1

Biotechnologie a farmaceutický průmysl

Lenka Dzurová

2

http://chemoinfo.ipmc.cnrs.fr/MOLDB/index.html

• snadné uchovávání kmene

• stabilita technologických vlastností v průběhu konzervace

• vysoká rychlost růstu (menší riziko kontaminace)

• možnost kultivace na relativně jednoduchých mediích

• snadná regulace růstu a produkce (nadprodukce)

• minimální tvorba vedlejších produktů (strukturních analogů)

• vysoká koncentrace produktu

• snadná izolace produktu (extracelulární vs. intracelulární)

• minimální nároky na design, a materiál technologického zařízení.

Technologické požadavky

Biotechnologická výroba ve farmacii

3

Ekonomické požadavky

• možnost využití levných a snadno dostupných substrátů

• dostatečně vysoká specifická rychlost tvorby produktu po dlouhou část kultivačního procesu

• vysoká produktivita procesu vztažená na:

- spotřebovaný substrát- dobu kultivace- pracovní objem zařízení - dodanou energii (míchání, aerace, chlazení ap.)

• minimální náklady na izolaci a purifikaci produktu (povaha mikrobní populace, vedlejší produkty ap.)

• celková minimalizace vstupních a provozních nákladů.

Ekologické požadavky

• nepatogenní kmeny (závisí na typu procesu)

• možnost využití netoxických substrátů

• omezení vzniku toxických meziproduktů a vedlejších produktů

• minimalizace aplikace organických rozpouštědel

• minimalizace odpadů (plynných, kapalných, pevných)

• snadná likvidace vzniklých odpadů

• snadná kontrolovatelnost procesu

4

1) Antibiotika

2) Antimykotika

3) Kancerostatika

4) Antivirové látky

5) Imunosupresiva

6) Alkaloidy

7) Vitamíny

8) Vakcíny

9) Steroidy

10) Enzymy

11) Jiné látky (aminokyseliny, cytokininy, polysacharidy,

protilátky, hormony)

1) Antibiotika

sekundární metabolity mikroorganismů tvořené v určitých vývojových fázích z primárních metabolitů (β-laktámová antibiotika, tetracykliny, makrolidy, aminoglykosidy, glykopeptidy, polypeptidová a amfeniklová antibiotika, streptograminy, lipopeptidy, linkosamidy, ansamyciny, kyselina fusidová).

v malých koncentracích potlačuji životní procesy jiných mikroorganismů

producenti antibiotik: mikromycety (plísně) a bakterie (aktinomycety – rod Streptomyces; G+ sporulujicí - Bacillus)

semisyntetická antibiotika: část syntetizována mikroorganismem a část dokončena chemicky

působení antibiotik:

• bakteriostatické (zabraňují množení bakterií)• baktericidní (usmrcují bakterie)

ideální antibiotikum má optimální antimikrobiální účinek s minimální toxicitou na hostitele (vysoká selektivita)

5

1. narušení syntézy buněčné stěny 2. porušení funkce cytoplazmatické membrány3. inhibice syntézy proteinů4. inhibice syntézy nukleových kyselin (inhibice DNA gyrasy, inhibice syntézy mRNA)

5. kompetitivní inhibice (inhibice syntézy kyseliny listové)

Mechanismy účinku

-laktamová antibiotika

• deriváty penicilínov, cefalosporinov, cefamycinov, monobaktamov, karbapenemov, inhibitory β-laktamas

• inhibice syntézy buněčné stěny (baktericidní)

Penicilín• první průmyslově vyráběné antibiotikum (1941)

• Penicillium notatum - kmen izolovaný Flemingem 1928 – 1mg/l

• nový producent (submerzní výroba) – Penicillium chrysogenum – 50mg/l

• přírodní penicilíny G (benzylpenicilín) a V (phenoxymethylpenicilín) nahrazený semisyntetickými

• penicilín G nemůže být podávaný ústně (rozkládaný v žaludku, jen injekce), penicilín V není tak labilní

6

Deriváty penicilínu G

1967

19611960

Penicilín acylasa

• aminohydrolasa (PA, EC 3.5.1.11), štěpí amidovou vazbu v penicilínu

• produkovaná mnoha bakteriemi, kvasinkami a vláknitými houbami

• obecně zdrojem je rekombinantní E. coli• produkce semisyntetických β-laktamů a chirálních sloučenin

7

Výroba penicilínu

1) naočkování suspenze spor P. chrysogenum do nutričně bohatého média2) kultivace 1 týden při teplotě 24°C

3) převedení do inokulačního fermentoru - malé vsádkové fermentory4) aerobní kultivace 1 až 2 dny -> nárůst mycelia

5) naočkování inokula do produkčního fermentoru („fed-batch“) - 7 dní

zdroj C - glukosa, sacharosa, hydrolyzované škroby

zdroj N - kukuřičné výluhy, kvasničný extrakt, (NH4)2SO4

antifoam – oleje (sójový, palmový, triacylglycerol, sádlo, PPG, silikonové prod.)

prekurzor - kyselina fenyloctová/fenoxyoctová (G/V) – dávkování kontinuálně

pH – kontrola do 0,1 jednotky - kyselina sírová/hydroxid nebo amoniak

fermentor - typu air-lift, resp. míchaný turbínový fermentor, objem 100-200m3

produkční kmen se uchovává ve formě lyofilizovaných spor, resp. vegetativního mycelia v ochranném mediu

(např. glycerol) v hluboko mrazících boxech (-70°C)

Růstová křivka výroby penicilínu G

8

1) ochlazení kultivačního media na teplotu 0-4°C (kvůli β-laktamasam)

2) odstranění mikrobiálních buněk pomocí rotační vakuové filtrace

3) snížení pH na hodnoty 3 až 4 (rozklad vedlejších produktů, převedení molekuly na nedisociovanou formu)

4) extrakce penicilinu do organického rozpouštědla (amylacetát, cyklické ketony)

5) odstranění barviv a dalších nečistot na koloně s aktivním uhlím

6) zvýšení pH na 5-7 a následná krystalizace v podobě sodné/draselné soli

7) izolace, promytí a sušení krystalů

8) purifikační kroky zahrnují rekrystalizaci, sterilní filtraci a sterilní

azeotropickou vakuovou destilaci

Izolace penicilinu

Cefalosporiny

• poprvé objevený náhodou v 1948 ve splaškách na Sardinii – cefalosporin C a penicilín N

• Acremonium chrysogenum (původně Cephalosporium)• malá aktivita – produkce derivátů cefalosporinu C (5 generaci)

• Cefalotin (I-generace – 1964 Keflin®) - široké spektrum aktivity

• Cefalosporin C acylasa z Pseudomonas sp.; produkce semisyntetickýchcefalosporinů

Cefamyciny

• Streptomyces sp.• obecně semisyntetické nebo syntetické

• rezistentní na -laktamasy

9

Monobaktamy• produkované Chromobacterium violaceum• aztreonam (Azactam®), aerocyanidine, aerocavin

• působí jen na G- bakterie

Karbapenemy• širokospektrální antibiotika• rezistentní na -laktamasy

• původně odvozena od thienamycinu - Streptomyces cattleya• jsou jedním z druhů antibiotik „poslední záchrany“ u mnoha bakteriálních infekcí

(E. coli, Klebsiella)

Inhibitory -laktamas• kyselina klavulanová (1974/75) - Streptomyces clavuligerus• váže se na serinové zbytky β-laktamáz – suicide inhibitor

• stačí v malém množství• kyselina klavulanová + amoxicilin = Augmentin /+ tikarcilin = Timentin

Tetracykliny

• širokospektrální antibiotika (také v zemědělské a veterinární praxi)

• účinek: vazba na ribozomy a inhibice syntézy proteinů v buňce

chlortetracyklin, 1945 - Streptomyces aureofaciensoxytetracyklin, 1950 - Streptomyces rimosus

tetracyklin - Streptomyces sp.

• rezistenci producentů vůči vlastním produktům lze zvyšovat jejich dlouhodobou kultivací v selekčním tlaku chlortetracyklinu

• dvojmocné kationty (Ca2+, Mg2+, Sr2+) vyvazují antibiotikum z roztoku a tím snižují inhibiční vliv na producenta

• výroba chlortetracyklinu vyžaduje potřebnou dávku Cl- iontů; naopak ostatní halogenidy blokují vazbu chloridového iontu a zvyšuje se podíl vyprodukovaného tetracyklinu na úkor chlortetracyklinu

10

Makrolidy

• Účinek: narušení procesů translace (vazba na P místo v ribozomální 50S podjednotce,

ovlivnění funkce peptidyltransferasy)

• uplatňují se jako náhrada v případě alergie na penicilinová antibiotika

erytromycin - Saccharopolyspora erythraeaspiramycin (toxoplasmosa), 1952 - Streptomyces ambofaciensfidaxomycin - Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenesis

tylosin (veterinární medicina) – Streptomyces fradiaeoleandomycin - Streptomyces antibioticus

midecamycin - Streptomyces mycarofacienskitasamycin - Streptomyces kitasatoensis

josamycin - Streptomyces narbonensis var. josamyceticus var. novacarbomycin - Streptomyces halstedii

Aminoglykosidy

• jedná se o látky tvořené 2 až 4 (amino)sacharidy, resp. (amino)cyklitoly• produkty bakterií Streptomyces (-mycin) nebo Micromonospora (-micin)

• inhibice proteosyntézy

streptomycin, 1943 Waksman - Streptomyces griseusneomycin, 1949 Waksman - Streptomyces fradiekanamycin, 1956 - Streptomyces kanamyceticus

gentamicin, 1963 - Micromonospora purpurea nebo M. echinosporasisomicin - Micromonospora inyonensis

tobramycin - Streptomyces tenebrariushygromycin - Streptomyces hygroscopicus

paromomycin (monomycin) - Streptomyces krestomuceticus

Hyg

11

• léčba rozsáhlých septických infekcí, komplikovaných infekcí v dutině břišní či močovém ústrojí, v léčbě nozokomiálních infekcí dýchacích cest

• mírně zvýšená toxicita pro člověka (nekrosa ledvinových tubulů- nefrotoxicita, závratě, postižení sluchových funkcí- ototoxicita) a značná toxicita pro samotného producenta

• užívají se nitrožilně nebo intramuskulárně

• v průběhu kultivačního procesu vzniká komplex strukturních analogů produktu, což negativně ovlivňuje následný izolační a purifikační proces (např. gentamicinje směsí 3 strukturních analogů a několika dalších minoritních složek)

Gen

Par

Sm

Glykopeptidy

• inhibují syntézu buněčné stěny bakterií

• účinné pouze na G+ (stafylokoky rezistentní k meticilinu, enterokoky)

• vankomycin, 1954 - Amycolatopsis orientalis (ototoxicita, nefrotoxicita)

• teicoplanin, ramoplanin - Actinoplanes teichomyceticus

Polypeptidová antibiotika

• inhibují syntézu buněčné stěny bakterií

• bacitracin, 1945 - Bacillus subtilis var Tracy (nefrotoxicita)

• kolistin, polymyxin B – Bacillus polymyxa• tyrotricin (tyrocidin+gramicidin) – Bacillus brevis

12

Streptograminy

vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) a Enterococcus (VRE)

streptogramin A a B – zvlášť bakteriostatický, spolu baktericidní (Synercid™)

streptogramin A – S. virginiae pristinamycin – Streptomyces pristinaespiralis

Lipopeptidy porušení funkce cytoplazmatické membrány

daptomycin - Streptomyces roseosporus

Linkosamidy

inhibují syntézu bílkovin vazbou na 50S podjednotku ribozomu

linkomycin – Streptomyces lincolnensis, derivát - klindamycin

• chloramfenikol, 1949 - Streptomyces venezuelae, obecně syntetický (toxicita pro kostní

dřeň!)

• širokospektré bakteriostatické antibiotikum

• inhibuje proteosyntézu, váže se na 50S podjednotku ribozomu

• rifampicin (rifampin) - Amycolatopsis rifamycinica• mechanismus účinku spočívá v inhibici RNA-polymerázy

• léčba mykobakteriálních nemoci – tuberkulózy a lepry

Amfenikolová antibiotika

Ansamyciny

Kyselina fusidová• 1960 - Fussidium coccineum, také Mucor ramannianus a Isaria kogana• bakteriostatický, inhibuje syntézu proteinů

13

2) Antimykotikamísta zásahu

• proti kvasinkám, kvasinkovým mikroorganismům a plísním

griseofulvin, 1939 – Penicillium griseofulvum (výroba - P. patulum)

• malá toxicita• narušuje mikrotubuly během buněčného dělení

• akumulace v kůži, vlasech a nehtech – léčba povrchových dermatomykóz• od 50. let systémový fungicid houbových patogenů rostlin

nystatin, 1950 – Streptomyces noursei

• léčba povrchových kandidóz kůže a sliznic, včetně střevní (perorální podání), kandidózy dutiny ústní a vaginální; nevstřebává se

• narušuje plasmatickou membránu (váže se na ergosterol)

amfotericin B, 1955 – Streptomyces nodosus

• hlavně na kvasinky, jen u závažných mykóz, podávání intravenózní• spolu s nystatinem patři mezi polyeny - vysoce účinné, ale také vysoce toxické -

obzvlášť pro ledviny a CNS

14

validamycin - Streptomyces hygroscopicus

• inhibitor trehalasy• pro kontrolu Rhizoctonia solani na rýži a okurcích (vločkovitost)

natamycin (pimaricin) - Streptomyces natalensis, S. gilvosporeus, S. lydicus, S. chattanoogensis a další

• makrolidové antimykotikum

• narušuje plasmatickou membránu (váže se na ergosterol)• nevstřebává se, účinný už v malých dávkách (<10 ppm)

• aplikace lokální (krém, kapky – zánět rohovky)• v potravinářství: protiplísňový konzervant sýrů a uzenin, aplikace sprejem nebo

prášek na celé, dělené nebo měkké sýry, případně na voskový obal některých sýrů - E 235

• látky a léky zastavující růst nádorů

• výroba vyžaduje uzavřené technologie (úplné oddělení výrobního procesu

od vnějšího prostředí)

• hlavní důvody:

– vysoká toxicita produktů - limitující prvek procesu

– velmi nízké koncentrace produktu ve značně komplexních

mediích (komplikovaná izolace a purifikace)

– požadavek dokonalé ochrany personálu a vnějšího prostředí (typy používaných producentů, vysoká biologická aktivita produktů, vysoká toxicita

intermediátů a odpadů)

– menší rozměry experimentálních a produkčních zařízení

3) Kancerostatika

15

Antracykliny - protinádorová antibiotika, inhibují topoizomerasu II daunarubicin, 1950s - Streptomyces peucetius var. caesius - léčba leukemii,

neuroblastomu; mnoho derivátů

Aktinomyciny – polypeptidová protinádorová atb, inhibují transkripci

daktinomycin (aktinomycin D), 1940 – Streptomyces sp. – trofoblastická nemoc, Erwingův sarkom, zásněť hroznová

Bleomyciny – indukují degradaci DNA řetězce bleomycin A2, 1966 - Streptomyces verticillus – léčba rakoviny varlat,

vaječníku, děložního hrdla, Hodgkinův lymfom pingyangmycin (bleomycin A5), 1969 – Streptomyces verticillus var

pingyangensis n.sp. – léčba rakoviny prsou, jater, menší poškození plic

• Gliotoxin – Aspergillus fumigatus, také Penicillium, Trichoderma - inhibuje multiplikaci RNA virů, rovněž účinný jako imunosupresivum (zabraňuje imunitním buňkám množit se, transplantace orgánů nebo kostní dřeně)

4) Antivirové látky

• Chaetomin - Chaetomium cochliodes - inhibuje multiplikaci RNA virů

• Funikulosin - Penicillium funiculosum - inhibuje DNA a RNA viry

• Boromycin – Streptomyces antibioticus - makrolidové antibiotikum – inhibuje

replikaci klinických izolátu HIV-1, také in vitro

16

5) Imunosupresiva• Cyklosporin, 1976 – Tolypocladium inflatum (syn.T. niveum),

Trichoderma polysporum a Cylindrocarpon lucidum

– selektivně inhibuje dělení lymfocytů (hlavně T)– při transplantacích kostní dřeně, jater a slinivky– působí efektivně i proti revmatické artritidě

• Sirolimus (rapamycin), 1972 – Streptomyces hygroscopicus

– redukuje produkci interleukinu-2 (inhibice aktivace B- a T-buněk)– snižuje riziko odmítnutí transplantovaných orgánů (hlavně ledvin)– jako povlak srdečních stentů

• Tacrolimus, 1987 – Streptomyces tsukubaensis

– redukuje produkci interleukinu-2– při transplantacích orgánů – léčba nemoci spojených s T-buňkami (např. atopický ekzém, vitiligo)

6) Alkaloidy

• produkty fytopatogenní houby rodu Claviceps známé už ve starověku

• houba tvoří mycelium v semeníku lipnicovitých rostlin –

sklerocium

• 1875- první chemicky čistá sloučenina ergotinin

• 1918- izolován klinicky využitelný ergotamin

• v polovině minulého století: základy průmyslové produkce námelových alkaloidů

• využívají se v gynekologii, porodnictví a interním lékařství, působí na nervová

zakončení a hladké svaly krevních cév - zastavují krvácení

• Ergotismus: těžká otrava zapříčiňují silné křeče, zvracení, bolesti hlavy, pomatenost a dokonce i smrt

17

• 4 strukturální skupiny: klavinové alkaloidy, lysergové kyseliny,

jednoduché amidy lysergové kyseliny, peptidy lysergové kyseliny

• Producenti: Claviceps purpurea - tmavě fialová sklerocia (peptidové deriváty)

Claviceps fusiformis – C. paspali - šedá sférická sklerocia (jednoduché amidy

kyseliny lysergové a klaviny)

• Produkce alkaloidů: polní (průmyslová), saprofytická (bez hostitele) v povrchovém respektive submersním uspořádání či umělá (syntéza)

Průmyslová produkce

Polní produkce:

• Infekce obilí suspenzí spor v době uvolnění klasu z posledního listu (jehlami

infikuji obilky žita)

• V průběhu 4 týdnů- vegetativní část životního cyklu houby

• Vznik námelových zrn a jejích uvolňovaní z klasů- sklizeň

• výtěžek cca 200 kg námele/ha

• Nevýhody: vliv podnebí a počasí na výrobní proces

18

Reaktorové technologie:

• produkce alkaloidů v odlišném fyziologickém stavu mikroorganismu

• navození stavu: změnou zastoupení jednotlivých nutrientů nebo výrazným zvýšením osmotického tlaku media (vhodná hodnota - cca 300g/l sacharosy, nebo ⅔ sacharosy nahradit např. chloridem sodným)

• kultivační proces trvá 2 až 3 týdny

• produkční kmeny snadno ztrácí schopnost hyperprodukce alkaloidů, jsou citlivé k mechanickému stresu a celkovému designu fermentorů

• Kultivace Claviceps: minerální médium obsahující glukosu, amonné ionty (nebo močovinu, glutamát, aspartát, dusičnany- zřídka), anorganické soli, biotin za zvýšené tenze CO2 a při pH 5 – 6

• růst při teplotě blízké 30°C, produkce alkaloidů v rozmezí teplot 21 – 24°C

Saprofytická produkce

Izolace

• Alkaloidy- intracelulární produkty, peptidové alkaloidy rozpustné v organických

rozpouštědlech, paspalová kyselina rozpustná ve vodě

• Sklerocium/ mycelium se dá do alkalického vodného roztoku, následně extrakce

organickým rozpouštědlem

• Extrakce a zahuštění ve vakuové odparce pro další přečištění

• Precipitace z metanolového roztoku

• Transformace paspalovékyseliny na lysergovou v prostředí hydroxidu amonného

za zvýšené teploty

19

7) Vitaminy

Výroba

• chemická syntéza

• izolace z přírodního materiálu• mikrobiální biosyntéza

• biotransformaceVitamíny vyráběné biotechnologicky

riboflavin (B2)kobalamin (B12)

kyselina L-askorbová (C)β-karoten (provitamin A)

ergosterol (provitamin D2)

Exogenní esenciální biokatalyzátory heterotrofních organismů, látky nezbytné

v malých množstvích, které si organismus není schopen sám syntetizovat a musí

je přijímat s potravou.

20

• chemická struktura v 1934; teplotně stabilní; částečně odolný vůči oxidaci

• v živých organismech je převážně ve formě FMN a FAD (60 až 90 %)

Riboflavin (vitamín B2, vitamín G, ovoflavín, laktoflavín)

• průmyslové kmeny - askomycety Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyi a Candidaflareri

• kultivační media: zdroj C - glukosa, sacharosa, maltosa, rostlinné oleje zdroj N -peptony, kukuřičný výluh, kvasničný extrakt; glycin - stimulátor produkce (stimulace syntézy GTP); biotin, inositol, thiamin - stimulátory růstu

• aerobní kultivační proces (teplota 26-29°C, cca 120 hodin) – 10-15g/l

• pokles pH z 6,5 na 4,5, tvorba mycelia, ojediněle vznikají sporangia

• rychlá spotřeba C-zdroje, tvorba spor, počátek flavigeneze

• vzrůst pH, maximální produkce riboflavinu

• lyze populace, tvorba dalšího riboflavinu – objevují se krystalky B2

Riboflavin

21

Izolace

Pro farmaceutické účely: • pH kultivačního media 4,5 a ohřev na 121 °C, 1 hodinu pro rozpuštění riboflavinu

• centrifugace (oddělení nerozpustného podílu)• redukce riboflavinu TiCl3 za vzniku nerozpustné formy

• filtrace sraženiny a následná reoxidace vzduchem• rozpuštění v 10% HCl, 60°C, neutralizace, krystalizace

• Extrakce zbytkového riboflavinu z mycelia vodní parou; z media extrakce do butanolu (po převedení na redukovanou formu).

• také se pro produkci používá genetický modifikovaný Bacillus subtilis – roste rychleji a má

vyšší produktivitu

• nebo pomocí mutantu B. subtilis a B. pumilus je možná produkce D-ribosy – výchozí surovina

chemické syntézy riboflavinu (semisyntetická výroba)

22

Kobalamin (vitamín B12)

• molekula poměrně složitá - komplexní vazba centrálního atomu Co se 4 atomy N pyrrolových jader = porfyrinový skelet

• rozpustný ve vodě

• jedině bakterie a archea obsahují enzymy nutné pro biosyntézu

• 1948 - poprvé izolován z živočišných tkání;

• 1954 - chemická struktura

• produkce přirozenou střevní mikroflórou u člověka,

• živočišné produkty: vejce, mléko, sýry, maso a vnitřnosti

• důležitý především pro správnou funkci krvetvorby, podílí se na syntéze DNA a ATP, nezbytný pro správnou funkci nervového systému

• léčba zhoubné chudokrevnosti, součást preparátu pro léčbu onemocnění jater, střev a slinivky břišní, také při otravě kyanidy

• Průmysloví producenti:

Pseudomonas denitrificans (aerobní systémy)

Propionibacterium shermanii a P. freudenrechii (GRAS) (anaerobní systémy)

fúzí protoplastů získaný kmen Rhodopseudomonas protamicus (jednostupňový aerobní proces

bez přídavku prekurzoru)

• kultivace v submersních dokonale míchaných fermentorech

• výhodným zdrojem C je melasa (obsahuje betain - stimulátor metabolické dráze 5-aminolevulové kyseliny)

• nutné vyhnout se zpětné inhibici produktem, proto proces je rozdělený na 2 stupně:

- anaerobní (80h, 30°C, pH 7, přetlak N2, mírné míchání) -> kobinamid

- aerobní, + 5,6-dimethylbenzimidazol (klíčový intermediát) -> kobalamin (cyanokobalamin)

23

• metylkobalamin aktivnější forma než levnější kyanokobalamin

• všechny formy B12 špatně asimilovány z trávicí soustavy - injekce nebo podjazykové tablety

• roční světová produkce přes 35 tun (2008)

• Izolace z media:

24

• 1912 – objev, 1933 - izolace z citronu a struktura

• roční světová produkce přes 50 000 tun (2002)

• bílá krystalická látka, dobře rozpustná ve vodě, E300

• redukční účinky, antioxidant

• tvorba žlučových kyselin a v metabolismu pojivových tkání hydroxyluje lysin a prolin v kolagenu, podporuje začleňování síranů do mukopolysacharidů, zapojuje se do syntézy karnitinu, derivátu lysinu a metioninu, a ovlivňuje -oxidaci mastných kyselin, zvyšuje aktivitu mikrosomálních enzymů

• Váže reaktivní formy O2- snižuje rozvoj aterosklerózy a zhoršeného prokrvení tkání, omezuje peroxidaci lipidů a profylaktický působí před cigaretovými oxidanty; podílí se na menší přilnavosti krevních destiček a bílých krvinek na endotelu stěny cév, podporuje proces hojení

Kyselina L-askorbová (vitamín C)

• biotransformace D-sorbitolu na L-sorbosu pomocí Acetobacter suboxydans nebo A. xylinum (D-sorbitol se připravuje chemickou redukcí D-glukosy na Raneyově

niklu)

• medium obsahuje glukosu, kvasničný extrakt /kukuřičný výluh, mírný přebytek

CaCO3, a asi 200g/l D-sorbitolu• 30°C, silná aerace -> 1-2 dny 90-95% konverze

• izolace L-sorbosy z media pomocí filtrace, zahuštění, purifikace na ionexech, krystalizace (asi 65%); výtěžek bývá 180g/l, čistota 99% -> chemická konverze

na kyselinu L-askorbovou

25

• 2. fermentační krok produkuje jiný intermediát – 2-keto-L-gulonovou kyselinu (KGA) pomoci bakterie Ketogulonicigenium vulgare (a Bacillus megaterium)

• vysoký výtěžek KGA (výnos 97%)

• metoda má nižší náklady, nepoužívá toxické rozpouštědla a produkuje méně odpadu

• chemická přeměna KGA na kys. L-askorbovou nebo: Zymomonas mobilis, E. coli, Fusarium oxysporum(hydrolasy, laktonasy)

• přímá konverze glukosy na kyselinu L-askorbovou je možná z využitím řasy Chlorella pyrenoidosa ATCC 53170 – ve fermentoru, limitovaný zdroj uhlíku –výtěžek 1,45 g/l kyseliny L-askorbové

• S. cerevisiae a Z. bailii akumuluji k. askorbovou při inkubaci z L-galaktosou

• Euglena gracilis produkuje současně β-karoten, vitamin C a vitamin E

-karoten (provitamín A)

• významný karotenoid, u mnoha organismů slouží jako žlutočervené barvivo, u živočichů jako antioxidant a prekurzor vitaminu A (spolu s -karotenem a

lykopenem)• nedostatek: zvyšuje se riziko rakoviny a klesá celková obranyschopnost organismu

• významnou roli hraje při ochraně kůže proti poškození nadměrným sluněním• v potravinářství E160a

26

• karoteny produkuje velké množství mikroorganismů,

• Průmyslově se uplatnily zvláště: Phycomyces blakesleanus, Blakeslea trispora a také jednobuněčná řasa Dunaliella salina

• houby se vyskytují ve dvou sexuálních formách, pro dosažení vysoké nadprodukce β-karotenu je nezbytná oddělená příprava inokula obou těchto forem, které se na počátku produkčního procesu smíchají

• jiná možnost - inokulace pouze „minus“ formou za současného přídavku trisporových kyselin (sekundární metabolity těchto hub), syntéza je dále stimulována přídavkem látek obsahujících β-ionový kruh

• medium – vysoká koncentrace živin a vysoká viskozita (lihové výpalky, škrob, rostlinné oleje ap.), antioxidant (zabraňuje rozkladu β-karotenu)

• kultivace 7 - 8 dnů, výtěžek 2,5 - 3,0g/l

• halofilní biotechnologie - produkce β-karotenu pomoci jednobuněčné řasy Dunaliella salina (extrémní halofil) – fotoautotrofní

• teplota 20-40º, pH 9.0

27

Izolace

• Houby produkují β-karoten jako intracelulární produkt.

• Izolace pro potravinářské a

farmaceutické účely zahrnuje:

- permeabilizace buněk (hydrolýza, dehydratace)

- extrakce lipidického podílu; saponifikace

- extrakce (petroléter, hexan ap.) - purifikace

- krystalizace

8) VakcínyOčkovací látky: atenuované (živé) neboinaktivované s nezměněnou schopnostíindukovat tvorbu protilátek, můžou býtcelobuněčné obsahující kapsulárníantigen nebo antigen z buněčné stěnynebo toxoid.

Toxoid – bakteriální toxin(obvykle exotoxin), jehož toxicita bylasnížena nebo odstraněna chemicky(formaldehydem) nebo tepelně, přičemžimunogenicita zůstává zachována

- vyvolává imunitní reakci na původnítoxin nebo posiluje reakci najiný antigen.

Adjuvans - látka, která zesilujeimunitní reakci na podaný antigen(Al(OH)3, AlK(SO₄)₂,Ca3(PO4)2, oleje)

28

Tetanus - křeče a ztráta koordinace svalových pohybů (toxiny produkované bakteriemi blokují uvolňování svalového stahu). Bez lékařské pomoci (antibiotika, sérum) končí zpravidla smrtí- zástava srdce nebo kolaps dýchacího systému (křeč mezižeberních a dalších svalů znemožní dýchání).

Spory bakterie Clostridium tetani (extrémně tvrdé, odolné teplu a většině antiseptik) rozšířeny v hnojené půdě. Profylaxe ve formě tetanické toxoidní vakcíny (toxoid neurotoxinu tetanospasminu).

produkce anaerobní fermentaci

29

9) Steroidy

prednisolon – léčba zánětlivých a autoimunitních onemocnění (astma, revmatoidní

artritida, ulcerózní kolitida, Crohnova nemoc aj.)

11 α-Hydroxyprogesterone – antiandrogen (léčba onemocnění spojených z androgeny

např. akné, Seboroická dermatitida), také léčba lupénky

hydrokortizon - kortikosteroidní hormon s protizánětlivými účinky

androstadienedione - prekurzor steroidových hormonů

• prekurzory biotransformace jsou relativně levné, nerozpustné ve vodě,

jen v rozpouštědlech (methanol, ethanol, aceton)

• využívájí se mikromycety (Rhizopus, Curvularia, Fusarium, Aspergillus) a

mykobakterie – suspenze nebo imobilizované rostoucí buňky, klidové

buňky, spory a extrakty bez buněk

• izolace – extrakce rozpouštědly nemísitelnými s vodou (např. chloroform)

• rozpouštědla nebo substráty bývají toxické, proto se přidává pouze

2-5 g/l – konverze 100%

30

10) Enzymy

• kolagenasa – Clostridium histolyticum • proteasa, která hydrolyzuje peptidové vazby v kolagenu• podporuje hojení• léčba Dupuytrenove kontraktury a Peyronieove nemoci

• urát-oxidasa – Aspergillus flavus• katalyzuje oxidaci kyseliny močové na 5-hydroxyisourát• léčba „neléčitelné“ dny (forma z PEG - PEGylated)• rasburikasa – rekombinantní urát-oxidasa (S. cerevisiae), metabolizuje kyselinu

močovou na allantoin – používaná v léčbě dny, rhabdomyolýzy se selháním ledvin a hyperurikemie (během chemoterapie)

• ureasa – Lactobacillus fermentum• katalyzuje hydrolýzu močoviny na NH3 a CO2

• odstraňování močoviny z krve při selhání ledvin

• laktasa – Kluyveromyces fragilis, K. lactis, Aspergillus niger, A. oryzae• katalyzují štěpení laktosy na jednoduché sacharidy D-glukózu a D-galaktózu• léčba intolerance laktosy• potravinové doplňky určené pro doplnění laktasy během konzumace mléčných

výrobků obsahujících laktosu (Lacteeze, Lactaid®)

• cholesterol esterasa – Pseudomonas fluorescens • katalizuje přeměnu mezi sterylem a sterolem• sledování hladiny cholesterolu v séru

• kreatininasa – Pseudomonas putida, rekombinantní E.coli• katalyzuje přeměnu kreatininu na kreatin• stanovení koncentrace kreatininu v séru

• diastasa (amylasa) – Aspergillus oryzae• katalyzuje štěpení škrobu na maltosu• normalizace trávení

31

Jiné látky

kyselina glukonová - Gluconobacter oxydans, Aspergillus niger, Penicilliumchrysogenum, Saccharomycopsis sp., Aerobasidium pullulans

• biosyntéza zahrnuje přímou oxidaci glukosy

• submersní aerobní kultivace, 30°C, pH 6,5 a 5,5 (růst a produkce) • léčba hypokalcemie a popálení HF (glukonát vápenatý, injekce), malárie

(glukonát chinonový, injekce do svalu), potravinové doplňky, kastrace psu (zinečnatá sůl)

• E574 - okyselující látka, antioxidant zvyšující účinnost dalších antioxidantů (v sirupech, ve vínu - zabraňuje vzniku zákalů), jako kypřící látka (ve směsích na

výrobu sladkých těst)• čisticí prostředky

kyselina arachidonová – Mortierella alpina• je důležitou složkou fosfolipidů u živočichů a prekursorem biosyntézy biologicky

důležitých sloučenin, tzv. eikosanoidů (prostaglandiny atd.)• přítomnost v potravě má pozitivní vliv na zdraví dětí

• submersní aerobní kultivace, výtěžek 5,8 g/l• SSF na rýžových otrubách – 122,2 mg PUFA (54,5 mg ARA)/g substrátu

Pythium oligandrum (Chytrá houba) - druh mykoparazitické řasovky, která napadá mnoho druhů hub včetně příbuzných řasovek

• netoxická pro člověka• přípravky vhodné pro potlačování mykózy kůže nohou, snižování potivosti a

odstraňování pachových symptomů• nemocí nemykotického původu (bércové vředy, atopický ekzém, lupénka)

• kosmetické přípravky vhodné pro lidi s poševní mykózou či paradontózou