en niveles de reso-lución tan altos, se en-contrarán una serie decambios que incluso sonevidentes entre indivi-duos del mismo grupo(por ejemplo, individuosde la misma variedad no

Figura 3: Diagrama para la estimación de seguridad de OGM. Adaptado deCockburn , 2002


GM), debido a la variabilidad natural. Esta va-riabilidad, hace muy difícil en estos momen-tos poder interpretar de manera clara mu-chos de los resultados que se obtienen, y susignificación biológica real, para poder sacarconclusiones en cuanto a su relevancia en labioseguridad.

Sin embargo, en un futuro cercano, y amedida que se avanza en el conocimientode los sistemas biológicos, será posible apli-car nuevas tecnologías a la evaluación de laseguridad alimentaria, no sólo de OGMs sinode cualquier alimento.

Conclusión

El objetivo del análisis de riesgos para or-ganismos y/o alimentos derivados del uso dela ingeniería genética (GM) es estimar el im-pacto que los efectos intencionales y los nointencionales de la modificación, pudierantener sobre la inocuidad del alimento o delorganismo GM, o sobre su impacto ambien-tal.

El enfoque utilizado para aplicar este pro-ceso (el enfoque comparativo) ha sidoconsensuado a partir de consultas y discusio-nes en el plano internacional, y se basa en lacomparación de parámetros como composi-ción, tóxicos naturales o aptitud nutricional,con la contraparte convencional que tienehistoria de uso seguro y es aceptado comoalimento inocuo (OECD, 2000).

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IX.- Capitulo 2

Bioseguridad de OrganismosGenéticamente Modificados - MarcosRegulatorios

Dr Burachik, Moisés

1. Panorama Internacional

Desde 1986, algunos países como Japón,por ejemplo, se han ocupado de elaborar ydesarrollar regulaciones para controlar laentrada en el mercado de productos deriva-dos del uso de técnicas de ADN recom-binante. En ese momento el foco estabapuesto en los ingredientes o aditivosalimentarios producidos por microor-ganismos recombinantes, pero a medidaque la tecnología avanzaba y se aplicaba aotros organismos, estas reglamentaciones sevieron extendidas a plantas y animales mo-dificados.

Numerosos países en los cinco continen-tes, tienen en este momento un marcoregulatorio disponible para la evaluación yaprobación de OGMs antes de su entradaen el mercado.

Entre los primeros países que han desa-rrollado estos procesos, se encuentran lospaíses europeos, siendo la Comisión Europea,el órgano de evaluación y control de la UniónEuropea. En los Estados Unidos, diferentesagencias están involucradas en estas evalua-ciones: la Agencia de Alimentos y Drogas(FDA), la Agencia para la Protección del Me-dio Ambiente (EPA) y el Departamento deAgricultura (USDA). Canadá y Australia-Nue-va Zelanda, han establecido sus sistemasregulatorios más recientemente (a partir de1993).

En cuanto a América Latina, Argentinafue el país pionero en esta materia, con lacreación de CONABIA en 1991, en el ámbitode la Secretaría de Agricultura, Ganadería,Pesca y Alimentación (ver más adelante). Esimportante notar que después de los EEUU,Argentina es el país con mayor grado deadopción de cultivos agrobiotecnológicos,seguido por Canadá.

Otros países de la región han comenza-do desde entonces a establecer sistemaspara la evaluación de la bioseguridad deOGMs. Colombia, Chile, Brasil, Uruguay, Pa-raguay, Bolivia, poseen comisiones técnicasevaluadoras, y en algunos de estos países yase han aprobado la comercialización y el cul-tivo de variedades GM. Estos sistemas estánsiendo establecidos en muchos otros países,especialmente apuntando a la implemen-tación del Protocolo de Bioseguridad, tam-bién conocido como Protocolo deCartagena, vigente desde Septiembre de2003. Este protocolo, firmado en el año 2000por más de 130 estados, regulará los movi-mientos transfronterizos de OGMs vivoso OVGMs , con el objeto de asegurar un ni-vel adecuado de bioseguridad en el comer-cio internacional y la conservación de labiodiversidad . Para una actualización sobremarcos regulatorios en America Latina, verel listado de sitios recomendados.

2. ¿Cuáles son los riesgos?

Uno de los problemas inherentes a la con-cepción de un marco regulatorio para losensayos de campo de plantas GM es el de laidentificación de los riesgos que deben con-siderarse. Esta identificación depende de lasopciones que se acepten de un conjunto deposibilidades y de los valores de los que op-tan, sean ellos científicos, funcionarios, polí-ticos, empresarios o público en general. Estoes, deben compatibilizarse criterios sobrelo que se consideran riesgos aceptables, enun marco de intereses muy variados.

Por otra parte, si bien la identificación delos riesgos se basará en conocimiento cientí-fico disponible ahora, existirá siempre uncomponente de extrapolación (si bien plau-sible) cuando se estimen efectos adversos«potenciales», que es la materia misma y elobjetivo del análisis de riesgos.

No obstante estas limitaciones, «la eva-luación de efectos potenciales de una enti-dad y sus implicaciones, para verificar y esti-mar la posiblidad de ocurrencia de un efectoadverso y caracterizar la naturaleza de talefecto es (definible como) una actividad cien-tífica» (Natl. Acad. Sci., 1983).

Con estas limitaciones en mente, lo quesigue es una lista acotada de características

388 BURACHIK, Moisés

comúnmente asociadas con los riesgos de losensayos de campo de plantas GM, que sonlos que se han tenido en cuenta al funda-mentar los requerimientos necesarios paraevaluar su impacto en cada caso .

I Pérdida de Diversidad Biológica:Aquí nos referimos a la pérdida debida a

la presión del mercado y de los costos sobrelos productores, induciendo cambios en lasprácticas agronómicas (menor uso de herbi-cidas e insecticidas) por la utilización (venta-josa) de OGMs, en desmedro de razas loca-les adaptadas (landraces) empleadas en laactualidad.

También podría producirse si se cultivanOGMs en la vecindad de centros de origen ode diversidad de sus parientes silvestres o deespecies sexualmente compatibles, por fenó-menos de introgresión génica (este riesgoes relativamente más importante en el he-misferio Sur).

II Transferencia genética a especies sil-vestres o malezas sexualmente compatibles,con el resultado de la formación de híbridosviables con fenotipos no deseados (p.ej.,tolerancia a herbicidas, resistencia a insectosu otras plagas). (Ver Capítulo 3, de esta par-te).

III Incremento de la presión de selección,tal que favorezca un aumento de la toleran-cia de plagas a insumos defensivos actualmen-te empleados. En el caso de insumos que porrazones ambientales, económicas o de ma-nejo agrícola, son apreciados por el produc-tor y/o por la sociedad (p.ej., herbicidas post-emergentes, productos biodegradables, in-secticidas biológicos, productos de menorcosto, o sin restricciones relacionadas con lapropiedad intelectual, etc.), el aumento dela tolerancia de la plaga al producto es unefecto desfavorable, ya que puede convertira dicho insumo en inútil en el futuro.

IV Modificación de las relacionespredador-plaga entre insectos, en detrimen-to de los insectos benéficos. Aquí se incluyenlos efectos sobre organismos no-blanco(caso de cultivos con incorporación de genesde resistencia a insectos). El conocimiento

insuficiente sobre especies amenazadas deextinción (p.ej., insectos benéficos, sus plan-tas-refugios, etc.), también es un factor a te-ner en cuenta.

V Persistencia en estado funcional(transferible, integrable y expresable) delDNA residual en suelos u otros hábitats (p.ej.,el intestino de mamíferos), y de los posiblesmecanismos de su eventual transferencia(p.ej. genes de resistencia a antibióticos ha-cia microorganismos patógenos humanos).Este riesgo se incluye en esta lista limita-da, pero su ocurrencia se considera en ge-neral muy poco probable.

VI Modificaciones en la relacionesecológicas con otros organismos en el largoplazo.

VII Fenómenos no esperados derecombinación (relacionados con promoto-res, enhancers, cápsides virales, etc) que cam-bien características epidemiológicas,ecológicas o rango de huésped depatógenos. Este es también un fenómenode ocurrencia muy poco probable. La exis-tencia de una zona potencialmenterecombinogénica en el promotor 35S del vi-rus del mosaico del coliflor, ampliamente uti-lizada en las construcciones insertadas enOGMs, no parece tener consecuencias bioló-gicas significativas. En cuanto a la resistenciaa virus por sobre-expresión de la cápside viral(un mecanismo que más probablemente setrate de silenciamiento génico que de re-encapsidación del ácido nucleico viral. Ver VIII-4) es también muy poco probable que gene-re fenómenos de trans-capsidación con cam-bios hipotéticos en el rango de huésped(cápside A tomada por un virus B, de modoque el rango de huésped de B pasa a ser elde A).

VIII Efectos del ingreso de proteínas deinactivación de antibióticos en la cadenaalimentaria. Posible necesidad de cambiar losmarcadores de selección utilizados en la ob-tención de las plantas transgénicas. Este ries-go no ha sido probado, y por el contrarioexisten muchas pruebas (y barreras bio-lógicas) de que tiene una muy baja proba-bilidad de ocurrencia. Sin embargo se inclu-


ye en esta lista por el impacto que tiene enla legislación europea en este sentido.

IX Posibles cambios en los flujos comer-ciales.

En el área del manejo de riesgos, es im-portante el manejo de las modificacionesesperables en la resistencia de las plagas, porparte de los productores, mediante un con-trol post-liberación. Este no es un riesgo,sino una condición necesaria para el mante-nimiento de la utilidad del OGM con deter-minadas características. Por ejemplo, la libe-ración de plantas conteniendo genes de re-sistencia a insectos (genes Bt), debe estaracompañada con programas de manejo (es-tablecimiento de refugios, control de plan-tas y cultivos vecinos) para prevenir que lapresión selectiva del evento seleccione pobla-ciones de insectos resistentes que haráninefectiva la protección inicialmente logradacon la modificación genética. En realidad estefenómeno sólo se puede retrasar, ya quetoda presión de selección generará individuostolerantes, en tiempos más o menos cortos.

3. Fundamentos de las normativas -Definiciones

La elaboración y evolución de un marcoregulatorio para la bioseguridad de una tec-nología novedosa como la biotecnología apli-cada al mejoramiento vegetal, no está exen-ta de dificultades.

Por una parte está la responsabilidad deasegurar la aplicación sustentable de lanueva tecnología, y de preservar al hombre,la flora, la fauna y el ambiente de los poten-ciales efectos perjudiciales de las innovacio-nes, tanto en el presente como en el futuro.Por otra parte, hay razones para no obsta-culizar el desarrollo de las innovacionesbiotecnológicas, que ya han demostradoposeer un gran potencial para brindar bene-ficios a la sociedad. Toda actividad humana(especialmente la innovación tecnológica)implica peligros (riesgos) y por lo tanto re-quiere la atención (gestión) de su seguridad.

La seguridad se obtiene definiendo, eva-luando y gestionando los riesgos asociadoscon la innovación.

Aplicando estos conceptos a labiotecnología, que implica el uso de organis-mos vivos, podemos enfocar el análisis delos riesgos de los ensayos hacia los siguien-tes aspectos generales:

• Identificación de los todos organis-mos involucrados (donantes, receptores,etc),

• Características de los organismosinvolucrados en la obtención del OGM (fa-miliaridad, patogenicidad, etc),

• Manera en que serán utilizados losOGMs (escala, contención)

• Características de las zonas y de losotros organismos (lugares, medio receptorpotencial, incluyendo seres humanos)

La normativa argentina ha tomado enconsideración estos aspectos, entre otros,para elaborar un marco regulatorio detalla-do para los Ensayos a Campo de PlantasTransgénicas, que se describe a continuaciónen sus rasgos principales.

Consideramos una definición aceptablede bioseguridad, como la protección de lasalud humana y del ambiente con respec-to a los riesgos conocidos y/o percibidosde la técnica o proyecto en cuestión, deacuerdo al estado actual de nuestros co-nocimientos. Está implícita en esta definiciónque una regulación para la bioseguridad, quesignifica una regulación de los riesgos acep-tables para la sociedad, conlleva una condi-ción de flexibilidad y de adaptación perma-nentes.

Para la normativa argentina, un OGM es:

• un organismo (vegetal, animal, micro-organismo o virus)

• en el cual se ha introducido informa-ción genética precisa y definida

• en forma deliberada y dirigida a obte-ner un determinado fenotipo

• siendo aquella introducción realizadade tal manera que dicha información genéticano podría haber sido adquirida por ese orga-nismo por la vía de mutaciones, recombina-ciones u otras formas de transferenciagenética reconocidas como mecanismos queoperan en la Naturaleza sin intervención hu-mana.


Esta definición hace referencia al méto-do de obtención del OGM, con el propósitode establecer el campo de aplicación de lanorma, excluyendo, por ejemplo, los cruza-mientos tradicionales. Sin embargo, en elanálisis del riesgo de la liberación de unOGM, la característica dominante, esto es,aquella que constituye el foco del análisis dela Comisión, es el inserto, esto es, la porciónde DNA efectivamente presente en elgenoma transformado, cuya naturaleza yconsecuencias (geno- y fenotípicas) caracte-rizan al OGM como tal.

Al OGM o conjunto de OGMs con undado inserto se los denomina colectiva-mente evento. Varios OGMs pueden conte-ner el mismo evento, y por lo tanto sus aná-lisis de riesgo serán equivalentes. Ocasional-mente, en etapas tempranas del desarrollode un OGM, se admite que el evento puedeno estar inequívocamente caracterizado, enel sentido de que no se ha definido el inser-to con la debida precisión (por ejemplo, elinserto puede estar en diferentes posicionesen el genoma del vegetal). En estos casos, elanálisis se enfoca en la construcción genéticautilizada en la transformación.

Definimos como transformación, el mé-todo utilizado para introducir la nueva in-formación genética, vehiculizada por elvector.

Si bien la normativa argentina atiendeaspectos del proceso de obtención de unOGM en el análisis de riesgo, esa atenciónsólo se enfoca en aquellas característicasque interesan en la evaluación del produc-to (y no del proceso de su obtención), en elsentido de que esas características se encon-trarán finalmente en el OGM obtenido.

Otra característica del marco regulatorioadministrado por la CONABIA es que consi-dera cada producto o liberación caso porcaso. Si bien los antecedentes (si los hubie-ra) se tienen en cuenta, y los casos similaresson identificados y considerados como obje-tos de información válida para la evaluación,los datos no son transferibles, y cada casoy/o solicitante deben ser coherentes yautosuficientes en cuanto a la informaciónque provee a la Comisión. La definición decaso es entonces relevante. Un caso estádefinido por:

• La empresa o ente solicitante.• El evento de transformación (es decir:

un inserto definido introducido en elgenoma de la planta, admitiéndose un con-junto de eventos con un único vector en lasetapas muy preliminares del desarrollo delOGM).

• La escala de la liberación.

Cualquiera de estas condiciones que nose conserve (p.ej., el mismo evento presen-tado por dos empresas o entes diferentes)representará un caso diferente.

La normativa puesta en práctica esproactiva, en el sentido de que requiere unanálisis previo de todas las previsibles conse-cuencias de una liberación antes de que talliberación sea autorizada.

4. Marco Regulatorio en Argentina

Argentina dispone desde 1991 de unmarco regulatorio para el Análisis y la Ges-tión de los Riesgos asociados con los Ensa-yos a Campo de Organismos GenéticamenteModificados (OGMs). Esta normativa es ad-ministrada por la Comisión Nacional Aseso-ra de Biotecnología Agropecuaria(CONABIA), que opera en el ámbito de laSecretaría de Estado de Agricultura, Ganade-ría, Pesca y Alimentos (SAGPyA). Esta Comi-sión es multisectorial (la forman represen-tantes de los sectores público y privado),multidisciplinaria, y es la encargada de emi-tir las recomendaciones con respecto a laautorización para los ensayos solicitados (ex-perimentación y/o liberaciones a campo).Estas recomendaciones son remitidas a laautoridad decisoria, que es el Secretario dela SAGPyA. En el presente trabajo se analizaesta normativa y se exponen algunas consi-deraciones sobre los factores que deben seratendidos.

La consideración básica que guía el fun-cionamiento y los dictámenes de la CONABIAes la Bioseguridad, y su característica esen-cial es que funda sus procedimientosoperativos en consideraciones exclusiva-mente técnicas, fundadas en los conoci-mientos científicos disponibles.

Los principales criterios aplicados en lanormativa argentina para decidir si una libe-


ración puede autorizarse, pueden resumirseasí:

a) el criterio de bioseguridad: la defini-ción, evaluación y gestión de los riesgos, es laconsideración primaria y su aplicación esproactiva, esto es, debe realizarse antes deautorizarse la liberación; los ensayos sonevaluados caso por caso; el foco del interésestá en el producto, pero aquellas caracte-rísticas del procedimiento de su obtenciónque terminan afectando o manifestándoseen el producto final, son también analizadas

b)el enfoque precautorio: el marcoregulatorio acompaña el desarrollo del pro-ducto, y no se requiere la fundamentacióncientífica completa para detener dicho desa-rrollo; basta que se presente alguna de lassiguientes situaciones: i) no existe suficienteinformación sobre el sistema, ii) los riesgosno son aceptables en base a presuncionesrazonables, iii) la evaluación no sea conclu-yente, o iv) el sistema es demasiado comple-jo

La CONABIA no interviene en las etapasulteriores (aprobación alimentaria, dictamensobre el impacto en las exportaciones y re-gistro, para la comercialización) del caminode una planta GM hacia el mercado (Ver Fi-gura 1). Sin embargo, emite un dictamenparticular fundado sobre la bioseguridad dela producción masiva a escala comercial delcultivo en cuestión. De este modo, la

CONABIA dictamina sobre la historia debioseguridad de la planta transgénica, parainformación de las agencias específicas delEstado encargadas de aquellos pasos.

Si bien el marco regulatorio inicial ha ex-perimentado algunas modificaciones a lo lar-go de los años (como respuesta a las necesi-dades de su adaptación en un campo tecno-lógico de rápido crecimiento), sus principiosbásicos se han mantenido y han demostra-do su eficacia, desde varios puntos de vistaque se describen más abajo. La versión quese presenta aquí resume las principales carac-terísticas de la normativa vigente en la ac-tualidad.

5. El Ente Regulatorio Argentino:CONABIA

La CONABIA es una Comisión multisec-torial, formada por miembros de los secto-res público y privado. Su Coordinación Técni-ca está a cargo de tres profesionales quepertenecen al sector público (véase la Tabla).Dada las características de esta composición,la operatoria de la Comisión hace especialénfasis en mantener una elevada ética detransparencia, evitando rigurosamente laposible interferencia de conflictos de intere-ses. Para ello, los miembros deben declararla existencia y naturaleza de sus intereses,sean ellos comerciales o científicos, y excluir-se totalmente de la discusión de solicitudesde liberación de OGMs que provengan de lasempresas o institutos a los que están vincu-

lados.La Comisión es profesio-

nalmente multidisciplinaria,los criterios para la toma dedecisiones son exclusivamen-te técnicos y el principio bá-sico que rige esas decisiones,que se toman por consenso,es la bioseguridad.

En los documentos quepresentan a la CONABIA, lossolicitantes de autorizacionesde ensayos tienen la opciónde hacer reserva de informa-ción que consideren confiden-cial. La información así consi-derada, será examinada porsolamente uno de los miem-

SolicitantesInformaciónrequerida

CONABIA

Fase Iliberaciónexperimental

Fase IIliberaciónextensiva/comercial

SENASA(seguridad alimentaria)

Secretario deAgricultura

Dirección de MercadosInternacionales

Evaluación del OGM a tres niveles

Aprobacióno Rechazo

Dictámenesfundamentados

FIGURA 1: el sistema de regulación y aprobación de OGMs en Argentina


bros de la Comisión, quien deberá emitir unjuicio fundado sobre la bioseguridad de la pro-puesta y exponer esta opinión (aunque nola información reservada) ante la Comisión.

A continuación se resumen los másimportates logros luego de once años de tra-bajo de CONABIA :

• El análisis de riesgo y autorización deunas 550 liberaciones de OGMs. El númerode presentaciones muestra un pronunciadocrecimiento hasta 1999, en que la gestión acargo de la Secretaría de Agricultura Ganade-ría Pesca y Alimentos desde esa fecha, y has-ta 2001, demoró la aprobación de muchosensayos.

• Procedimientos operativos ágiles, quemantienen la alta calidad de los análisis deriesgos sin obstruir ni producir demoras inne-cesarias en el normal desarrollo y aplicaciónde la tecnología.

• Juicios positivos manifestados sobre suactuación por varias autoridades representa-tivas de los entes regulatorios de países comoel Reino Unido de Gran Bretaña, EstadosUnidos de Norteamérica y Canadá, entreotros.

• Organización y Co-organización de Re-uniones Internacionales sobre Bioseguridady Manejo de Riesgo, con la participación derepresentantes de países con amplia expe-riencia regulatoria.

• Misiones de asesoramiento institu-cional a países limítrofes en la elaboraciónde sus marcos regulatorios.

• Desarrollo de varias iniciativas de ar-monización regulatoria regional.

• Asesoramiento a los negociadores dela Cancillería y participación institucional enlas discusiones sobre la política nacional conrelación a la implementación de la Conven-ción de Diversidad Biológica sobreBioseguridad para la Biotecnología.

Esta operatoria de CONABIA permite ase-gurar, tanto para la sociedad como para lossectores empresariales, un balance correctoentre la protección de la salud, la preserva-ción de la calidad ambiental y lasustentabilidad de los proyectos aprobados,con la implementación regulada, en tiempoy forma, de las innovaciones tecnológicas

propuestas por los solicitantes.La CONABIA realiza las evaluaciones de

todas las Solicitudes de liberaciones de OVGMal ambiente, y recomienda al Secretario deAgricultura, Ganadería, Pesca y Alimentossobre la conveniencia o no de autorizar di-chas liberaciones. Estas evaluaciones com-prenden dos fases:

1) las evaluaciones de las liberacionesexperimentales cuyo propósito es determi-nar que la probabilidad de efectos sobre elambiente es no significativa –primera fasede evaluación-, y

2) las evaluaciones de las liberacionesextensivas cuyo propósito es determinar quedichas liberaciones del OVGM no generaránun impacto sobre el ambiente que difierasignificativamente del que produciría elorganismo homólogo no GM –segundafase de evaluación-. (Ver Figura 1)

6. Primera Fase de Evaluación: Ensayosexperimentales

Los solicitantes deben presentar un lega-jo de información específica, que consta deuna Información General sobre la liberacióny sobre el OGM en cuestión y de un aparta-do sobre las Condiciones de Bioseguridadque se pondrán en práctica.

El campo del análisis de los riesgos abar-cado por estas informaciones, que debe pro-veer el solicitante, es amplio, e incluye tantolas características de la liberación como lasdel OGM. Con respecto a las característicasde la liberación, la Información General so-metida al análisis incluirá:

• Si el material es importado: statusregulatorio en el país de origen.

• Propósito de la liberación (objetivo,cronograma, protocolos, antecedentes). Si esa escala de invernadero o a campo

• Operaciones de transporte de OGM (in-greso al país, transportes internos).

• Cantidad y tipo de material a liberar,antecedentes en otros países.

• Lugar de la liberación.• Detalles operativos para auditar la libe-

ración (fechas, instituciones, personas).Con respecto a las características del

OVGM, se analizará el genotipo del evento


(es decir, las nuevas característicasgenéticas introducidas), para lo cual el soli-citante debe proveer información con res-pecto a:

• Descripción de la biología molecular delsistema donante-vector-receptor

• Método de transformación utilizado• Genes principales (y sus organismos do-

nantes). Genes auxiliares (marcadores deselección).

• Secuencias regulatorias (promotores,terminadores, enhancers, etc.). Otros ele-mentos genéticos introducidos.

• Productos de expresión, tejidos de laplanta en los que se expresan, niveles de ex-presión. Homologías de secuencia con pro-teínas tóxicas o alergénicas.

• Descripción fenotípica del organismoreceptor, centros de origen o diversidadgenética.

• Estabilidad fenotípica y número de ge-neraciones en los que se verificó.

En cuanto a la sección sobre las Condi-ciones de Bioseguridad, la información soli-citada depende de la escala de la liberación:desde laboratorio/invernadero hasta prue-bas a campo. En el caso de eventos que aúnno han obtenido la autorización decomercialización en el país, es decir, eventosregulados, que se siembran a gran escalapara producciones de semilla en contra-estación para el hemisferio Norte, o conotros fines, existe un protocolo específico quees necesario presentar para obtener la auto-rización.

En todos los casos el solicitante debe pro-veer información relativa a varios aspectosbásicos de los Procedimientos de Biose-guridad, a saber:

a) Durante la liberación: Descripción yubicación del lugar o instalación donde serealizará la liberación. Localización precisa(mapas detallados): distancia a caminos, lu-gares transitados, límites del predio bajo con-trol del solicitante. Características constructi-vas de bioseguridad (laboratorio o inverna-dero) y normas de acceso. Tamaño y núme-ro de parcelas, su diseño, plano de siembra ysuperficie a sembrar. Medidas de aislamien-to

• En ensayos a campo: distancias, tiem-pos de floración, jaulas, cobertura para evi-tar la diseminación del polen, por viento oinsectos, control de vectores potenciales depolen u otro material con capacidad de pro-pagación, etc.

• En ensayos en laboratorio o inverna-dero: métodos o estructuras de contencióncontra el ingreso de vectores potenciales dematerial genético.

b) En los movimientos de materiales:semillas, material vegetal acompañante, asícomo los lugares, normas e identificación delmaterial que sea almacenado.

c) En lo relacionado con el destino delmaterial cosechado: el solicitante deberáinformar sobre su utilización, aclarando si serálocal o si será exportado o destruído, e iden-tificando los lugares de su almacenaje final otransitorio.

d) En lo relacionado con la disposiciónfinal (OGM y materiales remanentes): se re-quiere información sobre el tratamiento delsuelo post-cosecha, el uso futuro del terre-no, los controles posteriores (detección deplantas voluntarias) y su duración.

e) En el caso de un eventual escape delOGM y/o de cualquier material asociado:El solicitante debe exponer con claridad losprocedimientos que seguirá en el caso de uneventual escape del OGM y/o de cualquiermaterial asociado. Normalmente, esto inclu-ye métodos de identificación del OGM, pro-cedimientos para limitar y controlar el esca-pe, así como la obligación de notificarperentoriamente a la autoridad regulatoria.

f) Técnicas que se usarán para detectarla transferencia de genes desde el OGM alambiente biótico.

g) Usos previstos del terreno con pos-terioridad a la liberación solicitada. Controlposterior de la parcela, duración de los con-troles post-cosecha.

Una vez completados los ensayos, es re-quisito indispensable para poder acceder anuevas autorizaciones, la entrega de un In-forme de Cierre de la Liberación, que inclu-ye observaciones relativas al comportamien-to agronómico del OVGM en cuanto agerminación, crecimiento vegetativo, flora-ción, susceptibilidad a enfermedades y pla-gas, así como efectos sobre organismos no


blanco y características de la cosecha, los tra-tamientos realizados y la disposición final .

Es importante notar que estas liberacio-nes son periódicamente inspeccionadas poragentes habilitados por la SAGPyA.

La normativa completa, así como losrequerimientos de información detallados enlos formularios que deben completarse paraobtener una autorización de liberación, seencuentran a disposición para la consulta através del sitio de CONABIA (ver en la listade lecturas y sitios recomendados).

7. Segunda Fase de Evaluación : el caminohacia el mercado

Como ya se ha enfatizado antes, la in-cumbencia básica de la CONABIA está limita-

da a la gestión de los riesgos y la bioseguridadde los ensayos a campo de plantas GM a di-ferentes escalas.

Los pasos siguientes hacia el mercado, esdecir la aprobación de su uso como materiaprima alimentaria, la verificación de que suliberación comercial no afectará negativamen-te nuestro comercio internacional, el registrode la nueva variedad, y la autorización parala producción comercial, son resorte de otrasagencias del Estado (Ver Figura 1). Esas de-pendencias basan su decisión en dos clasesde información:

• La información requerida a los solicitan-tes que es específica a sus necesidades (laaptitud alimentaria, la estructura de nuestromercado de exportación).

• La información suministrada por laCONABIA sobre el comportamiento del OGMen cuestión a lo largo de los ensayos autori-zados que se han realizado.

Esta última información constituye unaparte crucial del camino de la planta GM ha-cia el mercado, y es solicitada y analizada porla CONABIA. En la normativa argentina ac-tual se la denomina Segunda Fase de Eva-luación. La condición necesaria para dar unarespuesta positiva a estas solicitudes en lapráctica, es que la CONABIA considere que:

No existen riesgos para la salud huma-na, para el agroeco-sistema, y para la floray la fauna asociados, derivados del cultivono confinado del OGM en consideración.

Esta categorización requiere delsolicitante la presentación de unbreve Resumen (características delOGM; el evento, breve descripciónmolecular del inserto; usos delOGM, destacando los que difierandel organismo no transformado;condiciones especiales, si las hubie-ra, para el cultivo extendido en granescala) y de una Solicitud que secompone de:

A) Información General, que serefiere a la información anterior,pero de manera más detallada. De-berá incluir, entro otras informacio-nes,

• Caracterización delOVGM, incluyendo proteínas y/o RNAs queexpresa el OGM originados en el inserto y elfenotipo que resulta de esa expresión; lasventajas aportadas por la modificacióngenética; resultados de los ensayos de cam-po realizados, en el país y en el extranjero,en lo que respecta a la bioseguridad .

• Una declaración de equivalencia, di-ferencia o no equivalencia del OVGM. Elsolicitante declarará aquí si el OVGM es equi-valente al organismo no GM de la misma es-pecie, excepto por el fenotipo aportado porla modificación genética introducida. La de-claración se referirá a todas aquellas caracte-rísticas del OVGM que no fue intención mo-dificar en el evento. Se deben citar los traba-jos que sostienen esta declaración. La equi-

Tabla I: COMPOSICION DE LA CONABIA

R S PEPRESENTANTES DEL ECTOR RIVADO

INASE: Instituto Nacional de Semillas

SENASA: Servicio Nacional de Sanidady Calidad Agroalimentaria

Representantes del Sector Público

Coordinación Técnica de la Comisión:Dirección de Agricultura (Secretaría deEstado de Agricultura, Ganadería,Pesca y Alimentos)

Institutos Nacionales de Investigación:

De Investigaciones AgropecuariasDe investigaciones Científicas yTécnicasUniversidad de Buenos Aires

Secretaría de Recursos Naturales yDesarrollo Sustentable

Sociedad Argentina de Ecología

Cámara Argentina de ProductosVeterinarios

Cámara de Productos deSanidad Agropecuaria y Fertilizantes

Foro Argentino de Biotecnología

Asociación de Semilleros de Argentina


valencia se referirá al menos a: a) composi-ción centesimal, procesamiento, productos ysubproductos y b) características y prácticasagronómicas, áreas geográficas, tipos deambientes, precauciones específicas para elcultivo extensivo, si las hubiera, con relacióna efectos ambientales. Asimismo, se declara-rán aquí las observaciones sobre cualquierdiferencia no intencional o no esperada, ob-servada en cualquier aspecto de la expresiónfenotípica del OVGM en comparación con elorganismo no GM de la misma especie. Sedeberá incluir toda observación que hayasurgido en el monitoreo post- comercia-lización de este evento (si éste ha sido libe-rado comercialmente en otros países), comoasí también las que resultaran de investiga-ciones realizadas con posterioridad a dichasliberaciones comerciales.

• En caso que corresponda, el solicitantedeclarará aquí si el tipo de modificacióngenética tiene el propósito de introducir di-ferencias que determinan que el OVGM nopueda considerarse sustancialmente equiva-lente al no OVGM, explicando sucintamenteaquellas diferencias. (Ver también Capítulo1).

• Una historia de experimentaciones yensayos previos, instrucciones sobre manejo(agronómico y del producto) y almacenaje(producto, subproductos y remanentes) sidifieren del organismo no transgénico.

• Propuestas para el envasado, rotuladoy procesamiento, si difieren del organismo notransgénico y medidas que deben tomarseen caso de liberación accidental o mal em-pleo.

B. Caracterización general del OVGM :esta información se concentra en la meto-dología y la construcción utilizada en la ob-tención del OGM y en la caracterización ex-haustiva del mismo a nivel molecular yfenotípico. Se debe proporcionar informaciónsobre:

• La especie receptora (característicasfenotípicas, centros de origen y diversidad,distribución geográfica en Argentina, estabi-lidad genética, potencial de transferencia y/o intercambio de genes con otros organis-mos, reproducción, supervivencia, disemina-ción, interacciones con otros organismos,características patogénicas, tóxicas,antinutricionales, alergénicas u otras, e his-

toria de modificaciones genéticas previas).• La modificación genética : método de

transformación empleado, descripción de-tallada del vector (cada elemento genéticocomponente, su origen, tamaño y función;mapa del vector; secuencias nucleotídicas oregiones de la construcción cuyos productoso funciones no sean conocidas; capacidadpara transferir genes, o para ser movilizadospor conjugación, recombinación o integra-ción; regiones del vector que se incorporanal OGM, es decir que constituyen el inserto).

• Caracterización del inserto: análisismolecular de la inserción en el genoma delOVGM (número de sitios de integración, nú-mero de copias de cada gen, incorporaciónde porciones de genes), origen y función decada elemento insertado en el OVGM, infor-mación sobre si el inserto (esto es, alguno desus elementos) confiere alguna función norequerida para la expresión del fenotipo es-perado en el OVGM, transposiciones y/o re-arreglos dentro del inserto presente en laplanta (con respecto a las posiciones que loselementos genéticos tenían en el vector) y/o de/con porciones del genoma de la plantadentro del inserto y en sus regionesflanqueantes; información detallada de lassecuencias del genoma vegetal que flanqueandel inserto y sobre la presencia/ausencia defragmentos del inserto en regiones delgenoma vegetal fuera del inserto funcional.

• Los organismos donantes: caracterís-ticas patogénicas (con relación a las resultan-tes de la expresión de los elementos presen-tes en la construcción utilizada en la trans-formación). Características perjudiciales parala salud humana o animal (con la observa-ción del punto anterior), potencial y/o ante-cedentes de transferencia natural (esto es,en hábitats y condiciones naturales) de loselementos que constituyen la construcción,desde los organismos donantes a otros or-ganismos, su probabilidad o frecuencia, yfenotipos posibles u observados de los orga-nismos receptores.

• Caracterización del OVGM propia-mente dicho: características fenotípicas incor-poradas, si alguna característica fenotípica delorganismo receptor no GM no se expresa enel OVGM. Estabilidad genética, segregacióny transferencia a la progenie. Análisismolecular (Southern blot, PCR). Característi-cas de la expresión del nuevo material


genético. Productos expresados (debe incluirtodos los elementos genéticos que se incor-poran al OVGM, total o parcialmente), carac-terísticas de la expresión (p.ej., constitutiva,tejido-específica), tejidos del OVGM en quese expresan los genes introducidos y nivelesde expresión y su evolución temporal, en re-lación con el ciclo de la planta. Actividad bio-lógica de las secuencias expresadas, ARNstranscriptos no traducidos, sus niveles, fun-ción y caracterización. Análisis detallado delas posibilidades de transcripción, por ejem-plo, que comience dentro del inserto y se ex-tienda hacia el genoma de la planta ignoran-do señales de terminación, así como de trans-cripción y traducción de proteínas de fusióno de marcos de lectura nuevos, generadoscomo consecuencia de la inserción. También,se deben detallar las técnicas de deteccióndel OVGM en el ambiente: Métodosmoleculares y Métodos biológicos:

• Efectos sobre la salud humana: posi-bles efectos tóxicos o alergénicos del OVGM,sus materiales derivados, sus productosmetabólicos, los productos resultantes delprocesamiento industrial habitual (incluyen-do pero no limitado a alimentos), o los resul-tantes de interacciones de estos productoscon otros componentes normales de la die-ta humana. Efecto de la modificacióngenética sobre aquellas características delorganismo no GM que constituyan un peli-gro o riesgo para la salud (incluyendo, perono limitados a, los niveles de antinutrientes).

• Interacciones del OVGM con el am-biente: supervivencia en el ambiente, tasa degerminación y dormición, vigor vegetativo(calidad agronómica, susceptibilidad apatógenos, a insectos, a factores de estrésambiental), ventajas adaptativas presenteso potenciales del OVGM frente al organismono GM, en hábitats y condiciones naturales,y en condiciones de agroecosistemas para lamisma especie y para otros cultivosgeográficamente compatibles. Los modos ytasas de multiplicación y las formas naturalesde propagación. Información cuantitativasobre interacciones: susceptibilidad apatógenos, plagas e insectos y rendimiento.

• Impacto ambiental del OVGM en elagroecosistema: efectos del OVGM sobre laflora, fauna y población microbiana, con én-fasis en las especies benéficas. Efectos deri-

vados de cambios en las prácticasagronómicas (si los hubiera). Conceptos parael manejo de los efectos mencionados en lospuntos anteriores y condiciones específicaspara el manejo de efectos ambientales debi-dos al OVGM. Estudios realizados sobre elescape de genes vía polen.

C. Comportamiento esperado en la pro-ducción del OVGM a escala comercial: estainformación se refiere específicamente al im-pacto ambiental, a información general so-bre la inocuidad del OVGM o sus derivadosalimentarios y a su perfil composicional.

• Impacto Ambiental: efectos sobre laflora y fauna, manejo de efectos no desea-dos potenciales (p.ej., desarrollo de resisten-cia a Bt en insectos previamente sensibles),programa de investigaciones de seguimien-to propuesto, para monitorear posibles efec-tos sobre el ambiente en el largo plazo.

• Efectos sobre la salud humana: con-ceptos y programa de investigaciones que serealizaron para la evaluación de la inocuidadde las nuevas proteínas expresadas en elOVGM; evaluación de la toxicidad, digestiónen jugo gástrico simulado, a diferentes pH:velocidad, caracterización de los fragmentosoriginados y su actividad biológica. Toxicidadaguda de las nuevas proteínas en animalesde laboratorio; determinación del nivel deefecto adverso no observable (sigla del inglésNOAEL), si es posible. Cálculo de la ingestadiaria aceptable (IDA), y su comparación conla ingesta habitual para humanos en dietasnormales. Evaluación del potencial alergénico,homologías de las secuencias de aminoácidosde las nuevas proteínas con otras proteínasrelevantes (toxinas, alérgenos, etc.). Compo-sición centesimal del OVGM, y comparacióncon el correspondiente organismo no GM,en todos los tejidos de la planta; proteínas ycomposición en aminoácidos, lípidos y com-posición de ácidos grasos, carbohidratos yotros componentes (cenizas, fibra, materiaseca, vitaminas, etc.).

Como se presenta en el esquema corres-pondiente, la evaluación completa y detalla-da de la inocuidad y aptitud alimentaria delos OVGMs es llevada a cabo por otra Comi-sión Evaluadora, que funciona en la órbitadel SENASA (Servicio Nacional de Calidad y


Sanidad Agroalimentaria). Las característicasde esta etapa de evaluación son similares alas que lleva adelante CONABIA, y basa susconclusiones en toda la información presen-tada a CONABIA, más otra serie de datos,evidencias experimentales y estudios quedeben ser presentados específicamente enrelación con los aspectos nutricionales y/otoxicológicos del OVGM en cuestión, deacuerdo a los requisitos de la resolución ofi-cial.

En ambas instancias de evaluación debioseguridad se aplica el enfoque comparati-vo desarrollado en el Capítulo 1 y la conclu-sión a la que como mínimo, debe arribarse

para poder recomendar la autorización co-mercial, es:

El OGM es tan seguro como su contra-parte no modificada, para el medio am-biente y la salud humana o animal.8. Eventos con aprobación para suproducción o consumo en paísesLatinoamericanos

De acuerdo con el ultimo informe deISAAA (International Service for theAcquisition of Agri-Biotech Applications,2003), hay seis países en la región que hanaprobado cultivos transgénicos para su pro-

País Maíz AlgodónSoja Otros

Argentina

Brasil*

Colombia

Honduras

México**

Uruguay

-Maíz resistente alepidópteros (evento Bt176)-Maíz tolerante alherbicida glufosinato deamonio-Maíz resistente alepidópteros (eventoMON 810)-Maíz resistente alepidópteros (evento Bt11)-Maíz tolerante a glifo-sato (evento Nk603)

-Maíz resistente alepidópteros

-Maíz resistente alepidópteros

-Maíz resistente acoleóptero

-Maíz tolerante aherbicidas

-Maíz resistente alepidópteros (MON 810)

-Soja tolerante alherbicida glifosato




-Algodón resistentea lepidópteros

-Algodón toleranteal herbicida glifosato

-Algodón resistentea lepidópteros

-Algodón tolerante alherbicida glifosato

-Algodón resistentea lepidópteros (RL)

-Algodón toleranteal herbicida glifosato(TH)-Algodón RLxTH(evento combinado)

Clavel azul

Papa resistente aescarabajo de lapapa y virus Y(New leaf Y)Tomate de madu-ración retrasada.Canola tolerantea herbicidas

*Siembra permitida durante la campaña 2003-2004** maíces aprobados para importación en alimentos. Soja y algodón, siembras pre-comerciales.

Tabla 2. Países de América Latina que han aprobado cultivos GM


ducción o para su importación como alimen-tos.

Lecturas /sitios recomendados

BURACHIK, M. y TRAYNOR, P. 2002. Análisis of a NacionalBiosafety System: Regulatory Policies and Procedures inArgentina. ISNAR Country report 63. www.isnar.cgiar.org

McLEAN, M.A.; MACKENZIE, D.J. and COLE, BA, 2001.Policy Choices in the Development of NationalFrameworks for Biosafety Regulation. Report for theInternational Service for National Agricultural Research(ISNAR), The Hague.

www.sagpya.gov.ar (ir a Biotecnología , Conabia ySENASA): resolución 39/2003.

www.senasa.gov.ar : resolución 412/2002

www.agbios.com: sitio canadiense con informacióndetallada sobre cultivos GM y seguridad

www.ctnbio.gov.br: sitio de la Comisión de Bioseguridadde Brasil

www.oecd.org: Organización para el Desarrollo y laCooperación Económica

www.fda.gov: Agencia de Drogas y Alimentos de losEEUU

www.fao.org: Agencia para la Agricultura y laAlimentación de la Naciones Unidas

www.redbio.org: ir a Marco Regulatorio, parainformación sobre bioseguridad en America Latina y elCaribe

http://www.unep.ch/biosafety/: Programa ambiental delas Naciones Unidas . Información sobre el Protocolo deBioseguridad y marcos regulatorios internacionales

www.cibiogem.gob.mx: sitio de la Comisión evaluadorade bioseguridad de OGMs del gobierno de México.

www.ica.gov.co: sitio del Instituto ColombianoAgropecuario

www.anbio.org.br: Asociación Brasilera de Bioseguridad

www.usbiotechreg.nbii.gov: sitio con informaciónregultoria unificada de los EEUU


IX.-Capítulo 3

Flujo génico mediado por polen y suposible impacto ambiental

Poverene, Mónica; Ureta, Soledad

El flujo de genes es un proceso biológiconatural. Puede ocurrir flujo mediado por po-len entre plantas de la misma especie o deespecies relacionadas y depende del modode polinización y la compatibilidad genéticaentre la planta receptora y la dadora de po-len. También puede ocurrir flujo génico pormovimiento de semillas o de otras partesvegetales hacia poblaciones sexualmentecompatibles. Los agricultores pueden adop-tar prácticas de manejo para minimizar y con-trolar este flujo.

1. Flujo génico y riesgo de escape detransgenes al ambiente

El flujo génico es el proceso de incorpo-ración de genes de una población dentro deotra. En plantas, donde el concepto de es-pecie es frecuentemente puesto a prueba, elintercambio de material genético ocurre en-tre individuos formalmente consideradosuna especie o entre especies relacionadas.El flujo génico tiene lugar a través de la mi-gración de polen o semillas, dispersados porviento, agua o la acción de animales y el hom-bre. En el contexto de la agricultura, el inter-cambio de genes entre plantas y poblacio-nes es un proceso bien conocido en todoslos cultivos mejorados por técnicas tradicio-nales o mediante ADN recombinante y enlas plantas silvestres relacionadas con ellos.El flujo génico es un poderoso mecanismopara prevenir la diversificación de las pobla-ciones, pero también para permitir la difu-sión de mutaciones favorables (Rieseberg yBurke, 2001).

La utilización de cultivos transgénicosplantea la posibilidad de que el flujo detransgenes hacia otras poblaciones («escapeal ambiente») represente un riesgo para losecosistemas, dependiendo de las caracterís-ticas que aporten y sus efectos sobre la po-blación receptora. Se denomina escape a la

diseminación no intencional de la construc-ción genética de un OGM (plantas,microorganismos o animales) hacia otraspoblaciones, mediante mecanismos biológi-cos naturales como la reproducción sexual ola transferencia horizontal. La reproducciónsexual implica la unión de gametos femeni-nos y masculinos, uno de los cuales deberíaser portador del transgen. La transferenciagénica horizontal o lateral consiste en el in-tercambio de material genético entre espe-cies no relacionadas e involucra fenómenosdiferentes. Estos procesos son bien conoci-dos en microorganismos, mediados por dife-rentes sistemas moleculares de inserción(Kurland y col., 2003). En el caso de las plan-tas, el escape génico a través del polen es elmecanismo más probable y de allí que la aten-ción se enfocará sobre este aspecto.

El flujo de genes desde cultivos GM haciacultivos no transgénicos, la aparición de nue-vas malezas difíciles de erradicar y la reduc-ción de la biodiversidad son las inquietudesmás frecuentemente invocadas del escape detransgenes. Excepto el primero, no se haninformado casos concretos donde las otrasdos situaciones se hayan observado.

La literatura sobre los riesgos del escapees especulativa y los estudios científicamen-te documentados hasta el momento confir-man la imposibilidad de extraer conclusionesgenerales y la necesidad de efectuar pruebaspara cada caso particular (Carpenter y col.,2002; Conner y col, 2003), tal como lo reco-miendan las principales agencias regulatoriasdel mundo. Estas exigen ensayos experimen-tales con todos los eventos en desarrollo ygeneralmente, la información obtenida apartir de los mismos así como las conclusio-nes de los comités evaluadores se puedenconsultar en Internet (ver lista de sitios reco-mendados).

Las construcciones genéticas en las va-riedades GM son caracterizadas a nivelmolecular y en cuanto a sus efectosfenotípicos antes de su liberación (ver ca-pítulos 1 y 2 de esta Sección). El número deinsertos y de copias es conocido y la transmi-sión de los caracteres introducidos se estu-dia para evaluar su comportamiento y esta-bilidad. En algunos casos de transgénesisla transmisión puede ser variable. El culti-var de zapallo Freedom II posee tres insertos

400 POVERENE, Mónica; URETA, Soledad

de un transgen que confiere resistencia a vi-rus y su descendencia puede heredar una, doso las tres copias del gen (Spencer y Snow,2001). Normalmente, el carácter conferido seexpresa como dominante y aun cuando nose conozca exactamente el número de co-pias de un transgen en un genoma, la pro-babilidad de transmisión a través del polenmediante el proceso normal de meiosis, esde al menos 50%. En especies alógamas oparcialmente alógamas, la difusión deltransgen hacia variedades no transgénicasde la misma especie dependerá exclusiva-mente de los mecanismos de polinización,generalmente por el viento (anemófila) olos insectos (entomófila).

En la mayor parte de los cultivos se co-nocen las distancias mínimas de aislamien-to necesarias para prevenir la polinizacióncruzada entre variedades. Estas constituyenla base para determinar las medidas debioseguridad que se exigirán en cada casodurante la fase de liberación experimental.Una vez aprobado el cultivo para su siembraa escala comercial, esas distancias no sonnecesariamente aplicadas en la prácticaagronómica. La cuestión queda en manos delos agricultores y depende de los intereseseconómicos que para ellos represente lacomercialización de un cultivo transgénico,tradicional u orgánico. Un ejemplo de con-flicto se dio en 1998 en Canadá, donde seregistraron denuncias de contaminación delotes de colza tradicional con polen de colzaGM, posiblemente provenientes de lotes cer-canos o de plantas subespontáneas, escapa-das de los cultivos (http://news.bbc.co.uk/g o / p r / f r / - / 2 / h i / s c i e n c e / n a t u r e /3116713.stm).

En lugares donde se ha autorizado lasiembra de cultivos transgénicos, éstospueden coexistir con cultivos tradicionalesu orgánicos, lo que requiere medidas ade-cuadas durante el cultivo, cosecha, trans-porte y almacenamiento, a fin de evitar lamezcla accidental de materiales GM y noGM, que puede tener consecuencias eco-nómicas para productores que comerciali-cen productos no transgénicos. Las reco-mendaciones tendientes a evitarla consistenen: 1. Medidas a tomar dentro del estable-cimiento, como respetar las distancias de ais-lamiento, colocar barreras a la dispersión delpolen, o intercalar lotes con cultivo de una

especie distinta. 2. Cooperación entre esta-blecimientos vecinos sobre planes de siem-bra, o uso de variedades con tiempo de flo-ración diferente. 3. Utilizar los servicios deextensión para informar a los productores,monitoreo, intercambio de información téc-nica y servicios de alarma.

La modificación genética en plantas hasido exitosa en más de 20 familias botánicasdiferentes, comprendiendo cereales,oleaginosas, forrajeras, especies hortícolas,frutales, forestales y ornamentales(www.agbios.com). La mayor parte de lasespecies domesticadas como cultivos po-see parientes silvestres, los que frecuen-temente se utilizan como donantes de ca-racteres útiles para el mejoramientogenético, tales como resistencia a estresesbióticos y abióticos. Esto implica que entre laespecie domesticada y la silvestre existe sufi-ciente relación genética como para transferiresos caracteres mediante cruzamientos y se-lección. Los cruzamientos ocurren natural-mente en regiones donde las especies con-viven y muchas malezas han evolucionado através de la adquisición de genes de los culti-vos (Keeler, 1989; Ellstrand y col., 1999). Esposible que un transgen sea transferido deun cultivo GM hacia poblaciones silvestreso malezas relacionadas. Los transgenes queconfieren tolerancia a herbicidas, resistenciaa insectos o a patógenos podrían conferir lasmismas características a plantas silvestres re-lacionadas en la vecindad, determinando unamayor supervivencia bajo la presión de selec-ción natural (insectos herbívoros opatógenos) o de prácticas agronómicas usua-les para el control de malezas, plagas o en-fermedades (uso de pesticidas, agentes decontrol biológico). En consecuencia, aumen-taría el número o tamaño de las poblacionessilvestres. El concepto de «supermaleza» hasurgido como consecuencia de reconocer ladificultad que implicaría el control de esaspoblaciones. El potencial impacto ambien-tal depende tanto de la probabilidad detransferencia del transgen a la poblaciónsilvestre como de la consecuencia de esatransferencia (Ahl Goy y Duesing, 1996).Según la probabilidad de transferencia, loscultivos pueden clasificarse en tres grupos:I. Mínima probabilidad de transferencia aespecies silvestres, sea porque éstas no exis-


ten en el área o no hay compatibilidad sexualentre el cultivo y su pariente silvestre. II. Cul-tivos con baja probabilidad de transferen-cia, cuando la compatibilidad sexual es limi-tada. III. Cultivos con alta probabilidad detransferencia, cuando especies silvestressexualmente compatibles crecen en la vecin-dad del área sembrada.

Las consecuencias de la transferenciadependen de la capacidad potencial deltransgen para aumentar la aptitud bioló-gica y conferir ventajas selectivas a la es-pecie silvestre receptora. De acuerdo coneste criterio, también se pueden agrupar losgenes en diferentes clases. En la clase I sesitúan los transgenes que confieren peque-ña o ninguna ventaja adaptativa, como losmarcadores de selección, genes deandroesterilidad o de madurez retrasada. Laclase II, de escasa ventaja adaptativa, com-prende genes que pueden conferir algunaventaja bajo la adecuada presión de selec-ción, como los de tolerancia a herbicidas ode resistencia a insectos y enfermedades. Enla clase III se sitúan genes para mejorar elcrecimiento y la supervivencia, que confe-rirían ventajas adaptativas en cualquierambiente. La Tabla I presenta una clasifica-ción de los cultivos GM autorizados o bajoensayo en la Argentina, según esos criterios.

La reducción de la biodiversidad por cau-sa del uso de cultivos GM es probablementela consecuencia más difícil de visualizar. Laerosión o pérdida de variabilidad genéticaatribuida al monocultivo o al uso de unaspocas variedades que dominen el mercadode semillas, no es privativa de los cultivosGM y puede prevenirse mediante una ade-cuada planificación de la agricultura regio-nal. Por otra parte, algunas especies crecenen ambientes especializados ogeográficamente limitados como raras espe-cies silvestres o razas locales domesticadas(landraces) constituyendo reservorios de di-versidad genética de potencial uso en el me-joramiento genético. Cuando crecen en lavecindad de cultivos a gran escala, existe laposibilidad de cruzamientos naturales y flujogénico a través del polen del cultivo hacia laespecie local. Esto puede resultar en una pér-dida de vigor y fertilidad en los descendien-tes –depresión por alogamia– o de identi-dad genética por sucesivos ciclos de cruza-

miento con el cultivo, de manera que paula-tinamente la especie local se va perdiendohasta la completa extinción. El proceso esdependiente de la frecuencia de cruzamien-to, la cual a su vez depende de la cantidadrelativa de individuos de cada especie. Nue-vamente, el proceso puede evitarse me-diante adecuadas medidas de conservacióny manejo del cultivo.

Se puede concluir que la posibilidad deescape de transgenes es de orden diferen-te según la población recipiente. Una varie-dad no GM de la misma especie ciertamenteadquirirá el transgen si es expuesta al flujode polen del cultivo GM. Una rara variedadlocal domesticada perderá asimismo identi-dad por contacto genético con el cultivo. EnMéxico se ha informado la detección de ra-zas nativas de maíz portadoras de transgenesprovenientes de variedades GM, cuyo culti-vo está vedado (Quist y Chapela, 2001), loque ha generado controversias y estudioscientíficos adicionales. Algunos autores hacennotar que las prácticas de cultivo de los pe-queños productores de maíces criollos enMéxico también contribuyen al flujo génicoentre híbridos, variedades mejoradas, GM ylos maíces criollos, como parte de sus hábi-tos de selección y ensayo (Christou, 2002;Martínez–Soriano y col., 2002; CIMMYT2003).

Cuando no existen barreras biológicasal flujo génico, el escape depende exclusi-vamente de factores antrópicos y puedeser prevenido mediante un manejo cuida-doso. La situación no es tan simple si setrata de una población silvestreemparentada, ya que dependerá de las re-laciones genéticas con el cultivo, que de-terminan la probabilidad de hibridación. Serequerirá de una evaluación de la probabili-dad de escape y del impacto que el transgenpodría ocasionar en la población silvestre.

2. Factores que determinan el escape detransgenes y su impacto ambiental

La mayor parte de los cultivos actualesestá emparentada con una o más especiessilvestres o malezas, con las que puedehibridar y producir descendientes total o par-cialmente fértiles. Trigo, arroz, avena, sorgo,cebada, maíz, soja, girasol, colza, maní, po-


roto, caña de azúcar, remolacha azucarera,algodón, papa, zapallo, frutilla, rábano, za-nahoria, vid, tréboles y otras especies culti-vadas son objeto de experimentaciónbiotecnológica. El flujo génico a través delpolen permite la transmisión de caracteresheredables a parientes silvestres. Si esoscaracteres son beneficiosos para la super-vivencia o la fertilidad, aumentarán la ap-titud biológica de las poblaciones recipien-tes. El intercambio genético de los cultivoscon sus parientes silvestres es uno de losmecanismos de origen de las malezas (Keeler,1989; Ellstrand y col., 1999). Aproximadamen-te la mitad de los caracteres que determinaninvasividad están controlados por genes úni-cos, de modo que existe la posibilidad de quetransgenes relacionados con la aptitud bio-lógica persistan y modifiquen poblaciones sil-vestres. Podría resultar que éstas se vuelvanmás abundantes en su hábitat o invadannuevos hábitat. También podrían tener efec-tos adicionales sobre poblaciones de insec-tos o patógenos.

La evaluación del riesgo de escape detransgenes comprende tres etapas:

1. Investigación de barreras genéticas ogeográficas para el escape del transgen des-de el cultivo hacia las poblaciones silvestres.

2. Investigación del efecto del transgensobre la aptitud biológica de las plantas sil-vestres.

3. Investigación de las consecuenciasecológicas de la difusión del transgen en lapoblación silvestre.

Hasta el momento existe escasa infor-mación sobre situaciones reales y no sería po-sible generalizar las conclusiones, ya que és-tas dependen del evento de transformación,la población recipiente y las condiciones am-bientales donde tiene lugar el escape. A con-tinuación se expondrán algunos factores atener en cuenta en ese esquema.

3. Barreras geográficas y genéticas entreel cultivo y especies silvestres

Las especies silvestres suelen difundir-se desde su centro natural de origen, perono siempre están presentes en la mismaárea geográfica del cultivo. Por ejemplo, lasoja (Glycine max) y su pariente silvestre G.soja conviven naturalmente en China y

Corea, donde producen un híbrido interfértil,G. gracile, pero no en el resto del mundo. Elmaíz (Zea mays) hibrida con el teosinte (Z.m. ssp. mexicana, Z. diploperennis, Z.luxurians) presente en México, aunque exis-te evidencia que muestra que el flujo génicoentre híbridos de maíz y teosinte va en ladirección teosinte-híbrido y no en la direcciónopuesta (Evans y Kermicle, 2001).

En la Argentina, estas especies no convi-ven con parientes silvestres, mientras quecolza, arroz y girasol sí lo hacen y pueden cru-zarse con ellos. El primer paso consiste enel estudio sistemático de la flora local. Aúncuando se encontraran especies silvestresemparentadas, la hibridación con la especiecultivada dependerá de la afinidad genéticaque tengan entre ellas, la cual determinadesde completa fertilidad de los híbridoshasta grados variables de esterilidad y aún laimposibilidad de cruzamiento. Para que lacruza tenga lugar, ambos taxa deben flo-recer al mismo tiempo y el polen debe sercapaz de germinar y efectuar la fecunda-ción. La descendencia suele tener una fertili-dad menor que las especies parentales, peroraramente es por completo estéril. La fertili-dad parcial de los híbridos permite laintrogresión, la incorporación estable degenes de una especie en otra mediantesucesivas retrocruzas de sus descendien-tes con una o ambas especies parentales.Caracteres morfológicos y fenológicos inter-medios entre la especie cultivada y la silves-tre constituyen un buen diagnóstico de hi-bridación e introgresión, pero el estudio demarcadores moleculares resultainvalorable. Este ha demostrado que la ma-yor parte de los cultivos hibrida con sus pa-rientes silvestres y que los alelos de las espe-cies domesticadas persisten durante genera-ciones en las poblaciones silvestres, aún cuan-do no se adviertan cambios morfológicos.Este es el caso del girasol con sus parientessilvestres Helianthus annuus ssp. annuus yH. petiolaris en Norteamérica (Whitton ycol., 1997, Riesberg y col., 1999, Snow y col.,2000). En la Argentina, donde ambas espe-cies silvestres se han naturalizado, hemosencontrado numerosas evidencias de hibri-dación e introgresión con el cultivo en laregión central del país, tanto por caracte-res morfológicos y fenológicos como por mar-


cadores moleculares, constatando además lafertilidad parcial de los híbridos medianteestudios del polen y de la producción de se-millas (datos propios no publicados). En gira-sol se ha estudiado la transmisión a plantassilvestres de un transgen Bt (ver Parte VIII)para resistencia a lepidópteros (Show y col.,2003) y uno de oxalato oxidasa, OxOx queconfiere resistencia al hongo Sclerotinia(Burke y Rieseberg, 2003). En zapallo GM(Cucurbita pepo) se estudió la transferenciade la resistencia a dos virus, ZYMV y WMV2(Spencer y Snow, 2001). El flujo génico a tra-vés del polen es una poderosa fuerza evo-lutiva y el impacto sobre las poblacionessilvestres depende de su magnitud, asícomo del efecto de los alelos transmitidossobre la población recipiente.

La magnitud del flujo mediado por po-len puede medirse a través de la frecuen-cia de marcadores moleculares caracterís-ticos del cultivo presentes en una pobla-ción silvestre o sus descendientes. Estoshan demostrado que la ubicación de un genen el genoma tiene una importancia crucialpara su difusión mediante hibridación. Encolza, un aloploide (AACC), la introgresiónde tolerancia a herbicidas y androesterilidadhacia la especie diploide Brassica rapa (AA)sería menos probable si los transgenes quecodifican esos rasgos estuvieran en el genomaC, porque implicaría una recombinaciónintergenómica. (Jorgensen et al. 1996). Engirasol (Helianthus annuus) donde ha ocu-rrido una extensa remodelacióncromosómica mediante inversiones ytranslocaciones, la transferencia de untransgen hacia la especie silvestre H.petiolaris es improbable si este no está si-tuado en las porciones colineares entre am-bos genomas (Rieseberg y col., 1999).

La cuantificación de la tasa de hibrida-ción e introgresión entre el cultivo y la es-pecie silvestre mediante experimentos ade-cuados es previa a la investigación de lasconsecuencias génicas y ecológicas del es-cape del transgen, ya que si la tasa de hi-bridación fuera despreciable, no cabría pre-ocuparse por las consecuencias.

4. Efecto del transgen sobre la aptitudbiológica de las plantas silvestres

Una vez comprobada la posibilidad dehibridación y la presencia de un transgen enplantas silvestres, surge la pregunta: ¿se es-

pera que el transgen incremente su frecuen-cia en las poblaciones silvestres? El destinode un alelo en una población dependerá desu efecto sobre la aptitud biológica de losindividuos que lo adquieren. Si no tiene efec-to alguno en ese ambiente ecológico, se tra-ta de un alelo neutro y su destino depende-rá del azar, o sea que su frecuencia en la po-blación estará sujeta a la deriva génica ypersistirá o eventualmente se perderá. Si suefecto es deletéreo conducirá a una depre-sión alogámica, con disminución de la viabi-lidad y fertilidad de los híbridos. El efecto nue-vamente dependerá de la magnitud del flu-jo génico y cuanto mayor sea, mayor será elriesgo de extinción de la población silvestre.Si el alelo es beneficioso, el flujo génicoacelerará su diseminación en la poblaciónsilvestre y la frecuencia alélica aumentarárápidamente, en forma proporcional al mo-vimiento de polen desde el cultivo a la po-blación silvestre (Ellstrand y col., 1999).

La diseminación de un transgen en lapoblación silvestre requiere que loshíbridos cultivo/silvestre se reproduzcanen condiciones naturales. Estudios previosde hibridación entre cultivos no transgénicosde colza, sorgo, girasol, rábano, poroto y tri-go y sus parientes silvestres han demostra-do que no sólo lo hacen sino que su aptitudbiológica puede ser incluso mayor que la desus progenitores silvestres. En uno de los pri-meros estudios de transmisión de untransgen a poblaciones silvestres, Scott yWilkinson (1998) encontraron una baja fre-cuencia de plantas híbridas de Brassica rapaportadoras de un transgen de colza, consi-derado neutral y concluyeron que el riesgode transmisión era bajo. En tanto, Spencer ySnow (2001) demostraron que los híbridosentre calabaza GM y zapallo silvestre eransuficientemente vigorosos como para permi-tir la rápida introgresión de transgenes neu-trales y beneficiosos en las poblaciones silves-tres. En girasol, un transgen beneficioso queconfiere resistencia a lepidópteros mediantela producción de la proteína Bt Cry1Ac, au-mentó considerablemente la fecundidad delas plantas silvestres recipientes, aunque esteefecto varió entre localidades y años (Showy col., 2003). De acuerdo con estas observa-ciones, podría esperarse que el gen Bt aumen-te la aptitud biológica de girasoles silvestres


e incremente rápidamente su frecuencia enlas poblaciones naturales, debido a que re-duce el daño producido por varias especiesde insectos herbívoros. Sin embargo, eltransgen OxOx, que confiere resistencia alhongo Sclerotinia, no aumentó significati-vamente la fecundidad de plantas de girasolsilvestre, sugiriendo que su diseminación se-ría prácticamente neutral luego de un esca-pe hacia poblaciones naturales (Burke yRieseberg, 2003). En Brassica rapa untransgen Bt adquirido por cruzamiento concolza transgénica disminuyó su agresividadcomo maleza en un 20% comparado conB.rapa no GM (Adam, 2003). Estos son ejem-plos contrastantes de los efectos detransgenes sobre la aptitud y comporta-miento ecológico de poblaciones silvestres.

¿Cómo estimar los costos y beneficios deun transgen para la aptitud biológica de unaespecie silvestre? La aptitud o valoradaptativo es una medida relativa de laeficacia reproductiva de un genotipo, cuan-do se lo compara con otro genotipo. En estecaso, los genotipos a comparar son el queha adquirido el transgen por hibridación conel cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea elgenotipo silvestre de la población en ausen-cia de flujo génico del cultivo. Los componen-tes de la aptitud son la supervivencia y la fe-cundidad, que pueden resultar afectadas endistintos momentos del ciclo vital. La medi-ción de la aptitud puede hacerse a travésdel porcentaje de germinación, superviven-cia de plántula, número de flores, produc-ción de semilla, peso de la semilla, etc. y encada caso de estudio será necesario determi-nar cuáles parámetros reflejan mejor la su-pervivencia y la fertilidad de los individuos.Los resultados obtenidos deberían indicarla velocidad de diseminación del transgeny la probabilidad de que las poblacionesque lo incorporen, adquieran ventajasadaptativas.

En general, las poblaciones silvestres sonmenos susceptibles a patógenos y plagas quesus parientes cultivados. Mayor diversidadgenotípica, menor densidad de plantas yausencia de laboreo son algunas de las cau-sas de esa diferencia. Por ello, un transgenque confiera resistencia a una plaga o pató-geno puede no representar para la especiesilvestre una ventaja tan grande como para

el cultivo. Por el contrario, puede represen-tar un costo para la planta que lo adquieradebido a efectos pleiotrópicos sobre otroscaracteres fenotípicos que a su vez afectenla aptitud. El beneficio de un transgen aso-ciado a la resistencia a determinada plagadebe ser evaluado comparando la aptitudbiológica de plantas con el transgen y sin élque hayan sido expuestas a esa plaga. Por elcontrario, el costo de adquirir el transgendebe ser medido comparando la aptitud bio-lógica de plantas que lo llevan o no, en au-sencia de la plaga. Además, los caracteresque determinan supervivencia y fecundidadpueden ser afectados por las condicionesambientales, por lo que es necesarioestimarlos en distintos ambientes y a lo lar-go de varias estaciones de crecimiento. Lasdiferencias significativas entre plantas silves-tres GM y no GM en cada sitio, entre sitios yentre años pueden ser probadas para cadacarácter relacionado con la aptitud median-te un análisis de la varianza.

5. Consecuencias ecológicas de ladifusión del transgen en la poblaciónsilvestre

La teoría de la selección natural prediceque un fenotipo cuya aptitud biológica seasuperior a la de otros fenotipos de la pobla-ción, dejará mayor cantidad de descendien-tes y que si estos a su vez heredan el genotipofavorecido, su frecuencia aumentará en de-trimento de los demás genotipos. Sin embar-go, el impacto ambiental dependerá no sólode la frecuencia sino del cambio en lasinteracciones bióticas y abióticas de esegenotipo silvestre en su ambiente. La predic-ción de las consecuencias de un escape detransgenes requiere del estudio de la altera-ción de las interacciones ecológicas existen-tes entre las especies. Un gen de resistenciaa insectos o a enfermedades modificará laherbivoría o la relación huésped-patógenoentre la especie silvestre y otras especies desu hábitat, así como un transgen que favo-rezca el crecimiento modificará las relacionesde competencia intra e interespecíficas.Cuanto más se conozca acerca de la diná-mica poblacional de una especie, más fá-cilmente se podrá evaluar el impacto am-biental. En Cucurbita pepo, híbridos entre


un cultivar GM y plantas silvestres mostraronamplias variaciones en fecundidad entre añosy localidades, que fueron atribuidas a condi-ciones de suelo y clima, densidad de herbívo-ros, competencia con malezas, enfermeda-des y otros factores ambientales (Spencer ySnow, 2001). El crecimiento poblacional através de la producción de semilla es unode los parámetros más informativos y esmás probable que sea limitante para espe-cies anuales; por ello, caracteres que au-menten la producción o germinación desemilla tienen un gran efecto ecológico.Asimismo, está relacionado con la dispersión,la dinámica del banco de semillas y la longe-vidad de las poblaciones. Resultados prelimi-nares en poblaciones experimentales de gi-rasol silvestre sometidas a flujo génico de uncultivo GM (Bt) indicaron que el aumento dela producción de semilla determinó mayornúmero de plántulas, mayor supervivenciahasta la edad reproductiva, mayor númerode inflorescencias con semilla y mayor áreatotal de capítulo al año siguiente (Pilson y col.,2002). El incremento en tamaño y númerode las poblaciones silvestres de una especieafectará a otras especies vegetales delhábitat, cuya frecuencia relativa podría dis-minuir.

El escape de un transgen Bt de resisten-cia a insectos a una población silvestre po-dría tener un impacto negativo en varias es-pecies de herbívoros, algunas de las cualespueden ser especialistas, alimentándose conexclusividad de la especie silvestre receptora.Como parte de los estudios necesarios parala evaluación del impacto ambiental de even-tos Bt, se incluyen estudios del impacto deestos genes sobre especies no blanco (aque-llas que no son las controladasespecíficamente por esos genes) (Wolt y col.,2003). Las toxinas Bt son altamente específi-cas para determinados tipos de herbívoros(lepidópteros, coleópteros, dípteros) y la dis-minución de uno de ellos puede alterar lasrelaciones de competencia con los demás. Lasrelaciones ecológicas entre herbívoros suelenimplicar un delicado equilibrio demográficocuyo colapso podría contribuir a mayores ni-veles de infestación y daño (Groot y Dicke,2002).

El uso comercial de cultivos Bt ejerce una

presión selectiva que podría favorecer la se-lección de insectos resistentes a las toxinas,que llevan una mutación recesiva de resisten-cia en condición homocigota. La descenden-cia podría heredar los genes de resistencia yen unos pocos años, la biotecnología desa-rrollada para el control de insectos se volve-ría inefectiva. Para evitar esta situación se haideado la estrategia del cultivo refugio, queconsiste en sembrar una franja de variedadno transgénica junto a la variedad Bt. Losinsectos se reproducen libremente en esafranja, de modo que los raros portadores deresistencia se mantendrán en una frecuenciarelativamente baja en la población total deinsectos. La pérdida de la eficacia Bt es ac-tualmente una de las mayores preocupacio-nes ambientales en relación con el uso debiotecnología agrícola aplicada al control deinsectos. Hasta el momento no se han de-tectado insectos resistentes en condicionesde producción a campo de cultivos Bt(Shelton y col., 2002; Tabashnik y col., 2003).

Conclusiones

El estudio del impacto ambiental prece-de la liberación de cualquier nuevo eventode transformación en plantas para tener re-sultados confiables en el ambiente de la libe-ración. La mayor parte de los efectos no de-seados del escape de un transgen puedenevitarse mediante acciones adecuadas quepueden planificarse anticipadamente (mane-jo del cultivo, bancos de germoplasma, culti-vos refugio, etc.). Sin embargo, la difusión deun transgen hacia poblaciones silvestresemparentadas es difícil de evitar debido a queel polen de los cultivos puede alcanzar gran-des distancias. En las próximas décadas, loscultivos GM se utilizarán en gran escala, porlo que será necesario evaluar cuidadosamen-te el riesgo de escape de transgenes paracada uno de ellos. Esa evaluación, realizadapor equipos multidisciplinarios, debe conside-rar los siguientes aspectos: a) Presencia deespecies silvestres sexualmente compatiblescon el cultivo y la probabilidad de que eltransgen difunda en ellas. b) Cambios en lascaracterísticas de poblaciones de patógenos,insectos y malezas relacionadas con el culti-vo GM y medidas para evitar o retardar laaparición de biotipos resistentes. c) Cambios


Tabla I. Clasificación de las especies GM en Argentina según la probabilidad de transferencia del transgen (Grupo1,2,3) y las consecuencias biológicas de la modificación genética( Clase 1,2,3).


en la dinámica de poblaciones de otras es-pecies vegetales y animales que compartenel hábitat (polinizadores, parásitos ypredadores, microflora y fauna del suelo).Esos estudios también tienen en cuenta elfondo genético y las condiciones ambienta-les para cada caso en particular (Burachik yTraynor 2002, Ver Capítulos 1 y 2 de esta sec-ción).

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www.sagpya.gov.ar: CONABIA en Secretaría deAgricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos.


IX-Capítulo 4

Detección de OGM en la cadenaalimentaria

Tozzini, Alejandro C.

Una gran cantidad de plantasgenéticamente modificadas (GM) han sidoaprobadas para su cultivo en el ámbito mun-dial luego de haber pasado por rigurosos con-troles de seguridad alimentaria y ambiental.Sin embargo, algunos mercados, en particu-lar la Unión Europea, tienen estrictos reque-rimientos para su etiquetado. En este caso,la normativa de etiquetado que rige a partirde abril de 2004, establece el etiquetadoobligatorio de los alimentos y piensos deri-vados de un OGM, independientemente dela detectabilidad de ADN o proteínas, y sóloadmite la presencia adventicia (accidental) dehasta un 0.9% de OGM aprobados o de 0,5%en el caso de eventos, aún no aprobadospero con un dictamen de bioseguridad favo-rable.

La Argentina es uno de los países conmayor adopción de OGM, segundo despuésde los EE.UU. y antes que Canadá. El aprove-chamiento a campo de los beneficios de labiotecnología vegetal implicó inmediatamen-te la necesidad de implementar procedimien-tos de campo y laboratorio para poder dis-criminar mercaderías conteniendo un nivel deOGM superior a un determinado umbral, deaquellas que estaban por debajo. A partir delaño 1997 los exportadores comienzan a de-mandar el análisis de partidas de granos des-tinados a la Comunidad Europea. En esemomento el contenido aceptable era infe-rior al 1%, los protocolos de detección reque-rían de la germinación de los granos (paraextraer ADN de las hojas) y en algunos casoshasta el uso de sondas radioactivas. Desdeentonces, se ha avanzado sensiblemente enuna serie de aspectos que han hecho evolu-cionar el panorama, tanto en el país comoen el mundo:

- Se han desarrollado protocolos depurificación de ADN y de PCR para aplicara gran escala.

- Los métodos de PCR han evoluciona-

do hacia técnicas cuantitativas (PCR enTiempo Real)

- Se han desarrollado técnicasinmunológicas y «kits» específicos de fácilaplicación.

- Hay más información molecular sobrelos eventos y los primers específicos corres-pondientes.

- Los operadores de mercado se hanfamiliarizado con el concepto de OGM.

- Se han desarrollado y aplicado pro-gramas de Trazabilidad e Identidad Preser-vada para la característica «genéticamentemodificado».

- Se discuten protocolos y materialesde referencia a nivel de normas de CODEXAlimentarius, ISO (International StandardsOrganization) e ISTA (International SeedTesting Asociation) entre otras.

- En el país se ha desarrollado una lo-gística de segregación de granos y semi-llas capaz de abastecer con distintos pro-ductos, los requerimientos específicos demercados de exportación, o del nacional,en aquellos casos en los que la demandaesté dispuesta a cubrir los costos deriva-dos de la segregación.

A grandes rasgos, una planta genética-mente modificada es aquella a cuyo genomase han incorporado uno o más transgenesmediante alguna de las técnicas de ingenie-ría genética. Estos transgenes poseen unasecuencia nucleotídica específica y algunos deellos se expresan generando una proteínanueva en el organismo, lo cual le va a confe-rir un nuevo fenotipo a la planta. En cual-quiera de estos tres niveles, ADN, proteí-nas o fenotípico, es posible hacer un análi-sis para determinar cualitativa ocuantitativamente la presencia de unamodificación genética. La detección a nivelde ADN se realiza mediante amplificaciónpor PCR, a nivel de proteínas por técnicasinmunológicas (tiras reactivas o ELISA), mien-tras que la fenotípica implica la evaluaciónde la nueva característica producida por eltransgen. Desde el punto de vista de los re-querimientos técnicos, el análisis fenotípicopuede ser el más sencillo, mientras que el aná-lisis por PCR es en general, el más complejo.

Los protocolos analíticos son muy sensi-

410 TOZZINI, Alejandro C.

bles ya que detectan un gen en decenas demiles de genes del genoma, o una nueva pro-teína entre varios miles de proteínas. A estohay que sumarle la «dilución» no OGM /OGM, que en muchos casos requiere detec-tar y cuantificar un grano GM entre variosmiles.

Actualmente, los protocolos pueden de-tectar un evento o grupo de eventos en uncultivo en particular pero ninguno puede hoydetectar en un único ensayo todos los even-tos, por eso no se puede asegurar que unamuestra está «libre de OGM»; sólo se puedeasegurar que está libre de los eventos paralos cuales se hayan realizado los análisis per-tinentes.

Detección fenotípica

En referencia a los métodos de detecciónfenotípica, nos concentraremos en elfenotipo como resultado de algún proce-so metabólico de la planta (y no restringirnosa una definición de fenotipo que implique lamedición de alguna proteína). Las plantasgenéticamente modificadas (PGM) que seencuentran actualmente a campo presentanla característica de resistencia a herbicida y/oa insectos. La evaluación de la resistencia ainsectos de una planta se realiza medianteensayos biológicos complejos y de largaduración, por eso ésta no es una alternativapráctica parael análisis de granos. Sin embar-go, la resistencia a herbicidas sí puede serevaluada mediante ensayos sencillos en la-boratorio y a campo. Las semillas o granospueden ser puestos a germinar en presenciadel herbicida (para soja, 0.5 ml glifosato 48%en 1 litro de agua; Monsanto America Lati-na. 2001), y sólo germinarán aquellos indivi-duos portadores del gen de resistencia (Fig.1).

La cantidad de semillas GM puede serestimada en la muestra mediante un cál-culo sencillo: semillas RR = semillas germi-nadas con glifosato/semillas germinadascon agua.

Una vez que un lote ha sido sembrado ymientras el cultivo se encuentre en una eta-pa en la que es susceptible al herbicida, sepueden hacer aplicaciones de herbicida enpequeñas parcelas representativas (Fig. 2)para luego hacer el recuento de plantas so-

brevivientes sobre total de plantas tratadas.Si los individuos GM y no GM tienen el mis-mo rendimiento entonces, los granos quese cosechen en ese lote tendrán una pro-porción de GM/ no GM igual al porcentajede plantas sobrevivientes.

Estas alternativas de evaluación son usa-das en soja por los propios productores queabastecen a parte de la industria nacionalproductora de jugos y alimentos a base desoja. La industria, por su parte, controla estamateria prima mediante el uso de testsinmunológicos a la entrada de la planta pro-cesadora. Generalmente de un conjunto delotes así controlados se toma una muestraque se envía a un laboratorio para realizarun análisis por PCR para así tener un límitede detección menor y una cuantificación delcontenido de GM, lo que además les permi-te obtener un certificado de una tercera par-te (laboratorio independiente) para el con-trol de procesos de producción.

¿Detección inmunológica o por PCR?

La elección del método de detección de-pende de varios factores, uno de ellos es elproducto que se va a analizar: la matriz (gra-nos, harina, galletita, sopa, etc). En el casode grano y los primeros productos de mo-lienda de éstos, tanto la proteína como elADN conservan sus propiedades físico-químicas intactas, por lo tanto ambos mé-todos pueden aplicarse. Sin embargo, a me-dida que la materia prima es elaborada ha-

Figura 1: mezcla de semillas de maíz no GM y GM (eventoGA 21, Monsanto) puestas a germinar con agua (superior)y con solución de glifosato (inferior). (gentileza de Ing.Agr. Silvia Passalacqua y Mónica Abal. Lab. del SENASA)


cia alimentos terminados, los distintos trata-mientos a que son sometidos los componen-tes, hacen que se vayan degradando el ADNy las proteínas. Especialmente estas últimaspierden su estructura disminuyendo rápida-mente sus propiedades inmunológicas, porlo tanto no es apropiado aplicar métodosinmunológicos a alimentos con alto gradode procesamiento.

El ADN, por su parte, se corta en frag-mentos pequeños, hasta que la mayoríatiene un largo menor al segmento a ampli-ficar y por lo tanto ya no resulta ampli-ficable. A esto hay que sumarle las modifica-ciones químicas de las bases del ADN quehacen que pierdan su capacidad de servircomo templado en el proceso de copia invitro que ocurre durante la PCR (Fig. 3), poreso en determinadas ocasiones la presenciade OGM en las materias primas usadas dejade ser detectable en el producto final. Algosimilar ocurre con aquellas materias primasusadas como sustrato de procesosfermentativos, como la fabricación de cerve-za, al final del cual la mayoría de las molécu-las han sido digeridas y resintetizadas.

Junto con esto cabe acotar que los cos-tos de extracción/purificación del ADN sonmayores a partir de matrices elaboradas y/ocomplejas.

Otro de los factores que atenta contralas posibilidades de detección es el grado depurificación del producto: en productoscomo los aceites, la lecitina o la glucosa noqueda una cantidad suficiente de ADN comopara ser purificado y amplificado.

Procedimientos inmunológicos

Básicamente dos son los formatos quetoman los ensayos inmunológicos para ladetección de OGM: las tiras reactivas (ostrips de flujo lateral) o ELISA (ensayo deinmunodetección ligado a enzimas).

Flujo lateral o lateral flow

En este formato se reúnen todos losreactivos en un soporte sólido y medianteel flujo por capilaridad de la muestra en so-lución se logra determinar la presencia o au-

sencia de una determinada proteína (análi-sis cualitativo). Este formato ha sidoexitosamente aplicado para la detección deun sinnúmero de moléculas de importanciaen el diagnóstico veterinario y humano,como es el caso de los tests rápidos de em-barazo. Para el ensayo debe molerse unacantidad determinada de granos y una alí-cuota de esta harina mezclarse con un bu-ffer (provisto con el kit) o agua, para gene-rar una solución que incluya la proteína deinterés. La tira posee en la parte inferior unfieltro que sirve para absorber la solucióncon las proteínas y filtrar las partículas quese hallan en suspensión (Fig. 4). Al mismotiempo, en el otro extremo se encuentra unmaterial absorbente que recibe el flujo queasciende por capilaridad. El líquido en suascenso, pasa primero por una zona en don-de se halla un anticuerpo monoclonal (Atb)contra la proteína a detectar, conjugado conuna molécula coloreada (con oro o látex). Sila proteína está presente en la muestra, enesta zona se producirá el reconocimiento

Figura 2: representación esquemática de la aplicaciónde herbicida en parcelas representativas en un lote desoja para determinar y cuantificar la presencia deindividuos GM con resistencia al herbicida.

Figura 3: Representación esquemática de la degradaciónde las propiedades fisico-químicas de las proteínas y delDNA con el grado de procesamiento de la materia primahasta el alimento terminado. De alli la elección de latécnica adeacuada para detectar OGMs según la matriz aanalizar.


por el Atb y ambos seguirán migrando jun-tos. La segunda zona es la de «pegado» olínea de resultado. En ésta se halla inmovili-zado un segundo anticuerpo monoclonalcontra la proteína en cuestión, de forma quecuando ésta llega a esa zona, queda reteni-da y concentrada en una línea delgada, y altraer consigo al conjugado coloreado, la re-gión comienza a ser visible.

Finalmente, hay una tercera zona llama-da de control, en la cual un segundo anti-cuerpo contra el anticuerpo conjugado estáinmovilizado y retiene al conjugado que nohaya quedado retenido en la línea de re-sultado, generando también una línea visi-ble en esa zona. Esto indica que se produjoel flujo ascendente de líquido y que el anti-cuerpo conjugado se halla en buenas condi-ciones. La aparición de esta línea avala losresultados negativos, al indicar que la fal-ta de color en la linea de resultado no sedebe a una falla del kit. Cuando el resulta-do es positivo (visualización de color en lazona de resultado) no es necesario que apa-rezca la banda de control. En la práctica, labanda de control presenta menor intensidaden las muestras positivas que en las negati-vas debido a que el conjugado que llega aesta zona es sólo aquel que no se adhirió ala proteína y no quedó retenido en la líneade resultado (ver foto en Fig. 4). En casosexcepcionales todo el conjugado queda re-tenido en la línea de resultado quedando sincolor la banda de control.

Para realizar el ensayo a partir de granoses necesario moler los mismos y resuspenderen un buffer una muestra representativa dela harina obtenida. En esta suspensión seintroduce la parte inferior de la tira y se es-pera de 10 a 20 minutos el desarrollo de co-lor. El resultado es cualitativo (positivo onegativo) y la sensibilidad (o límite de de-tección) oscila entre el 0.5 y 2% para loseventos Bt11 y Mon810 en maíz (eventosprotegidos de insectos con el gen cry1Ab deB.thuringiensis) y de 0.1-0.3% para soja RR(evento GTS 40-3-2, tolerante a glifosato, conel gen para la enzima CP4EPSPS). Como semencionó, el ensayo es cualitativo, pero apartir de los resultados se pueden hacer cál-culos estadísticos para determinar la proba-bilidad de que la muestra tenga un conteni-do de granos GM inferior a un determinado

valor para un dado nivel de confianza. Paraesto, es imprescindible conocer la sensibi-lidad del strip expresada en granos GM/granos no GM, y trabajar con submuestrasque no excedan este número para evitar re-sultados falsos negativos. Por ejemplo, lasensibilidad de detección de la proteína CP4EPSPS es de 1 grano GM en 1000 no GM,por lo tanto el número máximo de granosa incluir en cada submuestra es de 1000.Entonces, para una submuestra de 1.000 gra-nos de resultado negativo y aceptando unnivel de confianza de 95% (i.e. la probabili-dad de resultado negativo del análisis es de5%), la frecuencia de no GM (probabilidadde no GM) será la raíz unmilésima de 0.05;esto es 0.997 y por lo tanto el contenidomáximo de GM esperado es de 0.003 (0.3%).Si de la misma muestra se analizan dossubmuestras de 1.000 granos y ambas resul-tan negativas, el cálculo ahora involucra la raízdosmilésima de 0.05, lo que determina uncontenido máximo de GM de 0.0015 (0.15%).Realizando el análisis de submuestras, la sen-sibilidad de análisis de una muestra se puedemejorar combinando estadísticamente los re-sultados de cada una de ellas. Los manualesde los distintos kits incluyen tablas de cálculoque están basadas en estos conceptos.

En general, los strips reactivos tienenuna versión optimizada para la deteccióna partir de tejido vegetal para poder reali-zar el análisis en los períodos en que el culti-vo aún no presenta granos. La mayor venta-ja de realizar el análisis en granos es la facili-dad para muestrear cientos de individuos ycombinarlos en una misma muestra; esto esmucho más difícil de lograr a partir de la re-colección de hoja. Por otro lado, algunoseventos (ej, maiz Bt 176, de Syngenta) tie-nen niveles de expresión de las proteínastransgénicas altos en hojas y prácticamentenulos en granos, por lo tanto en estos casosresulta ventajoso el análsis de hojas y des-aconsejado el de granos. Como se observaen la Figura 5 los eventos Bt11 y MON810pueden ser detectados hasta en una concen-tración de 0.5%, mientras que el evento 176no se detecta, aún en una concentración de10%. Resultados similares se obtienen con losstrips provistos por Envirologix o porStrategic Diagnostic Inc (A. Tozzini, datos nopublicados). Otros datos de perfomance de


reactivos inmunológicos en formato de stripso de ELISA para distintos eventos y provee-

dores puede verse en http://www.usda.gov/gipsa/tech-servsup.

Obviamente la gran venta-ja de esta metodología de aná-lisis radica en su simplicidad y ra-pidez, por eso se la utiliza «acampo» como control inicialen la conformación de conjun-tos que luego serán analiza-dos por algún método cuanti-tativo, o como primer controla la entrada de un proceso oindustria.

ELISA (enzyme-linkedimmunosorbant assay)

En este caso, el análisisinmunológico se resuelve sobreel soporte sólido de placas depoliestireno en el formato de96 pocillos o de tiras de 8 o 12pocillos. Estos pocillos estánrecubiertos con el anticuerpo de

Figura 4: Esquema de las partes de un strip reactivo (vertexto) y foto de dos strips para la detección de la proteínaCP4 EPSPS (resistencia a glifosato) mostrando unresultado negativo (izq.) y otro positivo (der). (Gentilezade Mónica Porcio, Agricheck Argentina, representantede Strategic Diagnostic Inc. www.sdix.com )

Figura 5: Ensayo de límite de detección de granos de maíz Bt utilizandoel Quickstick TM de Envirologix (www.envirologix.com). Los porcentajesexpresan granos de un evento/granos no GM. Entre paréntesis figura eltiempo en minutos transcurridos desde el inicio del ensayo y en el cualse iniciaron las lecturas de los resultados. No hubo cambios en unalectura posterior a los 20 min. (A. Tozzini, Instituto de BiotecnologíaINTA)

Figura 16: Lectura de un microchip luego de lahibridación con DNA marcado. Suponiendo que se tratarade un micro-array para identificar GMO, los puntosfluorescentes representarían secuencias pertenecientesa GM presentes en la muestra. En primer plano se muestrauna ampliación de uno de los 16 campos que conformanel micro-array.


captura, en los cuales se agrega lasolución con la muestra (prepara-ción similar a la anterior). Si la pro-teína en cuestión (antígeno) estápresente, ésta queda capturadaen el pocillo por los anticuerpos.Finalizado el período de incu-bación con la muestra ésta se vuel-ca del pocillo y se realizan lavadoscon buffer para retirar las molécu-las que no hayan sido capturadas.Luego se coloca un segundo anti-cuerpo que se unirá a la proteínacapturada por el anticuerpo ante-rior, y que está conjugado con unaenzima que transformará elcromógeno (ver más adelante).

Finalizada la incubación con elconjugado, se lava con buffer pararetirar todo el conjugado libre (nounido al antígeno). El últimoreactivo que se agrega es una so-lución conteniendo un cromó-geno, una sustancia incolora quees modificada por la enzima delconjugado en un compuesto co-loreado y que revela, por lo tan-to, la presencia del antígeno en lamuestra. La intensidad de colorgenerada en un pocillo determi-nado en un tiempo dado es me-dible en un espectrofotómetro

DNA genómico

Primers (en exceso) Separada de las hebras (95ºC) ypegado de los primers (60ºC)

Primers complementarios a la secuencia genómica

Extensión de los primers (72ºC) porla Taq polimerasa

Nuevas cadenas de DNA sintetizada a partir de losprimers y sobre las hebras genómicas

Separado de las hebras, pegado delos primers y extensión

Nuevas cadenas de DNA sintetizada sobre DNAsintético (tamaño del fragmento a detectar)

Separado de las hebras, pegado delos primers y extensión

DNA doble cadena del tamaño esperado (amplicón)

Duplicación de la cantidad de amplicónpor cada ciclo de amplificación

1.000.000.000 copias de amplicón1.000.000.000 copias de amplicón

CICLO 1

CICLO 2

CICLO 3

CICLO 30

Figura 6: Esquema del proceso de PCR (Polimerase Chain Reaction).Amplificación de un fragmento específico de DNA mediante un procesode síntesis in vitro.

Figura 14: Desarrollo de la amplificación en una PCR en Tiempo Real para distintas muestras (incluyendo la curva decalibración, el control sin DNA (línea horizontal marrón) y el control negativo (inicia fase exponencial en ciclo 39.


para placa de ELISA y es proporcional a lacantidad de antígeno inicial.

Por lo tanto, esta lectura puede transfor-marse (con una curva de calibración apropia-da) en una estimación cuantitativa del con-tenido del OGM en la muestra. La sensibili-dad de estos análisis se encuentra entre el0.3 y 1%, y requiere de un laboratorio decomplejidad baja a media y personal califica-do. El resultado se obtiene en 3 a 4 horas(sin contar la molienda de la muestra). Comoen el caso de las tiras, también son varias lasempresas que ofrecen anticuerpos y placaspara realizar este tipo de ensayo (ver http://www.usda.gov/gipsa/tech-servsup). Esteensayo es adecuado para asistir un proce-so de segregación de granos, para aquelloseventos que tengan una buena expresión dela proteína transgénica en granos y en casosque se necesite hacer un análisis cuantitativosencillo.

Para un determinado tipo de proteína,por ejemplo la de Bacillus thuringiensis BtCry1A, la secuencia de aminoácidos codifica-da es la misma (o muy similar) en las distin-tas construcciones utilizadas para generar losdistintos eventos de transformación, aúncuando sus secuencias nucleotídicas sean muydistintas. Por eso, el mismo anticuerpo pue-de ser usado para detectar distintas cons-trucciones presentes en los distintos even-tos (los maíces tolerantes a lepidópterosMON 810, Bt11 y Bt176, tienen Bt Cry1A).

En algunos casos no es posible generarun anticuerpo para detectar la proteína in-troducida debido a que es muy similar a pro-teínas propias de la planta original y por lotanto no es posible generar un anticuerpoque detecte a la proteína introducida sindetectar también la ya presente en la planta(reacción cruzada). Este es el caso de la pro-teína que determina la resistencia a glifosatointroducida en el evento GA21, en el cual laproteína modificada (mEPSPS, la enzima to-lerante al herbicida) presenta sólo dosaminoácidos de diferencia en 450, con res-pecto a la EPSPS nativa de maíz, la cual essensible al glifosato.

Detección del ADN

Existen varias técnicas para determinar lapresencia de una determinada secuencia de

ADN; sin embargo, los servicios de detecciónde secuencias transgénicas utilizan casi exclu-sivamente PCR. El transgen es uno más en-tre las decenas de miles de genes origina-les de la planta. Además, en la práctica, serequiere de la capacidad de poder detectarun grano GM entre 1.000 o 10.000 granosno GM, y la PCR ha demostrado tener la sen-sibilidad suficiente como para cumplir estecometido. Sin embargo, la mayor dificultadde un análisis dirigido a detectar niveles mí-nimos de OGM no radica en las técnicas ana-líticas sino en la posibilidad de hacer unmuestreo representativo en la práctica, acor-de a los niveles a detectar. Las muestras degranos (de al menos 15.000 granos paradetecciones de 0.1%) deben ser molidas yreducidas en su granulometría para tomaruna muestra de harina menor a un miligramoy de allí, purificar su ADN.

La reacción en cadena de la polimerasaes una síntesis in vitro de ADN, mediada poruna ADN polimerasa ADN-dependiente apartir de un cebador o primer (segmento deADN simple cadena de 18 a 25 nucleotidos).Un par de primers son utilizados para deter-minar la especificidad y el tamaño del frag-mento a amplificar. Una ADN polimerasatermo-rresistente proveniente de Termo-philus aquaticus, Taq polimerasa, es la enzi-ma encargada de la replicación del ADNbajo un programa de ciclos repetidos quealterna normalmente tres temperaturas: unatemperatura de desnaturalización (94-95°ºC) en la cual el ADN doble cadena se abreen hebras simples, le sigue una etapa de hi-bridación de los primers (de 45 a 68° ºC) enla cual éstos se unen por complementariedadde bases con el ADN simple cadena y sirvende punto de inicio de la síntesis de ADN porla Taq polimerasa. Finalmente la temperatu-ra se eleva a 72°ºC, en la fase de elongación,ya que ésta es la temperatura óptima de fun-

Figura 7: Ubicación de distintos pares de primers conrespecto a la construcción y al sitio de inserción en elgenoma de la especie.


cionamiento de la enzima y de esta forma seacelera la reacción. Así termina un ciclo decopia y se inicia el siguiente elevando nueva-mente la temperatura hasta 94-95°ºC (Fig. 6,ver pág.6). Estos ciclos tienen una duraciónde 2 a 4 minutos y se repite de 35 a 50 ve-ces multiplicando una copia del fragmen-to inicial en más de 1.000 millones de co-pias al final del proceso.

El producto de la amplificación se resuel-ve por electroforesis en gel de agarosa y sevisualiza con un colorante fluorescente(bromuro de etidio) bajo radiación UV. Esteaparece como una banda de un tamaño pre-determinado de pares de bases, correspon-diente al fragmento amplificado.

La técnica de PCR es muy sensible, y porlo tanto, niveles ínfimos de contaminacióncon ADN en una muestra pueden generarun resultado positivo falso. La amplificaciónrepetida del mismo fragmento de ADN(amplicón) va generando cientos de miles demillones de copias dentro del mismo labora-torio y estas copias pueden contaminar lasnuevas muestras y los reactivos si no se tie-nen cuidados especiales. En primer lugar se

requiere de un laboratorio especialmente di-señado con cuartos separados para las dis-tintas tareas del análisis y con un flujounidireccional de la muestra desde las áreas«limpias» hasta la última zona «sucia». En elprimer cuarto se muele la muestra, en el se-gundo se purifica el ADN y se prepara la reac-ción de PCR y en el último se produce la am-

plificación y se resuelve por electroforesis. Eneste último cuarto se abre el tubo de reac-

ción y es donde se «liberan» losamplicones. Es conveniente que elprimer y último cuarto tengan pre-sión negativa, mientras que en elde purificación la presión debe serpositiva.

Cada cuarto debe ser limpiadoregularmente con hipoclorito desodio, tener un sistema de luz UVpara la destrucción del ADN y tenersus propios equipos e instrumentos.Sólo personal capacitado puede in-gresar en los laboratorios paraminimizar el transporte deamplicones de un cuarto a otro.

El reactivo clave en una reacciónde PCR son los primers que deter-minarán el fragmento a amplificar.Para esto, se requiere conocer la

secuencia de nucleótidos de un segmentode la construcción usada para generar elevento, para así poder diseñarlos. Esta in-formación no siempre está disponible, perouna vez que se la conoce, la síntesis deprimers es mucho más barata y sencilla quela producción de anticuerpos para reactivosinmunológicos. Según sea la secuencia so-

810

Bt11

40-3-2

Figura 8: Representación esquemática de las partes componentes delas construcciones de los eventos aprobados en la Argentina en soja ymaíz (no están los dos eventos en algodón). P35S: promotor 35S,T35S: terminador 35S, Tnos: terminador de la nopalin sintetasa, Pmaíz:promotor no especificado de un gen de maíz, Cry 1Ab: proteína Btque confiere resistencia insectos, CP4 EPSPS: proteína que confiereresistencia al herbicida glifosato, PAT: fosfinotricin acetil transferasa,determina resistencia a glifosinato.

Evento P 35S Tnos T35S

GA21 0 1

GTS 40-3-2 1 1

MON 810 1

NK 603 1 2

T25 1 1

TC1507 1 2

176 1 3

Bt11 2 2

MON 809 3 1

T14 3 3

3

MON 832 4 1

DBt418 5

CBH 351 �5 �5

Tabla 1: Número de copias por genoma de distintassecuencias regulatorias en diferentes eventos (P35S =promotor 35S CaMV. Tnos = terminador de la nopalinsintetasa. T35S = terminador del 35S de CaMV)


bre la cual se ubiquen los primers, los mis-mos tendrán propiedades de detección dis-tintas. Los primers generales o «universa-les» están diseñados sobre secuencias pre-sentes en la mayoría de las construccionesvegetales (promotores, terminadores, genesmarcadores, etc.), por lo tanto, permiten de-tectar varios eventos (Fig. 7). Los primersespecíficos permiten detectar uno o pocoseventos. Si estos están ubicados sobre la se-cuencia codificante pueden detectar un mis-mo tipo de construcción, por ejemplo, loseventos Bt11 y MON810. Normalmente, conuna construcción se obtienen muchos even-tos en una misma especie, pero sólo uno al-canza la fase comercial; sin embargo, a vecesuna misma construcción se usa para trans-formar varias especies y por ello, una mismaconstrucción se repite en el mercado en va-rios cultivos. En estos casos, los primers queamplifican esta construcción detectan varioseventos. Por ejemplo, con los mismosprimers se puede amplificar el evento GTS 40-3-2 de soja y el NK603 en maíz (así como tam-bién los mismos reactivos inmunológicos).

Los primers evento-específicos estándiseñados sobre el inserto y sobre la regióngenómica adyacente al sitio de integración;por eso, permiten detectar un solo evento(de todos los que hayan sido obtenidos conuna determinada construcción).

Todos los eventos aprobados en la Ar-gentina hasta la fecha (ver: Biotecnología –CONABIA en www.sagpya.mecon.gov.ar) tie-nen en su estructura por lo menos una copiade la secuencia del promotor 35S, sea paradirigir la transcripción del gen principal o delgen marcador (Fig. 8 y Tabla 1); por eso, unareacción de PCR con primers ubicados sobreel p35S permite detectar la presencia de cual-quiera de estos eventos.

Existen dos tipos de PCR desde un puntode vista técnico: la primera versión de PCR,ahora denominada de Punto Final (EndPoint PCR), debido a que el resultado de laamplificación se obtiene al finalizar la reac-ción (electroforesis en gel), y la otra versión,más reciente, la PCR en Tiempo Real (RealTime PCR), ya que el resultado de la amplifi-cación se lee ciclo a ciclo (sistema de tubo ce-rrado).

Desde el punto de vista del objetivo dela reacción, un ensayo puede hacerse a losfines de detectar la presencia de OGM o deun evento en particular (análisis cualitativo)o para cuantificar su presencia (análisis cuan-titativo).

La cinética de acumulación del produc-to de PCR se puede describir en tres etapas,la primera de lenta acumulación del produc-to, una segunda en la cual en virtud de lacantidad de copias acumuladas, el crecimien-to del producto es exponencial y la terceraen la cual el sistema se satura y alcanza un«plateau». (Fig. 9).

Los momentos (ciclos del proceso) en loscuales se alcanzan las distintas etapas depen-den del número inicial de copias del seg-mento de ADN a amplificar en la muestra;una muestra con mayor número de copiasiniciales alcanzará la fase exponencial antesque una con menor número. Otra caracterís-tica del sistema es que la fase estacionaria ode plateau, determina que las cantidadesde producto totales acumuladas en las dis-tintas muestras tiendan a igualarse aunquehayan iniciado con un número distinto decopias. (Fig. 10).

Figura 9. Evolución de la acumulación de DNA en unareacción de PCR positiva. La fase exponencial decrecimiento está marcada entre barras.

Figura 10: Evolución de la acumulación de DNA enfunción de los ciclos para distintas reacciones de PCRcorrespondiente a diferentes concentraciones inicialesdel fragmento de DNA a amplificar. La línea umbralcorresponde a un determinada cantidad de DNA, que essuperado por las distintas reacciones en diferentes ciclos.


El resultado de una PCR en Punto Final(PCR PF) se obtiene una vez que se han cum-plido todos los ciclos de amplificación progra-mados y el producto se resuelve por elec-troforesis en un gel de agarosa. El bromurode etidio agregado al gel o después de ha-berlo corrido se intercala en el ADN y permi-te visualizar los productos de amplificacióncuando se lo irradia con iluminación UV. Deesta manera se puede determinar la presen-cia del producto esperado (amplificación

cado entre el 0.01 y 0.05% de genomas GM.Esto equivale a detectar de 5 a 25 copias detransgen por reacción según el tamaño delgenoma de la especie y de la cantidad deADN usado en cada reacción. Programandoun alto número de ciclos (45 a 50 ciclos) sepermite que aún las muestras con un bajo

Figura 11: Resultado semicuantitativo por PCR de PuntoFinal. Scanning de una foto de trabajo, los trazosverticales a mano alzada separan las distintas calles delgel. Las primeras 6 calles corresponden a la Curva deCalibración con los siguientes puntos, 0.05%, 0.1%, 0.25%.0.5%. 1% y 5% (genomas GM/genomas totales). Lesiguen dos calles correspondientes al control negativo(maíz no GM, molido en la misma tanda que las muestrassiguientes). Los pares de calles de 1 a 7 corresponden a7 muestras con dos repeticiones cada una (dos extracciónde DNA y una PCR de cada extracción), muestras 1, 2 y 3,GM no detectado con LOD 0.05%; muestras 6 y 7 GMdetectado, con contenido estimado inferior al 0.1%;muestras 4 y 5 debe repetirse la PCR y/o extracción hastaigualar los resultados entre las repeticiones(generalmente esto ocurre con muestras con bajocontenido de GMO por un tema de muestreo de la harinay del DNA).

específica), identificado por su pesomolecular (en pares de bases), relativo a unmarcador de peso conocido. También se pue-de observar la presencia de productosinespecíficos si los hubiera.

Análisis cualitativo por PCR PF

La PCR en Punto Final es adecuada paraanálisis cualitativos, es decir, donde el re-sultado se medirá como amplificación positi-va (OGM detectado) o como negativa, (OGMno detectado), considerando la sensibilidadlograda , límite de detección o LOD.Optimizando todos los parámetros de lareacción: ADN de muy buena calidad, primersbien diseñados, reactivos de máxima calidady con un programa y un equipo adecuados,se puede lograr un límite de detección ubi-

Figura 12: PCR competitiva. Co-amplificación de lasdiluciones crecientes del estandar y decrecientes del DNAde la muestra. En el punto de equivalencia se igualan lasmasas de los productos de amplificación

número de copias iniciales alcancen la faseexponencial y acumulen una masa visible deproducto, a costa de saturar las muestras concontenidos mayores. En estos ensayos, ade-más de los controles negativos compues-tos por una muestra con ADN de materialno GM y el control sin ADN (sólo agua), sedebe incluir como controles positivos almenos dos puntos de concentración conoci-da de GM. Una de éstas debe tener un con-tenido de GM igual al límite de deteccióndeseado de forma tal de verificar que el LODse ha alcanzado y otro superior como segun-do control en caso de que la eficiencia delproceso no haya sido óptima. Estos valorespodrían ser 0.05% (LOD) y 0.20%. Es muy con-veniente que estos controles positivos se ini-cien en el proceso de análisis a partir delmomento de la purificación del ADN. De estamanera, se está controlando en ellos la cali-dad del ADN obtenido, además de la eficien-cia del proceso de PCR. El análisis cualitati-vo es también denominado screening test,ya que permite hacer un primer análisis a undeterminado número de muestras y luegoderivar a PCR cuantitativa aquellas que resul-taron positivas.

Análisis semicuantitativo por PCR PF

En un análisis en PF puede obtenerse unaestimación del contenido de OGM en unrango dinámico acotado. Un resultado po-


sitivo se expresa como detección de OGM yun contenido estimado por una curva decalibración con valores próximos al LOD delensayo. Para esto hay que estandarizar muybien las condiciones intralaboratorio, espe-cialmente cantidad y calidad de ADN y canti-dad de ciclos de amplificación (teniendo encuenta que alcanzado el plateau de la reac-ción, la cantidad de ADN acumulado tiendea igualarse entre muestras con distintas con-centraciones de OGM). El resultado positivose expresa como: OGM detectado con unLOD de ensayo X; la cantidad de productogenerado se ubica entre las señales produ-cidas por los estándares A y B (controlespositivos). Por ej.: amplificación de promo-tor 35S positiva con un LOD = 0.05%; la canti-dad de producto amplificado se ubica entrelos generados por los estándares de 0.1 y0.5%. Cuando este ensayo se realiza con unacurva de calibración puede verse, por ejem-plo, una señal débil en los estándares de 0.05y 0.1%, una señal media en 0.25 y 0.5% y fuer-te en 1 y 5% (Fig. 11).

Análisis cuantitativos por PCR PF, PCRcompetitiva

Una de las estrategias desarrolladas paracuantificar por PCR de Punto Final fue la PCRcompetitiva (Hardegger y col., 1999) y estábasada en la co-amplificación (en la mismareacción y a partir del mismo par de primers)de un estándar interno de concentraciónconocida. Cuando la señal de amplificacióngenerada a partir de la muestra y a partir delestándar interno son iguales, se asume que

ambos procesos partieron de igualnúmero de copias iniciales del ADNblanco. El estándar interno se cons-truye clonando en un plásmido elfragmento a amplificar y producién-dole una inserción o deleción de ma-nera tal que cuando se resuelvan enun gel los productos de amplifica-ción a partir de la muestra y delestándar, se distingan por sus pe-sos moleculares. Para lograr una re-acción donde se igualen los produc-tos de amplificación (muestra: con-trol interno) se arma una serie dediluciones crecientes del estándar yse combina con una serie de dilu-ciones decreciente de la muestra

(Fig. 12.).Esta estrategia, además de laboriosa

(para obtener una reacción donde se igua-len los productos de amplificación), requieredel desarrollo del control interno, pero sepuede realizar en un laboratorio de PCR tra-dicional.

PCR en Tiempo Real (Real Time PCR)

En un sistema de PCR en Tiempo Real, elproceso de amplificación se va siguiendociclo a ciclo, observando el incremento de lamasa de ADN presente en cada reacción. Estose logra gracias a un termociclador que tieneadosado un sistema óptico que emite un hazde luz sobre cada muestra y registra la emi-sión de fluorescencia a partir de las misma yde uno o más reactivos fluorescentes agre-gados a la reacción y que emiten luz de ma-nera proporcional a la cantidad de ADN pre-sente (Fig. 13). La ventaja de este sistema esque permite detectar en qué momento cadareacción alcanza su fase exponencial de am-plificación (Fig. 14, ver pág.6), y éstacorrelaciona con la cantidad de copias delADN blanco que había inicialmente en lamuestra.

Para poder cuantificar se necesita incluiren el experimento una curva de calibracióncon la cual comparar las muestras incógnitas.A partir de esta curva, se determinará en quéciclo alcanza la fase exponencial cada concen-tración de OGM. Una muestra con un 10%de OGM alcanzará la fase exponencial antesque una muestra con un 1%; y ésta antes queuna con 0.1%. La cuantificación del conte-nido de OGM se obtiene comparativamen-

Figura 13: Esquema de la estructura optica del ABI prism 7700 (PEBiosystem). Este sencillo esquema muestra como a partir de uanfuente de luz (laser en este caso) se direcciona la luz hasta cadamuestra y la emisión de retorno es dirigido hacia una cámara. Undetalle de equipos como este es que la tapa caliente que apoya sobrelas muestras debe ser transparente. Fuente PE Biosystems


te con la curva de calibración usada y ensus mismas unidades (número de copias,porcentual, etc) (Fig. 10 y Fig. 15).

Una de estas expresiones relativas se lo-gra cuantificando genomas modificados, res-pecto de los genomas totales de la especie.Para determinar el número de genomasmodificados se mide el número de copias delsegmento de ADN transgénico (una copiapor genoma), mientras que para medir elnúmero de copias de genoma de la especiese cuantifica el número de copias de un genendógeno, de copia única y propia de laespecie, esto siempre dentro de la mismamuestra de ADN. Por lo tanto, en este ensa-yo se necesita utilizar dos curvas de calibra-ción, una para el número de copias deltransgen y otra para la cuantificación del genendógeno, para lo cual se utilizan plásmidosconteniendo las secuencias en cuestión.Cuando la cuantificación de una muestra serealiza por evento, la suma de los porcentua-les de cada evento determina el contenidototal de la muestra.

Para granos, la curva de calibración pue-de prepararse mezclando distintas propor-ciones de granos modificados con no mo-dificados. De esta manera, la extracción deADN a partir de estas mezclas ya tiene unaproporción fija y conocida de genomas mo-dificados/no modificados. Si en la reacción dePCR se utiliza la misma cantidad y calidad deADN en los estándares y en las muestras, sepuede hacer la comparación directa entreéstos para realizar la cuan-tificación.

Como en todo análisis cuantitativo, elmaterial de referencia es de suma impor-tancia. Para maíz y soja existen preparados(harinas) comerciales con distintas concentra-ciones de GM (de 0 a 2%). Este material de

referencia, es preparado por el IRMM de Eu-ropa (Institute for Reference Material andMeasurements, www.irmm.-jrc.be ) y por sucosto se lo usa generalmente para calibrarlos materiales preparados en el laboratorio;sin embargo, es muy difícil lograr la estabili-dad y reproducibilidad de los valores entrelotes e incluso algunos productos se handiscontinuado.

En materia de plásmidos, una firma japo-nesa comercializa uno que contiene 8 secuen-cias que están presentes en un gran númerode eventos comerciales (www.fasmac.co.jp).

Al tema de los materiales de referenciase le agrega el de las unidades de medición.En la mayoría de los contratos comercialesde granos en los cuales se estipula un deter-minado contenido de OGM, este contenidose expresa de manera porcentual pero sinespecificar las unidades. Lo mismo ocurredentro de la legislación europea de etique-tado (EC 49/2000) y su reciente modificaciónhacia un límite de 0.9% para cada especie in-grediente (EC 1829/2003), donde tampocose especifica las unidades de esta mediciónrelativa. En general se asume que se tratade una medición relativa de peso en peso.Sin embargo, ninguno de los métodos ana-líticos cuantitativos, ELISA cuantitativo oPCR cuantitativa, puede medir estas unida-des e incluso cuantifican elementos distin-tos entre ellos. Si en una muestra de granosse conoce el número de granos GM, se pue-de calcular con precisión el contenido porcen-tual en peso. Sin embargo, conocer el núme-ro de granos GM a partir de un contenidode genomas modificados medidos por la pre-sencia del promotor 35S, implica conocer in-formación precisa de la muestra o suponer-la. Por ejemplo, en una especie diploide, si

Figura 15: Ajustematemático de losresultados de lasmuestras queintegran la curva decalibración y a partirdel cual se calcularála concentración deGM en las muestras.Los puntos incluidosen esta curva son0.05, 0.1, 0.25. 0.5,1 y5% (Genomas/genomas totales).


el evento está en estado homocigota, ten-dremos el doble de copias del p35S que siestá en estado de heterocigosis (lo más pro-bable es que en una muestra tengamos pro-porciones distintas de ambos estados). Ade-más, en los granos heterocigotas, el tejidotriploide del endos-perma genera diferen-cias en la densidad del transgen por uni-dad de masa; si el transgen llegó al granopor la gameta masculina (polen), elendosperma tendrá una relación modificado:no modificado de 1:2, mientras que si ingre-só por la gameta femenina, la relación será2:1, debido a la contribución genética des-igual de ambos padres en el endosperma 3n.

También hay que conocer los eventosinvolucrados, ya que algunos tienen una co-pia del p35S por genoma, mientras que otrostienen dos, tres y hasta 5 copias (Tabla 1).Cuando se está cuantificando la contamina-ción accidental con GM de un lote de gra-nos, es poco probable que se tenga la infor-mación precisa de la misma y su origen.

¿Cómo detectar OGM en el futuro?

En un futuro cercano serán muchos loseventos aprobados y liberados en el mun-do, y las secuencias hoy presentes en la ma-yoría de los eventos, como son el promotor35S y el terminador NOS, ya no serán comu-nes. El desarrollo de nuevos promotores es-pecíficos de la especie y la función hará quelos distintos eventos prácticamente no ten-gan ninguna secuencia en común. Con la tec-nología actual, esto implica que deberíamosrealizar una reacción de PCR por cada even-to posible para poder finalmente decir quela muestra no contiene (con un límite de de-tección dado) una determinada lista de even-tos correspondiente a todos los que hayansido ensayados. Hoy, un ensayo de PCR di-rigido al P35S y cuyo resultado sea negati-vo permite descartar la presencia de másdel 90% de los eventos del mercado mun-dial.

El consumidor, especialmente el europeo,ha solicitado la eliminación en las plantastransgénicas de los genes de resistencia aantibióticos. Estos son usados como marca-dores de selección en los procesos de trans-formación y regeneración vegetal. Estas se-cuencias también son comunes a muchos

eventos y por lo tanto útiles a la hora dedetectar la presencia de modificacionesgenéticas, pero estos genes ya no estaránpresentes en los nuevos materiales GM.

Por otro lado, los próximos desarrollosplanean agregar o modificar varias caracte-rísticas en el mismo genotipo o la introduc-ción de pasos metabólicos complejos. Estoimplicará la introducción de varios genes dis-tintos en transformaciones sucesivas. Las téc-nicas actuales de integración al azar en elgenoma tienen una muy baja eficiencia deproducción. Por eso, para estos desarrollosse requerirá el uso de sistemas de integra-ción al genoma que sean dirigidos a sitiosespecíficos del mismo (sistemas de integra-ción por recombinación). Unos pocos siste-mas se presentan como promisorios para suuso, entre ellos el sistema Cre/Lox, (SrivastavaV, Ow DW, 2001). Por lo tanto es posible quelas secuencias requeridas para el funciona-miento de estos sistemas sean, en el futuro,blanco para la deteccción de OGM.

En diversos ámbitos se está discutiendola posibilidad de introducir secuencias nocodificantes en el genoma de las plantas jun-to con los genes de interés de una modifica-ción genética, para generar blancos de de-tección universales frente a la diversidad deeventos que habrá en el futuro.

Frente a esta perspectiva de diversidadde modificación genética y tan heterogéneamundialmente, la nueva tecnología de losmicrochips, microarrays o micromatrices,podría permitir detectar y cuantificar en unsolo ensayo la presencia de cientos o milesde secuencias. A grandes rasgos, unmicrochip es un pequeño soporte sólido deltamaño de un cubreobjetos para microscopiaóptica, en el cual se han fijado puntos orde-nados y microscópicos de secuencias de sim-ple cadena conocidas.

Estas secuencias tienen la capacidad dehibridar con su ADN complementario, y siéste está marcado con un fluoróforo, el pun-to de la micromatriz quedará marcado. Lue-go de la hibridación con la muestra de ADNmarcado, un aparato de barrido especial rea-liza la lectura punto por punto, identifican-do los puntos marcados y por lo tanto lassecuencias que están presentes en la mues-tra bajo análisis (Fig. 16, ver pág.5).

Desde el año 2001 una comisión europea


de investigación está encargada de desarro-llar el «GMO chip», un chip de baja densi-dad (1000 puntos /cm2) que permita detec-tar la presencia de distintos OGM simultánea-mente (ver: www.gmochips.org).

Segregación, trazabilidad e identidadpreservada para GMO

El objetivo de un programa de traza-bilidad es generar un producto de identidadpreservada, esto es un producto del cual sepuede conocer su origen y los procesos a quefue sometido hasta alcanzar el producto fi-nal en destino. La identidad preservada seaplica para obtener un producto identifica-do por su origen geográfico, y/o por su con-tenido y/o por su método de producción.Esto implica el trabajo de auditores, ensayosde laboratorio y documentación a lo largode todo el proceso. La trazabilidad está aso-ciada a la reastreabilidad (identificar el ori-gen de los productos) y a la segregación,para evitar las mezclas y para descartar todoaquello que no cumpla con lo requerido.Muchas veces se confunden los términostrazabilidad y segregación y no se refieren alos mismos conceptos. Segregación implicamantener separado un producto de otros,mientras que trazabilidad significa conocer suorigen y no forzosamente separación. Latrazabilidad de un producto puede mostrarque en sus composición hay ingredientes di-ferentes, por ejemplo derivados de OGMs.Lo que suele ocurrir es que se utiliza a latrazabilidad como una herramienta paraasegurar la segregación e identidad de unproducto.

Para que un programa de trazabilidad sejustifique se necesita de la demanda de unsector dispuesto a pagar un precio mayor alnormal por una determinada característica decalidad.

En el caso de los granos, existen progra-mas para asegurar calidad y origen y recien-temente se le ha acoplado un nuevo atribu-to que es el contenido de OGM. Los nivelesrequeridos varían de acuerdo al destino delproducto. Actualmente éstos, van de menosdel 0.1% al 5% en algunos casos. En funciónde este requerimiento, se arma un progra-ma de trazabilidad y/o segregación que re-querirá de mayores controles cuanto menor

sea el nivel admitido de OGM.Cuanto menor sea el nivel exigido, ma-

yor será el costo del producto. Esto no sóloes por los mayores controles en todo el pro-ceso sino también por la mayor cantidad demercadería que quedará fuera de la toleran-cia y que se descartará del programa.

El primer paso es identificar los puntoscríticos del proceso productivo en los cualesla mercadería pueda sufrir una mezcla acci-dental que pueda incrementar los niveles deOGM por encima del máximo nivel requeri-do.

En granos, los programas de trazabilidadno se diseñan para una sola característica.Además del contenido de OGM, también seanaliza la pureza del tipo de grano, el conte-nido de aflatoxinas, ausencia de materialesextraños y contaminantes, etcétera.

El desarrollo de un programa detrazabilidad implica la participación y ca-pacitación de numerosos agentes; entreellos el productor agropecuario, los trans-portistas, los acopiadores y, por supuesto,todo el personal que ejecuta y audita elprograma.

El primer paso del programa, y el másimportante, es el control y selección de loslotes de semillas. El contenido de OGM enla semilla determinará el mínimo conteni-do del producto final, ya que por lo generallas mezclas accidentales en el proceso ten-derán a elevar el contenido de OGM. Poresto, el contenido de OGM en la semilla debeser holgadamente inferior el máximo niveladmitido al final del proceso. En programasavanzados, la auditoría se inicia dentro delsemillero multiplicador, controlando las líneasparentales que formarán el híbrido.

Controlada la semilla, se reparte entre losdistintos productores que participan del pro-grama, quedando registrada la identidad delos lotes y la superficie sembrada de los mis-mos (algunos programas incluyen los datosde información satelital, GPS, para la ubica-ción y el seguimiento de los lotes).

Una segunda instancia de control es latoma de muestra en precosecha, con elobjetivo de corroborar que se utilizó la se-milla indicada en el lote asignado y que nohubo mezclas con semillas de otras fuentes.También en este momento se toman mues-tras de hojas o granos de lotes linderos para


determinar la presencia o no de materialgenéticamente modificado de la misma es-pecie que pueda mezclarse con el lote delprograma por polinización cruzada.

En caso de que el lote lindero resultepositivo se descartarán del programa lashileras del lote más próximas al lote linde-ro para descartar los granos que pudieranhaber recibido polen del lote GM positivo.

Las cosechadoras y todos los vehículos detransporte de los granos (carros y camiones)deben ser limpiados y controlados de restosde granos de tareas anteriores

En el momento de la cosecha los diferen-tes camiones que ingresan en el acopio conlos granos del programa son controladosantes de la descarga mediante ensayosinmunológicos rápidos (strips reactivos)para detectar a tiempo posibles errores dedestino o identificación.

Una muestra de granos del conjunto decamiones (cada 20 a 30 camiones) se envía allaboratorio para su análisis por PCR para te-ner un análisis más sensible y cuantitativo.

Así se van conformando conjuntos conmaterial identificado de mayor cantidad (si-los, celdas) hasta lograr el volumen requeri-do. Del último continente (celda o bode-ga) se realiza un nuevo ensayo de PCR queconfirma el cumplimiento con el nivel de OGMsolicitado. Sin embargo, no sólo tiene valorel último resultado obtenido de la mercade-ría sino todos los procesos para asegurar ycontrolar la calidad realizados a lo largo delproceso de producción con segregación ytrazabilidad. Por esto, el producto se entre-ga con una carpeta que contiene toda la in-formación generada por el programa detrazabilidad y que valida el último resultadoanalítico obtenido.

Conclusiones

Combinando estratégicamente las distin-tas técnicas para detectar OGM, en progra-mas sencillos o complejos de trazabilidad, esposible producir granos con distintos conte-nidos de OGM, segregados del resto de laproducción de commodities (a granel). Asíes posible abastecer al sector exportador, alos productores de especialidades(speciailties), para quienes es vital que susproductos estén diferenciados e identifica-

dos, o a la industria en general que requierade un producto diferenciado; mientras almismo tiempo se producen commodities deprecio no diferenciado, aprovechando lasventajas económicas y técnicas de labiotecnología. La trazabilidad y segregaciónpor contenido de OGM es sólo una de lasmuchas características que se utilizan paradefinir productos, y más allá del caso de losproductos de la biotecnología moderna enel contexto actual, uno de los desafios de laproducción argentina de granos y alimentosparece ser la de poder segregar e identificarla mayor cantidad de productos dentro desus commodities.

Finalmente hay que mencionar que losmateriales genéticamente modificados queno mantengan una equivalencia sustancialcon los materiales tradicionales, por defini-ción, van a ser segregados e identificadosde acuerdo a la nueva característica de valor(nutricional, por ejemplo) y serán producidosdentro de distintos tipos de programas consegregación positiva y de etiquetado de pro-ducto para asegurar su pureza, calidad y suvalor de uso diferencial.

Lecturas recomendadas

A. C. TOZZINI, M.C. MARTINEZ, M.F. LUCCA, C. V. ROVERE,A. J. DISTEFANO, M. DEL VAS and H. E. HOPP. Semi-quantitative detection of genetically modified grainsbased on 35S promoter amplification. www.ejb.org/content/vol3/issue2/full/6 (2000).

A. HOLST-JENSEN, S. RØNNING, A. LØVSETH and K. G.BERDAL (2003) PCR technology for screening andquantification of genetically modified organisms(GMOs). Anal. Bioanal Chem 375: 985-993.

AGBIOS GM DATABASE: http//64.26.159.139/dbase.php

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