Comité Editor

Presidente: Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D. Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet. Rubén Pulido F., M.V., Mg.Sc., Ph.D. Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D.

Asistente Editorial: Claudia Cárdenas A., Ing. Agr.

ISSN 0301-732xISSN 0717-6201

Archivos de Medicina VeterinariaVOL. 43, Nº 1, 2011

Universidad Austral de ChileFacultad de Ciencias Veterinarias

Casilla 567 - Valdivia, Chile

Comité Editor Asesor

Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, ChileCarmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canada

Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC, Dr. habil. - University of London, UKOscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canada

Raúl Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, España Claudia Muñoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA

Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepción, Chile Sergio Recabarren, Lic. Biología, M.Sc. - Universidad de Concepción, Chile

Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USAPedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile

Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USAGerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

VOLUMEN 43, Nº 1, 2011

CONTENIDO

EDITORIAL ....................................................................................................................................................................... V

REVISIONES BIBLIOGRáFICAS

Uso de concentrados autólogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crónicas del aparato musculoesquelético equino.JU Carmona, C López, CE Giraldo ...................................................................................................................................... 1

Atresia folicular en peces teleósteos: una revisión.I Valdebenito, L Paiva, M Berland ........................................................................................................................................ 11

ARTÍCULOS ORIGINALES

Evaluación de la respuesta clínico-patológica e inmune humoral en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente con el virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV).LF Vega, B Valladares, S Martínez-Castañeda, U Alonso, R Enríquez, R Montes de Oca, C Ortega .................................. 27

Análisis de las concentraciones de azufre en agua, alimento y gas sulfúrico ruminal de rebaños bovinos de carne de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile.M Gómez, B González, D Pinochet, P Aburto ...................................................................................................................... 35

Comparación de métodos basados en los requerimientos nutricionales y disponibilidad de biomasa para estimar la capacidad de carga para venado cola blanca.FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Bárcena, F Clemente ............................................................................................... 41

Evaluación a través de tomografía computarizada del efecto de una infusión endovenosa de ketamina en el desarrollo de atelectasia inducida por anestesia general en perros.CA Henríquez, LM Mieres, HA Bustamante, DE Herzberg, CE Campillo, MP Cabrera, MA Gómez ............................... 51

Utilización de fascia lata alogénica para la herniorrafia perineal canina: comunicación de 7 casos clínicos.GG Semiglia, DF Izquierdo, JH Zunino ............................................................................................................................... 59

COMUNICACIONES

Suplementación de vacas en periodo de transición con propionato-propilen glicol o minerales traza orgánicos: implicancias para la eficiencia reproductiva y la lactancia.OA Peralta, D Monardes, M Duchens, L Moraga, RL Nebel ............................................................................................... 65

Eficacia de un desinfectante sobre Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. y Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV), patógenos de salmón del Atlántico (Salmo salar) cultivado en Chile. M Muller, P Ilardi, R Avendaño-Herrera .............................................................................................................................. 73

Insectos asociados a fecas de pollo en una avícola de Chile Central.J Retamales, F Vivallo, J Robeson ........................................................................................................................................ 79

Uso de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo enteritidis: prevención de la colonización intestinal y reproductiva.C Borie, C Hauva, J Quiroga, V Bravo, ML Sánchez, MA Morales, P Retamal, J Retamales, J Robeson .......................... 85

Carcinoma folicular de tiroides en perros. Reporte de casos.AB De Nardi, CR Daleck, MCV Silva, JC Canola, LGGG Dias, SG Calazans, SC Fernandes, D Eurides, LAF Silva, RR Huppes ............................................................................................................................................................................ 91

Evaluación del método del tubo para concentrar plaquetas caninas: estudio celular.RF Silva, CMF Rezende, FO Paes-Leme, JU Carmona ....................................................................................................... 95

VOLUME 43, Nº 1, 2011

CONTENTS

EDITORIAL ....................................................................................................................................................................... V

REVIEW ARTICLES

Use of autologous platelet concentrates as regenerative therapy for chronic diseases of the equine musculoskeletal system.JU Carmona, C López, CE Giraldo ...................................................................................................................................... 1

Follicular atresia in teleost fish: a review.I Valdebenito, L Paiva, M Berland ........................................................................................................................................ 11

ORIGINAL ARTICLES

Evaluation of the clinical - pathological and humoral immune response in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected experimentally with the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).LF Vega, B Valladares, S Martínez-Castañeda, U Alonso, R Enríquez, R Montes de Oca, C Ortega .................................. 27

Determination of sulphur contents in water, forage and ruminal hydrogen sulphide concentrations in beef cattle herds from La Araucanía, Los Ríos and Los Lagos regions of Chile.M Gómez, B González, D Pinochet, P Aburto ...................................................................................................................... 35

Comparison of methods based on the nutritional requirements and availability of biomass to estimate carrying capacity for white tailed deer.FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Bárcena, F Clemente ............................................................................................... 41

Evaluation of an endovenous ketamine infusion through computed tomography on the development of pulmonary atelectasis due to general anesthesia in dogs.CA Henríquez, LM Mieres, HA Bustamante, DE Herzberg, CE Campillo, MP Cabrera, MA Gómez ............................... 51

Use of allogenic fascia lata in perineal herniorrhaphy in dogs: communication of 7 clinical cases.GG Semiglia, DF Izquierdo, JH Zunino ............................................................................................................................... 59

COMMUNICATIONS

Supplementing transition cows with calcium propionate-propylene glycol drenching or organic trace minerals: implications on reproductive and lactation performances.OA Peralta, D Monardes, M Duchens, L Moraga, RL Nebel ............................................................................................... 65

Efficacy of a commercial disinfectant against Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp and Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) pathogens of Atlantic salmon (Salmo salar) farmed in Chile.M Muller, P Ilardi, R Avendaño-Herrera .............................................................................................................................. 73

Insects associated with chicken manure in a breeder poultry farm of Central Chile.J Retamales, F Vivallo, J Robeson ........................................................................................................................................ 79

Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization.C Borie, C Hauva, J Quiroga, V Bravo, ML Sánchez, MA Morales, P Retamal, J Retamales, J Robeson .......................... 85

Follicular thyroid carcinoma in dogs. Report of cases.AB De Nardi, CR Daleck, MCV Silva, JC Canola, LGGG Dias, SG Calazans, SC Fernandes, D Eurides, LAF Silva, RR Huppes ............................................................................................................................................................................ 91

Evaluation of the tube method for concentrating canine platelets: cellular study.RF Silva, CMF Rezende, FO Paes-Leme, JU Carmona ....................................................................................................... 95

Arch Med Vet 43, V (2011)

Editorial

En marzo de 2011 se pone fin al período de marcha blanca en la implementación de la plataforma electrónica eQuipu, como parte de una red de revistas ISI chilenas. El objetivo de dicha plataforma es apoyar el trabajo de los editores y mejorar la calidad de las revistas científicas chilenas mediante el fortalecimiento de una red de editores profesionales, la adopción de los más altos estándares de la industria editorial y la consolidación de una plataforma común de envío de trabajos, y que permite una marcada modernización de todo el proceso editorial, y en el caso de los autores realizar un seguimiento on-line del estado en que se encuentran sus trabajos. Durante los últimos meses el Comité Editor ha realizado los ajustes necesarios para la adecuada implementación de este nuevo sistema, tales como la capacitación de sus integrantes en el manejo del software, y la adquisición de una moderna red computacional para el trabajo del Comité Editorial. Pensamos que esto agilizará y dará mayor dinamismo al proceso, no sólo de envío sino también al sistema de arbitraje, todo lo cual debería redundar en una mayor calidad y agilidad del proceso editorial, acortando los tiempos entre recepción y aceptación de un artículo. Paralelamente a lo anterior, se pretende a la brevedad que los artículos aceptados en Archivos de Medicina Veterinaria, al igual que en otras revistas científicas, se encuentren disponibles (en su versión pdf) en la página web de la revista (www.veterinaria.uach.cl) con antelación a la publicación de la revista impresa. De este modo se logrará acceder a las publicaciones en forma temprana, permitiendo citarlas si es pertinente. Finalmente, hemos decidido aceptar solamente artículos de Revisión en inglés a partir de enero del presente año. Todo esto es un esfuerzo por contribuir a mantener el sostenido aumento del Índice de Impacto que hemos logrado en los últimos años.

1

Arch Med Vet 43, 1-10 (2011)

REVISIÓN BIBLIOGRáFICA

Aceptado: 24.03.2010.

∗ Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; carmona@ucaldas.edu.co

Uso de concentrados autólogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crónicas del aparato musculoesquelético equino

Use of autologous platelet concentrates as regenerative therapy for chronic diseases of the equine musculoskeletal system

JU Carmona∗, C López, CE Giraldo

Grupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia

SUMMARY

Platelets are of pivotal importance for wound healing since they release growth factors that in turns produce chemotaxis, both cellular proliferation and differentiation, angiogenesis, and extracellular matrix deposition. The use of autologous platelet concentrates (APCs) has been proposed for accelerating wound healing, decreasing inflammation, to stimulate the regenerative capability of the injured tissues, to decrease the fibroblastic activity and to avoid the production of non functional scarring tissue. APCs could be obtained by several methods. Each method produces APCs of different both cellular and molecular quality. Recently, some basic and clinical information that justifies the usage of APCs for the treatment of degenerative musculoskeletal diseases in horses, such as osteoarthritis, tendinopathies and desmopathies has been published.

Palabras clave: equino, enfermedades musculoesqueléticas, plasma rico en plaquetas, factores de crecimiento.Key words: equine, musculoskeletal diseases, platelet rich plasma, growth factors.

INTRODUCCIÓN

La cicatrización de heridas está dirigida por una suce-sión de complejos mecanismos celulares y moleculares. Muchas células están involucradas en este proceso. Estas producen y son sensibles a una infinidad de moléculas (por ejemplo: citocinas, factores de crecimiento (GFs) y eicosanoides, entre otros) que permiten, en condiciones fisiológicas, la reparación o incluso la regeneración de los tejidos lesionados (Theoret 2005). Las plaquetas (PLTs) desempeñan un papel primordial en la cicatrización de las heridas, ya que estos fragmentos citoplásmicos además de poseer propiedades hemostáticas (Hartwig e Italiano 2003) también poseen propiedades proinflamatorias, reguladoras (Mannaioni y col 1997) y acciones regenerativas, las cuales están mediadas por la interacción con células (neutrófilos y células endoteliales) y por la liberación de GFs, quimio-cinas y otras moléculas (Anitua y col 2004).

Se ha propuesto el uso de concentrados autólogos de plaquetas (APCs) en seres humanos para estimular la cicatrización de heridas en cirugía oral y maxilofacial (Marx y col 1998, Anitua 1999, Carlson y Roach 2002), en cirugía plástica (Powell y col 2001, Bhanot y Alex 2002)

y ortopédica (Lowery y col 1999, Sánchez y col 2003). En medicina equina los APCs han sido empleados para el tratamiento de heridas en las extremidades (Carter y col 2003) y enfermedades musculoesqueléticas crónicas (Carmona y col, 2009a, b, Waselau y col 2008, Abellanet 2009). Los objetivos de esta revisión son describir la razones biológicas (fisiológicas), experimentales y clínicas que sustentan el uso de APCs en caballos con enfermedades crónicas del aparato musculoesquelético, tales como la osteoartritis, tendinopatias y desmopatías.

GÉNESIS, FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE LAS PLAQUETAS

Los megacariocitos (MKs) son los precursores de las PLTs. Estas células se desarrollan a partir de células progenitoras mieloides multipotenciales CD34+ que re-siden en el tejido hemopoyético y el torrente sanguíneo. Los MKs representan aproximadamente el 0,1-0,5% de las células nucleadas de la médula ósea. Estas células se encuentran en la región más profunda de los sinuosidades capilares de la médula ósea y emiten prolongaciones citoplasmáticas (proplaquetas) que están en contacto con la sangre. Estas prolongaciones son seccionadas y las PLTs son liberadas al torrente sanguíneo (Hartwig e Italiano 2003). Las plaquetas equinas son fragmentos citoplasmáticos discoides de 5-7 µm de largo y 1-3 µm de ancho (Leven 2000, Paes-Leme y col 2006); aunque es frecuente observar PLTs grandes (>20 mµ) en el torrente sanguíneo (Argüelles y col 2006).

2

JU CARMONA Y COL

MEMBRANA DE LAS PLAQUETAS Y SUS RECEPTORES

La membrana de las plaquetas se compone de tres capas: glicocalix, capa fosfolipídica y submembranosa (Tablin 2000). El glicocalix es la capa exterior que contiene receptores glicoproteicos implicados en la activación y adhesión de las PLTs. Estas glicoproteínas constituyen los antígenos de membrana de las PLTs, que se dividen en tres familias: integrinas, proteínas ricas en leucina y selectinas. Una bicapa fosfolipídica asimétrica con pro-piedades anticoagulantes constituye la capa central. La estructura de esta capa es idéntica a la de otras células con dominios de proteínas periféricas y transmembranales que actúan como receptores de membrana (Tablin 2000). La capa submembranosa contiene los microtúbulos de actina y actúa como el esqueleto que da la forma discal a la plaqueta en reposo. Esta capa interviene activamente en los procesos de señalización plaquetaria (Spencer y Becker 1997).

Las integrinas producen agregación y adhesión plaque-taria (Gentry 2000, Tablin 2000, Pelagalli y col 2003). Las integrinas están constituidas por dos subunidades, α y β, las cuales no están ligadas covalentemente. Las integrinas están conectadas de forma interna con el citoplasma de las PLTs por una sola cola y externamente con el medio por varias subunidades con dominios extracelulares. En la parte interior las integrinas están asociadas con las proteínas de señalización (proteínas G, tirosina-quinasas) y fosfoinositoles.

La P-selectina es la principal molécula de adhesión de las PLTs y MKs. Esta glicoproteína está presente en la superficie de los gránulos α que interactúan con fi-brinógeno, factor von Willebrand (vWF), fibronectina y vitronectina (Mannaioni y col 1997, Gentry 2000, Pelagalli y col 2003). La externalización de la integrina P-selectina está relacionada con la activación de las PLTs equinas (Segura y col 2006).

CITOPLASMA Y GRáNULOS DE LAS PLAQUETAS

La red citoplásmica de las PLTs está constituida por dos tipos de actina (globular y filamentosa). La actina filamentosa actúa como soporte estructural para diferentes gránulos plaquetarios y mitocondrias. La respuesta pla-quetaria se produce por una actividad contráctil mediada por la polimerización del complejo actina-miosina. Los microtúbulos citoplasmáticos mantienen la forma dis-coide de las PLTs y dirigen los movimientos generados por actina-miosina (Gentry 2000, Hartwig e Italiano 2003). Las PLTs de los mamíferos contienen tres tipos de gránulos: lisosomales, densos y alfa (α) (Mannaioni y col 1997, Pelagalli y col 2002). Los gránulos lisosomales contienen hidrolasas ácidas, guanina, fosfolipasas y quina-sas, que actúan como enzimas proteolíticas e hidrolíticas (Tablin 2000). Los gránulos densos almacenan ATP, ADP, calcio, fósforo y serotonina (figura 1A). El ADP induce la

migración plaquetaria y en combinación con la serotonina produce la contracción de las arterias lesionadas. El ATP antagoniza la acción del ADP (Pelagalli y col 2002). Los gránulos α contienen varias moléculas (citocinas, quimio-cinas, GFs, entre otras), algunas específicas para las PLTs (por ejemplo: factor plaquetario 4 y β-tromboglobulina) y otras que no son específicas para ellas, tales como la albúmina, condroitín 4-sulfato, fibrinógeno, fibronec-tina, trombospondina, factor V, factor Va y factor von Willebrand (Mannaioni y col 1997, Anitua y col 2004). Estas proteínas son importantes para todas las funciones plaquetarias, tales como la formación y crecimiento de trombos, modulación inflamatoria y la síntesis de matriz extracelular (ECM) durante la cicatrización de heridas (Gentry 2000). Los gránulos α almacenan principalmente siete GFs directamente implicados en la cicatrización de las heridas, entre ellos: factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), TGF-β2, factor de crecimiento epidér-mico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-I) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Anitua y col 2005, Weibrich y col 2005). El cuadro 1 muestra un resumen que describe las principales características y la acción biológica de estas proteínas durante la cicatrización de heridas.

RESPUESTA PLAQUETARIA

Cuando se produce lesión tisular, se dispara una fuerte interacción celular. Se producen respuestas plaquetarias independientes, tales como el cambio de forma, trans-formación interna, secreción de gránulos (figura 1B) (Paes-Leme y col 2006), formación del tapón hemostático

Figura 1. Micrografías obtenidas mediante microscopía electró-nica de transmisión (MET) de una plaqueta equina normal (A) y de una plaqueta equina activada. MP: membrana plasmática. G: glicógeno. α: gránulos alfa. P: pseudópodo. MT: mitocondria. T: microtúbulos. La barra representa 1 µm (Cortesía de la Pfra. Fabiola Paes Leme). Micrographies obtained by transmission electron micros-copy (TEM) of a normal equine platelet (A) and an activated equine platelet (B). MP: plasmatic membrane. G: glycogen. α: alpha granules. P: pseudopodium. MT: mitocondria. T microtubules. The bar represents 1 µm (Courtesy by Pfr. Fabiola Paes Leme).

3

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELÉTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

Cuadro 1. Algunos factores de crecimiento y quimiocinas contenidas en los gránulos α de las plaquetas Some growth factors and chemokines contained in platelet α-granules

Factor de crecimiento/Quimiocinas y sus formas biológicas y receptores

Efectos biológicos durante la cicatrización de las heridas Referencias

Factor de crecimiento derivado de las pla-quetas (PDGF). PDGF-AA, -BB, -AB, -CC y -DD. Dos receptores (PDGFRs): α y β

Este es un quimiotáctico e inductor de proliferación celular. Estimula la angiogénesis y promueve la expresión de las metaloproteínas de matriz (MMP)-1 y su inhibidor tisular (TIMP-1) en la última fase de la remodelación. Los productos de la proliferación de fibroblastos, migración epitelial, vascularización extensiva y la infiltración de neutrófilos.

Nimmi 1997, Reigstad y col 2005, Theoret 2005

Factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). TGF-β1, -β2, -β3. Cinco recep-tores (TβRs). TβRI y TβRII son los más importantes

Regula la expresión de colágenos y fibronectina. Restringe la degradación de la matriz extracelular (ECM). Disminuye la expresión de las MMPs, promueve la síntesis de TIMPs y del factor de crecimiento de fibroblastos y la producción de angiogenésis. TGF-β3 tiene efectos antifibróticos. Interacción con TβRI produce proliferación celular y con TβRII síntesis de ECM.

Braun y col 2002, Todorovic y col 2005, Huang y Huang 2005

Factor de crecimiento epidérmico (EGF). Un receptor EGF (EGFR)

Induce la proliferación celular, diferenciación y motilidad. Es altamente expresado en el margen de las heridas, promueve la reepitelización. EGF induce la expresión de MMP-1 y regula el cambio de colágeno tipo I.

Nimmi 1997, Calvin 1998

Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). VEGF-B, -C, -D y dos proteínas VEGF. Dos receptores: VEGFR-1 y R-2

Promueve la vascularización de los tejidos lesio-nados y facilita el arribo de células inflamatorias y reparadoras. Tiene efectos sobre la proliferación de células del endotelio vascular.

Nimmi 1997, Ferrara 2001, Braun y col 2002, Theoret 2005

Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). FGF-1, -2, -4, -7, -9, -10 y -19.

FGF-1 (FGF básico) es una potente proteína an-giogénica y controla los depósitos de ECM, puesto que inhibe la síntesis del colágeno tipo I.

Nimmi 1997, Braun y col 2002, Theoret 2005

Factor de crecimiento insulínico (IGF). IGF-I y IGF II. Dos receptores: IGF-I-R y - II-R

IGF es un péptido anabólico. Produce proliferación celular y depósito de ECM.

Harr idge 2003 , Fr i sb ie y col 2000

Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Proteína de unión HGF (HGF-BP)

Este péptido tiene efectos angiogénicos, puesto que incrementa la expresión de VEGF.

Catlow 2003, Anitua y col 2005

Factor plaquetario 4 (PF-4). Condroitin sulfato (receptor)

Produce quimiotaxis de leucocitos y la adhesión de neutrófilos a las células endoteliales. Es un péptido antiangiogénico, puesto que interactúa directamente con FGF o VEGF mediante el bloqueo de sus re-ceptores de superficie celular. Inhibe la apoptosis de monocitos e induce la diferenciación de estas células a macrófagos.

Mannaioni y col 1997, Boehlen y Clemetson 2001

Betatromboglobulina (β-TG). Tres péptidos relacionados

Estas quimiocinas producen quimiotaxis de neu-trófilos y degranulación plaquetaria. En el último estado de inflamación, β-TGs desensibilizan la degranulación de neutrófilos y actúan como pro-teínas antiinflamatorias.

Mannaioni y col 1997, Boehlen y Clemetson 2001

primario y retracción del coágulo (Gentry 2000, Tablin 2000). Moléculas de la superficie plaquetaria, como las integrinas, regulan la capacidad de comunicación inter-celular durante la formación del tapón hemostático, la respuesta inflamatoria y los procesos de reparación de tejidos (Mannaioni y col 1997). La expresión cinética es

diferente para cada tipo de gránulo plaquetario. Primero, los gránulos α liberan sus contenidos como consecuencia de estímulos de baja intensidad. Luego, los gránulos densos son activados y, finalmente, los gránulos lisoso-males liberan sus productos proteolíticos (Gentry 2000, Pelagalli y col 2002). Esta cadena de eventos se conoce

4

JU CARMONA Y COL

como “reacción de liberación plaquetaria” (Pelagalli y col 2003). Las plaquetas equinas son especialmente sensibles al ADP, colágeno y factor activador de plaquetas (Pelagalli 2003). Las plaquetas y sus proteínas secretadas, principalmente GFs y quimiocinas, disparan el inicio del proceso inflamatorio y secuencialmente coordinan el incremento o la disminución del efecto de muchas células y moléculas implicadas en la cicatrización de las heridas (cuadro 2). Estos procesos aún no son bien comprendidos.

Marx (2004) señaló que la clave del efecto regene-rativo de los APCs (acuñado por él como plasma rico en plaquetas –PRP–) está asociada con el uso de “plaquetas

vivas”. En ese sentido, las plaquetas deberían ser mani-puladas con delicadeza durante la extracción venosa y subsecuentemente durante la preparación e inyección del APC. La inyección de una dosis superior a lo normal de “plaquetas vivas” en tejidos lesionados podría dar lugar a una respuesta similar a la inducida por estos fragmentos citoplasmáticos cuando ocurre una lesión tisular. Aunque Marx (2004) declaró que el número de PLTs concentradas en un PRP debería ser mayor que 1 millón de fragmentos citoplasmáticos por µL, los autores de esta revisión y otros como Anitua y col (2004) han observado que concentra-ciones hasta de 300.000 PLTs por µL pueden inducir un efecto terapéutico similar.

Cuadro 2. Patobiología de la cicatrización de heridas: células, citocinas, factores de crecimiento y otras moléculas implicadas en este proceso. Pathobiology of wound healing: cells, cytokines, growth factors and other molecules implicated in this process.

Fases de la cicatrización de heridas*

Principales características y células implicadas

Factores de crecimiento implicados y otras moléculas

Inflamatoria Diseñada para proteger el cuerpo contra la pérdida excesiva de sangre y la invasión de sustancias extrañas. Células implicadas: plaquetas, células endoteliales, neutrófilos y monocitos.

Factores de coagulación, fibrina, fibronectina, trombospondina, bradiquinina, C3a/C5a, hista-mina, leucotrienos, P-selectina, IL-1β, TNF-α, PDGF, TGF-α, TGF-β, EGF, IGF, VEGF, HGF, PF-4, β-TG.

Proliferativa (fibroplasia)

Comienza la formación de tejido de granulación ne-cesario para la migración celular y la deposición de colágeno. Células implicadas: macrófagos, fibroblastos y queratinocitos.

EGF, TGF-α, TGF-β, FGF-1, HB-EGF, PDGF, IL-6, VEGF, IL-4, C5a, colágeno tipo I y III fragmentos y fibronectina.

Angiogenésis Este proceso se superpone con fibroplasia. Es necesario para transportar el oxígeno y nutrientes al tejido de granulación. Comienza con la ruptura de la membrana basal por la acción de colagenasas y plasminógeno activador secretado por las células endoteliales. Células implicadas: las células endoteliales y pericitos.

FGF, TNF-α, IL-8, ácido láctico, aminas bio-génicas, TGF-β, VEGF y PDGF

Epitelización Es la fase más lenta del proceso de cicatrización de heridas. Comienza 1 a 2 días después de producidas las heridas y hay una reconstitución de las células de la epidermis y otros epitelios. Se produce una migración de los queratinocitos desde el borde del corte de la epidermis y a través del defecto, posiblemente gracias a la disolución temporal de desmosomas y hemidesmo-somas. La migración se produce gracias a la formación de pseudópodos.

EGF, factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF), TGF-β

Contracción La contracción de la herida determina la velocidad de cicatrización por segunda intención. El día 7 después de producida la herida, los defectos de la piel se redu-cen gracias al movimiento centrípeto de la piel intacta circundante.

Fibronectina y receptores de integrina β1, PDGF y interferón gamma (IFN-γ)

Depósito y remodelación de matriz

La fase de maduración se caracteriza por la disminución del número de fibroblastos y alcanzar el equilibrio entre la producción de colágeno y su lisis. El equilibrio entre la síntesis de colágeno y la degradación durante la fase de remodelación depende de la presencia simultánea de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y sus inhibidores naturales específicos de tejidos (TIMPs).

MMPs

* Esta es una clasificación arbitraria. De hecho, cada fase del proceso de cicatrización se ha superpuesto. Il-1β: Interleucina 1 beta. TNF-α: Factor de Necrosis Tumoral alfa. C: Complemento. Otras abreviaturas, tal como en el cuadro 1.

5

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELÉTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA PREPARACIÓN DE CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE PLAQUETAS

Whitman y col (1997) introdujeron el uso de APCs (gel autólogo de plaquetas) en cirugía maxilofacial humana para aumentar el piso de los senos maxilares como un sustitutivo del pegamento de fibrina autóloga (Matras 1982). Después de esto, muchos dispositivos automatizados, semiautomatizados y métodos manuales se han desarrollado para la concentración de plaquetas en seres humanos (Zimmermann y col 2001, 2003, Appel y col 2002, Weibrich y col 2002b, 2003a, b, Eppley y col 2004). Estos dispositivos concentran más PLTs, leucocitos y GFs, que algunos procedimientos de aféresis (Marx y col 1998) y el método del tubo (Weibrich y col 2005, Tamimi y col 2007).

Todas las técnicas utilizadas para preparar APCs pre-sentan ventajas e inconvenientes. Aún no se ha desarrollado un método o dispositivo ideal para concentrar plaquetas y factores de crecimiento. El sistema de aféresis requiere alta tecnología y personal experimentado y un gran vo-lumen de sangre (> 450 mL) (Marx y col 1998, Weibrich y col 2002a). Sin embargo, se presenta un bajo riesgo de contaminación bacteriana durante la preparación de los APCs (Vasconcelos y col 2003).

Los sistemas semiatomatizados (buffy coat) permi-ten concentrar un elevado número de PLTs y GFs en comparación con las otras dos técnicas (Zimmermann y col 2001, Appel y col 2002, Weibrich y col 2002b, 2003a, b, Zimmermann y col 2003, Eppley y col 2004) y, además, el riesgo de contaminación bacteriana es

menor (Vasconcelos y col 2003) que con el método manual (tubo) (Weibrich y col 2005). Sin embargo, estos dispositivos también concentran un elevado número de leucocitos y son costosos. Es importante señalar que la función exacta de los leucocitos en los APCs no se ha establecido. Sin embargo, se cree que la concen-tración de un gran número de glóbulos blancos en los APCs podría ser perjudicial para los tejidos tratados (Zimmermann y col 2003).

Los métodos manuales (tubo) son sencillos y baratos; sin embargo, requieren de un estricto manejo aséptico para evitar la contaminación bacteriana (Weibrich y col 2005, Tamimi y col 2007, álvarez y col 2010). Las ventajas del método del tubo incluyen su simplicidad y bajo costo, mientras que los métodos semiautomatizados son costo-limitantes, ya que requieren kits y centrífugas especializadas.

Los tres métodos generales utilizados para la obten-ción de APCs en seres humanos han sido validados en caballos. Se ha evaluado la capacidad para concentrar PLTs, leucocitos, algunos GFs (Carter y col 2003, Sutter y col 2004, Argüelles y col 2006, Schnabel y col 2007, Carmona y col 2008) y óxido nítrico (Carmona y col 2008) (cuadro 3).

INVESTIGACIÓN BáSICA QUE SUSTENTA EL USO CLÍNICO DE CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE PLAQUETAS EN CABALLOS

Las plaquetas contienen GFs que han sido evaluados individualmente en cartílago y tendón equino. De estos, el PDGF-BB e IGF-I han demostrado efectos positivos

Cuadro 3. Técnicas utilizadas para la preparación de concentrados de plaquetas autólogos equinos. Comparación de algunos aspectos celulares y moleculares. Techniques used for preparing equine autologous platelet concentrates. Comparison of some cellular and molecular aspects.

Métodos Plaquetas x103/µl

WBCs x103/µl

TGFβ1ng/ml

TGFβ2ng/ml

TGFβ3pg/ml

PDGF-AB ng/ml

PDGF-BB ng/ml

IGF-I ng/ml

Oxido nítrico (µM) Referencias

Secquire PRP System

1.472 32,5 15,3 1 – – – 107,4 – Sutter y col 2004

Smart PReP 2 system

395 4,48 ~9,5 – – – ~8,5 ~200 – Schnabel y col 2007

Aféresis490-55 33,7

7,4-23,6 4,3 – 7,4 – 183,4 –

Carter y col 2003, Sutter y col 2004

Aféresis más filtración

2.172 61,2 57,9 – – – – – – Sutter y col 2004

Método del tubo

272 8,4 10,5 – 30.772 – – – 35 Argüelles y col 2006, Carmona y col 2008

Sangre entera 158-165 6,371 5,58,3 1,2 <30.774 – ~3 171,5 33 Sutter y col 2004, Argüelles y col 2006, Carmona y col 2008

WBCs: Leucocitos. Otras abreviaturas, tal como en el cuadro 1.

6

JU CARMONA Y COL

en tendón equino in vitro (Haupt y col 2006) e in vivo (Dahlgren y col 2002). Lo mismo ha sido documentado en condrocitos equinos in vitro, especialmente con IGF-I (Frisbie y col 2000) y TGF-β1 (Fortier y col 1997). Estos GFs incrementan la síntesis de ECM del cartílago articular y producen proliferación de condrocitos.

La investigación básica del efecto de los APCs en caballos se ha centrado en estudios en sistemas in vitro (Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, 2008, McCarrel y Fortier 2009) y en modelos de tendinitis (Maia y col 2009, Bosch y col 2010). Se ha dado gran preponderancia al efecto de los APCs sobre el metabolismo de tenocitos y/o miofibroblastos y la matriz extracelular de tendón y/o ligamento suspensorio de caballos. Sin embargo, hasta el momento (según lo revisado por los autores), no se ha descrito el efecto in vitro de los APCs sobre cartílago, menisco o membrana sinovial de equinos. Los APCs aumentan la capacidad metabólica y proliferativa de tenocitos y fibroblastos, la cual se hace evidente al incrementar la expresión de colágeno tipo I y la síntesis de proteína oligomérica de matriz del cartílago (COMP) (Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, 2008). Por otra parte, Anitua y col (2005) demostraron in vitro, en explan-tes de tendón humano, que estas sustancias promovían la angiogénesis mediante el incremento de la expresión del factor de crecimiento vásculo-endotelial (VEGF) y el factor de crecimiento hepatocitario (HGF).

Recientemente, se ha publicado una investigación sobre el efecto de un APC (obtenido mediante el método del tubo) en un modelo equino de tendinitis inducida por colagenasa (Maia y col 2009) y otra sobre el efecto de un APC (obtenido mediante un método semiautomatizado) sobre la calidad de la reparación de lesiones tendinosas centrales (core lesion) induci-das mecánicamente en caballos. En el primer estudio se observó que a los 36 días los caballos tratados con APC tenían una mejor disposición histológica de las fibras de colágeno y fibroblastos sobre la matriz de sus tendones en comparación con los caballos del grupo control. Sin embargo, el número de fibroblastos y vasos sanguíneos no fue diferente entre ambos grupos (Maia y col 2009). En el segundo estudio se observó que a los 6 meses el grupo de caballos tratados con APC presentó una mejor arquitectura histológica, mayor contenido de colágeno, glicosaminoglicanos, DNA y mayor resistencia ténsil que el grupo control (Bosch y col 2010). Se puede apreciar que ambos métodos para concentrar plaquetas produjeron resultados biológicos similares en esos estudios experimentales.

En cuanto al efecto in vitro de los APCs sobre el meta-bolismo de tejidos articulares, en porcinos se ha observado que producen proliferación de condrocitos y aumento de la síntesis de su matriz extracelular (Akeda y col 2006) y en sinoviocitos de personas con osteoartritis promueven la síntesis de ácido hialurónico y la expresión de VEGF (Anitua y col 2007).

USO CLÍNICO DE CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE PLAQUETAS COMO TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEGENERATIVAS DEL APARATO LOCOMOTOR EQUINO

La historia del uso clínico de los APCs como tra-tamiento de enfermedades degenerativas del aparato musculoesquelético de caballos, tales como tendinopatía (principalmente) del tendón flexor digital, desmopatía del ligamento suspensor y osteoartritis es muy reciente. En Estados Unidos existe predilección por el uso de dispo-sitivos semiautomatizados, tales como el Secquire (PPAI Medical, Fort Myers, FL, USA) (Waselau y col 2008) y el SmartPReP2 system (Harvest Technologies, Plymouth, MA, USA), para preparar APCs equinos con finalida-des terapéuticas (Schnabel y col 2007). Entretanto, en Europa continental y en algunos países de Latinoamérica se emplea el método manual del tubo (Argüelles y col 2006, Carmona y col 2008). Un aspecto importante que se debe considerar es que independientemente del método empleado (tal como se ha observado reciente-mente en estudios experimentales (Maia y col 2009, Bosch y col 2010)), se han obtenido buenos resultados en caballos con diferentes enfermedades locomotoras. Sin embargo, el método del tubo tiene la ventaja de ser muy barato y efectivo en comparación con los métodos semiautomatizados (Monteiro y col 2009).

TRATAMIENTO DE LESIONES DEGENERATIVAS DE

TENDONES Y LIGAMENTOS

Se ha descrito el uso de APCs en casos de tendinopatía (Abellanet 2009, Carmona y col 2009a) y desmopatía del ligamento suspensorio (Waselau y col 2008, Abellanet 2009, Carmona y col 2009a). Los APCs (obtenidos mediante el método del tubo) fueron utilizados inicialmente en un pequeño número de caballos con afecciones tendinosas y ligamentosas (Carmona y col 2009a). Los pacientes de ese estudio presentaron una mejoría clínica y ecográfica, pero esa investigación incluyó un bajo número de pacien-tes (n = 5) y no había un grupo control. Sin embargo, el tratamiento fue seguro, ya que las inyecciones de APCs no indujeron reacciones adversas en los caballos tratados. Waselau y col (2008) describieron los resul-tados de una inyección de un APC (obtenido mediante método semiautomatizado) seguido de un programa de ejercicio controlado como tratamiento de desmitis mo-derada o severa del cuerpo del ligamento suspensorio en 9 caballos de carreras. Los pacientes alcanzaron su nivel atlético entre 6, 5-17 meses poslesión y corrieron consecutivamente durante dos años. Sin embargo, en ese estudio no había grupo control.

Recientemente, Abellanet (2009) describió los resul-tados de un estudio clínico controlado en el que se evaluó el uso de APCs (obtenidos mediante el método del tubo (Argüelles y col 2006, Carmona y col 2008, 2009)) en 72

7

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELÉTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

caballos con tendinopatía del tendón flexor digital superfi-cial, 10 con tendinopatía del flexor digital profundo y 16 con lesiones del ligamento suspensorio. Los caballos con tendinopatía del tendón flexor digital superficial presen-taron una mejoría clínica del 80% vs 45% para el grupo control (n = 9). De los caballos que fueron tratados con APCs presentaron recidiva el 22% en comparación con el 80% del grupo control. Los caballos con tendinopatía del flexor digital profundo que recibieron tratamiento con APCs presentaron mejoría del 100% en comparación con el 0% del grupo control (n = 4) y una recidiva del 17% en los caballos tratados. Los caballos con desmopatía del ligamento suspensor presentaron mejoría clínica el 90% vs 0% del grupo control (n = 16). De los caballos que fueron tratados con APCs recayó el 10%. En general todos los caballos tratados con APCs se recuperaron en un periodo de 6 meses.

TRATAMIENTO DE OSTEOARTRITIS

Carmona y col (2009b) describieron el tratamiento con APCs de 4 caballos con OA de diferentes articula-ciones. Los resultados obtenidos fueron favorables ya que los APCs disminuyeron el grado de cojera y efusión sinovial por más de 8 meses. Sin embargo, en ese es-tudio no había un grupo control, por lo que los autores sólo pudieron concluir que la inyección intraarticular de APCs en caballos con OA era segura. Sin embargo, recientemente Abellanet (2009) evaluó el efecto clínico de la inyección intraarticular de APCs en 30 caballos con OA. En ese trabajo se observó mejoría clínica en el 75% de los caballos tratados contra 0% en el grupo de 12 caballos con OA que no recibió tratamiento. El porcentaje de recidiva en esa investigación fue del 30%. Los caballos que recayeron presentaban alteraciones radiológicas severas, principalmente fragmentos óseos libres mayores de 4 mm (Abellanet 2009).

EFECTOS ADVERSOS ASOCIADOS CON LA INYECCIÓN DE CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE PLAQUETAS

Hasta la fecha no hay informes sobre efectos adver-sos secundarios derivados del uso de APCs en pacientes equinos. Los autores han realizado más de 1.000 inyec-ciones de APCs, obtenidos mediante el método del tubo (Argüelles y col 2006, Carmona y col 2008), sin ningún tipo de complicación, aunque algunos caballos afectados por enfermedad articular desarrollaron un ligero derrame sinovial durante las primeras 48 horas después de la in-yección de APCs (Carmona y col 2009b). Es posible que estas efusiones sinoviales transitorias estén relacionadas con la presencia de leucocitos en los APCs. Sin embar-go, el PDGF liberado durante la activación plaquetaria también podría contribuir con este problema, ya que es un poderoso factor de crecimiento quimiotáctico para

leucocitos periféricos (Nimmi 1997). Existe alguna desconfianza entre veterinarios para inyectar APCs vía intraarticular en caballos con OA, pues se piensa en la posibilidad de desarrollar una artritis séptica posinyección. Recientemente, álvarez y col (2010) demostraron que los APCs obtenidos mediante el método del tubo no sufren contaminación bacteriana, siempre y cuando se realice un adecuado protocolo de desinfección de la piel del sitio de la venopunción y que estos sean preparados en un cuarto cerrado y sin corrientes de aire. Por otra parte, es necesario considerar que los APCs tienen una potente acción antimicrobiana contra las bacterias de la piel de los caballos (álvarez y col, datos sin publicar), tales como Staphylococcus aureus (Bielecki y col 2007).

NÚMERO Y VIABILIDAD DE PLAQUETAS, NÚMERO DE DOSIS, INTERVALO POSOLÓGICO, MOMENTO IDEAL DE APLICACIÓN VERSUS EFECTIVIDAD CLÍNICA DE LOS CONCENTRADOS AUTÓLOGOS DE PLAQUETAS

Según la literatura revisada y particularmente por los resultados obtenidos in vivo en modelos experimentales (Maia y col 2009, Bosch y col 2010) y en estudios clí-nicos (Waselaw y col 2008, Abellanet 2009, Carmona y col 2009a, b) existe una buena respuesta terapéutica de los APCs a partir de dosis de plaquetas tan bajas como 300.000/µL (Maia y col 2008, Carmona y col 2009a, b, Abellanet 2009) y tan altas como más de un millón/µL (Waselaw y col 2008). Para los autores de esta revisión la fracción celular extraplaquetaria y la viabilidad plaque-taria son aspectos más importantes que concentrar una gran cantidad de plaquetas “no viables” y de factores de crecimiento (McCarrel y Fortier 2009). Aunque existe una corriente norteamericana que recomienda congelar APCs para un posterior uso en el paciente, nuestro equipo cree que estos concentrados se deben activar y aplicar inmediatamente. Esto porque es posible que la viabilidad celular del APC y su actividad metabólica produzcan una reacción de liberación más adecuada y temporalmente sostenida de los gránulos alfa y una mejor interacción celular (Anitua y col 2004).

Los resultados de Abellanet (2009) confirman, es-pecialmente para lesiones de tejidos blandos, que entre mayor sea el número de aplicaciones de APC/lesión, se presentará una mejor respuesta clínica y un menor número de recaídas. Los autores consideran que tres e incluso cuatro aplicación de APCs, con un intervalo de 10-15 días entre aplicación, es un esquema posológico adecuado. Este esquema terapéutico se ha basado en la impresión clínica de los autores y, por otra parte, los estudios de Abellanet (2009) indican que algunos biomarcadores anabólicos declinan 15 días después de la aplicación intraarticular o intrasinovial de APCs en caballos. Los autores consideran que los APCs pueden ser aplicados en cualquier momen-to de evolución de las lesiones. No se debe olvidar que

8

JU CARMONA Y COL

la mayoría de las enfermedades del aparato locomotor equino son “crónicas por naturaleza” y que los episodios agudos son solamente agravamientos momentáneos de las mismas patologías (Carmona y Prades 2009). Los APCs constituyen un excelente tratamiento analgésico y anti-inflamatorio para las lesiones en “fase aguda” de tendones, ligamentos y articulaciones y sólo existen “limitaciones teóricas”, que sugieren su aplicación únicamente en la fase proliferativa de la lesión, especialmente tendinosa (Schnabel y col 2007).

CONCLUSIÓN

Los APCs constituyen una opción terapéutica real para el manejo de las enfermedades crónicas musculo-esqueléticas del caballo. Según los resultados obtenidos en modelos experimentales y en pacientes con enferme-dad natural, existe una buena respuesta terapéutica de los APCs a partir de dosis de plaquetas tan bajas como 300.000/µL. Los APCs deberían ser aplicados al menos tres veces con un intervalo de 2 semanas entre aplica-ción. El método del tubo representa una opción simple y económica para preparar concentrados autólogos de “plaquetas viables”.

Es necesario ampliar el conocimiento sobre los efec-tos moleculares de los APCs sobre el cartílago articular equino y realizar más estudios clínicos doble ciego que incluyan un gran número de pacientes equinos con dife-rentes enfermedades musculoesqueléticas y hacer estudios sobre el comportamiento de biomarcadores anabólicos y catabólicos a largo tiempo (3 años). Los resultados de estudios de tal magnitud no sólo serían de beneficio para los caballos, sino que tendrían una importante aplicación traslacional en seres humanos.

RESUMEN

Las plaquetas son fundamentales para la reparación tisular de las heridas, ya que secretan factores de crecimiento, los cuales inducen quimiotaxis, proliferación y diferenciación celular, neovascularización y producción de la matriz extracelular. Se ha propuesto el uso de concentrados autólogos de plaquetas (APCs) para acelerar la cicatrización de heridas, disminuir la inflamación, estimular la capacidad regenerativa de los tejidos lesionados, disminuir la actividad fibroblástica y la producción de tejido cicatricial no-funcional. Los APCs pueden ser preparados mediante diferentes métodos. Cada método produce APCs de diferente calidad celular y molecular. Recientemente, se ha generado información básica y clínica que justifica el uso de APCs en caballos con enfermedades degenerativas del aparato musculoesquelético equino como la osteoartritis, tendinopatías y desmopatías.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Profesora Fabiola de Oliveira Paes Leme, MV, MSc, PhD (Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil), por el aporte de las fotografías ultraestructurales de las plaquetas equinas presentadas en este trabajo.

REFERENCIAS

Abellanet I. 2009. La terapia de lesiones de tejidos blandos y articulaciones con plasma rico en plaquetas en caballos de deporte: evidencia clínica y bioquímica que valida su utilización. Tesis de Doctorado, Facultad de Veterinaria, Universidad Autónoma de Barcelona, España.

Akeda K, HS An, M Okuma, M Attawia, K Miyamoto, EJ Thonar, ME Lenz, RL Sah, K Masuda. 2006. Platelet-rich plasma stimulates porcine articular chondrocyte proliferation and matrix biosynthesis. Osteoarthritis Cartilage 14, 1272-1280.

álvarez ME, CE Giraldo, JU Carmona. 2010. Contaminación bacteriana en concentrados de plaquetas de caballos. Arch Med Vet 42, 49-56.

álvarez ME, CE Giraldo, I Samudio, JU Carmona. 2011. Actividad bactericida in vitro de concentrados de plaquetas, plasma pobre en plaquetas y plasma de equinos contra Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Arch Med Vet 43, en prensa.

Anitua E. 1999. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int J Oral Maxillofac Implants 14, 529-535.

Anitua E, I Andia, B Ardanza, P Nurden, AT Nurden. 2004. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration. Thromb Haemost 91, 4-15.

Anitua E, I Andia, M Sánchez, J Azofra, MM Zalduendo, M de la Fuente, P Nurden, AT Nurden. 2005. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J Orthop Res 23, 281-286.

Anitua E, M Sánchez, AT Nurden, MM Zalduendo, M de la Fuente, J Azofra, I Andia. 2007. Platelet-released growth factors enhance the secretion of hyaluronic acid and induce hepatocyte growth factor production by synovial fibroblasts from arthritic patients. Rheumatology (Oxford) 46, 1769-1772.

Appel TR, B Pötzsch, J von Müller, JJ Lindern, SJ Bergé, RH Reich. 2002. Comparison of three different preparations of platelet concentrates for growth factor enrichment. Clin Oral Implant Res 13, 357-362.

Argüelles D, JU Carmona, J Pastor, A Iborra, L Viñals, P Martínez, E Bach, M Prades. 2006. Evaluation of single and double centri-fugation tube methods for concentrating equine platelets. Res Vet Scien 81, 237-245.

Bhanot S, JC Alex. 2002. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plast Surg 18, 27-33.

Bielecki TM, TS Gazdzik, J Arendt, T Szczepanski, W Król, T Wielkoszynski. 2007. Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study. J Bone Joint Surg Br 89, 417-420.

Boehlen F, K Clemetson. 2001. Platelets chemokines and their receptors: what is their relevance to platelet storage an transfusion practice? Transfus Med 11, 403-417.

Bosch G, HT van Schie, MW de Groot, JA Cadby, CH van de Lest, A Barneveld, PR van Weeren. 2010. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J Orthop Res 28, 211-217.

Braun S, U auf dem Keller, HD Beer, M Krampert, M Müller, S Werner, C Dickson, S Werner. 2002. Growth factors in development, repair and disease. Eur J Cell Biol 81, 375-382.

Calvin M. 1998. Cutaneous wound repair. Wounds 10, 12-32.Carlson NE, RB Roach. 2002. Platelet-rich plasma: clinical applications

in dentistry. J Am Dent Assoc 133, 1383-1386.Carmona JU, D Argüelles, M Prades. 2008. Transforming growth factor

beta-3 and nitric oxide levels in four autologous platelet concentrates and plasma derived from equine blood. Arch Med Vet 40, 155-160.

Carmona JU, M Prades. 2009. Platelet concentrates to treat musculoske-letal disease in horses. VDM Verlag Dr. Müller Aktiengesellschaft & Co. KG, Saarbrücken, Germany.

Carmona JU, M Prades, D Argüelles. 2009a. Autologous platelet con-centrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses. Arch Med Vet 41, 77-82.

9

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELÉTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

Carmona JU, C López, M Prades. 2009b. Use of autologous platelet concentrates obtained by the tube method as a treatment for arthro-pathies in horses. Arch Med Vet 41, 175-179.

Carter CA, DG Jolly, CE Worden, DG Hendren, CJ Kane. 2003. Platelet-rich plasma gel promotes differentiation and regeneration during equine wound healing. Exp Mol Pathol 74, 244-255.

Catlow K, JA Deakin, M Delehedde, DG Fernig, JT Gallagher, MS Pavão, M Lyon. 2003. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its in-teraction with heparin sulphate and dermatan sulphate. Bioch Soc Transact 31, 352-353.

Dahlgren LA, MCH van der Meulen, JEA Bertram, GS Starrak, AJ Nixon. 2002. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis, J Orthop Res 20, 910-919.

Eppley BL, JE Woodell, J Higgins. 2004. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plast Reconst Surg 114, 1502-1508.

Ferrara N. 2001. Role of vascular endothelial growth factor in regula-tion of physiological angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 280, C1358-C1366.

Fortier LA, AJ Nixon, HO Mohammed, G Lust. 1997. Altered biological activity of equine chondrocytes cultured in a three-dimensional fibrin matrix and supplemented with transforming growth factor beta-1. Am J Vet Res 58, 66-70.

Frisbie DD, EA Sandler, GW Trotter, CW McIlwraith. 2000. Metabolic and mitogenic activities of insulin-like growth factor-1 in interleukin-1-conditioned equine cartilage. Am J Vet Res 61, 436-441.

Gentry PA. 2000. Platelet biology. Schalman’s Veterinary Hematology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA, Pp 459-466.

Harridge SD. 2003. Ageing and local growth factors in muscle. Scand J Med Scien Sport 13, 34-39.

Hartwig J, J Italiano. 2003. The birth of the platelet. J Thromb Haemost 1, 1580-1586.

Haupt JL, BP Donnelly, AJ Nixon. 2006. Effects of platelet-derived growth factor-BB on the metabolic function and morphologic features of equine tendon in explant culture. Am J Vet Res 67, 1595-1600.

Huang SS, JS Huang. 2005. TGF-β control of cell proliferation. J Cell Bioch 96, 447-462.

Leven ER. 2000. Megakaryocytes. Schalman’s Veterinary Hematology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA, Pp 443-447.

Lowery GL, S Kulkarni, AE Pennisi. 1999. Use of autologous growth factors in lumbar spinal fusion. Bone 25 (S2), 478-508.

Maia L, MV de Souza, JI Ribeiro, AC de Oliveira, GES Alves, L dos Anjos Benjamin, YFR Silva, BM Zandim, JCL Moreira. 2009. Platelet-rich plasma in the treatment of induced tendinopathy in horses: histologic evaluation. J Equine Vet Sci 29, 618-626.

Mannaioni PF, GM Bello, E Masini. 1997. Platelets and inflammation: role of platelet-derived growth factor, adhesion molecules and histamine. Inflamm Res 46, 4-18.

Marx RE, ER Carlson, RM Eichstaedt, SR Schimmele, JE Strauss, KR Georgeff. 1998. Platelet rich plasma: growth factor enhance-ment for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 85, 638-646.

Marx RE. 2004. Platelet-rich plasma: evidence to support its usage. J Oral Maxillofac Surg 62, 489-496.

Matras H. 1982. The use of fibrin glue in oral and maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg 40, 617.

McCarrel T, L Fortier. 2009. Temporal growth factor release from platelet-rich plasma, trehalose lyophilized platelets, and bone marrow aspirate and their effect on tendon and ligament gene expression, J Orthop Res 27, 1033-1042.

Monteiro SO, O M Lepage, CL Theoret. 2009. Effects of platelet-rich plasma on the repair of wounds on the distal aspect of the forelimb in horses. Am J Vet Res 70, 277-282.

Nimmi ME. 1997. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials 18, 1201-1225.

Paes-Leme FO, LJ Wurzinger, AC Vasconcelos, GES Alves. 2006. Ativação de plaquetas de eqüinos com laminite induzida e tratados com ketoprofeno, fenilbutazona e flunixin meglumina. Arq Bras Med Vet Zootec 58, 149-157.

Pelagalli A, P Lombardi, D d’Angelo, R Della Morte, L Avallone, N Staiano. 2002. Species variability in platelet aggregation response to different agonists. J Comp Pathol 127, 126-132.

Pelagalli A, MA Belisario, S Tafuri, P Lombardi, D d’Angelo, L Avallone, N Staiano. 2003. Adhesive properties from different animal species. J Comp Pathol 128, 127-131.

Powell DM, E Chang, EH Farrior. 2001. Recovery from deep-plane rhytidectomy following unilateral wound treatment with autologous platelet gel: a pilot study. Arch Facial Plast Surg 3, 245-250.

Reigstad L, JE Varhaug, JR Lillehaug. 2005. Structural and functional specificities of PDGF-C and PDGF-D, the novel members of the platelet-derived growth factors family. FEBS J 272, 5723-5741.

Sánchez M, J Azofra, E Anitua, I Andía, S Padilla, J Santisteban, I Mujika. 2003. Plasma rich in growth factors to treat an articular cartilage avulsion: a case report. Med Scien Sports Exerc 35, 1648-1652.

Segura D, L Monreal, S Pérez-Pujol, M Pino, A Ordinas, R Brugués, JG White, G Escolar. 2006. Assessment of platelet function in horses: ultrastructure, flow cytometry and perfusion techniques. J Vet Intern Med 20, 581-588.

Schnabel LV, HO Mohammed, BJ Miller, WG McDermott, MS Jacobson, KS Santangelo, LA Fortier. 2007. Platelet rich plasma (PRP) enhances anabolic gene expression patterns in flexor digitorum superficialis tendons. J Orthop Res 25, 230-240.

Schnabel LV, HO Mohammed, MS Jacobson, LA Fortier. 2008. Effects of platelet rich plasma and acellular bone marrow on gene expression patterns and DNA content of equine suspensory ligament explant cultures. Equine Vet J 40, 260-265.

Smith JJ, MW Ross, RK Smith. 2006. Anabolic effects of acel-lular bone marrow, platelet rich plasma, and serum on equine suspensory ligament fibroblasts in vitro. Vet Comp Orthop Traumatol 19, 43-47.

Spencer FA, RC Becker. 1997. Platelets: Structure, Function, and Their Fundamental Contribution to Hemostasis and Pathologic Thrombosis. Textbook of Coronary Thrombosis and Thrombolysis, Kluwer Academic Publishers, Norwell, USA, Pp 31-49.

Sutter WW, AJ Kaneps, AL Bertone. 2004. Comparison of hematologic values and transforming growth factor-β and isulin-like growth factor concentrations in platelets concentrates obtained by use of buffy coat and apheresis methods from equine blood. Am J Vet Res 65, 924-930.

Tablin F. 2000. Platelet structure and function. Schalman’s Veterinary Hematology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, USA, Pp 448-452.

Tamimi FM, S Montalvo, I Tresguerres, L Blanco-Jerez. 2007. A com-parative study of 2 methods for obtaining platelet-rich plasma. J Oral Maxillofac Surg 65, 1084-1093.

Theoret CL. 2005. The pathophysiology of wound repair. Vet Clin Equine 21, 1-13.

Todorovic V, V Jurukovski, Y Chen, L Fontana, B Dabovic, DB Rifkin. 2005. Latent TGF-β binding proteins. Int J Biochem Cell Biol 37, 38-41.

Vasconcelos E, AC Figueiredo, J Seghatchian. 2003. Quality of platelet concentrates derived by platelet rich plasma, buffy coat and apheresis. Transfus Apher Sci 29, 13-16.

Waselau M, WW Sutter, RL Genovese, AL Bertone. 2008. Intralesional injection of platelet-rich plasma followed by controlled exercise for treatment of midbody suspensory ligament desmitis in Standardbred racehorses. J Am Vet Med Assoc 232, 1515-1520.

Weibrich G, RS Buch, WK Kleis, G Hafner, WE Hitzler, W Wagner. 2002a. Quantification of thrombocyte growth factors in platelet concentrates produced by discontinous cell separation. Growth factors 20, 93-97.

Weibrich G, WK Kleis, G Hafner. 2002b. Growth factor levels in the platelet-rich plasma produced by 2 different methods: curasan-

10

JU CARMONA Y COL

type PRP kit versus PCCS PRP system. Int J Oral Maxillofac Implants 17, 2184-2190.

Weibrich G, WK Kleis, R Buch, WE Hitzler, G Hafner. 2003a. The Harverst Smart PReP system versus the Friadent-Schütze platelet rich plasma kit. Clin Oral Implants Res 14, 233-239.

Weibrich G, WK Kleis, G Hafner, WE Hitzler, W Wagner. 2003b. Comparison of platelet, leukocyte, and growth factor levels in point-of-care platelet-enriched plasma, prepared using a modified Curasan kit, with preparations received from a local blood bank. Clin Oral Implants Res 14, 357-362.

Weibrich G, WK Kleis, WE Hitzler, G Hafner. 2005. Comparison of the platelet concentrate collection system with the plasma-rich-in-growth-factors kit to produce platelet rich plasma: a technical report. Int J Oral Maxillofac Implants 29, 118-123.

Whitman DH, RL Berry, DM Green. 1997. Platelet gel: an autologous

alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial

surgery. J Oral Maxillofac Surg 55, 1294-1299.

Zimmermann R, R Jakubietz, M Jakubietz, E Strasser, A Schlegel,

J Wiltfang, R Eckstein. 2001. Different preparation methods to

obtain platelet components as a source of growth factors for local

application. Transfusion 41, 1217-1224.

Zimmermann R, D Arnold, E Strasser, J Ringwald, A Schlegel, J Wiltfang,

R Eckstein. 2003. Sample preparation technique and white cell

content influence the detectable levels of growth factors in platelet

concentrates. Vox Sang 85, 283-289.

11

Arch Med Vet 43, 11-25 (2011)

REVISIÓN BIBLIOGRáFICA

Aceptado: 19.05.2010.

* Casilla 15-D, Temuco, Chile; ivisler@uct.cl

Atresia folicular en peces teleósteos: una revisión

Follicular atresia in teleost fish: a review

I Valdebenitoa*, L Paivaa, M Berlandb

a*Escuela de Acuicultura, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.bEscuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.

SUMMARY

Many fish species with economic importance have been heavily exploited, causing the collapse of their fisheries. For this reason, there have been attempts to cultivate fish species for commercial purposes, resulting in varying success. It has been observed that when some species are kept in captivity or under intensive exploitation in its natural environment, they present reproductive dysfunctions that leads to the appearance of follicular atresia. This process is scarcely studied in fish and the characterization by several authors shows differences in nomenclature and criteria that make even more difficult its understanding. The objective of this work is to present a literature review of follicular atresia in fish that will contribute to its understanding and study. The follicular atresia is a degenerative process observed in some oocytes that can occur at any time of its development. The presence of follicular atresia has been associated with normal degenerative conditions due to seasonal changes in the gonadal activity, health disorders or inadequate management conditions in fish culture. It has been suggested that this process is a mechanism that allows the recycling of components and energy. However, in certain species such as puye (Galaxias maculatus) and cutthroat trout (Salmo clarki), among others, it has been noted the presence of follicular atresia with pathological characteristics, in which the yolk reabsorption does not occur causing the hardening of the more developed follicles that leads finally to the female death.

Palabras claves: reproducción de peces, oogénesis, folículo ovárico, atresia folicular.Key words: fish reproduction, oogenesis, ovarian follicle, follicular atresia.

INTRODUCCIÓN

La creciente demanda de alimentos ha provocado que muchas especies de peces con importancia económica sean intensamente explotadas, con el consecuente colapso de sus pesquerías y su tendencia a desaparecer de aquellos hábitats donde históricamente se les ha encontrado (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, en algunas especies se han hecho intentos por lograr cultivar individuos con fines comerciales, obteniéndose relativo éxito. Estas poblaciones cuando son mantenidas en confinamiento o sometidas a intensa presión de explotación presentan alteraciones gonadales que pueden disminuir su desempeño reproduc-tivo, lo que se refleja especialmente en la reducción de parámetros como la tasa de fertilidad y sobrevivencia en incubación (Leonardo y col 2006).

Una de las más serias limitantes para el cultivo comer-cial de una nueva especie es el conocimiento y control de la biología reproductiva y los problemas o disfunciones que en ella acontecen, ya que ésta es la base de sustentación para los futuros programas productivos (Zohar y Mylonas 2001).

El manejo de las pesquerías a menudo requiere de la valoración de parámetros de madurez sexual, desove y

fecundidad, los que necesitan de la comprensión cabal de la microestructura y función gonadal (Rutaisire y Booth 2004). Dicha información está disponible sólo para una pequeña cantidad de especies comercialmente importantes y en muchos casos sólo de forma parcial (Tyler y Sumpter 1996).

Los estudios histológicos proveen de información precisa del desarrollo oocitario, pero son lentos y costosos debido a que involucran complejas técnicas de laboratorio (West 1990). Sin embargo, actualmente se ha incrementado el interés en el estudio de las alteraciones histológicas (histopatología), debido a que los cambios estructurales a nivel gonadal son el resultado de la integración de un gran número de procesos fisiológicos que interactúan entre sí (van der Oost y col 2003).

La presente revisión realiza una breve descripción de las alteraciones reproductivas de hembras de peces enfocada en el proceso de atresia folicular, basándose en disfunciones analizadas en literatura con diferentes especies de peces teleósteos.

ESTRUCTURA GONADAL EN PECES

ORGANIZACIÓN HISTOLÓGICA

La microestructura del ovario de los peces teleósteos revela que éste se encuentra envuelto por una delgada túnica albugínea de tejido conectivo laxo, la cual presenta engrosamientos donde existen vasos sanguíneos que

12

I VALDEBENITO Y COL

irrigan la gónada. En el interior del ovario se observan laminillas ovígeras que se desprenden de la albugínea, proyectándose hacia el lumen del órgano. El cuerpo de la laminilla está formado por tejido conectivo y escasas fibras musculares lisas, recubiertas por el epitelio germi-nal ovárico. El folículo ovárico se encuentra embebido dentro de un heterogéneo tejido de sostén, el que en su conjunto constituye el ovario (Nagahama 1983, Peredo y Sobarzo 1993).

Microscópicamente el folículo ovárico de los peces es relativamente simple, siendo su organización similar en todos los teleósteos. El oocito de ubicación central está rodeado por una envoltura acelular denominada corion, zona radiata (Leonardo y col 2006) o envoltura vitelina (Leino y col 2005). Esta envoltura se encuentra cubierta externamente por células foliculares, las cuales a medida que crece el oocito incrementan su número, distribuyéndose en una envoltura continua de una monocapa de células (llamada granulosa) y una capa externa de células teca-les o envoltura folicular externa (figura 1). Ambas capas celulares se encuentran separadas por la membrana basal (Takashima e Hibiya 1995). Histológicamente, la eviden-cia actual sugiere que la capa de células de la granulosa está compuesta por una población celular homogénea. Sin embargo, esta capa celular también contiene células micropilares, las cuales son fácilmente distinguibles de las células granulosas por sus características morfológicas, como son su forma triangular y su ubicación en el canal micropilar. Por el contrario, la capa de células tecales presenta mayor heterogeneidad, ya que está compuesta de capilares, fibroblastos, fibras de colágeno y en muchos casos de células especiales de la teca (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995, Linares-Casenave y col 2002).

OOGÉNESIS

Se han empleado muchos criterios para caracterizar el proceso de oogénesis, entre ellos se encuentran: el tamaño, la cantidad y distribución de varias inclusiones celulares, especialmente gránulos de vitelo y morfología de los cromosomas. El proceso de oogénesis se ha dividido en cinco, seis u ocho etapas en la mayoría de los teleósteos (Ünver y Ünver Saraydin 2004). Sin embargo, la mayoría de los autores coinciden en una clasificación de seis estados de desarrollo oocitario (figura 2), los cuales se describen a continuación.

Oogonias: El primer paso en la oogénesis es similar al desarrollo encontrado en la espermatogénesis, ya que las oogonias experimentan proliferación por divisiones mitóticas. Estas oogonias se presentan distribuidas de una manera no uniforme, aisladas o formando cistos (Peredo y Sobarzo 1993), con características citológicas que presentan poca variación entre las especies. En la carpita cabezona (Pimephales promelas Rafinesque, 1820) las oogonias poseen un gran núcleo con algunos nucléolos de tamaño variable y en algunos casos un pequeño aro de citoplasma (Leino y col 2005).

Cromatina nucleolar: Esta etapa comprende desde lep-toteno a paquiteno durante la profase I. Las principales características al microscopio óptico son la redistribución de los cromosomas por todo el núcleo adoptando variadas figuras cromosomales, además de una redistribución de organelos citoplasmáticos. Durante esta etapa en la mayoría de las especies, una estructura citoplasmática conocida como el cuerpo vitelino de Balbiani o “núcleo vitelino”

Figura 1. Estructura de un folículo ovárico de puye (Galaxias maculatus). (A) VG vesícula germinal; C citoplasma vitelínico; PF pared folicular. Barra = 30 µm (40x). (B) CR corion; G monocapa granulosa; T capa tecal. Barra = 10 µm (100x). Structure of puye (Galaxias maculatus) ovary follicle. (A) VG germinal vesicle; C vitellinic cytoplasm; PF follicular wall. Scale Bar = 30 µm (40x). (B) CR chorion; G monolayer of granulosa cells; T thecal layer. Scale bar = 10 µm (100x).

13

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

inicia su desarrollo (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995), el cual ha sido caracterizado como una estructura altamente basofílica. A través de microscopía electrónica se ha revelado que ésta no es una estructura homogénea, ya que está compuesta por diversos organelos como retí-culo endoplásmico liso, aparato de Golgi, mitocondrias, gránulos lipídicos y cuerpos multivesiculares (Wallace y Selman 1981).

Fase perinucleolar: El inicio de esta fase se caracteriza por la aparición e inicio de la migración de múltiples nucléolos hacia el nucleoplasma periférico. Desde este momento el gran núcleo del oocito será llamado vesícula germinal (Nagahama 1983, Begovac y Wallace 1988, Takashima e Hibiya 1995). A pesar de que la meiosis se encuentra detenida en diploteno, el crecimiento oocitario y la diferenciación de la pared folicular continúa. Desde un punto de vista práctico, la organización básica del folículo ovárico puede ser observada mediante microscopía óptica por primera vez durante la fase perinucleolar, cuando el oocito se encuentra rodeado dentro de una capa continua de células foliculares (Takashima e Hibiya 1995) y teca-les, las cuales poseen un núcleo aplanado con una capa muy delgada de citoplasma, difícil de observar. A nivel ultraestructural, tanto la capa de la granulosa y de células tecales se hacen distinguibles y rudimentos del corion pueden aparecer (Ravaglia y Maggese 2002). Además, en muchas especies el cuerpo de Balbiani es claramente

definido en una posición yuxtanuclear. Posteriormente, este cuerpo sufre una desintegración gradual y migra hacia la superficie oocitaria (Takashima e Hibiya 1995).

Alvéolo cortical (Vesícula vitelina): Esta fase se caracteriza por la formación de vesículas vitelinas alrededor de la vesícula germinal y en algunos peces por la formación de gotas lipídicas en el citoplasma, como en la carpita cabe-zona (P. promelas) (Leino y col 2005, Honji y col 2006). La formación de estas vesículas vitelinas se inicia en la periferia del ooplasma en algunas especies, pudiendo observarse sólo escasas vesículas durante una fase tem-prana. Sin embargo, a medida que el desarrollo progresa van llenando y distribuyéndose por todo el citoplasma contribuyendo a un incremento de tamaño por parte del oocito (Ravaglia y Maggese 2002, Leino y col 2005). Otra característica de importancia es la aparición de mi-crovellosidades y corion (Takashima e Hibiya 1995, Honji y col 2006), la cual en el caso de la carpita cabezona es claramente visible hasta en los oocitos más pequeños de esta fase. Las células foliculares son de apariencia esca-mosa en la fase temprana, transformándose en cuboidales en la fase tardía (Leino y col 2005). En la mayoría de los teleósteos el inicio de la fase de alvéolo cortical precede el inicio de la fase vitelina, pero en algunas especies como el pez cebra (Branchydanio rerio Hamilton, 1822), estas fases pueden iniciarse conjuntamente (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995). Algunos autores separan esta etapa en tres: Vesícula de Vitelo I, Vesícula de Vitelo II, Vesícula de Vitelo III (Rutaisire y Booth 2004).

Vitelogénesis: En peces, antes de que la vitelogénesis se inicie, tiene lugar una serie de transformaciones nucleares, nucleolares y citoplasmáticas que hacen que el aspecto de los oocitos varíe de manera considerable (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010). Esta primera etapa corresponde al crecimiento primario o fase de crecimiento citoplasmático, donde se produce un incremento de los organelos citoplasmáticos, como son las mitocondrias, cuerpos multivesiculares, retículo endo-plasmático y los elementos del Golgi. La segunda etapa corresponde a la vitelogénesis propiamente tal, fase donde el oocito experimenta un aumento de tamaño prolongado y sostenido. En los meses anteriores a la puesta, se produce un crecimiento drástico del ovario de la mayoría de los teleósteos (desde menos del 1% hasta un 20% o más de Índice Gonadosomático (IGS), dependiendo de la especie). Este crecimiento es debido al cúmulo de grandes reservas nutritivas o vitelo por parte de los oocitos (Zanuy y Carrillo 1987). Por ejemplo, en la trucha arco iris el oocito joven posee un promedio de 20 µm de diámetro y al término de su desarrollo es de alrededor de 4 mm (Nagahama 1983). La síntesis de vitelo recibe el nombre de vitelogénesis, la cual ocurre fuera del oocito (vitelogénesis exógena) (Zanuy y Carrillo 1987, Le Menn y col 2000, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010).

Figura 2. Esquema de un corte transversal de ovario de pez con distintas etapas de crecimiento folicular. I oogonia; IIa croma-tina nucleolar; IIb oocitos perinucleolares; III alvéolo cortical; IV vitelogénesis; V oocito maduro; VI oocito ovulado (Extraído de Takashima e Hibiya 1995). Scheme of cross section of fish ovary with different stages of follicular growth. I oogonia; IIa chromatin nucleolar; IIb perinucleolar stage; III cortical alveoli; IV vitellogenesis; V mature oocyte; VI spawned egg (Extracted from Takashima and Hibiya 1995).

Cuerpo de Balbiani

Alvéolo cortical

VesículasVitelinas

Lípidos

Lípidos

I, IIaIIb

III

VI

IVV

14

I VALDEBENITO Y COL

El oocito empieza a incorporar material por mi-cropinocitosis formando gránulos de vitelo, los cuales inicialmente son más pequeños que los alvéolos corticales, encontrándose dispersos en el citoplasma periférico. Sin embargo, a medida que el oocito crece los gránulos de vitelo son de mayor tamaño y más numerosos, emigran-do hacia el interior del ooplasma y desplazando a los alvéolos corticales hacia la periferia (Nagahama 1983, Leino y col 2005).

Durante esta fase se han caracterizado tres tipos distintos de material vitelino: gotas lipídicas, vesículas vitelinas y gránulos vitelinos, la secuencia de aparición de este ma-terial vitelino varía según la especie (Nagahama 1983). En estados avanzados de vitelogénesis, las inclusiones lipídicas (generalmente triglicéridos) coalescen entre sí para formar una sola o varias gotas de grasa, dependiendo de la especie (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010).

La arquitectura de la pared folicular aumenta su com-plejidad durante esta fase. A nivel estructural el corion en algunas especies como los scianidos, puede ser reconocido por la presencia de tres capas, denominadas: Z1, Z2, Z3 (Nagahama 1983). Esta última es de apariencia reticular o estriada durante gran parte de la vitelogénesis, debido al gran número de canales o poros (Leino y col 2005). No obstante, durante el final de la vitelogénesis, puede perder su apariencia debido a la compactación (Takashima e Hibiya 1995).

Maduración: Morfológicamente esta fase es caracterizada por el inicio o reanudación de la migración de la vesícula germinal hacia el polo animal y la posterior ruptura de ésta (proceso llamado “breakdown” en inglés), además se produce una clarificación del vitelo y un marcado in-cremento de tamaño debido a la hidratación (Nagahama 1983, Zanuy y Carrillo 1987, Takashima e Hibiya 1995, Ünver y Ünver Saraydin 2004, Honji y col 2006). Cabe señalar que en algunas especies, como los salmonídeos y la carpita cabezona (P. promelas), la vesícula germinal inicia su migración hacia el polo animal antes de la maduración durante las últimas etapas de la vitelogénesis, pero en otras como los scianidos la vesícula germinal permanece en el centro del oocito hasta el inicio de la maduración final (Takashima e Hibiya 1995, Leino y col 2005). En esta etapa concluye la primera división meiótica con la expulsión del primer cuerpo polar, para nuevamente volver a detenerse, esta vez en metafase de la segunda división (Takashima e Hibiya 1995), para luego ser ovulado y eventualmente desovado (o puesto).

Wallace y Selman (1980) observaron que durante la maduración final en Fundulus heteroclitus (Linnaeus 1766), células de la granulosa experimentaron algunas alteraciones citológicas específicas, tales como un enorme aumento del aparato de Golgi con presencia de material secretorio e incremento de las cisternas glandulares de retículo endoplásmico rugoso y ribosomas libres.

Los oocitos ya maduros son llamados huevos u ovas, los cuales durante la ovulación (con la meiosis detenida en metafase II) son expelidos en la cavidad peritoneal en especies con ovarios gimnovárico (Nagahama 1983) o en la cavidad ovárica en especies con ovario cistovárico. En muchas especies de peces marinos y de estuario se produce un marcado aumento del volumen oocitario debido al ingreso de agua dentro del oocito, proceso llamado hidratación. El reinicio y finalización de la segunda división meiótica ocurre posterior a la fecundación del oocito II.

La ovulación en los teleósteos involucra una serie de pasos preparatorios. Primero la capa folicular debe separarse del oocito, el mecanismo que comanda la interrupción en la comunicación folículo-oocito previo a la ovulación es desconocido, pero se ha sugerido la intervención de enzimas proteolíticas en la disrupción de la conexión. Se ha demostrado la presencia de algunos elementos con-tráctiles como microfilamentos en las células tecales, así como la presencia de fibras musculares lisas. A través de experimentos con inhibidores de estos sistemas contrácti-les como Citocalasina B, se ha sugerido que este sistema de microfilamentos es necesario para la ovulación de los teleósteos (Nagahama 1983).

Posterior a la ovulación y desove, el ovario contiene folículos postovulatorios (POFs), ovas no desovadas, oocitos adultos inmaduros, oogonias y en peces con estaciones de desove continua o prolongada, oocitos en varias etapas de desarrollo (Takashima e Hibiya 1995, Ünver y Ünver Saraydin 2004).

Los folículos postovulatorios están constituidos por capas foliculares que permanecen en el ovario después de liberado el oocito. Inicialmente los POFs son una estruc-tura definida, pero rápidamente se deterioran tornándose indetectables dentro de algunos días (Macchi y col 2003, Honji y col 2006, Ganias y col 2007).

CONTROL ENDOCRINO DE LA REPRODUCCIÓN EN PECES

Similar a lo ocurrido en vertebrados superiores el desarrollo y crecimiento oocitario está gobernado por el sistema neuroendocrino, el cual estimula a los tejidos ováricos para el desarrollo folicular y la producción de esteroides (Hafez 2002). En peces, al igual que en otros vertebrados no mamíferos, la gran sensibilidad al medio ambiente ejerce un importante control sobre la reproducción, modulando a través de la integración de los sistemas sensoriales la secreción de hormonas liberadoras hipotalámicas. El mecanismo de secreción de esteroides es un complejo sistema que involucra la percepción de estímulos ambientales, conexiones neuro-nales y órganos endocrinos, el cual de manera general está compuesto por órganos de los sentidos, glándula pineal, hipotálamo e hipófisis, esta última es la encargada de secretar hormonas estimuladoras de tejidos sintetizadores de esteroides (Nagahama 1983, Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009).

15

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

Las gonadotrofinas (GtHs) se han purificado en es-pecies como el salmón, la carpa y la trucha, separándose dos fracciones denominadas GtH I (FSH) y GtH II (LH) (Zanuy y Carrillo 1987, Arantes y col 2010). La GtH I induce la captura de vitelogenina (Zanuy y Carrillo 1987, Luckenbach y col 2010) y, dependiendo de la especie, puede estimular la esteroidogénesis y liberación de AMPc, por lo cual se la denomina hormona vitelogénica. Por otra parte, la GtH II induce la maduración de los oocitos, la ovulación, además de estimular la formación de AMPc, denominándose hormona madurativa (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009). Ambos tipos de GtH son libe-radas desde la hipófisis y vertidas al torrente sanguíneo, donde al llegar a las gónadas, estimulan a los tejidos ováricos para realizar la síntesis esteroidogénica a nivel folicular en las células de la granulosa, células tecales, cuerpos atrésicos y folículos postovulatorios (corpora lutea) (Nagahama 1983, Valdebenito 2008, Mylonas y col 2010) (figura 3).

La síntesis de esteroides gonadales es llevada a cabo por células de la granulosa y de la teca en forma

conjunta, produciendo 17β-estradiol y esteroide inductor de la maduración (17α-20β-dihidroxi-4-pregnen-3ona), respectivamente (Nagahama 1983).

La acción fisiológica del 17β-estradiol es inducir la biosíntesis y secreción hepática de vitelogenina, la cual es liberada en la sangre y transportada hasta el ovario, en donde cumple un rol primordial durante la etapa de vitelo-génesis. La hormona 17α, 20β-dihidroxi-4-pregnen-3-ona, es altamente efectiva en la inducción de la maduración in vitro. Este esteroide es sintetizado por el folículo en respuesta a la gonadotrofina, encontrándose en elevadas concentraciones en el plasma de hembras que experimen-tan maduración final oocitaria (FOM) (Nagahama 1983), pero no sólo el folículo ovárico es el único secretor de esteroides gonadales, estructuras postovulatorias también participan en su secreción. Los folículos postovulatorios recientes han sido caracterizados por un alto grado de vascularización de la capa tecal e hipertrofia de las célu-las de la granulosa y al igual que en la granulosa de los folículos en crecimiento, existe evidencia de la actividad de enzimas involucradas en la producción de hormonas

Cuadro 1. Factores involucrados en disfunciones reproductivas causantes de atresia folicular en peces. Factors involved in reproductive dysfunctions causatives of follicular atresia in fish.

Factor Efecto o Alteración Especie(s) o Genero(s) Autor(es)

Agonistas estrogénicos y androgénicos

Probable interferencia de la maduración final oocitaria

Pimephales promelas Leino y col 2005.

Estrés ambiental Desequilibrio hormonal Chalcalburnus chalcoides Ünver y Ünver Saraydin 2004.

Temperatura elevada previo a la maduración

Detención del desarrollo ovárico Acipenser transmontanus Linares-Casenave y col 2002.

Fotoperiodo largo Inhibe regresión gonadal Bairdiella spp. yRhodeus spp.

Zanuy y Carrillo 1987.

Temperatura elevada del medio Ausencia de recrudescencia gonadal

Gillichthys mirabilis Zanuy y Carrillo 1987.

Melatonina Regresión o bloqueo del desarro-llo gonadal

Oryzias latipes Urasaki 1972.

Ondas de luz largas Inhibición de la maduración Plecoglossus sp. Lam 1983.

Presencia de mercurio en el medio

Regresión gonadal e inhibición de la ovulación

Oryzias latipes Lam 1983.

Altos niveles de zinc o cobre en el medio

Bajo número de oocitos ovulados.

Pimephales promelas Lam 1983.

Pesticidas (organoclorados) Inhibición hormona luteinizante (LH)

Oryzias latipes Lam 1983.

Temp. elevada constante durante madurez máxima

Bajo porcentaje de oocitos ovulados

Salmo clarki Smith y col 1983.

Falta de fotoperiodo decreciente Inhibición de la maduración Salmonídeos Billard y col 1978.

Carencia de fotoperiodo largo o temperatura elevada

Ausencia de maduración Notemigonus crysoleucas de Vlaming 1975.

Fotoperíodo alterado Probable interferencia de la maduración final oocitaria

Galaxias maculatus Datos sin publicar.

16

I VALDEBENITO Y COL

Figura 3. Esquema del mecanismo de control endocrino e interacción folicular en peces teleósteos. PDR pars distalis rostralis; PDP pars distalis proximalis; PI pars intermedia (modificado de Zanuy y Carrillo 1987). Model of endocrine control mechanism and follicular interaction in teleosts fish. PDR pars distalis rostralis; PDP pars distalis proximalis; PI pars intermedia (modified from Zanuy and Carrillo 1987).

esteroidales, lo que sugiere una similitud de los folículos postovulatorios con el cuerpo lúteo de los mamíferos, ya que en éstos existe biosíntesis de esteroides (Kagawa y col 1981, Nagahama y Kagawa 1982, Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995).

ATRESIA FOLICULAR

La atresia folicular se ha caracterizado como un proceso de degeneración que pueden sufrir algunos oocitos durante su desarrollo (Nagahama 1983, 1994), el cual se incrementa en poblaciones de cultivo o silvestres sometidas a altos grados de explotación o captura, pudiendo ser generado por distintas disfunciones o alteraciones reproductivas. Por ejemplo, en la especie Labeo victorianus (Boulenger, 1901), los investigadores Rutaisire y Booth (2004) examinaron

dos poblaciones silvestres en ríos distintos, determinándose distintos tipos de atresia para cada una de las poblaciones y una tasa de atresia mayor para la población con mayor presión de explotación.

DISFUNCIONES REPRODUCTIVAS INVOLUCRADAS

ASPECTOS GENERALES

Varias especies de peces exhiben disfunciones reproduc-tivas cuando son criadas en cautiverio. Comúnmente, son fallas en hembras cerca de la maduración final del oocito (FOM), ovulación o desove (Zohar 1988,1989a, b, Peter y col 1993). Estas disfunciones probablemente resultan de la combinación del estrés inducido por la cautividad (Sumpter

17

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

y col 1994, Pankhurst y van der Kraak 1997) y la falta de un ambiente adecuado para el desove natural (Zohar 1989a, b, Yaron 1995, Battaglene y Selosse 1996, Ohta y col 1997). Los peces criados en cautividad generalmente exhiben un acelerado crecimiento y maduración. Sin em-bargo, este ambiente puede fallar en proveer los cambios cíclicos requeridos para completar el ciclo reproductivo (Linares-Casenave y col 2002).

Los problemas reproductivos pueden ser clasificados en tres tipos:

El primero y más severo es ejemplificado por la anguila de agua dulce (Anguilla spp.), la cual experimenta una falla de la vitelogénesis cuando es mantenida en cautiverio, lo que también ha sido observado en grupos de lisas (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) mantenidas exclusivamente en agua salada en las cuales la vitelogénesis se detiene en etapas muy tempranas (de Monbrison y col 1997).

En el segundo tipo, la vitelogénesis progresa nor-malmente, pero al principio de la temporada de desove los oocitos postvitelogénicos fallan en la maduración oocitaria final y ovulación, convirtiéndose en atrésicos (Zanuy y Carrillo 1987, Tucker 1994, Berlinsky y col 1997, Larsson y col 1997, Mylonas y col 1997a, b). Este tipo de disfunción es el problema reproductivo más común encontrado en pisciculturas (Mylonas y col 2010). Como lo observado en la especies Galaxias maculatus (Jenyns, 1842) y P. promelas.

El tercer tipo corresponde a la ausencia de desove (puesta) al final del ciclo reproductivo. En especies que exhiben este problema, el oocito experimenta una vitelogénesis, FOM y ovulación normal en respuesta a los estímulos fisiológicos y ambientales, pero los oocitos ovulados no son liberados (Zanuy y Carrillo 1987, Zohar y Mylonas 2001). Este tercer tipo es presentado en todas las especies salmonídeas mantenidas en cultivo.

Las disfunciones o alteraciones reproductivas pueden producirse debido a una serie de factores extrínsecos e intrínsecos (cuadro 1) alterados, conllevando así a la aparición de atresia folicular:

FACTORES EXTRÍNSECOS

Factores externos como la temperatura, luz, salinidad y confinamiento juegan un papel preponderante en la maduración, ovulación y puesta, debido a su profunda influencia sobre la sensibilidad folicular, ya que se requie-ren señales ambientales precisas para su sincronización (Ekcstein 1975, Daettlaff y Davydova 1979, Sower y col 1982, Arantes y col 2010). La temperatura afecta el desarrollo gonadal a través de la acción directa sobre la gametogénesis, la secreción de hormonas hipofisiarias, la tasa de depuración hormonal, la respuesta del hígado a los estrógenos y, finalmente, sobre la respuesta de las gónadas a la estimulación (Zanuy y Carrillo 1987), lo cual ha sido demostrado en estudios de atresia folicular inducida por temperatura en el esturión blanco (Acipenser transmontanus

Richardson, 1836), un actinopterigio no teleósteo, donde hembras sometidas a medios con temperaturas mayores a las normales previo a la adquisición de competencia maduracional han detenido su desarrollo ovárico con la consecuente aparición posterior de atresia folicular (Linares-Casenave y col 2002). De manera similar, en la especie Gillichthys mirabilis (Cooper, 1864) la regresión gonadal es inducida en individuos sometidos a un régimen térmico elevado por un periodo prolongado. En muchas especies, además de temperaturas elevadas se requiere de fotoperíodos de días cortos. Sin embargo, en especies de los géneros Bairdiella y Rhodeus basta un fotoperíodo de días cortos para inducir la regresión gonadal (Zanuy y Carrillo 1987).

Como se mencionó anteriormente, la calidad espectral e intensidad luminosa también puede modificar la puesta. Se ha observado especies con un amplio espectro de respuesta y otras más selectivas donde longitudes de ondas cortas estimulan la maduración y ondas largas la inhiben (Lam 1983). La coincidencia existente entre niveles elevados de esteroides sexuales durante la recrudescencia gonadal y fotoperíodos decrecientes posteriores al solsticio de verano ha dado lugar a la hipótesis que en los salmonídeos los fotoperíodos decrecientes disparan la maduración gona-dal (Billard y col 1978). Al contrario, en Notemigonus crysoleucas (Mitchill, 1814) la maduración final de los oocitos y ovulación sólo se presenta en peces expuestos a regímenes de fotoperiodos largos y temperaturas elevadas. Cabe señalar que ambos factores por separado no fueron capaces de inducir la maduración y ovulación en dicha especie (de Vlaming 1975).

En algunas especies se ha advertido que la melatonina induce la regresión o bloquea el desarrollo gonadal en peces que están en las últimas etapas de recrudescencia gonadal durante la primavera a fotoperíodos cortos. Cabe señalar que la melatonina puede tener efectos anti o pro gonadotropos según la hora del día en que es administra-da. Además, se conoce la existencia de influencia lunar sobre la estación de puestas con la fase de vitelogénesis iniciada, por lo que es previsible que dicha influencia esté involucrada sólo en las etapas finales del ciclo reproductor, como son la maduración final, ovulación y puesta (Zanuy y Carrillo 1987).

En la “shemaya” (Chalcalburnus chalcoides Güldenstädt, 1772) se ha descrito la aparición de atresia folicular posterior al desove y ocasionalmente durante la etapa de maduración, presentándose en oocitos en cualquier etapa de desarrollo. Aparentemente, el estrés ambiental sería la principal causa de la atresia en esta especie (Ünver y Ünver Saraydin 2004).

Otros factores que pueden afectar la gametogénesis y puesta son la nutrición, el ambiente social tales como las feromonas, estímulos visuales y táctiles, corrientes de agua, oxígeno disuelto, presión barométrica, conta-minación, radiación, entre otros (Zanuy y Carrillo 1987, Leino y col 2005).

18

I VALDEBENITO Y COL

FACTORES INTRÍNSECOS

Del mismo modo, se han investigado factores internos que pueden alterar el proceso de oogénesis. Se ha observado que la presencia de la hormona madurativa en salmonídeos presenta niveles más elevados durante el periodo periovu-latorio, mientras que durante la incorporación activa de vitelo los niveles de esta hormona son más bajos (Fostier y col 1982, Ng e Idler 1983). Experimentalmente, se ha visto la imposibilidad de inducir la maduración en oocitos de la lubina (Dicentrarchus labrax Linnaeus, 1758) con ovarios en estado avanzado de vitelogénesis, a pesar de ser inyectada con hCG (gonadotrofina coriónica humana), demostrándose de esta forma que las hormonas de tipo madurativas son indispensables para que la maduración y ovulación se lleve a cabo. En peces tratados con un anticuerpo contra la gonadotrofina vitelogénica (FSH) se observó la detención de la vitelogénesis con posterior aparición de atresia folicular. Sin embargo, cuando se administraron anticuerpos contra la hormona madurativa no se observaron los efectos anteriores. Aparentemente, la señal que dispara irreversiblemente todo el proceso de maduración y ovulación en salmonídeos es la caída de los niveles plasmáticos de 17β-estradiol, debido a una merma en la actividad de la aromatasa de la granulosa y por consiguiente la pérdida de la retroalimentación negativa de los esteroides sobre la secreción de gonadotrofina, la que alcanzaría niveles máximos (Zanuy y Carrillo 1987, Zeilinger y col 2009).

En la carpita cabezona (P. promelas) se estudiaron las disrupciones endocrinas y cambios gonadales inducidos por químicos. Los agonistas de receptores de estrógenos provocaron un aumento en la incidencia de atresia folicular, probablemente debido a que altos niveles de vitelogenina interfieren con la maduración final. Sin embargo, ago-nistas más débiles como el Methoxychlor incrementaron la incidencia de atresia, pero sólo en algunas hembras. En el caso de los agonistas de receptores de andrógenos, estos incrementaron la atresia en folículos preovulatorios, muchos de los cuales adquirieron una apariencia inusual en su deposición de vitelo, la cual se vio disminuida en relación al tamaño del oocito. Los antagonistas de an-drógenos como Flutamine aumentaron la incidencia de folículos en desarrollo temprano y folículos atrésicos. Observaciones similares se describieron para inhibidores del metabolismo esteroide (Leino y col 2005).

CARACTERÍSTICAS DE LA ATRESIA FOLICULAR

Morfológicamente la atresia folicular comienza con la ruptura y vacuolización del corion (Santos y col 2008), además de la disolución de la membrana nuclear. Según el grado de desarrollo alcanzado por el oocito, su conte-nido de vitelo también será reabsorbido por fagocitosis desde las células de la granulosa (figura 4). La atresia folicular involucra la hipertrofia de las células de la

granulosa y posiblemente las células tecales (Nagahama 1983, Linares-Casenave y col 2002). Durante la atresia temprana las células de la granulosa remueven la cubierta del huevo y los contenidos oocitarios por digestión liso-somal y las células tecales son infiltradas por linfocitos (Linares-Casenave y col 2002). Esta puede presentarse en cualquier momento del desarrollo oocitario (Leonardo y col 2006, Ganias y col 2008), aunque lo más común es que aparezca en las fases de vitelogénesis y preovulatoria (Bromage y Cumaranatunga 1988). Desafortunadamente, los mecanismos que regulan la atresia folicular no están debidamente entendidos (Santos y col 2008), así como sus cambios estructurales, ultraestructurales y su correlación con cambios bioquímicos a nivel plasmático (Linares-Casenave y col 2002, Rutaisire y Booth 2004).

La atresia folicular y en algunos casos la aparición de necrosis están relacionadas con cambios patológicos debidos a afecciones sanitarias o condiciones degenerativas norma-les acompañados de cambios estacionales en la actividad gonadal (Takashima e Hibiya 1995). Los oocitos atrésicos (corpora atretica preovulatoria) son una característica muy común del ovario de los teleósteos (Ball 1960, Saidapur 1978), los cuales pueden presentarse tanto en peces de vida silvestre como en cautiverio (Leonardo y col 2006). Este proceso de degeneración se puede presentar particu-larmente bajo situaciones de estrés (Santos y col 2008) y condiciones ambientales adversas, especialmente en peces en cautiverio (Ball 1960, Linares-Casenave y col 2002). Como se mencionó, la presencia de ciertos contaminantes en el agua se han relacionado con la aparición de atresia folicular (Takashima e Hibiya 1995, Leino y col 2005), así como con alteraciones macroscópicas anormales en la morfología gonadal e inhibición de la oogénesis, además de tumores ováricos espontáneos o químicamente

Figura 4. Folículo atrésico de puye (Galaxias maculatus). CE cápsula externa; CR corion; VR vitelo en reabsorción. Barra = 50 µm (40x).

Atretic follicle of puye (Galaxias maculatus). CE external capsule; CR chorion; VR yolk in reabsorption. Scale bar = 50 µm (40x).

19

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

inducidos, tales como cistadenomas, fibromas, adenomas y linfosarcomas (Takashima e Hibiya 1995).

Los folículos atrésicos han sido descritos como un sitio de biosíntesis de esteroides en los teleósteos debido a su apariencia glandular (Ball 1960, Hoar 1969, Browning 1973). Sin embargo, en especies como el esturión blanco (A. transmontanus) se ha concluido que no existe evidencia morfológica de síntesis de hormonas en éstos (Linares-Casenave y col 2002, Leonardo y col 2006). Pruebas histoquímicas han fallado en demostrar cualquier actividad enzimática esteroidogénica, así como en la detección de progesterona, testosterona y 17β-estradiol en folículos atrésicos incubados con gonadotrofinas. Actualmente, diversos autores postulan que los folículos atrésicos están asociados sólo con degeneración y reabsorción de vitelo (Nagahama 1983).

Sin importar la razón por la cual los oocitos son reabsorbidos por el organismo, las especies en que se describe atresia folicular comparten un patrón común a nivel ultraestrutural, ya que todos los elementos constitu-tivos del folículo ovárico son reabsorbidos (teca externa, teca interna, células foliculares, corion y oocitos). Los gránulos de vitelo, en el caso de estar presentes, pierden su individualidad, constituyendo una masa amorfa acidófila. La apariencia de los folículos atrésicos se caracteriza por la carencia de una forma definida, presentando vacuolas y pequeñas escamas u hojuelas amarillentas (Honji y col 2006).

CLASIFICACIÓN DE LA ATRESIA FOLICULAR

Diversos autores han caracterizado y dividido el proceso de atresia folicular en distintas etapas según la especie estudiada, no existiendo unificación en su nomenclatura (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, algunos investigadores han dividido la atresia folicular de los teleósteos en cuatro etapas consecutivas de acuerdo a la descripción al microscopio óptico de Bretschneider y Duyvene de Wit (1947) en Rhodeus amarus (Bloch 1782). Otros autores como Vizziano y Beroi (1990) clasifican los folículos atrésicos como hipertróficos y no hipertró-ficos, correspondiendo a las fases de proliferación de células foliculares y reducción del tamaño del oocito, respectivamente (Uribe y col 2006). Khoo (1975) entrega una descripción detallada de los cambios histológicos de la atresia folicular en el “goldfish” después de reali-zada su hipofisectomía, clasificándola en cinco etapas consecutivas: alfa (α), beta (β), gamma (γ), delta (δ) y épsilon (ε). Para mayores detalles, se recomienda revisar el trabajo de este autor.

La atresia observada por Tricas e Hiramoto (1989) en Chaetodon multicinctus (Garrett 1863) es cualitativamente similar a la descrita en otras especies, los oocitos vitelo-génicos que presentan su desarrollo detenido, muestran distintas etapas degenerativas de atresia:

Alfa: Caracterizada por ondulaciones del corion, disrup-ción nuclear, quiebre temprano de glóbulos de vitelo e hipertrofia de células de la granulosa.

Beta: Las células de la granulosa migran y fagocitan el vitelo. Las células de la teca no son observadas invadiendo el interior del oocito. El final de la atresia beta es caracte-rizada por la completa desintegración del corion.

Gamma: La reabsorción del contenido oocitario continúa durante esta etapa, hasta la reabsorción completa del contenido. Se presentan folículos pequeños y de aspecto irregular (posibles células luteales) de coloración amarillo-naranjo con tinción HyE. Las células tecales del folículo todavía rodean el oocito remanente.

Delta: Es caracterizada por la presencia de compo-nentes residuales después de la reabsorción de vitelo y citoplasma.

Épsilon: Algunos autores han postulado que en esta etapa “células del cuerpo lúteo se podrían diferenciar en nuevas células oogoniales” (Khoo 1975).

En estudios del “ningu” (L. victorianus), los autores Rutaisire y Booth (2004) clasifican la atresia folicular en tres tipos, según las características histológicas observadas:

a) Caracterizada por la rápida fragmentación del corion y disolución del contenido citoplasmático, observán-dose oocitos liquefactos además de una disminución de éstos. Este tipo de atresia es más común en oocitos terciarios de ovarios desovados exitosamente.

b) Fue observada en oocitos en estado de vesícula de vitelo II, estando determinada por el quiebre de los glóbulos vitelinos en gránulos más pequeños, acom-pañado de degeneración vacuolar del citoplasma con un corion intacto, no se observaron signos de fagoci-tosis. La presencia de atresia tipo II, generalmente está relacionada con una falla o interrupción en el desove, teniendo esta una alta prevalencia en el estudio con-ducido por Rutaisire y Booth (2004). Sin embargo, en este tipo de atresia el ovario reabsorbió activamente los oocitos maduros para facilitar la recrudescencia gonadal.

c) Fue encontrada en baja frecuencia y sólo en oocitos previtelogénicos, caracterizándose por una degenera-ción de los oocitos debido a una tumefacción celular poco nítida al microscopio óptico, no se observó la invasión y fagocitosis de los folículos a diferencia de lo descrito para otras especies.

DESCRIPCIONES DE LA ATRESIA FOLICULAR EN PECES

En el esturión blanco (A. transmontanus) en una primera etapa se inicia la degeneración del corion, lo que

20

I VALDEBENITO Y COL

se manifiesta por la desaparición de sus estriaciones. A diferencia de otras especies se observan agregaciones de material nuclear en el citoplasma de folículos atrésicos tempranos. La corteza citoplasmática aparece desorgani-zada con agregaciones densas de gránulos de glicógeno y algunos glóbulos de lípidos se fusionan incrementando su tamaño. La lámina basal permanece intacta a pesar de la fagocitosis sufrida por el corion. En una etapa intermedia se produce la digestión del corion y la capa tecal aparece vascularizada e incrementada en su espesor con una lámina basal aún intacta. A medida que la etapa intermedia progresa, la lámina basal se degenera y las plaquetas de vitelo y gotas lipídicas son fagocitadas. Este cuerpo atrésico permanece encapsulado por una capa celular vascularizada. Posteriormente, en una etapa avanzada de la atresia las células fagocíticas comparti-mentalizan el citoplasma. Durante esta fase las plaquetas de vitelo desaparecen, aunque los lípidos e inclusiones de pigmentos permanecen por un tiempo prolongado. Los cuerpos atrésicos multicelulares formados en esta última etapa persisten en el ovario por muchos meses, exhibiendo una reducción gradual en el tamaño celular y concomitantemente una acumulación de pigmento oscuro. Las observaciones indican que la sensibilidad a la temperatura ocurriría en la oogénesis tardía, durante el periodo de síntesis de proteínas requeridas para que el oocito adquiera su competencia maduracional. Las etapas tempranas e intermedias de la atresia transcurren bastante rápido, la última etapa puede durar hasta más de cinco meses a temperaturas elevadas en esta especie (Linares-Casenave y col 2002).

Se postula que las células foliculares poseen la ha-bilidad de adquirir características fagocitarias, lo que ha sido observado durante la fagocitosis de folículos atrésicos en algunos peces. Histológicamente se ha ca-racterizado por áreas de tinción color marrón con HyE (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, en el esturión blanco (A. transmontanus) las células transformadas de la granulosa sólo aparecen en la fase inicial de di-gestión del oocito. En este mismo estudio las células tecales aparecen involucradas en los principales cambios fibróticos del folículo, los que resultan en la formación de una densa cápsula alrededor del cuerpo atrésico sin participar en la fagocitosis. El destino del pigmento de melanina del oocito y el origen del pigmento oscuro en folículos atrésicos no está claro. Estas observaciones han sido descritas en muchos estudios de teleósteos y anfibios. Pareciera ser que estos pigmentos están asociados a fagocitosis del oocito y degeneración de células fagocíticas en cuerpos atrésicos avanzados (Linares-Casenave y col 2002).

En algunas especies como la trucha arco iris se ha obser-vado atresia vinculada a apoptosis en folículos preovulatorios (Wood y van der Kraak 2001), pero no ha sido descrito en el esturión blanco. Cabe señalar que en las últimas etapas de atresia los cuerpos atrésicos compuestos de masas de

células experimentan una reducción en su tamaño debido a una baja en el número de células, sugiriendo la apoptosis de células transformadas de la granulosa, lo que podría jugar un rol durante las últimas etapas de la atresia folicular en el esturión blanco (Linares-Casenave y col 2002).

En la sardina ibérica (Sardina pilchardus Walbaum 1792) se ha descrito la separación de los folículos atrésicos pre-ovulatorios tardíos del epitelio, los cuales se concentran en la parte central de las laminillas ovígeras (Ganias y col 2007). Este patrón también ha sido observado en otros peces como la lisa (M. cephalus) por los autores McDonough y col (2005). Los folículos atrésicos tardíos permanecen en el ovario por largos periodos, extendién-dose incluso hasta la próxima temporada de desove. Esta separación del epitelio laminar constituye un mecanismo para administrar el espacio disponible para los nuevos oocitos de la próxima temporada de desove (Ganias y col 2007).

A nivel histológico la atresia folicular tardía puede ser confundida con los folículos postovulatorios (POFs) de más de 24 horas (Macchi y col 2003, Ganias y col 2007). La duración de la degeneración de los folículos posto-vulatorios varía según la especie, desde menos de un día hasta más de una semana. Histológicamente estas pueden diferenciarse debido a que durante todas las etapas de la atresia folicular, el folículo está cercado dentro de estructuras celulares. Por el contrario, los POFs siempre conservan una abertura hacia el lumen ovárico y no son separados del epitelio de las laminillas, manteniéndose en el epitelio hasta completar su reabsorción (Ganias y col 2007).

En la carpita cabezona (P. promelas) el inicio de la atresia folicular está dada por el quiebre o aberturas del corion, posteriormente el núcleo y el material vitelino inician su degeneración, provocando la reabsorción del vitelo, lo que se distingue por una débil tinción del folículo. Leino y col (2005) reportaron la aparición de altos niveles de atresia folicular en tres gónadas de un total de veintisiete, la cual se presentó principalmente en folículos maduros, lo que indicaría que estas hembras “perdieron” su oportunidad para desovar. En cultivos experimentales de carpita cabezona (P. promelas) la incidencia de atresia es relativamente baja (Jensen y col 2001, Leino y col 2005), oscilando entre 1,6% a 4,6% en algunos experimentos (Leino y col 2005).

En el bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus 1766), un pez migrador de los ríos sudamerica-nos, se observó la aparición de procesos de degeneración ováricos cuando éstos fueron mantenidos en confinamiento y no se indujo su reproducción durante un experimento controlado, en el cual se dividió la población en grupos que fueron muestreados histológicamente a lo largo de un periodo de tiempo. En el primer grupo se encontraron oocitos en diferentes etapas de desarrollo. La atresia ob-servada se caracterizó de forma similar a la encontrada en otras especies por hipertrofia de las células foliculares,

21

reproducción de peces, oogénesis, folículo ovárico, atresia folicular

corrugación del corion y algunas vacuolas en el ooplasma periférico. en el segundo grupo los ovarios presentaban gran cantidad de oocitos alterados, alrededor de un 10% más que en la etapa previa. Microscópicamente estos pre-sentaban la pérdida de su forma redondeada, mostrando desorganización nuclear y citoplasmática. su núcleo se presentó ligeramente excéntrico y a nivel citoplasmá-tico se observaron grandes cantidades de gránulos de diferentes tamaños. las células foliculares presentaban una hipertrofia severa, penetrando los alrededores del interior oocitario y gránulos de vitelo emergían entre las células foliculares. el corion estaba altamente corrugado y roto. en el tercer y cuarto grupo los ovarios contenían gran cantidad de oocitos perinucleares y pocos oocitos atrésicos, los cuales poseían un corion corrugado y en muchos casos completamente desintegrado. la mayor parte de los gránulos de vitelo estaban desintegrados y sólo una pequeña cantidad de vitelo permanecía en el centro del oocito. esta etapa final marcó la completa degeneración oocitaria, con presencia de fagocitosis y vasos sanguíneos. los eventos morfológicos observados son similares a los descritos en otras especies de peces de agua dulce nativas del Brasil. los primeros signos de atresia ovárica y folicular aparecieron a finales de enero, coincidiendo con la caída en los valores de la tempe-ratura del agua, días más cortos y disminución en las lluvias, lo que supondría que el estrés ambiental induce la atresia folicular en el caso de esta especie (leonardo y col 2006). por otra parte, en la lubina (D. labrax) Zanuy y col (1995) observaron un mayor número de oocitos atrésicos en individuos mantenidos en un fotoperiodo de días largos constantes y un régimen térmico alterado respecto al grupo control bajo condiciones naturales de luz y temperatura.

en la anguila de pantano (Synbranchus marmoratus Bloch 1795) el inicio de la atresia puede ser detecta-do por cambios en las células foliculares, las cuales modifican su apariencia de planas o cuboidales a una apariencia cilíndrica y vacuolada. estas últimas parti-ciparían de forma activa en el proceso de fagocitosis agrupándose en masas epitelioides en etapas avanzadas de fagocitosis. estas estructuras atrésicas muestran una intensa fluorescencia bajo luz ultravioleta (uv). al final del proceso, las células fagocíticas, granulocitos degenerativos y remanentes foliculares permanecen juntos formando una estructura heterogénea compacta (ravaglia y Maggese 2002).

en el “huaiquil” (Micropogonias furnieri desmarest, 1823) se han registrado incrementos en los porcentajes de atresia folicular, en poblaciones del estuario del río de la plata, en las cuales se observó un incremento en la atresia folicular, variando desde un 20% durante la primera temporada reproductiva hasta un 60% en la segunda temporada (Macchi y col 2003). además, se observó un aumento en la presencia de oocitos atrésicos a medida que la temporada de desove progresaba, lo que

coincide con lo descrito por valdebenito y col (1995) en poblaciones de esta especie del lago Budi en el sur de chile. los altos niveles de atresia han sido usados para establecer el final del desove en esta especie (Macchi y col 2003).

en poblaciones silvestres de sardina monterrey (sardina española) (Sardinops sagax Jenyns 1842) se estimaron los porcentajes de atresia folicular, concluyéndose que un 2% puede ser considerado normal. sin embargo, al final de la temporada este porcentaje se eleva a un 5%, lo que indica el final del máximo de puesta, aunque se ha descrito la reabsorción generalizada de los oocitos. cuando sobre el 50% de los oocitos es afectado se denomina atresia mayor, lo que generalmente coincide con el final de la temporada de desove. una vez alcanzado este nivel de reabsorción, se reduce la probabilidad que estas hembras desoven nuevamente. el proceso de atresia mayor es una problemática poco estudiada en poblaciones silvestres. en la sardina monterrey la atresia puede presentarse en oocitos durante los primeros estadios de desarrollo hasta en oocitos previos al desove. las posibles causas de atresia mayor se han vinculado con condiciones de baja temperatura, problemas nutricionales, hacinamiento y contaminantes. establecer las causas de la interrupción del desarrollo ovárico es difícil. sin embargo, se ha re-lacionado la atresia de folículos con vitelo en sardinas adultas con condiciones o cambios ambientales que puedan interrumpir la puesta (torres-villegas y col 2007). en el caso de la lubina (D. labrax) Zanuy y col (1995) demostraron que una manipulación inadecuada del foto-periodo y la temperatura para alterar la época de puestas, indujo una atresia generalizada dando lugar a una drástica disminución de la fecundidad. en la sardina monterrey (S. sagax) la aparición de atresia en oocitos sin vitelo se asocia a factores de condición corporal subóptimos, lo que sugiere un efecto ambiental a largo plazo e inanición prolongada, ya que esta atresia se presentó principalmente en peces pequeños. el análisis histológico de la atresia folicular reveló una alta incidencia en el porcentaje de atresia de oocitos en estado de alvéolo cortical desde el inicio de la temporada reproductiva, observándose también atresia alfa y beta sin vitelo. Hacia finales de invierno e inicio de primavera se observó la presencia de atresia mayor en el 90% de las hembras, coincidiendo con el máximo de puesta de la temporada reproductiva, además de observarse atresia en oocitos en vitelogénesis avanzada (torres-villegas y col 2007).

en algunos peces pelágicos la frecuencia de atresia es alta de forma normal, alcanzando valores cercanos al 20% en especies como Trachurus trachurus (linnaeus 1758) (torres-villegas y col 2007). lee y Yang (2002) obser-varon la aparición de atresia folicular en alrededor de un 60% en la especie Lateolabrax maculatus (Mcclelland, 1844), la cual fue capturada desde un ambiente silvestre y posteriormente mantenida a una temperatura y horas de

22

i valdeBenito Y col

luz constantes, la atresia fue vinculada a una disminución de la temperatura.

se ha postulado a la atresia como un mecanismo de reciclaje que permite recuperar componentes y energía de oocitos que no alcanzaron su desarrollo (uribe y col 2006). sin embargo, algunos autores postulan que la atresia sólo se trataría de un proceso de apoptosis (torres-villegas y col 2007). aparentemente, el proceso de atresia se presenta como una vía alternativa dentro del desarrollo del ciclo ovárico en peces, permitiendo la creación de un ambiente tisular óptimo a nivel gonadal para las futuras temporadas reproductivas. sin embargo, este proceso se puede presentar de dos formas:

“Normal”, con reabsorción activa de todos los constituyentes foliculares por parte de células especializadas del folículo y estructuras ováricas adyacentes, la que se puede presentar en cualquier etapa del desarrollo oocitario, con vacuolización y licuefacción del vitelo en estados más avanzados.

“Patológica” donde no ocurre reabsorción del contenido oocitario, la que de forma general se presenta en oocitos durante etapas de desarrollo avanzado posteriores a la vitelogénesis, produciendo un endurecimiento irreversi-ble del vitelo que puede hipertrofiar el ovario y causar finalmente la muerte de la hembra. esta atresia patológica se ha presentado con frecuencia en especies como el puye (G. maculatus) en poblaciones sometidas al estrés estando bajo condiciones de cultivo experimental. en dicha especie, los ovarios presentan un gran aumento de volumen, rompiendo incluso la pared abdominal en casos extremos, mostrándose duros al corte, lo que

indicaría una alta presencia de minerales. las causas de la atresia patológica en esta especie son aún descono-cidas. sin embargo, su incidencia es mayor en grupos mantenidos con fotoperiodos alterados, presentándose como un proceso crónico, donde aparentemente estarían involucrados procesos fisiológicos alterados del pez, tales como alteraciones inmunológicas o del balance mineral, dadas las características gonadales observadas (cuadro 2). este tipo de atresia ha sido descrita por Mitchell (1989) para poblaciones neozelandesas de la misma especie bajo cultivo experimental y en especies no teleósteas como el esturión (ruban y col 2006).

conclusiones

la atresia folicular es un proceso multifuncional, donde los estímulos ambientales aparecen como los más relevantes y más específicamente los que hacen referencia al fotoperiodo y la temperatura.

los cambios histológicos de la atresia a nivel folicular son muy similares entre las distintas especies estudiadas, por lo que la descripción de los caracteres anátomo-his-tológicos de la atresia folicular realizados por diferentes autores no presenta grandes variaciones. a pesar de esto, no existe una nomenclatura clara para la descripción del proceso de atresia folicular.

la atresia folicular “normal” se presenta como un proceso estratégico establecido dentro del ciclo de de-sarrollo gonadal de diversas especies, el cual permite un reciclaje energético bajo condiciones adversas. sin embargo, este proceso puede verse alterado en algunas especies.

Cuadro 2. características generales de los tipos de atresia folicular en peces. general characteristics of atresia types in fish.

parámetro evaluado atresia “normal” atresia “patológica”

etapa del desarrollo folicular cualquier etapa del desarrollo folicular etapas avanzadas (vitelogénesis en adelante)

ovulación presente, aunque puede variar (atresia mayor) ausente, todos los folículos comprometidos

tamaño ovárico normal aumentado de volumen

consistencia ovárica tejido normal, relativa laxitud duro, firme al corte, probablemente mineralizado

condiciones ambientales tanto en vida silvestre, como en condiciones de cultivo

condiciones de cultivo controlado

ocurrencia generalmente al final del ciclo reproductivo cualquier momento del ciclo reproductivo

prevalencia variable, según etapa de la estación reproductiva alta en algunas cohortes

estado del vitelo licuefacto con presencia de vacuolas endurecido

reabsorción activa por fagocitosis y/o apoptosis ausente

factores causantes comprometidos

extrínsecos, relacionados con estímulos ambientales

extrínsecos e intrínsecos

23

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

La atresia folicular “patológica” afecta a individuos con alto nivel de estrés, en los cuales debido a factores internos no pueden mantener una adecuada homeostasis de sus procesos fisiológicos, lo que altera la ovogénesis en cualquiera de sus etapas, pudiendo llevar a la muerte de la hembra si el proceso se detiene durante la etapa final de desarrollo del oocito.

RESUMEN

Muchas especies de peces de importancia económica han sido intensamente explotadas, provocando el colapso de sus pesquerías. Por este motivo, en algunas de estas especies se han hecho intentos por lograr cultivar individuos con fines comerciales, obteniendo relativo éxito. Se ha observado que cuando algunas especies son mantenidas en cautiverio o bajo intensa presión de explotación en su medio natural presentan disfunciones reproductivas que conducen a la aparición de atresia folicular. Este es un proceso poco estudiado en peces y la caracterización realizada por varios autores, arroja diferencias de criterios y nomenclatura que dificultan aún más su comprensión. El objetivo de la presente investigación es realizar una revisión bibliográfica de la atresia folicular en peces y contribuir a su comprensión y estudio. La atresia folicular es un proceso degenerativo observado en algunos oocitos en cualquier momento de su desarrollo. La aparición de atresia folicular se ha relacionado con condiciones degenerativas normales debido a cambios estacionales en la actividad gonadal, afecciones sanitarias, o bien, a condiciones de manejo inadecuadas en peces mantenidos en cultivo. Este proceso se ha postulado como un mecanismo que permite reciclar componentes y energía. Sin embargo, en especies como el puye (Galaxias maculatus), la trucha garganta cortada (Salmo clarki), entre otras, se ha observado la presencia de una atresia folicular con características patológicas, en la cual la reabsorción del vitelo no ocurre, causando el endurecimiento de los folículos más desarrollados, lo que puede conducir finalmente a la muerte de la hembra.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo del proyecto FONDEF D06I1020 y a la Dirección de Investigación de la Universidad Católica de Temuco a través del proyecto DGIUCTemuco Nº 2007-DGI-CDA-05. Además, al Dr. Manuel Carrillo por la revisión y observaciones al manuscrito, y al Dr. Adrián Hernández en la corrección del resumen en inglés.

REFERENCIAS

Arantes FP, HB Santos, E Rizzo, Y Sato, N Bazzoli. 2010. Profiles of sex steroids, fecundity, and spawning of the curimatã-pacu Prochilodus argenteus in the São Francisco River, downstream from the Três Marias Dam, Southeastern Brazil. Anim Reprod Sci 118, 330-336.

Ball JN. 1960. Reproduction in female bony fishes. Symp Zool Soc Lond 1, 105-135.

Battaglene SC, PM Selosse. 1996. Hormone-induced ovulation and spawning of captive and wild broodfish of the catadromous Australian bass, Macquaria novemaculeata (Steindacher), (Percichthyidae). Aquac Res 27, 191-204.

Begovac P, R Wallace. 1988. Stages of oocyte development in the pipefish Syngnathus scovelly. J Morphol 197, 353-369.

Berlinsky DL, K William, RG Hodson, CV Sullivan. 1997. Hormone induced spawning of summer flounder Paralichthys dentatus. J World Aquacult Soc 28, 79-86.

Billard R, B Breton, A Foster, B Jalabert, C Well. 1978. Endocrine control of teleost reproductive cycle and its relation to external fac-tors: salmonid and cyprinid models. In: Gallard PJ, Boer HH (eds).

Comparative Endocrinology. Elsevier/North- Holland Biomedical Press, Amsterdam, New York, USA, Pp 37-48.

Bretschneider LH, JJ Duyvene de Wit. 1947. Sexual endocrinology of non-mammalian vertebrates. Monographs on the progress of research in Holland during the war. Vol. II. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands.

Bromage N, R Cumaranatunga. 1988. Egg production in the rainbow trout. In: Muir JF, Roberts RJ (eds). Recent advances in aquaculture. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, Pp 64-138.

Browning HC, 1973. The evolutionary history of the corpus luteum. Biol Reprod 8, 128-157.

Daettlaff TA, MN Davydova. 1979. Differential sensitivity of cells of follicular epithelium and oocytes in the stellate sturgeon to unfavor-able conditions, and correlating influence of triiodothyronine. Gen Comp Endocrinol 39, 236-243.

de Monbrison D, I Tzchori, MC Holland, Y Zohar, Z Yaron, A Elizur. 1997. Acceleration of gonadal development and spawning induc-tion in the Mediterranean grey mullet, Mugil cephalus: preliminary studies. Isr J Aquacult-Bamid 49, 214-221.

de Vlaming VL. 1975. Effects of photoperiod and temperature on go-nadal activity in the cyprinid teleost (Notemigonus crysoleucas). Biol Bull 148, 402-415.

Ekcstein B. 1975. Possible reasons for the infertility of grey mullets confined to fresh water. Aquaculture 5, 9-17.

Fostier A, R Billard, B Breton, M Legendre, S Marlot. 1982. Plasma 11 –oxo- testosterone and gonadotripin during the beginning of spermation in the rainbow trout Salmo gairdneri R. Gen Comp Endocrinol 46, 428-434.

Ganias K, C Nunes, Y Stratoudakis. 2007. Degeneration of postovulatory follicles in the Iberian sardine Sardina pilchardus: structural changes and factors affecting resorption. Fish Bull 105, 131-139.

Ganias K, C Nunes, Y Stratoudakis. 2008. Use of late ovarian atresia in describing spawning history of sardine, Sardina pilchardus. J Sea Res 60, 297-302.

Hafez B, ESE Hafez. 2002. Foliculogénesis, maduración del óvulo y ovulación. En: Hafez B, Hafez ESE (eds). Reproducción e insemi-nación artificial en animales. 4a ed. McGraw-Hill Interamericana Editores S.A., México, Pp 70-83.

Hoar WS. 1969. Reproduction. In: Hoar WS, Randall DJ (eds). Fish Physiology, Vol. III. Academic Press, New York, USA, Pp 1-72.

Honji R, A Vaz-dos-Santos, CL Rossi-Wongtschowski. 2006. Identification of the stages of ovarian maturation of the Argentine hake Merluccius hubbsi Marini, 1933 (Teleostei: Merlucciidae): advantages and disadvantages of the use of the macroscopic an microscopic scales. Neotrop Ichthyol 4, 329-337.

Jensen KM, JJ Korte, MD Kahl, MS Pasha, GT Ankley. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 128, 127-141.

Kagawa H, K Takano, Y Nagahama. 1981. Correlation of plasma estradiol-17β and progesterone levels with ultrastructure and histochemistry of ovarian follicles in the white-spotted char, Salvelinus leucomaenis. Cell Tissue Res 218, 315-329.

Khoo KH. 1975. The corpus luteum of goldfish (Crassius auratus L.) and its functions. Can J Zool 53, 1306-1323.

Lam TJ. 1983. Environmental influences on gonadal activity in fish. In: Hoar WS, Randall DJ, Donaldson EM (eds). Fish Physiology, Vol IX B. Academic Press, New York, USA, Pp 65-116.

Larsson DGJ, CC Mylonas, Y Zohar, LW Crim. 1997. Gonadotropin releasing hormone-analogue (GnRH- A) advances ovulation and improves the reproductive performance of a cold-water batch-spawning teleost the yellowtail flounder (Pleuronectes ferrugineus). Can J Fish Aquat Sci 54, 1957-1964.

Lee WK, SW Yang. 2002. Relationship between ovarian development and serum levels of gonadal steroids hormones, and induction of oocyte maturation and ovulation in the cultured female Korean spotted sea bass Lateolabrax maculatus. Aquaculture 207, 169-183.

24

I VALDEBENITO Y COL

Leino L, K Jensen, G Ankley. 2005. Gonadal histology and character-istic histopathology associated with endocrine disruption in the adult fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Pharmacol 19, 85-98.

Le Menn F, B Davail, C Pelissero, P N’Diaye, E Bon, L Perazzolo, J Nunez-Rodriguez. 2000. A new approach to fish oocyte vitellogenesis. In: Norberg B, Kjesbu OS, Taranger GL, Andersson E, Stefansson SO (eds). Proceedings of the 6th International Symposium on the Reproductive Physiology of Fish, Bergen, Norway, Pp 281-284.

Leonardo AFG, E Romagosa, SR Batlouni, MI Borella. 2006. Occurrence and significance of ovarian and follicular regression in cachara Pseudoplatystoma fasciatum (Linnaeus, 1766): a histology approach. Arq Bras Med Vet Zootec 58, 831-840.

Linares-Casenave J, JP Van Eenennaam, SI Doroshov. 2002. Ultrastructural and histological observations on temperature-induced follicular ovarian atresia in the white sturgeon. J Appl Ichthyol 18, 382-390.

Luckenbach JA, M Kusakabe, P Swanson, G Young. 2008. Unilateral ovariectomy increases egg size and reduces follicular atresia in the semelparous Coho Salmon, Oncorhynchus kisutch. J Exp Zool Part A 309, 468-476.

Macchi G, E Acha, M Militelli. 2003. Seasonal egg production of whitemouth croaker (Micropogonias furnieri) in the Río de la Plata estuary, Argentina-Uruguay. Fish Bull 101, 332-342.

McDonough CJ, WA Roumillat, CA Wenner. 2005. Sexual differentiation and gonad development in striped mullet (Mugil Cephalus L.) from South Carolina estuaries. Fish Bull 103, 601-619.

Mitchell C. 1989. Laboratory culture of Galaxias maculatus and potential applications. New Zeal J Mar Freshwat Res 23, 325-336.

Mylonas C, L Woods III, Y Zohar. 1997a. Cyto-histological examination post-vitellogenesis and final oocyte maduration in captive-reared striped bass. J Fish Biol 50, 34-49.

Mylonas C, Y Magnus, A Gissis, Y Klebanov, Y Zohar. 1997b. Reproductive biology and endocrine regulation of final oocyte maturation of cap-tive white bass. J Fish Biol 51, 234-250.

Mylonas C, A Fostier, S Zanuy. 2010. Broodstock management and hormonal manipulation of fish reproduction. Gen Comp Endocrinol 165, 516-534.

Nagahama Y, H Kagawa. 1982. In vitro steroid production in the postovula-tory follicles of the amago salmon, Oncorhynchus rhodurus, in response to salmon gonadotropin. J Exp Zool Part A 219, 105-109.

Nagahama Y. 1983. The functional morphology of teleost gonads. In: Hoar WS, Randall DJ, Donaldson EM (eds) Fish Physiology, Vol. IX A. Academic Press, New York, USA, Pp 223-276.

Nagahama Y. 1994. Endocrine regulation of gametogenesis in fish. Int J Dev Biol 38, 217-229.

Ng TB, DR Idler. 1983. Yolk formation and differentiation in te-leosts fishes. In: Hoard WS, Randall DJ, Donaldson EM (eds). Fish Physiology, Vol. IX A. Academic Press, New York, USA, Pp 373-404.

Ohta H, H Tanaka. 1997. Relationship between serum levels of human chorionic gonadoptropin (hCG) and 11-ketotestosterone after a single injection of hCG and induced maturity in the male Japanese eel, Anguilla japonica. Aquaculture 153, 123-134.

Pankhurst NW, G van der Kraak. 1997. Effects of stress on reproduc-tion and growth of fish. In: Iwama GK, Pickering AD, Sumpter JP, Schreck CB (eds). Fish Stress and Health in Aquaculture. Cambridge University Press, Cambridge, UK, Pp 73-93.

Peredo S, C Sobrazo. 1993. Microestructura del ovario y ovogénesis en Galaxias maculatus (Jenyns, 1842). Biol Pesq 22, 23-32.

Peter RE, HR Lin, G van der Kraak, EM Little. 1993. Releasing hormones, dopamine antagonists and induced spawning. In: Muir JF, Roberts RJ (eds). Recent advances in aquaculture. Blackwell Scientific, Oxford, UK, Pp 25-30.

Ravaglia MA, MC Maggese. 2002. Oogenesis in the swamp eel Synbranchus marmoratus (Bloch, 1795) (Teleostei; synbranchidae). Ovarian anatomy, stages of oocyte development and micropyle structure. Biocell 23, 325-337.

Ruban GI, NV Akimova, VB Goriounova, EV Mikodina, MP Nikolskaya, VG Shagayeva, MI Shatunovsky, SA Sokolova. 2006. Abnormalities in Sturgeon gametogenesis and postembryonal ontogeny. J Appl Ichthyol 22, 213-220.

Rutaisire J, A Booth. 2004. A histological description of ovarian re-crudescence in two Labeo victorianus populations. Afr J Aquat Sci 29, 221-228.

Saidapur SK. 1978. Follicular atresia in the ovaries of non mammalian vertebrates. Int Rev Cytol 54, 225-244.

Santos HB, RG Thomé, FP Arantes, Y Sato, N Bazzoli, E Rizzo. 2008. Ovarian follicular atresia is mediated by heterophagy, autophagy, and apoptosis in Prochilodus argenteus and Leporinus taeniatus (Teleostei: Characiformes). Theriogenology 70, 1449-1460.

Smith CE, WP Dwyer, RG Piper. 1983. Effect of water temperature on egg quality of cutthroat trout. Prog Fish-Cult 45, 176-178.

Sower SA, B Schreck, EM Donaldson. 1982. Hormone induced ovula-tion of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) held in sea water and fresh water. Can J Fish Aquat Sci 39, 627-632.

Sumpter JP, TG Pottinger, M Rand-Weaver, PM Campbell. 1994. The wide-ranging effects of stress on fish. In: Davey KG, Peter RE, Tobe SS (eds). Perspectives in Comparative Endocrinology. National Research Council, Ottawa, Canada, Pp 535-538.

Takashima F, T Hibiya. 1995. IX Gonads. In: Takashima F, Hibiya T (eds). An atlas of fish histology: Normal and Pathological Features. 2nd ed. Kodansha Ltd., Tokyo, Japan, Pp 128-153.

Torres-Villegas R, RI Ochoa-Báez, L Perezgómez, G García-Melgar. 2007. Estimaciones de atresia mayor en la temporada reproductiva 1999-2000 en la sardina monterrey (Sardinops sagax) en Bahía Magdalena, México. Rev Biol Mar Oceanogr 42, 299-310.

Tricas T, J Hiramoto. 1989. Sexual differentiation, gonad development, and spawning seasonality of the Hawaiian butterflyfish, Chaetodon multicinctus. Environ Biol Fish 25, 111-124.

Tucker JW. 1994. Spawning by captive serranid fishes: a review. J World Aquacult Soc 25, 345-359.

Tyler CR, JP Sumpter. 1996. Oocyte growth and development in teleosts. Rev Fish Biol Fisher 6, 287-318.

Ünver B, S Ünver Saraydin. 2004. Histological examination of ovarium development of shemaya Chalcalburnus chalcoides living in Lake Tödürge (Sivas/Turkey). Folia Zool 53, 99-106.

Urasaki H. 1972. Effects of restricted photoperiod and melatonin administration on the gonadal weight in the Japanese killifish. J Endocrinol 55, 619-620.

Uribe MC, G De la Rosa, A García, S Guerrero-Estévez, M Aguilar. 2006. Características histológicas de los estadios de atresia de folículos ováricos en dos especies de teleósteos vivíparos: Ilyodon whitei (Meek, 1904) y Goodea atripinnis (Jordan, 1880) (Goodeidae). Hidrobiológica 16, 67-73.

Valdebenito I, S Peredo, K González, C Sobarzo. 1995. Ciclo repro-ductivo anual del “Huaiquil o Roncador” (Micropogonias furnieri Desmarest, 1823 Sin. Micropogon manni Moreno, 1970) (Pisces: Sciaenidae) del Lago Budi. Estud Oceanol 14, 29-37.

Valdebenito I. 2008. Terapias hormonales utilizadas en el control arti-ficial de la madurez sexual en peces de cultivo: una revisión. Arch Med Vet 40, 115-123.

Van der Oost R, J Beyer, NPE Vermeulen. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environ Toxicol Pharmacol 13, 57-149.

Vizziano D, N Berois. 1990. Histología del ovario de Macrodon ancylodon (Bloch y Schneider, 1801) (Teleostei: Scianediae). Ovogénesis. Folículos post-ovulatorios. Atresia. Rev Bras Biol 50, 523-536.

Wallace RA, K Selman. 1980. Oogenesis in Fundulus heteroclitus. II. The transition from vitellogenesis into maturation. Gen Comp Endocrinol 42, 345-354.

Wallace RA, K Selman. 1981. Cellular and dynamic aspects of oocyte growth in teleosts. Amer Zool 21, 325-343.

West G. 1990. Methods of assessing ovarian development in fishes: a review. Aust J Mar Freshwat Res 41, 199-222.

25

REPRODUCCIÓN DE PECES, OOGÉNESIS, FOLÍCULO OVáRICO, ATRESIA FOLICULAR

Zeilinger J, T Steger-Hartmann, E Maser, S Goller, R Vonk. R Länge. 2009. Effects of synthetic gestagens on fish reproduction. Environ Toxicol Chem 28, 2663-2670.

Zohar Y. 1988. Gonadotropin releasing hormone in spawning induction in teleosts: Basic and applied considerations. In: Zohar Y, Breton B (eds). Reproduction in fish: Basic and Applied Aspects in Endocrinology and Genetics. INRA Press, Paris, France, Pp 47-62.

Zohar Y. 1989a. Fish reproduction: its physiology and artificial manipulation. In: Shilo M, Sarig S (eds). Fish Culture in Warm Water Systems: Problems and Trends. CRC Press, Boca Raton, USA, Pp 65-119.

Zohar Y. 1989b. Endocrinology and fish farming: aspects in reproduction growth, and smoltification. Fish Physiol Biochem 7, 395-405.

Zohar Y, CC Mylonas. 2001. Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes. Aquaculture 197, 99-136.

Wood AW, GJ van der Kraak. 2001. Apoptosis and ovarian function: novel perspectives from the teleosts. Biol Reprod 64, 264-271.

Yaron Z. 1995. Endocrine control of gametogenesis and spawning induc-tion in the carp. Aquaculture 129, 49-73.

Zanuy S, M Carrillo. 1987. La reproducción de los peces teleósteos y su apli-cación en acuicultura. En: Espinosa de los Monteros J, Labarta U (eds). Reproducción en acuicultura. CAICYT. Madrid, España, Pp 1-131.

Zanuy S, F Prat, M Carrillo, NR Bromage. 1995. Effects of constant photoperiod on spawning and plasma 17β-oestradiol levels of sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquat Living Resour 8, 147-152.

Zanuy S, M Carrillo, A Rocha, G Molés. 2009. II Regulación y control hormonal del proceso reproductor de los teleósteos. En: Carrillo M, Espinosa de los Monteros J (eds). La reproducción de los peces: aspectos básicos y sus aplicaciones en acuicultura. OESA, CSIC, MMAMRN, Madrid, España, Pp 97-172.

27

Arch Med Vet 43, 27-34 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 20.10.2010.

* cortegas@uaemex.mx

Evaluación de la respuesta clínico-patológica e inmune humoral en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente

con el virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV)

Evaluation of the clinical-pathological and humoral immune response in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) experimentally infected

with Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV)

LF Vegaa, R Montes de Ocaa, B Valladaresa, S Martínez-Castañedaa, U Alonsoa, R Enríquezb, C Ortegaa*

aCentro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México, México.

bLaboratorio de Biotecnología Acuática, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.

SUMMARY

The aim of this study was to assess the relationship between the clinical-pathologic process in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) and the immunoglobulin M (IgM) levels in blood serum. Parameters were evaluated up to 45 days post infection (dpi) in fish intraperitoneally inoculated (IP) with 1X104 TCDI of IPNV, with minimal essential medium (MEM) and in the control group. Infected fish showed classical signs of infectious pancreatic necrosis (IPN) disease since day 19 pi, reaching 70% of accumulated mortality, and the survivor fish showed emaciation and IgM blood serum levels which progressively increased up to its maximum peak at day 31 pi; the most significant histopathological changes were the increase in melanomacrophage centers in the kidney, pancreatic necrosis and catarrhal enteritis. Viral isolation was possible only in the infected fish starting at day 3 pi up to day 45 (P > 0.5). The results suggest that even though the fish infected with IPNV can develop a humoral immune response characterized by the increase in IgM levels, this is insufficient to develop protection because while IgM levels are increasing, so does the viral title accompanied by clinical signs and histopathological injuries that are typical of the disease.

Palabras clave: IPNV, IgM, virus, respuesta inmune. Key words: IPNV, IgM, virus, immune response.

INTRODUCCIÓN

El virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV), virus prototipo de la familia Birnaviridae, ocasiona una enfermedad sistémica aguda altamente contagiosa, usual-mente letal para salmónidos jóvenes menores a 1.500 grados/día.

Los animales que sobreviven a brotes de enfermedad o que se infectan de forma subclínica se convierten en portadores, perpetuando el riesgo de infección (Wolf 1988, Rodríguez y col 2001). En México, la presencia de IPNV fue confirmada en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) importadas como ovas ojo desde Norteamérica, creando una situación de emergencia para la producción de trucha en el país (Ortega y col 2002).

El cuadro clínico patológico típico de la enfermedad se presenta en crías de primera alimentación, caracterizado por mortalidad súbita y elevada, natación lenta y errática, hiperpigmentación cutánea, severa distensión abdominal, presencia de pseudofecas, exoftalmia y branquias pálidas

(McKnight y Roberts 1976, Wolf 1998). A la necropsia, la cavidad celómica suele presentar ascitis, páncreas y grasa abdominal presentan petequias multifocales, y en general los órganos internos muestran coloración pálida (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006).

El desarrollo de una respuesta inmune específica contra IPNV a través de la producción de anticuerpos neutralizantes específicos de tipo IgM contra las proteínas virales VP2 y VP3 ha sido demostrada en peces inmuni-zados con virus inactivo y durante la infección con virus activo (Jarp y col 1996). Imajoh y col (2005) observaron nivel máximo de anticuerpos neutralizantes a 21 dpi, en aparente asociación con la disminución del título viral; sin embargo, un título alto de anticuerpos no siempre garan-tiza disminución de la carga viral, y en peces que actúan como portadores se ha observado que el virus continúa replicándose ante la incapacidad de los anticuerpos para controlar la infección (Yamamoto 1975). Esta situación aparentemente está influida por factores como la edad de los peces, temperatura, forma de presentación y el tipo de antígeno (Ogut 2004, Park y Reno 2005, Ortega y Enríquez 2007). No obstante, poco se conoce sobre la relación exis-tente entre la manifestación clínico-patológica y el nivel de respuesta inmunitaria ocasionada por la infección. Este trabajo tiene por objetivo determinar el nivel de anticuerpos

28

LF VEGA Y COL

específicos (IgM) y describir el cuadro clínico y lesiones histopatológicas desarrolladas por crías de trucha arco iris sometidas a una infección experimental.

MATERIALES Y MÉTODOS

Virus. Para el estudio se utilizó el virus obtenido en México el año 2000, tipificado como VR-299 (Ortega y col 2002); el virus fue replicado a 15 ºC en botella de 25 cm3 con-teniendo células CHSE-214 (Chinook salmon embryo) propagadas en minimal essential Medium (MEM) suple-mentado con 2% de suero fetal bovino (SFB), adicionado con 10.000 UI/mL de penicilina G sódica y 100 µL de sulfato de estreptomicina por mL (Gibco®, USA). Después de expresar efecto citopático (CPE), la botella se congeló y descongeló en dos ocasiones, el contenido se cosechó y centrifugó a 559 x g durante 10 min a 4 ºC. El título viral se determinó por el método de Reed y Muench (1938), y finalmente se calculó la dosis infectiva en cultivo de tejido a un título de 1x104 TCID50/mL.

Peces. Crías de trucha arco iris de 500 unidades térmi-cas acumuladas (UTA), 4,5 cm de longitud y 1,5 g de peso obtenidas de una piscicultura libre de IPNV fueron mantenidas en adaptación en estanques de fibra de vidrio de 200 L de agua en recirculación con los siguientes parámetros fisicoquímicos: temperatura 17 ºC, dureza 200 mg/L, alcalinidad 120 mg/L, oxígeno 8,0 ppm, amonio 0,1 ppm, nitratos 0,01 ppm y pH 7,5. Previo al experimento, se realizó un estudio sanitario para descartar que los peces fuesen portadores de agentes infecciosos, particularmente confirmar su condición sanitaria de libres de IPNV (OIE 2005).

Grupos experimentales. Los peces fueron distribuidos en tres grupos de 300 individuos cada uno y luego de ser anestesiados con 100 mg/L de p-aminobenzoate ([BZ-20] Veterquímica®, Santiago de Chile), el grupo I (GI) fue inoculado por vía intraperitoneal (IP) con 0,2 mL de solución viral a concentración de 1x104 TCDI50/mL. El grupo II (GII) fue únicamente inoculado con MEM con 2% de SFB; mientras que el grupo III (GIII) no fue inoculado. Los peces fueron sometidos a las mismas condiciones de manejo, mantenidos en constante aireación y alimentados con dieta comercial en proporción de 1% de biomasa (Pedregal® Toluca, México); los signos clínicos y morta-lidad se registraron diariamente; el agua de los estanques sufrió una tasa de recambio de 25% por semana.

Recuperación de muestras. A los 0, 3, 5, 7, 10, 15, 31 y 45 dpi quince peces de cada grupo fueron sacrificados por sobredosis de anestesia con 100 mg/L de p-aminobenzoate (Veterquímica, Santiago de Chile). Luego de su decapitación, la sangre fue colectada en viales de 0,5 mL y centrifu-gada a 358 x g a 4 ºC durante 30 min; el suero obtenido se congeló a -70 ºC hasta su uso. Para el reaislamiento

viral, aproximadamente 1 mL de pool de tejido renal, esplénico y ciegos pilóricos se depositó en tubo Falcon, conteniendo 9 mL de MEM con 2% de SFB (proporción 1:9 peso/volumen). La muestra se maceró y centrifugó a 559xg por 15 min a 10 ºC y el sobrenadante obtenido fue conservado a 4 ºC hasta su uso.

Aislamiento e identificación de IPNV. Células CHSE-214 en MEM con 10% de SFB fueron sembradas en placas de poliestireno de 24 pocillos (NunClon®) y al tener un 90% de confluencia se inocularon con 100 µL del sobrenadante diluido 1:10 y 1:100. Después de permitir la adsorción por una hora a 15 ºC, las células recibieron un mL de MEM con 2% de SFB y se incubaron a 15 ºC durante 7 días; las células que manifestaron efecto citopático (CPE) fueron sometidas a inmunofluorescencia indirecta (IFAT) específica para IPNV mediante el Kit IPNV-FluoroTest Indirecto (Bios Chile, Ingeniería Genética S.A. Chile). Para el análisis histopatológico, peces decapitados se colocaron en formol al 10% tamponado a pH 7,0 y posteriormente se procesaron para tinción de hematoxilina y eosina (H-E). Para evaluar las lesiones en riñón, hígado, intesti-no y páncreas se utilizó la escala: 0 = ausencia de lesión, 1 = lesión leve, 2 = lesión moderada y 3 = lesión severa.

Detección de IgM. Placas de ELISA fondo plano de 96 pocillos (NunClon®) fueron cubiertas con 100 µL de una solución viral con 1X104 UPF en solución amortiguadora de carbonato y bicarbonato de sodio pH 9,6. La placa se incubó durante 12 h a 4 ºC y se lavó con solución amor-tiguadora Trisma base, cloruro de sodio y Tween 20 pH 7,3; posteriormente, se bloquearon los sitios de unión inespecíficos mediante incubación en una solución de albúmina sérica bovina (Sigma) al 1% (p/v) por 2 h a 22 ºC; la placa se lavó en tres ocasiones y finalmente se adicionaron 100 µL de diluciones del suero y se incubó por 12 h a 4 ºC. Se retiró el excedente y la placa se lavó cinco veces antes de agregar en cada pozo 100 µL de IgM antisalmón elaborada en ratón (Donada por la Dra. Alexandra Adams del Institute of Aquaculture, University of Stirling, Escocia), se incubó por 60 min a 22 ºC, después de lo cual el excedente se retiró y nuevamente la placa fue lavada para finalmente adicionar el anticuerpo secundario IgG antirratón marcado con peroxidasa a una dilución de 1:10.000, incubándose nuevamente durante 60 min a 22 ºC. Después de cinco lavados, a cada pocillo se agregaron 100µL del cromógeno en una solución amortiguadora Trizma base (Sigma-Aldrich; México), cloruro de Sodio (J.T. Baker, Estado de México, México), timerosal (Merck, Naucalpan, Estado de México, México), tween 20 (Merck, Naucalpan, Estado de México, México), albúmina sérica bovina al 1%, pH de 7,3, y se incubó por 10 min a 22 ºC. La reacción fue detenida por adición de solución de ácido sulfhídrico (Merck, Naucalpan, Estado de México, México) 2M y se efectuó la lectura en lector de ELISA modelo 680 (Bio-Rad Laboratorios, California, USA) a 450 nm.

29

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

Análisis de datos. Los valores de datos correspondientes a los signos clínicos, mortalidad, lesiones histopatoló-gicas y aislamiento viral fueron analizados por medio de frecuencias presentadas en tablas y gráficas. El nivel de IgM (DO) se evaluó a través de análisis de varianza y comparación de medias utilizando el software estadístico GraphPad Prism 5.

RESULTADOS

SIGNOS CLÍNICOS

La signología clínica típicamente asociada a la infec-ción por IPNV únicamente estuvo presente en peces del grupo GI (figuras 1a-d), en los que el oscurecimiento de piel se manifestó inicialmente en el 25% de la población a los 2 dpi, disminuyendo paulatinamente hasta los 9 días; sin embargo, el oscurecimiento afectó al 100% entre 20 a

27 dpi, sólo observándose en 5% a 32 dpi. Por su parte, en el GII el obscurecimiento sólo se manifestó en 5% de los peces entre los días 1 a 5; peces de GIII no manifestaron cambio de color. El abultamiento abdominal en peces infectados (GI) se inició a 5 dpi en el 10% de la pobla-ción y luego de alcanzar un ligero incremento a los 6 dpi se mantuvo en 5% hasta los 20 dpi en que notablemente se incrementó hasta alcanzar el 50% entre 25 y 30 dpi. La presencia de pseudofecas se detectó en los peces in-fectados a 6 dpi en el 10% de la población, con gradual incremento hasta alcanzar un pico máximo de 50% entre los 25 a 29 dpi; por su parte, la descoordinación comenzó a los 19 dpi en el 5% de la población, con punto máximo de 50% a 25 dpi, siendo únicamente evidente en el 3% de la población a 32 dpi.

En los primeros dos dpi en los tres grupos de peces se observó una mortalidad baja que no presentó diferencias entre grupos (P > 0,05). Sin embargo, los peces infectados

Figura 1b. Porcentaje de crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con manifestación de abultamiento abdominal durante la infección con IPNV. Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing abdominal bulging when infected with IPNV.

Figura 1a. Porcentaje de crías de trucha arco iris (Oncor-hynchus mykiss) que mostró cambio de coloración durante la infección con IPNV. Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing colour change when infected with IPNV.

Figura 1c. Porcentaje de crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con presencia de falsas heces durante la infección con IPNV. Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing pseudofaeces when infected with IPNV.

Figura 1d. Porcentaje de crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) que mostraron incoordinación durante la infección con IPNV. Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing incoordination when infected with IPNV.

30

LF VEGA Y COL

con IPNV presentaron una mortalidad acumulada de 70% con un pico máximo de 51,02% a los 25 dpi, mientras que en GII la mortalidad fue de 20% y de 13,33% en peces del grupo control (P < 0,01) (figura 2).

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE IPNV

IPNV no fue identificado en muestras obtenidas de peces de los grupos GII y GIII; en cambio, en peces infectados (GI) el aislamiento fue posible en todos los tiempos de muestreo, a excepción de muestras correspondientes a 0 dpi (datos no mostrados). Pese a que el título viral no fue calculado, el virus se multiplicó en los peces inoculados; las muestras obtenidas a 3 dpi expresaron CPE en células a 7 dpi; por su parte, las muestras correspondientes a 5 y 7 dpi manifestaron CPE 5 días después de su inoculación en línea celular. La manifestación fue más rápida en las muestras de peces obtenidas a los 10 dpi, donde el CPE se presentó 3 días después de su inoculación, mientras que en células inoculadas con las muestras obtenidas a 15 y 31 dpi el CPE ocurrió a 2 días postinoculación. Por su parte, las muestras obtenidas a los 45 dpi produjeron CPE hasta el día 6 postinoculación.

HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS

Durante el periodo experimental los órganos internos de peces de los grupos GII y GIII no presentaron cambios patológicos, situación similar a muestras correspondientes al día 0 en peces de GI; sin embargo, a partir de 3 dpi el número de centros de melanomacrófagos en riñón de GI manifestó un incremento gradual en muestreos posteriores (figura 3a), mientras que la principal lesión en hígado fue necrosis multifocal leve a moderada. El intestino anterior y ciegos pilóricos presentaron severa infiltración de células mononucleares con engrosamiento de vellosidades y enteritis catarral (figura 3b), de mayor severidad a partir del día 25 pi. En páncreas se observó

ligera infiltración de células mononucleares y alrededor de los 15 dpi se presentó necrosis de páncreas exocrino, con remanentes de estructura de sostén, tejido adiposo y endocrino (figuras 3c y 3d).

NIVEL DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)

Los peces del grupo GI presentaron un promedio de 0,132 densidad óptica (DO) de IgM al día 3 pi, nivel que se incrementó a 0,255 DO a los 5 dpi y disminuyó a 0,176 a los 7 dpi; sin embargo, a partir de este tiempo el nivel se incrementó en forma gradual, alcanzando un punto máximo de 0,573 DO a 31 dpi con tendencia descendente posterior. Por su parte, los grupos GII y GIII no mostraron presencia de IgM en ningún tiempo de la fase experimental (figura 4), indicando desarrollo de una respuesta específica en los peces infectados.

DISCUSIÓN

En peces la coloración oscura de la piel es inducida por hormonas estimuladoras de melanóforos y generalmente se considera un signo de estado de salud deficiente por acompañarse de baja tasa de crecimiento y mortalidad, sumado al incremento de cortisol en el suero sanguíneo como indicador de estrés (Ruane y Komen 2003). En el presente estudio, el oscurecimiento descrito previamente en peces infectados por IPNV (McKnight y Roberts 1976) estuvo únicamente presente en los grupos de peces inocu-lados, siendo la primera manifestación clínica de IPN en peces de GI, en los que el estrés acumulado por la infección indujo hasta un 100% de manifestación en el periodo que también mostró mayor mortalidad; mientras que en peces de GII el proceso únicamente se manifestó durante la primera semana postinoculación con MEM, relacionado al estrés provocado por el manejo e inoculación (Swanson y col 1982), a diferencia del grupo GIII que únicamente fue sometido a anestesia por inmersión.

El abultamiento abdominal, una característica común en casos clínicos de IPN que es atribuida a necrosis del páncreas exocrino, intestino anterior e hígado, dilatación de estómago y ascitis (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006), sólo se manifestó en los peces infectados, en mayor porcentaje a partir de los 20 dpi, coincidiendo con la máxima manifestación de otros signos clínicos de la enfermedad y mayor mortalidad; no obstante, al inicio de la infección el abultamiento también se presentó en un bajo porcentaje de la población como supuesto signo agudo de la enfermedad (Roberts y Pearson 2005). Sin embargo, esta última condición también podría encontrar relación con lo referido por Swanson y col (1982), quienes observaron que la dilatación abdominal por el acumulo de fluido proteico también puede ocurrir en peces que únicamente han sido inoculados con MEM, lo cual podría estar influido por la preparación del medio utilizado. Tomando en cuenta que en el estudio los peces de GII no

Figura 2. Mortalidad de crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente con IPNV. Mortality of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) when infected with IPNV.

31

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

Figura 3a. Izquierda, riñón de cría de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancreática infecciosa de 31 días postinfección. Se observa moderado aumento de células melanomacrofágicas (flecha). Derecha, control. 400X. Left, kidney of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 31 dpi an important number of melanomacrophage cells are noticed (arrow). Right control.

Figura 3b. Izquierda, ciego pilórico de cría de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancreática infecciosa a 15 días postinfección. Se observa severa infiltración de células mononucleares y necrosis de tejido pancreático aledaño. Derecha, control. 400X. Left, pyloric ceacal of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 15 dpi a moderate caliciform cell hyperplasia is observed (arrow) with mononuclear cell infiltration (asterisk). Right, control. 400X.

Figura 3c. Izquierda, páncreas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancreática infecciosa a 15 días postinfección. Se observa severa destrucción de células pancreáticas e infiltración de células mononu-cleares tanto en páncreas como en ciego pilórico aledaño. Derecha, control. 400X. Left, pancreas of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 15 dpi an important destruction of pancreatic tissue is observed, besides mononuclear cells infiltration in pancreas and pyloric cecal is observed too. Right, control. 400X.

a

b

c

32

LF VEGA Y COL

Figura 3d. Páncreas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancreática infecciosa a 15 días postinfección. Se observa severa necrosis del tejido pancreático y adiposo distribuido entre ciegos pilóricos. Pancreas of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) in-fected with IPNV. At 45 dpi a severe pancreatic and adipose necrosis is observed between pyloric cecals.

natatoria o natación errática, que es una manifestación tardía del cuadro clínico de IPN, asociada a daños del sistema nervioso central (Frantsi y Savan 1971) fue evidente justo antes de la muerte de los peces infectados.

Los signos clínicos descritos en este trabajo presentan relación con la mortalidad obtenida en los peces infectados; sin embargo, la mortalidad ante casos de infección natural y experimental con IPNV es muy variable, pudiendo ser desde una infección subclínica hasta cuadros de 90% de mortalidad (Wolf 1988, Ortega y Enríquez 2007). En el presente estudio, los signos clínicos propios de IPNV y su confirmación por aislamiento viral indican que 70% de la mortalidad observada en GI correspondió a efectos directos del virus inoculado; resultados similares han sido descritos por Frantsi y Savan (1971), en truchas de arroyo (Salvelinus fontinalis), y por Jorgensen y col (2003) en smolts de salmón del Atlántico (Salmo salar) infectados con IPNV serotipo Sp (105 TCID50), donde la mortalidad se inició a 7 dpi alcanzando un 75% a los 33 dpi. En el presente trabajo, usando un inóculo de 104 TCID50, se obtuvo máxima mortalidad alrededor de los 25 dpi asociada a título alto de virus replicante, ya que células inoculadas con estas muestras mostraron CPE a 2 dpi; en este sentido, además de la dosis infectiva y las cepas utilizadas, las diferencias reportadas pueden estar asociadas a factores como el estado de inmunidad de los peces y condiciones ambientales (Ortega y Enríquez 2007).

Los melanomacrófagos son células pigmentarias presentes en tejido hematopoyético de bazo, riñón y áreas periportales del hígado que contienen inclusiones de melanina, hemosiderina y lipofucsina, capaces de in-gerir agentes microbianos o desechos metabólicos (Press y Evensen 1999); su proliferación acompañada de restos de desechos celulares es evidente en peces infectados con IPNV (Swanson y col 1982), por lo que en el presente estudio su incremento progresivo en riñón de peces ino-culados podría relacionarse a la infección viral (Lerner y Thomas 2002) y estrés prolongado. Asimismo, las lesiones pancreáticas características de la enfermedad se iniciaron a partir de los 3 dpi con moderada disociación de acinos pancreáticos; sin embargo, durante el periodo de mayor mortalidad también se observaron lesiones pancreáticas más graves y extensas, manifestando vacuolización y necrosis difusa de páncreas exocrino. Datos similares se han descrito previamente por Swanson y col (1982) en truchas de arroyo inoculadas o en brotes naturales de IPN en la misma especie.

IPNV pudo ser aislado e identificado únicamente de órganos de peces del grupo GI a partir de los 3 dpi, donde el CPE fue manifiesto a los 7 dpi en línea celular asociado a poca carga viral; en cambio, las muestras obtenidas de peces de entre 5 y 31 dpi presentaron multiplicación más rápida en la línea celular, siendo nuevamente más lenta en órganos de peces de 45 dpi, donde el CPE se manifestó a los 6 dpi. Estos resultados concuerdan con lo informado

manifestaron abultamiento abdominal, su ocurrencia en los peces infectados indicaría efecto viral.

La presencia de pseudofecas, únicamente evidente en el grupo GI, es atribuida directamente a la enteritis catarral aguda derivada de necrosis y desprendimiento del epitelio intestinal, provocados por la replicación de IPNV en células epiteliales (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006). Al respecto, McKnight y Roberts (1976) mencionan que peces que sufren descamación de mucosa intestinal severa mueren más rápido que los que padecen un proceso patológico menos grave al que pueden sobre-vivir durante períodos más largos; basado en lo anterior, la enteritis catarral podría ser la principal causa de muerte en los peces infectados. Por otra parte, la descoordinación

Figura 4. Nivel promedio de inmunoglobulina M (IgM) en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas con IPNV.

IgM average level in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) when infected with IPNV.

33

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

por Swanson y col (1982) en trucha de arroyo, que entre 5 y 25 dpi presentaron mayor concentración viral en ciegos pilóricos y tejido renal. Considerando que el ciclo de re-plicación de IPNV se cumple en aproximadamente 20 h, es poco probable que el aislamiento realizado a los 3 dpi corresponda al virus inoculado, mientras que el CPE tardío obtenido a los 45 dpi podría deberse a una disminución del título viral en los órganos de los peces para entrar al estado de portador (Imajoh y col 2005).

IPNV o sus productos pueden inducir la producción de anticuerpos específicos de tipo IgM; sin embargo, el nivel de la respuesta es variable y su participación en el control de la infección también es incierta al ser procesos influidos por la temperatura del agua, forma de presentación del antígeno o tipo de vacuna (Ortega y Enríquez 2007). Imajoh y col (2005) reportan que después de la infección la presencia de anticuerpos específicos contra IPNV puede detectarse a los 6 dpi, mientras que en otros casos aparecen después de 12 semanas pi (Frost y Ness 1997). En el presente estudio únicamente los peces inoculados con IPNV desarrollaron una repuesta humoral específica, máxima a los 31 dpi; el resultado muestra relación con observaciones de Imajoh y col (2005) en truchas arco iris que generaron máximo nivel de anticuerpos neutralizantes a 21 dpi y descenso paulatino hasta 90 dpi. Sin embargo, en este estudio, el incremento de IgM se registró en forma más temprana a lo reportado por otros autores, lo cual podría estar asociado a activación de algunas células productoras de anticuerpos para inducir una pronta respuesta humoral (Frost y Ness 1997); en este sentido Lockhart y col (2004) evidenciaron que los peces más susceptibles a infección viral desarrollan una respuesta de defensa más rápida que los animales menos susceptibles. Asimismo, es poco probable que la respuesta se deba a previa estimulación para generar anticuerpos contra el virus, ya que previo al estudio los peces fueron analizados para descartarlos como portadores, y además la misma respuesta también habría sido manifiesta en los grupos GII y GIII.

Los resultados obtenidos indican que junto con la replicación de IPNV y la manifestación de signos clínicos propios de la infección, también se presentó un incremento del nivel de IgM como desarrollo de una respuesta inmune específica, aparentemente incapaz de ejercer un estado de protección. Al respecto, Ogut (2004) reportó coexistencia de alto título viral y de anticuerpos, como aparentemente ha ocurrido en el presente estudio; sin embargo, no se informó la respuesta clínico-patológica en los animales infectados; en este sentido, quedan por determinarse los mecanismos por los cuales el virus puede coexistir con los anticuerpos y con el sistema inmune en general para permitir o impedir el desarrollo del cuadro clínico asociado a la infección (Ortega y Enríquez 2007), o si bien esto último es una condición influida por las características del agente.

Considerando que la respuesta inmune inespecífica actúa como la primera barrera de protección contra la infección viral poco influida por la temperatura, los resultados encaminan también a proponer estudios para determinar la relación existente entre el nivel de anticuer-pos y la expresión de moléculas de actividad antiviral inespecífica inducida por interferón tipo I (IFN-I) y con el desarrollo de la infección inducida por cepas de IPNV de características distintas.

RESUMEN

Se realizó un estudio para obtener información acerca de la relación existente entre el cuadro clínico-patológico desarrollado en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas con el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) y el nivel de inmunoglobulina M (IgM) en suero sanguíneo. Los parámetros fueron determinados hasta 45 días postinfección (dpi) en peces inoculados por vía intraperitoneal (IP) con 1X104 TCDI de IPNV o únicamente inoculados con Medio Mínimo Esencial (MEM) y en un grupo control no inoculado. Los peces infectados presentaron los signos característicos de necrosis pancreática (IPN) a partir de 19 dpi, alcanzando una mortalidad acumulada de 70%, con evidente emaciación de animales sobrevivientes; asimismo, el nivel de IgM en suero sanguíneo se incrementó progresivamente hasta alcanzar su punto máximo a 31 dpi; los hallazgos histopatológicos más significativos fueron: incremento de centros de melanomacrófagos en riñón, necrosis pancreática y enteritis catarral. El aislamiento viral fue posible únicamente en peces infectados a partir del día 3 y hasta los 45 dpi (P > 0,5). Los resultados observados sugieren que aunque los animales infectados con IPNV pueden desarrollar una respuesta inmune humoral caracterizada por incremento de IgM, ésta es insuficiente para desarrollar protección, ya que al mismo tiempo que se incrementa el nivel de IgM, también aumenta el título viral, acompañado de signos clínicos y lesiones histopatológicas típicas de la enfermedad.

REFERENCIAS

Frantsi C, M Salvan. 1971. Infectious pancreatic necrosis virus, temperature and age factores in mortality. J Wildlife Dis 7, 249-255.

Frost P, A Ness. 1997. Vaccination of Atlantic salmon with recombinant VP2 of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), added to a multivalent vaccine, suppresses viral replication following IPNV challenge. Fish Shellfish Immunol 7, 609-619.

Imajoh M, T Hirayama, S Oshima. 2005. Frequent occurrence of apoptosis is not associated with pathogenic infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) during persistent infection. Fish Shellfish Immunol 18, 163-177.

Jarp J, T Taksdal, B Tørud. 1996. Infectious Pancreatic Necrosis in Atlantic salmon, Salmo salar, in relation to specific antibodies, smoltification, and infection with erythrocytic inclusion body syndrome (EIBS). Dis Aquat Org 27, 81-88.

Jorgensen JB, LH Johansen, K Steiro, A Johansen. 2003. CpG DNA induces protective antiviral immune responses in Atlantic salmon (Salmo salar L.). J Virol 21, 11471-11479.

Lerner AB, BF Thomas. 2002. Biochemistry of melanin formation. Physiol Rev 30, 91-93.

Lockhart K, SK Gahlawat, D Soto-Mosquera, TJ Bowden, AE Ellis. 2004. IPNV carrier Atlantic salmon growers do not express Mx mRNA and poly I:C induced Mx response does not cure the carrier state. Fish Shellfish Immunol 17, 347-352.

McKnight J, RJ Roberts. 1976. The pathology of Infectious pancreatic necrosis. I. The sequential histopathology of the naturally occurring condition. Br Vet J 132, 76-85.

34

LF VEGA Y COL

Ogut H. 2004. Effects of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Serum (RTS) on replication of Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV). Turk J Vet Anim Sci 29, 505-510.

OIE, Oficina Internacional de Epizootias. 2005. Aquatic Animal Health Code (8th ed). Paris, France.

Ortega C, R Montes de Oca, D Groman, C Yason, B Nicholson, S Blake. 2002. Case report: Viral Infectious Pancreatic Necrosis in Farmed rainbow trout from Mexico. J Aquat Anim Health 14, 305-310.

Ortega C, R Enríquez R. 2007. Factores asociados a la infección celular por el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV). Arch Med Vet 39, 7-18.

Park KC, PW Reno. 2005. Characteristics of inhibition of infectious pan-creatic necrosis virus (IPNV) by normal rainbow trout Oncorhynchus mykiss serum. Dis Aquat Org 63, 43-52.

Press CM, Ø Evensen. 1999. The morphology of the immune system in teleost fishes. Fish Shellfish Immunol 9, 309-318.

Reed LJ, H Muench. 1938. A simple method of estimating fity per cent endpoints. J Hyg 3, 493-497.

Roberts RJ, MD Pearson. 2005. Infectious Pancreatic Necrosis in Atlantic salmon, Salmo salar L. J Fish Dis 28, 383-389.

Rodríguez S, M Alonso, S Pérez-Prieto. 2001. Detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from leukocytes of carrier rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Pathol 36, 13-46.

Ruane nm, H Komen. 2003. Measuring cortisol in the water as an indica-tor of stress caused by increased loading density in commun carp (Ciprinus carpio). Aquaculture 218, 685-693.

Smail DA, N Bain, DW Bruno, JA King, F Thompson, DJ Pendrey, S Morrice, CO Cunningham. 2006. Infectious pancreatic necrosis virus in Atlantic salmon, Salmo salar L., post-smolts in the Shetland Isles, Scotland: virus identification, histopathology, immunohisto-chemistry and genetic comparison with Scottish mainland isolates. J Fish Dis 29, 31-41.

Swanson RN, JC Carlisle, JH Gillespie. 1982. Pathogenesis of infectious pancreatic necrosis virus infection in brook trou, Salvelinus fortinatus (Mitchill), following intraperitoneal injection. J Fish Dis 5, 449-460.

Wolf K. 1988. Infectious Pancreatic Necrosis. In: Fish Viruses and Fish Disease. Cornell University Press, Ithaca, NY, USA, Pp 115-157.

Yamamoto T. 1975. Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) carriers and antibody production in a population of rainbow trout (Salmo gairdneri). J Fish Dis 5, 1343-1347.

35

Arch Med Vet 43, 35-40 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 15.09.2010.# Proyecto FONDECYT Nº 11070053, Proyecto DID S-2006-14

* Casilla 567, Valdivia, Chile; marcelogomez@uach.cl

Análisis de las concentraciones de azufre en agua, alimento y gas sulfúrico ruminal de rebaños bovinos de carne de las regiones

de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile#

Determination of sulphur contents in water, forage and ruminal hydrogen sulphide concentrations in beef cattle herds from La Araucanía,

Los Ríos y Los Lagos regions of Chile

M Gómez*a, B González a, D Pinochetb, A Gutiérreza, P Aburtoa

aInstituto de Farmacología y Morfofisiología Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

bInstituto de Ingeniería Agraria, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

Sulphur is an essential element for the metabolism of ruminant animals. However, high dietary concentrations of sulphur are potentially harmful. The purpose of this study was to measure the forage and water sulphur content in samples from 45 beef herds from the La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos regions of Chile. Additionally, ruminal gas hydrogen sulphide (H2S) concentrations were obtained from 5 animals on each farm. Samples were collected during the spring 2008 and summer 2009. Pasture sulphur content was 1,482 ± 592 ppm in the spring and 1,471 ± 448 ppm in the summer. Water sulphur concentrations in all farms was < 1.5 ppm each season. Ruminal gas H2S concentrations in animals was 273 ± 187.5 ppm and 245.4 ± 173 ppm in spring and summer, respectively. Positive and significant correlations were found between pasture sulphur content and ruminal H2S concentration for both periods. Estimated total sulphur intake considering pastures and water was < 0.2% sulfur on a dry matter basis. The results of this study suggest that forage and water sulphur concentrations in Southern Chile do not represent a potential risk of intoxication in grazing beef cattle.

Palabras clave: azufre, bovinos, pradera, agua.Key words: sulphur, bovine, pastures, water.

INTRODUCCIÓN

El azufre es un macroelemento esencial en rumiantes para la formación de aminoácidos como la cistina, cisteína, metionina, taurina y ciertas vitaminas como biotina y tiamina (Whitehead 2000). Este mineral está presente en aproximadamente un 0,15% del peso corporal en bo-vinos (NRC 2001). La absorción del azufre por parte de los rumiantes se realiza mayoritariamente en la forma de sulfato o como ion sulfuro (NRC 1996). Estos compues-tos pueden ser utilizados por los microorganismos del rumen más eficientemente que el azufre elemental para la formación de biomasa microbiana (Whitehead 2000). La flora ruminal transforma el exceso de azufre en gas, el sulfuro de hidrógeno (H2S), que se acumula en el rumen y traspasa al torrente sanguíneo (Galyean y Rivera 2003). Niveles elevados de azufre y sulfatos, consumidos por los rumiantes a través de las plantas, agua y otros alimentos, pueden afectar a los animales de variadas formas (Gould

y col 2002). Niveles altos de azufre en el agua y forraje se han asociado a una forma de polioencefalomalacia (PEM) en rumiantes (Gibson y col 1988, McAllister 1991, Gould 2000). Adicionalmente, niveles altos de sulfuros pueden intervenir en la absorción y disponibilidad de otros metales trazas importantes como el cobre y selenio (NRC 2001). Gooneratne (1989) postula que esta deficiencia en cobre interferiría indirectamente en el metabolismo de la tiamina contribuyendo a la presentación de la PEM. Además, esta deficiencia secundaria de cobre produciría efectos nega-tivos en la reproducción, niveles productivos del ganado y características de la canal (Suttle 1993, Loneragan y col 1998, Gould y col 2002).

Los requerimientos diarios de azufre en la dieta para bovinos de carne adultos y en crecimiento de acuerdo al NRC (1996) son de 1.500 a 2.000 partes por millón (ppm). Esto equivale a un 0,15% del alimento base materia seca (BMS). Niveles de azufre en la ración de hasta 0,4% BMS son considerados el máximo tolerable en bovinos de carne y de leche (NRC 1996, 2001). Sin embargo, la tolerancia de rumiantes para dietas azufradas varía inversamente con la proporción de concentrado en la dieta (Klasing y col 2005). Bovinos y otros rumiantes con dietas menores a un 15% de forraje poseen riesgo de PEM cuando el azufre dietario es de 0,35% BMS (Klasing y col 2005).

36

M GÓMEZ Y COL

Por otro lado, dietas con niveles de forraje sobre el 40% necesitan niveles de azufre dietario sobre 0,5% para producir riesgo de PEM (Klasing y col 2005). Sulfuros y sulfatos pueden encontrarse en altas concentraciones en el agua, forrajes de ciertas crucíferas y granos, malezas, suplementos o aditivos minerales y fertilizantes (Hill y Ebbert 1997, Gould 2000, Kul y col 2006, McKenzie y col 2009). En nuestro país no existen recomendaciones de niveles máximos tolerables de compuestos azufrados en la dieta. Los objetivos de este trabajo fueron determinar la concentración de azufre presente en el agua de bebida y praderas de predios bovinos de carne de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos, y evaluar si existen diferencias entre predios localizados en la zona costera, la depresión intermedia y precordillera.

MATERIAL Y MÉTODOS

MUESTREO Y SELECCIÓN DE PREDIOS

Se analizaron 45 predios productores de carne bovina con más de 50 animales por predio, pertenecientes a las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos durante los meses de octubre 2008 (primavera) y enero (verano) del 2009. Para cada Región en estudio se seleccionaron por muestreo dirigido 5 predios correspondientes a la zona costera, 5 a la zona de depresión intermedia y los 5 restantes a la zona de precordillera. De cada predio –y para cada período (primavera y verano)– se obtuvieron 3 muestras de pradera y 3 muestras de agua. Además, de cada predio se obtuvieron muestras de gas ruminal de 5 animales seleccionados de forma aleatoria simple para análisis de ácido sulfhídrico (H2S) ruminal, analizándose un total de 225 animales por período. Para cada predio, los muestreos de agua, alimento y gas ruminal fueron obtenidos en un mismo día.

ANáLISIS DE AZUFRE EN EL AGUA

En cada uno de los predios seleccionados se obtuvieron 3 muestras seriadas de agua de aproximadamente 100 mL cada una, las cuales fueron recolectadas de los bebederos para animales o de las fuentes de agua disponibles en cada predio. Los muestreos se realizaron una vez por predio en ambos períodos. Posteriormente las muestras de agua fueron identificadas y refrigeradas para su posterior aná-lisis. Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Suelos del Instituto de Ingeniería Agraria y Suelos de la Universidad Austral de Chile (UACh) para medición de la concentración de azufre, utilizando para ello pruebas turbidimétricas. La concentración de azufre fue expresada en partes por millón (ppm). Para el caso del agua los valores entregados por el Laboratorio son expresados en sulfato (SO4 mg/L), lo que es equivalente a ppm (1 mg/L = 1 ppm). Dado que un tercio del contenido de sulfato es azufre, los resultados del análisis de Laboratorio fueron divididos

por 3 para obtener la cantidad de azufre aportada por el agua (S mg/L).

ANáLISIS DE AZUFRE EN EL FORRAJE

De cada predio, y en ambos períodos, se obtuvieron 3 muestras de pradera. Para estimar la concentración de azufre proveniente del forraje se determinó la concen-tración de sulfuro en la pradera o de los componentes individuales de la dieta de los predios muestreados. Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Suelos del Instituto de Ingeniería Agraria y Suelos de la UACh. Las concentraciones de azufre se obtuvieron por la técnica de calcinación y determinación por técnica de turbidimetría. Estos valores se expresaron como porcentaje de sulfuro en la materia seca, los que se convirtieron posteriormente a ppm.

CONCENTRACIÓN TOTAL DE AZUFRE EN LA DIETA

La concentración total de azufre (CTS) en la dieta se estimó mediante la suma de la concentración de azufre en el agua (% SH2O) más la concentración de azufre en el forraje (%SF) (Gould 2000). La ingesta diaria total de forraje por animal se calculó estimando un consumo promedio de materia seca equivalente al 2,5% del peso vivo del animal (Ruiz 1996).

CONCENTRACIÓN DE áCIDO SULFHÍDRICO EN GAS

RUMINAL

De cada predio analizado, se obtuvieron 5 muestras de gas ruminal de 5 animales seleccionados aleatoriamente por muestreo simple con el objeto de medir la concentra-ción de H2S. La determinación de H2S en gas ruminal se realizó mediante tubos detectores, utilizando la técnica paralumbar descrita previamente (Gould y col 1997). Esta técnica provee una adecuada estimación en terreno de las concentraciones de sulfato ruminal y es comparable a técnicas de laboratorio como la cromatografía (Gould 2000). En esta técnica se prepara asépticamente la fosa paralumbar izquierda y bajo anestesia local se introduce una aguja espinal estéril (8,9 cm, 18G) hacia el saco dorsal del rumen. Luego el estilete de la aguja es removido y la base de ésta es unida a un circuito conectado a un tubo calibrado para detección de H2S (Sensibilidad de 50 a 1000 ppm). Posteriormente, 100 mL de gas ruminal son extraídos hacia el tubo para realizar la medición de H2S, utilizando para ello un sistema colector de gas a precisión (Gastec gas precision sampler and hydrogen sulfide analyzer tube, Sensidyne, Clearwater, Fl, USA).

ANáLISIS ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos fueron evaluados para establecer normalidad en su distribución. Se utilizó el test de análisis de Varianza (ANDEVA) para evaluar las diferencias entre

37

AZUFRE, BOVINOS, PRADERA, AGUA

grupos (ubicación geográfica y región), utilizando un valor de significancia de 0,05 para establecer la presencia de diferencias estadísticas entre promedios. Se realizó la prueba de T student en los casos de comparación de varia-bles entre períodos (primavera y verano). Adicionalmente, se realizó un análisis de correlación entre las variables en estudio para ambos períodos. Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el Software JMP8® Statistics (SAS Institute, Cary, NC, USA).

RESULTADOS

En la totalidad de los predios muestreados la principal fuente de alimentación durante el período en estudio fue la pradera. La concentración de azufre en la pradera para ambos períodos varió entre 900 a 3.000 ppm (0,09 y 0,3% de azufre BMS). Los niveles de azufre en agua tuvieron una concentración promedio, para ambos períodos, de 1,13 ± 0,1 ppm y los valores no superaron los 1,5 ppm considerándose baja su concentración. Los análisis por regiones no mostraron diferencias significativas (P > 0,05) entre las variables estudiadas (cuadro 1). Los niveles de azufre en agua y alimento no presentaron diferencias significativas (P > 0,05) al considerar la zona geográfica de los predios (figura 1). El análisis de 12 muestras de 4 tipos de concentrado de uso nacional (inicial, crecimiento y adulto) indicó concentraciones de azufre entre 3.000 a 6.000 ppm (0,3 a 0,6% de azufre BMS) (cuadro 2).

Los niveles de H2S ruminal obtenidos tanto en primavera como en verano variaron desde valores menores a 50 ppm hasta 800 ppm. No se observaron diferencias significativas en los resultados de H2S ruminal al considerar la región de origen, la estación o zona geográfica de los predios de origen (figura 2). La comparación entre los promedios de las concentraciones de H2S ruminal en primavera (273,1 ± 187,5 ppm) y verano (245,4 ± 173,1 ppm) no evidenció diferencias significativas (P > 0,05).

Los niveles de H2S a nivel ruminal presentaron una co-rrelación positiva y estadísticamente significativa (P < 0,05) con los niveles de azufre en alimento tanto en la época de primavera (r = 0,59) como en verano (r = 0,77).

El consumo promedio total de azufre estimado con-siderando las fuentes de pradera y agua en 45 predios de la regiones en ambos períodos fue de 25,8 g/día, lo que constituye un 0,21% de azufre en la dieta.

DISCUSIÓN

Los niveles de azufre en la pradera variaron entre un 0,03% a 0,2% BMS. No se observaron diferencias significa-tivas en las concentraciones de azufre en ambos períodos ni tampoco entre las diferentes zonas geográficas analizadas. Los niveles observados en la pradera son coincidentes con los informados en otros estudios con rangos de azufre no superiores a 0,3% BMS (Gould 2000). Se considera que en general, las praderas tienden a tener niveles bajos de azufre debido a su bajo contenido proteico (NRC 2001). Sin embargo, los niveles de azufre en la pradera pueden estar aumentados si existe la presencia de malezas con alto contenido de este mineral (Loneragan y col 1998). En la zona sur de Chile, uno de los factores importantes que afectan la disponibilidad de azufre en el suelo para las plantas es la cantidad de sulfato que se pierde en la zona radicular por lixiviación (Rhue y Kamprath 1973, Vidal 2003). Otro factor que influye en la disponibilidad de azufre en las plantas es el tipo de suelo. Análisis de suelos trumaos y rojo del sur de Chile han mostrado niveles bajos de azufre (Teuber 1996).

El NRC (1996), en dietas para bovinos de carne, re-comienda niveles de azufre dietario de aproximadamente 0,15% BMS con un máximo tolerable de 0,4% BMS. Plantas de la familia Brassicaceae son conocidas por sus altos contenidos de azufre (Loneragan y col 2001, Mackenzie y col 2009). Suplementos como la col forra-jera (Brassica napus) pueden tener niveles de azufre de 0,6% hasta un 1% BMS y por tanto no debieran exceder el 30% de la ración (Soto 1996). El azufre presente en las plantas forma parte de azufre elemental, sulfuro de hidrógeno, glutatión, fitoquelatinas, glucosinolatos y proteínas ricas en azufre, todos componentes esen-ciales ante situaciones de estrés biótico y abiótico, los cuales median resistencia a agentes fúngicos e insectos

Cuadro 1. Concentración de azufre en pradera y en agua de 45 predios de producción de carne bovina pertenecientes a las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile muestreados durante la época de Primavera 2008 y Verano 2009. Sulphur content of pasture and water of 45 beef farms during spring 2008 and summer 2009 in La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos regions of southern Chile.

Región

Concentraciones de Azufre (ppm)

Primavera 2008 Verano 2009

Pradera Agua Pradera Agua

La Araucanía 1566,6 ± 519,1 1,09 ± 0,11 1456,0 ± 483,3 1,14 ± 0,08Los Lagos 1246,6 ± 277,7 1,16 ± 0,09 1506,6 ± 475,7 1,12 ± 0,09Los Ríos 1633,3 ± 622,9 1,12 ± 0,10 1453,3 ± 412,0 1,17 ± 0,11Total 1482,2 ± 592,6 1,12 ± 0,10 1471,1 ± 448,0 1,14 ± 0,09

38

M GÓMEZ Y COL

Figura 1. Concentraciones promedio (ppm) de azufre en pradera (A) y agua (B) según zona geográfica (costa: Costa, depresión intermedia: Depr y precordillera: Prec) en 45 predios bovinos de carne en los periodos de primavera 2008 y verano 2009. Cada barra de error está construida utilizando ± 1 desviación estándar del promedio. Mean concentration (ppm) of sulphur content in pasture (A) and water (B) according to geographic area (coastal, central and pre-Andean areas) of 45 beef farms during spring 2008 and summer 2009.

Cuadro 2. Concentración de azufre (ppm) en algunos suplementos utilizados en los predios bovinos de carne del sur de Chile. Sulphur content (ppm) in some food supplements used in beef farms of southern Chile.

Suplemento Concentración de Azufre(ppm)

Heno Ballica (n = 7) 2.300

Ensilaje Ballica (n = 6) 1.400

Nabo Forrajero (n = 3) 5.000

Concentrado 1 (n = 3) 3.500

Concentrado 2 (n = 4) 5.900

Concentrado 3 (n = 4) 4.000

Concentrado 4 (n = 4) 4.100

Concentrado 1: Concentrado Inicial Suralim®, Biomaster S.A., Chile.

Concentrado 2: Cosetan®, Biomaster-IANSA, Chile.

Concentrado 3: Concentrado vaca 14 Suralim®, Biomaster S.A., Chile.

Concentrado 4: Concentrado crecimiento Suralim®, Biomaster S.A., Chile.

(Booth y col 1991). La capacidad de generar H2S de los microorganismos ruminales aumenta bajo condiciones de dietas altas en azufre (Cummings y col 1995, Gould 1998). Los resultados del análisis de concentración de azufre en la pradera de predios bovinos de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos indican que las concentraciones de azufre en la pradera no sobrepasaron

los riesgos de exposición a niveles tóxicos de azufre. Estudios previos en Nebraska (USA) indican que en predios con niveles de 0,4% BMS de azufre en la dieta presentaron una incidencia de PEM de 0,14% (Vanness y col 2009a). Cuando los niveles de azufre en la dieta superaron los 0,56% BMS, la incidencia de PEM fue de un 6,06% BMS (Vanness y col 2009a).

Los suplementos analizados indicaron niveles altos de azufre de 0,4% y 0,5% BMS en nabos y algunos con-centrados respectivamente. Estos niveles altos de azufre en plantas crucíferas ya han sido mencionados por otros autores (Soto 1996, Kul y col 2006, McKenzie y col 2009). Sin embargo, se desconoce la proporción en la dieta en que estos suplementos alimentarios fueron utilizados en los predios en estudio.

El contenido de azufre en el agua puede representar una proporción importante del total de azufre ingerido por bovinos (Gould y col 2002). En nuestro país, los ni-veles máximos permitidos de sulfato en agua de bebida según la norma oficial para calidad del agua no debieran exceder las 250 ppm (Norma Chilena Oficial 1984). Los niveles de azufre en agua obtenidos en nuestro estudio no sobrepasaron las 1,2 ppm (1,12 ± 0,1 ppm en primavera y 1,14 ± 0,09 en verano). Un estudio en Estados Unidos, que incluyó el análisis de azufre en agua de 498 predios bovinos provenientes de 23 diferentes Estados indicó rangos de azufre en el agua desde < 200 ppm hasta 7.600 ppm (Gould y col 2002). Se ha indicado que concentraciones de azufre en agua sobre 583 ppm pueden disminuir la

39

AZUFRE, BOVINOS, PRADERA, AGUA

Figura 2. Concentraciones promedio (ppm) de H2S en gas ruminal obtenidas de 225 bovinos durante la época de primavera y verano en las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile (A) y en tres áreas geográficas (costa: Costa, depresión intermedia: Depr, precordillera: Prec) de cada región (B). En cada región se analizaron 75 animales. Cada barra de error está construida utilizan-do ± 1 desviación estándar del promedio. Mean concentrations of H2S ruminal gas concentrations obtained from 225 bovines during spring and summer in La Araucanía, Los Ríos and Los Lagos regions of southern Chile (A) and from three geographic regions (B) . On each region 75 animals were analyzed.

productividad en el ganado bovino y las características de la canal, incluyendo disminución del peso caliente de ésta y de la proporción de grasa a nivel de la 12a costilla (Loneragan y col 2001). Zinn y col (1997) señalaron que ingestas moderadamente altas de azufre en la dieta de bovinos de carne (0,25% BMS) producen una disminución del peso de la canal y del área del músculo longissimus. Adicionalmente, se ha estimado que concentraciones de azufre en el agua sobre las 2.000 ppm, en ambientes de temperatura moderada, pueden resultar en una ingesta total de azufre en la dieta de hasta 0,53% con presentación de casos clínicos de PEM (Gould 2000). Esta concentración total de azufre ingerido puede incluso aumentar en altas temperaturas ambientales, debido al mayor consumo de agua (Gould 2000).

Los niveles de H2S en gas ruminal de nuestro estudio indicaron valores no significativos entre los períodos de primavera (273,1 ppm) y verano (245,4 ppm). Valores similares (264 ppm) han sido informados por McAllister y col (1997) en bovinos de carne sin signos de PEM en el período de verano de USA. Niveles de H2S en gas ruminal sobre 1.000 ppm son sugerentes de toxicosis. Los máximos niveles de encontrados en nuestro estudio no sobrepasaron las 800 ppm. Por otra parte, se encon-tró una alta correlación entre los niveles de H2S en gas ruminal con la concentración de azufre en la pradera. En un estudio, que utilizó subproductos de maíz en la dieta con concentraciones de azufre en la dieta de 0,42% a 0,47% se encontraron niveles de H2S en gas ruminal de

1.700 ppm a 7.500 ppm en bovinos de carne (Vanness y col 2009b). Otro estudio que midió niveles de H2S 12 horas postalimentación indicó niveles de H2S de 1.100 ppm a concentraciones dietarias de azufre de 0,53% y niveles de 825 ppm cuando las mismas fueron de 0,34% BMS (Vanness y col 2009a). Al parecer, los niveles de H2S ruminal tienden a correlacionarse positivamente con los niveles dietarios de azufre al comparar dietas similares en cuanto a los alimentos utilizados. Sin embargo, esta relación no es tan clara cuando se comparan niveles de azufre provenientes de dietas de diferente composición (Vanness y col 2009a). Factores como los cambios del pH ruminal, inducidos por el cambio de dieta, se han corre-lacionado negativamente con los niveles de H2S ruminal (Gould y col 2002).

El consumo promedio total de azufre estimado por Unidad Animal (animal de 500 kg) fue de 25,8 g/día, lo que se traduce en un 0,21% en BMS. El consumo de este mineral no presenta riesgos de intoxicación para los animales, ya que de acuerdo al NRC (1996) lo recomendado como requerimiento diario para ganado de carne es de un 0,15 a 0,20% de azufre en BMS, siendo la concentración máxima tolerable de azufre en la dieta un 0,4% en BMS.

En conclusión, los resultados indican que las concen-traciones de azufre encontradas en los predios ganaderos de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile no representan un riesgo potencial para el consumo de azufre en bovinos. Adicionalmente, no se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones de

40

M GÓMEZ Y COL

azufre del agua y pradera provenientes de las zonas costera, intermedia y precordillerana en ambos períodos en estudio. Las concentraciones de azufre en la pradera es un factor que influye en la concentración ruminal de H2S.

RESUMEN

El azufre es un macroelemento esencial en rumiantes. Niveles elevados de azufre y sulfatos consumidos por rumiantes a través de las plantas, agua y otros alimentos pueden reducir el apetito y la tasa de crecimiento en los animales, afectar la absorción de otros elementos y causar afecciones respiratorias y/o neurológicas. El propósito de este estudio fue medir los niveles de azufre en la dieta, analizando las praderas (3 muestras por predio) y el agua (1 muestra por predio) en 45 predios dedicados a la producción de carne, de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile durante los períodos de primavera 2008 y verano 2009. Adicionalmente, se obtuvieron muestras de gas ruminal de 5 animales por predio, muestreándose un total de 225 animales por período. Posteriormente, se analizaron las diferencias en las concentraciones de azufre en agua y pradera y H2S en gas ruminal de los predios provenientes de las zonas de la costa, depresión intermedia y precordillera. Los resultados obtenidos indican que las concentraciones promedios de azufre en la pradera fueron de 1.482 ± 592 ppm y de 1.472,1 ± 448 ppm en el periodo primavera y verano respectivamente, no evidenciándose diferencias significativas. La concentración de azufre en agua fue de 1,12 ± 0,1 y 1,14 ± 0,09 ppm durante el período de primavera y de verano, respectivamente. Los resultados de los análisis por región y zona geográfica (costa, depresión intermedia y precordillera) no mostraron diferencias significativas. La concentración de H2S en gas ruminal en los animales en estudio fueron de 273,1 ± 187,5 y de 245,4 ± 180 ppm en primavera y en verano, respectivamente. El análisis de correlación entre variables indicó una asociación positiva entre los niveles de azufre en alimento y H2S en gas ruminal para el período de primavera y verano. El consumo promedio total de azufre estimado considerando las fuentes de pradera y agua en 45 predios durante ambos períodos fue < 0,2% de azufre en la dieta. En conclusión, los resultados indican que las concentraciones de azufre encontradas en los predios ganaderos de las regiones de La Araucanía, Los Ríos y Los Lagos de Chile no representan riesgo para el consumo en bovinos.

REFERENCIAS

Booth EJ, KC Walker, DW Griffiths. 1991. A time-course study of the effect of sulphur on glucosinolates in oilseed rape (Brassica napus) from the vegetative stage to maturity. J Sci Food Agric 56, 479-493.

Cummings BA, DH Gould, DR Caldwell. 1995. Rumen microbial alterations associated with sulfide generation in steers with dietary sulfate-induced polioencephalomalacia. Am J Vet Res 56, 1390-1395.

Galyean M, JD Rivera, 2003. Nutritionally related disorder affecting feedlot cattle. Department of Animal Science and Food Technology. Can J Anim Sci 83,13-20.

Gibson DM, JJ Kennelly, GW Mathison. 1988. The performance of dairy and feedlotcattle fed sulfur dioxide-treated high-moisture barley. Can J Anim Sci 68, 471-482.

Gould DH, BA Cummings, DW Hamar. 1997. In vivo indicators of pathologic ruminal sulphide production in steers with diet-induced polioencephalomlacia. J Vet Diagn Invest 9, 72-76.

Gould DH. 1998. Polioencephalomalacia. J Anim Sci 76, 309-314.

Gould DH. 2000. Update on sulfur-related polioencephalomalacia. Vet Clin North Am Food Anim Pract 16, 481-496.

Gould DH, DA Dargatz, FB Garry, DW Hamar, PF Ross. 2002. Potentially hazardous sulfur conditions on beef cattle ranches in the United States. J Am Vet Med Assoc 221, 673-677.

Hill FI, PC Ebbert. 1997. Polioencephalomalacia in cattle in New Zealand fed chou moellier (Brassica oleracea). New Zeal Vet J 45, 37-39.

Klasing KC, JP Goff, JL Greger 2005. Mineral tolerance of animals. 2nd ed. The National Academies Press, Washington DC, USA, Pp 372-385.

Kul O, S Karahan, M Basalan, N Kabakci. 2006. Polioencephalomalacia in cattle: a consequence of prolonged feeding barley malt sprouts. J Vet Med A53, 123-128.

Loneragan GH, DH Gould, RJ Callan, CJ Sigurdson, DW Hamar. 1998. Association of excess sulfur intake and an increase in hydrogen sulfide concentrations in the ruminal gas cap of recently weaned beef calves with polioencephalomalacia. J Am Vet Med Assoc 213, 1599-1604.

Loneragan GH, JJ Wagner, DH Gould, FB Garry, MA Thoren. 2001. Effects of water sulfate concentration on performance, water intake, and carcass characteristics of feedlot steers. J Anim Sci 79, 2941-2948.

McAllister MM. 1991. Sulfur toxicosis and polioencephalomalacia in ruminants. Doctoral Thesis, Department of Pathology, Colorado State University.

McAllister MM, DH Gould, MF Raisbeck, BA Cummings, H Loneragan. 1997. Evaluation of ruminal sulfide concentrations and seasonal outbreaks of polioencephalomalacia in beef cattle in a feedlot. J Am Vet Med Assoc 211, 1275-1279.

McKenzie RA, AM Carmichael, ML Schibrowski, SA Duigan, JA Gibsonand, JD Taylor. 2009. Sulfur-associated polioencepha-lomalacia in cattle grazing plants in the Family Brassicaceae. Aus Vet J 87, 27-32.

Norma Chilena Oficial. 1984. Normas oficiales para la calidad del agua en Chile. Norma Chilena Oficial 409, Pp 1-11.

NRC, National Research Council. 1996. Nutrient requirements of beef cattle. 7th ed. National Academy Press, Washington DC, USA.

NRC, National Research Council. 2001. Nutrient Requirement of Dairy Cattle. National Academy Press, Washington DC, USA, Pp 131-132.

Rhue R, E Kamprath. 1973. Leaching losses of sulfur during winter months when applied as gypseum, elemental S or prilled S. Agronomy J 65, 603-605.

Suttle N. 1993. Overestimation of copper deficiency. Vet Rec 133, 123-124.Teuber N. 1996. La pradera en la costa de la X Región (Valdivia-

Llanquihue) En: Ruiz I (ed). Praderas para Chile. INIA, Santiago, Chile, Pp 579-589.

Vanness S, N Meyer, T Klopfenstein, G Erikson. 2009a. Hydrogen sulfide gas levels post-feeding. Nebraska Beef Cattle Report 84-85.

Vanness S, N Meyer, T Klopfenstein, G Erikson. 2009b. Ruminal sul-fide levels in corn byoproducts diets with varying roughage levels. Nebraska Beef Cattle Report 86-89.

Vidal R. 2003. Determinación de un índice de retención de S-sulfato agregado en grandes grupos de suelos agrícolas de Chile. Memoria de titulación, Escuela de Agronomía, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Whitehead D. 2000. Nutrient elements in grassland. Soil-Plant-Animal relationships. CAB International. Walingford, UK, Pp 369-370.

Zinn RA, E álvarez, M Méndez, M Montaño, E Ramírez, Y Shen. 1997. Influence of dietary sulfur level on growth performance and digestive function in feedlot cattle. J Anim Sci 75, 1723-1728.

41

Arch Med Vet 43, 41-50 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 15.09.2010.

* Calz. Del hueso 1100, México D.F. 04960, México; ppfx221@correo.xoc.uam.mx

Comparación de métodos basados en los requerimientos nutricionales y disponibilidad de biomasa para estimar la capacidad de carga para venado cola blanca

Comparison of methods based on the nutritional requirements and availability of biomass to estimate carrying capacity for white tailed deer

FX Plataa*, GD Mendozaa, JA Viccona, R Bárcenab, F Clementeb

aUniversidad Autónoma Metropolitana, Doctorado en Ciencias Biológicas, México D.F.bColegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México.

SUMMARY

Due to the importance of the estimation of carrying capacity (K animals/ha) in white tailed deer, the objectives of this study were: 1) To compare the estimation of K with five methods, three of them based on nutrient availability (dry matter (DM), digestible energy (DE) and nitrogen (N)), one based on pressure of pasture and one based on the requirement of metabolizable energy (ME) based on the ecological metabolism of the deer, and; 2) To compare the K estimated when using the total biomass or vegetation groups consumed by the deer (grasses, herbs, shrubs and trees). The information about diet composition and biomass was collected at a hunting ranch in Aguascalientes, Mexico. The results were analyzed as a factorial arrangement (5 x 4), with the factors being the estimation method and the vegetal group factors. The estimated K (deer/ha) with total biomass was the highest (1.043), followed by grass (0.707) and herbs (0.325), whereas the estimates with trees and shrubs were the lowest ones (0.228 and 0.032 deer/ha). The K estimated, based in shrubs availability gives the value most similar to the population density than with the other methods, independently of selected method (DM, DE or N availability, pressure of pasture or ecological metabolism). It is concluded that carrying capacity should be estimated based on shrubs availability when considering the population density (0.02 - 0.04 deer/ha) as the appropriate indicator to evaluate the carrying capacity.

Palabras clave: capacidad de carga, Odocoileus virginianus, requerimientos nutricionales, vegetación.Key words: carrying capacity, Odocoileus virginianus, nutritional requirements, vegetation.

INTRODUCCIÓN

La estimación del número de animales que un hábitat puede mantener en una condición vigorosa y saludable es un problema que tiene sus orígenes a comienzos del siglo pasado. Por tal razón y a lo largo de todo este tiempo se han generado y discutido diversos tipos de modelos que permiten su determinación (McLeod 1997). Dependiendo de la especie y función para la que sea utilizada, la ca-pacidad de carga ha sido definida de diversas maneras (Miller y Wentworth 2000). En general, la capacidad de carga ecológica (K) es definida como el número máximo de animales que puede crecer dentro de una población de acuerdo al modelo logístico, mientras que las restric-ciones a dicho crecimiento incluyen la disponibilidad de espacio, agua y biomasa comestible, de tal forma que la tasa de crecimiento (r) es igual a cero cuando una pobla-ción alcanza K (Gotelli 2008). Esta K es afectada por la presencia de enfermedades que afectan a la población, la disponibilidad de agua, la presencia de competidores naturales y depredadores (Gallina 1990, Mandujano 2007). Por otro lado, la capacidad de carga económica se refiere

al valor que permite maximizar el número de individuos a condición de no generar cambios en la composición botánica del sitio (Beck y col 2006). Mientras que para los productores de ganado doméstico y los manejadores de pastizales, la estimación de la carga animal representa al número máximo de animales en un pastizal que permite el mantenimiento o mejoramiento de la vegetación o de los recursos utilizados, y se utiliza como sinónimo de K (Jacoby 1989, Young 1998, Galt 2000). En todos los casos, la K de una región, es dependiente del tipo y disponibilidad de vegetación presente, de los hábitos de consumo de la especie y la época del año (Stuth y Sheffield 2001).

Se han evaluado diferentes métodos para determi-nar la capacidad de carga; Mandujano (2007) evaluó la capacidad de carga de un área del estado de Jalisco (México) utilizando el concepto ecológico y considerando que K es igual a la densidad estimada de animales más los animales muertos en el área. En bovinos, Paladines y Lazcano (1983) diseñaron una técnica para estimarla incorporando el concepto de presión de pastoreo (PP), el cual en lugar de estimar el consumo del animal asigna un porcentaje de su peso vivo como requerimiento de forraje. En venados, Hobbs y Swift (1985), McCall y col (1997) y Stuth y Sheffield (2001), han evaluado métodos que utilizan la materia seca o los nutrientes disponibles en el área y los dividen entre los requeri-mientos nutritivos. Sin embargo, dichos requerimientos

42

FX PLATA Y COL

son definidos en forma fija (Robbins 1973, McCall y col 1997, Galbraith y col 1998), lo que fisiológicamente no ocurre en los animales. Debido a que los requeri-mientos nutricionales cambian con la época del año, el género y el estado fisiológico del animal, Moen (1978) desarrolló un modelo para estimar el gasto energético de un venado cola blanca en función de estos factores y definió a este requerimiento de energía como meta-bolismo ecológico del venado (MEV); este modelo fue modificado por Clemente (1984), para estimar el MEV como requerimiento de energía metabolizable (EM) en función del peso vivo.

La estimación adecuada de K es fundamental para garantizar tanto el mantenimiento de la población de venados como el de la comunidad vegetal. Sin embargo, uno de los problemas que se tienen al determinar la K de hábitats para venado cola blanca en vida libre es que algunos métodos de estimación utilizan procedimien-tos similares a los usados con bovinos domésticos sin considerar su selectividad (McCall y col 1997, Stuth y Sheffield 2001). Los hábitos alimenticios del venado son de ramoneo y el tipo de vegetales que consumen son casi totalmente diferentes a los consumidos por los bovinos.Se ha demostrado que aun bajo condiciones de excelente pastizal, sólo consumen alrededor de un 8% de gramíneas del total de su dieta (Hansen y col 1977, Stuth y Winward 1977, Bryant y col 1979). Otros autores han mostrado que la palatabilidad de las arbustivas y las herbáceas es un factor determinante en la selección de la dieta de venados y que pueden incluso minimizar el consumo de leguminosas o gramíneas si este tipo de arbustivas están presentes (Augustine y Jordan 1998, Sauvé y Côté 2007, Plata y col 2009). También se ha demostrado que el uso de hábitat por esta especie es dependiente del tipo de especies vegetales que lo conforman, de tal manera que aunque un área ofrezca mayor biomasa vegetal comes-tible los venados pueden localizarse en mayor densidad en otras áreas con menor densidad relativa de alimento (Mandujano y col 2004).

Considerando que el metabolismo energético del venado cola blanca se modifica en una forma dinámica y que el modelo de presión de pastoreo utilizado en bovinos no ha sido evaluado en venado cola blanca, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar la estimación de K por cinco métodos, tres basados en disponibilidad de componentes nutritivos: materia seca (MS), energía digestible (ED), nitrógeno (N), otro basado en la presión de pastoreo y un último en el requerimiento de EM estimado con base al MEV, y 2) Estimar los cambios en la K al sustituir en los modelos evaluados la biomasa total por los grupos de vegetación consumidos por el venado (arbóreas, herbáceas, arbus-tivas y gramíneas) comparando los resultados de las estimaciones de capacidad de carga versus la densidad poblacional de venados reportada de la zona.

MATERIAL Y MÉTODOS

SITIO DE MUESTREO

Se usó la información del muestreo de vegetación realizado por Clemente (1984) en un rancho cinegético (“El Antrialgo”) localizado en el municipio de San José de Gracia, Aguascalientes, México, entre los paralelos 22º05’ y 22º10’ latitud N y los 102º35’ y 102º40’ latitud W, dentro de la zona sujeta a conservación ecológica denominada “Sierra Fría”. El rancho tiene una extensión de 260 ha, con una altura sobre el nivel del mar de 2.350 msnm. La precipitación anual de la región fue de 600 mm distribuidos principalmente de junio a octubre, la evapora-ción media anual es de 1.500 mm, y el clima corresponde al tipo BSwh de acuerdo a la clasificación de Koppen, modificada por García (1981). El tipo de suelo del área de estudio va de suelo complejo de montaña podzólico a suelo de depósito abanico aluvial y lacustre. La relación de especies que componen la cubierta vegetal del lugar se observa en el cuadro 1. Este rancho se caracterizó por tener actividad ganadera cuatro años antes de convertirse en rancho cinegético.

MUESTREO DE VEGETACIÓN

El muestreo de vegetación se realizó en los meses de julio (antes de la lluvia), octubre (época de lluvias) y diciembre (después de las lluvias) de 1983. Dichos muestreos corresponden a los momentos más importantes de cambios vegetativos (Beauchamp y Stromberg 2008, Rogers y col 2004) y no se muestreó al inicio del año por considerar que al no haber precipitación pluvial los cambios en crecimiento eran nulos (Otto y col 2002).

Tomando como criterio la dominancia de especies arbó-reas y arbustivas, se determinaron tres tipos de hábitats. El primero dominado por Quercus-Arctostaphylus, el segundo dominado por Quercus-Arctostaphylus-Juniperus, mientras que el tercero por Quercus-Juniperus. Todos los muestreos se realizaron en el año de 1984. Para el muestreo de julio se localizaron tres áreas representativas de cada hábitat y para los muestreos de octubre y diciembre se localizaron tres áreas representativas del primero y un área representativa del segundo y el tercero. En total se tuvieron 19 sitios de muestreo de 400 m2 (20 x 20 m) cada uno.

ESTIMACIÓN DE BIOMASA

Para las especies arbóreas de cada árbol dentro del área de muestreo se recolectó el material vegetativo disponible a 1,60 m de altura (Jordan 1967). Para las arbustivas menores a esa altura se colectó la biomasa total separando las hojas tiernas, rebrotes y frutos. Para las determinaciones de la disponibilidad de forraje (herbáceas y gramíneas) dentro de cada área de muestreo se distribuyeron al azar 2 cua-drantes de 1 m2 y se recolectó todo el material herbáceo y

43

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIÓN

gramíneo presente en el suelo (Bullock 1996). La biomasa vegetal de cada estrato se estimó como el producto del área total por el promedio de los kg de MS del mismo en ese periodo, mientras que la biomasa total fue el resultado de la sumatoria de las biomasas de todos los estratos en el mismo periodo.

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA BIOMASA VEGETAL

Tanto las especies analizadas como las características nutritivas, la composición química y la digestibilidad in vitro de la dieta de acuerdo a cada época fueron reportadas previamente (Clemente y col 2005). La concentración de energía bruta del alimento se determinó de acuerdo a los métodos oficiales de AOAC (1995). La concentración de energía digestible (ED) de cada estrato vegetal se estimó con el producto de la relación EDMS Mcal/kg = (DIVMS/100) × EB utilizando la digestibilidad in vitro de

los diferentes grupos vegetales en cada época del año y la relación de energía metabolizable se estimó con la ecuación EM = 0,82 × ED (González y Everitt 1982).

REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS DEL ANIMAL

Para la estimación del consumo de materia seca (CMS) y los requerimientos de ED y N, se consideró un venado de 60 kg de peso vivo (PV). El CMS en estos modelos se estimó con el valor obtenido por Galbraith y col (1998) de 46 g de MS por kilogramo de peso metabólico (CMS kg/ día = 0,046*PV0,75). La estimación del requerimiento de ED (RED) para mantenimiento fue de 158 kcal por kilogramo de peso metabólico (RED = 158* PV0,75; Ullrey y col 1970). El requerimiento de nitrógeno (RN) se estimó en 710 mg por kilogramo de peso metabólico (RN g/día = 0,710* PV0,75; Robbins 1973). El metabolismo ecológico del venado (MEV, kcal/día) se calculó utilizando una hoja de cálculo del programa

Cuadro 1. Especies que componen la cubierta vegetal del rancho El Antrialgo. Vegetal species at the soil cover at the Antrialgo Ranch.

Arctostaphylos pungens Ericaceae ArbustivaAristida orcuttiana Poaceae GramíneaBorreria densiflora Rubiaceae HerbáceaCarex coulteri Cyperaceae Herbácea

Calea spp Asteraceae HerbáceaCastilleja tenuiflora Scrophulariaceae ArbustivaCologania angustifolia Fabaceae HerbáceaCologania obovata Fabaceae HerbáceaConyza gnaphalioides Asteraceae HerbáceaCyperus seslerioides Cyperaceae HerbáceaEvolvulus prostratus Convolvulaceae HerbáceaGeranium spp Geraniaceae ArbustivaAllium glomeratum Liliaceae HerbáceaHypericum silenoides Clusiaceae HerbáceaIpomoea capillacea Convolvulaceae HerbáceaJuniperus deppeana Cupressaceae ArbóreaLycurus phleoides Poaceae GramíneaMuhlenbergia emersleyi Poaceae GramíneaMuhlenbergia pungens Poaceae GramíneaMuhlenbergia rigida Poaceae GramíneaOdontotrichum amplum Asteraceae HerbáceaOxalis latifolia Oxalidaceae HerbáceaPerymenium buphthalmoides Asteraceae ArbustivaPolygala alba Polygalaceae HerbáceaQuercus rugosa Fagaceae ArbustivaQuercus microphylla Fagaceae ArbustivaStevia pilosa Asteraceae HerbáceaStevia serrata Asteraceae HerbáceaStipa virescens Poaceae GramíneaViola barroetana Violaceae Herbácea

44

FX PLATA Y COL

Excel de Microsoft Office y se encuentra disponible en la plataforma de Bioeficiencia1 que corresponde al modelo de Moen (1978) modificado por Clemente (1984), con el cual se estimó el requerimiento energético considerando los días julianos 31, 59, 90, 120, 151, 181, 212, 243, 273, 304, 330 y 365 que corresponden al día último de cada mes, respectiva-mente, y se multiplicó por el número de días de cada mes.

DENSIDAD ANIMAL

La densidad poblacional de venado en el año durante el cual se hizo el muestreo de vegetación en la zona fue reportada por Romo (1987), quien estimó la densidad de venados en la zona aplicando dos técnicas diferentes: un muestreo por transectos de observación directa y un muestreo por conteo indirecto basado en indicios (huellas). También se consideraron los antecedentes publicados por Villalobos (1998), quien reportó estimados de la población de venados en Sierra Fría desde 1975 hasta 1996. Estas estimaciones fueron realizadas a partir de 24 muestreos realizados en un área de 2.975 ha. Ambas densidades junto con las de Kobelkowsky y col (2000) fueron tomadas como indicadores de referencia para discutir la estimación de la capacidad de carga (Mandujano 2007).

ESTIMACIÓN DE CAPACIDAD DE CARGA

Se estimó la K del área muestreada utilizando los mo-delos descritos a continuación. En todos los métodos la eficiencia de utilización fue del 35%, ya que en el modelo logístico de crecimiento dicha asignación garantiza que el crecimiento de una población no se limita (Gotelli 1998). La estimación se realizó para cada periodo de muestreo considerando su duración (91 días el verano, 61 días el otoño y 213 días el período de invierno).

MODELOS EVALUADOS

MODELOS DE DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES

Se seleccionaron tres de los métodos publicados por McCall y col (1997) basados en la disponibilidad de MS, ED y N. Para estimar la K con la biomasa total se usó el algoritmo de Hobbs y Swift (1985), utilizando la ecuación 1. Para la estimación de la K por grupo vegetal se consideró la concentración del nutriente evaluado (MS, ED o N) en cada uno de los estratos vegetales presentes en el área, utilizando la ecuación 2.

(1) KBi Fj

RDi

n

=∗

=∑0 35 1,

1 Modelación sobre eficiencia animal. http://bioeficiencia.avanzavet.com/ consultada el 12 de febrero de 2008.

(2) KBi Fj

RD= ∗

0 35,

Donde:

K = Carga del área de estudio (venados/ha).Bi = Biomasa del estrato vegetal i (gramíneas, herbáceas, arbustivas y arbóreas; kg/ha).Fj = Contenido de los componentes nutritivos del estrato vegetal j (MS kg, N kg/kg o ED Mcal/kg).R = Requerimiento de los componentes nutritivos de un venado de 60 kg (kg o kcal).D = Tiempo de utilización (días).0,35 = Eficiencia de utilización del forraje.

MÉTODO BASADO EN LA PRESIÓN DE PASTOREO

Para estimar la capacidad de carga con el método basado en la presión de pastoreo (Paladines y Lazcano 1983) se estimó la disponibilidad (D) de MS total o de cada estrato vegetal por ha y se aplicó la siguiente ecuación:

(3) K

D AT PP

=

∗ ∗ ∗∗

0 35 100

60

,

Donde:

K = Capacidad de carga (venado/ha)D = Disponibilidad de MS total o por estrato vegetal (kg/ha)0,35 = Eficiencia de utilización del forrajeA = área (ha)T = Tiempo (días)PP = Presión de pastoreo (% de PV)60 = Peso vivo del venado (kg)

La presión de pastoreo asignada fue igual al factor de consumo proporcional al peso vivo (PV) propuesto por Stuth y Sheffield (2001) de 3,5% del PV, el tiempo (T) cambió de acuerdo a la época del año. Para determinar el número de animales por ha (K) que se pueden sostener con los diversos estratos vegetales se dividió el número de kg de animal entre 60.

En las metodologías basadas en la disponibilidad de MS, ED y N y en la presión de pastoreo, el consumo y los requerimientos fueron mantenidos constantes a lo largo del año.

MÉTODO BASADO EN EL METABOLISMO ECOLÓGICO

Este método se basó en una estimación del requeri-miento energético del venado en vida libre, por una serie de ecuaciones que conforman el metabolismo ecológico (ME, kcal/día), el cual se calculó utilizando la secuencia

45

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIÓN

descrita por Moen (1978) modificada por Clemente (1984). A diferencia de los métodos anteriores, el modelo de me-tabolismo ecológico es un método dinámico que cambia el requerimiento energético de acuerdo a la época del año junto con los cambios de actividad del venado. Para estimar la capacidad de carga en este modelo se dividió la energía metabolizable disponible de la biomasa total o de los diver-sos estratos vegetales entre la sumatoria del requerimiento energético del animal de los meses que corresponden a cada periodo, utilizando la siguiente fórmula:

(4) KEmf A

MEVn

dm

=∗ ∗

-

-

∑∑

0 351

1

,

Donde:

K = Capacidad de carga (venados de 60 kg/ha)Emf = Energía metabolizable del forraje de la especie vegetal 1 hasta n (kcal /ha)A = área total del predio (ha)n = Estratom = Día julianoMEVd = Metabolismo ecológico diario de un venado de 60 kg (kcal/día). El cálculo de esta variable se observa en el cuadro 2.0,35 = Eficiencia de utilización del forraje

ANáLISIS ESTADÍSTICO

Tanto el análisis estadístico de la biomasa de los dife-rentes grupos vegetales como de la capacidad de carga se realizaron utilizando un diseño en bloques al azar conside-rando a la época del año como factor de heterogeneidad y se realizó una prueba de Tukey para comparar las medias de los tratamientos, para lo cual se utilizó el procedimiento GLM del SAS (1994, SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA). La biomasa total no se incluyó en dicho análisis por ser el resultado de la sumatoria de los grupos vegetales; en consecuencia, es mayor a cada uno de los mismos.

Los estimados de capacidad de carga se analizaron con un diseño de tratamientos con arreglo factorial (cinco

por cinco), donde los factores fueron los métodos y los estratos vegetales consumidos por el venado (MS total, gramíneas, herbáceas, arbustivas y arbóreas). Por esto también se realizaron contrastes de interés, para comparar algunos efectos específicos tanto entre grupos vegetales como entre métodos (Herrera y Barreras 2005).

RESULTADOS

En el cuadro 1 se presenta la relación de las especies que componían la cubierta vegetal y que fueron mues-treadas para la estimación de biomasa total, disponible y nutrientes aportados para la estimación de K. El análisis estadístico mostró que existieron diferencias estadísticas (P < 0,05) tanto entre la biomasa vegetal total y disponible por grupo vegetal como en la concentración de energía digestible y metabolizable de los mismos (cuadro 3). Las gramíneas fueron el grupo que aportó la mayor cantidad de biomasa, energía digestible y metabolizable, mientras que las arbóreas y herbáceas aportaron cantidades inter-medias y las arbustivas fueron las que menor cantidad de compuestos nutritivos aportaron. Sin embargo, la cantidad de N disponible por grupo vegetal no mostró cambios importantes (P > 0,05). La época del año no modificó ni la biomasa total ni la disponibilidad de MS en cada estrato vegetal, ni tampoco tuvo efecto en los compuestos nutritivos disponibles. Debido a que no se encontraron efectos de la época del año, en el cuadro 3 se presentan las medias y el error estándar de la biomasa disponible y los compuestos nutritivos contenidos en cada estrato. Además, se presenta como referencia la biomasa total, biomasa disponible y compuestos nutritivos resultantes de la sumatoria de los grupos vegetales y los requerimientos de MS, ED, N y EM de un animal de 60 kg de peso vivo.

En el análisis estadístico de K (cuadro 4) se encon-traron diferencias significativas tanto entre los métodos de estimación (P < 0,003) como entre la K estimada a partir de los diversos grupos vegetales (P < 0,0001); sin embargo, la interacción entre los mismos no fue signifi-cativa (P = 0,20), por lo que sólo se presentan los efectos principales de método de estimación y grupo vegetal, los cuales se contrastan con la densidad poblacional

Cuadro 2. Modelos para estimar el metabolismo ecológico de los venados de cola blanca1. Models for estimation of ecological metabolism of white-tailed deer.

MachosMEm = [{1,02850 sin [(Dj) (0,09863) + 239] + 0,0281} + 2,67] ∗ 70 {[(e1,617 + 0,3810 In edias) ∗ {sin [Dj) (0,9863) + 90] ∗ 0

HembrasMEH = 2,56894e0,19602 (c) ({[1,0285 ∗ sin [(dj + 170,0536e0,15488(c)) ∗ 0,9863] + 0,0281] [0,19 + 0,05 (c)]} + [0,81 - 0,05 (c)]) * 70 {[(e1,617+0,3810 In edias) ∗ {sin [(Dj) (0,98)

1 La solución a la ecuación está disponible en Bioeficiencia. Modelación sobre eficiencia animal. http://bioeficiencia.avanzavet.com/ consultada el 12 de febrero de 2008.

46

FX PLATA Y COL

Cuadro 3. Biomasa, compuestos nutritivos disponibles por grupo vegetal y requerimientos del venado de cola blanca utilizados para estimar capacidad de carga con diferentes métodos. Biomass, nutrient availability by vegetative group and white-tailed deer requirements used to estimate carrying capacity with different methods.

Aportes nutritivosBiomasa disponible por grupo vegetal

Gramíneas Herbáceas Arbóreas Arbustivas Total EEM

Materia seca disponible (kg/ha) 127,4a 49,5ab 38,3ab 5,8b 221,1 24,2

Proporción de la biomasa aportada (%) 57,3 22,4 17,3 2,6 100

ED1 (Mcal/ha) 135,4a 113,4ab 54,0ab a9,6b 312,4 26,9

Proporción de la ED aportada (%) 43,3 36,4 17,3 3,1

EM2 (kcal/ha) 111,0a 93,0ab 44,3ab 7,9b 256,2 22,0

Proporción de la EM aportada (%) 43,3 36,3 17,3 3,1

Nitrógeno (kg/ha) 0,76a 0,64a 0,38a 0,05a 1,83 1,0

Proporción del N aportado (%) 22,7 35,0 20,6 2,9

Requerimientos anuales del venado de cola blanca3

MS, kg/año ED, Mcal/año N, kg/año MS asignada4/año EM, Mcal/año

334,15 1.154,896 5,184 766,5 880, 62

ab Literales diferentes en el mismo renglón son diferentes (P < 0,05).1 ED: Energía digestible.2 EM: Energía metabolizable.3 Considerando un venado con un PV de 60 kg, por lo que el peso metabólico3 (Peso vivo),75 es de 19,90 kg.4 Es la cantidad de MS asignada de acuerdo a la presión de pastoreo. Kg de forraje por 3,5% PV.

Cuadro 4. Capacidad de carga de venados de cola blanca (venados/ha) estimada por diferentes métodos y grupos vegetales. Carrying capacity of white-tailed deer (deer/ha) estimated using different methods and vegetal groups.

Método de estimación

Disponibilidad de compuestos nutritivos

MS1 Nitrógeno ED2 Presión de pastoreo Metabolismo ecológico EEM

1,043a 0,604ab 0,451b 0,387b 0,256b 0,118

Grupo vegetal

Pastos Herbáceas Arbóreas Arbustivas Total EEM

0,707b 0,325bc 0,228c 0,033c 1,449a 0,118

Densidad animal, venados /ha

Autor, (año) 1975 1978 1984 1991 1996 2000

Romo, (1987) 0,02-0,04

Villalobos, (1998) 0,0065 0,0159 0,0241 0,0181 0,027

Kobelkowsky y col (2000) 0,0231

1 Materia seca.2 Energía digestible.abc Literales distintos son diferentes estadísticamente, Tukey (P < 0,05).

47

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIÓN

(DP) del venado cola blanca en los años del muestreo y subsecuentes publicados por Romo (1987), Villalobos (1998) y Kobelkowsky y col (2000). Dentro de métodos, la estimación de K utilizando la MS generó el valor más alto, mientras que la estimación por PC produjo valores intermedios y el uso de ED, PP y EM generaron los valo-res más bajos. Dentro de grupos vegetales, la estimación más alta de K se obtuvo con la sumatoria de la biomasa de los diferentes grupos, mientras que las gramíneas y las herbáceas generaron valores intermedios y tanto las arbó-reas como las arbustivas tuvieron los valores menores; sin embargo, sólo estas últimas tuvieron un valor de K menor a la DP. El análisis de los contrastes mostró que dentro de los métodos evaluados tanto la suma de las herbáceas con las arbustivas versus los pastos y las arbóreas como la de las arbustivas con las arbóreas versus los pastos y las herbáceas tuvieron una menor K (0,15 vs. 0,33 P < 0,01 y 0,10 vs. 0,38 P < 0,002).

DISCUSIÓN

Las diferencias en la biomasa vegetal y en la cantidad de componentes nutritivos disponibles aportados por cada grupo vegetal pueden ser explicadas parcialmente en base a la ausencia de actividad ganadera que tenía el rancho antes de convertirse en coto de caza. Holecheck y col (2006) han revisado y discutido en forma abundante los efectos del pastoreo en la vegetación; sus datos muestran que dicha actividad incrementa la cantidad de gramíneas y reduce el número de arbustivas presentes en un sitio. Sin embargo, cuando dicha actividad desaparece por efecto de exclusión del ganado la sustitución de gramíneas por herbáceas y arbustivas es mínima si no se realiza una práctica cultural que estimule el crecimiento de las mismas (Adler y col 2004). También, trabajos publicados por Bates (2005) y Bates y col (2005) muestran que la producción de herbáceas y arbustivas se deprime por la ausencia de prácticas de corte o pastoreo de tal forma que se ocasiona una reducción en la biomasa de las mismas después de 4 años. Tobler y col (2003) mostraron que el pastoreo de bovinos modifica la proporción de especies gramíneas en un clima de sabana, por lo que bajo las condiciones de este trabajo, no es sorprendente que la biomasa aportada por los pastos sea mayor que la aportada por los otros grupos vegetales.

Por otro lado, la ausencia del efecto de época del año ha sido similar a la de otros estudios, que muestran que bajo un estado de equilibrio, la biomasa producida en una comunidad vegetal permanece relativamente constante a lo largo de las diferentes épocas del año, lo cual se explica como el resultado del incremento de la MS de algunas especies vegetales cuando otras tienden a disminuir su producción en el mismo momento (Buttolph y Coppock 2004).

La estimación de la capacidad de carga es un problema que ha sido tratado de resolver desde hace mucho tiempo

utilizando diversas metodologías que incluyen la dispo-nibilidad de la MS (McCall y col 1999), del hábitat de la zona (Warren y Krysl 1983), así como la concentración de proteína y ED de la dieta (McCall y col 1997), usando como referencia el requerimiento de MS, proteína o energía de un venado cola blanca estándar. Sin embargo, dentro de la literatura revisada, sólo el estudio de Mandujano (2007) ha contrastado la capacidad de carga estimada con la densidad poblacional, lo cual sería el criterio de comparación más cercano para la evaluación del pará-metro estimado.

La comparación de la K con la DP es importante, dado que de acuerdo con Mandujano (2007), cuando un área no tiene disturbios, la K es igual a la DP más los animales muertos por los predadores y, en consecuencia, las K esti-madas correctamente son aquellas que se acercan más a la DP. En ese sentido, nuestros resultados indican que tanto los métodos como los componentes nutritivos selecciona-dos para determinar el requerimiento del animal tienen un impacto en la estimación de la capacidad de carga. A menor exigencia en el requerimiento de forraje o de nutrientes, mayor K estimada. Por ejemplo, si se compara la capacidad de carga estimada a partir de la concentración de ED de los grupos vegetales (0,451) con la estimada en base al metabolismo ecológico (0,256), se puede apreciar que, al no considerar el gasto energético adicional al metabolismo basal lleva a una sobrestimación de la misma. El cálculo original de Moen (1978) para estimar el metabolismo ecológico del venado es laborioso; sin embargo, el uso de programas disponibles en plataformas permite deter-minar el requerimiento en forma sencilla considerando otros factores (época del año, sexo, estado fisiológico) y mejora la estimación del requerimiento energético evitando la subestimación del mismo. La metodología basada en presión de pastoreo tiene la ventaja de ser más sencilla en su uso para los manejadores de fauna silvestre, pues no requiere el cálculo del requerimiento energético del venado en vida libre.

Los resultados de esta estimación muestran que el uso de biomasa total, así como el de gramíneas, arbóreas y herbáceas, resulta en valores más altos que la DP, lo cual sobrestima el número de animales que puede soportar el área; en contraste, la estimación de K con arbustivas resulta en valores que indican que podría estar cercana a la DP (0,04 venados/ha), dicha DP se mantiene a lo largo del tiempo durante al menos 15 años después del estudio (cuadro 2), lo que corrobora entonces que la estimación de capacidad de carga a partir de las arbustivas es un método que permite obtener valores cercanos a la misma. Aunque diversos in-vestigadores han mostrado que el venado cola blanca tiene una dieta basada predominantemente en especies arbustivas y arbóreas (85%), las herbáceas y gramíneas forman parte de su dieta (Gallina 1993, Plata y col 2009). También se ha demostrado la tendencia de dicha especie a migrar a áreas con una menor biomasa vegetal si esta es de mayor calidad nutritiva (Mandujano y col 2004).

48

FX PLATA Y COL

La estimación de la K a partir de la sumatoria de todas las especies vegetales está fundamentada en las preferencias de los rumiantes por las especies vegetales y el hecho de que los venados tienen una dieta diversa, por lo que se puede utilizar la sumatoria de la biomasa de los diversos grupos vegetales que el animal consume (Stuth y Sheffield 2001). Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el uso de biomasa total no es viable para estimar la K porque la proporción de grupos vegetales consumidos no es homogénea, por lo que se requeriría identificar la preferencia del grupo vegetativo consumido por cada tipo de rumiante y así corregir los aportes.

La estimación de K con base a las gramíneas resulta en valores mayores que la DP; además, su uso como estima-dor para venados puede ser biológicamente cuestionado. Estudios de composición de dieta del venado cola blanca en México indican que los pastos pueden estar del 0 al 6% (Martínez y col 1997, Clemente y col 2005, Plata y col 2009). La baja capacidad de los selectores de con-centrados para incluir gramíneas en su dieta (< 25%) ha sido establecida claramente por Janis y col (2000) y está asociada al tamaño y requerimiento metabólico del animal, pues se ha establecido que las especies con menor tamaño tienen un mayor gasto energético y una mayor velocidad de tránsito intestinal que las especies grandes, por lo que están obligados a buscar tanto las especies vegetales como las partes más nutritivas de la planta que garanticen su supervivencia (McNaughton y Georgiadis 1986). La estimación de K basada en herbáceas y arbóreas produce valores mayores a la DP. En el caso de las herbáceas se ha detectado que bajo condiciones de pastoreo tanto de animales domésticos como silvestres uno de los impactos más comunes es la modificación de la composición de tal forma que aumenta el número de plantas indeseables por dichas especies (Gonzales y Clements 2010), esta proliferación de especies no consumidas puede explicar el aumento de K y la baja DP del sitio.

Por su parte, el uso de arbustivas estimaría una ca-pacidad de carga muy similar a la DP, lo cual se puede explicar por el hecho de que este grupo constituye uno de los principales alimentos consumidos por el venado. En la zona de estudio, este grupo se ha encontrado como componente de la dieta del venado cola blanca desde el 39% (Kobelkowsky 2000) hasta el 49% (Clemente y col 2005). También, los trabajos de Stewart y col (2000) muestran la predilección que tienen los venados hacia los arbustos. Sus datos muestran que independientemente de la cobertura los venados prefieren áreas con más presencia de arbustivas que de herbáceas. Paton y col (1999) utilizaron la EM de este grupo vegetal para estimar la K en áreas naturales de España con buenos resultados, por lo que en términos prácticos lo más sencillo sería estimar la K a partir de la disponibilidad de MS de arbustivas utilizando el modelo con la presión de pastoreo, mientras que lo más complicado es estimar dicha variable a partir de la EM y el metabolismo ecológico del venado.

Se concluye que la determinación de la capacidad de carga en venado cola blanca debe considerar sus prefe-rencias alimenticias, la selección del método y el impacto que tienen los requerimientos de nutrientes en la estima-ción del parámetro. Los métodos en base a energía y PP producen mejores estimaciones que los métodos basados en N o MS, dado que los resultados son más cercanos a la densidad poblacional y se esperaría que no pusiesen en riesgo a largo plazo el uso sustentable del recurso vegetal. Tanto el uso de biomasa total como de pastos, herbáceas y arbóreas producen una sobrestimación de la capacidad de carga, por lo no se recomiendan para estimar K. Bajo las condiciones de este trabajo la estimación de K a partir de la biomasa disponible de las arbustivas produce la mejor aproximación a la DP del área.

RESUMEN

Debido a la importancia que tiene la metodología en la estimación de la capacidad de carga (K animales/ha) en venado cola blanca, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar la estimación de la K por cinco métodos; tres basados en disponibilidad de compuestos nutritivos (materia seca (MS), energía digestible (ED) y nitrógeno (N)), otro basado en la presión de pastoreo y un último en el requerimiento de energía metabolizable (EM) estimado con base al metabolismo ecológico del venado, y 2) Comparar la K estimada al usar la biomasa total o por los grupos de vegetales consumidos por el venado (gramíneas, herbáceas, arbustivas y arbóreas). Se utilizó la información de composición de la dieta y de biomasa de un rancho cinegético localizado en Aguascalientes, México. Los resultados fueron analizados de acuerdo a un modelo con arreglo factorial (5 x 5), donde los factores fueron el método de estimación y el grupo vegetal. Los valores de K estimados con biomasa total fueron los mayores (1,449), seguidos por los pastos (0,707), luego por las herbáceas (0,325), mientras que los estimados con arbóreas y arbustivas dieron los menores valores (0,228 y 0,03). La estimación de K por medio de plantas arbustivas (0,033 venados/ha) proporciona un valor más similar al de la densidad poblacional (0,02-0,04 venados/ha) que el estimado con otros grupos vegetativos, independientemente del método seleccionado (disponibilidad de MS, ED, N, metabolismo ecológico y la presión de pastoreo). Considerando la densidad poblacional (0,02-0,04 venados/ha) como el indicador apropiado para evaluar la capacidad de carga, se concluye que debe estimarse con base a la disponibilidad de arbustivas.

REFERENCIAS

Adler PB, DG Milchunas, WK Lauenroth, OE Sala, IC Burke. 2004. Functional traits of graminoids in semi-arid steppes: a test of grazing histories. J Appl Ecol 41, 653-663.

AOAC, Association of Official Analytical Chemists. 1995. Methods of Analysis. Washington D.C., USA.

Augustine DJ, PA Jordan. 1998. Predictors of white-tailed deer grazing intensity in fragmented deciduous forests. J Wild Manage 62, 1076-1085.

Bates JD. 2005. Herbaceous response to cattle grazing following Juniper cutting in Oregon. Rangeland Ecol Manag 58, 225-233.

Bates JD, RF Miller, T Svejcar. 2005. Long-term successional trends following western Juniper cutting. Rangeland Ecol Manage 58, 533-541.

Beauchamp VB, JC Stromberg. 2008. Changes to herbaceous plant communities on a regulated desert river. River Res Applic 24, 754-770.

49

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIÓN

Beck JL, JM Peek, EK Strand. 2006. Estimates of elk summer range nutritional carrying capacity constrained by probabilities of habitat selection. J Wild Manage 70, 283-294.

Bryant FC, MM Kothmann, LB Merrill. 1979. Diets of sheep, angora goats, spanish goats and white-tailed deer under excellent range conditions. J Range Manage 32, 412-417.

Bullock J. 1999. Plants. In: Sutherland WJ (ed). Ecological census techni-ques. A Handbook. Cambridge University Press, Cambridge, UK.

Buttolph LP, DL Coppock. 2004. Influence of deferred grazing on ve-getation dynamics and livestock productivity in an Andean pastoral system. J Applied Ecol 41, 664-674.

Clemente SF. 1984. Utilización de la vegetación nativa del venado cola blanca (Odocoileus virginianus). Tesis de Maestría, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México, México.

Clemente SF, E Riquelme, GD Mendoza, R Barcena, S González, R Ricalde. 2005. Digestibility of forage diets of white-tailed deer (Odocoileus virginianus, Hays) using different ruminal fluid inocula. J Appl Anim Res 27, 71-76.

Galbraith JK, GW Mathison, RJ Hudson, TA McAllister, KJ Cheng. 1998. Intake, digestibility, methane and heat production in bison, wapiti and white-tailed deer. Can J Anim Sci 78, 681-691.

Gallina SA. 1990. El venado cola blanca y su hábitat en la Michilia, Durango. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, México.

Galt D, F Molinar, J Navarro, J Joseph, J Holechek. 2000. Grazing capacity and stocking rate. Rangelands 22, 7-11.

García E. 1981. Modificaciones al sistema de clasificación climática de Köppen para adaptarlo a las condiciones de la República Mexicana. Instituto de Geografía, Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F., México, Pp 145-150.

Gonzales EK, DR Clements. 2010. Plant Community Biomass shifts in response to mowing and fencing in invaded oak meadows with non-native grasses and abundant ungulates. Restoration Ecology 18, 753-761.

González CL, JH Everitt. 1982. Nutrient contents of major food plants eaten by cattle in the south Texas plains. J Range Manage 35, 733-736.

Gotelli NJ. 2008. Logistic population growth. In: Gotelli NJ (ed). A primer of ecology. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Ma, USA, Pp 25-48.

Hansen RM, RC Clark, W Lawhorn. 1977. Foods of wild horses, deer, and cattle in the Douglas mountain area, Colorado. J Range Manage 30, 116-118.

Herrera JG, AB Serrano. 2005. Comparación de medias de tratamientos En: Martínez JA (ed). Análisis estadístico de experimentos agrope-cuarios. Colegio de Postgraduados, México, Pp 124-136.

Hobbs NT, DM Swift. 1985. Estimates of habitat carrying capacity incorporating explicit nutritional constraints. J Wild Manage 49, 814-822.

Holechek JL, TT Baker, JC Boren, D Galt. 2006. Grazing impacts on rangeland vegetation: what we have learned. Livestock grazing at light-to-moderate intensities can have positive impacts on rangeland vegetation in arid-to-semiarid areas. Rangelands 28, 7-13.

Jacoby PW. 1989. A glossary of terms used in range management: A definition of terms commonly used in range management. Society for Range Management, Denver, Colorado, USA, Pp 1-20.

Janis CM, J Damuth, JM Theodor. 2000. Miocene ungulates and te-rrestrial primary productivity: Where have all the browsers gone? PNAS 97, 7899-7904.

Jordan JS. 1967. Deer browsing in northern hard-woods after clear cutting. uS Forest Serv Res Paper No 57.

Kobelkowsky SR. 2000. Evaluación de hábitat y estructura de la pobla-ción de venado cola blanca (Odocoileus virginianus) en la región central de la Sierra Fría, Aguascalientes. Tesis de Maestría, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México, México.

Kobelkowsky-Sosa R, J Palacio-Núñez, F Clemente-Sánchez, GD Mendoza-Martínez, JG Herrera-Haro, J Gallegos-Sánchez. 2000.

Calidad del hábitat y estado poblacional del venado cola blanca (Odocoileus virginianus, Hays) en ranchos cinegéticos de la sierra fría, Aguascalientes. Revista Chapingo Serie Ciencias Forestales y del Ambiente 6, 125-130.

Mandujano S, S Gallina, G Arceo, A Pérez-Jiménez. 2004. Variación estacional del uso y preferencia de los tipos vegetacionales por el venado cola blanca en un bosque tropical de Jalisco. Acta Zoológica Mexicana (N.S.) 20, 45-67.

Mandujano S. 2007. Carrying capacity and potential production of un-gulates for human use in a Mexican tropical dry forest. Biotropica 39, 519-524.

Martínez MA, V Molina, F González, S Marroquín, J Navar. 1997. Observations of white-tailed deer and cattle diets in México. J Range Manage 50, 253-257.

McCall DG, DA Clark, LJ Stachurski, JW Penno, AM Bryant, BJ Ridler. 1999. Optimized dairy grazing systems in the northeast United States and New Zealand. I. Model description and evaluation. J Dairy Sci 82, 1795-1807.

McCall TC, RD Brown, CL Bender. 1997. Comparison of techniques for determining the nutritional carrying capacity for white-tailed deer. J Range Manage 50, 33-38.

McLeod SR. 1997. Is the concept of carrying capacity useful in variable environments? Oikos 79, 529-542.

McNaughton SJ, NJ Georgiadis. 1986. Ecology of African grazing and browsing mammals. Ann Rev Ecol Syst 17, 39-65.

Miller KV, JM Wentworth. 2000. Carrying capacity. In: Demarais S, Krausman PR (eds). Ecology and management of large mammals in North America. Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, USA, Pp 140-155.

Moen AN. 1978. Seasonal changes in heart rates, activity, metabolism, and forage intake of white- tailed deer. J Wild Manage 42, 715-738.

Otto R, JM Fernández-Palacios, BO Krüsi. 2001. Variation in species composition and vegetation structure of succulent scrub on Tenerife in relation to environmental variation. J Veg Sci 12, 237-248.

Paladines O, CE Lascano. 1983. Recomendaciones para evaluar ger-moplasma bajo pastoreo. En: Lascano CE (ed). Germoplasma forrajero bajo pastoreo en pequeñas parcelas, Vol. 1. CIAT, Colombia, Pp 165-183.

Plata FX, S Ebergeny, JL Resendiz, O Villarreal, R Bárcena, JA Viccone, GD Mendoza. 2009. Palatabilidad y composición química de alimentos consumidos en cautiverio por el venado cola blanca de Yucatán (Odocoileus virginianus yucatanensis). Arch Med Vet 41, 123-129.

Paton D, J Núñez-Trujillo, MA Díaz, A Muñoz.1999. Assessment of browsing biomass, nutritive value and carrying capacity of shrublands for red deer (Cervus elaphus L.) management in Monfragüe natural park (SW Spain) J Arid Environ 42, 137-147.

Robbins CT. 1973. The biological basis for the determination of ca-rrying capacity. Doctoral dissertation, Cornell University, Ithaca, NY, USA.

Rogers O, TE Fulbright, DC Ruthven III. 2004. Vegetation and deer response to mechanical shrub clearing and burning. J Range Manage 57, 41-48.

Romo DM. 1987. Dinámica de la población del venado cola blanca (O. virginianus) en la sierra de San Blas de pabellón del estado de Aguascalientes, México. Tesis de Biología, Centro Básico. Universidad Autónoma de Aguascalientes, México.

Sauvé DG, SD Côté. 2007. Winter forage selection in white-tailed deer at high density: Balsam Fir is the best of a bad choice. J Wild Manage 71, 911-914.

Steel RG, JH Torrie. 1980. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. McGraw-Hill Book Company, New York, USA, Pp 172-233.

Stuth JW, AH Winward. 1977. Livestock-deer relations in the Lodgepole pine-pumice region of central Oregon. J Range Manage 30, 110-116.

Stuth JW, WJ Sheffield. 2001. Determining carrying capacity for com-binations of livestock, white-tailed deer and exotic ungulates. In:

50

FX PLATA Y COL

Wildlife Management Handbook, Texas A&M University System, Texas, USA, Pp 5-12.

Tobler MW, R Cochard, PJ Edwards. 2003. The impact of cattle ranching on large-scale vegetation patterns in a coastal savanna in Tanzania. J Applied Ecol 40, 430-444.

Ullrey DE, WG Youatt, HE Johnson, LD Fay, BL Schoepke, WT Magee. 1970. Digestible and metabolizable energy requirements for winter maintenance of Michigan white-tailed does. J Wild Manage 34, 863-869.

Villalobos SV. 1998. El venado cola blanca en la sierra fría de Aguascalientes. Agric Rec Nat 2, 2-33.

Warren RJ, LJ Krysl. 1983. White-tailed deer food habits and nutritional status as affected by grazing and deer-harvest management. J Range Manage 36, 104-109.

Young CC. 1998. Defining the range: The development of carrying capacity in management practice. J History Biol 31, 61-83.

51

Arch Med Vet 43, 51-58 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 06.10.2010.

* Casilla Nº 567, Valdivia, Chile; mmieres@uach.cl

Evaluación a través de tomografía computarizada del efecto de una infusión endovenosa de ketamina en el desarrollo de atelectasia inducida por anestesia general en perros

Evaluation of an endovenous ketamine infusion through computed tomography on the development of pulmonary atelectasis due to general anesthesia in dogs

CA Henríqueza, LM Mieresb*, HA Bustamanteb, DE Herzbergb, CE Campilloa, MP Cabrerab, MA Gómezc

aPrograma de Doctorado en Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.bInstituto de Medicina Preventiva Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.cInstituto de Farmacología y Morfofisiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

The aim of this study was to assess through computed tomography the presence of pulmonary atelectasis in dogs under inhalatory anesthesia and evaluate the effect of an endovenous ketamine infusion upon it. For this purpose 12 dogs separated in two groups (A and B) of 6 dogs each were used. Both groups were subjected to the same anesthetic protocol. The protocol consisted in premedication with xilacine IM, induction with propofol IV and maintenance with inhalatory anesthesia for a period of two hours. The group B received also a ketamine infusion. Computed tomographic images were taken at 0, 60 and 120 minutes, with the purpose of monitoring developments of atelectasis. In 58% of the dogs it was possible to determine the presence of some degree of atelectasis. In these animals atelectasis was observed in all the cases, but only in one lung. Atelectasis was found in 5 animals in the group without infusion of ketamine and in 2 animals in the group with infusion. The collapsed lung zones ranged between 0.13 and 8.03 cm2 in group A, and 0.07 and 2.10 cm2 in group B. Results indicated that ketamina infusion did not influence the presentation of pulmonary atelectasis. With regard to the evolution of the atelectasis through time, slight changes were observed in both groups, not being statistically significant (P > 0.05).

Palabras clave: atelectasia, anestesia, tomografía computarizada, perro.Key words: atelectasis, anesthesia, computed tomography, dog.

INTRODUCCIÓN

El intercambio gaseoso óptimo requiere el transporte conjunto de aire y de la sangre hasta el alvéolo (ventilación y flujo sanguíneo), por lo que la relación de ventilación y perfusión (V/Q) es vital. De forma ideal el pulmón debiera recibir volúmenes equilibrados tanto de ventilación como de perfusión. En condiciones reales, existe un cierto dese-quilibrio V/Q en parte como resultado de la acción de las fuerzas de gravedad sobre el pulmón, como se aprecia en animales de gran tamaño (como por ejemplo equinos) en decúbito, sobre todo supino y lateral (Robinson 2003).

La anestesia general y enfermedades pulmonares acentúan el desequilibrio V/Q y por lo tanto perjudican el intercambio de gases (Robinson 2003).

En humanos se puede encontrar aproximadamente entre 16 a 20% del parénquima pulmonar hipoventilado o colapsado durante la anestesia, generando zonas de baja relación V/Q y shunt pulmonar (Hedenstierna y col 1986). El colapso ocurre con regularidad durante el periodo de inducción anestésica, pero puede persistir aún después

de finalizado el proceso anestésico y contribuye signifi-cativamente a aumentar los gastos de atención de salud, la convalecencia e incluso aumenta la probabilidad de enfermedad y muerte (Magnusson y Spahn 2003).

En la década de los ochenta fue diagnosticado en humanos por primera vez el colapso alveolar producido por anestesia. Esto fue observado tanto en pacientes neo-natos como adultos gracias a la introducción de nuevas técnicas de rayos X como la tomografía computarizada (TC) (Magnusson y Spahn 2003). Este colapso alveolar se denominó atelectasia pulmonar, la cual era producida por la anestesia (Tusman y col 2002). En 1985, Brismar y col mostraron que 5 minutos posterior a la inducción de la anestesia aparecían picos de densidad en ciertas áreas de ambos pulmones. Luego Hedenstierna y col (1989) también encontraron estos aumentos de densidad en ovejas anestesiadas, demostrando a través de microscopía que estas densidades se trataban de regiones pulmonares atelectásicas (Pedersen y col 1992). La cantidad de tejido atelectásico está determinada por la magnitud del shunt producido por la anestesia (Warner y col 1996).

La atelectasia pulmonar aparece en el 90% de los pacientes humanos sometidos a un procedimiento de anes-tesia general (Gunnarsson y col 1991). Esto convierte a la atelectasia en una de las complicaciones más frecuentes en pacientes quirúrgicos. Se puede presentar de forma

52

CA HENRÍQUEZ Y COL

subclínica y resolverse espontáneamente en 24 a 48 horas o persistir por mayor tiempo (Brooks-Brunn 1995).

En general se describen distintos factores que influyen en la presentación y severidad de la atelectasia pulmonar durante un proceso anestésico. Dentro de estos factores destaca el posicionamiento, siendo más severa cuando los pacientes mantienen un decúbito supino, presentándose de manera más pronunciada cercana al diafragma, disminu-yendo hacia el ápex pulmonar (Reber y col 1996). Además se ve asociada con la edad, siendo mucho más severa en pacientes pediátricos. Condición corporal, Strandberg y col (1987), utilizando imágenes de tomografía, observaron una alta correlación entre el porcentaje de atelectasia y la masa corporal, explicando la mayor presentación de ésta en pacientes con obesidad. Otro factor es el porcentaje de oxígeno inspirado, siendo este punto en el que se ha puesto mayor atención en el último tiempo, ya que se ha descubierto que a una menor concentración de oxígeno inspirado el porcentaje de atelectasia presentado es menor y se presenta luego de un tiempo mayor de anestesia (Staffieri y col 2007). Por último se destaca el tipo de anestésico utilizado, ya que por ejemplo la ketamina no produce atelectasia.

La ketamina es un anestésico inyectable, que pertenece junto a la fenciclidina y la tiletamina al grupo de los anesté-sicos disociativos (Sumano y Ocampo 1997). En pacientes con ventilación espontánea la administración de la mayoría de los anestésicos causa una inmediata baja de la Capacidad Residual Funcional (CRF), lo cual resulta en un aumento de la diferencia entre la oxigenación arterial y alveolar (Gooding y col 1977). El uso de anestésicos que mantengan el tono muscular pulmonar previene la aparición de atelectasia. La ketamina aparece como el único anestésico con la capacidad de mantener la CRF y por ende prevenir la presentación de atelectasia, reduciendo así la capacidad de presentar hipoxemia intraoperatoria (Tweed y col 1972, Gooding y col 1977, Tokics y col 1987, Hedenstierna 2003).

Durante la anestesia con ketamina en pacientes con ven-tilación espontánea el volumen total puede ser mantenido al mismo nivel que en estado consciente (Tokics y col 1987). Además, hay cambios mínimos en el intercambio gaseoso y ausencia de atelectasia y shunt. Al parecer esto sería debido a la mantención del tono del músculo esquelético y a la mantención de la presión vascular (Hass y Harper 1992). Ketamina administrada en perros en infusiones de 10 ug/kg/min otorga analgesia adecuada en pacientes so-metidos a intervenciones quirúrgicas (Wagner y col 2002) y es capaz de reducir la concentración alveolar mínima de isoflurano en un 25% (Muir y col 2003). Adicionalmente, en el estudio de Muir y col (2003), el efecto analgésico de ketamina se asoció a un incremento significativo de la presión arterial media (PAM) en comparación a la PAM de perros mantenidos anestésicamente sólo con isoflurano. Previamente otros autores han señalado el efecto anal-gésico de dosis bajas de ketamina en perros sin reportar efectos adversos asociados (Ko y col 2001, Slingsby y

Waterman-Pearson 2000), sin embargo, no se ha reportado si ketamina administrada en la dosis mencionada anterior-mente puede reducir el porcentaje de atelectasia pulmonar en perros sometidos a anestesia general inhalatoria.

La TC ha emergido como el método imagenológico preferido para el pulmón, debido a la amplitud de niveles de atenuación entre las estructuras, gran resolución y velocidad. A partir de las imágenes pulmonares obtenidas mediante tomografía computarizada es posible medir el volumen, distribución y comportamiento de la ventilación bajo varias condiciones clínicas (Duggan y Kavanagh 2005).

En contexto de lo anterior se planteó como hipótesis que la administración de una infusión endovenosa de ketamina en perros bajo anestesia general inhalatoria previene el desarrollo de atelectasia pulmonar. Para ello se establecieron como objetivos: determinar el porcentaje de atelectasia pulmonar en caninos sometidos a anestesia inhalatoria y el efecto de una infusión endovenosa de ketamina sobre la presentación de atelectasia pulmonar en caninos bajo anestesia inhalatoria.

MATERIAL Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Se utilizaron 12 caninos (Canis lupus familiaris), entre 2 y 6 años de edad, con un peso entre 25 y 45 kilogramos, sin distinción de sexo y raza, clínicamente sanos y con una condición corporal de 3 (escala de 1-5). Tanto el mantenimiento como el procedimiento realizado en ellos estuvieron de acuerdo con las directrices de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

A los animales se les retiraron los alimentos sólidos y líquidos doce y seis horas, respectivamente, antes del inicio del estudio. Cada animal fue premedicado con xilacina a una dosis de 1 mg/kg por vía intramuscular. Posterior a la premedicación se realizó la inducción anestésica admi-nistrando propofol a una dosis de 4,4 mg/kg. Luego los animales fueron intubados y la anestesia fue mantenida con isoflurano en O2 a una concentración continua durante todo el estudio (1% a 2% vol.).

Los animales fueron separados en dos grupos: un grupo “A”, el cual está comprendido por seis animales a los cuales se les mantuvo únicamente bajo anestesia inhalatoria con isoflurano y un grupo “B”, comprendido por los otros seis animales, el cual fue mantenido mediante anestesia inhalatoria con isoflurano, más la administración de una infusión endovenosa de 10 μg/kg/min de ketamina (Muir y col 2003). Para esto 60 mg de ketamina fueron diluidos en un litro de cristaloide (NaCl 0,9%), el cual se administró a una razón de 10mL/kg/h, utilizando un equipo de infusión BRAUN, Infusomat® fmS. Ambos grupos de animales se mantuvieron anestesiados durante un periodo de dos horas, tiempo durante el cual se monitorizaron sus frecuencias y constantes (frecuencia respiratoria, frecuencia cardiaca, presión arterial, saturación de oxígeno).

53

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFÍA COMPUTARIZADA, PERRO

Una vez anestesiados los animales, se procedió a la toma de dos radiografías por individuo, una en decúbito lateral derecho y otra en decúbito lateral izquierdo, con el fin de descartar la presencia de alguna enfermedad pulmonar preexistente.

Los animales fueron posicionados en la mesa de tomo-grafía en decúbito prono con las cuatro extremidades en extensión. El examen tomográfico de la cavidad torácica fue realizado con un equipo TC de 4ª generación Picker JQ/PQ 4,25 Diagnostic, utilizándose los parámetros técnicos de 130 kV y 85 mA con un tiempo de adquisición de 2 segundos. Se realizó una primera tomografía 5 minutos posteriores a la inducción –tiempo que duró el posiciona-miento de los animales–, en la cual se realizaron 3 cortes transversales de tórax en la zona entre el ápex cardiaco y el diafragma, a intervalos de 2 mm y de un grosor de 5 mm. Posteriormente se realizaron dos tomografías a los 60 y 120 minutos posteriores a la inducción anestésica con los mismos parámetros utilizados en la primera. Éstas se realizaron con el fin de determinar las variaciones en la cantidad de tejido atelectásico a través de un procedimiento anestésico prolongado.

VARIABLES A ANALIZAR

Se realizó la medición de las distintas variables en los tres cortes en cada tiempo y se promediaron los resultados obteniendo un solo valor para cada variable.

Área Pulmonar: Para la medición de esta área pulmonar se contorneó toda el área torácica comprendida por cada pulmón exceptuando las áreas correspondientes al medias-tino, corazón, diafragma y vasos importantes. La ventana

utilizada fue W: 1.100 UH; L: -450 UH y en la cual se consideraron como área pulmonar todos los valores entre +100 y -1.000 HU (figura 1).

Área Atelectásica: Las áreas con valores de atenuación entre -100 y +100 HU encontradas en cada corte transversal fueron contorneadas utilizando un recurso del tomógra-fo denominado región de interés, siendo su atenuación promedio expresada en HU y entregando el área en mm² (figura 2). Para este propósito se utilizó una ventana de W: 200 HU; L: 0 HU.

Porcentaje de Atelectasia: Se calculó en base a los resul-tados de área pulmonar atelectásica en relación al área pulmonar de ambos pulmones por separado y al área pulmonar total.

ANáLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados de los tres cortes tomográficos de cada sesión fueron promediados e ingresados a una planilla MS EXCEL® y se analizaron mediante el uso de estadística descriptiva en base a media aritmética. Se realizó una prueba de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y para determinar si existieron diferencias significativas entre las mediciones entre grupos se realizó una prueba para muestras independientes no paramétricas Test de Kruskal-Wallis y para determinar las diferencias entre tiempos se efectuó un Test exacto de Friedman. Ambos test con un nivel de significancia de P < 0,05.

El programa computacional utilizado fue el Statistix versión 8.0 para Windows (Statistix 8, Copyright© 1985-2003, Analytical Software, USA).

Figura 1. Imagen tomográfica torácica tomada entre el ápex del corazón y el diafragma (izquierda). Imagen en la que se explica el sistema de medición del área pulmonar (derecha). C: corazón; PD: pulmón derecho; PI: pulmón izquierdo; VC: vena cava caudal. Transverse CT image of the thorax taken between the apex of the heart and the diaphragm (left). CT image showing the system for measur-ing lung area (right). C: heart; PD: right lung; PI: left lung; VC: caudal vena cava.

54

CA HENRÍQUEZ Y COL

RESULTADOS

Las imágenes obtenidas mediante TC permitieron diferenciar claramente las zonas atelectásicas y deter-minar por zonas de alta densidad. Además fue posible diferenciar claramente los distintos márgenes de las estructuras y los cambios en sus densidades, lo que permite realizar mediciones y comparaciones claras y precisas entre distintos cortes o individuos, por lo que se puede indicar a la TC como un método de gran valor diagnóstico en patologías torácicas de pequeños animales.

En el cuadro 1 se presenta el grupo sin infusión de ketamina (grupo A) y el grupo con infusión de ketamina (grupo B), indicando con una cruz a aquellos perros en los que se presentó algún grado de atelectasia (58%) y el pulmón afectado, pudiéndose observar que un 86% de los individuos que presentaron atelectasia independien-temente del grupo, ésta se presentó sólo en el pulmón izquierdo.

Las frecuencias y constantes no presentaron variaciones apreciables, a pesar de lo largo del periodo de anestesia al cual fueron sometidos los animales.

Las mediciones de las áreas pulmonares atelectásicas por perro del grupo A y del grupo B, en los cortes 1, 2 y 3, tomadas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción se presentan en los cuadros 2 y 3. De la misma manera, los registros de los porcentajes de atelectasia del grupo A y del grupo B en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción se presentan en los cuadros 4 y 5.

En los cuadros 2 y 3 se presentan en detalle las áreas atelectásicas observadas en los animales del grupo A y B respectivamente, observándose en el caso del grupo A que dos de los animales (perros 1 y 2) presentaron una mayor cantidad de tejido afectado, mientras que los otros tres presentaron cantidades menores. Del mismo modo, en el grupo B se puede observar que solamente uno de los animales (perro 3) presentó un grado mayor de tejido atelectásico, mientras que el otro animal, presentó una cantidad muy pequeña.

Figura 2. Imagen tomográfica torácica tomada entre el ápex del corazón y el diafragma (izquierda). Imagen en la que se explica el sistema de medición del área pulmonar atelectásica (derecha). C: corazón; D: diafragma; PD: pulmón derecho; PI: pulmón izquierdo; VC: vena cava caudal. Transverse CT image of the thorax taken between the apex of the heart and the diaphragm (left) (left). CT image showingthe measurement system for atelectatic lung area determination (right). C: heart; D: diaphragm; PD: right lung; PI: left lung; VC: caudal vena cava.

Cuadro 1. Presentación de atelectasia en pulmones derecho e izquierdo en dos grupos de perros bajo anestesia general (n = 6). Presentation of atelectasis in the right and left lungs in both groups of dogs under general anesthesia (n = 6).

PerroGrupo A Grupo B

D I D I

1 – + – –2 + – – –3 – – – +4 – + – +5 – + – –6 – + – –

– No presenta atelectasia; + Presenta atelectasia; Grupo A, perros sin infusión de ketamina; Grupo B, perros con infusión de ketamina; D, pulmón derecho; I, pulmón izquierdo.

55

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFÍA COMPUTARIZADA, PERRO

Cuadro 2. áreas atelectásicas de los pulmones derecho e izquier-do en los perros sin infusión de ketamina (grupo A), expresadas en mm2 y medidas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción (n = 6). Atelectatic areas of the right and left lungs in dogs without infusion of ketamine (group A), expressed in mm2 in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

PerroMinuto 0 Minuto 60 Minuto 120

D I D I D I

1 0,0 33,3 0,0 40,0 0,0 54,0

2 58,7 0,0 68,7 0,0 80,3 0,0

3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

4 0,0 0,0 0,0 3,3 0,0 10,0

5 0,0 5,7 0,0 2,7 0,0 6,7

6 0,0 2,3 0,0 3,0 0,0 1,3

D: pulmón derecho; I: pulmón izquierdo.

Cuadro 3. áreas atelectásicas de los pulmones derecho e izquierdo en los perros con infusión de ketamina (grupo B), expresadas en mm2 y medidas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción (n = 6). Atelectatic areas of the right and left lungs in dogs with infusion of ketamine (group B), expressed in mm2 in minutes 0,60 and 120 post-induction (n = 6).

PerroMinuto 0 Minuto 60 Minuto 120

D I D I D I

1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

3 0,0 21,0 0,0 20,3 0,0 1,7

4 0,0 0,7 0,0 4,3 0,0 3,3

5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

D, pulmón derecho; I, pulmón izquierdo.

En los cuadros 4 y 5 se observa el porcentaje de atelec-tasia pulmonar presente en los perros de ambos grupos en estudio. Fue posible determinar que existieron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo sin infusión de ketamina y el grupo con infusión (P < 0,05).

En cuanto al comportamiento de la atelectasia a través del tiempo, en el caso del grupo A, a pesar de observarse en algunos animales (perros 1 y 2) una leve tendencia al aumento en los porcentajes de atelectasia pulmonar, ésta no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). Por otra parte, en los animales del grupo B se aprecia una leve tendencia a la disminución, particularmente en uno de los perros (perro 3); sin embargo, ésta, al igual que en grupo anterior, no fue estadísticamente significativa (P > 0,05).

DISCUSIÓN

En este estudio el porcentaje de perros que presenta-ron atelectasia pulmonar fue del 58%, resultado que no coincide con los presentados por el trabajo realizado por Lundquist y col (1988), quienes estudiaron la presentación de densidades pulmonares en 28 perros anestesiados con barbitúricos y donde se plantea la presentación de atelec-tasia en el 7% de los perros anestesiados. Esta diferencia entre los resultados del presente estudio con los de los expuestos por Lundquist y col (1988) puede explicarse debido es que este último no administró oxígeno adicio-nal, por lo que los animales sólo fueron ventilados con la concentración de oxígeno atmosférico; en cambio, en nuestro estudio y en el realizado por Aneli (2005) se administró una concentración inspiratoria de oxígeno de un 100%, lo cual, como ya se ha explicado, disminuye el tiempo de aparición y aumenta el porcentaje de tejido pulmonar atelectásico. Otra razón que puede explicar

Cuadro 4. Porcentaje de atelectasia pulmonar en relación al área pulmonar total, presentada en los perros sin infusión de ketamina (grupo A), en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción (n = 6). Percentage of lung atelectasis in relation to the total lung area in dogs without ketamine infusion (group A), in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

Perro Minuto 0 Minuto 60 Minuto 120

1 0,26% 0,31% 0,44%

2 0,37% 0,44% 0,52%

3 0,00% 0,00% 0,00%

4 0,00% 0,00% 0,09%

5 0,04% 0,02% 0,05%

6 0,02% 0,02% 0,01%

Cuadro 5. Porcentaje de atelectasia pulmonar en relación al área pulmonar total, presentada en los perros con infusión de ketamina (grupo B), en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción (n = 6). Percentage of lung atelectasis in relation to the total lung area in dogs without ketamine infusion (group B), in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

Perro Minuto 0 Minuto 60 Minuto 120

1 0,00% 0,00% 0,00%

2 0,00% 0,00% 0,00%

3 0,18% 0,17% 0,02%

4 0,01% 0,04% 0,03%

5 0,00% 0,00% 0,00%

6 0,00% 0,00% 0,00%

56

CA HENRÍQUEZ Y COL

los distintos resultados entre los estudios es la diferencia de pesos entre los perros en estudio, ya que Lundquist y col (1988) utilizaron perros mestizos con un promedio de peso de 18,7 kg, mientras que en este estudio se utilizaron perros con un peso superior a los 25 kg, situación que se asemeja a lo realizado por Aneli (2005), quien utilizó 16 perros adultos de raza Rottweiller, encontrando en ellos un porcentaje de presentación de atelectasia de un 43,75%, similar a los resultados de esta investigación.

Destaca el hecho que en el 86% de los perros, en los que se presentó algún grado de atelectasia pulmonar, ésta se ubicó en el pulmón izquierdo, hecho que no aparece mencionado en la literatura y que pudiese deberse a un factor anatómico particular de esta especie, como lo pudiese ser la marcada diferencia en la lobulación y que predisponga a la mayor ocurrencia de colapso en ese pulmón.

Es posible además encontrar diferencias con estudios realizados en pacientes humanos, como los realizados por Rothen y col (1999), Sargent y col (1999), Hedenstierna y col (2000), Benôit y col (2002), los cuales registraron que entre un 85% y 90% de ellos presentaban atelectasia pulmonar. Según Aneli (2005), algún factor fisiológico relevante no determinado aún puede estar relacionado con la diferencia notable entre las especies. Nyman y col (1990) realizaron un estudio del deterioro del inter-cambio gaseoso en caballos, y Hedenstierna y col (1989) trabajaron en un modelo ovino en el cual se pudo apre-ciar la presencia de opacidades en los pulmones que al ser estudiadas histológicamente se determinó que eran zonas atelectásicas, acompañadas de edema y una leve congestión vascular. Ambos estudios determinaron que en las distintas especies animales se presentan opacidades pulmonares dependientes de la gravedad, pero con algunas diferencias histológicas.

El área pulmonar atelectásica varió entre 0,7 y 80,3 mm2, similar a lo presentado por el trabajo de Rothen y col (1996), quienes obtuvieron áreas con atelectasia que variaron entre 2 y 80 mm2. Ellos estudiaron el volu-men de atelectasia presentado por sus pacientes con una distinta concentración inspiratoria de oxígeno. Distintos autores, entre los que destacan Rothen y col (1995), Reber y col (1996) y Edmark y col (2003), plantean que una concentración elevada de oxígeno promueve la formación de atelectasia. En el presente estudio los resultados obtenidos demostraron una pequeña cantidad de ésta, lo que hace concordar con lo planteado por Aneli (2005), quien sugiere que no está contraindicado el uso de una elevada concentración de oxígeno en la especie canina. Por otro lado, Staffieri y col (2007) describen que la diferencia de presentación de atelectasia dada por los cambios en la concentración de oxígeno, sí existe en caninos anestesiados y sometidos a una cirugía abdominal, específicamente a una ovariohisterectomía, obteniendo como resultados mayor cantidad de tejido atelectásico y una diferencia marcada entre concentraciones de 100% (12,8 ± 3,7 cm2) y 40% (2,5 ± 0,9 cm2) de oxígeno, lo

cual hace pensar que un factor principal en cuanto a la cantidad de tejido atelectásico presente durante la anes-tesia, más que la anestesia misma, es la incapacidad del diafragma de mantener la diferencia de presión durante la cirugía abdominal.

Los porcentajes totales de atelectasia pulmonar va-riaron entre un 0,01% y 0,52%, similares a los resultados presentado por Aneli (2005), los que variaron entre 0,05% y 1,20% y Lundquist y col (1988) en el cual el porcentaje fue de un 1%. Por otra parte es distinto a los resultados del trabajo de Bletz y col (2004), el que fue realizado con 8 cerdos y en el cual se registraron las diferencias de mediciones de atelectasia entre la tomografía helicoidal y de corte dinámico donde obtuvieron resultados de 19,0% y 28,4%, respectivamente. También difieren con los resultados presentados por Hedenstierna y col (1989), cuyos autores encontraron porcentajes entre un 3% y 4%; estudio realizado en humanos.

El grupo tratado con ketamina presentó diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo sin ella. Esto concuerda con los resultados descritos por Tokics y col (1987), según los cuales sólo hubo presencia de atelectasia en uno de ocho pacientes durante la anestesia con ketamina, concluyendo que al no producirse la rela-jación de la pared diafragmática, así como tampoco una disminución significativa de la presión vascular pulmonar, esto impediría que disminuya de manera importante la CRF, permaneciendo ésta mayor a la capacidad de cierre, evitando así el colapso y la presentación de atelectasia. La diferencia presentada entre los estudios puede deberse a que Tokics y colaboradores realizaron su estudio con humanos, quienes, como se ha planteado anteriormente, presentan una mayor cantidad de tejido atelectásico en comparación a los perros. Además, la ketamina fue administrada en bolo como anestésico principal, lo cual difiere al presente estudio donde se administró como infusión a una dosis de 10 μg/kg/min, lo cual pudo resultar insuficiente para causar el efecto de mantención del tono muscular pero que tiene un efecto en la presión vascular pulmonar, lo cual pudiese producir una disminución en la susceptibilidad a producir atelectasia.

En relación al tiempo de aparición de atelectasia, ésta se presentó en la primera tomografía, la que se denomina en el presente estudio como la tomada en el minuto 0, la cual en realidad era tomada aproximadamente 5 minutos luego de la inducción, tiempo que se ocupaba para el posicionamiento del animal en el tomógrafo. Esto es similar a lo expuesto por Brismar y col (1985) y Rothen y col (1995), a quienes utilizando una concentración de oxígeno de un 100%, que fue la misma utilizada en el pre-sente estudio, la atelectasia se presentó de igual manera a los 5 minutos posteriores a la inducción. Asimismo difiere de lo presentado por Rothen y col (1995) que al utilizar una concentración de oxígeno de un 40% la atelectasia se presentó a los 40 minutos luego de la inducción, lo cual se explica por lo planteado anteriormente.

57

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFÍA COMPUTARIZADA, PERRO

En cuanto a la influencia del tiempo de anestesia sobre la atelectasia, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los minutos 0, 60 y 120 postinducción. Esto es explicado por Duggan y Kavanagh (2005), quienes describen el impacto del tiempo sobre la atelectasia. Ellos plantean que la máxima disminución del CRF se produce unos pocos minutos luego de la inducción anestésica y que éste no está influenciado por la profundidad ni el tiempo de anestesia.

Es de esta manera que podemos concluir que fue posi-ble determinar que un 58% del total de perros en estudio presentó algún grado de atelectasia pulmonar. La infusión de ketamina influyó significativamente en la presentación de atelectasia pulmonar, debido a que no hubo diferen-cias estadísticamente significativas en los porcentajes de atelectasia presentados entre el grupo de perros con infusión y el grupo sin infusión. No existió diferencia estadísticamente significativa entre los porcentajes de atelectasia presentados en ambos grupos a los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción, y por último que en el 86% de los perros que presentaron atelectasia ésta se presentó en el pulmón izquierdo, sugiriendo que existe algún factor posiblemente anatómico que predispone a la mayor presentación en ese pulmón.

RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar, a través de tomografía computarizada, el efecto de una infusión endovenosa de ketamina sobre la atelectasia pulmonar en perros sometidos a anestesia inhalatoria. Para esto se utilizaron 12 perros separados en dos grupos (A y B) de 6 perros cada uno. Ambos fueron sometidos al mismo protocolo anestésico que consistió en premedicación con xilacina, inducción con propofol y mantención con anestesia inhalatoria por un periodo de dos horas. Al grupo B se le administró además una infusión de ketamina. Se realizaron cortes tomográficos 1 cm craneal al diafragma, en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la inducción, con el fin de monitorear la evolución en el caso de presentarse atelectasia. La totalidad del estudio fue realizado en las dependencias del Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Austral de Chile.

Se determinó la presencia de atelectasia en diferentes grados en el 58% de los perros, observándose en la totalidad de los animales en sólo uno de los pulmones. Además se presentó en 5 perros en el grupo sin infusión de ketamina y sólo 2 en el grupo con infusión. Asimismo, las áreas atelectásicas variaron entre 0,13 y 8,03 cm2 en el grupo A y 0,07 y 2,10 cm2 en el grupo B.

La infusión de ketamina no influyó en la presentación de atelectasia pulmonar. Con respecto a la evolución de la atelectasia a través del tiempo, se apreciaron leves cambios en ambos grupos, los cuales no fueron estadísticamente significativos (P > 0,05).

REFERENCIAS

Aneli E. 2005. Avaliaçao dos efeitos do posicionamento relacionados à opacificaçao pulmonar gravitacional dependente em caes (Canis familiaris) através da tomografía computadorizada. Memoria de título, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil.

Benôit Z, S Wicky, J Fisher, P Frascarolo, C Chapuis, D Spahn, L Magnusson. 2002. The effect of increased Fio2 before tracheal extubation on postoperative atelectasis. Anesth Analg 95, 1777-1781.

Bletz C, K Markstaller, J Karmrodt, A Herweling, M Melvan, R Goetz, A Stepniak, B Eberle, H Kauczor, C Heussel, M Thelen. 2004. Quantification of atelectases in artificial respiration: spiral-CT versus dynamic single-slice CT. Rofo 176, 409-416.

Brett A, G Christensen, D Low, J Reinhardt. 2005. Computed Tomography Studies of Lung Mechanics. Proc Am Thorac Soc 2, 517-521.

Brismar B, G Hedenstierna, H Lundquist, A Strandberg, L Svensson, L Tokics. 1985. Pulmonary densities during anesthesia with muscular relaxation: a proposal of atelectasis. Anesthesiology 62, 422-428.

Brooks-Brunn J. 1995. Postoperative atelectasis and pneumonia. Heart Lung 24, 94-115.

David M, J Karmrodt, C Bletz, S David, A Herweling, H Kauczor, K Markstaller. 2005. Analysis of atelectasis, ventilated, and hy-perinflated lung during mechanical by dinamic CT. Chest 128, 3757-3770.

Don H, M Wahba, L Cuadrado, K Kelkor. 1970. The effects of anesthesia and 100 per cent oxygen on the functional residual capacity of the lungs. Anesthesiology 32, 521-529.

Duggan M, B Kavanagh. 2005. Pulmonary Atelectasis A Pathogenic Perioperative Entity. Anesthesiology 102, 838-854.

Edmark L, K Kostova-Aherdan, M Enlund, G Hedenstierna. 2003. Optimal oxygen concentration during induction of general anesthesia. Anesthesiology 98, 28-33.

Gooding J, A Dimick, M Tavakoli, G Corssen. 1977. A physiologic analysis of cardiopulmonary responses to ketamine anesthesia in non-cardiac patients. Anesth Analg 56, 813-816.

Gunnarsson L, L Tokics, H Gustavsson, G Hedenstierna. 1991. Influence of age on atelectasis formation and gas exchange impairment during general anesthesia. Br J Anaesth 66, 423-432.

Haas D, D Harper. 1992. Ketamine: A review of its pharmacologic proper-ties and use in ambulatory anesthesia. Anesth Prog 39, 61-68.

Hedenstierna G, J Santesson. 1976. Breathing mechanics, dead space and gas exchange in the extremely obese, breathing spontaneously and during anaesthesia with intermittent positive pressure ventilation. Acta Anaesthesiol Scand 20, 248-254.

Hedenstierna G, L Tokics, A Strandberg, H Lundquist, B Brismar. 1986. Correlation of gas exchange impairment to development of atelectasis during anaesthesia and muscle paralysis. Acta Anaesthesiol Scand 30, 183-191.

Hedenstierna G, H Lundquist, B Lundh, L Tokics, A Strandberg, B Brismar, C Frostell. 1989. Pulmonary densities during anaesthesia. An Experimental study on lung morphology and gas exchange. Eur Respir J 2, 528-535.

Hedenstierna G, L Tokics, B Lund. 2000. Atelectasis formation during anesthesia: causes and measures to prevent it. J Clin Monit Comput 16, 329-335.

Hedenstierna G. 2003. Alveolar collapse and closure of airways: regular effects of anaesthesia. Clin Physiol Funct Imaging 23, 123-129.

Ko J, S Fox, R Mandsager. 2001. Anesthetic effects of ketamine or isoflurane induction prior to isoflurane anesthesia in medetomidine-premedicated dogs. J Am Anim Hosp Assoc 37, 411-419.

Lundquist H, G Hedenstierna, H Ringertz. 1988. Barbiturate anaesthesia does not cause pulmonary densities in dogs: a study using computer-ized axial tomography. Acta Anaesthesiol Scan 36, 626-632.

Magnusson L, D Spahn. 2003. New concepts of atelectasis during general anaesthesia. Br J Anaesth 91, 61-72.

Muir W, A Wiese, P March. 2003. Effects of morphine, lidocaine, ketamine, and morphine-lidocaine-ketamine drug combination on minimum alveolar concentration in dogs anesthetized with isoflurane. Am J Vet Res 64, 1155-1160.

Nyman S, B Funkquist, C Kvart, C Frostell, L Tokics, A Strandberg, H Lundquist, B Lundh, B Brismar, G Hedenstierna. 1990. Atelectasis causes gas exchange impairment in the anaesthetised horse. Equine Vet J 22, 317-324.

Pedersen T, J Viby-Mogensen, C Ringsted. 1992. Anaesthetic practice and postoperative pulmonary complications. Acta Anaesthesiol Scand 36, 812-818.

58

CA HENRÍQUEZ Y COL

Reber A, G Engberg, B Sporre, L Kviele, H Rothen, G Wegenius, U Nylund, G Hedenstierna. 1996. Volumetric analysis of aeration in the lungs during general anaesthesia. Br J Anaesth 76, 760-766.

Robinson E. 2003. Función Respiratoria. En: Cunningham J. (ed) Fisiología Veterinaria. McGraw-Hill Interamericana, México D.F., México, Pp 468-514.

Rothen H, B Sporre, G Engberg, G Wegenius, M Högman, G Hedenstierna. 1995. Influence of gas composition on recurrence of atelectasis after a reexpansion maneuver during general anesthesia. Anesthesiology 82, 832-842.

Rothen H, B Sporre, G Engberg, G Wegenius, A Reber, G Hedenstierna. 1996. Atelectasis and pulmonary shunting during induction of general anaesthesia - can they be avoided? Acta Anaesthesiol Scand 40, 524-529.

Rothen H, P Neumann, J Berglund, J Valtysson, A Magnusson, G Hedenstierna. 1999. Dynamics of re-expansion of atelectasis during general anaesthesia. Br J Anaesth 82, 551-556.

Sargent M, A McEachern, D Jamieson, R Kahwaji. 1999. Atelectasis on pediatric chest CT: Comparison on sedation techniques. Pediatr Radiol 29, 509-513.

Slingsby L, A Waterman-Pearson. 2000. The post-operative analgesic effects of ketamine after canine ovariohysterectomy-a comparison between pre-or post-operative administration. Res Vet Sci 69, 147-152.

Staffieri F, D Franchini, G Carella, M Montanaro, V Valentini, B Driessen, S Grasso, A Crovace. 2007. Computed tomographic analysis of the effects of two inspired oxygen concentrations on pulmonary aeration in anesthetized and mechanically ventilated dogs. Am J Vet Res 68, 925-931.

Strandberg A, L Tokics, B Brismar, H Lundquist, G Hedenstierna. 1987. Constitutional factors promoting development of atelectasis during anaesthesia. Acta Anaesthesiol Scand 31, 21-24.

Sumano H, L Ocampo. 1997. Farmacología Veterinaria. McGraw-Hill. México D.F., México, Pp 349-514.

Tokics L, A Strandberg, B Brismar, H Lundquist, G Heenstierna. 1987. Computerized tomography of the chest and gas exchange measurements during ketamine anaesthesia. Acta Anaesthesiol Scand 66, 157-167.

Tusman G, S Bohm, F Melkun, D Staltari, C Quinzio, C Nador, E Turchetto. 2002. Alveolar recruitment strategy increases arterial oxygenation during one-lung ventilation. Ann Thorac Surg 73, 1204-1209.

Tweed W, M Minuck, D Mymin. 1972. Circulatory responses to ketamine anesthesia. Anesthesiology 37, 613-619.

Wagner A, J Walton, P Heller, J Gaynor, K Mama. 2002. Use of low doses of ketamina administered by constant rate infusion as an adjunct for postoperative analgesia in dogs. J Am Vet Med Assoc 221, 72-75.

Warner D, M Warner, E Ritman. 1996. Atelectasis and chest wall shape during halothane anesthesia. Anesthesiology 85, 49-59.

59

Arch Med Vet 43, 59-64 (2011)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 06.10.2010.

* Juan Spikerman 2180, CP 11.700, Montevideo, Uruguay.

gsemigli@adinet.com.uy

Utilización de fascia lata alogénica para la herniorrafia perineal canina: comunicación de 7 casos clínicos

Use of allogenic fascia lata in perineal herniorrhaphy in dogs: communication of 7 clinical cases

GG Semigliaa*, DF Izquierdoa, JH Zuninob

aUniversidad de la República Oriental del Uruguay, Departamento de Pequeños Animales, Facultad de Veterinaria, Universidad de la República Oriental del Uruguay, Montevideo, Uruguay.bBanco de Órganos y Tejidos, Facultad de Medicina, Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay.

SUMMARY

The aim of this study was to describe and evaluate the treatment of perineal herniorrhaphy in dogs using allogeneic fascia lata. For this purpose, fascia lata was obtained from dog weighing 15 kg or more, whose death cause did not involve infectious or oncologic conditions, nor collagen- disease or trauma, or surgical scars to the thighs. The fascia lata was preserved in 75% glycerin solution. Seven patients with unilateral perineal hernia were selected for this clinical trial. Using a perineal approach, the hernia was reduced, muscles repositioned, and reconstruction was achieved suturing the fascia lata with interrupted 0 Nylon monofilament suture. Evaluations were made at 7, 15, 30 and 60 days, to assess the following parameters: defecation, micturition, local inflammation, and pain. The allogeneic graft was not rejected, and the herniorrhaphy technique was successful in all cases. No post-surgical complications were observed at 60 days after, while defecation, micturition and regional anatomy returned to normality. Allogeneic processed fascia lata has herein demonstrated to be biocompatible and well tolerated, thus allowing to be considered a safe and useful option to perineal herniorrhaphy technique in dogs.

Palabras clave: herniorrafia, injerto, alogénico, canino.Key words: herniorrhaphy, graft, allogeneic, dogs.

INTRODUCCIÓN

La hernia perineal (HP) ha sido reportada en varias especies, siendo la canina la más afectada (Hosggod y col 1995, Fossum y col 1999, Duval y col 2001). Esta patología resulta de la debilidad y separación de los músculos y la fascia que conforman el diafragma pél-vico, permitiendo que el recto y contenido pélvicos y/o abdominales se desplacen hacia caudal (Hedlund 2004). El diafragma pélvico está compuesto por los músculos elevador del ano, coccígeo y la fascia perineal profunda y superficial (Hedlund 2004). Cualquier canino de raza pura o mestiza puede afectarse, pero hay ciertas razas predispuestas como el Terrier de Boston, Collie, Bóxer, Pekinés, Corgi galés, Kelpie, Caniche miniatura, Pastor alsaciano, Boyero de flandes, Antiguo pastor inglés, Dachshund y mestizos (Anderson y col 2001, Hedlund 2004). La HP afecta fundamentalmente a machos adul-tos a partir de los 5 años de edad, en su mayoría enteros, aunque pueden verse afectados también los castrados, y se han documentado unos pocos casos en hembras (Brown y

Udall 1964, Anderson y col 2001). Los contenidos de la HP son en orden de prevalencia la grasa retroperitoneal, líquido seroso, recto, próstata, vejiga urinaria e intestino delgado (Anderson y col 2001). Los signos clínicos incluyen tumefacción en región perineal unilateral o bilateral con predominio del lado derecho, tenesmo fecal y urinario, constipación, obstipación, disquecia y retención urinaria (Bellenger y Canfield 2003, Hedlund 2004).

La causa específica de la hernia perineal aún no ha sido establecida. Sin embargo, factores causales postulados incluyen: desequilibrio de hormonas gonadales (Hosggod y col 1995), esfuerzo contra el diafragma pélvico como resultado de prostatomegalia (Dorn y col 1985) y/o enfer-medad rectal (Hosggod y col 1995), y variación anatómica de la musculatura del diafragma pélvico por atrofia mus-cular de origen neurogénico (Bellenger y Canfield 2003, Hedlund 2004).

El tratamiento de elección para la HP es el quirúrgi-co, existiendo varias técnicas para su resolución; las dos más comunes son la herniorrafia convencional (estándar) (Weaver y Omamegbe 1981) y la transposición del músculo obturador interno (Anderson y col 2001). Otras técnicas descritas son: la transposición de colgajos musculares tales como los músculos semitendinoso (Mann y Constantinescu 1998), glúteo superficial (Weaver y Omamegbe 1981) o la combinación de ambos; la utilización de flap miocutáneo del músculo gracilis (Bellenger y Canfield 2003).

60

GG SEMIGLIA Y COL

Diferentes técnicas y materiales tales como colágeno porcino (Frankland 1986), submucosa intestinal porcina (Stoll y col 2002), mallas de polipropileno (Matera y col 1981, Fossum y col 1999, Shoukry y col 1997) y fascia lata autógena (Bongartz y col 2005) se han utilizado en la plastia de hernias perineales en caninos.

Se han reportado varios usos de fascia lata en cirugía veterinaria, tales como en la reparación de ligamento cru-zado craneal (Carvalho Buquera y col 2002), reparación de tendón calcáneo común (Shani y Shahar 2000), reparación de defectos uretrales (Gultekin y col 2005), reemplazo total de ligamento patelar (Gemmil y Carmichael 2003), estabilización de articulación coxofemoral (Seullner Brandão y col 2002) y en herniorrafia perineal (Bongartz y col 2005). En este último caso de forma autógena. Sin duda los materiales biológicos obtenidos de fuentes seguras y procesados adecuadamente aseguran su biocompatibilidad y buena tolerancia en injertos e implantes alogénicos.

El objetivo de este estudio fue determinar la bio-compatibilidad de la fascia lata alogénica conservada en glicerina al 75%, para ser utilizada en la herniorrafia perineal canina.

MATERIAL Y MÉTODOS

Para la extracción de fascia lata fueron elegidos ani-males mayores de 15 kg, cuyo motivo de muerte no fue ninguna enfermedad infecciosa u oncológica, además de carecer de colagenopatías y presencia de traumatismos o abordajes quirúrgicos previos a nivel del muslo. Los ca-dáveres fueron obtenidos del Hospital del Departamento de Pequeños Animales de la Facultad de Veterinaria de la República Oriental del Uruguay, con previa autorización firmada de los propietarios.

La extracción de la fascia lata se realizó dentro de las primeras 6 horas de la muerte del animal, respetando medidas de asepsia quirúrgica que incluyeron rasurado del miembro posterior desde la cadera hasta la articulación tibio-tarsal y antisepsia con solución acuosa de povidona yodada al 1%. Se procedió a la colocación de campos estériles, se identificaron los reperes óseos, hacia proximal el trocánter mayor del fémur y hacia distal la articulación fémoro-tibio-rotuliana. Se realizó incisión de piel y celular subcutánea, siguiendo una línea longitudinal que una a ambos puntos de referencia –proximal y distal– con una leve curvatura hacia craneal. Llegado al plano de la apo-neurosis, se cambia la hoja de bisturí. Se extrajo el tejido adiposo que la cubre, quedando así expuesta la fascia lata en toda su extensión. Para facilitar el procesamiento es importante liberar en forma minuciosa el tejido adiposo de la fascia in situ. Luego se procedió a la identificación de la unión musculotendinosa, de los bordes craneal y caudal, incidiendo los mismos con bisturí, de proximal a distal. La fascia lata se libera del plano profundo hacia proximal y se secciona transversalmente a nivel de la unión musculotendinosa.

El material extraído se colocó sobre campos estériles, se procedió a cambiar guantes y por medio de rugina se retiraron restos de tejido adiposo. La remoción completa del tejido adiposo se obtuvo sumergiendo el tejido en so-lución de éter y alcohol etílico, en proporción 1:1 por un período de 24 hs a 4 ºC. Posteriormente se lava con 1 litro de solución fisiológica en tres etapas, quedando sumergida en suero fisiológico durante 15 min. Se tomaron muestras para estudio microbiológico con tapa rotulada, con el autogenerado del donante y fecha de extracción. Toda la técnica de colección y procesamiento de la fascia lata fue según lo reportado por Zunino y col 2001. Posteriormente la fascia fue colocada en frasco estéril con tapa, conte-niendo glicerol al 75% (en proporción 1:50) (Zunino y col 2001), que fue previamente esterilizado en autoclave modelo Scanlan Morris, Ohlo Chemical & Surgical Equipment Co, Madison, Wisconsin, U.S.A, a 120 ºC y 1 atmósfera de presión durante 20 minutos. El tiempo de conservación máximo a una temperatura de –4 ºC hasta su utilización fue de 6 meses. Después de este tiempo el material es descartado.

Siete caninos machos con un rango de edades de 7 a 12 años, y rango de peso de 4 a 40 kg, que ingresaron al Hospital de Pequeños Animales de la Facultad de Veterinaria de la República Oriental del Uruguay con motivo de con-sulta de HP unilateral, participaron del trabajo. Fueron evaluados clínicamente, para descartar otras patologías coexistentes (cuadro 1). El estado general de los pacientes fue analizado mediante estudios de Hemograma, Plaquetas, Función renal y Función hepática.

El protocolo anestésico utilizado fue basado en ace-tilpromazina1 a dosis de 0,05 miligramos por kilo (mg/kg) vía intramuscular (IM) y clorhidrato de ketamina2 a dosis de 5 mg/kg vía IM como premedicación; la inducción fue realizada 20 minutos después con lidocaína3 al 2% a dosis de 2,2 mg/kg vía intravenosa (IV) lenta y tiopental4 al 2,5% a efecto por vía IV; para el mantenimiento fue utilizado isofluorano5 entre 1,5% a 3% con una mezcla de oxígeno del 1%; la analgesia fue realizada junto a la premedicación y fue realizada con dipirona6 a dosis de 25 mg/kg IV y clorhidrato de tramadol7 a dosis de 2 mg/kg IV; 30 minutos antes de comenzar el acto qui-rúrgico fue administrado bencilpenicilina procaínica y dihidroestreptomicina8 a una dosis de 11.000 UI/kg (unidades internacionales por kilo).

La región perineal fue tricotomizada y preparada de forma aséptica, y el paciente fue colocado en decúbito ventral con la cola llevada hacia craneal. Posterior a la

1 Acedan, Holliday.2 Vetanarkol, König.3 Lidocaína, Dispert.4 Pentovet, Richmond.5 Isoflurane USP, Halocarbon corporation.6 Neusal, Dispert.7 Dalgion, Gramón Bagó.8 Repen, Fatro.

61

HERNIORRAFIA, INJERTO, ALOGÉNICO, CANINO

colocación de los campos quirúrgicos, se realizó incisión en piel sobre la hernia desde lateral hasta la base de la cola, casi por debajo de la masa herniaria; la incisión es curvada ligeramente hacia lateral en dirección dorsoventral. Una vez que fueron identificados los músculos comprometidos y liberados de sus adherencias, se procedió a la reducción de la hernia, para posteriormente suturar la fascia lata en el defecto. Para permitir una mejor manipulación de la fascia lata ésta fue sumergida en solución de suero fisiológico por 20 minutos para su hidratación, para posteriormente ser suturada a los músculos esfínter anal externo, coccí-geo, obturador interno y ligamento sacrotuberal mediante puntos simples de vicryl Nº 0 (figura 1). El tamaño de la fascia lata a suturar va a ser directamente proporcional al tamaño del defecto. Al momento de pasar los puntos por el músculo obturador interno y ligamento sacrotuberal se debe tener cuidado con los nervios perineal y pudendo, y la arteria y vena pudendas internas. Antes de realizar la síntesis rutinaria de subcutáneo y piel se realizó palpa-ción rectal para descartar la posibilidad de presencias de sutura en la luz intestinal. En todos los casos la cirugía es acompañada de orquiectomía escrotal.

Los animales fueron medicados en el postoperatorio vía oral con amoxicilina más ácido clavulánico9 a dosis de 22 mg/kg cada 12 hs por 15 días, carprofeno10 a razón de 2,2 mg/kg cada 12 h por 3 días y dipirona11 a una dosis de 25 mg/kg durante 7 días. La alimentación realizada en el postoperatorio fue de ración comercial con alto contenido en fibras en un intervalo de tres horas.

Los controles postoperatorios se realizaron a los 7, 15, 30 y 60 días. La valoración clínica fue realizada

9 Clavamox, Pfizer.10 Rimadyl, Pfizer.11 Novemina, Laboratorio Lazar.

Cuadro 1. Reseña y datos patológicos de 7 caninos machos intervenidos quirúrgicamente para reparación de hernia perianal Clinical and pathological data of seven patients undergoing herniorrhaphy surgery

Animal Edad (años) Raza Peso (Kg) Contenido herniario Patología rectal Lado afectado

1 10 Cruza 15 GR, R Saculación Derecho

2 8 Ovejero Alemán 40 GR, P Ausente Derecho

3 12 Cruza 12 GR, R, P, V Divertículo Derecho

4 7 Cruza 4 GR, R, P Saculación Derecho

5 10 Cruza 17 GR, R Divertículo Derecho

6 10 Cruza 5 GR, R Divertículo Derecho

7 7 Ovejero Alemán 35 GR, R Divertículo Izquierdo

GR: grasa retroperitoneal

R: recto

P: próstata

V: vejiga

considerando los siguientes criterios usados por Bongartz y col 2005: grado de defecación (0 = defecación normal, 1 = leve dificultad, 2 = moderada dificultad y 3 = severa dificultad); grado de inflamación local (0 = no hay infla-mación, 1 = leve, 2 = moderada, 3 = severa), grado de dolor (0 = sin dolor, 1 = dolor leve, 2 = dolor moderado, 3 = dolor grave). Los parámetros fueron evaluados por el médico veterinario y por el propietario.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Del total de animales sometidos a cirugía, cinco fueron caninos sin raza definida y dos de la raza Ovejero Alemán. Las patologías rectales encontradas fueron: saculación (2) divertículo (4) y un animal no presentó alteraciones rectales. Seis de los pacientes presentaron hernia unilateral derecha y el restante presentó hernia unilateral izquierda. El contenido herniario fue: grasa retroperitoneal, recto, próstata y vejiga variando su combinación en cada paciente (cuadro 1). La técnica quirúrgica en todos los casos tardó aproximadamente una hora y treinta minutos, y en el transcurso de la misma no se presentaron complicaciones. En la primera semana del postoperatorio se identificaron los mayores grados de inflamación (figura 2), dolor y di-ficultades en la defecación, que fueron disminuyendo en las semanas siguientes llegando a cero en todos los casos en el momento del alta (cuadro 2).

El paciente Nº 2 en la primera semana presenta dehis-cencia de tres puntos de la sutura en piel que fue tratada con lavados con solución fisiológica al 0,9% tres veces por día, lográndose la cicatrización a los 25 días del posto-peratorio, luego de cuatro meses de haber recibido el alta médica regresa a consulta por hernia perineal contralateral al sitio de la cirugía. El paciente Nº 3 regresa a los 3 meses de haber recibido el alta médica con una falla renal, que

62

GG SEMIGLIA Y COL

Figura 1. Sutura de la fascia lata a los músculos (A) esfínter anal externo, (B) obturador interno y (C) coccígeo, descritos en la técnica quirúrgica para herniorrafia perianal en caninos Suture of the fascia lata to the muscles (A) external anal sphincter, (B) internal obturator, (C) coccygeal, described in the surgical techniques for perineal herniorrhaphy in dogs

Figura 2. A - Preoperatorio, B - 15 días del postoperatorio de paciente canino hembra tratado quirúrgicamente por hernia perianal. A - Preoperative, B - 15 Posoperative days of a patient treated for herniorrhaphy.

no es posible compensar y fallece. A la fecha en el resto de los pacientes no se presentaron recidivas ni indicios de rechazo del injerto (fístulas y/o inflamación).

Tradicionalmente la técnica más empleada para la HP en caninos ha sido la herniorrafia tradicional en base a puntos simples de material absorbible o no absorbible. Varios autores como Bellenger (1980), Mattheison (1989),

Anderson y col (2001) y Hedlund (2002) reportan las complicaciones encontradas después de esta técnica como lesión del nervio pudendo, incontinencia fecal, infección en el sitio de la incisión, dehiscencia de la sutura, incontinen-cia urinaria y recidiva de la hernia. Estas complicaciones no fueron encontradas en nuestro trabajo con la técnica de fascia lata alogénica. La lesión del nervio pudendo se

A B

AB

C

AB

C

63

HERNIORRAFIA, INJERTO, ALOGÉNICO, CANINO

evita, porque no es necesario realizar suturas bajo tensión y abarcando gran cantidad de músculo, ya que el defecto creado va a ser cubierto por la fascia lata. La incontinencia fecal, urinaria y recidiva de la hernia no se presentó hasta el momento en ninguno de los 7 pacientes.

Las técnicas de colgajos musculares (músculos obtura-dor interno, gluteosuperficial y semitendinoso) publicadas por Chambers y Rawling (1991) requieren experiencia por parte del cirujano para disminuir las complicaciones posquirúrgicas y el tiempo operatorio. Si bien no son reportadas grandes complicaciones con estas técnicas, el hecho de manipular los tejidos blandos de alrededor, genera una inflamación mayor, y el cirujano que realiza la técnica debe ser experimentado para disminuir los tiempos quirúrgicos. La simplicidad de la técnica mencionada en este trabajo permite que cirujanos con poca experiencia obtengan buenos resultados pre y posquirúrgicos con tiempos de cirugía relativamente cortos.

Materiales sintéticos como mallas de polipropileno re-portado por Matera y col (1981), al ser un material extraño al organismo puede generar reacciones inflamatorias que complican la adecuada cicatrización y evolución. En nuestro caso el material utilizado si bien es externo al organismo del animal, es de la misma especie con un componente inmunológico bajo, por lo que no genera grandes reacciones inflamatorias como fue observado. Más recientemente se comenzó con la utilización de materiales biológicos tales como la submucosa intestinal porcina reportada por (Stoll y col 2002), colágeno dermal porcino (Frankland 1986) y fascia lata autógena (Bongartz y col 2005). Los materiales biológicos tienen la ventaja de no provocar grandes reac-ciones inflamatorias como los sintéticos. Con respecto a la mucosa intestinal porcina y el colágeno porcino, son injertos xenogénicos, los cuales tienen un mayor índice de rechazo por su mayor antigenicidad que los implantes alogénicos (Frankland 1986).

La fascia lata autógena implica un aumento de la morbilidad del sitio dador, así como aumenta el tiempo

operatorio (Bongartz y col 2005), lo que no ocurre con la técnica de fascia lata alogénica.

Según los resultados obtenidos en 7 pacientes ope-rados y evaluados en nuestro trabajo podemos concluir que la fascia lata alogénica conservada en glicerina al 75% resulta un buen injerto para la utilización en la herniorrafia perineal canina, disminuyendo tiempo y complicaciones quirúrgicas. Esta técnica no produce grandes reacciones inflamatorias manifiestas que indi-quen un rechazo en el organismo receptor, permitiendo una buena evolución a mediano plazo, sin recidivas de la hernia.

Estudios posteriores serán necesarios con el propó-sito de aumentar el número de animales intervenidos, compararla con otras técnicas con objetivo de evaluar objetivamente sus ventajas y desventajas y realizar estudios histopatológicos.

RESUMEN

Este estudio describe y evalúa la técnica para la herniorrafia perineal utilizando fascia lata alogénica. Para esto se procedió a la extracción quirúrgica de fascia lata de caninos mayores de 15 kg, que posteriormente fue conservada en glicerina al 75%. Se seleccionaron siete pacientes caninos machos con hernia perineal unilateral. Los animales fueron sometidos a cirugía mediante un abordaje perineal, reduciendo la hernia, reposicionando los músculos y utilizando la fascia lata alogénica como material de reconstrucción del diafragma pélvico fijada a puntos simples con nylon monofilamento Nº 0. Se realizaron controles a los 7, 15, 30 y 60 días postcirugía, evaluando los siguientes parámetros: defecación, inflamación local y dolor. El injerto alogénico fue compatible en todos los casos tratados, lográndose una herniorrafia exitosa, sin complicaciones posoperatorias a los 60 días. En todos los casos la defecación, micción y anatomía regional volvieron a la normalidad. Este material demostró ser biocompatible y muy bien tolerado, permitiéndonos disponer de una opción segura para la técnica de herniorrafia perineal en el perro.

AGRADECIMIENTOS

A Marcos Ishimoto Della Nina, MV, por la realización del diseño gráfico.

Cuadro 2 Evaluación postoperatoria (7, 15, 30 y 60 días) en los 7 caninos intervenidos quirúrgicamente para reparación de hernia perianal. Postoperative evaluation (7, 15, 30 and 60 day) in 7 dogs after perineal herniorrhaphy.

AnimalSignos clínicos

ComplicacionesAlta médica

postintervención(días)Dolor Defecación Inflamación

1 2 0 0 0 1 1 1 0 3 1 0 0 Ninguna 60

2 2 1 0 0 2 1 0 0 3 1 0 0 Dehiscencia 60

3 2 0 0 0 2 1 1 0 3 1 0 0 Ninguna 30

4 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Ninguna 30

5 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 Ninguna 60

6 2 1 1 0 2 1 1 0 1 1 0 0 Ninguna 30

7 2 2 1 0 2 1 0 0 2 2 1 0 Ninguna 60

64

GG SEMIGLIA Y COL

REFERENCIAS

Anderson MA, GM Constantinescu, FA Mann. 2001. Reparación de hernia perineal en caninos. En: Bojrab MJ. Técnicas actuales en cirugía de pequeños animales. 4ª ed. Inter-Médica, Buenos Aires, Argentina, Pp 510-518.

Bellenger CR. 1980. Perineal Hernia in dogs. Aust Vet 56, 434-438.Bellenger CR, R Canfield. 2003. Perineal hernia. In: Slatter D (ed).

Textbook of small animal surgery. 3rd ed. Saunders, Philadelphia, USA, Pp 487-498.

Bongartz A, F Carofiglio, M Balligand, M Heimann, A Hamaide. 2005. Use of autogenous fascia lata graft for perineal herniorraphy in dogs. Vet Surg 34, 405-413.

Brown DR, ND Udall. 1964. An unusual inguinal hernia in a bitch. Vet Rec 76, 1244-1249.

Carvalho-Buquera LE, JC Canola, JG Padilha Filho, J Maziero-Furlani, IC Talieri, AL Selmi. 2002. Radiografia e macroscopia do joelho após estabilização extra-artiuclar utilizando fáscia lata, fio de poliéster trançado ou fio de poliamida para correção da ruptura do ligamento cruzado cranial em cães. Ciencia Rural, Santa María 32, 73-78.

Chambers JN, CA Rawlings. 1991. Applications of a semitendinosus muscle flap in two dogs. J Am Vet Med Assoc 199, 84-86.

Dorn AS, RE Cartee, DC Richardson. 1982. A preliminary comparision of perineal hernia in the dog and man. J Am Anim Hosp Assoc 18, 624-632.

Duval JM, MA Anderson, GM Constantinescu. 2001. Hernia perineal en felinos. En: Bojrab MJ (ed). Técnicas actuales en cirugía de pequeños animales. 4ª ed. Inter-Médica, Buenos Aires, Argentina, Pp 523-525.

Fossum TW, CS Hedlund, DA Hulse, AL Johnson, HB Seim III, MD Willard, GL Carroll. 1997. Cirurgia do períneo, do reto e do ânus. In: Fossum TW. Cirurgia de pequenos animais. Editorial Roca, São Paulo, Brasil, Pp 371-385.

Frankland AL. 1986. Use of porcine dermal collagen in the repair of perineal hernia in dogs –a preliminary report. Vet Rec 119, 13-14.

Gemmill TJ, S Carmichael. 2003. Complete patellar ligament replace-ment using a fascia lata autograft in a dog. J of Small Anim Pract 44, 456-459.

Gultekin A, C Mete, S Mahmut, O Isa. 2005. Repair of urethral defects using fascia lata autografts in dogs. Vet Surg 34, 514-518.

Hedlund CS. 2002. Perineal hernia. In: Fossum TW (ed). Small animal surgery. 2nd ed. Mosby, St. Louis, USA, Pp 433-437.

Hedlund CS. 2004. Hernia perineal: Diagnóstico y tratamiento. Waltham Focus 14, 5-11.

Hosgood G, CS Hedlund, RD Pechman, PW Dean. 1995. Perineal herniorrhaphy: periooperative data from 100 dogs. J Am Anim Hosp Assoc 31, 331-342.

Mann FA, GM Constantinescu. 1998. Técnicas de salvataje para la her-niorrafia perineal defectuosa. En: Bojrab MJ (ed). Técnicas actuales en cirugía de pequeños animales. 4ª ed. Inter-Médica, Buenos Aires, Argentina, Pp 518-523.

Matera A, PS De Moraes Barros, AJ Stopiglia, RE Randi. 1981. Hérnia perineal no cão tratamento cirúrgico mediante utilização de malha de polipropileno. Rev Fac Med Vet Zootec 18, 37-41.

Mattheison DT. 1989. Diagnosis and management of complications occurring after perineal herniorraphy in dogs. Princeton Junction. Comp Cont Educ Pract 11, 797-822.

Seullner Brandao CV, P Iamaguti, LM Alvarez De Figuereido. 2002. Substituição do ligamento da cabeça do fêmur com auto-enxerto de fáscia lata na luxação coxofemoral em cães. Ciência rural, Santa María 32, 275-280.

Shani J, R Shahar. 2000. Repair of chronic complete traumatic rupture of the common calcaneal tendon in a dog, using a fascia lata graft. Vet Comp Ortho Traum 13, 104-108.

Shoukry M, M El-Keiey, M Hamouda, S Gadallah. 1997. Commercial polyester fabric repair of abdominal hernias and defects. Vet Rec 140, 606-607.

Stoll MR, JL Cook, ER Pope, WL Carson, JM Kreeger. 2002. The use of porcine small intestinal submucosa as a biomaterial for perineal herniorrhaphy in the dog. Vet Surg 31, 979-390.

Weaver AD, JO Omamegbe. 1981. Surgical treatment of perineal hernia in the dog. J Small Anim Pract 22, 749-758.

Zunino JH, MC Saldías, O Wodowóz. 2001. Técnicas de selección, ex-tracción procesamiento y conservación de Tejidos. Publicación de Circulación Interna, Bco. de Tejidos. Banco Nacional de Órganos y Tejidos, Hospital de Clínicas, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

65

Arch Med Vet 43, 65-71 (2011)

COMMUNICATION

Accepted: 18.08.2010.# Financed by College of Agriculture and Life Sciences, Virginia

Polytechnic Institute and State University y Zinpro Corporation, Eiden Prairie, MN, USA.

* Edificio Federico Saelzer, 4to piso, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile; oscarperalta@uach.cl

Supplementing transition cows with calcium propionate-propylene glycol drenching or organic trace minerals: implications on reproductive and lactation performances#

Suplementación de vacas en periodo de transición con propionato-propilen glicol o mineralestraza orgánicos: implicancias para la eficiencia reproductiva y la lactancia

OA Peraltaa*, D Monardesb, M Duchensb, L Moragab, and RL Nebela

aDepartment of Dairy Science, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, 24061, USA.bFacultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue el de evaluar los efectos de una suplementación de propionato de calcio-propilen glicol y una formulación de minerales traza orgánicos (4-Plex) en la eficiencia reproductiva y productiva de vacas durante el periodo postparto. En el ensayo 1 se suplementó aleatoriamente a vacas en lactancia (n = 37) con una mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR) o con un control (CODR), al parto (día 0) y al pico de lactancia (día 30). En el ensayo 2 se trató a las vacas (n = 33) con una fórmula de minerales trazas (TM) o un placebo (COTM) durante el postparto. Los niveles de calcio, fósforo y ácidos grasos no esterificados (NEFA) fueron detectados en suero. Se evaluó la composición de grasa, proteína, células somáticas y cuerpos cetónicos en la leche. Los estros fueron detectados utilizando un sistema HeatWatch y las ovulaciones fueron estimadas mediante detección de progesterona en la leche. La suplementación de DR resultó en mayores (P < 0,05) concentraciones de calcio en suero comparado con CODR. No se detectaron diferencias en la composición de la leche entre los grupos tratados. La suplementación de TM resultó en un menor (P < 0,0001) número de servicios por concepción comparado con COTM. Por lo tanto, la suplementación de DR fue efectiva en aumentar los niveles de calcio en suero; sin embargo, no fue suficiente para inducir otras respuestas metabólicas, reproductivas o productivas. La suplementación diaria de minerales redujo el número de servicios requeridos para la concepción; sin embargo, no mostró otros efectos reproductivos o productivos.

Key words: calcium propionate, propylene glycol, trace minerals, fertility.Palabras clave: propionato de calcio, propilen glicol, minerales traza, fertilidad.

INTRODUCTION

Lactating dairy cows undergo important changes in energy and mineral metabolism during the transition period corresponding from the last three weeks of ges-tation until the first three weeks post-partum (Grummer 1993). These changes are consequence of the increased nutritional demand associated with the later stages in fetal development followed by the onset in milk production. Furthermore, the gradual decrease in dry matter intake results in considerable mobilization of body reserves and deterioration of body condition (Butler and Smith 1989). Nutritional status of high producing dairy cattle during transition period has important implications for fertility performance and productive state (Butler 2000).

Calcium and energy precursors such as calcium pro-pionate and propylene glycol have been used for several years for prevention of metabolic disorders in transition cows (Johnson 1954). Feeding calcium propionate at

calving and 12 h after calving has been shown to reduce the number of cows suffering from subclinical hypocalcemia (Goff et al 1996). Propionate plays a major glucogenic effect as a volatile fatty acid in the rumen and can decrease beta-hydroxy butyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA) during the first 2 days post-partum (Goff et al 1996). Similarly, propylene glycol as an oral drench can reduce concentrations of NEFA and BHB (Christensen et al 1997) and increase levels of glucose and insulin before parturition (Studer et al 1993). Nevertheless, the effect of energy precursor has also been tested in fertility performance during post-partum in dairy cows. Oral supplementation of calcium propionate plus propylene glycol showed no effect on fertility performance in cows fed anionic diets (Melendez et al 2003). However, pro-pylene glycol administration during post-partum improved ovarian activity as showed by earlier first ovulation and longer first luteal phase after calving (Miyoshi et al 2001). We hypothesized that supplementation of a calcium pro-pionate and propylene glycol drenching at parturition and peak of lactation may have a positive metabolic effect and improve reproductive and productive performance in lactating dairy cows. Supplementation at parturition may help in reducing NEB, while administration at Day 30 post-partum may impact over the physiology of first

66

OA PERALTA ET AL

ovulation and the start of luteal activity (Beam and Butler 1998, Vries and Veerkamp 2000).

Trace minerals such as zinc, magnesium, copper and cobalt have important roles in protein synthesis, vitamin metabolism and immune function (Spears and Weiss 2008). The final impact of mineral supplementation to dairy cows; however, may depend on the presence of a dietary mineral imbalance or deficiency (Vanegas et al 2004). Particularly, copper supplementation at the dry period has showed to improve fertility during post-partum (Black and French 2004). The role of copper in the immune function may have a beneficial effect in the resumption of the reproductive performance after calving (Torre et al 1996). Trace minerals has also been reported to improve lactation performance by increasing milk production and reducing somatic cells count (Nocek et al 2006). Thus, our second hypothesis for this study postulates that daily TM supplementation during two months of the post-partum period may improve reproductive and productive performances. The aim of this study was to evaluate the metabolic, reproductive and productive impacts of two different dietary supplements 1) calcium propionate-propylene glycol drenching, and 2) commercial organic trace mineral formulation during the post-partum period.

MATERIAL AND METHODS

COWS AND TREATMENT PROTOCOLS

This study was conducted at the Virginia Tech Dairy Center using 70 Holstein cows fed twice daily a TMR of corn silage, alfalfa hay, and cotton seed (table 1). No anionic salts were included in the diet. Mean milk yield for the herd was 9500 kg/year with 380 kg of fat and 280 kg of protein using twice daily milking and freestall barn housing. Cows were randomly assigned to each dietary supplement group. In trial 1, the drenched group (DR; n = 18) received 3 liters of a mixture of calcium propionate, propylene glycol, water, and minerals (table 1), and the control group was administered 3 liters of a saline solution (NaCl 0.9%) (CODR; n = 19). Both groups were dosed 12 h post-partum and at 30 days in milk (DIM) using a Cattle Pump System (Springer Magrath Company, Mc Cook, Nebraska). In trial 2, cows were supplemented daily with one gel cap bolus containing 14 g of a trace mineral (TM; n = 17) formula (4-Plex, Zinpro Corporation, Eden Praire, MN) or with an empty bolus as a control (COTM, n = 16) from 12 hrs post-partum until 60 DIM (table 1). Boluses were administered orally using a plastic balling

Table 1. Nutrient composition of basal diet1 and propionate-propylene glycol (DR) and trace minerals (TM) supplements for lactating cows. Composición nutricional de la dieta basal1 y suplementos de propionato-propilen glicol (DR) y minerales trazas (TM) para vacas en lactancia.

Basal Diet Supplements

Components(DM basis)

Lactating cow diet

NRC1 requirements Components DR TM

Crude protein (%) 16 14.1 Calcium propionate2 (g) 375

NEL (Mcal/kg) 0.32 0.28 Propylene glycol (g) 400

Fiber (ADF) (%) 25 17 to 21 NaCl (g) 50

Ca (%) 1.2 0.62 Ca3 (g) 97.8

P (%) 0.38 0.32 P4 (g) 26.5

Mg (%) 0.32 0.2 Mg5 (g) 15

K (%) 1.78 1.0 Mn (mg/kg) > 14,300

S (%) 0.24 0.3 Zn (mg/kg) > 25,800

Na (%) 0.4 0.22 Cu (mg/kg) > 9,000

Zn (mg/kg) 60 43 Co (mg/kg) > 1,800

Mn (mg/kg) 71 13 Methionine (mg/kg) > 82,100

Cu (mg/kg) 8 11 Lysine (mg/kg) > 38,000

Co (mg/kg) 1 0.11

1 NRC requirements for a Holstein cow, 680 kg BW, 25 kg/d of milk production. Dry matter intake of 20 kg/d.2 98% purity and 80.6 g of Ca.3 in 100 g of Monocalcium Phosphate and 375 g of Calcium propionate.4 in 100 g of Monocalcium Phosphate.5 in 25 g of Magnesium oxide.

67

CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

gun. All animal experimentation was performed according to the Institutional Animal Care and Use Committee at Virginia Tech.

SAMPLING AND ANALYSES

Blood samples for calcium and phosphorus concen-trations were obtained at 0, 6 and 12 h post-treatment administration corresponding to 12, 18, and 24 h post-partum, respectively. Analysis for calcium and phosphorus was performed using a colorimetric enzymatic kit (Olympus diagnostica GnbH Irish Branch, Lismeehan, O’Callaghan’s Mills, Co. Clare, Ireland). Serum samples for NEFA analy-sis were taken by venipuncture of the median coccygeal vein or artery using vaccutainer tubes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) at 7 days before partum, at calving, at treatment administration, and weekly during 9 weeks post-partum. Samples were allowed to clot for 4 hrs and spun at 900 x g for 15 min. Serum was decanted and frozen at -20 ºC. NEFA was measured using a colorimetric enzymatic kit (Wako NEFA C kit, Wako chemicals Inc., Osaka, Japan). Milk samples were taken 3 times weekly until 60 DIM for determination of acetoacetate using a qualitative test for detection of ketone bodies (Ketocheck test, Great States, Animal Health, St. Joseph, MO). Liver biopsies were taken 30 days before and 30 days after parturition for determination of trace mineral content. Liver samples were obtained trans-cutaneously between the 11th and 12th ribs on the right side of the cow using a reverse cutting custom made biopsy instrument. Element analysis was conducted by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES). Progesterone concentration was measured in milk 3 times weekly from 7 days post-partum until 60 DIM for estimation of the time of ovulation using a non extraction progesterone assay kit (Coat-A-Coat, Diagnostic products Corp., Los Angeles, CA). An increase in milk progesterone concentrations of > 1 ng mL-1 for a period of 2 to 3 days was considered as an indication of ovulation 3 to 4 days before. A HeatWatch transmitter (DDx Inc., Denver, CO) was installed by 10 DIM to determine time of onset of estrus and number of standing events. Cows were artificially inseminated (AI) after voluntary waiting period (60 DIM) and pregnancies were diagnosed by palpation per rectum. Daily milk yield and weekly somatic cells, fat and protein content were estimated until 70 DIM.

DATA AND STATISTICAL ANALYSIS

All statistical analyses were performed using SAS software package (SAS version 9.1.3., SAS Institute, Inc., Cary, NC). Serum concentrations of calcium, phosphorous, NEFA, copper and zinc content, and somatic cell score were compared between treatments using a linear mixed model appropriate for repeated measurements per subject (animal) with the compound symmetry for modeling the

error covariance structure. The fixed effects part of the model included the effects of treatment, day of sampling, parity and interactions between variables. Intervals of days from calving to first ovulation and first detected estrus were compared between groups using the Lifetest analysis. The survival data curves were compared using a log-rank test. The Phreg procedure was used for calculation of the equality of the survivor function and risk ratios for ovulation and estrus occurrence considering treatment, parity, and service number effects. Control cows were considered to have a risk ratio of 1. Milk yield, fat, and protein accumulated until 60 DIM were compared between groups using the GLM procedure including treatment, parity, and interactions between variables. Presence of acetoacetate was compared between groups using a logistic regression analysis. The level of significance was determined at P < 0.05.

RESULTS AND DISCUSSION

We first analyzed metabolic response of lactating cows supplemented with DR at parturition. Calcium levels increased (P < 0.05) at 6 h and remained higher for 12 h after DR supplementation (Figure 1A). Other studies have shown a rise in calcium concentration within 30 and 60 min of calcium propionate administration and then sustained levels within the next 6 to 8 h (Goff and Horst 1994). Sustained levels of calcium in serum for the initial 6 h may be explained by the slow gastrointestinal absorbance of the calcium propionate constituent of the DR formula (Goff and Horst 1994). Goff et al (1996) reported higher levels of calcium 12 h after treatment in cows supplemented with two doses of calcium pro-pionate at calving and 12 h later. Our data showed that a single dose of calcium propionate 12 h after calving was sufficient to increase calcium concentrations for at least 12 h. Although, there was not a clear effect after treatment administration, lower values of phosphorous in cows supplemented with DR (Figure 1C) may be a homeostatic response after increased concentrations of calcium. Supplementation of this glycogenic formula at 12 h post-partum was not effective in reducing NEFA concentrations (Figure 2A). The acute increase of NEFA values at calving are associated with fat mobilization consequence of decreased DMI and increased NEB before parturition (Grummer 1993, Gerloff and Herdt 1999). Previous studies have supplemented propylene glycol for more than10 days during pre-partum in order to increase glycemia and subsequently reduce NEFA levels during transition period (Studer et al 1993, Grummer et al 1994, Goff et al 1996, Stockes and Goff 2001). However, this data indicate that a single day supple-mentation is insufficient to reduce fat mobilization and consequent NEFA levels in cows under NEB. Moreover, concentrations of NEFA in our herd were within normal values during post-partum indicating that an energeti-cally balanced diet may have minimized the effect of

68

OA PERALTA ET AL

Figure 1. Serum calcium (a,b) and phosphorous (c,d) concentrations at 0, 6, and 12 h post-treatment (12, 18, and 24 h post-partum, respectively) for cows supplemented with drench (DR, ) or trace minerals (TM, ). Control cows (CODR, ; COTM, ) for each respective treatment. Different superscripts indicate significant (P < 0.05) difference between hours (1, 2) and treatments (a, b).

Concentraciones de calcio (a,b) y fósforo (c,d) a las 0, 6 y 12 h post-tratamiento (12, 18 y 24 h post-tratamiento, respectivamente para vacas suplementadas con propionato de calcio-propilen glicol (DR, ) y minerales trazas (TM, ). Vacas control (CODR, ; COTM, ) para cada tratamiento respectivo. Superíndices diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05) entre horas (1,2) y tratamientos (a,b).

Figure 2. Serum NEFA concentrations detected at pre- and post-partum for cows treated with (a) drench (DR, ) or (b) trace minerals (TM, ). Control cows (CODR, ; COTM, ) for each treatment. Different superscripts indicate significant (P < 0.05) difference treatments (a, b).

Concentraciones de NEFA en suero detectadas durante el pre- y post-parto para vacas tratadas con (a) mezcla propionato de calcio-propilen glicol (DR, ) o (b) minerales trazas (TM, ). Vacas control (CODR, ; COTM, ) para cada tratamiento. Superíndices diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05) entre horas (1,2) y tratamientos (a,b).

69

CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

energy supplements. We do not have a clear explanation for the higher NEFA concentrations at day 35 in cows supplemented with DR. The metabolic response of TM supplementation in lactating cows during post-partum showed no differences for calcium, phosphorus and NEFA concentrations (Figures 1B-D and Figures 2B). Analyses of trace mineral in liver showed no differences in zinc and copper content between treatments groups; however, cows supplemented with TM showed an in-crease (P < 0.05) in copper levels from 220 ppm at the dry period to 319 ppm at lactation period compared with 268 and 280 ppm in the dry and lactation periods in the COTM group. Prevalence of ketosis was not significantly different between groups (DR = 4.67, CODR = 3.54%; TM = 5.50%; COTM = 3.08%).

We analyzed the return of ovarian activity using a HeatWatch electronic estrus detection system and pro-gesterone measurements in milk. Supplementation of DR at parturition and at peak of lactation had no significant impact over reproductive variables (table 2). Similarly, Melendez et al (2003), using 161 cows found no effect of a single supplementation of a similar drench on several reproductive variables including conception rates, calving to conception interval, and services per conception. As

described above, the lack of a significant effect of DR supplementation on reproduction performance may be associated to the limited metabolic impact of the admi-nistration of a single dose of this supplement separated by a 30-day interval during post-partum. Depending on the concentration present on the diet, supplementation of trace minerals has showed a positive effect on reproductive performance in dairy cows (Campbell et al 1999, Vanegas et al 2004). In our study, cows supplemented with TM dis-played lower (P < 0.0001) services per conception (1.14) compared to COTM (2.10) cows (table 2). Previous trials using different supplements containing copper during the dry period have showed significant improvements in ferti-lity (Black and French 2004). The physiological effect of copper on the reproductive physiology of dairy cows is not completely understood; however, copper mediation of the immune function may have a beneficial effect on cellular processes occurring during post-partum including uterine involution, ovarian activity and embryonic development (Torre et al 1996). There were no significant differences in milk yield, fat, protein and somatic cell count at 60 DIM between treatments groups (table 3). Previous reports have showed inconsistent results of a similar glycogenic drench administration on productive variables with studies

Table 2. Reproductive parameters for cows supplemented with drench (DR), trace minerals (TM), and respective controls (CODR and COTM) during early lactation. Parámetros reproductivos para vacas suplementadas con mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR), minerales trazas (TM) y controles respectivos (CODR y COTM) durante la lactancia temprana.

Variable DR CODR TM COTM SEM1

Conception rate 41.9 44.1 45.8 47.6

Days to first ovulation

Mean 32.8 31.7 29.7 30.5 2.73

Median 29 22.5 22 21.7

Risk ratio 0.8 1 0.87 1

Days to first estrus

Mean 45.7 46.4 42.7 45.3 6.96

Median 46 66 42 68

Risk ratio 0.60 1 0.57 1

Standing events at first estrus (no) 2.3 3.1 4.3 3.3 0.50

First to second estrus interval (d) 46.2 35.6 38.6 36 7.35

Standing events at second estrus (no) 3.5 4.4 4.8 4.2 0.10

Days to first service

Mean 98 108 90 103 7.04

Median 94 105 92 98

Risk ratio 0.68 1 0.71 1

Services per conception 2.21 2.06 1.14a 2.10b 0.26

Different superscripts (a,b) indicate significant (P < 0.05) difference.1 Standard error of the mean.

Superíndices diferentes (a,b) indican diferencias significativas (P < 0,05). 1 Error estándar de la media.

70

OA PERALTA ET AL

Table 3. Milk yield, fat and protein composition, and somatic cell score for cows supplemented with drench (DR), trace minerals (TM) and respective controls (CODR and COTM) cows during early lactation. Producción de leche y composición de grasa, proteína e índice de células somáticas en vacas suplementadas con mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR), minerales trazas (TM) y controles respectivos (CODR y COTM) durante la lactancia temprana.

Variable DR CODR TM COTM SEM1

Milk yield2 (kg) 2.181 2.270 2.204 2.189 122.9

Fat2 (kg) 87.1 94.1 89.4 88.4 2.99

Protein2 (kg) 60.1 66.12 60.64 58.3 4.29

Somatic cells (Score) 2.5 1.73 2.28 2.23 1.35

Different superscripts (a, b) indicate significant (P < 0.05) difference.1 Standard error of the mean.2 Accumulated until 70 days in milk.

indicating a positive effect (Higgins et al 1996, Stockes and Goff 2001) or no effect (Melendez et al 2003). Similarly, supplementation of TM has showed a positive effect on milk yield and somatic cell count (Kellog and Lane 1996) or no effect on milk production and composition (Kellog et al 1996, Campbell et al 1999).

In conclusion, supplementation of a calcium propionate-propylene glycol drenching at parturition and at peak of lactation was effective in increasing calcium in serum shortly after treatment; however, was not sufficient in inducing other metabolic, reproductive or productive responses. Administration of TM during 60 days after calving resulted in lower number of services required per conception; however, this supplementation showed no effect on other reproductive or productive variables. The impact of DR and TM supplementation on lactation cows during transition period might have been minimized by the proper diet management of the herd used in this study.

SUMMARY

The aim of this study was to estimate the effect of the supplementation of a calcium propionate-propylene glycol drenching and a commercial organic trace mineral formulation (4-Plex) on reproductive and lactation performances in cows during the post-partum period. In trial 1, lactating dairy cows (n = 37) were randomly assigned either to a calcium propionate-propylene glycol drenching (DR) or to a control (CODR). Both groups were treated at 12 h post-partum and at 30 DIM. In trial 2, (n = 33) cows were treated with either a trace mineral (TM) formula or a placebo (COTM) daily from 12 h post-partum until 60 DIM. Blood samples were collected to evaluate calcium, phosphorus and non-esterified fatty acids serum levels. Milk samples were obtained for fat, protein, somatic cell, and ketone bodies composition. Liver biopsies were taken for zinc and copper content. Estruses were detected using a HeatWatch system and ovulations were estimated by detecting progesterone concentrations in milk samples. Supplementation with DR resulted in higher (P < 0.05) concentrations of calcium compared to the control group. There were no differences in NEFA, ketone bodies, milk yield, protein, fat and somatic cell count between treatment groups. Supplementation of TM resulted in less (P < 0.0001) services per conception compared to COTM. Thus, DR supplementation during post-partum was effective in increasing calcium in serum shortly after treatment; however, was not sufficient

to induce other metabolic, reproductive or productive responses. Daily trace mineral supplementation resulted in lower services required per conception; however, this supplementation showed no effect on other reproductive or productive variables.

REFERENCES

Beam SW, WR Butler. 1998. Energy balance, metabolic hormones, and early postpartum follicular development in dairy cows fed prilled lipid. J Dairy Sci 81, 121-131.

Black DH, NP French. 2004. Effects of three types of trace element supplementation on the fertility of three commercial dairy herds. Vet Rec 154, 652-658.

Butler WR. 2000. Nutritional interactions with reproductive performance in dairy cattle. Anim Reprod Sci 60-61, 449-457.

Butler WR, RD Smith. 1989. Interrelationships between energy balan-ce and post partum reproductive function in dairy cattle. J Dairy Sci 72, 767-783.

Campbell MH, JK Miller, FN Schrick. 1999. Effect of additional Cobalt, Copper, Manganese, and Zinc on reproduction and milk yield of lactating dairy cows receiving bovine somatotropin. J Dairy Sci 82, 1019-1025.

Christensen JO, RR Grummer, FE Rasmussen, SJ Bertics. 1997. Effect of method of delivery of propylene glycol on plasma metabolites of feed-restricted cattle. J Dairy Sci 80, 563-568.

de Vries MJ, Veerkamp RF. 2000. Energy balance of dairy cattle in relation to milk production variables and fertility. J Dairy Sci 83, 62-69.

Gerloff BJ, TH Herdt. 1999. Fatty liver in dairy cattle. In: Howard J, Smith R (eds). Current Veterinary Therapy 4, Food Animal Practice. W. B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania. USA, Pp 230-233.

Goff JP, RL Horst. 1994. Calcium salts for treating hypocalcemia: car-rier effects, acid-base balance, and oral versus rectal administration. J Dairy Sci 77, 1451-1456.

Goff JP, RL Horst, PW Jardon, C Borelli, J Wedam. 1996. Field trials of an oral calcium propionate paste as an aid to prevent milk fever in periparturient dairy cows. J Dairy Sci 79, 378-383.

Grummer RR. 1993. Etiology of lipid related metabolic disorders in periparturient dairy cows. J Dairy Sci 76, 3882-3896.

Grummer RR, JC Winkler, SJ Bertics, VA Studer. 1994. Effect of pro-pylene glycol dosage during feed restriction on metabolites in blood of prepartum Holstein heifers. J Dairy Sci 77, 3618-3623.

Higgins JJ, WK Sanchez, MA Guy, ML Anderson. 1996. An oral gel of calcium propionate plus propylene glycol is effective in elevating calcium and glucose levels in periparturient dairy cows. J Dairy Sci 79 (Suppl. 1), 130.

Johnson RB. 1954. The treatment of ketosis with glycerol and propylene glycol. Cornell Vet 44, 6-21.

71

CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

Kellog DW, A Lane. 1996. Effect of supplementing 4-Plex to lactating Holstein cows. In: Technical Bull. Zinpro Corp., Eden Prairie, MN, USA, Pp 34-38.

Melendez P, GA Donovan, GA Risco, R Littel, JP Goff. 2003. Effect of calcium-energy supplement on calving-related disorders, fertility and milk yield during the transition period in cows fed anionic diets. Theriogenology 60, 843-854.

Miyoshi S, JL Pate, DL Palquist. 2001. Effects of propylene glycol drenching on energy balance, plasma glucose, plasma insulin, ovarian function and conception in dairy cows. Anim Reprod Sci 68, 29-43.

Nocek JE, MT Socha, DJ Tomlinson. 2006. The effect of trace mineral fortification level and source on performance of dairy cattle. J Dairy Sci 89, 2679-2693.

NRC, National Research Council. 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th ed. National Academy Press, Washington DC., USA.

SAS Institute. 2006. Base SAS® 9.1.3 Procedures Guide. 2nd ed. Volumes 1, 2, 3 and 4. Cary, NC, USA.

Spears JW, WP Weiss. 2008. Role of antioxidants and trace elements in health and immunity of transition dairy cows. Vet J 176, 70-76.

Stockes SR, JP Goff. 2001. Case study: Evaluation of calcium propionate and propylene glycol administered into the esophagus of dairy cattle at calving. The Professional Animal Scientist 17, 115-122.

Studer VA, RR Grummer, SJ Bertics. 1993. Effect of prepartum propylene glycol administration on periparturient fatty liver in dairy cows. J Dairy Sci 76, 2931-2939.

Torre PM, RJ Harmon, RW Hemken, TW Clark, DS Trammell, BA Smith. 1996. Mild dietary copper insufficiency depresses blood neutrophil function in dairy cattle. J Nutr Immunol 4, 3-24.

Vanegas JA, J Reynolds, ER Atwill. 2004. Effect of an injectable trace mi-neral supplement on first-service conception rate of dairy cows. J Dairy Sci 87, 3665-3671.

73

Arch Med Vet 43, 73-78 (2011)

COmmuniCaTiOn

accepted: 18.08.2010.

* ravendano@unab.cl, reavendano@yahoo.com

Efficacy of a commercial disinfectant against Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. and Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV)

pathogens of Atlantic salmon (Salmo salar) farmed in Chile

Eficacia de un desinfectante sobre Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. y Virus de la necrosis Pancreática infecciosa (iPnV), patógenos de salmón

del atlántico (Salmo salar) cultivado en Chile

M Mullera, P Ilardib, R Avendaño-Herrerac*

aaQuaFaRma, División de acuicultura, Veterquímica S.a., Puerto montt, Chile.bLaboratorio de investigación y Desarrollo-Veterquímica, Cerrillos, Santiago, Chile.

cuniversidad andrés Bello, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Ciencias Biológicas, Viña del mar, Chile.

REsuMEN

En el presente trabajo se evaluó la eficacia in vitro del desinfectante Duplalim®, una combinación sinérgica de glutaraldehído y sales de amonio cuaternario de cuarta generación, contra 4 patógenos de peces prevalentes de la salmonicultura chilena. Los resultados muestran que todas las concentraciones ensayadas (diluciones entre 1:200 a 1:400) fueron eficaces sobre los aislados de Vibrio ordalii y Vibrio anguillarum post-30 s de exposición, detectando niveles de reducción igual a 1.8 x 106 uFC/ ml. Concentraciones superiores de Duplalim® (dilución 1:50) y un tiempo de exposición no menor a 5 min. fueron necesarios para eliminar completamente al patógeno intracelular Francisella sp. Cuando el desinfectante fue ensayado contra el Virus de la necrosis Pancreática infecciosa (iPnV), se detectó que la dilución 1:400 tiene un efecto significativo después de 2 minutos sin importar los títulos de iPnV testeados (mayor concentración evaluada 107.6 TCiD50/ ml). Duplalim® se evaluó en condiciones masivas contra los miembros de la familia Vibrionaceae. En comparación a los controles (sin adición desinfectante), la dilución 1:400 de Duplalim® eliminó completamente V. ordalii y V. anguillarum después de 15 minutos de tratamiento, tanto en el agua de cultivo como en la superficie de mallas usadas en el cultivo del salmón. así, el análisis microbiológico del agua de los controles mostró concentraciones de 1.4 ± 0.3 × 106 uFC/ ml, mientras en el caso de las mallas 7.6 ± 3.2 × 105 uFC/ ml1. En resumen, los antecedentes obtenidos indican que el uso del desinfectante Duplalim® es efectivo contra V. ordalii, V. anguillarum y iPnV en bajas concentraciones y cortos periodos de exposición (dilución 1:400 por 15 min.), mientras que para el patógeno intracelular se requiere una concentración mayor.

Key words: disinfectant, Chilean fish pathogens, atlantic salmon.Palabras clave: desinfectante, patógenos de peces, salmón del atlántico.

most important pathogen in the salmon industry in Chile because no commercial vaccines are available. in general, most treatments proposed for the outbreaks are based on the administration of drugs through feed. Considering that a selective effect of antimicrobial use on the emergence of resistant fish bacteria has been documented in several reports (Smith et al 1994, alderman and Hastings 1998), alternative treatments to the use of drugs are necessary.

in salmonids aquaculture facilities, disinfectants are vital tools for effective farm biosecurity, used to reduce pathogenic microorganisms on biological surfaces by rather non-specific actions. They include iodophores used for eggs and equipment disinfectants, salts, organic chlorocompounds (e.g. chloramines-T), aldehydes (e.g. formalin), hydrogen peroxide and quaternary ammonium compounds (e.g. ben-zalkonium chloride) (Burka et al 1997). The majority of these chemicals have also been used to inactivate bacterial and virus pathogens on contaminated rearing equipment, seawater pipes, air hoses, tanks, and nets as well as the hands and feet of the working staff. Besides its disinfecting

inTRODuCTiOn

Fish diseases of major importance in Chilean salmon farming includes infectious pancreatic necrosis (iPn) and Piscirickettsia salmonis (Fryer and Hedrick 2003), which cause significant economic losses due to mortali-ties of atlantic salmon, Salmo salar, fry and post-smolt in seawater. in addition, an increase in disease detection of emergent pathogens as Vibrio ordalii (Colquhoum et al 2004), Streptococcus phocae (Gibello et al 2005, Romalde et al 2008), Francisella (Birkbeck et al 2007) and, lately, Vibrio anguillarum (avendaño-Herrera et al 2007) has been observed in the last decade. To date, economic losses caused by these bacterial pathogens, except V. ordalii, have decreased; however, it remains one of the

74

m muLLER et al

properties, few studies have been designed to assess the quaternary ammonium compounds, particularly a syner-gistic blend of superquats and glutaraldehyde (Duplalim®, Veterquímica S.a., Chile), which is commercialized as a disinfectant of broad spectrum, presenting fast action and low toxicity. For these reasons, the aims of this study were to determine the efficacy of Duplalim® in treating various fish pathogens under in vitro conditions and large scale and validate the treatment regimes for controlling these diseases in salmon production.

maTERiaL anD mETHODS

This study was done in two experimental stages: i) In vitro susceptibility of the extracellular bacteria V. ordalii and V. anguillarum, intracellular pathogens as Francisella sp. and iPnV. ii) Large scale assays conducted at the hatch-ery of the Laboratory of Research and Development at Veterquímica. The experiments 1 and 2 of the stage i was carried out in triplicate for each bacterial strain, while the experiment 3 considered the use of iPnV.

STaGE i: In VItro aSSayS in LaBORaTORy

ExPERimEnT 1

The effectiveness of different Duplalim® treatments against V. ordalii and V. anguillarum was assessed following the procedures of avendaño-Herrera et al (2006). The V. ordalii strains used in this work, au2, au3 and PF180, were isolated in Chile during 2003-2005 from clinically infected atlantic salmon (Silva-Rubio et al 2008a). in the case of V. anguillarum, three strains isolated from atlantic salmon coded as PF2, PF7 and PF8 and belonging to serotype O3 of this fish pathogen (Silva-Rubio et al 2008b) were employed. The reference strains of Vibrio ordalii aTCC 33509T and Vibrio anguillarum aTCC 43307 from the american Type Culture Collection were used for comparative purposes. The experimental assays were conducted in sterile 6-well multidishes (nunclon™ Surface) containing 10 ml of natural sterilized (filtered and autoclaved) seawater. inocula were prepared from bacteria grown on tryptone soy agar (Oxoid) supplemented with 1% naCl (Winkler) plates (TSa-1), washed in 0.85% sterile saline solution (SS), resuspended and diluted in SS, and then each well was seeded with 500 μl of the bacterial suspension to achieve an initial V. ordalii and V. anguillarum concentration of 5 x 106 cells ml-1 as determined by direct microscopy count (equivalent to 1.8 x 106 CFu x ml-1, respectively). after a stabilization period of 30 min. at 19 ± 1 ºC, susceptibility of each fish pathogens and bacterial strain to different Duplalim®

concentrations was examined in triplicate, adding this chemical compound to 1:200; 1:300 and 1:400 dilutions. Duplalim® was evaluated during 30, 60, 120 and 180 s at 20 ºC. Controls without the addition of the disinfectant

were run simultaneously in exactly the same conditions as described above.

To determine the cultivable cells in the seawater, samples of 0.5 ml were taken aseptically, after each treatment. all samples were serial-diluted in SS and 0.1 ml of each dilu-tion was plated in duplicate on TSa-1 plates for the count of total heterotrophic marine bacteria. after incubation, biochemical identification tests (aPi20E; Biomèrieux) and slide agglutination tests (Silva-Rubio et al 2008a, b) were carried out to determine the presence of the inoculated V. ordalii and V. anguillarum strains in each multidish.

ExPERimEnT 2

The Francisella sp. strain used in this work was iso-lated in Chile in 2006 from spleen of clinically infected atlantic salmon. To determine the effect of different Duplalim® concentrations on Francisella sp, bactericidal assays were conducted according to a previously described protocol of avendaño-Herrera et al (2006) with minor modification.

Pure colonies of Francisella sp. cultivated at 20 ºC were picked up from cysteine heart agar (Difco™) plates containing 5% sheep blood (Olsen et al 2006), adjusted in sterile freshwater to contain 3 x 108 CFu x ml-1. Duplalim®

was evaluated during 2, 5 and 15 min treatment periods for the control of Francisella sp. using diluted disinfectant to a 1:50; 1:200 and 1:400 concentrations. Francisella sp. controls were run simultaneously without the addition of the disinfectant. The experiment was also carried out in triplicate.

Treatments were considered effective if a pure cul-ture of grey white, slightly mucoid convex colonies of Francisella sp. was absent when the samples which were taken aseptically at the end of the incubation period were spread onto media.

ExPERimEnT 3

infectious pancreatic necrosis virus (iPnV) strain 483, of the serotype Sp, originated from an outbreak in Salmo salar cultured in Chile in 2005, was used for the assay. The virulent iPnV isolate was previously identified from tissue according to Espinoza and Kuznar (2002). The virus was subjected to two rounds of plaque purification on Chinook salmon embryo cells (CHSE-214) before propagation in the same fish cell line to obtain a stock (Johansen and Sommer 2001). The infected cell cultures were kept frozen at -80 ºC until they were used. a small aliquot of the material was frozen separately and was used for the determination of TCiD50 (50% tissue culture infective dose) by end-point dilution (Reed and muench 1938). The experimental assays were conducted in sterile 6-well multidishes (nunclonTm Surface) containing 10 ml of the CHSE-214 with iPnV at titres of 105.6; 106.6 and 107.6 TCiD50 ml-1. Susceptibility of iPnV to Duplalim® was examined in triplicate, with

75

DISINFECTANT, CHILEAN FISH PATHOGENS, ATLANTIC SALMON

the addition of this chemical compound at final dilution of 1:400, and then incubated for 2, 5 and 15 min at 19 ± 1 ºC. The action of the disinfectant was stopped using a specific neutralizer (polysorbate 80 (3%), lecithin 3 g/L, sodium thiosulphate 5 g/L, L-histidine 1 g/L and saponin 30 g/L), which was validated for all disinfectants before use in the tests. Negative controls, consisted of a harvested cell culture medium from uninfected cell cultures exposed to the same Duplalim® concentration but not inoculated with IPNV. The infected cell cultures but not treated with the disinfectant were included as positive controls. All controls were run simultaneously in the exact same conditions as described above.

To test the efficacy of superquats and glutaraldehyde compounds to inactivate IPNV, 0.5 ml aliquots of the virus solution were taken aseptically and transferred to plates containing the CHSE-214 cells. Each sample was passaged three times every seven days and incubated at 18 ºC. The cytopathic effect was observed by inverted microscopy for up to 7, 14 and 21 days post-infection.

Moreover, attempt was made to check if the inhibition caused by Duplalim® was produced only by the disinfec-tant or contributed to the persisted active residues in the media. The IPNV isolate 483 was cultured as previously described and concentrated by successive ultrafiltrated steps until 1015 TCID50/ml was obtained. Two aliquots of 5 ml each was taken, one of them being used as control (no disinfectant added) and the other aliquot treated with Duplalim® at final dilution of 1:400, followed by incuba-tion for 2 min at 18 ºC. Each solution was transferred to a Centricon ultrafiltration device with 10-kDa molecular mass cutoff (Millipore), and supernatants were removed by centrifugation (3500 x g for 60 min at 4 ºC). IPNV were resuspended in phosphate buffered saline (pH 7.4) and dialysis was repeated until a concentration of residual Duplalim® reached 1:10000 dilutions. The control sample (without disinfectant) was treated in the same way. Finally, 100 µl of the treatment and control were left in a 24-well plate containing CHSE-214 cells and mixed. Serial ten-fold dilutions (from 10-1 to 10-5) were made in quadruplicate and then incubated at 18 ºC for two weeks. Each plate was observed by inverted microscopy for the appearance of cytopathic effect for 7 and 14 days.

STAGE II: LARGE SCALE ASSAY

To mimic a “near real-life” the assays for the evaluation of Duplalim® was performed in buckets containing 10 L of 0.45 µm filtered seawater. Four buckets were inoculated with the strains of V. anguillarum Au2 and V. ordalii PF2 at a final concentration of 1.8 x 106 CFU x ml-1 of a 1:1 mix concentration. Each bucket was seeded with the bacterial suspension prepared as described for experi-ment 1 and homogenized with a fish net for 60 s. Each fish net was maintained inside the buckets. Following a 30 min acclimatization period, addition of Duplalim® at

a concentration of 1:400 was performed to two buckets, while the remaining inoculated buckets without the disin-fectant were considered as positive controls. The negative control corresponded to a new bucket with only seawater, no bacteria nor chemical disinfectant added.

In order to evaluate the effect of Duplalim® on the microorganisms attached to the surface of the fishing net (net used in salmon cages) at the end of incubation (24 h), the thread mesh of each experimental set was sampled. For this, ten pieces of net were carefully cut into 1 cm2

pieces, washed repeatedly with SS and put into Falcon tubes containing 10 ml of SS. The bacteria that were attached to the pieces of mesh were removed using an Ultrasonics Homogenizer for 15 seconds.

Bacteriological sampling of water was carried out at 15 min, 4 h and 24 h post-treated with Duplalim®. Samples were serial diluted in SS and 0.1 ml of each dilution was plated on TSA-1 for the total count of Vibrionaceae. To increase the sensitivity of the technique, samples of 1 ml were taken directly from the water of each bucket and seeded onto the same bacteriological medium. The plates were incubated at 20 ºC for one week. After incubation, selective counts of CFU (according to the morphotypes grown on TSA-1 plates) and confirmation by serological identification tests (i.e. slide agglutination assays) ac-cording to Silva-Rubio et al (2008a, b) were carried out to determine the presence of each bacterium inoculated in seawater.

RESULTS AND DISCUSSION

The addition of Duplalim® at concentrations among 1:200 to 1:400 to seawater killed completely V. ordalii and V. anguillarum in all in vitro treatments, regardless of the period tested and strains used. In contrast, there was no loss of viability in the un-disinfectant controls with values of 1.6 ± 0.56 x 106 CFU x ml-1 for V. anguillarum, and 1.4 ± 0.97 x 106 CFU x ml-1 for V. ordalii (similar to initial inoculate of each pathogen).

The addition of Duplalim® to freshwater killed com-pletely Francisella sp. at a concentration of 1:50 within 5 and 15 min. (table 1). When the concentration of the disinfectant was decreased, a higher degree of resistance to Duplalim® was observed. Interestingly, in freshwater with a dilution of 1:400, Francisella sp. cells were recov-ered regardless the incubation time. Similar cultivability pattern to Francisella sp. cells was observed in the nega-tive control groups (without disinfectant). In spite of the limited number of the isolates tested (only one) it seems that Francisella sp., an intracellular facultative micro-organism, had the highest resistance to Duplalim® than the extracellular pathogens such as V. ordalii and V. an-guillarum. In a recent study, Verner-Jeffreys et al (2009) reported that two Gram-positive bacteria (Lactococcus garviae and Carnobacterium piscicola) were apparently more resistant to four biocide products than other two

76

M MULLER ET AL

of infected host cells (Olsen et al 2006) the resistance shown by the isolate to Duplalim® might be explained by the low concentration that can be attained by this disinfectant compound. Until now, the molecular base of this resistance is unknown. Further studies are needed to elucidate the composition and chemical structure and/or the role of some enzyme produced by Francisella in its protection.

The survival capacity of the IPNV isolate 483 in the CHSE-214 cells after the Duplalim® treatments is shown in table 2. The concentration of the disinfectant had a significant effect with 2, 5 and 15 min. of exposure, regardless of the IPNV titres employed (until a concen-tration of 1015 TCID50 ml-1). As expected, the results of cytopathic effect test showed that IPNV produced degenerative changes in the CHSE cell line without disinfectant passed three times. On the other hand, it is important to denote that the action of active residues was efficiently stopped with the addition of the neutral-izer as well as by the dialysis procedures. Therefore, no toxicity of the disinfectant and solvent either detected over the cells. In fact, after incubation (IPNV with and/or without Duplalim®) only total cytopathic effect was detected in the CHSE-214 plates without the disinfectant, therefore, IPNV was re-isolated at 10-5 serial dilutions during two weeks.

Table 1. In vitro bactericidal effect of Duplalim® on Francisella sp. at 20 ºC.

Efecto bactericida in vitro de Duplalim® en Francisella sp. a 20 ºC.

Duplalim® Exposure time (min)

dilutions 2 5 15

Untreated-control +++a +++ +++

1:50 + – –

1:200 +++ ++ –

1:400 +++ +++ ++

a Data correspond to the results of the Francisella sp. isolate in triplicate.

- Effective (no CFU after exposure).

Growth of Francisella sp.: +, < 102; ++, 103 and +++, > 105.

Table 2. Effect of Duplalim® at final dilution of 1:400 on in vitro inactivation of Infectious Pancreatic Necrosis Virus. Efecto de Duplalim® en dilución final de 1:400 sobre la inactivación in vitro del Virus de la Necrosis Pancreática.

Titre viral (TCID50/ ml) Exposure time (min) Passage 1a Passage 2 Passage 3

105.6 2 – – –

5 – – –

15 – – –

Untreated-control + + +

106.6 2 – – –

5 – – –

15 – – –

Untreated-control + + +

107.6 2 – – –

5 – – –

15 – – –

Untreated-control + + +

1015 2 – – –

Untreated-control + + +

a Three replicates per passage.

– Effective (no cytopathic effect after exposure).

+ Positive Sample for IPNV with an extensive cytopathic effect of approximately 90% was observed at 7 days.

Gram-negative pathogens. In general, in the case of the Gram-positive bacteria it is suggested that the presence of some cell structures (i.e. capsular material) may confer resistance to antibacterial compounds (i.e. activity of serum). Considering that Francisella sp. replicates and grows within the membrane-bound cytoplasmatic vacuoles

77

DISINFECTANT, CHILEAN FISH PATHOGENS, ATLANTIC SALMON

In general, most of the disinfection studies in IPNV have been carried out using other chemical disinfectants such as iodine, chlorine and formalin. Both iodine and chlorine inactivated IPNV, although the efficacy depended on the pH, virus concentration and the presence of organic matter in water (Elliott and Amend 1978). Studies of Desaultes and MacKelvie (1975) reported that a 30 min exposure to chlorine at a concentration of 40 ppm effectively inac-tivates a concentration of 107.5 TCID50/ ml, while using 35 ppm iodine for the same time is appropriate to eradicate a concentration of 106.6 TCID50/ ml. These authors also denoted that although formalin exhibited some virucidal activity, it was not a good choice for the inactivation of IPNV (MacKelvie and Desaultes 1975).

With the aim to asses if Duplalim® can be a suit-able candidate for the treatment of seawater and surface of tanks, nets and/or rearing equipment, bioassays were performed in buckets with seawater containing a mesh to stop fish and seeded with two different fish pathogens. In this study, members of the genus Vibrio were selected because they constitute part of the microbiota of marine fish as well as part of the normal microbiota of the aquatic environment, and therefore present a constant threat for any susceptible host (Austin and Austin 2007). The culture of V. ordalii and V. anguillarum in the buckets treated with 1:400 disinfectant concentrations had a significant effect on the survival of the microbiota in the seawater, with no viable bacteria being detectable from 15 min post-treatment. In contrast, controls without the addition of Duplalim®

maintained 1.37 ± 0.29 x 106 CFU/ ml during the experi-ment. Similarly, there was no evidence of Vibrionaceae culture adhered on the fishing net compared to untreated Duplalim® tries. It is important to note that survival for an aquatic bacterium in seawater outside the fish host may depend on biofilm formation. V. anguillarum is normally found attached to surfaces, as opposed to a free-swimming form, which is likely to provide an adaptive or survival advantage for bacteria in the aquatic environment (Costerton et al 1987, 1995). In each of these environments, the bacterium likely utilizes its external membrane to protect its intracellular contents from damaging agents or condi-tions (Wang et al 2003). When attempt of resuscitation of the non-culturable bacteria with the addition of fresh medium was employed, no cells from the mesh samples were recovered onto TSA-1 (data not shown), indicating that all microorganisms were completely killed.

On the other hand, cultivable bacteria remained constant in the positive controls (without the disinfectant), regard-less of the period sampled, and showing an average value of 1.4 ± 0.3 × 106 CFU/ ml. The bacteria adherence on the mesh without exposure to the disinfectant was about 55.3% (7.6 ± 3.2 × 105 CFU/ ml) lower in concentration than those containing in the seawater after 24 h. Selective counts of V. anguillarum on TSA-1 sampled from the buckets with no treatment represented an average of 49.7% of the total microbiota counted. As expected, seawater without

the mixed bacteria and disinfectant remained with a low load of bacteria (6.3 × 105 CFU × ml-1) through the entire period of the study.

Although Duplalim® is one of the most used disinfectants in the Chilean salmon industry, it has been legally registered and recently validated to be used against Infectious Salmon Anaemia Virus (ISA) virus and its effective use may be well established in this study; we cannot discard that organic matter present in the water column or dirty conditions in the water could interfer on the efficiency of the disinfectant. Studies are being carried out to test this condition using the Verner-Jeffreys et al (2009) protocol.

It can be concluded that, apart from the fact that in this work we used a methodology that is different to the test standards used for the evaluation of bactericidal and virucidal activity of disinfectants and antiseptics for use in the veterinary field published recently by Verner-Jeffreys et al (2009), our results demonstrate that the use of Duplalim® in aquaculture is effective in low concentra-tion and short time of exposure (15 min. at a concentration of 1:400 dilutions), with the exception of the intracellular pathogen used in this work. It is important to highlight that Verner-Jeffreys et al (2009) tested disinfectants of different nature than Duplalim® (i.e. hydrogen peroxide, peracetic acid, acidic iodophore and Chloramine T) and suggested that when studying other desinfectants (i.e. superquats and glutaraldehyde), the procedure can be adopted or modified to be used in countries outside Europe. Therefore, the use of Duplalim® may be appropriate as a general preventive disinfection method against V. ordalii, V. anguillarum and IPNV for treating water culture, surface of tanks, nets and/or rearing equipment, but all these equipments would need to rinse off before they could be used in contact with fish.

SUMMARY

The efficacy of the disinfectant Duplalim®, a synergistic blend of superquats and glutaraldehyde, was analysed in vitro against 4 fish pathogens. All concentrations tested (1:200 to 1:400 dilutions) were efficacious on killing Vibrio ordalii and Vibrio anguillarum in seawater after 30 s, being the level of reduction equal to 1.8 x 106 CFU/ ml. Higher concentration of Duplalim® (1:50 dilutions) and time of exposure (at least 5 min) is needed to kill completely Francisella sp, an intracellular freshwater pathogen. When Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) was treated with 1:400 disinfectant dilution, this concentration had a significant effect after 2 minutes, regardless of the IPNV titres employed (concentration greater than 107.6 TCID50/ ml). Duplalim® was tested in large scale against Vibrionaceae members. In comparison to the controls (without the disinfectant), 1:400 dilutions of Duplalim® totally killed V. ordalii and V. anguillarum in seawater as well as on the surface of the fishing net (used in the cages of cultured salmon) after 15 min. Cultivable bacteria remained constant in the buckets without the disinfectant (1.4 ± 0.3 × 106 CFU/ ml), regardless of the period sampled. In the case of the adherence on the fishing net, bacteria not exposed to the disinfectant were detected at a concentration of 7.6 ± 3.2 × 105 CFU/ ml. These data indicate that the use of Duplalim® against V. ordalii, V. anguillarum and IPNV is effective in low concentration and short time of exposure (15 min at a concentration of 1:400 dilutions), while the intracellular pathogen requires higher concentration.

78

M MULLER ET AL

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported in part by Grant IPC 019 from the Program Bicentenario Ciencia y Tecnología, CONICYT-Chile and also by Grant DI-01-10/R from the Universidad Andrés Bello.

REFERENCES

Alderman DJ, TS Hastings. 1998. Antibiotic use in aquaculture: devel-opment of antibiotic resistance-potential consumer health risks. Int J Food Sci Technol 33, 139-155.

Austin B, A Austin. 2007. Bacterial fish pathogens: Diseases of farmed and wild fish. Praxis Publishing Ltd, Chichester, UK.

Avendaño-Herrera R, B Magariños, R Irgang, AE Toranzo. 2006. Use of hydrogen peroxide against the fish pathogen Tenacibaculum mar-itimum and its effect on infected turbot (Scophthalmus maximus). Aquaculture 257, 104-110.

Avendaño-Herrera R, A Silva-Rubio, AE Toranzo. 2007. First report of Vibrio anguillarum in Chilean salmon farms. AFS/ Fish Healt Newsletter 35, 8-10.

Birkbeck TH, M Bordevik, MK Frøystad, M.K, A Baklien. 2007. Identification of Francisella sp. from Atlantic salmon, Salmo salar L., in Chile. J Fish Dis 30, 505-507.

Burka JF, KL Hammell, TE Horsberg, GR Johnson, DJ Rainnie, DJ Speare. 1997. Drugs in salmonid aquaculture - a review. J Vet Pharmacol Therap 20, 333-349.

Colquhoun DJ, IL Aase, C Wallace, á Baklien, K Gravningen. 2004. First description of Vibrio ordalii from Chile. Bull Eur Ass Fish Pathol 24, 185-188.

Costerton JW, K-J Cheng, GG Geesy, TI Ladd, JC Nickel, M Dasgupta, TJ Marrie. 1987. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol 41, 435-464.

Costerton JW, Z Lewandowski, DE Caldwell, DR Korber, HM Lappin-Scott. 1995. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol 49, 711-745.

Elliott DG, DF Amend. 1978. Efficiency of certain disinfectants against infectious pancreatic necrosis virus. J Fish Biol 12, 277-286.

Espinoza JC, J Kuznar, 2002. Rapid simultaneous detection and quan-titation of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). J Virol Meth 105, 81-85.

Fryer JL, RP Hedrick 2003. Piscirickettsia salmonis: a Gram-negative intracellular bacterial pathogen of fish. J Fish Dis 26, 251-262.

Gibello A, A Mata, M Blanco, A Casamayor, L Domínguez, JF Fernández-Garayzábal. 2005. First identification of Streptococcus phocae isolated from Atlantic salmon (Salmo salar). J Clin Microbiol 43, 526-527.

Johansen LH, AI Sommer. 2001. Infectious pancreatic necrosis virus infection in Atlantic salmon Salmo salar postsmolts affects the outcome of secondary infections with infectious salmon anaemia virus or Vibrio salmonicida. Dis Aquat Org 47, 109-117.

Mackelvie RM, D Desautels. 1975. Fish viruses-survival and inactivation of infectious pancreatic necrosis virus. J Fish Res Board Can 32, 1269-1273.

Olsen AB, J Mikalsen, M Rode, A Alfjorden, E Hoel, K Straum-Lie, R Haldorsen, DJ Colquhoun. 2006. A novel systemic granulomatous inflammatory disease in farmed Atlantic cod, Gadus morhua L., associated with a bacterium belonging to the genus Francisella. J Fish Dis 29, 307-311.

Reed LJ, H Muench. 1938. A simple method for estimating fifty percent endpoints. Amer J Hyg 27, 493-497.

Romalde J, C Ravelo, I Valdés, B Magariños, E de la Fuente, C San Martín, R Avendaño-Herrera, AE Toranzo. 2008. Characterization of Streptococcus phocae, an emerging pathogen for salmonid culture. Vet Microbiol 130, 198-207.

Silva-Rubio A, C Acevedo, B Magariños, B Jaureguiberry, AE Toranzo, R Avendaño-Herrera. 2008a. Antigenic and molecular characteriza-tion of Vibrio ordalii strains isolated from Atlantic salmon (Salmo salar) in Chile. Dis Aquat Org 79, 27-35.

Silva-Rubio A, R Avendaño-Herrera, B Jaureguiberry, AE Toranzo, B Magariños. 2008b. First description of serotype O3 in Vibrio anguillarum strains isolated from salmonids in Chile. J Fish Dis 31, 235-239.

Smith P, MP Hiney, OB Samuelsen. 1994. Bacterial resistance to antimi-crobial agents used in fish farming: a critical evaluation of method and meaning. Annu Rev Fish Dis 4, 273-313.

Verner-Jeffreys DW, CL Joiner, NJ Bagwell, RA Reese, A Husby, PF Dixon. 2009. development of bactericidal and virucidal testing standards for aquaculture disinfectants. Aquaculture 286, 190-197.

Wang S-Y, J Lauritz, Jana, J Jass, DL Milton. 2003. Role for the major outer-membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation. Microbiology 149, 1061-1071.

79

Arch Med Vet 43 79-83 (2011)

COMMUNICATION

Accepted: 11.08.2010.

* Av. Universidad 330, Curauma, Valparaíso, Chile; julio_retamalesl@yahoo.es

Insects associated with chicken manure in a breeder poultry farm of Central Chile

Insectos asociados a fecas de pollo en una avícola de Chile Central

J Retamalesa, *, F Vivalloa, b, J Robesona

aInstituto de Biología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.bLaboratorio de Biología Comparada de Hymenoptera, Programa de Pós-Graduação em Entomologia,

Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil.

RESUMEN

Los insectos son muy comunes en las instalaciones de la industria avícola y diferentes medidas de bioseguridad se aplican para evitar su propagación debido al hecho que pueden acarrear agentes patógenos. Por lo tanto, es de suma importancia saber qué insectos comúnmente están presentes en los galpones avícolas para optimizar los protocolos de control. Ya que la información sobre este tema es escasa, el objetivo de la presente investigación fue determinar los principales grupos taxonómicos de insectos presentes en el guano de una granja avícola industrial en la zona central de Chile. Las muestras de guano fueron recolectadas en una granja avícola en la Región de Valparaíso, Chile, de áreas adyacentes a las líneas de alimentación y depósitos de agua. Las muestras fueron refrigeradas, transportadas al laboratorio y procesadas para la clasificación taxonómica de los adultos y estados inmaduros de insectos. Los resultados indican una colonización marcada por el escarabajo Alphitobius diaperinus y por los dípteros Fannia sp. en relación con otras seis familias de insectos que se determinaron. Alrededor del 94% de los insectos encontrados en el guano estaban presentes en las muestras procedentes de las zonas adyacentes a las reservas de agua. Por lo tanto, las fugas de los dispositivos de suministro de agua se han convertido en un punto crítico de control de estas plagas entomológicas de las aves de corral, las cuales han sido reportadas como portadoras de una gran variedad de virus, bacterias y parásitos eucariotas.

Key words: Alphitobius diaperinus, insect vectors, poultry farms.Palabras clave: Alphitobius diaperinus, insectos vectores, galpón avícola.

INTRODUCTION

The Chilean poultry industry has increased its produc-tion with the incorporation of new control technologies to prevent insect colonization (Armijo 2006). However, insects are very invasive and the implemented biosecurity measures do not curtail completely the entry of insects into hatcheries. Therefore, they may become active agents that mediate outbreaks of infectious diseases in birds, generating significant financial losses (Cedó 2001, Ricaurte 2005).

There is evidence that insects have an active role in the transport and spread of various avian pathogens in broiler breeder houses (Gray et al 1999, Olsen and Hammack 2000). Alphitobius diaperinus Panzer (Coleoptera: Tenebrionidae) is a major insect pest on poultry farms worldwide, and be-sides generating structural damage, pest control expenses and decreased feeding efficiency (Roche et al 2009), it has been associated with the ability to transmit disease agents such as bacteria of the genera Escherichia, Salmonella and Campylobacter (Chernaki-Leffer et al 2002, Segabinazi

et al 2005, Templeton et al 2006), viruses such as fowl pox and Newcastle (De las Casas et al 1976), fungi of the genera Aspergillus, Penicillium and Candida (De las Casas et al 1972), and protozoans such as Eimeria (Coccidiosis) (Goodwin and Waltman 1996). A. diaperinus also acts as a vector of cecal worms and avian tapeworms (Watson et al 2000).

Despite the importance of insect pest control in the poultry industry, little is known about the entomofauna associated with poultry production and it is scarcely studied in Chile. Therefore, we decided to determine the major insect taxa present in chicken manure in poultry breeder facilities on a major poultry farm in Chile. As a result of this investigation we generated a checklist of the different taxonomic groups of insects associated with poultry faeces in order to facilitate optimization of control measures to minimize dissemination of infec-tious agents and to preserve or improve the quality of poultry production.

MATERIALS AND METHODS

SAMPLING

Insects were collected from eight industrial poultry houses (10 birds/m2) located in the Province of San Antonio, Region

80

J RETAMALES ET AL

of Valparaíso, Chile, during April and May of 2005; a total of 432 manure samples of were collected from this site.

Each house was open-sided with the long axis oriented east to west and containing chickens 43-48 weeks of age at the time of collection. The concrete house floors were covered with a 20 cm layer of accumulated manure that is removed on a yearly basis. Above that, two feeder lines spanned the length of each house, located at 2 m from both the north and south walls. The sampling sites, Sector 1 (S1) and Sector 2 (S2), were located under the north and south feeder lines, respectively. Furthermore, two water drinking lines spanned the central region; sampling sites of Sector 3 (S3) were located under these drinking lines.The moisture content of faeces was determined through a visual and tactile analysis of manure (Rivera et al 2007). We found that moisture increased significantly in S3 compared to S1 and S2.

Populations of insects established at 48 weeks of flock age were sampled following Strother and Steelman (2001) with modifications; samples (0.2 kg each) were collected using a garden shovel from sites at S1, S2 and S3 to a maximum depth of 15 cm, zigzagging along the slopes of the barn houses. The 432 samples were indivi-dually deposited in labeled transparent plastic bags and brought to the laboratory in a refrigerated cooler to avoid the deterioration of specimens.

IDENTIFICATION OF THE ENTOMOFAUNA

Insects were taken out from the faeces samples and placed in labeled vials according to their place of collection and preserved in 70% ethanol. Within 3 days they were processed for identification. The insects were identified at

family and/or species level, depending on the abundance percentage (number of individuals per family / total number of insects found of these taxa) and the distribution (presen-ce of insect family / total number of samples examined) thoughout the breeding barns.

The criteria for identifying adults were based on the taxonomical characters cited by Artigas (1994) and Toro et al (2003). Immature stages were identified according to Chu (1949).

RESULTS AND DISCUSSION

Insects have the ability to colonize poultry manure and therefore key factors for the establishment of a particular entomofauna are the reproductive and developmental characteristics of insects, the food availability present in the poultry houses and the physical and chemical char-acteristics, humidity in particular (Strother and Steelman 2001). In fact, both larvae and adults of orders Hymenoptera, Diptera, Coleoptera and Lepidoptera were found in the poultry farm studied. The same groups of insects were described by other investigators (Kaufman et al 2000) with the exceptions of Lepidoptera (Incurvariidae and Eriocraniidae) and Hymenoptera (Formicidae) which presumably were not using the poultry farm houses as a site for oviposition and the development of immature stages (figure 1).

Of the 1,131 insects examined, 74.6% belonged to the order Coleoptera, the most frequently represented families being Histeridae and Tenebrionidae. The most abundant insect found associated with poultry manure on the farm examined was the beetle Alphitobius dia-perinus. This is in agreement with results obtained by

Figure 1. Percentage of abundance (number of individuals per family / total number of insect found) and distribution (presence of family insect / total number of samples examined) of insect families in chicken manure. Porcentaje de abundancia (número de individuos por familia / número total de insectos encontrados) y distribución (presencia de la familia de insecto / número total de muestras examinadas) de las familias de insectos en el guano avícola.

81

ALPHITOBIuS DIAPERINuS, INSECT VECTORS, POULTRY FARMS

Calibeo-Hayes et al (2005) as well as by Strother and Steelman (2001), and Salin et al (2003), who reported that this insect is the most resistant and persistent in avian rearing facilities even when a combination of insecticides is applied.

A. diaperinus is known to be actively involved in the transmission of various infectious agents and parasites found in birds (table I). In natural conditions, results obtained by Chernaki-Leffer et al (2002) and Segabinazi et al (2005) suggest a limited role of A. diaperinus in the spread of Salmonella, a pathogen associated with the poultry industry. Nevertheless, there are still dis-putes about the role of A. diaperinus in the dispersal of Salmonella in experimental conditions depending on the serovar involved. For example, Davies and Wray (1995) indicate that A. diaperinus does not possess the ability to transmit S. Enteritidis whereas Roche et al (2009) found that larvae and adults of A. diaperinus could act as vectors for the transmission of S. Typhimurium to broilers.

Fannia sp. (Diptera: Fanniidae) was the second most abundant insect found in poultry faeces (23.4%, only immature stages). It had also been cited as an important colonizer of this kind of faeces worldwide (Kaufman et al 2000). This taxon serves as a mechanical vector of different diarrheal pathogens (Manrique and Delfín 2007). Moreover, Fannia sp. has been recently reported as a vector of Dermatobia hominis larvae (Diptera: Oestridae), an agent that causes myasis in humans and animals (Barreto and Souto 2004).

A. diaperinus and Fannia sp. are present in similar per-centages of distribution in the chicken breeding barns examined, followed by Carcinops pumilio (figure 1). Another important feature observed for A. diaperinus and other groups of insects is that the et al onize and establish mainly in areas of high substrate moisture. In fact, 94.1% of the insects found were associated with the high-humidity manure sector S3. Also, the abundance of A. diaperinus adults and Fannia larvae decreases significantly from sector S3 towards sectors S2 (3.4%) and S1 (2.5%).

Table 1. Transport of avian pathogens. Transporte de patógenos aviares.

Insect Pathogens Reference

A. diaperinus Virus Fowl pox and Newcastle virus De las Casas et al 1976Avian leukosis virus Eidson et al 1966Infectious Bursal Disease McAllister et al 1995(Gumboro Disease).

Bacteria Escherichia coli Chernaki-Leffer et al 2002Salmonella sp. Skov et al 2004

Roche et al 2009Campylobacter sp. Templeton et al 2006

Strother et al 2005Bates et al 2004

Clostridium perfringens Vittori et al 2007Staphylococcus sp., Goodwin and WaltmanStreptococcus sp. 1996Bacillus subtilis. De las Casas et al 1972

Fungi Aspergillus, Penicillium De las Casas et al 1972Fusarium, Candida

Protozoa Eimeria sp. Goodwin and Waltman1996

Helminths Cecal worms Watson et al 2000Choanotaenia infundibulum (tapeworm) Elowni and Elbiharis 1979

Fannia sp. Insect Dermatobia hominis Barreto and Souto 2004

C. pumilio Bacteria Salmonella enteritidis Gray et al 1999Campylobacter sp. Skov et al 2004

Relation of the main insects found in poultry houses with the transport f avian pathogens.

Relación de los principales insectos encontrados en las granjas avícolas y el transporte de patógenos aviares.

82

J RETAMALES ET AL

The activity of the histerid beetle Carcinops pumilio is interesting to highlight. This insect is known worldwide for its ability to prey upon fly larvae, including the house fly and representatives of the genus Fannia (Tobin et al 1999, Achiano and Giliomee 2006). Therefore, the presence of both tenebrionids and fanniids in sectors of high moisture could be accounted for by the fact that A. diaperinus eats the eggs of C. pumilio, thus reducing the number of the natural biological controllers of Fannia sp. (Dunford and Kaufman 2006).

Overall, it seems important to investigate the complex interactions between insects in poultry rearing facilities to enhance the use of biological pest control tools in these environments, an approach that could considerably reduce the economic cost incurred by the massive use of insecticides (Kaufman et al 2002).

In summary, the insects reported in this study could generate significant financial losses due to destruction of facilities, parasitism in birds and spread of infectious agents. Nevertheless, some of them play important ecologi-cal roles in poultry farms, acting as controlling agents of other insect pest populations, a trait that could be positively employed. Moreover, improvements in water drainage systems become mandatory since they are critical control points for insect pest management.

SUMMARY

Insects are common in poultry facilities and different biosecurity measures are enforced to prevent their spread due to the fact that they may carry pathogenic agents. Therefore, it is of utmost importance to know what insects are commonly present in poultry sheds to optimize control protocols. Since information on this subject is scarce, this investigation aimed to determine the main insect taxa present in chicken manure on a major poultry farm in Central Chile. Samples of hen manure were collected at a poultry farm in the Region of Valparaíso, Chile, from areas adjacent to feeding lines and water reservoirs. Samples were chilled, transported to the laboratory and processed for taxonomic classification of both adult and immature stages of insects. Results indicated a marked colonization of the beetle Alphitobius diaperinus and of the dipterans Fannia sp.,compared to other six families of insects that were also determined. About 94% of the insects found in chicken manure were present in samples from areas adjacent to water reservoirs. Therefore, leaks from water supply devices become a critical point of control of these entomological poultry pests that have been reported to carry a variety of viral, bacterial and eukaryotic parasites.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was partially funded by Vicerrectoría de Estudios Avanzados of the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile. Project: DI-UCV 122.705/2008. J Retamales is the recipient of a CONICYT Doctoral Scholarship. We thank Ms. Paola Arenas for revising the manuscript.

REFERENCES

Achiano K, J Giliomee. 2006. Rearing the house fly predator Carcinops pumilio (Erichson) (Coleoptera: Histeridae) on an artificial diet. Afr J Biotechnol 5, 1161-1166.

Armijo A. 2006. Estudio sobre empresas productoras de pollo. Organización de consumidores y usuarios de Chile, área técnica ODECU, Chile.

Artigas J. 1994. Entomología Económica. Insectos de interés Agrícola, Forestal, Médico y Veterinario. 1a ed. Vol. 2. Ediciones Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Barreto C, S Souto. 2004. Fannia flavicincta (Diptera: Fanniidae): a new vector of Dermatobia hominis (Linnaeus Jr.) (Diptera: Cuterebridae). Rev Bras Zool 21, 115-116.

Bates C, KL Hiett, NJ Stern. 2004. Relationship of Campylobacter isolated from poultry and from darkling beetles in New Zealand. Avian Dis 48, 138-147.

Calibeo-Hayes D, S Denning, M Stringham, D Watson. 2005. Lesser mealworm (Coleoptera: Tenebrionidae) emergence after mechanical incorporation of poultry litter into field soils. J Econ Entomol 98, 229-235.

Cedó R. 2001. Bioseguridad en las granjas. Selecciones avícolas: Jornadas profesionales de producción de carne de pollo, Arenys de Mar, Francia.

Chernaki-Leffer A, S Biesdorf, L Almeida, E Leffer, F Vigne. 2002. Isolamento de enterobactérias em Alphitobius diaperinus e na cama de aviários no oeste do Estado do Paraná, Brasil. Rev Bras Cienc Avic 4, 243-247.

Chu HF. 1949. The Immature Insect. Picture Key Nature Series. University of Illinois, Illinois, USA.

Davies R, C Wray. 1995. Contribution of the lesser mealworm beetle (Alphitobius diaperinus) to carriage of Salmonella enteritidis in poultry. Vet Rec 137, 407-408.

De Las Casas E, PK Harein, DR Deshmukh, BS Pomeroy. 1972. Bacteria and fungi within the lesser mealworm collected from poultry brooder houses. Environ Entomol 1, 27-30.

De Las Casas E, PK Harein, DR Deshmukh, BS Pomeroy. 1976. Relationship between the lesser mealworm, fowl pox and Newcastle disease virus in poultry. J Econ Entomol 69, 775-779.

Dunford J, P Kaufman. 2006. Lesser mealworm, litter beetle, Alphitobius diaperinus (Panzer) (Insecta: Coleoptera: Tenebrionidae). Entomology and Nematology Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, USA.

Eidson CS, SC Schmittle, RB Goode, JB Lal. 1966. Induction of leukosis tumors with the beetle Alphitobius diaperinus. Am J Vet Res 27, 1053-1057.

Elowni EE, S Elbiharis. 1979. Natural and experimental infection of the beetle Alphitobius diaperinus with Choanotaenia infundibulum and other chicken tapeworms. Vet Res Commun 3, 171-173.

Goodwin MA, WD Waltman. 1996. Transmission of Eimeria, viruses, and bacteria to chicks: darkling beetles (Alphitobius diaperinus) as vectors of pathogens. J Appl Poult Res 5, 51-55.

Gray J, C Maddox, P Tobin, J Gummo, C Pitts. 1999. Reservoir compe-tence of Carcinops pumilio for Salmonella enteritidis (Eubacteriales: Enterobacteriaceae). J Med Entomol 36, 888-891.

Kaufman P, D Rutz, C Pitts. 2000. Pest management recommendations for poultry. Cornell and Penn State Cooperative Extension publi-cation, USA.

Kaufman P, M Burgess, D Rutz, C Glenister. 2002. Population dynamics of manure inhabiting arthropods under an integrated pest manage-ment (IPM) Program in New York poultry facilities - 3 case studies. J Appl Poult Res 11, 90-103.

Manrique-Saide P, H Delfín-González. 1997. Importancia de las moscas como vectores potenciales de enfermedades diarreicas en humanos. Rev Biomed 8, 163-170.

McAllister JC, CD Steelman, LA Newberry, JK Skeeles. 1995. Isolation of infectious bursal disease virus from the lesser mealworm, Alphitobius diaperinus (Panzer). Poultry Sci 74, 45-49.

Olsen A, T Hammack. 2000. Isolation of Salmonella spp. from the housefly, Musca domestica L., and the dump fly, Hydrotaea ae-nescens (Wiedemann) (Diptera: Muscidae), at caged-layer houses. J Food Prot 63, 958-960.

Ricaurte S. 2005. Bioseguridad en granjas avícolas. Redvet 6, 1-17.

83

ALPHITOBIuS DIAPERINuS, INSECT VECTORS, POULTRY FARMS

Rivera LE, MR Goyal, M Crespo. 2007. Métodos de medir humedad del suelo. En: Goyal, MR (ed). Manejo de riego por goteo. 2a ed. Recinto Universitario de Mayagüez, Puerto Rico, Pp 27-63.

Roche AJ, NA Cox, LJ Richardson, RJ Buhr, JA Cason, BD Fairchild, NC Hinkle. 2009. Transmission of Salmonella to broilers by con-taminated larval and adult lesser mealworm, Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae). Poult Sci 88, 44-48.

Salin C, YR Delettre, P Vernon. 2003. Controlling the mealworm Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) in broiler and turkey houses: field trials with a combined insecticide treatment: insect growth regulator and pyrethroid. J Econ Entomol 96, 126-130.

Segabinazi S, M Lovato, A Da Silva, G Jacobsen, R Dariva. 2005. Bactérias da família Enterobacteriaceae em Alphitobius diaperinus oriundos de granjas avícolas dos Estados do Rio Grande do sul e Santa Catarina, Brasil. Acta Sci Vet 33, 51-55.

Skov M, A Spencer, B Hald, L Petersen, B Nauerby, B Carstensen, M Madsen. 2004. The role of litter beetles as potential reservoir for Salmonella enterica and thermophilic Campylobacter spp. between broiler flocks. Avian Dis 48, 9-18.

Strother K, D Steelman. 2001. Spatial analysis of Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) in broiler production facilities. Environ Entomol 30, 556-561.

Strother K, D Steelman, E Gbur. 2005. Reservoir competence of lesser mealworm (Coleoptera: Tenebrionidae) for Campylobacter jejuni (Campylobacterales: Campylobacteraceae). J Med Entomol 42, 42-47.

Templeton J, A De Jong, P Blackall, J Miflin. 2006. Survival of Campylobacter spp. in darkling beetles (Alphitobius diaperi-nus) and their larvae in Australia. Appl Environ Microbiol 72, 7909-7911.

Tobin P, S Fleischer, C Pitts. 1999. Spatio-temporal dynamics of resident and immigrating populations of Carcinops pumilio (Coleoptera: Histeridae) in high-rise poultry facilities. J Med Entomol 36, 568-577.

Toro H, E Chiappa, C Tobar. 2003. Biología de Insectos. Ediciones Universitarias, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.

Vittori J, R Schocken-Iturrino, KC Prochnon, C Martins, G Gomes, L Melo De Souza, C Peters. 2007. Alphitobius diaperinus como veiculador de Clostridium perfringens em granjas avícolas do interior paulista - Brasil. Cienc Rural 37, 894-896.

Watson DW, JS Guy, SM Stringham. 2000. Limited transmission of turkey coronavirus in young turkeys by adult Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae). J Med Entomol 37, 480-483.

85

Arch Med Vet 43 85-89 (2011)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 01.09.2010.

# Proyecto Fondecyt 1080291.

* Casilla 2 Correo 15 La Granja, Santiago, Chile; cborie@uchile.cl

Uso de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo Enteritidis: prevención de la colonización intestinal y reproductiva#

Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization

C Boriea*, C Hauvaa, J Quirogaa, V Bravoa, ML Sáncheza, MA Moralesa, P Retamala, J Retamalesb, J Robesonb

aDepartamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

bLaboratorio de Bacteriología, Instituto de Biología, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.

SUMMARY

Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE) remains an important enteropathogen in the poultry industry and public health. Due to the limited effectiveness of control measures, lytic bacteriophages have shown a potential use as biocontrollers of SE in birds. The aim of this study was to determine the effectiveness of prophylactic therapy with phages to control intestinal and reproductive tract colonization of SE in laying hens. 22-week old Hy-Line Brown hens free of Salmonella, were treated with a mixture of three bacteriophages (1011 PFU/dose/phage) and challenged with 2.4 x 108 CFU of SE, 24 hours post phage treatment. On day 10 post challenge, hens were euthanatized, and individual samples of cecum, ovary and oviduct, were analyzed using qualitative and quantitative bacteriology. Eggs laid during the experience were collected and processed to detect SE. The incidence of Salmonella in ceca was similar between positive control and treated groups (96.67%) and cecal bacterial counts did not present significant differences between them (P > 0.05). In reproductive tissues, phagetherapy was able to slightly reduce the SE count in the ovary (P < 0.05), but not in oviducts (P > 0.05). This lytic activity of phages observed in ovaric tissue, encourages further efforts to elucidate the real contribution of bacteriophages as SE biocontrollers in laying hens.

Palabras clave: Salmonella, prevención, bacteriófagos, gallinas de postura, aves.Key words: Salmonella, prevention, bacteriophages, laying hens, poultry.

INTRODUCCIÓN

Las infecciones por Salmonella spp corresponden a una enfermedad transmitida por alimentos, de fuerte impacto en la salud pública. En la Unión Europea, durante el año 2008, la salmonelosis fue la segunda enfermedad zoonótica más frecuente, donde S. enterica serotipo Enteritidis (SE) fue uno de los serotipos más prevalentes (EFSA 2010). Una situación similar se notificó en Estados Unidos de Norteamérica durante el año 2009 (MMWR 2010). En Chile, en el año 2006 se incrementó en un 300% el número de casos confirmados de salmonelosis (2.219 casos) res-pecto al año 2000, correspondiendo en el 50% de los casos al serotipo S. Enteritidis (Figueroa 2007). De la misma forma se observó un aumento en el número de hallazgos de Salmonella spp en mataderos de aves, de 37 en el año 2004 a 74 en el año 2006 (Figueroa 2007).

Entre los alimentos más frecuentemente asociados se encuentran los derivados de la industria avícola, es-pecialmente el consumo de huevos y sus derivados (Gast 2007). En Chile, entre los años 1975 y 1996, un 38,2% de los aislados alimentarios de Salmonella Enteritidis se detectaron en alimentos que contenían huevo (tortas, mayonesa), mientras que sólo un 6,4% de ellos se detectó en alimentos derivados de carne de ave (Prat y col 2001, Figueroa 2007).

Para enfrentar este problema la industria avícola ha implementado varias medidas de control incluyendo vacunas, pre y probióticos, normas de bioseguridad y uso de antimicrobianos, entre otros (Gast 2007). Pese a lo anterior, la enfermedad aún está presente en el ser humano, situación agravada por la emergencia de multirresistencia tanto en las cepas aisladas de casos clínicos como de reservorios animales. Por esta razón, el estudio de bacteriófagos líticos ha concitado el inte-rés en el control de Salmonella gracias a su habilidad para infectar sólo bacterias específicas, manteniéndose inocuos para la microflora intestinal y para células eucariotas. Estos virus o fagos, una vez que reconocen receptores específicos de la superficie bacteriana, inyectan

86

C BORIE Y COL

su genoma, el cual se multiplica generando una nueva progenie viral; el ciclo termina con la lisis bacteriana y la liberación de la progenie viral al ambiente (Joerger 2003, Dabrowska y col 2005). Gracias a esta actividad lítica, ellos han sido exitosamente usados como herra-mienta terapeútica y profiláctica frente a patógenos tales como Listeria monocytogenes (Leverentz y col 2003), Campylobacter spp. (Atterbury y col 2003, Bigwood y col 2008), Escherichia coli (O’Flynn y col 2004) y Salmonella spp (Leverentz y col 2001, Modi y col 2001, Whichard y col 2003, Fiorentin y col 2005a, Higgins y col 2005). En el caso específico de Salmonella spp, la fagoterapia ha disminuido la incidencia y el recuento en intestino, así como también la invasión sistémica en pollos (Fiorentin y col 2005b, Toro y col 2005, Filho y col 2007). La aplicación profiláctica de bacteriófagos ha producido resultados promisorios. Así, utilizando una mezcla de tres fagos (108 Unidades Formadoras de Placas/dosis/fago) en pollos de 6 días de edad pretrata-dos con un probiótico (Broilact®) y luego de tres días, desafiados con SE (2,95 x 105 Unidades Formadoras de Colonias/dosis/ave), la incidencia de infección se redujo en 61,3% y el recuento promedio disminuyó en 0,36 log10 UFC/g en las aves que recibieron probiótico y fagos, valores que demuestran mayor eficiencia que lo obtenido cuando ambas terapias se administraron por separado (Borie y col 2009).

Los estudios han sido realizados en pollos jóvenes y no existen publicaciones sobre el efecto de una fagoterapia en gallinas de postura, cuyos huevos son considerados alimentos de riesgo para la población humana. Este estudio tuvo como objetivo determinar la eficacia de una mezcla de bacteriófagos en la prevención de la colonización de SE en tejido reproductivo (ovario/oviducto) y ciegos de gallinas comerciales de postura.

MATERIALES Y MÉTODOS

AVES

Se trabajó con gallinas comerciales de postura Hy-Line Brown de 22 semanas de edad negativas a Salmonella por cultivo y PCR de deposiciones y por prueba serológica de microaglutinación (Servicio Agrícola y Ganadero, Chile). Las aves fueron criadas y manejadas siguiendo las reco-mendaciones de los Comité de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y recibieron alimento sin antimicro-bianos y agua ad libitum.

CEPA DESAFÍO

Se utilizó una cepa de SE aislada de “pool” de órganos (hígado, bazo y corazón) de una gallina reproductora. Se seleccionó, en el laboratorio, una mutante espontánea resistente a ácido nalidíxico y rifampicina (nalR rifR).

AISLAMIENTO, PROPAGACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

BACTERIÓFAGOS (BP)

Se seleccionaron tres bacteriófagos líticos previamente caracterizados (Santander 2003, Robeson y col 2008). En breve, 1 mL de agua de alcantarillado de un plantel avícola de la V Región (zona central de Chile) fue mezclado con 10 mL de caldo Luria Bertani (LB, Difco) con rifampicina (100 µg/mL, Arlab) y con 0,5 mL de un cultivo en fase exponencial de crecimiento de SE ATCC 13076 (mutante rifampicina resistente), incubando esta mezcla en agitación a 37 ºC por 24 horas. Un mL fue centrifugado a 9.300 g por 5 minutos y el sobrenadante fue tratado con cloroformo y posteriormente sembrado en una placa con desarrollo de SE ATCC 13076 (método de la doble capa de agar). Luego de 24 horas a 37 ºC se purificaron las placas líticas existentes. Se prepararon stocks de bacteriófagos mediante propagación de los fagos purificados en caldo LB con SE ATCC 13076. Este método produjo stocks de fagos con un título > a 1012

UFP. Cada fago fue administrado vía oral forzada (intraeso-fágico), suspendido en agua destilada para alcanzar una multiplicidad de infección (MOI) de 103 UFP.

DISEñO EXPERIMENTAL

Se trabajó con 80 aves de 18 semanas de edad, sepa-radas en cuatro grupos: el grupo 1 constituido por 10 aves que no recibieron terapia ni infección con SE (control negativo), el grupo 2 con 30 aves que recibieron sólo SE (control positivo), el grupo 3 con 10 aves que sólo recibieron bacteriófagos y el grupo 4 con 30 gallinas que fueron tratadas con fagos e infectadas con SE. Los cuatro grupos se mantuvieron en salas experimentales separadas, atendidas por personal exclusivo para evitar contamina-ción entre ellos. A las 22 semanas de edad, las 10 aves del grupo 3 (sólo BP) y las 30 aves del grupo 4 (BP +SE) recibieron por vía oral forzada (intraesofágico) la mezcla de bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) durante tres días consecutivos. Veinticuatro horas más tarde, las 30 aves del grupo 2 (sólo SE) y las 30 aves del grupo 4 fueron desafiadas por vía oral forzada (intraesofágico) con una Dosis Mínima Infectante (DMI) (2,4 x 108 UFC) de SE nalR rifR suspendida en 3 mL de agua peptonada fosfatada (Oxoid). Diez días postdesafío, todos los grupos fueron sometidos a eutanasia con T61 (Shering Ploug Animal Health) (AVMA, 2001), obteniendo muestras individuales de ciegos, ovarios y oviductos para análisis de bacteriología cualitativa y cuantitativa. Adicionalmente, en los grupos 2 y 4 se procesaron todos los huevos puestos durante la experiencia (10 días) para la detección de SE, considerando un pool de 10 huevos.

BACTERIOLOGÍA

Cada muestra de ciego, ovario y oviducto fue pesada y colocada en una bolsa plástica estéril (Whirl Pak, Nasco)

87

SALMONELLA, PREVENCIÓN, BACTERIÓFAGOS, GALLINAS DE POSTURA, AVES

adicionada de caldo Rapapport-Vassiliadis (RV, Difco) en razón 1:10. Una vez trituradas y homogeneizadas (un mL fue separado para bacteriología cuantitativa), las muestras se incubaron a 37 ºC por 72 horas, sembrando cada 24 horas en placas de agar XLD (Difco) adicionado de rifampicina y ácido nalidíxico (20 µg /mL de cada uno) e incubadas a 37 ºC por 24 horas. Las colonias sospechosas se confir-maron con suero anti O-Salmonella poly A-I y Vi (Difco). Las muestras negativas fueron procesadas por PCR para la detección genómica de SE, de acuerdo a metodología implementada y descrita previamente (Borie y col 2008). Los huevos se procesaron como “pool”, con un máximo de 10 unidades/”pool”/grupo.

Se consideró un animal positivo cuando se detectó SE al menos en una de sus tres muestras (ciegos, ovario, oviducto).

Para la bacteriología cuantitativa, un mL de las muestras suspendidas en caldo RV sin incubar fueron diluidas al décimo en agua peptonada fosfatada (Oxoid), sembrando en superficie 100 µL sobre agar XLD adicionado de ácido nalidíxico y rifampicina. Las placas se incubaron a 37 ºC por 24 horas, procediendo a contar las unidades formadoras de colonias (UFC).

ANáLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados de la bacteriología cualitativa fueron expresados como porcentaje de aves infectadas (aves positi-vas a SE) y las diferencias entre los grupos experimentales (2 y 4) fueron determinadas por Chi cuadrado (INFOSTAT 2004). Los recuentos (UFC) de SE en ciegos y tejidos reproductivos (ovarios/oviductos) fueron transformados a unidades logarítmicas (UFC log10) y sometidos a análisis de varianza (ANOVA); las diferencias entre las medias se evaluaron por Test de Tukey (INFOSTAT 2004). Toda muestra que fue positiva en la bacteriología cualitativa pero negativa en la cuantitativa, se le asignó valor 1; por otro lado, toda muestra negativa por bacteriología cualitativa y cuantitativa se le asignó valor 0. Un valor de P < a 0,05 fue considerado con significancia estadística.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis de la bacteriología cualitativa demostró que la proporción de infección cecal y de tejidos reproductivos no fue diferente (P > 0,05) entre el grupo control positivo y el grupo que recibió la mezcla de fagos (cuadro 1). En todas las muestras cecales donde se aisló SE también se detectaron fagos, a diferencia de lo observado en ovarios y oviductos, donde escasamente se aislaron bacteriófagos (datos no mostrados). En ambos grupos experimentales (grupos 2 y 4) no se detectó SE en los huevos frescos puestos durante toda la experiencia (10 días). Todas las muestras de ciegos, ovarios, oviductos y huevos que fueron negativas por bacteriología cualitativa también lo fueron por PCR (datos nos mostrados).

Los promedios de recuentos de SE en ciegos y tejidos reproductivos se observan en la figura 1. En compara-ción con el grupo control positivo, las aves tratadas con bacteriófagos presentaron una leve disminución de los recuentos, diferencia que fue significativa sólo en ovarios (P < 0,05).

No se observaron cambios de conducta ni manifes-taciones clínicas sugerentes de enfermedad digestiva en los grupos experimentales, así como tampoco lesiones macroscópicas en la necropsia.

Bajo el presente diseño experimental la mezcla de bacteriófagos no disminuyó la colonización cecal de SE en las gallinas de postura, situación similar a lo observado por Sklar y Joerger 2001 en pollos tratados con diferen-tes concentraciones de bacteriófagos y por Higgins y col 2007 en pavos tratados con bacteriófagos asociados a un antiácido. La baja eficiencia de los fagos en gallinas de postura, comparada con los buenos resultados obtenidos previamente en pollos, podría ser explicada por el bajo pH del tracto digestivo en gallinas adultas comparadas con pollos y mamíferos (Rosales 2005, Ghise 2009). Se ha demostrado que el pH ácido reduce la actividad lítica de algunos fagos (Leverentz y col 2001, Dabrowska y col 2005), efecto que puede ser revertido por la adición de antiácidos (Smith 1987, Koo y col 2001, Higgins y col 2007). Los fagos utilizados en el presente estudio mantienen un título estable entre pH 3 y 11 (Santander 2003), por lo que no se consideró usar antiácidos. Otros factores adicionales que pudieran incidir en los resul-tados serían: i) Viscosidad y flora bacteriana normal que actuarían como barrera mecánica, disminuyendo la probabilidad de contacto entre bacterias y fagos (Joerger 2003). ii) motilidad intestinal que disminuiría el tiempo de contacto efectivo entre bacterias y fagos (Fiorentin y col 2005b, Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007). En este estudio los fagos se administraron 72, 48 y 24 horas antes del desafío con SE, por lo que es factible que los títulos de fagos disminuyeran antes de encontrarse con la bacteria blanco. Para evitarlo, se utilizaron elevadas dosis

Cuadro 1. Aislamiento de Salmonella Enteritidis desde ciegos, ovarios y oviductos de gallinas de postura experimentalmente infectadas y pretratadas con una mezcla de bacteriófagos. Isolation of Salmonella Enteritidis from cecum, ovaries and oviducts of experimentally infected laying hens pre-treated with a mixture of bacteriophages.

Grupo Nº aves

Tejidos positivos a SE (%)

Ciegos Ovarios Oviductos

Control (SE) 30 29 (96,67) 13 (43,3) 7 (23,3)

Tratado (BP + SE) 30 29 (96,67) 9 (30,0) 3 (10,0)

SE: Salmonella Enteritidis, BP: bacteriófago.

88

C BORIE Y COL

de fagos (1011 UFP/día) en relación a la concentración de bacterias inoculadas. iii) Resistencia bacteriana a los fagos (Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007), situación que se reduce utilizando dos o más bacteriófagos (Sklar y Joerger 2001, Fiorentin y col 2005a, Toro y col 2005), como es el caso del presente estudio.

La DMI utilizada para infectar las gallinas fue similar a la señalada por otros autores para gallinas adultas (Keller y col 1995, Kinde y col 2000, Gast y col 2004a, Gast y col 2004b). Esta dosis logró una elevada tasa de colonización en ciegos (> 95%) pero escasa en ovarios y oviductos (43,3% y 23,3%, respectivamente), esto último probablemente debido a la baja invasividad de la cepa. El escaso aislamiento de SE obtenido en tejidos reproductivos contrasta con lo observado por otros investigadores, donde los porcentajes de aislamiento van de 50-70% para ovarios y 37-60% para oviductos (Gast y Beard 1990, Gast y col 2004a). La invasividad de esta cepa podría mejorarse mediante pasajes en tejidos reproductivos de gallinas (Gast y col 2003).

Finalmente, se puede concluir que bajo el presente diseño experimental la administración preventiva de bacteriófagos en gallinas de postura infectadas con SE es menos efectiva que lo descrito previamente en pollos y que, por lo tanto, mayores estudios son necesarios para definir su potencial para disminuir el riesgo en salud pública. El modelo experimental debe ser reevaluado en cuanto a la concentración de bacteriófagos (aumento de la MOI) y a la invasividad de la cepa desafío.

RESUMEN

Salmonella enterica serotipo Enteritidis (SE) continúa siendo un importante enteropatógeno para la industria avícola y para la Salud Pública. Debido a la limitada efectividad de las medidas de control, los bacteriófagos líticos han mostrado un uso potencial como biocontroladores de SE en aves. El propósito de este estudio fue determinar la efectividad de una terapia profiláctica con fagos para el control de la colonización de SE en el tracto intestinal y reproductivo de gallinas de postura. Gallinas Hy-Line Brown, de 22 semanas de edad, libres de Salmonella, fueron tratadas con una mezcla de tres bacteriófagos (1011 UFP/dosis/fago) y desafiadas con 2,4 x 108 UFC de SE, veinticuatro horas postratamiento. Al día 10 postdesafío, las gallinas se sometieron a eutanasia, obteniéndose muestras individuales de ciegos, ovario y oviducto, las cuales fueron analizadas por bacteriología cualitativa y cuantitativa. Se recolectaron los huevos puestos durante la experiencia y se procesaron para detectar SE. La proporción de Salmonella Enteritidis en los ciegos fue similar entre los grupos control positivo y tratado (96,67%) y el recuento bacteriano cecal tampoco presentó diferencias significativas (P > 0,05). En los tejidos reproductivos, la administración de fagos no disminuyó la incidencia de infección (P > 0,05), pero fue capaz de reducir levemente los recuentos de SE en ovario (P < 0,05), aunque no en oviducto (P > 0,05). La actividad lítica de los fagos demostrada en tejido ovárico, aunque escasa, sugiere realizar mayores esfuerzos para dilucidar la real contribución de los bacteriófagos como biocontroladores de SE en gallinas de postura.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por el proyecto Fondecyt Nº 1080291.

Figura 1. Recuento promedio de Salmonella Enteritidis (SE) desde tejidos de gallinas infectadas y pretratadas con bacteriófagos (BF) (*P < 0,05). Average of Salmonella Enteritidis (SE) counts from tissues of chickens experimentally infected and pre-treated with bacteriophages (BF) (*P < 0.05).

89

SALMONELLA, PREVENCIÓN, BACTERIÓFAGOS, GALLINAS DE POSTURA, AVES

REFERENCIAS

Atterbury RJ, PL Connerton, C Dodd, CE Rees, IF Connerton. 2003. Application of host-specific bacteriophages to the surface of chicken skin leads to a reduction in recovery of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol 69, 6302-6306.

Atterbury RJ, MA Van Bergen, F Ortiz, MA Lovell, JA Harris, A De Boer, JA Wagenaar, VM Allen, PA Barrow. 2007. Bacteriophage therapy to reduce salmonella colonization of broiler chickens. Appl Environ Microbiol 73, 4543-4549.

AVMA, American Veterinary Medical Association. 2001. Report of the AVMA Panel on Euthanasia. J Am Vet Med Assoc 218, 669-696.

Bigwood T, JA Hudson, C Billington, GV Carey-Smith, JA Heinemann. 2008. Phage inactivation of foodborne pathogens on cooked and raw meat. Food Microbiol 25, 400-406.

Borie C, I Albala, P Sánchez, ML Sánchez, S Ramírez, C Navarro, MA Morales, AJ Retamales, J Robeson. 2008. Bacteriophage treatment reduces Salmonella colonization of infected chickens. Avian Dis 52, 64-67.

Borie C, ML Sánchez, C Navarro, S Ramírez, MA Morales, J Retamales, J Robeson. 2009. Aerosol spray treatment with bacteriophages and competitive exclusion reduces Salmonella Enteritidis infection in chickens. Avian Dis 53, 250-254.

Dabrowska K, K Switala-Jelen, A Opolski, B Weber-Dabrowska, A Gorski. 2005. Bacteriophage penetration in vertebrates. J App Microbiol 98, 7-13.

EFSA, European Food Safety Authority. 2010. Community Summary Report and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and food-borne outbreaks in the European union in 2008. EFSA, Parma, Italy.

Estrada M, S Márquez. 2005. Interacción de los factores ambientales con la respuesta del comportamiento productivo en pollos de engorde. Rev Col Cs Pec 18, 246-257.

Figueroa J. 2007. Descripción y análisis de las acciones realizadas por los servicios públicos (salud animal y salud pública), frente a salmonelosis humana. Memoria de título, Escuela de Ciencias Veterinarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Filho R, J Higgins, S Higgins, G Gaona, A Wolfenden, G Téllez, B Hargis. 2007. Ability of bacteriophages isolated from different sources to reduce Salmonella enterica serovar Enteritidis in vitro and in vivo. Poultry Sci 86, 1904-1909.

Fiorentin L, ND Vieira, W Barioni. 2005a. Use of lytic bacteriophages to reduce Salmonella Enteritidis in experimentally contaminated chicken cuts. Braz J Poul Sci 7, 255-260.

Fiorentin L, ND Vieira, WJr Barioni. 2005b. Oral treatment with bacte-riophages reduces the concentration of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contents of broilers. Avian Pathol 34, 258-263.

Gast RK, CW Beard. 1990. Isolation of Salmonella enteritidis from internal organs of experimentally infected hens. Avian Dis 34, 991-993.

Gast RK, J Guard-Petter, PS Holt. 2003. Effect of prior serial in vivo passage on the frequency of Salmonella enteritidis contamination in eggs from experimentally infected laying hens. Avian Dis 47, 633-639.

Gast RK, J Guard-Bouldin, PS Holt. 2004a. Colonization of reproduc-tive organs and internal contamination of eggs after experimental infection of laying hens with Salmonella heidelberg and Salmonella enteritidis. Avian Dis 48, 863-869.

Gast RK, BW Mitchell, PS Holt. 2004b. Evaluation of culture media for detecting airborne Salmonella Enteritidis collected with an elec-trostatic sampling device from the environment of experimentally infected laying hens. Poultry Sci 83, 1106-1111.

Gast RK. 2007. Serotype-specific and serotype-independent strategies for preharvest control of food-borne Salmonella in poultry. Avian Dis 51, 817-828.

Ghise A. 2009. The pH of the Digesta in the Gastrointestinal Tract, in Laying Hens. Bull uASVM, Vet Med 66, 491-492.

Higgins JP, SE Higgins, KL Guenther, W Huff, AM Donoghue, DJ Donoghue, BM Hargis. 2005. Use of a specific bacteriophage

treatment to reduce Salmonella in poultry products. Poult Sci 84, 1141-1145.

Higgins S, J Higgins, L Bielke, BM Hargis. 2007. Selection and applica-tion of bacteriophages for treating Salmonella enteritidis infections in poultry. Int J Poult Sci 6, 163-168.

Joerger RD. 2003. Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages. Poultry Sci 82, 640-647.

Keller L, C Benson, K Krotec, R Eckroade. 1995. Salmonella Enteritidis colonization of the reproductive tract and forming and freshly laid eggs of chickens. Infect Immun 63, 2443-2449.

Kinde H, HL Shivaprasad, BM Daft, DH Read, A Ardans, R Breitmeyer, G Rajashekara, KV Nagaraja, IA Gardner. 2000. Pathologic and bacteriologic findings in 27-week-old commercial laying hens experimentally infected with Salmonella enteritidis, phage type 4. Avian Dis 44, 239-248.

Koo J, DL Marshall, A DePaola. 2001. Antacid increases survival of Vibrio vulnificus and Vibrio vulnificus phage in a gastrointestinal model. Appl Environ Microbiol 67, 2895-2902.

Leverentz B, WS Conway, Z Alavidze, WJ Janisiewicz, Y Fuchs, MJ Camp, E Chighladze, A Sulakvelidze. 2001. Examination of bacteriophage as a biocontrol method for Salmonella on fresh-cut fruit: a model study. J Food Protec 64, 1116-1121.

Leverentz B, WS Conway, MJ Camp, WJ Janisiewicz, T Abuladze, M Yang, R Saftner, A Sulakvelidze. 2003. Biocontrol of Listeria monocytogenes on fresh-cut produce by treatment with lytic bacteriophages and a bacteriocin. Appl Environ Microbiol 69, 4519-4526.

MMWR, Morbidity and Mortality Weekly Report. 2010. Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food-10 states, 2009. M M W R 59, 418-422.

Modi R, Y Hirvi, A Hill, MW Griffiths. 2001. Effect of phage on survival of Salmonella enteritidis during manufacture and storage of cheddar cheese made from raw and pasteurized milk. J Food Protec 64, 927-933.

O’Flynn G, RP Ross, GF Fitzgerald, A Coffey. 2004. Evaluation of a cocktail of three bacteriophages for biocontrol of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol 70, 3417-3424.

Prat S, A Fernández, A Fica, J Fernández, M Alexandre, I Heitmann. 2001. Tipificación fágica de aislados de Salmonella enteritidis de muestras clínicas, alimentarias y avícolas en Chile. Rev Panam Salud Pública 9, 7-12.

Robeson J, J Retamales, C Borie. 2008. Genomic variants of bacteriopha-ges against Salmonella enterica serovar Enteritidis with potential application in the poultry industry. Braz J Poult Sci 10, 173-178.

Rosales R. 2005. Broilact® hace la diferencia. En: Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A. (eds) una alternativa inteligente: exclusión competitiva. Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A, Guadalajara, México.

Santander J. 2003. Aislamiento y caracterización de bacteriófagos bio-controladores de Salmonella enteritidis y su ensayo sobre Salmonella pullorum: evaluación in vivo utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans como sistema animal modelo. Tesis de Magíster, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.

Sklar I, R Joerger. 2001. Attempts to utilize bacteriophage to combat Salmonella enterica serovar Enteritidis infections in chickens. J Food Safe 2, 15-29.

Smith H, M Huggins, K Shaw. 1987. Factors influencing the survival and multiplication of bacteriophage in calves and in their enviromental. J Gen Microbiol 133, 1127-1135.

Toro H, SB Price, AS McKee, FJ Hoerr, J Krehling, M Perdue, L Bauermeister. 2005. Use of bacteriophages in combination with competitive exclusion to reduce Salmonella from infected chickens. Avian Dis 49, 118-124.

Whichard JM, N Sriranganathan, FW Pierson. 2003. Suppression of Salmonella growth by wild-type and large-plaque variants of bac-teriophage Felix O1 in liquid culture and on chicken frankfurters. J Food Protec 66, 220-225.

91

Arch Med Vet 43 91-94 (2011)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 01.09.2010.

* Rua Rui Barbosa 502-casa 05, Jardim Filadélfia, CEP: 77813-205, Araguaína, Tocantins, Brasil; andrigobarboza@yahoo.com.br

Carcinoma folicular de tiroides en perros. Reporte de casos

Follicular thyroid carcinoma in dogs. Report of cases

AB de Nardiab*, CR Daleckc, MCV Silvac, JC Canolac, LGGG Diasc, SG Calazansc, SC Fernandesc, D Euridesd, LAF Silvae, RR Huppesa

aUniversidad de Franca, San Pablo, Brasil.bUniversidad Federal de lo Tocantins, Tocantins, Brasil.

cUniversidad Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, San Pablo, Brasil.dUniversidad Federal de Uberlândia, Minas Gerais, Brasil.

eUniversidad Federal de Goiás, Goiás, Brasil.

SUMMARY

The aim of this study was to report the occurrence of two cases of thyroid neoplasm in dogs. The treatment of choice for these cases was surgical removal. In both cases the diagnostic was infiltrative follicular carcinoma of thyroid. The first animal did not present a good recovery after the surgery, and died four hours after the procedure. In the second case, the diagnosis was more precocious and antineoplastic chemotherapy was used after the surgery. At the time of submission of this manuscript, this animal had survived for fourty months. Currently, there is a need to define the protocols of chemotherapy to avoid relapse and metastases, in order to increase the life expectancy in dogs with thyroid neoplasm.

Palabras clave: neoplasia, tiroides, carcinoma folicular, perro.Key words: neoplasia, thyroid, follicular carcinoma, dog.

INTRODUCCIÓN

Las neoplasias de la tiroides son poco frecuentes en perros y corresponden entre 1,2% y 4% de todos los tu-mores caninos (Page 2001, De Nardi y col 2002), siendo las neoplasias malignas las más comunes y representan de 63% a 88% de todos los tumores tiroideos (Bezzola 2002, Silva y col 2005).

Según Grubor y Haynes (2005), los tumores malignos de la tiroides pueden ser originados de las células foli-culares (tipo compacto, papilar o mixto) o de las células parafoliculares (medulares o de células C) que son raros en perros. Las neoplasias de tiroides son más comunes en perros de razas medianas y grandes (Bezzola 2002). La edad media del diagnóstico es entre nueve y diez años (Page 2001, Morris y Dobson 2002).

En las neoplasias malignas de tiroides es frecuente la invasión del tumor en el interior de la laringe, tráquea, esófago, músculos, vasos y nervios cervicales (Lurye y Behrend 2001). Las metástasis están presentes en un gran

número de casos, principalmente en los linfonódulos sa-télites, pulmones, hígado y vértebras cervicales (Lurye y Behrend 2001, Page 2001). Las radiografías torácicas son importantes en el preoperativo para identificar metástasis pulmonares o la presencia de tumores en el tejido tiroideo ectópico (De Nardi y col 2009).

La escisión quirúrgica de las neoplasias de tiroides es el tratamiento de elección (De Nardi y col 2009). De acuerdo con Fossum (2001), la remoción quirúrgica de los carcinomas es difícil, debido a la naturaleza invasiva e irrigación acentuada, pero debe ser considerada cuando las metástasis aún no se presentan.

En los tumores malignos de tiroides está siempre indicada la quimioterapia adyuvante con el objetivo de evitar recidivas y promover la destrucción de las micrometástasis, aumentando así supervivencia de los pacientes (Rodaski y De Nardi 2004). Según Page (2001) y Morris y Dobson (2002) la media de supervivencia a tumores invasivos después de la resección quirúrgica es de siete a ocho meses. El presente trabajo tiene como objetivo relatar la ocurrencia de dos casos de neoplasia de tiroides en perros, teniendo en cuenta la presenta-ción clínica, diagnóstico y las formas de tratamiento empleadas.

92

AB DE NARDI Y COL

MATERIALES Y MÉTODOS

Dos caninos con aumento de volumen en la región cervical ventral fueron examinados en el Servicio de Oncología del Hospital Veterinario “Governador Laudo Natel” de la Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias - UNESP / Jaboticabal, San Pablo, Brasil. El primer caso era un macho de 12 años, de raza Cocker Spaniel, de 19 kg presentando una masa de 14 cm de diámetro con poca movilidad. El segundo caso era una hembra de 12 años, de raza Poodle, de 6 kg, presentando una masa de 3,5 cm de largo y 2,5 cm de diámetro no adherida a los tejidos vecinos.

Como procedimiento de rutina durante la evaluación clínica de los pacientes con sospecha de neoplasia de tiroides se procedió a la realización de la anamnesis, examen físico (evaluación del tamaño del tumor), de laboratorio (hemograma, alanino aminotransferasa, creatinina y urinalisis), examen radiográfico de la cabeza, cuello y del tórax en las proyecciones ventrodorsal, late-rolateral, derecha e izquierda, con el objetivo de evaluar el compromiso de estructuras adyacentes e investigar la presencia de metástasis.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A través del análisis de la historia clínica de estos pa-cientes no fue posible correlacionar ninguna etiología con el desarrollo de estas neoplasias (Page 2001). Relacionando la incidencia de las neoplasias de tiroides con la edad de los animales atendidos, se nota mayor predisposición al desarrollo neoplásico en animales viejos (Lurye y Behrend 2001, Bezzola 2002). Los signos clínicos encon-trados en estos animales fueron alteraciones respiratorias y disfagia provocadas por la compresión ocasionada por la neoplasia sobre la tráquea y/o esófago, respectivamente (figura 1A y 1B).

En ninguno de los casos los pacientes presentaban signos clínicos de hiper o hipotiroidismo. El hipotiroi-dismo puede ser una consecuencia de la destrucción del tejido tiroideo provocada por el desarrollo de la neoplasia (Morris y Dobson 2002). Generalmente estos tumores no son funcionales, pues solamente 10% de los casos son hiperfuncionales y los animales pueden presentar signos de hipertiroidismo (Page 2001). A través de la evaluación radiográfica no fue posible identificar alteraciones neoplá-sicas en el tejido tiroideo ectópico que es principalmente encontrado en la región cervical, el cual también puede estar localizado en mediastino craneal y en la porción torácica de la aorta caudal (De Nardi y col 2009).

El prediagnóstico de carcinoma tiroideo fue obteni-do por citología por aspiración con aguja fina (CAAF) y el diagnóstico definitivo a través de la evaluación histopatológica. Siguiendo lo recomendado por Lurye y Behrend (2001) y De Nardi y col (2002), cuando los linfonódulos satélites estaban aumentados se procedió

a CAAF, con el fin de evaluar la presencia de células neoplásicas en estas estructuras.

La citología por aspiración con aguja fina permitió además la realización del diagnóstico diferencial en relación a la presencia de otras afecciones, como abscesos, sialode-nopatías, linfoma, tumor de la carótida y hemangiosarcoma (Morris y Dobson 2002). Contrariamente a lo descrito por Fossum (2001), la CAAF no resultó en hemorragias significativas y aspirados de mala calidad. Los animales de este estudio, en el momento del diagnóstico de la neoplasia, presentaban elevación de las enzimas hepáticas conforme lo descrito por Morris y Dobson (2002).

De acuerdo con Fineman y col (1998), Bezzola (2002) y Grubor y Haynes (2005) el tratamiento de los carci-nomas de tiroides fue seleccionado teniendo en cuenta el tamaño del tumor, el grado de invasión, la presencia de síntomas sistémicos y las modalidades terapéuticas disponibles. El tratamiento elegido para los dos casos fue la exéresis quirúrgica. La remoción quirúrgica del

Figura 1. A) Imagen radiográfica de la región cervical de un canino de la raza Cocker Spaniel revelando aumento de opacidad de tejidos blandos, con reducción del área de la oro y nasofa-ringe. B) Neoplasia de tiroides de aproximadamente 14 cm de diámetro, localizada en la región ventral izquierda del cuello. C) Imagen radiográfica de la región cervical de una perra de la raza Poodle indicando metástasis de carcinoma folicular de tiroides en linfonódulo cervical caudal profundo, provocando colapso de tráquea. D) Imagen del transoperatorio revelando la presencia de carcinoma folicular de tiroides (Flecha grande). La flecha pequeña indica la presencia de metástasis en linfonódulo cervical caudal profundo. A) X ray image of the cervical region of a Cocker Spaniel revealing increase of the soft tissues opacity, with reduction of the oral and nasopharynx area. B) Thyroid neoplasia of approximately 14 cm diameter located in the left ventral region of theneck. C) X ray image of the cervical region of a poodle bitch showing folicular thyroid carcinoma metastasis in the deep flow cervical lymphonode, provoking trachea collapse. D) Transoperative image revealing the presence of a thyroid folicular carcinoma (big arrow).The small arrow shows the presence of metastasis in the deep flow cervical lymphonode.

93

NEOPLASIA, TIROIDES, CARCINOMA FOLICULAR, PERRO

carcinoma de tiroides en el primer paciente, el cual no presentaba metástasis en las evaluaciones preoperatorias, fue difícil debido a la naturaleza invasiva y vascularidad acentuada de este tumor como es relatado por De Nardi y col (2009) y Fossum (2001). En este paciente, sin embargo, estructuras, como vena yugular, arteria carótida, nervio vago y linfonódulo retrofaríngeo estaban comprometi-dos dificultando la obtención de márgenes de seguridad adecuados (Brearley 2000, Worth y col 2005). En el segundo caso conjuntamente con el tumor primario fue realizada la exéresis de dos linfonódulos satélites (Lurye y Berrend 2001, De Nardi y col 2002), pues el linfonó-dulo cervical caudal profundo estaba comprometido por metástasis (figuras 1C y 1D).

El examen histopatológico del primer caso reveló la presencia de células redondas gigantes, con citoplasma escaso y núcleo evidente con alto índice mitótico, frecuentes mitosis atípicas e infiltración angiolinfática intratumoral; además había focos de necrosis y calcificación.

En el segundo caso se observó material representativo de neoplasia constituido por células redondas pequeñas, con escaso citoplasma y núcleo hipercromático dispuestos en acinos, constituyendo puentes celulares. Coexistían áreas de hemorragia y calcificación, con frecuentes figuras de mitosis. En ambos casos la conclusión fue de carcinoma folicular infiltrativo de tiroides.

La quimioterapia debe considerarse para todos los carcinomas de tiroides independientemente del éxito quirúrgico (De Nardi y col 2009). Este tratamiento debe hacerse como una herramienta terapéutica para prevenir la repetición y fomentar la destrucción de micrometástasis (De Nardi y col 2009). La quimioterapia antineoplásica utilizando doxorrubicina es más eficaz para el tratamiento de carcinoma tiroideo en perros, pero la respuesta puede variar de animal a animal (De Nardi y col 2009).

En los dos casos fue empleada la quimioterapia an-tineoplásica. En el primer paciente, el tratamiento tuvo como objetivo promover la citorreducción tumoral antes del procedimiento quirúrgico (Silva y col 2005), pues el tumor se encontraba adherido y afectaba estructuras importantes. Se administra, inicialmente, quimioterapia citotóxica utilizándose lomustina11 (90 mg/m2, por vía oral, cada 21 días, en un total de dos sesiones), vincristina2 (0,5 mg/m², por vía intravenosa, cada 7 días, en un total de cuatro sesiones) y prednisona3 (1 mg/kg, por vía oral, diariamente, por cuatro semanas) (De Nardi y col 2006). Sin embargo, no se observó ninguna regresión neoplásica con el tratamiento quimioterapéutico. Según Page (2001) y Grubor y Hayner (2005), pacientes con tumores exten-sos, metastáticos y con elevado índice mitótico tienen pronóstico reservado, generalmente con pocos meses de supervivencia.

1 Citostal (Bristol-Myers Squibb - São Paulo - SP - Brasil).2 Vincristex (Cristália - Itapira - SP - Brasil).3 Meticorten (Schering-Plough - Rio de Janeiro - RJ - Brasil).

En el segundo caso la quimioterapia fue empleada como terapia adyuvante en el posoperatorio. El protocolo utilizado fue la asociación de doxorrubicina4 (30 mg/m², por vía intravenosa, cada 21 días, en un total de cuatro sesiones) y ciclofosfamida5 (250 mg/m², por vía oral, cada 21 días, en un total de cuatro sesiones).

De acuerdo con la clasificación TNM de las neopla-sias de tiroides en perros propuesta por Morris y Dobson (2002), el primer paciente presentaba estado 3 de evolución neoplásica (T3b, N0, M0), mientras que el segundo paciente presentaba estado 2 (T2b, N1a, M0). El pronóstico de los animales de este estudio presentó estrecha correlación con el estadio clínico de la neoplasia. El primer animal no presentó buena recuperación posquirúrgica y falleció cuatro horas después de terminada la cirugía. En el segundo caso, el animal se encuentra hasta el momento con una sobrevida de cuarenta meses, probablemente debido a que el paciente tuvo un diagnóstico precoz y además recibió quimioterapia postquirúrgica.

Conforme a lo descrito por Brearley (2000), el pronóstico de perros con carcinoma de tiroides puede ser mejorado con el empleo de la radioterapia, pues esta forma de tra-tamiento confiere buenos resultados cuando es empleada como terapia adyuvante después de la resección quirúrgica. Otra terapia que puede ser utilizada es iodo radioactivo (I¹³¹). Este tipo de tratamiento destruye selectivamente el tejido tiroideo neoplásico, por lo tanto, preserva el tejido tiroideo normal y las glándulas paratiroides. Este está indicado como terapia adyuvante después de la remoción quirúrgica del tumor y puede ser empleado en perros con neoplasias de tiroides (Worth 2005).

Los estudios epidemiológicos de todos los tipos de cáncer que afectan a los perros y a los gatos son de suma importancia, pues de esta forma se conoce mejor la in-cidencia de estas afecciones, mejorando el tratamiento y pronóstico de los casos futuros. Además de esto, hay necesidad de definir protocolos quimioterapéuticos más eficaces para combatir las recidivas y metástasis, aumen-tando la expectativa de vida de estos pacientes.

RESUMEN

El presente trabajo tiene como objetivo relatar la ocurrencia de dos casos de neoplasia de tiroides en perros. El tratamiento de elección para estos casos fue exéresis quirúrgica. En ambos casos el diagnóstico fue carcinoma folicular infiltrativo de tiroides. El primer animal no presentó buena recuperación posquirúrgica, y murió cuatro horas después del término de la cirugía. En el segundo caso el diagnóstico fue más precoz y después de la cirugía se asoció el uso de la quimioterapia antineoplásica. Hasta el momento, este animal presenta cuarenta meses de supervivencia. Actualmente, existe la necesidad de definir protocolos quimioterapéuticos más eficaces para evitar la ocurrencia de recidivas y metástasis, aumentando la expectativa de vida de los perros con neoplasia tiroidea.

4 Doxolem (Zodiac - Pindamonhangaba - SP - Brasil).5 Ciclofosfamida (Neovita - Rio de Janeiro - RJ - Brasil).

94

AB DE NARDI Y COL

REFERENCIAS

Bezzola P. 2002 Thyroid carcinoma and hyperthyroidism in a dog. Can Vet J 43, 125-126.

Brearley MJ. 2000. Radiation therapy for unresectable thyroid carcinomas. J Am Vet Med Assoc 217, 466-467.

De Nardi AB, S Rodaski. 2002. Prevalência de neoplasias e modalida-des de tratamentos em cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná. Arch Vet Sci 7, 15-26.

De Nardi AB, FM Ferreira, JPE Pascon, AM De Brun, AS Lima. 2009. Neoplasias do Sistema Endócrino. En: Daleck CR, De Nardi AB, Rodaski S (eds). Oncologia em cães e gatos. Roca, São Paulo, Brasil, Pp 438-444.

Fineman LS, TA Hamilton, A De Gortari, P Bonney. 1998. Cisplatin chemotherapy for treatment of thyroid carcinoma in dogs: 13 cases. J Am Vet Med Assoc 34, 109-112.

Fossum TW. 2001. Cirurgia do sistema endócrino. En: Fossum TW y col (eds). Cirurgia de Pequenos Animais. Roca, São Paulo, Brasil, Pp 476-490.

Grubor B, JS Haynes. 2005. Thyroid carcinosarcoma in a dog. Vet Pathol 42, 84-87.

Lurye JC, EN Behrend. 2001. Endocrine tumors. Vet Clin North Am Small Anim Pract 31, 1083-1110.

Morris J, J Dobson, 2002. Sistema endocrino. En: Morris J, Dobson J (eds). Oncologia en Pequeños Animales. Inter-Médica, Buenos Aires, Argentina, Pp 183-190.

Page RL. 2001. Tumors of the endrocrine system. In: Withrow SJ, MacEwen EG (eds). Small Animal Clinical Oncology. 3rd ed. W B Saunders, Philadelphia, USA, Pp 423-433.

Rodaski S, De Nardi AB. 2004. Quimioterapia Antineoplásica em Cães e Gatos. 3a ed. Editora Maio, Curitiba, Brasil, Pp 307.

Silva MCV, CR Daleck, SG Calazanz, AB De Nardi, SC Fernandes, JC Canola, AE Santana, MLA Mistieri. 2005. Carcinoma folicular infiltrativo da tireóide e paratireóide em cão. Rev univ Rural Ser Cienc Vida 25, 297-298.

Worth AJ, RM Zuber, M Hocking. 2005. Radioiodide (131I) therapy for the treatment of canine thyroid carcinoma. Aust Vet J 83, 208-214.

95

Arch Med Vet 43 95-98 (2011)

COMUNICACIÓN

Evaluación del método del tubo para concentrar plaquetas caninas: estudio celular

Evaluation of the tube method for concentrating canine platelets: cellular study

RF Silvaa, b*, CMF Rezendeb, FO Paes-Lemeb, JU Carmonaa

aGrupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia.

bEscola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

SUMMARY

The aim of this study was to evaluate a manual method for concentrating canine platelets and consequently produce autologous platelet concentrates (APCs) for clinical and experimental proposals. The APCs were obtained by venous blood collection in tubes with ACD solution and were spun at 191 g for 6 minutes. The cell counts of whole blood and APCs, were statistically different (P < 0.01) between the values for platelets, leukocytes, granulocytes, monocytes, but not for lymphocytes. A strong negative correlation (ρ = -0.702 P = 0.011) between the number of lymphocytes and platelets in the APCs was found. The collection efficiency of platelets was 29.9% and the concentration of platelets was 49.4% higher in APCs when compared to the whole blood samples. The results indicated that this simple centrifugation method allows concentrating canine platelets.

Palabras clave: perro, plasma rico en plaquetas autólogo, medicina regenerativa, método del tubo.Key words: dog, autologous platelet rich plasma, regenerative medicine, tube method.

INTRODUCCIÓN

Los concentrados autólogos de plaquetas (APCs) son fuente de diversos factores de crecimiento (GFs), entre los que se destacan el GF transformante beta I (TGF-β1), GF insulínico tipo I (IGF-I), GF derivado de las plaquetas (PDGF) y otras moléculas que modulan la inflamación y la reparación tisular (Anitua y col 2004, Argüelles y col 2006). Los APCs han sido ampliamente usados en medicina humana en procedimientos tales como la reconstrucción alveolo-maxilar (Thor y col 2007), y su uso se ha extendido a la cirugía plástica, cirugía ortopédica, medicina deportiva (tratamiento de lesiones tendinosas en atletas), tratamiento de úlceras gástricas, úlceras cutáneas crónicas y úlceras corneales (Anitua y col 2007). En medicina veterinaria se ha reportado la utilización clínica de APCs en equinos para tratar afecciones locomotoras crónicas (Carmona y col 2009a, b) y heridas de las extremidades (Monteiro y col 2009), entre otras.

A pesar del uso creciente de APCs en medicina equina (Carmona y Prades 2009), existen escasos reportes sobre el uso clínico de APCs en caninos. Aunque esta especie ha sido ampliamente usada como modelo experimental para evaluar el efecto de esta sustancia como coadyuvante (único o combinado con biomateriales) en la regeneración ósea

maxilar (Moreno y col 2004, Bonomi y col 2007, Dutra y col 2008) o apendicular (You y col 2007) y en pruebas de osteointegración (Casati y col 2007). Cabe resaltar que los resultados experimentales obtenidos en estos estudios no han sido muy satisfactorios. Esto debido a la gran disi-militud metodológica y a la falta de una estandarización experimental para elegir el anticoagulante ideal y los parámetros de centrifugación que permitan concentrar un adecuado número de plaquetas en esa especie.

Hasta el momento se han descrito dos métodos para obtener APCs a partir de sangre canina, el método del tubo (manual) (Jensen y col 2004, Choi y col 2005) y el método semiatomatizado SmartPReP 2 system (Thoesen y col 2006). Los autores evaluaron el método descrito para concentrar plaquetas mediante el método del tubo (Jensen y col 2004, Choi y col 2005) y no encontraron reproducibilidad alguna (datos sin publicar) al seguir las recomendaciones de esos investigadores. Por otra parte, el uso de dispositivos semiatomatizados (Thoesen y col 2006) para concentrar plaquetas caninas son costo-prohibitivos en la mayoría de los países del continente. El objetivo fundamental de la presente investigación fue estandarizar un método manual que permitiera concen-trar plaquetas caninas de manera reproducible con la finalidad de poder usar APCs tanto en el campo clínico como experimental en caninos. La hipótesis del estudio fue que las plaquetas de perro podrían ser concentradas mediante la recolección de sangre entera en tubos con ácido cítrico-citrato de sodio-dextrosa (ACD) centrifu-gados de manera única.

Aceptado: 08.09.2010.

* Calle 65, Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; raul.silva@ucaldas.edu.co

96

RF SILVA Y COL

MATERIAL Y MÉTODOS

Este estudio fue aprobado por el comité de ética en experimentación animal de la Universidad Federal de Minas Gerais, Brasil, protocolo número 125/2009.

ANIMALES

Se utilizaron doce perros de raza Fila Brasilero, seis machos con edades entre 24 y 108 meses y seis hembras con edades entre 18 y 60 meses, clínicamente sanos al momento de la recolección de la sangre y serológicamente negativos a leishmaniosis y erliquiosis.

OBTENCIÓN DEL CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS

Se realizó extracción de sangre mediante punción de la vena safena con un catéter mariposa 21 G (Shandong Weigao Group, China). La sangre de cada animal fue de-positada en un tubo de 10 mL con 1,5 mL de solución A de ACD, citrato de trisodio (22 g/L), ácido cítrico (8 g/L) y dextrosa (24,5 g/L) (BD, New Jersey, USA). Una muestra adicional de sangre fue depositada en un tubo de 5 mL con k3EDTA para realizar un hemograma. La sangre del tubo con ACD fue centrifugada (SIGMA 3K30, Alemania) a 191 g durante 6 minutos. Posteriormente, con la ayuda de una micropipeta de volumen fijo de 1000 µL se reco-lectaron (aproximadamente) los primeros 100 µL de la porción roja y los primeros 900 µL de plasma, por debajo y por encima de la interfaz eritrocitos-plasma, respectiva-mente. Los APCs obtenidos fueron analizados mediante hemograma automatizado por impedancia volumétrica (Abacus Junior Vet, Austria). Cada muestra fue analizada por triplicado. Los parámetros hematológicos evaluados

incluyeron hematocrito (PCV), recuentos de plaquetas (PLT), leucocitos (WBC), valores relativos y absolutos de linfocitos (LYM), monocitos (MID), neutrófilos, eosinófilos y basófilos (GRA).

ANáLISIS ESTADÍSTICO

Las variables hematológicas estudiadas presentaron distribución normal (prueba de Kolmogorov-Smirnov (P > 0,05)). Los valores de sangre entera y del APC fueron comparados mediante la prueba de Student (t) para muestras pareadas. Los factores sexo y edad fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA). Todos los resultados se presentaron como media y error estándar. Se empleó el coeficiente de correlación de Pearson (ρ) para determinar el grado de asociación entre los parámetros evaluados en el APC y en sangre entera. Finalmente, para estudiar la relación entre variables se realizó un análisis de regresión lineal simple. Se aceptó una diferencia estadísticamente significativa de P ≤ 0,01 para t, y P ≤ 0,01 y P ≤ 0,05 para ρ. La eficiencia de co-lección de plaquetas se determinó mediante la fórmula de Weibrich y col (2003): (volumen de APC x recuento de plaquetas en el APC/volumen de sangre entera x recuento de plaquetas en sangre entera) x 100.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los recuentos celulares de la sangre entera y de los APCs, presentaron diferencias estadísticamente signifi-cativas (P < 0,01) respecto a los valores de PLT, WBC, valores relativos y absolutos de GRA, absolutos de MID, relativos de PCV y LYM, mas no en los valores absolutos de LYM y relativos de MID (cuadro 1). Tampoco se ha-llaron diferencias entre el sexo y la edad de los animales

Cuadro 1. Valores promedios (± error estándar) de las variables hematológicas en muestras de sangre entera y concentrado de plaquetas. Mean (± standard error) values for the hematologic variables in the whole blood samples and the platelet concentrates.

Variable Sangre entera Concentrado de Plaquetas

PLT (fragmentos x 103 / µL) 345,3 (44,93)* 515,9 (60,74)

PCV % 44,2 (1,96)* 3,97 (1,14)

WBC (células x 103 / µL) 16,6 (2,08)* 6,9 (0,48)

LYM (células x 103 / µL) 5,05 (1,45) 3,07 (0,27)

LYM% 26,6 (4,01)* 46,6 (5,76)

MID (células x 103 / µL) 0,79 (0,22)* 0,275 (0,04)

MID% 4,2 (0,58) 3,9 (0,50)

GRA (células x 103 / µL) 10,7 (0,93)* 3,6 (0,54)

GRA% 69,3 (4,19)* 49,2 (5,53)

PLT: plaquetas; PCV: hematocrito; WBC: leucocitos; LYM: linfocitos; MID: monocitos; GRA: neutrófilos, eosinófilos y basófilos.

*Variable significativamente diferente (P < 0,01) entre la sangre entera y el concentrado autólogo de plaquetas.

97

PERRO, PLASMA RICO EN PLAQUETAS AUTÓLOGO, MEDICINA REGENERATIVA, MÉTODO DEL TUBO

y los recuentos celulares en el análisis hematológico. Se encontró correlación negativa (ρ = -0,702 P = 0,01) entre el recuento de linfocitos y de plaquetas presentes en los APCs. Las respectivas ecuaciones de regresión lineal son presentadas en el cuadro 2. La eficiencia en la colección de plaquetas fue de 29,9%. La concentración de plaquetas fue 49,4% superior en los APCs respecto a las muestras de sangre entera.

Jensen y col (2004) describieron un método manual para concentrar plaquetas de perros con EDTA, mediante centrifugación única. Ellos obtenían un incremento de plaquetas y leucocitos en el APC en relación a sangre entera de 670% (1.884.000 PLT/µL) y 720% (64.200 WBC/µL), respectivamente. Sin embargo, el EDTA no es un anticoagulante ideal para concentrar plaquetas (White y Escolar 2000). Comparado a los resultados de Jensen y col (2004), el método descrito en este artículo concentra una menor cantidad de plaquetas, mientras que presenta una concentración de leucocitos 58% inferior. Por otra parte, el uso de APCs con EDTA podría provocar lesiones estructurales, bioquímicas y funcionales a las plaquetas (White y Escolar 2000) y ser irritante para los tejidos tratados.

Existen algunos reportes en los que se describe el uso del citrato de sodio como anticoagulante (Ferraz y col 2007, Bonomi y col 2007, Choi y col 2005, You y col 2007) para concentrar plaquetas caninas. En esos trabajos describen la concentración de plaquetas en esa especie mediante dos tiempos de centrifugación. Normalmente, el producto final de esos protocolos osciló entre 400.000 a 1.300.000 PLT/µL. En esas investigaciones las plaquetas fueron contadas manualmente (microscopia óptica) y no se presentó otra información hematológica adicional de las características de los APCs obtenidos.

El método del tubo planteado en este estudio con una centrifugación única concentra plaquetas de una manera cercana al rango descrito para dos centrifugaciones. Lei y col (2009) concluyeron que la calidad del APC está estrechamente relacionada con el anticoagulante empleado. El uso de ACD produce superior calidad del

APC que cuando se emplea citrato de sodio o heparina. Lo anterior plantea una ventaja del método descrito en este artículo. Li y col (2009) usaron ACD como anticoa-gulante y mediante doble centrifugación concentraron una media de 1.100.000 PLT/µL en el APC. Esto corresponde, aproximadamente, al doble de la cantidad de plaquetas concentradas con el método desarrollado por nuestro grupo. Sin embargo, desde el punto de vista clínico y tal como ha sido evaluado en caballos, no existe correlación alguna entre el número de plaquetas concentradas y la respuesta clínica de los caballos tratados (Carmona y col 2011).

La cantidad de plaquetas que se concentran con el método evaluado en este estudio podría ser suficiente para producir efectos biológicos (Weibrich y col 2004, Carmona y col 2011). Es necesario recordar que lo más importante de un método para concentrar plaquetas es que además de concentrar altos números de las mismas permita obtener plaquetas vivas e inactivas (Marx 2004, Carmona y col 2011). El método evaluado permitió concentrar plaquetas y disminuir de manera significativa los MID y GRA y porcentualmente los LYM. Es decir, la población celular concentrada fue en su totalidad diferente a la san-guínea basal. Quizás esa modificación pueda tener alguna influencia en la utilización clínica de los APCs, debido al importante efecto regulador que tienen los neutrófilos, macrófagos y linfocitos sobre la reparación tisular (Park y col 2004). Cabe aclarar que hasta el momento el papel (perjudicial o benéfico) de los WBC no ha sido comple-tamente esclarecido (Carmona y col 2011).

Las correlaciones positivas encontradas entre la concentración de plaquetas en el APC con MID, GRA y cuya significancia tiende a disminuir con la totalidad de los WBC, podrían deberse a la baja velocidad y tiempo inherentes a la técnica de centrifugación y no necesaria-mente a que la concentración de PLT-APC esté asociada con los valores basales de estas variables. La correlación negativa encontrada entre PLT y LYM en el APC sugiere que a medida que aumenta la cantidad de LYM la con-centración de PLT-APC disminuye exponencialmente,

Cuadro 2. Coeficientes de correlación de Pearson (ρ) y ecuaciones de regresión lineal para la variable dependiente (número de pla-quetas en el APC). Pearson correlation coefficient (ρ) and lineal regression equation for the response variable (numbers of platelets in APC).

Variable ρ P Ecuación de regresión lineal R2

PLT 0,946** 0,000 PLT-APC = 74.432,699 + 1,279 (PLT) 0,946

MID 0,819** 0,001 PLT-APC = 337.459,058 + 225,286 (MID) 0,671

GRA 0,797** 0,002 PLT-APC = 41.894,228 + 51,673 (GRA) 0,635

LYM-APC –0,702* 0,011 PLT-APC = 986.142,041 – 153,162 (LYM-APC) 0,493

WBC 0,602* 0,038 PLT-APC = 223.619,431 + 17,572 (WBC) 0,363

PLT: plaquetas; PCV: hematocrito; WBC: leucocitos; LYM: linfocitos; MID: monocitos; GRA: neutrófilos, eosinófilos y basófilos. PLT-APC, número de plaquetas en el concentrado de plaquetas. *P < 0,05. **P < 0,01.PLT-APC, numbers of platelets in autologous platelet concentrate. *P < 0.05. ** P < 0.01.

98

RF SILVA Y COL

lo que podría indicar que el método concentra plaquetas asociadas a valores de LYM similares a los encontrados en sangre entera. La correlación altamente significativa entre las concentraciones basales de plaquetas y PLT-APC y la correspondiente ecuación de regresión lineal indican que para este método el pronóstico del valor de PLT-APC estaría basado en un incremento constante de 74.432,699 más 1,279 veces el valor del número de plaquetas en sangre entera. Si bien la eficiencia de recolección de plaquetas se presenta aparentemente baja, esto podría deberse al hecho de que para efectos del presente estudio sólo se obtuvo 1 mL de plasma por tubo.

Los resultados obtenidos permiten concluir que la metodología empleada para concentrar plaquetas podría ser aceptable para obtener efectos biológicos en la utili-zación clínica de los APCs como terapia regenerativa en medicina y cirugía canina. El análisis de regresión linear podría permitir predecir el valor de PLT-APC a partir del conocimiento de las variables conocidas en sangre entera tales como PLT, MID, GRA, LYM y WBC. La relevancia del método descrito radica en que permite concentrar plaquetas mediante utilización de ACD como anticoagulante para incrementar la calidad de APC y que éste se obtiene mediante una única centrifugación a baja velocidad y corto tiempo. En el futuro se deberán evaluar las características bioquímicas y ultraestructurales del APC activado, para determinar su calidad biológica como biofármaco autólogo.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue evaluar un método manual para concentrar plaquetas caninas y en consecuencia producir concentrados autólogos de plaquetas (APCs) para propósitos clínicos y experimentales. Los APCs fueron obtenidos a partir de sangre venosa depositada en tubos con solución ACD que fueron centrifugados a 191 g durante 6 minutos. Para los recuentos celulares de sangre entera y APCs, se encontraron diferencias estadísticamente significativas (P < 0,01) entre los recuentos de las plaquetas, leucocitos, granulocitos, monocitos, pero no entre los valores de linfocitos. Se encontró una correlación negativa (ρ = -0,702 P = 0,011) entre el número de linfocitos y plaquetas en los APCs. La eficiencia de recolección de plaquetas fue de 29,9% y la concentración de plaquetas fue de 49,4% mayor en los APCs, en comparación con las muestras de sangre entera. Los resultados indicaron que este método de centrifugación simple permite concentrar plaquetas caninas.

REFERENCIAS

Anitua E, I Andia, B Ardanza, P Nurden, AT Nurden. 2004. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration. Thromb Haemost 91, 4-15.

Anitua E, M Sanchez, G Orive, I Andia. 2007. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials 28, 4551-4560.

Argüelles D, JU Carmona, J Pastor, A Iborra, L Viñals, P Martínes, E Bach, M Prades. 2006. Evaluation of single and double centrifugation tube methods for concentrating equine platelets. Res Vet Sci 81, 237-245.

Bonomi S, CR Auada, F Almeida, DC Branco, KB Braga, C Muramoto, M Amaku. 2007. Plasma rico em plaquetas combinado a hidroxiapatita na formação do calo ósseo em fraturas induzidas experimentalmente no rádio de cães. Ciênc Rural 37, 1045-1051.

Carmona JU, M Prades. 2009. Platelet concentrates to treat musculo- skeletal disease in horses. VDM Verlag Dr. Müller Aktiengesellschaft & Co. KG, Saarbrücken, Germany.

Carmona JU, M Prades, D Argüelles. 2009a. Autologous platelet con-centrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses. Arch Med Vet 41, 77-82.

Carmona JU, C López, M Prades. 2009b. Use of autologous platelet concentrates obtained by the tube method as a treatment for ar-thropathies in horses. Arch Med Vet 41, 175-179.

Carmona JU, C López, CE Giraldo. 2011. Uso de concentrados autólogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crónicas del aparato musculoesquelético. Arch Med Vet 43 (1-10).

Casati MZ, BC Vasconcelos-Gurgel, PF Gonçalves, SP Pimentel, G Rocha-nogueira, JRFH Nociti, EA Sallum. 2007. Platelet-rich plasma does not improve bone regeneration around peri-implant bone defects - A pilot study in dogs. Int J Oral Macillofac Surg 36, 132-136.

Choi BH, SJ Zhu, BY Kim, SH Huh, SH Lee, JH Jung. 2005. Effect of platelet-rich plasma (PRP) concentration on the viability and proliferation of alveolar bone cells: an in vitro study. Int J Oral Maxillofac Surg 34, 420-424.

Dutra CEA, MM Pereira, R Serakides, MCF Rezende. 2008. In vivo evaluation of bioactive glass foams associated with platelet-rich plasma in bone defects. J Tissue Eng Regen Med 2, 221-227.

Ferraz VCM, CRA Ferrigno, A Schmaedecke. 2007. Platelet concentration of plateletrich plasma from dog, obtained through three centrifuga-tion speeds. Braz J Vet Res Anim Sci 44, 435-440.

Jensen TB, O Rahbek, S Overgaard, K Søballe. 2004. Platelet rich plasma and fresh frozen bone allograft as enhancement of implant fixation - An experimental study in dogs. J Orthop Res 22, 653-658.

Lei H, L Gui, R Xiao. 2009. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin Biochem 42, 1452-1460.

Li NY, RT Yuan, T Chen, LQ Chen, XM Jin. 2009. Effect of Platelet-Rich Plasma and Latissimus Dorsi Muscle Flap on Osteogenesis and Vascularization of Tissue-Engineered Bone in Dogs. J Oral Maxillofac Surg 67,1850-1858.

Marx RE. 2004. Platelet-rich plasma: evidence to support its usage. J Oral Maxillofac Surg 62, 489-496.

Monteiro SO, O M Lepage, CL Theoret. 2009. Effects of platelet-rich plasma on the repair of wounds on the distal aspect of the forelimb in horses. Am J Vet Res 70, 277-282.

Moreno L, J Marín, F Enríquez, G González, L Moreno, L Cisneros, LM Sancha. 2004. Utilización de plasma rico en plaquetas para regeneración periodontal en un perro. Rev Odont Mex 8, 64-69.

Park JE, A Barbul. 2004. Understanding the role of immune regulation in wound healing. Am J Surg 187, 11S-16S.

Thoesen MS, WS Vander- Berg-Foels, T Stokol, KM Rassnick, MS Jacobson, SB Kevi, RJ Todhunter. 2006. Used of a centrifugation-based, point-of-care device for production of canine autologous bone marrow and platelet concentrates. Am J Vet Res 67, 1655-1661.

Thor A, V Franke-Stenport, CB Johansson, L Rasmusson. 2007. Early bone formation in humans bone grafts treated with platelet-rich plasma: preliminary histomorphometric results. Int J Oral Maxillofac Surg 36, 1164-1171.

Weibrich G, KGK Wilfried, B Rainer, WE Hitzler, G Hafner. 2003. The Harvest Smart PRePTM system versus the Friadent-Schütze platelet-rich plasma kit. Clin Oral Impl Res 14, 233-239.

Weibrich G, T Hansen, W Kleis, R Buch, WE Hitzler. 2004. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone 34, 665-671.

White G, G Escolar. 2000. EDTA-induced changes in platelet structure and function: adhesion and spreading. Platelets 11, 56-61.

You TM, BH Choi, J Li, JH Jung, HJ Lee, SH Lee, SM Jeong. 2007. The effect of platelet-rich plasma on bone healing around im-plants placed in bone defects treated With Bio-oss: a pilot study in the dog tibia. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 103, 8-12.

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Fundada en 1969 ISSN 0301-732x

Revista seleccionada por los siguientes repertorios científicos internacionales: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publica, en español o inglés, contribuciones científicas originales en la forma de ar-tículos científicos, revisiones bibliográficas y comunicaciones cortas que pueden incluir observaciones clínicas, descripciones de técnicas o métodos, y avances en todos los aspectos de las ciencias veterinarias y bienestar animal.

ENVíO DE LA PUBLICACIóN

Los artículos deben ser enviados al Editor en forma electrónica a través de www.equipu.cl, e incluir:

• Unaversiónelectrónicadeltexto,cuadros(preferentementeen formato MS Word), figuras (en formato Excel, JPG o TIFF, 300 dpi) y una declaración de la responsabilidad de autoría, con la firma de todos los autores.

• Lostrabajosdebenseroriginalesy,porlotanto,nodebenestar en proceso de arbitraje en otra revista.

• Losartículosquesepresentensinconsiderarlasnormasdeestilo serán devueltos sin ser sometidos a revisión.

• Para experimentos conanimalesohumanos, elComité Editor podrá solicitar que se adjunte la autorización de un Comité de Bioética o instancia similar.

• SedeberáincluirunacartadirigidaalEditorsolicitandolapublicación de su trabajo y señalando a uno de los autores como responsable de la revisión de las pruebas de imprenta y de la correspondencia.

• Lapropiedadintelectualdelostrabajospublicadospertenecea los autores.

• LosrevisoresdeArchivos de Medicina Veterinaria asesoran al Comité Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado. Los autores podrán sugerir revisores. Todos los artículos enviados para publicación serán enviados a dos revisores seleccionados por el Comité Editor y pueden incluir, o no, los sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en los informes, se recurrirá a un tercero en carácter de árbitro-arbitrador, que asesorará al Comité Editor para decidir el destino del trabajo. Los revisores están obligados a mantener el carácter confidencial de toda la información de los trabajos, aun cuando no sean publicados.

• Previo a la publicación de un trabajo aceptado sedebe pagar un valor cuyo monto se señala en la Web www.veterinaria.uach.cl

FORMA Y PREPARACIóN DEL ARTíCULO

Tipos de artículos

Artículos de revisión: son realizados por expertos que re-sumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente se ajustan a un formato definido de presentación. Los autores deberían previamente consultar a los editores antes de iniciar el trabajo de revisión. El Comité Editor podrá solicitar a expertos el envío de artículos de revisión, los que también serán sometidos al proceso de arbitraje y edición. No deben exceder de 30 pági-nas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Sólo se aceptarán revisiones escritas en inglés.

Artículos científicos: éstos informan un nuevo avance en Ciencias Veterinarias basados en una investigación original. El formato de ellos deberá incluir summary, introducción, material y métodos, resultados, discusión, resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20 páginas, incluidos cuadros, figuras y referencias.

Comunicaciones cortas: informan de manera breve un avance, resultado de un experimento, observaciones clínicas o nueva metodología, ajustándose al siguiente formato: summary, introducción, material y métodos, resultados y discusión (sección conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 12 páginas, incluidos cuadros, figuras y referencias.

ESTILO Y FORMATO DE LA REVISTA

Presentación general: la revista publica artículos en español o inglés.

Los artículos deberán ser escritos con letras Times New Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio, en tamaño carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm en los cuatro bordes.

Todas las páginas deben ser numeradas de manera conse-cutiva en el ángulo superior derecho, y las líneas deberán ser numeradas en cada página, iniciándose con el número 1, junto al margen izquierdo, en todo el trabajo.

Los títulos de capítulos deben ser escritos en mayúscula, justificados al lado izquierdo, en líneas separadas y sin punto final. Ejemplo: MATERIAL Y MÉTODOS. En los subtítulos sólo la primera letra es mayúscula (Ejemplo: Diseño experi-mental) y deberá ser justificado al lado izquierdo. Subtítulo secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra cursiva. No deberán usarse subrayado ni numeración de sub-títulos o lista de ítems.

Las cifras deben ser escritas en números. Cuando están al inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera, deben ser expresadas en palabras. Un decimal deberá ser pre-cedido de un numeral usando punto cuando el artículo es en inglés o coma cuando el artículo es en español (Ejemplo: 0,5 no, 5). Múltiplos de mil deben escribirse separados por punto (Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad deberán ajustarse al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la práctica en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como “07 de septiembre de 1954” en el texto, pero pueden presentarse abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe expresar según las 24 horas cronológicas (Ejemplo: 13:00 h).

Para la nomenclatura química se deben utilizar las normas de la Sociedad de Bioquímica (Biochem J 209, 1-27, 1983), los fármacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres genéricos (en minúsculas), si es necesario colocar marcas y sus fuentes deberán ir a pie de página. Las enzimas deben ser identi-ficadas, cuando se mencionan por primera vez, según la Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Los términos en latín y sus abreviaciones que son de uso común en la literatura científica, tales como: in vitro, in vivo, ad libitum deberán ir en cursiva. Los valores de probabilidad deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Des-viación estándar, error estándar de la media e intervalos de confianza, se abreviarán en la forma siguiente: DE, EE y IC, respectivamente.

Título

El título del trabajo debe ser conciso, específico e informa-tivo. Sólo la primera letra será mayúscula, en negritas, centrado, iniciándose en la línea 10, sin usar marcas comerciales o abre-viaciones. Se deberá señalar, con superíndice (#) la fuente de financiamiento, si lo hubiese, que se detallará a pie de página. Separado por el espacio de una línea se deberá escribir el título en inglés.

Autores y direcciones

Los nombres de los autores se escribirán bajo el título separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido separando por comas entre los autores, ajustándose al siguiente ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al término de cada nombre de autor debe identificarse con una letra en superíndice, el nombre de la sección, departamento, servicio o institución a la que pertenece o perteneció dicho autor, durante la ejecución del trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la correspondencia, debiéndose señalar a pie de página el número de fax, correo electrónico y casilla de correo.

Pie de página

Serán usados para elaborar abreviaciones citadas en el título de cuadros, marcas comerciales, nombre y dirección de empresas. Deben ser indicados con números.

Summary

La segunda página debe contener un summary, de no más de 250 palabras y que describa los propósitos del estudio o investigación, el material y métodos empleados, los resultados principales y las conclusiones más importantes. No se deben emplear abreviaturas no estandarizadas. En línea aparte, separado por un espacio y justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras clave) en minúsculas, las que no deben ser más de 4.

Introducción

En la tercera página en la línea 1 se escribirá el título del capítulo. En la línea siguiente, con sangría, predeterminada de un tabulador en 5 espacios, se plantearán los antecedentes que sustentan el propósito del artículo, sin un despliegue extensivo del tema y utilizando sólo las referencias más pertinentes. Se deben indicar, cuando corresponda, la hipótesis que se postula y los objetivos de la investigación.

Entre párrafos debe conservar el interlineado y medio.

Material y Métodos

Separado por un espacio de la sección anterior, se deberá describir el capítulo con suficientes detalles para permitir a otros repetir el estudio. Después de la primera referencia en el texto a drogas o reactivos, se deben señalar el nombre genérico, dosis y vía de administración. Para el caso de equipo especializado se indicarán la marca, el modelo y el nombre del fabricante.

Los métodos estadísticos utilizados deben ser señalados como subtítulos: “Análisis estadístico” y deben incluir un adecuado detalle, que permita a los lectores establecer con precisión cómo han sido analizados y presentados los datos y las unidades de medidas en que están expresadas (medias aritméticas, desvia-ciones estándares, errores estándares de la media, medianas, rangos o límites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron paramétricas (Chi cuadrado, prueba “t” de Student, Anova, etc.) o no paramétricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se deberán identificar el nombre, la versión y el proveedor del programa computacional utilizado, ejemplo: SPSS versión 9.0 para Win-dows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Resultados

Separado por el espacio de una línea de la sección anterior, se deberá describir el capítulo de resultados, presentado en forma concisa y lógica, sin discusión o referencia a otro trabajo. Los cuadros y figuras deben ser los mínimos necesarios y los datos no deben ser repetidos en el texto y tampoco deberán ser mostrados simultáneamente o reiterados.

Discusión

Esta sección, separada por una línea de la anterior, debe evaluar e interpretar los resultados, relacionándolos a los de otros estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos. Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, haciéndola de manera lógica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones

que no estén respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en trabajos aún no publicados.

Resumen

El resumen en español deberá ser escrito en hoja aparte, y deberá ajustarse a las mismas normas señaladas para el summary. Separadas por el espacio de una línea se deberán escribir las palabras clave en letras minúsculas, no debiendo ser más de cuatro y justificadas en el lado izquierdo.

Agradecimientos

Deben ser breves y sólo incluir personas o instituciones que han hecho una contribución directa, han provisto material necesario o dado las facilidades para la realización del estudio.

Referencias

La precisión con la que son señaladas las referencias es de responsabilidad de los autores y deben corresponder al artículo original; asegúrese que todos los artículos citados en el texto estén incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el texto, las citas se deben indicar entre paréntesis y en orden cronológico, citando el apellido del autor y la expresión “y col” después del apellido del primer autor, cuando son más de dos, Ej.: (Pérez 1994, Castro y Martínez 1996, Cifuentes y col 2002).

El listado de referencias debe ir en orden alfabético de acuerdo al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use el término anónimo entre comillas, tanto en el texto como en el listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor, solo o con más autores, deben ser escritas en orden cronoló gico. Las letras a, b, c, etc., deberían ser agregadas como superíndice cuando un autor escribe más de un trabajo en el mismo año. Los nombres de los autores deben escribirse en minúsculas, sin punto entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los siguientes ejemplos como guía.

Para artículos en revista: Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

Para capítulos en libros o publicaciones ocasionales:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen

in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006.

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

Para artículos y resúmenes publicados en series regulares:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998.

Valores sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Con-greso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

Para memoria de título:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Para tesis:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-

CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.Minimice el uso de resúmenes como referencias. Evite usar

“datos no publicados” o “comunicación personal” al menos que de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse referencia en el texto como pie de página, pero no debe aparecer en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han sido aceptados para publicación deben ser citados como “en prensa”; sin embargo, trabajos que han sido sometidos a publi-cación, pero no han sido aceptados todavía, deben ser referidos como “datos no publicados”.

Direcciones de páginas Web no deben ser incluidas en las referencias; si su uso es imprescindible, la dirección debe ser señalada en el texto como pie de página, incluyendo fecha de consulta.

INSTRUCCIONES COMPLEMENTARIAS

Cuadros

Las leyendas de los cuadros y figuras deben ser autoexpli-cativos y presentarse en español e inglés.

Los cuadros deben ser el menor número posible, presentados en hoja aparte, con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte superior. La información de los cuadros no debe repetir lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente con números arábigos, en el orden en que aparecen en el texto, asignándoseles un título breve y autoexplicativo que indique su contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un encabezamiento corto o abreviado. Sólo los encabezamientos de las columnas y los títulos generales se separan con líneas hori-zontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y no por líneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias, deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para todas las abreviaturas no estándar y las unidades de medidas deben ser agregadas entre paréntesis. Si se usan superíndices para señalar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el número

DIRECCIÓNComité Editor Archivos de Medicina Veterinaria

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chilee-mail: archmv@uach.cl - Fono-Fax: (56-63) 221459

www.veterinaria.uach.clwww.scielo.cl

Casilla 567, Valdivia, CHILE

Representante Legal:Víctor Cubillos Godoy

Rector de la universidad Austral de Chile

de dígitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El ancho máximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para una columna, o los 170 mm para dos columnas.

Figuras

Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte inferior y numeradas consecutivamente usando números arábigos, según el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1. Denomine figura a cualquier ilustración que no sea cuadro, Ej.: gráficos, radiografías, ecografías, electrocardiogramas, fotografías, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente y acompañadas de una corta descripción que contenga la expli-cación de todos los marcadores, líneas y símbolos usados. Si la figura tiene secciones, éstas deben ser identificadas como a, b, c, etc., en la esquina superior derecha y deberán ser descritas en la leyenda.

Para el caso de fotografías, en el reverso y con lápiz a carbón, deben señalarse con flecha la orientación espacial, el número de la figura y el nombre del autor principal. Los símbolos, flechas o letras, empleados en las fotografías, deben tener un tamaño y contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Envíe las

figuras protegidas en un sobre grueso y de tamaño apropiado. Las figuras pueden diseñarse a una o dos columnas de ancho (80 y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de las figuras deben ser financiadas por los autores.

Cuando las figuras no son originales debe señalarse la autoría, y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorización del autor para ser reproducidas.

Pruebas de imprenta

Una prueba de imprenta será enviada al autor encargado de la correspondencia, para su lectura y corrección puntual, y debe ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicación.

La decisión final para la publicación del trabajo será en el momento en que el Comité Editor acepte las correcciones, que a sugerencia de los árbitros han realizado los autores. Modifica-ciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores no serán aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarán responsabilidad por la impresión de errores de los ar tículos que los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish or English, original scientific contributions such as scientific articles, reviews and short communications which can include clinical observations, descriptions of methods or techniques and advances in all aspects of veterinary science and animal welfare.

SUBMISSION OF MANUSCRIPTS

Manuscripts should be submitted to the Editor via the on line platform www.equipu.cl and it must include:

• Anelectronicversionofthetext,tables(preferablyinMSWord format), figures (in Excel format, JPG or TIFF, with 300 dpi), and a letter declaring authorship, signed by all authors.

• Themanuscriptsmustbeoriginal,andmaynotbeconsideredfor publication in another journal.

• Manuscriptsthatdonotconformtoeditorialrequirementswill be returned without review.

• TheeditormayrequireacopyoftheappropriateBioethicalCommittee Certification for manuscripts describing studies involving animals or humans.

• AcoveringlettertotheEditormustbeincludedrequestingpublication of the work, and naming the corresponding author who will also revise the proof of the article, should it be accepted for publication.

• Theintellectualpropertyoftheworkwillberetainedbytheauthors.

• RefereesofArchivos de Medicina Veterinaria will aid the Editorial Committee to determine whether the manuscript fulfills publication requirements. The authors may suggest possible referees. All articles submitted for publication will be assessed by two referees. The referees will be selected by the Editorial Committee, and may or may not include those nominated by the authors. In the case of a disagreement between the referee’s reports, a third referee will aid the Editorial Committee to reach a decision. Referees are obliged to keep all information from the articles confidential, including unpublished information.

• Previoustothepublicationofacceptedarticles,thepublicationcharge must be paid, the amount of which can be found at www.veterinaria.uach.cl.

PREPARATION AND FORM OF MANUSCRIPTS

Types of articles

Review articles: provide expert summaries of current knowledge in a particular field of veterinary science, and do not necessarily have a set format. Authors should consult with the Editor before initiating a review. The Editorial Committee may solicit an expert to prepare a review, which will also be refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length, including tables, figures and references. Only reviews in english will be accepted.

Scientific articles: report new advances in veterinary science based on original research. The format must include summary, introduction, material and methods, results, discussion, resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 20 pages, including tables, figures and references.

Short communications: briefly inform of an advance, experimental result, clinical observations or new methodology, with the following format: summary, introduction, material and methods, results and discussion (combined), resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 12 pages, including tables, figures and references.

JOURNAL STYLE AND LAYOUT

General presentation: The journal publishes articles in English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top right corner, and lines must be numbered on the left, starting with number one, on all pages.

Headings must be in upper case, left-justified on a separate line with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS. Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified; secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use underlining and do not number sub-headings or itemized lists.

In the text, numbers must be written in numerals. When a sentence begins with a number or when necessary for clarity, this should be written in words. A decimal point must be preceded by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the decimal in English and a comma in Spanish. All measurements should be reported in IS units unless it is normal practice in a discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit).

Founded in 1969 ISSN 0301-732x

Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour clock for times of day (e. g. 13:00 h).

Chemical nomenclature must be expressed using the Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983), generic names (in lower caps) must be used for medications. If brands and sources of medications need to be included, this should be included as a foot-note. Enzymes must be identified at first mention, in accordance with the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Latin terminology and abbreviations commonly used in scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must be italicized. Probability values must be presented as P<0.05 or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and CI, respectively.

Title

Titles should be short, specific and informative. The title is centred in bold, starting at line 10 without using trade names or abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript symbol # should be used to indicate the source of funding, with details given as a footnote, if appropriate.

Author’s names and addresses

Author’s names are written underneath the title, separated by a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Superscript letters should be used after each author’s name to identify the section, department, service or institute of the author where the work was conducted. The corresponding author is indicated using the superscript letter followed by an asterisk, with the full contact details, including fax number and email address indicated in the footnote.

Footnotes

These are used to define abbreviations used in table titles, commercial brands, the name and address of companies. They must be indicated with numbers.

Resumen

The second page must contain a summary in Spanish (Resumen), of no more than 250 words, that describes the objectives of the study or research, the material and methods used, the principal results and the most important conclusions. Non-standard abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified and separated by a space, up to four palabras clave (key words) should be identified.

Introduction

The subheading “Introduction” is written on the third page on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context of the study is briefly presented without an extensive revision of the theme, and only citing the most relevant references. When appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing between paragraphs must be kept.

Material and methods

Separated by one space from the previous section, this section should contain sufficient detail to allow others to repeat the study. When the first reference in the text is made to medications or chemicals, the generic name, dose and route of administration

should be indicated. For specialized equipment, the brand, model and manufacturer’s name must be indicated.

Details of all statistical methods used must be given at the end of this section under the sub-heading “Statistical analysis” and should include adequate detail to allow readers to determine precisely how data have been analysed and the units that are used to express the results (mathematical mean, standard deviation, standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits, etc.). The use of parametric (Chi-square, student’s T-test, ANOVA, etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses must be indicated. The name, version and sources of computational statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version 9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Results

Separated by one space from the previous section, this section should contain a concise and logical description of the results obtained without discussion or reference to other work. The minimum number of tables and figures should be included to present the pertinent data without repetition, and data presented in tables and figures should not be repeated in the text.

Discussion

This section, separated by one space from the previous section, should evaluate and interpret the results and relate these to other relevant results. The results should not be repeated and new results must not be presented in this section. Care should be taken to ensure that the discussion is developed in a logical and concise manner, and conclusions are reached, as well as a discussion of their relevance. Conclusions that are not directly supported by the data of the study or other unpublished studies should not be presented.

Summary

The summary is written in English, and must be presented on a separate page. The summary should contain the same elements as the “Resumen”. On a separate line, following the summary, left-justified in small caps and separated by a space, up to four key words should be identified.

Acknowledgements

This section should be brief, and should only include people or institutions that have made a direct contribution, provided necessary material or have provided the facilities for the study’s development.

References

The accuracy of the reference section is the responsibility of the authors and references must be verified against the original article. Please ensure that all articles cited in the text are included in the reference list and vice versa. In the text, citations should be listed in parentheses in chronological order, citing authors’ names, and using et al after the first author’s name where there are more than two (e.g. Pérez 1994, Castro and Martínez 1996, Cifuentes et al 2002).

The reference list must be ordered alphabetically according to the first author’s name, and all authors’ names and initials must be included. When no author is given, use the term “Anonymous” in both text and reference list. References with the same author, single or with coauthors, should be listed in chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended as a superscript when more than one work is cited from the

same author within the same year. Authors names should appear with the initials and first letter of the surname in upper caps and the remainder of the surname in lower caps, with no dots between initials. Journal titles and names of books should be in italics using standard abbreviations. Use the following examples as a guide:

For journal articles:Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

For chapters in books or occasional publications:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen

in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006..

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

For articles and proceedings published in regular series:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998. Valores

sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

For dissertations:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

For Theses:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-

CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Minimise the citation of abstracts as references. Authors are specifically discouraged from citing “unpublished data” or “personal communication”, unless this information exists in written form, in which case the text should be referred to as a footnote, but this should not appear in the list of references. References to papers which have been accepted but not published should be cited as “in press”, whereas manuscripts which have been submitted for publication but not accepted should be referred to as “unpublished data”.

Web pages should not be included as references. If so required, web page addresses should be written as footnotes, including date of consultation.

COMPLEMENTARY INSTRUCTIONS

Tables

The titles to tables and figures should be self-explanatory and must be presented in both Spanish and English.

The number of tables should be kept to a minimum and presented on separate pages with their respective titles in English and Spanish at the top. Information in tables must not be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively with Arabic numbers in the order in which they are referred to in the text. The brief title to the table should indicate the contents of the table and should be understandable without reference to the text. Each column of each table must have a short or abbreviated heading. Only column headings and general titles should be separated with horizontal lines. Data columns should be separated by spaces and not vertical lines. When additional explanatory information is required, this should appear at the foot of the table. Explanatory information for non-standard abbreviations and units should appear within parentheses. If superscripts are used to indicate significant differences between values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column. Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80 mm for one column or 170 mm for two columns.

Figures

Figures should be submitted on separate pages, with their respective titles in English and Spanish at the bottom and numbered consecutively using Arabic numerals in the order they are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies, ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive caption that contains an explanation for all markers, lines and symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections, these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and must be described in the caption.

The reverse of photographs must be marked using graphite pencil with the number of the figure, the first author and an arrow showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or letters used should be of an adequate size and contrast to be easily visible. Photographs should be submitted in a protective, adequately sized envelope. Figures may be one or two column-widths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured figures must be met by the authors.

The authorship of non-original figures must be acknowledged, and when appropriate, authorization to reproduce these figures must be provided.

Proofs

A proof will be sent to the corresponding author for proof-reading, and must be returned within the specified time. Otherwise the Editor reserves the right to carefully proof-read the article but without assuming responsibility for errors, to continue with the publication process.

The final decision regarding acceptance of the manuscript will be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript following correction according to the referees’ comments. Alterations to the proof that do not correspond to minor errors will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept any responsibility for printed errors which were not noted by the authors at the time of proof-reading the proof.

SUSCRIPCIÓNARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Estimado lector:

Para renovar la suscripción anual de nuestra revista (3 números, abril/agosto/diciembre) puede visitar nuestra página web en www.veterinaria.uach.cl, opción suscripciones y pago online, o bien, remitir cheque por $ 15.000 (quince mil pesos) a nombre de la Universidad Austral de Chile, dentro de un sobre dirigido al Comité Editor, adjuntando el presente cupón.

SeñoresComité EditorRevista Archivos de Medicina VeterinariaUniversidad Austral de ChileCasilla 567Valdivia - Chile

Nombre o razón social .......................................................................................................................................

Dirección. ............................................................................................................................................................

Ciudad ................................................................................ Fono........................................................................

País .....................................................................................................................................................................

ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIASUBSCRIPTION FORM

Yearly Subscription - 3 issues - US $ 50.00

Dear reader:

To renew your annual subscription (3 issues, april/august/december), please order through our website at www.veterinaria.uach.cl where you can pay online. Cheque payments should be made to Universidad Austral de Chile and sent to the following address, enclosing the subscription form below:

Comité EditorRevista Archivos de Medicina VeterinariaUniversidad Austral de ChileP.O. Box 567Valdivia - Chile

Name ....................................................................................................................................................................

Address ................................................................................................................................................................

City .......................................................................................................................................................................

Code .....................................................................................................................................................................

Country ................................................................................................................................................................

ANDROS IMPRESORESwww.androsimpresores.cl