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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA. BIOLOGIA MOLECULAR Aula 7. REPLICAÇÃO DO DNA. DNA polimerases : enzimas que sintetizam DNA. - Replicação do genoma: REPLICASES - Outras: REPARO e funções auxiliares na replicação - PowerPoint PPT Presentation
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BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR
Aula 7Aula 7
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIAVETERINÁRIA
DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVADEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA
REPLICAÇÃO DO DNAREPLICAÇÃO DO DNA
O DNA é REPLICADO POR POLIMERASES,QUE SEGUEM INTRUÇÕES de UM MOLDE
(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi
1. Os precursores ativados (dATP, dTTP, dGTP dCTP), devem estar presentes. Mg++ também.
2. DNA polimerase adiciona dNTPs à extremidade3'- OH da cadeia pré-existente.
3. DNA template (molde) é essencial (SS, DS DNA)
ATCGTCCGTAAGTTCGCGCTAAGGTTAGCAGGCAT
DNA polimerases:DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA enzimas que sintetizam DNA
- Replicação do genoma: - Replicação do genoma: REPLICASESREPLICASES
- Outras: - Outras: REPAROREPARO e funções auxiliares na replicação e funções auxiliares na replicação
- Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III)- Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, II, III)
-Eucariotas: 5 polimerases (Eucariotas: 5 polimerases (, ß, , ß, , , , , ) )
- Mas, apenas Mas, apenas UMA é a replicaseUMA é a replicase
PROPRIEDADES das DNA polPROPRIEDADES das DNA pol
- - Sintetizam Sintetizam DNADNA a partir de moldes a partir de moldes DNADNA
- Necessitam de - Necessitam de PRIMERPRIMER
- Mecanismo de síntese é similar- Mecanismo de síntese é similar
- Síntese na direção Síntese na direção 5’ > 3’5’ > 3’
- Alta fidelidadeAlta fidelidade
- Atividade proofreadingAtividade proofreading
PolimerizaçãoPolimerização
Mecanismo de PolimerizaçãoMecanismo de Polimerização
A REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVAA REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVA
A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONALA REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL
A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUAA REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC
ATCGATAG
TAGCTATC
5’-UACGAUCGATCGATCG
A Síntese de uma das cadeias é A Síntese de uma das cadeias é CONTÍNUACONTÍNUA
LEADING strandLEADING strand
E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA????????
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC
ATCGATAG
TAGCTATC
5’-UACGAUCGATCGATCG
A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC
ATCGATAG
TAGCTATC
5’-UACGAUCGAUCGATCG
A Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUAA Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUA
LAGGING strandLAGGING strand
AUCGAUAC
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCGATCG!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTAGCTAGC
ATCGATAG
TAGCTATC
Síntese da LEADING strand Síntese da LEADING strand
UMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃOUMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃO
UACGAUCGAU
...3’- ATGCTAGCTAGCTAGC
...5’- TACGATCGATCGATCG
ATCGATCGAT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!TAGCTAGCTA
ATCGATAG
TAGCTATC
Síntese da LAGGING strandSíntese da LAGGING strand
UAGCUAGC
-Vários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃOVários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃO
- Remoção dos PRIMERsRemoção dos PRIMERs
- Ligação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKILigação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKI
ATCGTTTCGCGTCTATCTGCTGCTGCTCTTATATCGATAG
TAGCTATCTAGCTATC
ATCTAG
UAGCUAG
REPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUAREPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUA (O filme)(O filme)
REPLICAÇÃO EM PROCARIOTASREPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS
DNA POLIMERASES em DNA POLIMERASES em E.coliE.coli
- DNA pol I – DNA pol I – REPAROREPARO (tbém auxiliar na (tbém auxiliar na ReplicaçãoReplicação))
- DNA pol II - DNA pol II - REPAROREPARO
- DNA pol III – DNA pol III – É A REPLICASEÉ A REPLICASE!!!!!!!!
- Apenas a Apenas a I e III são ESSENCIAISI e III são ESSENCIAIS
PROPRIEDADES DAS DNA pol de PROPRIEDADES DAS DNA pol de E.coliE.coli
II IIII IIIIII
-Polimerização 5’>3’Polimerização 5’>3’ ++ ++ ++
-Atividade exonucleaseAtividade exonuclease-3’>5’3’>5’ ++ ++ ++
-5’>3’5’>3’ ++ -- --
-Taxa de síntese por segTaxa de síntese por seg 600600 ,, 30.00030.000
-Moléculas por célulaMoléculas por célula 400400 ,, 10-2010-20
“PROOFREADING”
(3’ > 5’ EXONUCLEASE)
DNA pol I (DNA pol I (E.coliE.coli))
Primeira DNA pol caracterizada
Polipeptídeo único: 104 kDa
Clivagem gera dois produtos: 68kDa e 35 kDa
Klenow fragment (68kDa): polimerase, exo 3’ > 5’
Fragmento de 35kDa: atividade 5’ > 3’ exonuclease
Capaz de iniciar a síntese em “NICKs”(única)
Funções – -Reparo (Nick translation)
-Termina a síntese da “lagging strand”
NICK TRANSLATIONNICK TRANSLATION
DNA pol III (Replicase de DNA pol III (Replicase de E.coliE.coli))
Complexo enzimático (várias subunidades)Complexo enzimático (várias subunidades)
Atividade polimerase e 3’ > 5’ exonucleaseAtividade polimerase e 3’ > 5’ exonuclease
Síntese da Síntese da leading e lagging strandsleading e lagging strands
Fidelidade: 10Fidelidade: 10-8-8 - 10 - 10-10 -10 (1 erro/genoma/1000 ciclos)(1 erro/genoma/1000 ciclos)
Proofreading-Proofreading- aumenta fidelidade 10 a 200 vezes aumenta fidelidade 10 a 200 vezes
Síntese: 800 a 1000 nt/sSíntese: 800 a 1000 nt/s
ETAPAS da REPLICAÇÃOETAPAS da REPLICAÇÃO
1. INICIAÇÃO 1. INICIAÇÃO
PrimossomaPrimossoma
2. ELONGAÇÃO 2. ELONGAÇÃO
ReplissomaReplissoma
3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO
REPLICON: A UNIDADE DE REPLICAÇÃO
Inicia na ORIGEM - termina no TERminador
BACTÉRIAS: um ÚNICO REPLICON (4.000 kb)
REPLICAÇÃO: 46’
ORI: 245 bp
Contém 3 (13bp repeats), 4 (9bp repeats)
Sítios p/ ligação da proteína DnaA
ORIgem em E.coli -245 bpORIgem em E.coli -245 bp
-Três 13mer repeatsTrês 13mer repeats
- Quatro 9mer repeatsQuatro 9mer repeats
Pré-INICIAÇÃO em E.coliPré-INICIAÇÃO em E.coli
-DnaA liga-se nos 9merDnaA liga-se nos 9mer
- Multimerização da DnaAMultimerização da DnaAForma agregados e flexionamForma agregados e flexionamO DNAO DNA
Separação das cadeiasSeparação das cadeiasInicia nos 13mersInicia nos 13mers
-DnaB+DnaC juntam-seDnaB+DnaC juntam-seAo complexo e formam oAo complexo e formam oComplexo de iniciaçãoComplexo de iniciação
-DnaB – helicaseDnaB – helicase-DnaC- liga-se na DnaBDnaC- liga-se na DnaB
FUNÇÕES NO REPLICATION FORKFUNÇÕES NO REPLICATION FORK
FunçãoFunção E.coliE.coli
HelicaseHelicase DnaBDnaB
PrimasePrimase DnaGDnaG
ClampClamp subunit subunit
CatáliseCatálise Pol IIIPol III
Remoção do PrimerRemoção do PrimerE substituição por DNAE substituição por DNA Pol IPol I
Ligação dos OkazakiLigação dos Okazaki LigaseLigase
Helicase
Primase
DNApol III
SSB
DNApol I
REPLICAÇÃO EM EUCARIOTASREPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS
EUCARIOTASEUCARIOTAS
Múltiplos REPLICONSMúltiplos REPLICONS
YEAST (40kb), mamíferos (100kb)YEAST (40kb), mamíferos (100kb)
ORI? Terminador?ORI? Terminador?
Iniciam na fase S Iniciam na fase S
Síntese (2000bp/min x 50.000/min em Síntese (2000bp/min x 50.000/min em E.coliE.coli))
Síntese não é simultâneaSíntese não é simultânea
Replicação completa em 6 horasReplicação completa em 6 horas
DNA pol de EUCARIOTASDNA pol de EUCARIOTAS
Pol Pol - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg
Pol Pol - Reparo - Reparo
Pol Pol - Replicase (Ld & Lg) - Replicase (Ld & Lg)
Pol Pol - Replicação do DNA mitocondrial - Replicação do DNA mitocondrial
Pol Pol - Reparo - Reparo
PROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTASPROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTAS
-Polimerização 5’>3’Polimerização 5’>3’ ++ ++ ++ ++ ++
-Atividade exo 3’>5’Atividade exo 3’>5’ -- -- ++ ++ ++
-Atividade PRIMASE -Atividade PRIMASE ++ -- -- -- --
- Localização- Localização NN NN MM NN NN
FUNÇÕES NO REPLICATION FORKFUNÇÕES NO REPLICATION FORK
FunçãoFunção E.coliE.coli Hela cellsHela cells
HelicaseHelicase DnaBDnaB ??
PrimasePrimase DnaGDnaG Pol alfa/primasePol alfa/primase
ClampClamp subunit subunit PCNAPCNA
CatáliseCatálise Pol IIIPol III Pol Pol
Remoção do PrimerRemoção do Primer Pol IPol I MF1MF1
Ligação dos OkazakiLigação dos Okazaki LigaseLigase Ligase ILigase I
As DNA pol PRECISAM de Primer!!!!As DNA pol PRECISAM de Primer!!!!
PRIMERS utilizados pelas DNA PolPRIMERS utilizados pelas DNA Pol
Primer de RNA (replicação procariotas/eucariotas)
O próprio DNA-OH (reparo, alguns vírus)
Proteína (alguns vírus)
Primer de RNAPrimer de RNA(replicação Euc + Proc)(replicação Euc + Proc)
Primer de DNAPrimer de DNANick + parvovírusNick + parvovírus
Proteína -0H - AdenovírusProteína -0H - Adenovírus
MUTAÇÕES (definição)MUTAÇÕES (definição)
Origem:Origem:
1.1. Erros da Polimerase durante a REPLICAÇÃOErros da Polimerase durante a REPLICAÇÃO
2.2. Erros da Polimerase durante o REPAROErros da Polimerase durante o REPARO
3. Lesões (cross-link) durante a interfase3. Lesões (cross-link) durante a interfase
Mutações em ponto, deleções e inserçõesMutações em ponto, deleções e inserções
Podem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do localPodem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do local
Em células somáticas: podem levar a neoplasias!Em células somáticas: podem levar a neoplasias!
MUTAÇÕES EM PONTO:MUTAÇÕES EM PONTO:
1.1. De acordo com a troca de base:De acordo com a troca de base:Transições ou TransversõesTransições ou Transversões
2. De acordo com o efeito:2. De acordo com o efeito:- Silenciosa (mesmo a.a) - Silenciosa (mesmo a.a) - “Missense” (a.a. diferente)- “Missense” (a.a. diferente)- “Nonsense” (stop codon)- “Nonsense” (stop codon)
Não altera a fase de leituraNão altera a fase de leitura2. Inserção2. Inserção
3. Deleção3. Deleção
Alteram a fase de leitura (frameshift)Alteram a fase de leitura (frameshift)
BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR
Aula 7Aula 7
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