Bioproduction of antifungal and antimicrobial peptides and their applications in biocontrol

Pascal DHULSTER

1

Charles VIOLLETTE InstituteLaboratory research in agri‐food and biotechnology

ICV EA 7394  USC INRA 1411 AFP  

USC ANSES

FR CNRS no 3417

2

french chemist (1823 – 1898)

3

Nature de l’UnitéFR CNRS no 

3417

Estrées Mons

4

« Charles VIOLLETTE Institute »FR CNRS no 

3417

2 Associated International Laboratories

CRIBLAGE, CARACTERISATION ET PRODUCTION DE METABOLITES D’ORIGINE MICROBIENNE

5

ContextProBioGEM‐ Lille MiPI‐ Gembloux

Collaboration from 2003

Production of lipopeptides by microorganisms

Improvement of strains by genetic engineering

Development of production and separation and 

purification processes

Mechanisms of action

Applications biopesticides

Discovery of new molecules

▪ start‐up Lipofabrik

Biocontrol

6

ContextICV  

TEAM ProBioGEMand QSA

INAF TEAMS: Laurent Bazinet and Ismail Fliss

Collaboration 10 years ago

Production of antimicrobial peptides and peptide fractions

Lactic acid bacteriabacteriocins

Development of production and 

purification processes

Mechanisms of actionMicrobiote Interactions

Animals HealthPackaging

Inert surfacesEmployees

Hydrolysis of proteins

Volet Qualité‐santé‐innocuitéProcesses for the production ofActive fractions

7

Surfactant production in bubblelessdesigned bioreactors

8

• Peptidic sequenceL-Leu- D-Leu- L-Asp-L-Val- D-Leu- L-Leu- L-Glu

• Acide gras : C13 to C17• bacterial strain

BBG21, BBG131

• Peptidic sequenceL-Glu- L-Orn- D-Tyr- D-alloThr- L-Glu- D-Ala- L-Pro- L-Gln- L-Tyr- L-Ile

• Acide gras : C14 to C18• bacterial strain

BBG21

Surfactins FengycinsIturins(mycosubtilin)

• Peptidic sequenceL-Asn- D-Tyr- D-Asn-L-Gln- L-Pro- D-Ser- L-Asn

• Fatty acids: C14 to C17• bacterial strain

BBG101

Lipopeptides produced by Bacillus subtilis

9

• Lipopeptides properties

surfactants:Surfactins, iturins, fengycins

antifungal activity:Fengycins, iturinsPotential biopesticides

eliciting activity (plant resistance induction)Surfactins

• Bacterial strainB. subtilis , model strain BBG21 (surfactin and fengycin producing strain)aerobic metabolismproduces up to around 1g/L of lipopeptidic biosurfactants

Background

10

Ongena and Jacques, Trends microbiol, March 2008

11

Role of mycosubtilin in the protection of tomatoes against Pythium aphanidermatum

A B C

(Leclère et al.,2005, appl. environ. microbiol., 71, 4577-4584)

12

lettuce/ Bremia lactucae

Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4

13

Laitue/ Bremia lactucae

0

10

20

30

40

50

60

70

Témoin Mycosubtiline

nom

bre

de s

alad

es

classe 4classe 3classe 2classe 1 classe 0

Mycosubtilin reduces the severity of the disease

14

lettuce/ Bremia lactucae

0102030405060708090

100

Témoin DMSO (0,1%) surf 50 mg/L myco 50 mg/L myco+surf 50/50 mg/LPour

cent

age

de la

itues

infe

ctée

s (%

)

Traitements

Pourcentage de laitues infestées par B. lactucae

a

ab

bb

ab

The surfactin / mycosubtline mixture has a synergistic effect on the protection of lettuce

15

Raisin/Botrytis cynerea

Traitement avec un mélange surfactine/fengycine

Preventive treatment with a surfactin / fengycin mixture reduces the percentage of contaminated berries

16

Production issue

• The production of bacterial surfactants requires an important supply of oxygen• Aeration and conjugate agitation generate foam

T 6h: Agitation + aeration + surfactant= foamT 0h: inoculation T 12h: Loss of culture

17

Production issue• The production of bacterial surfactants requires an important supply of oxygen• Aeration and conjugate agitation generate foam

• Consequences: Uncontrolled losses of cells and substrateDifficulty controlling fermentationImpossibility of coupling a purification step

T 6h: Agitation + Aeration + Surfactant= FoamT 0h: Inoculation T 12h: Loos of culture

18

Production Issue

Foam

Foam

Technologicalbottleneck

19

Control by anti‐foam?Chemical  anti‐foam agent

makes difficult biosurfactant purification (BS)can alter biological properties of biosurfactantsconsumption increases with amount of BS produced

Mechanical anti‐foam system: not efficient enough

Solutionsto monitor foam formation and to use foam as an extraction process• Overflowing exponential fed bioreactor

to change air sparging aeration to bubbleless aeration• Three phase inverse fluidized bed bioreactor• Membrane contactor aerated bioreactor• Rotating disk bioreactor

Foam formation control

20

• Schéma du bioréacteur O‐EFBC

Feed vessel

Air Inlet

TemperaturepH, pO2 , Feed rate Control

Pump 2 Cooling device 1

Cooling device 2

Pump 1

Pump 3

Base Acid

Balance

Air Outlet

UPPER LEVEL

Cooling agent

fout

Foam collector

Foam

fin

• Capacité moussante = volume de mousse stabilisée/volume d’air injecté

• CM de l’iturin A: 0,99 (Razafindralambo et al., 1998)

• CM de la surfactin: 0,98 (Razafindralambo et al., 1996)

Foam formation control

21

A specific productivity of 1.1 mg mycosubtiline of biomass. g‐1h‐1 is obtained for an average growth rate of 0.071 h‐1

The estimation of the quantity of biomass produced over time allows to calculate the evolution of μ and therefore a mean μ

The analyses of the quantities of mycosubtiline produced over time allow to calculate the specific productivity in mycosubtiline qP

Foam formation control

Problem for the scale up.Difficulty of coupling to separation techniques (foam stability)

22

Objectives

To reach at least the same growth level and the same lipopeptide concentration than in a conventional air sparged bioreactor (foamingbioreactor)

Foam formation control

to change air sparging aeration to bubbleless aeration:

Three phase inverse fluidized bed bioreactorMembrane contactor aerated bioreactorRotating disk bioreactor

23

• Three phase inverse fluidized bed bioreactor (TPIFBB)(Fahim et al., 2013)

culture volume: 2.5L

down‐flow circulation of the culture medium

partial foam control by a falling film in the upperpart of the bioreator

increase of gas hold‐up in the culture medium

aeration‐ with air sparging (periodic feed)‐ with falling film: gaz‐film interfacial transfer

Limited air-sparging aeration

24

• TPIFBB’s performancesOxygen transfer coefficient (Kla):  between 0.006 s‐1 and 0.06 s‐1

Lipopeptide production in batch culture with B. subtilis BBG21

surfactins = 1232 mg L‐1 fengycins= 50 mg L‐1

Modelisation of oxygen transfer coefficient: correlation to gas and liquidvelocities and surface tension

Limited air-sparging aeration

To conclude

Well aerated bioreactorThe complexicity of design limits up‐scaling

25

Bioreactor withexternal aerationmodule

Bioreactor withimersed aerationmodule

O2 O2 O2

AirCulture

Oxygen transfer through the porous hollow fiber membrane 

Air‐liquid contactor aerated bioreactor(Coutte et al. , 2010; Coutte et al. 2013)

Choice of the membrane

Aeration without mixing air-culture medium

Applications :‐ Blood oxygenation (Tsugi et al., 1981, Khoshbinet al., 2005)‐ Waste water treatment (Brindle et al., 1996; Pankhania et al., 1999)‐ Animal cell cultures (Schneider et al., 1995)

26

1 All the values presented are means value of duplicates (standards deviations were essentially within 1‐12%). After two washings with water at 30°C and two washings with NaOH pH 10.0 at 50°C.

Lipopeptides Foaming Bioreactor

Externalmodule 

bioreactor

Immersedmembranebioreactor

Surfactin production analysisAmount of surfactin produced in the broth (mg)

Amount of surfactin produced in the foam (mg)

Amount of surfactin desorbed from the hollowfiber after washing* (mg)Total amount of surfactin produced (mg)

Fengycin production analysisAmount of fengycin produced in the broth (mg)

Amount of fengycin produced in the foam (mg)

Amount of fengycin desorbed from the hollowfiber after washing* (mg)Total amount of fengycin produced (mg)

60

714

‐

774

‐

45

‐

45

168

‐

604

772

35

‐

112

147

319

‐

150

469

982

‐

0

982

Lipopeptide production results

27

Influence of oxygen transfer on lipopeptide production

Oxygen transfer coefficient (Kla) in flasks and lipopeptide production

KLa = 6,67x10‐6N1,16VL‐0,83d00,38d1,92 (Fahim et al., Bioresource Technol., 2012)

High KLaMedium KLaLow KLa

28

Oxygen transfer coefficient (Kla) (h-1)

Foaming Bioreactor

External module bioreactor

Immersed membrane bioreactor

Initial KlaKla during the fermentation aKla after fermentation Kla after washing* 

27.29 (SD : 0.17)23.70 (SD : 9.83)

--

39.36 (SD : 0.09)22.21 (SD : 4.5)4.07 (SD : 0.01)15.47 (SD : 0.09)

28.24 (SD : 0.15)13.19 (SD : 3.48)1.75 (SD : 0.06)4.46 (SD : 0.51)

a Values are mean data from two experiments with dynamic measurement of KLa. SD: Standard deviation* After one washing with water at 30°C

Oxygen transfer evolution during culture

Aeration membrane fouling

Evolution of oxygen transfer coefficient a

External module bioreactor

Immersed bioreactor

Initial Kla (h‐1)Kla after surfactin adsorption (h‐1)

39.36 (SD : 0.09)25.53 (SD : 0.07)

28.24 (SD : 0.15)2.57 (SD : 0.02)

a Values are mean data from three experiments with dynamic measurement of KLa. SD: Standard deviation.

Influence of surfactin on oxygen transfer

Origin of membrane foulingSurfactin adsorption for immersed membrane bioreactorBiofilm formation for external module

29

Results

Equivalent production of lipopeptides with the conventional air sparged bioreactor

Good stability of the performances. Easy up‐scaling because of membrane modularity. 

Objectives

A model will be developped to describe oxygen transfer through the membrane for the bioreactor with an external aeration module (A. Berth’s ) using dimensionalanalysis. This model should help for up‐scaling.

Aeration without mixing air-culture medium

30

Production

Extraction

Concentration

PurificationPurity (surfactine): 95%

Diafiltration

Fermentation and downstream processing coupled for lipopeptide production and purification

patented by the University of Lille 1 Sciences et Technologies

(Coutte et al., 2013)

Bioreactor integration

31

• Rotating disc bioreactor (Chtioui et al., 2012)

Biomass‐ biofilm on the disks (< 1mm thickness)‐ plantonic biomass

surface oxygen transfer(repetitive biofilm emersion, medium mixing, no bubble)

Stainless steeldisks as biofilm substrate

Disk surface bacterial colonization

Aeration without mixing air-culture medium

32

0

200

400

600

800

1000

7 disques sans agitateurs 14 disques sans agitateurs

Conc

entra

tion

(mg

L-1 )

Surfactine

Fengycine

KLa = 0,0011 s‐1

KLa = 0,0019 s‐1

Adhered cells= 0,5 g 

Adhered cells = 0,8 g 

Aeration without mixing air-culture medium

fg/sf 4.4                  3.8

•Proportional increase of oxygen transfer rate and biomass and lipopeptide production with the disk number

• Limitation of disk rotation speed because of foam production

Influence of disk number on oxygen transfer rate

7 disks 14 disks

33

Results

Highly heterogenous bioreactor with very low aeration of the culture medium but a highly aerated biofilm

Easy to run, quite low energy consumption, easy up‐scaling

Aeration without mixing air-culture medium

34

Acknowledgements

Thanks to my colleagues of ProBioGEM Team at Institut Charles Viollette

Financial support :

Philippe JacquesDidier LecouturierFrédérique GancelKrasimir DimitrovPeggy VauchelFrançois CoutteIordan NikovJean‐Sébastien Guez Alice RochexValérie Leclère

35

Production of antimicrobial peptides by hydrolysis of  bovine 

hemoglobin

36

Protein sources: Blood (cruor, hemoglobin),Milk (Caseins and Alpha‐lactalbumin), Alfalfa (RuBisCO)

Fish coproducts

Food Coproducts

Digestive Enzymes (Pepsin and Chymotrypsin)

Peptidic hydrolysates

KineticModeling

Déterminant MinimalRelation structure/function

mechanism of action

Identification and characterization of peptides

Bioactives peptides research

peptide mappings Processdesign and control

Valorisation of peptides

Obtaining and characterization of active peptides from agro‐food co‐products

37

major source of pollution is a real problem on ecological and environmental

co‐product

source of peptides with biological activities 

antibacterial agents

antistress

antihypertensiveantioxidant opioid

analgesic

60% 40%

Thèse de LUDIVINE SIONThèse de Rémi PRZYBYLSKI

Large amount of proteins(albumin, fibrinogen…)

Pharmaceutical interest!

38

Waste of meat industries:30000 T/year in France

Bovine Hémoglobin Porcine Pepsin

Hydrolysis

Peptide hydrolysates

39

Since 1980 in Lille

Chaîne alpha

Chaîne bêta

Hème

T0 (t=0min)

DHc = 0%

T1 (t=15min)

DHc = 7,8%

T2 (t=30min)

DHc = 9,9%

T3 (t=1h)

DHc = 11,9%

T4 (t=2h)

DHc = 13,9%

T5 (t=4h30)

DHc = 14,2%

T6 (t=10h)

DHc = 14,9%

Chaîne alpha

Chaîne bêta

Hème

T0 (t=0min)

DHc = 0%

T1 (t=2,5min)

DHc = 3,2%

T2 (t=5min)

DHc = 4%

T3 (t=30min)

DHc = 7%

T4 (t=1h)

DHc = 8,5%

T5 (t=2h)

DHc = 11,4%

T6 (t=3h)

DHc = 13,9%

5 40

Thèse d’Estelle ADJE

Estelle Yaba Adje,  Rafik Balti , Mostafa kouach, Didier Guillochon and Naïma Nedjar‐Arroume (2013), Probiotics Antimicrob. Prot. 5: 176–186.

41

Hémoglobine bovine Pepsine porcine

55 Peptides antibactériens

1‐32 33‐98 107‐141

5 Familles Peptidiques5 Familles Peptidiques

Chaîne Chaîne Chaîne Chaîne

114‐145

1‐30

Cartographies peptidiques

Naïma Nedjar-Arroume, Véronique Dubois-Delval, Estelle Yaba Adje, Jonathan Traisnel, François Krier, Patrice Mary, Mostafa Kouach,Gilbert Briand, and Didier Guillochon (2008), Peptides, 29 : 969-977.

Thèse de Véronique DUBOIS

42

Groupe 1 Groupe 2

Hélice αGrand nombre d’AA

Random coilPetit nombre d’AA

CMI = 80 M CMI = 5 M

55 Peptides antibactériens55 Peptides

antibactériens

Cartographies peptidiques

Cartographies peptidiques

Naïma Nedjar-Arroume, Véronique Dubois-Delval, Estelle Yaba Adje, Jonathan Traisnel, François Krier, Patrice Mary, Mostafa Kouach,Gilbert Briand, and Didier Guillochon (2008), Peptides, 29 : 969-977.

Thèse de Véronique DUBOIS

43

Objectifs Compétences Bilan/projets Perspectives

107VTLASHLPSDFTPAVHASLDKFLANVSTVLTSKYR141

137TSKYR141

1 38SKYR141

139KYR141

140YR141

133TVLTSKYR141

Déterminant peptidique antimicrobien minimal KYR

CMI:80 M

CMI: 8 M

CMI: 6 MCMI: 4 M

CMI: 1 M

Pas d’activité

Déterminant peptidique antimicrobien minimal RYH

140LAHRYH145

143RYH145

114ARNFGKFFTPVLQADFQKVVAGVANALAHRYH145

121FTPVLQADFQKVVAGVANALAHRYH145

CMI:85 M

CMI: 80 M

CMI: 71 M

CMI: 18 M

CMI: 1 M

126QADFQKVVAGVANALAHRYH145

antibacterial peptidic sequence minimal

Lucie Catiau, Johnatan Traisnel, Véronique Delval-Dubois, Nour-Eddine Chihib, Didier Guillochon, and Naïma Nedjar-Arroume(2011), Peptides 32 : 633–638.

Lucie Catiau, Johnatan Traisnel, Nour-Eddine Chihib, Guillaume Le Flem, Annick Blanpain, Oleg Melnyk, Didier Guillochon, andNaïma Nedjar-Arroume (2011), Peptides 32: 1463–1468.

44

The target peptide: the neokyotorphin

• α‐chain of bovine hemoglobin1VLSAADKGNV10KAAWGKVGGH20AAEYGAEALE30RMFLSFPTTK40TYEPHFDLSH50GSAQVKGHGA60KVAAALTKAV70EHLDDLPGAL80SELSDLHAHK90LRVDPVNFKL100LSHSLLVVTLA110SHLPSDFTPA120VHASLDKFLA130NVSTVLTSKY140R

Final peptide653 DapI = 10.5

BioactivitiesAnalgesic

ANTIMICROBIAL

Micrococcus luteusStaphylococcus aureusSalmonella enteritidis

Escherichia coliListeria innocua

45

…

The challenge of the hydrolysate fractionationHemoglobin subunitsare rapidly digested… 

…to give intermediate peptideswith high molecular weights…

…then to give more and more final peptides (low MW) !

…

Target peptide:

Neokyotorphin

The challenge of the hydrolysate fractionation

46

Pilote d’ÉDUF

‐ +

MUF10 kDa

MEC MEA

10 g.L‐118 L.h‐1

2 g.L‐118 L.h‐1

20 g.L‐112 L.h‐1

20 g.L‐112 L.h‐1

+-Él

ectrolytes

Électrolytes

Récupérationcationique Hydrolysat

Thesis of Rémi PRZYBYLSKI

Developed a selective method of obtaining of the antimicrobial peptide α137-141 from the co-product of slaughterhouses by using the electrodialysis coupled with an ultrafiltration membrane (EDUF)

α137-141+

47

Study the effect of hydrolysis degree on the peptides migration during the EDUF treatment

Selection of the most appropriate hydrolysis degree for the selective separation of neokyotorphin

Improve the neokyotorphin purity by pH‐controlduring the EDUF treatment

Neokyotorphin fractionation strategy: overview

48

Conclusions about EDUF

The EDUF is a suitable method to fractionate the bovine hemoglobin hydrolysates and to separate selectively the NKT.

The most appropriate hydrolysis degree is 5% to separate the neokyotorphin.The enrichment factor in NKT was superior than 13‐fold comparedto the initial hydrolysate.

Selecting a pH of 9.0 increased the NKT purity about 75‐foldcompared to the initial hydrolysate.

49

Du co‐produit à sa valorisation

Peptides enzyme production

Séparation of bioactive peptides from hydrolysat

valorization of enriched fractions

Valorisation of bioactive peptidesCoproducts from industrial waste

Peptides as antibacterial and antioxidant agents in meatThe rejection becomes an added value

Identifications et caractérisations

Thèse de Rémi PRZYBYLSKIR. Przybylski, L. Firdaous, G. Châtaigné, P. Dhulster, N. Nedjar (2016)Food Chemistry 211 (2016) 306–313

50

Fraction d’ÉDUF : potentiel conservateur ?

0

2

4

6

8

0 2 4 7 9 11 14

Col

onie

s tot

ales

(log

UFC

/g)

Durée de conservation (jours)

0

2

4

6

8

0 2 4 7 9 11 14

Bac

étie

s col

iform

es (l

og U

FC/g

)

Durée de conservation (jours)

COLONIES TOTALES

COLIFORMES

Thèse de Rémi PRZYBYLSKI

R. Przybylski, L. Firdaous, G. Châtaigné, P. Dhulster, N. Nedjar (2016) Food Chemistry 211 (2016) 306–313

51

Acknowledgements

Thanks to my colleagues of ProBioGEM Team at Institut Charles Viollette

Naïma NEDJARLoubna FIRDAOUSRozenn RAVALLECBenoit CUDENNECChristophe FLAHAUTFrançois KRIERKrasimir DimitrovPeggy Vauchel

Véronique DUBOISEstelle ADJEKarima HEDHILIRémi PRZYBYLSKI poster

Titre du poster 17: Électroséparation d’un peptide antimicrobien à partir d’un co‐produitdes abattoirs et son application comme potentiel conservateur de la viande.

… Special thanks to Jean‐François Goossens and Mostafa Kouach(C.U.M.A. – EA 4481) for technical assistance in mass spectrometry… 

52

THANK YOU FOR YOUR ATTENTION

Pascal DHULSTER

53