102 BIOTECHNOLOGIE

BIOspektrum | 01.12 | 18. Jahrgang

AHMED SALLAM1, MARTIN KREHENBRINK2, ALEXANDER STEINBÜCHEL1

1INSTITUT FÜR MOLEKULARE MIKROBIOLOGIE UND BIOTECHNOLOGIE,

UNIVERSITÄT MÜNSTER2DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY, UNIVERSITY OF OXFORD, UK

Although the functions and applications of dipeptides have been poorlystudied, compared to proteins or amino acids, their unique propertieshave long been appreciated. A major obstacle to the industrial productionof dipeptides has always been their relatively complicated chemical syn-thesis. However, novel methods for the economical production of specificdipeptides through biotechnological processes have been developedrecently.

10.1007/s12268-012-0148-1© Springer-Verlag 2012

Dipeptide – Aminosäuren der nächsten Generation?ó Als Verbindungen aus zwei Aminosäurensind Dipeptide die einfachsten Peptide. Dipep-tide entstehen unter anderem bei der enzy-matischen Verdauung von Proteinen, z. B. imDarm von Säugetieren. Andere Dipeptide wer-den vom Körper selbst gebildet und erfüllenverschiedene wichtige Funktionen in derErhaltung der Leistungsfähigkeit.

Zahlreiche Studien zeigten, dass die Auf-nahmerate für Aminosäuren in Form vonDipeptiden im menschlichen Darm weit höherist als für freie Aminosäuren. Dabei wurdenspezifische Aufnahmesysteme in den Darme-pithelzellen identifiziert, welche ausschließ-lich alle Di- und Tripeptide, die aus L-Amino-

Peptidsysnthese

Biotechnologische Herstellung vonDipeptiden und deren Anwendungen

¯ Abb. 1: Übersicht über die Dipeptidsynthe-se. A, Grundprinzip der chemischen Synthese.Je nach Prozess müssen reaktive Gruppen(z. B. Amino- oder teilweise auch Carboxylgrup-pen) durch Schutzgruppen (S) vor ungewolltenReaktionen geschützt werden. Diese Schutz-gruppen müssen nach der Reaktion abgespal-ten werden. Vor der Reaktion muss die Carbo-xylgruppe der N-terminalen Aminosäure che-misch aktiviert werden (A), z. B. als Säurean -hydrid oder als Säurechlorid. B, Peptidasereak-tion. Unter normalen Bedingungen läuft dieReaktion in Richtung der Hydrolyse statt.Durch Entfernung der Produkte (Wasser oderDipeptid) kann das Gleichgewicht jedoch inRichtung der Dipeptidbildung verschoben wer-den. Das gebildete Dipeptid ist von der Spezi-fität der Peptidase abhängig. C, Bildung einerPeptidbindung durch Aktivierung der Carboxyl-gruppe als Methylester. Unter Abspaltung vonMethanol kann die Carboxylgruppe enzyma-tisch aminoacyliert werden. Das gebildeteDipeptid ist von der Enzymspezifität abhängig.D, Aminosäure-Ligase-Reaktion. Die Reaktionist irreversibel und findet in vivo statt. Dasgebildete Dipeptid ist von den vorhandenenAminosäuren und der Spezifität der Ligaseabhängig. E, Prinzip der Cyanophycinhydrolyse.Cyanophycin (links) wird durch Cyanophycina-se (CphEal) in Asp-Arg-Dipeptide gespalten. Jenach Zusammensetzung des Cyanophycinskönnen auch weitere Dipeptide (z. B. Asp-Lys,Asp-Orn) gebildet werden.

A

B

C

D

E

103

BIOspektrum | 01.12 | 18. Jahrgang

säuren bestehen, sowie einige verwandte Ver-bindungen, wie z. B. β-Laktam-Antibiotika,transportieren. Di- bzw. Tripeptide werdenerst innerhalb der Darmepithelzellen zu freienAminosäuren hydrolysiert, welche anschlie-ßend in den Blutkreislauf abgegeben und anandere Stellen im Körper abtransportiert wer-den. Eine Hydrolyse von Dipeptiden im Darm-lumen selbst findet nur sehr begrenzt statt.Somit spielen diese Peptidtransporter, die invielen Organen vorkommen, eine entschei-dende Rolle in ernährungsbedingten und phar-makologischen Therapien [1].

Ein Beispiel für ein physiologisch wirksa-mes körpereigenes Dipeptid ist das Carnosin(β-Ala-His), welches in vielen tierischen Gewe-ben als Oxidationsschutz und pH-Regulatorvorkommt und auch in der Sportmedizinangewendet wird. Vor allem in Muskelgewe-be kommt dieses Dipeptid in hohen Konzen-trationen vor.

Andere natürliche Dipeptide wie Ile-Tyr,Lys-Trp, Val-Tyr und Ile-Trp haben eine blut-drucksenkende Wirkung. Eine Anti-Tumor-Wirkung wurde für das synthetische Lys-Glugezeigt, während Leu-Ile eine positive Wir-kung auf Nervenzellen aufweist. Arg-Aspagiert gefäßerweiternd, stimuliert die Sekre-tion von Wachstumshormonen und verbes-sert die Geweberegeneration.

Neben zahlreichen spezifischen physiolo-gischen Funktionen besitzen viele Dipeptideauch vorteilhafte chemische und physikali-sche Eigenschaften. So ist das Dipeptid Ala-Gln wesentlich stabiler gegenüber hohen Tem-peraturen als freies L-Glutamin. Ebenfallskann sich das Löslichkeitsverhalten einesDipeptids (z. B. Ala-Gln: 586 Gramm pro Liter)deutlich von dem der einzelnen Aminosäu-ren unterscheiden (Alanin: 89 Gramm proLiter; Glutamin: 36 Gramm pro Liter) (Weite-re Vorteile und potenzielle Anwendungen fürDipeptide sind in den Übersichtsartikeln [2]und [3] zu finden). Obwohl Dipeptide auf-grund dieser Vorteile als die nächste Genera-tion von Aminosäuren betrachtet werden kön-nen, ist ihre kommerzielle Verfügbarkeit auf-grund fehlender kostengünstiger Herstel-lungsmethoden in der Regel noch begrenzt.

Dipeptidsynthese: Stand der TechnikZur Herstellung von Peptiden gibt es zweigrundsätzliche Synthesewege: zum einen dierein chemische Peptidsynthese, zum ande-ren die Peptidsynthese mithilfe von Enzy-men.

Chemische Peptidsynthese: Die klassi-sche chemische Peptidsynthese wird mithil-

fe spezieller Schutzgruppen durchgeführt(Abb. 1A). Insbesondere bei Aminosäuren mitmehreren funktionellen Gruppen (wie etwaArginin oder Lysin) erfordert dies im Gegen-satz zu einfacheren Aminosäuren wie z. B.Alanin eine relativ komplizierte Chemie. Auflange Sicht erscheinen gerade in diesen Fäl-len biotechnologische Methoden vielverspre-chender. Bei der Synthese von längeren Pep-tidketten werden diese häufig in der Fest-phasensynthese an ein unlösliches Harzgekoppelt. Da die Synthese von Dipeptidenjedoch nur die Bildung einer einzigen Pep-tidbindung erfordert, werden Dipeptide häu-fig auch in Lösung synthetisiert.

Enzymatische Peptidsynthese: Neben derallgemein verbreiteten ribosomalen Peptid-synthese existieren in der Natur noch weite-re enzymatische Mechanismen zur Bildungvon Peptidbindungen. Zu den daran beteilig-ten Enzymen zählen unter anderem Polyglu-tamat-Synthetase, Glutathion-Synthase, Cyano -phycin-Synthetase, D-Alanin-D-Alanin-Liga-se (Ddl), L-Aminosäure-Ligase (Lal) und ver-schiedene nicht-ribosomale Peptidsyntheta-sen. Da diese Enzyme freie Aminosäuren (ste-reo-)spezifisch verknüpfen, kann auf teureSchutzgruppenchemie verzichtet werden [2].

Dipeptidsynthese im GroßmaßstabIn Ermangelung effizienter Methoden zurgenerellen Herstellung von Dipeptiden sindbisher nur wenige Dipeptide industriell rele-vant. L-Asp-L-Phe-OMe [N-(L-α-Aspartyl)-L-phenylalaninmethylester, der Süßstoff Aspar-tam®] sowie L-Ala-L-Gln werden kommerziellin großem Maßstab hergestellt.

Aspartam® ist mit einem Produktionsvolu-men von ca. 38.000 Tonnen [4] ein gutes Bei-spiel für ein im Großmaßstab produziertesDipeptid-Derivat. Kommerziell stehen die che-mische Synthese sowie ein chemo-enzymati-scher Mischprozess zur Verfügung. Die che-mische Synthese geht von einem N-geschütz-ten Anhydrid der Asparaginsäure, wie z. B.N-Formyl-Aspartoanhydrid, und Phe-OMe alsAusgangsstoffen aus. Diese reagieren zu α-Aspartam, wobei anschließend noch dieSchutzgruppe durch Ansäuern abgespaltenwerden muss. Als Nebenprodukt entsteht bit-terschmeckendes β-Asp-Phe-OMe. Bei der che-mo-enzymatischen Synthese wird die Reak-tion der Aminosäuren mithilfe der PeptidaseThermolysin aus Bacillus thermoproteolyticuskatalysiert (Abb. 1B, [5]). Da Thermolysin nurL-Phe-OMe als Substrat erkennt, kann dasRacemat D,L-Phe-OMe als Ausgangsstoff verwendet werden. Probleme bereitet der

Verlust an Enzymaktivität während der Syn -these.

Ala-Gln wird in der Infusionsmedizin alsErsatz für das instabilere Glutamin eingesetzt.In einem rein chemischen Syntheseweg kannAlanin mit Carbonylchlorid (Phosgen-Gas) zuN-Carboxyalanin-Anhydrid umgesetzt wer-den, welches danach mit Glutamin zu Ala-Gln-Carbamat reagiert. Dieses wird danndurch Säurebehandlung zu Ala-Gln umge-setzt. Abschließend müssen jedoch Neben-produkte wie Ala-Ala-Gln oder D-Ala-Glnabgetrennt werden [6]. Zudem existiert einchemo-enzymatisches Verfahren zur Herstel-lung von Ala-Gln aus Ala-OMe und Gln, wel-ches auf einem Enzym aus Empedobacter bre-vis beruht. Das Enzym ist in der Lage, unterAbspaltung von Methanol eine Peptidbindungzu knüpfen (Abb. 1C, [7]). Allerdings trittnach Verbrauch der Reaktanden eine Hydro-lyseaktivität auf.

Zusätzlich wurde ein auf der Aminosäure-Ligase (Lal) basierendes Verfahren entwickelt,bei welchem Ala-Gln mit Escherichia colimittels Fed-Batch-Fermentation auf Mini-malmedium produziert wurde [8]. Generellist Lal zur Bildung verschiedener Dipeptide inder Lage (Abb. 1D), sodass stets eine Opti-mierung der Biosynthese der gewünschtenAminosäuren notwendig ist, um eine hoheAusbeute zu erreichen und die Bildung uner-wünschter Dipeptide zu unterdrücken. Gela-dene Aminosäuren werden jedoch kaum alsSubstrat akzeptiert.

Produktion von Dipeptiden durch dieHydrolyse von CyanophycinEine vor Kurzem beschriebene Strategie zurProduktion von Arg-Asp geht von Cyanophy-cin (CGP) aus, einem Biopolymer, welches inCyanobakterien und anderen Bakterien alsStickstoffspeicherstoff auftritt [9, 10]. CGPkann mittlerweile großtechnisch durch Fer-mentation preiswert produziert werden.Durch Behandlung mit einem CGP-abbauen-den Enzym (Cyanophycinase, CphEal) ausPseudomonas alcaligenes kann das Polymerinnerhalb weniger Stunden in Asp-Arg-Dipep-tide zerlegt werden (Abb. 1E, [11, 12]), welchevon der Reaktionslösung durch Ultrafiltrationabgetrennt werden. Bei einem Reinheitsgradvon mehr als 99 Prozent beträgt der Ertragdieses Verfahrens 91 Prozent (wt/wt). Dadurch die Wahl der Kulturbedingungen bzw.des Produktionsstamms Arginin durch ver-wandte Aminosäuren wie Lysin, Citrullin,Ornithin oder Canavanin ersetzt werden kann,kann dieser Prozess auch zur Herstellung wei-

104 BIOTECHNOLOGIE

BIOspektrum | 01.12 | 18. Jahrgang

terer Dipeptide angewendet werden. Durchdieses Verfahren sind daher auch Dipeptidezugänglich, die aus hoch geladenen oder kom-plexen Aminosäuren bestehen und daher überdas Lal-abhängige Verfahren gar nicht undüber klassische chemische Methoden nurunter hohem technischen Aufwand syntheti-sierbar sind.

AusblickObwohl sich die industrielle Herstellung vonDipeptiden zurzeit noch in den Kinderschu-hen befindet, ist das Interesse an dieser Stoff-klasse aufgrund ihrer besonderen Eigen-schaften bereits jetzt sehr groß. In den letztenJahren sind zudem vielversprechende Ansät-ze entwickelt worden, die eine wirtschaftli-che und zugleich umweltfreundliche Pro-duktion von Dipeptiden in greifbare Nähegerückt haben. Die Auswahl des geeignetenSystems wird hierbei zu einem großen Teildurch die Zusammensetzung des gewünsch-ten Dipeptids bestimmt. Die Entwicklungzuverlässiger Produktionsverfahren wirdgleichzeitig zu einer Erschließung neuerAnwendungsfelder führen. ó

Literatur[1] Daniel H, Spanier B, Kottra G et al. (2006) From bacteriato man: archaic proton-dependent peptide transporters atwork. Physiology 21:93–102[2] Yagasaki M, Hashimoto S (2008) Synthesis and applica-tion of dipeptides; current status and perspectives. ApplMicrobiol Biotechnol 81:13–22[3] Sallam A, Steinbüchel A (2010) Dipeptides in nutritionand therapy: cyanophycin-derived dipeptides as natural alter-natives and their biotechnological production. Appl MicrobiolBiotechnol 87:815–828[4] Sprenger GA (2007) Aromatic amino acids. In: WendischVF (Hrsg) Amino acid biosynthesis-pathways, regulation andmetabolic engineering. 5. Auflage, Microbiology Monographs.Springer, Berlin. 93–128[5] Lombard C, Saulnier J, Wallach JM (2005) Recent trendsin protease-catalyzed peptide synthesis. Protein Peptide Lett12:621–629[6] Fürst P, Pfaender P, Werner F (1985) GlutaminhaltigeAminosäure-Zubereitungen. EP Patent Nr. EP 0087750[7] Yokozeki K, Hara S (2005) A novel and efficient enzyma-tic method for the production of peptides from unprotectedstarting materials. J Biotechnol 115:211–220[8] Tabata K, Hashimoto S (2007) Fermentative production ofL-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineeredEscherichia coli strain expressing L-amino acid α-ligase. ApplEnviron Microbiol 73:6378–6385[9] Sallam A, Steinbüchel A (2008) Anaerobic and aerobicdegradation of cyanophycin by the denitrifying bacteriumPseudomonas alcaligenes strain DIP1 and the role of threeother coisolates in a mixed bacterial consortium. ApplEnviron Microbiol 74:3434–3443[10] Sallam A, Steinbüchel A (2009) Cyanophycin-degradingbacteria in digestive tracts of mammals, birds and fish andconsequences for possible applications of cyanophycin and itsdipeptides in nutrition and therapy. J Appl Microbiol 107:474–484

[11] Sallam A, Kalkandzhiev D, Steinbüchel A (2011)Production optimization of cyanophycinase ChpEal fromPseudomonas alcaligenes DIP1. AMB Express 1:38[12] Sallam A, Kast A, Przybilla S et al. (2009)Biotechnological process for production of β-dipeptides fromcyanophycin at technical scale and its optimization. ApplEnviron Microbiol 75:29–38

Ahmed Sallam, Martin Krehenbrink, AlexanderSteinbüchel (v. l. n. r.)

Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Alexander SteinbüchelWestfälische Wilhelms-Universität MünsterInstitut für Molekulare Mikrobiologie und BiotechnologieCorrensstraße 3D-48149 MünsterTel.: 0251-8339821Fax: 0251-8338388steinbu@uni-muenster.de