UMIVERDIDADE DE SAO PAULO FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE ANALISES CLNICAS E TOXICOLGICAS LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNSTICO

Apostila de noes de Biologia molecular

Prof. Dr. Mario H. Hirata Profa. Dra Rosrio D. C., Hirata

1999

NDICE Tpico Pgina

Aula nmero 1: Introduo........................................................................................................................................ 2 Estrutura do DNA e RNA...................................................................................................................... 2 Replicao, transcrio e traduo...................................................................................................... 4 Organizao do genoma de eucariotos, procariotos e viral................................................................. 7 Enzimas de restrio e suas aplicaes.............................................................................................. 10 Aula nmero 2: Extrao do DNA genmico .......................................................................................................... 13 Aula nmero 3: Princpios de eletroforese............................................................................................................. Fatores que influenciam na eletroforese....................................................................................... Tipos de suporte............................................................................................................................ Tipos de eletroforese.................................................................................................................... Aplicaes da eletroforese nas tcnicas moleculares................................................................... Aula nmero 4: Reao de polimerizao em cadeia (PCR).................................................................................. Princpios da reao de PCR.............................................................................................................. Protocolo geral para PCR.................................................................................................................... Fatores que influenciam na PCR......................................................................................................... Escolha de iniciadores para PCR........................................................................................................ Aula nmero 5: PCR no Diagnstico das Doenas genticas................................................................................. Polimorfismo e mutaes.................................................................................................................... Diagnstico de alguns polimorfismos por PCR................................................................................... Polimorfismo de apolipoprotena......................................................................................................... Polimorfismo de receptores da LDL.................................................................................................... 19 20 22 22 23 28 28 31 31 35 39 39 41 42 44

Aula nmero 6: PCR no diagnstico de Doenas infecto-contagiosas ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 46 Meningites bacterianas---------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 Tuberculose-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 Infeco pelo virus da Hepatite C---------------------------------------------------------------------------------------- 59 Infeco pelo virus HIV----------------------------------------------------------------------------------------------------- 64 Aula nmero 7: PCR e RFLP na identificao de indivduos.................................................................................. 68

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APLICAO DA PCR EM LABORATRIO CLNICO E MEDICINA FORENSE Aula nmero 1 Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

INTRODUOOs avanos nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente

para o entendimento da etiologia das doenas humanas. As tcnicas de recombinao dos cidos nucleicos tm permitido aos pesquisadores identificar os vrios genes responsveis por doenas hereditrias, avaliar os mecanismos de infeco dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciao e proliferao celular (principalmente nos processos neoplsicos), entre outros. A biologia molecular vem tambm apresentando aplicao bastante expressiva na pesquisa de marcadores genticos teis no diagnstico laboratorial. Por outro lado, as diferenas nas sequncias do DNA, observadas entre as espcies ou entre os indivduos, so extremamente teis para as anlises forenses, os testes de paternidade, a identificao de antgenos de histo-compatibilidade, a identificao de allelos mutantes, a identificao de gneros e espcies de bactrias, fungos, leveduras, vrus e outros. Nesta apostila sero abordados os princpios bsicos de biologia molecular, bem como sero descritas as aplicaes da tcnica de PCR no diagnstico clnico e nos testes de identificao.

ESTRUTURA DOS CIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)As informaes genticas so armazenadas nos cidos nucleicos. H dois tipos de cidos

nucleicos: cido desoxiribonucleico (DNA) e cido ribonucleico (RNA). O DNA encontrado principalmente nos cromossomos no ncleo das clulas, enquanto RNA est presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos. Os cidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotdeos. Cada nucleotdeo constituido por uma base nitrogenada, uma molcula de acar e um grupamento de fosfato (PO4 =). H dois tipos de acar nos cidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas so as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contm A, C, G e T, enquanto que o RNA contm U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotdeos esto ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotdica. Essa cadeia formada por ligaes entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotdeo e o carbono 3 do acar do nucleotdeo adjacente (Figura 1B). Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotdica simples, enquanto que o DNA composto de duas cadeias polinucleotdicas pareadas, dispostas em direo contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligaes covalentes do esqueleto de acar-fosfato localizam-se na parte 3

externa da estrutura e as bases nitrogenadas esto projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molcula de DNA segue uma sequncia em que cada base de uma cadeia pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hlice, onde o ngulo e a distncia entre um nucleotdeo e outro sempre constante.

(A) 5 fosfatoC 2O H H5 4

(B) 3 hidroxilaOHA

O

O H1

P

CH2

O

3

2

T

O H

OPCH2

CH2

2-deoxiriboseOC 2O H H5 4

P

G

C

O

O H1

O

CH2P

P3 2

O H

O H

CH2

riboseP

O

T

A

O

CH2

P

(C)HCH3 H N O(p a ra a c a d e ia )

CH2

O

C

G

O

CH2P

O H N H

N N H

N N

H H

H

NN N O

H H

ON

N N

H

OH

3 hidroxila

5 fosfato

(p a ra a c a de ia )

H N

(p a ra a c a d e ia )

(p a ra a ca d e ia)

T im ina

A d e n in a

C ito s ina

G uan in a

Figura 1. Caractersticas estruturais das molculas dos cidos nucleicos. (A) Molcula do acar. (B) Representao diagramtica do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotdicas do DNA. P representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molcula de DNA mostrando as pontes de hidrognio.

E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molcula de DNA a relao entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espcies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina igual da pirimidina citosina. Essa caracterstica importante definida pela propriedade fisico-qumica das molculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (fora de atrao de Van Der Waals), somada fora de atrao entre os tomos de cargas opostas (ligaes inicas ou pontes de hidrognio). Essas propriedades so bastante especficas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultnea com significante energia de interao, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interao das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. 4

importante salientar que a ligao entre a A e T ou U ocorre por interao de 2 pontes de hidrognio, enquanto que entre a C e a G a ligao se d por 3 pontes de hidrognio (ligao mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequncia de uma das cadeias polinucleotdicas do DNA complementar a outra (cadeia complementar). A estrutura secundria de dupla hlice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, est disposta linearmente. Entretanto, pode ser tambm circular como nas bactrias, plasmdeos e certos vrus, e pode ser tambm de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposio da molcula de DNA nos organismos superiores de particular importncia, onde a informao gentica est amplamente concentrada nos cromossomas dentro do ncleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA compactado na forma super-enrolada em vrios nveis: primrio, duplex; secundrio, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; tercirio, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternria, formando voltas ou loops. Esta disposio super-enrolada a forma natural do DNA.

Propriedades dos cidos nucleicosOs cidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos fsicos e qumicos. Em condies fisiolgicas, a estrutura de dupla hlice do DNA bastante estvel. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociao, desnaturao ou melting. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condies de associao (temperatura a 65C, ou pH prximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenmeno de associao tambm denominado de renaturao, hibridizao ou annealing. Esses processos de desnaturao e renaturao so essenciais para manipulao dos cidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparao e identificao desses compostos. Outra propriedade fsica muito importante dos cidos nucleicos a sua capacidade de absorver energia na regio do ultravioleta, apresentando o pico de absorbncia mxima em 260 nm. Esta propriedade til tanto para a quantificao quanto para avaliar a pureza dessas substncias.

REPLICAO, TRANSCRIO E TRADUO

ReplicaoToda vez que uma clula se divide, todo o seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo em absoluto as informaes genticas contidas na clula precursora, esse processo denominase replicao. A replicao ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA 5

de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a sntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicao ocorrer necessrio que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse um processo energeticamente desfavorvel e ocorre com a ao conjunta de uma proteina DNA-especfica e vrias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, ento, de forma independente e separada. A replicao pode ter incio em vrios stios, mas cada origem de replicao utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha sintetizada pela ao catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direo de 5' para 3', a sntese de uma das cadeias complementares realizada de forma contnua enquanto que a outra sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontnua so ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e manuteno da integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem tambm, alm da funo de sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica ou "a correo de leitura" na qual os nucleotdeos incorretamente incorporados so removidos. Essa propriedade fundamental para a manuteno a integridade da sequncia original.

Figura 2. Representao da molcula de DNA durante a replicao: as duas cadeias precursoras so separadas e as cadeias complementares que so sintetizadas.

TranscrioA sntese protica no resultante da leitura direta da sequncia nucleotdica do DNA. Sabemos que o DNA est localizado no cromossoma do ncleo da clula e a sntese protica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informaes genticas contidas na sequncia nucleotdica do DNA tm que ser transferidas para uma molcula intermediria que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, ento, a sntese da proteina. O processo de sntese de mRNA conhecido por transcrio e o tamanho da molcula de mRNA definido pela sequncia de aminocidos que o cido nucleico codifica. Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de mRNA para cada gene. A indicao de qual fita do DNA deve ser transcrita orientada por uma sequncia especfica denominada promotor, localizada antes (upstream) da sequncia a ser transcrita, que reconhecida pela 6

RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao ocorre na direo 5 - 3. Isto significa que cada molcula de mRNA ser identica sequncia nucleotdica da fita de DNA que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (RNA ribossmico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a sntese protica. O material gentico de certos virus (retrovirus) o RNA e a informao gentica segue, portanto, a direo reversa (de RNA para DNA). Este processo conhecido por transcrio reversa, na qual a sintese de DNA dirigida pelo RNA e a enzima responsvel denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos retrovrus.

TraduoA relao entre a sequncia de nucleotdeos do DNA e a sequncia de aminocidos da proteina correspondente denominada cdigo gentico. Esse cdigo universal e encontrado em todos os organismos vivos. O cdigo gentico lido em grupos de trs nucleotdeos, cada um codificando um aminocido (Tabela 1). Cada sequncia de trinucleotdeo denominada codon e a sequncia de condons que codifica um polipeptdeo especfico denominada cistron.

Tabela 1. O cdigo gentico1a.base(5) U Phe Phe Leu Leu C Leu Leu Leu Leu A Isoleu Isoleu Isoleu Met* G Val Val Val Val * codon de iniciao U C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Treo Treo Treo Treo Ala Ala Ala Ala 2a. base A Tir Tir Terminao Terminao His His Glu Glu Asp Asp Lis Lis AcAsp AcAsp AcGlu AcGlu 3a.base (3) G Cis Cis Terminao Trip Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gli Gli Gli Gli U C A G U C A G U C A G U C A G

O processo de decodificao pelo qual a informao gentica presente na molcula de mRNA dirige a sntese proteica denominado traduo. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferncia ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotdeos em comprimento e de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molcula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotdeo de sequncia varivel forma o anti-codon que pode parear com um codon da molcula de mRNA. Na outra extremidade da molcula de tRNA est uma 7

sequncia para ligao a um aminocido especfico. Portanto, um codon particular no mRNA relacionado atravs de um tRNA a um dado aminocido. Na traduo, o ribossoma liga-se primeiramente a um stio especfico na molcula de mRNA (codon de iniciao, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, ento, se movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminocios ao final da cadeia polipeptdica em alongamento. A traduo finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminao ("stop codon"). A direo da leitura de 5-3, sendo que a sequncia de nucleotdeos da fita de DNA corresponde sequncia de aminocidos da proteina traduzida na direo do N-terminal para o C-terminal. Em princpio as sequncias de bases nos cidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificao se inicia. Para uma dada sequncia UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as trs fases de leitura possveis so : UUA GCA AAG CUG CGA A UAG CAA AGC UGC GAA U AGC AAA GCU GCG AAU G Entretanto, o cdigo gentico no se sobrepe, pois a fase de leitura ditada pelas sequncias de iniciao e de terminao da traduo presentes na molcula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por mutaes que removem ou inserem bases na sequncia nucleotdica. Esse tipo de alterao conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da funo da proteina produzida.

F x d ino m og n t ainr c lu r lu o a f r a e ic t a e laR p a eTa s rc e lic o r n c i o d RA o N

Ta s r r n ci o

Rp a e lic o

DA N

RA N

Poe a r t in s Ta u r do

Ta s r r v r a r n ci o e es

ORGANIZAO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL

Estrutura GnicaOs cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequncia de nucleotdeos na qual esto dispostos muitos genes. O gene uma unidade de herana constituida por uma sequncia nucleotdeos que carrega as informaes necessrias para a sntese de um dado polipeptdeo. O gene uma entidade estvel mas pode sofrer mutaes, sendo que a nova forma do gene herdada de modo estvel, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que determinam a expresso de alguma caracterstica particular. 8

Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genmico no totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplide (gamtico) humano compreende 3 x 106 kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milho de genes, mas somente 3000 locos de doena foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as caractersticas normais como altura e inteligncia, uma grande poro do DNA genmico no tem funo definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funes importantes, incluindo o controle de ao gnica. Genes que so responsveis pela sntese de enzimas especficas ou peptdeos so denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais.

Controle da expresso gnicaNas clulas existem mecanismos moleculares que controlam o nmero e a quantidade das proteinas produzidas. As diferenas na sntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as molculas de mRNA so transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional)

Processamento ps-transcricional do mRNAA transcrio e a traduo nos procariotos so processos concomitantes mas nos eucariotos so processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrio ocorre no ncleo e a traduo no citoplasma. Durante a passagem do ncleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. Nos procariotos, a sequncia de nucleotdeos do gene colinear com a sequncia de aminocidos de uma dada protena, entretanto, nos eucariotos a sequncia codificante geralmente interrompida por sequncias adicionais. A maioria dos genes dos eucariotos so compostos por regies codificadoras denominadas exons e regies no-codificadoras denominadas introns. Estes introns so sequncias posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primrio. Esse processo denominado processamento do RNA ou RNA splicing. Aps a remoo dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequncia AAUAAA extremidade 3 do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucariticos possuem 100 a 200 resduos de adeninas ligadas extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoo dos introns, o mRNA sofre a adio de resduos de 7-metilguanosina (Caps) na extremidade 5, denominada metilao Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molcula mais estvel e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutaes que ocorrem nas regies de juno dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma protena diferente da original. Alguns genes complexos tem molculas de mRNA muito grandes, que so processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que so traduzidos em polipeptdeos diferentes. Esse processo denominado processamento alternativo (alternative splicing) e ocorre no mesmo tecido 9

mas em diferentes estgios de desenvolvimento e diferenciao e pode tambm ocorrer em diferentes tecidos.

Estrutura gnica dos procariotosExistem regies especficas no DNA, denominadas promotores que identificam o stio de incio da transcrio do RNA (regio na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio). Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metablica so adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequncias regulatrias. Este conjunto denominado operon, sendo que a sequncia que regula a expresso desses genes denominada operador. O operador encontra-se antes (upstream) da sequncia do promotor, nas posies de -35 a -10 antes do incio da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulao destes operons obedece a condies nutricionais ou ambientais. O estmulo da expresso de uma enzima em resposta presena de um substrato particular denominada induo. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrlise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presena de lactose (indutor) induz a sntese de -galactosidase por ativao do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligao da RNA polimerase ao DNA e a taxa de sntese do mRNA da -galactosidase. Na ausncia do indutor o operon reprimido pela ao do repressor. O repressor liga-se a uma sequncia especifica no operador, bloqueando a ligao da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a sntese de mRNA que codifica para a galactosidase.

Estrutura gnica dos eucariotosOs promotores dos eucariotos so elementos que sinalizam o stio onde a transcrio deve iniciarse e, possivelmente, controlam o nvel de expresso do gene associado. Geralmente esto localizados cerca de 30 bases upstream do codon de iniciao (ATG) e ompreendemsquencias denominadas boxes ou motifs. As mais frequentes so as TATA, CAT e CG boxes. Alm dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequncias regulatrias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, upstream ou downstream) e que potenciam a taxa de transcrio. importante salientar que estes amplificadores no so especficos e potenciam a transcrio de qualquer promotor que estiver na sua vizinhana. A eficincia da expresso de um gene em um tecido especfico depende da adequada combinao e integrao dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes. O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que so replicas de genes ativos mas no produzem um produto reconhecvel, geralmente ocorrem devido a mutaes acumuladas no gene. Transposons so elementos genticos mveis que se deslocam de uma regio para outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localizao destes segmentos de DNA no genoma instvel. Estes transposons contm os genes que codificam para as enzimas necessrias 10

sua insero e para remobilizao para outro stio. Geralmente, a insero de um transposon produz mutao ou rearranjo cromossmico varivel que abole a funo do gene que recebe esse elemento mvel. Polimorfismo de DNA A anlise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequncias entre os indivduos. Mini e microsatlites so sequncias curtas, repetidas consecutivamente, que esto distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instveis durante a replicao do DNA de gerao para gerao. A consequncia que o nmero de repeties dentro de uma sequncia varia largamente entre os indivduos. Em funo dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivduo, exceto gmeos idnticos, ter um padro ou perfil de DNA pessoal (Fingerprinting). Esses perfis so usados para estabelecer a identidade dos indivduos em diversas situaes. As sequncias de microsatlites mais comuns no DNA humano so CA ou GT, dependendo de qual das fitas de DNA est sendo lida, pois h milhares dessas sequncias espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetio pode ser muito varivel e pode fornecer excelentes marcadores genticos para estudar o comportamento fenotpido das famlias. A maioria dessas sequncias repetitivas no produz efeito deletrio, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a sndrome do X frgil, causada pela expanso de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repeties. Verificou-se tambm que disturbios neurolgicos na distrofia miotnica e na doena de Huntington, esto associados a alteraes no tamanho dos microsattiles. Esta descoberta forneceu a base cientfica para o fenmeno de antecipao no qual os disturbios genticos tornam-se mais severos nas geraes subsequentes.

IMPORTNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULARMuitas enzimas que atuam na replicao e transcrio tem sido purificadas e a sua atividade

biolgica usada in vitro para reaes moleculares especficas diretas. A maioria dessas enzimas isolada de bactrias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas so utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificao de genes de interesse, preparo de sondas de cidos nucleicos, ensaios de hibridizao, entre outras aplicaes. As nucleases representam uma categoria de enzimas especficas de cidos nucleicos que hidrolizam as ligaes fosfo-diester dos polmeros de cidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligaes internas (endonucleases). As nucleases podem ser especficas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-especficas podem catalizar apenas cadeias nicas (por exemplo, a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). As endonucleases de restrio so nucleases encontradas naturalmente em bactrias e so denominadas enzimas de restrio porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do 11

hospedeiro no atacado porque os stios vulnerveis a suas prprias enzimas so protegidos por um processo denominado metilao do DNA. Cada enzima designada de acordo com o organismo do qual derivada. A EcoRI, por exemplo, uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrio reconhecem sequncias de 4, 5 ou 6 nucletdeos. Muito poucas reconhecem sequncias maiores. Algumas so denominadas isosquisomeros, por clivar em diferentes stios dentro de uma mesma sequncia (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo stio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas reconhecem diferentes sequncias com o mesmo stio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada regio da molcula de DNA onde a sequncia especfica ocorre, a enzima de restrio corta ambas as cadeias de forma reprodutvel, formando extremidades assimtricas ou coesivas (stick-end) ou simtricas ou cegas (blunted-end). Estas enzimas so utilissmas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicao, catalizam a formao de ligaes fosfo-diester entre dois segmentos de cidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presena de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases no tem essa exigncia para o processamento do mRNA. As Polimerases catalizam a sntese do polmero de cido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas so fundamentais para a clonagem e ampificao de genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, uma enzima extremamente til para a amplificao do DNA in vitro pela reao de polimerizao em cadeia (PCR). A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovrus, cataliza a sntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos vrus, mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrio reversa constitui-se um mtodo til para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biolgicas utilizando esse mtodo..

Enzimas de restrio e suas aplicaesTecnologia de DNA recombinante Como vimos, as endonucleases de restrio so enzimas que clivam a molcula de DNA em stios sequncia-especficos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutvel podem ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molcula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo molculas de DNA recombinado biologicamente funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinao foram utilizados os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos so pequenos pedaos de DNA circular extracromossmicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactrias e se replicam independentemente do DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o plasmdeo pode ser aberto e um fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ao de uma DNA ligase, produzindo um plasmdeo 12

recombinate. Os plasmdeos fornecem veculos teis para carregar fragmentos de DNA ou genes e, quando transfectados em bactrias (usualmente Escherichia coli), podem produzir clones que ao serem replicados in vivo, produziro cpias mltiplas do fragmento de DNA incorporado. Identificao de genes O DNA extrado de um fragmento de tecido, de leuccitos ou de clulas do lquido amnitico, contm milhares de genes, embora em algumas clulas muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e somente relativamente poucos estejam ativos. A identificao de um gene ou sequncia nucleotdica especifica em todo esse DNA pode ser realizada atravs do mtodo de Southern blot (E.M. Southern, 1975). Nesse mtodo, as enzimas de restrio so utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos resultantes so separados por eletroforese e identificados por hibridizao de cidos nucleicos, utilizando uma sequncia de nucleotdeos especfica (sonda gentica) que capaz de reconhecer o gene de interesse. Polimorfismo de restrio Em muitas doenas, o defeito gentico desconhecido e a produo de sondas gene-especficas muito difcil ou no possvel. Entretanto, o gene produtor da doena pode estar muito proximo (ligado) a um stio de reconhecimento de uma enzima de restrio particular. Sabe-se que variaes nas sequncias de DNA ocorrem aleatoriamente atravs do genoma inteiro e no esto associados a uma doena especfica. Estas variaes (alteraes de bases) resultam na perda de um stio de restrio existente ou de aquisio de um novo sitio. Tais alteraes nas sequncias de DNA significam que os fragmentos, produzidos por uma enzima de restrio particular, tero diferentes comprimentos entre diferentes indivduos e podem ser reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese. Eles so denominados polimorfismos de tamanho de fragmento de restrio (RFLP) e so herdados como caractersticas genticas simples obedecendo as leis mendelianas de herana. detectar o gene defeituoso sem efetivamente conhece-lo. Literatura recomendada Emery, A.E. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine, 2a. Ed., 1995, A.E.H Emery & S. Malcon, eds., Johon Wiley & Sons Ltda, Chichester, England, 206 pg. Lewin, B. Genes V., B. Lewin, ed., 1994, Oxford University Press, New York, USA, 1272 pg. Strachan, T. Human molecular Genetics. T. Strachan & A.P.Read, eds., 1996, Bios Scientific Publications Ltd., Oxford, UK, 596 pg. Watson, J. Recombinant DNA, 2a. Ed., J. Watson, M. Gilman, J. Witkowrk, M. Zoller, 1992, Scientific American Inc., New York, USA, 626 pg. Se for demonstrado, em estudos de famlias, que um gene produtor de doena est ligado a um RFLP, este pode, ento, fornecer um meio de

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Aula nmero 2

EXTRAO DE DNA GENMICOProfa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Marcos de Oliveira Machado

INTRODUOO potencial de aplicaes das tcnicas de DNA recombinante em laboratrios de Bioqumica Clnica

esto se tornando altamente evidentes, especialmente para a anlise do diagnstico das vrias doenas genticas e de outras mais. Correntemente, as anlises de DNA para o diagnstico esto disponveis somente para algumas desordens genticas, mas o campo de estudo est rapidamente se expandindo e novas anlises esto sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnstico envolve a extrao de DNA dos leuccitos humanos. Tradicionalmente essas tcnicas de extrao consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos mtodos populares para esse fim, envolve digesto com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (10-15 ml), ou utilizam solventes orgnicos como o fenol, clorofrmio e lcool isoamlico, os quais so altamente txicos. Embora esses mtodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferncia dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vrios filtros comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferncia cruzadas de amostras ou a introduo de contaminantes. Tais tcnicas no so bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratrios clnicos. Portanto, um mtodo simples, rpido e econmico necessrio para a introduo das anlises de DNA nos laboratrios de Bioqumica Clnica. Os estudos de ligao gentica utilizando a tcnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrio (RFLP), a reao em cadeia da polimerase (PCR), a tcnica de transferncia de DNA (Southern blot), e outras, necessitam que o DNA extrado esteja em boas condies de uso; ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reao. O uso da tcnica de precipitao salina para a extrao de DNA utilizando como detergente o Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgnicos e o alto custo e demorada digesto da proteinase K. Esta tcnica envolve a desidratao e precipitao das protenas celulares com soluo de cloreto de sdio concentrada. O DNA extrado fica livre de RNA, de protenas e da degradao de enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extrado muito boa comparada com as outras tcnicas de extrao. O DNA apropiado para as tcnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digesto com enzimas de restrio.

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PREPARAO E ANLISE DE CIDOS NUCLEICOSOs mtodos de isolamento e purificao dos cidos nucleicos consistem de trs etapas: (1) lise das

clulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mdodo enzimtico ou qumico para remover as protenas contaminantes e outras macromolculas; e (3) precipitao alcolica para isolamento do DNA. Os protocolos bsicos geralmente so aplicveis a um ampla variedade de materiais.

1. Isolamento de DNA genmico de tecidos e clulas:O mtodo bsico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o detergente inico SDS, extrao fenlica das proteinas e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo til para preparao de DNA genmico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mnimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genmico produzido adequado para amplificao por PCR ou para a disgesto com enzimas de restrio e anlise de transferncia de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genmico, o que dificulta a quantificao por espectroscopia no UV. Algumas amostras de DNA no amplificam bem por PCR ou no so completamente digeridas com enzimas de restrico e devem, portanto, ser reextraidas. Outro mtodo compreende a solubilizao dos tecidos ou clulas com SDS, que inativa as DNAses endgenas. A proteinase K usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digesto com Rnase para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princpio anterior. Este mtodo adequado para extrair DNA genmico para anlise de DNA por Southern blot ou construo de bibliotecas genmicas. Porm no adequado para extrair DNA de tecidos pois no h etapa de ruptura do tecido conectivo.. O protocolo mais adequado rotina laboratorial para avaliao de polimorfismos e mutaes genticas compreende a lise celular com SDS, remoo das proteinas por precipitao com cloreto de sdio concentrado (salting-out) e isolamento do DNA genmico por precipitao etanlica.

2. Isolamento de RNA de clulas ou de amostras biolgicasA maioria dos procedimentos de purificao e concentrao de RNA so semelhantes aos utilizados na purificao de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitao do RNA. essencial que toda gua usada diretamente ou nos tampes seja tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases. O mtodo mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilizao simultanea do tecido ou clulas e inativao de Rnases endgenas na presena de isotiocianato de guanidina, com subsequente separao do RNA do DNA e das protenas por ultracentrifugao em gradiente de cloreto de csio. Dois outros mtodos que no requerem ultracentrifugao podem se utilizados: (1) lise com detergente no-inico para proporcionar um mtodo rpido para preparao de amostras de RNA citoplasmtico e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoo das proteinas pela extrao fenlica em pH cido, seguida de precipitao do RNA. O segundo mtodo frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biolgicas 15

Outros mtodos de isolamento e identificao do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separao eletrofortica do RNA em gel de agarose contendo formaldeido para deteco e quantificao de espcies especficas de RNA por Northern blotting e hibridizao; entre outros.

3. Isolamento de DNA genmico de bactriasAs bactrias de uma cultura lquida saturada so lisadas e as proteinas removidas por digesto com proteinase K. Os debris de parede celular, polissacardeos e as proteinas remanescentes so removidas pela extrao fenlica e o DNA genmico recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaao com etanol.

PURIFICAO E CONCENTRAO DE DNA DE SOLUES AQUOSASOs procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir solues aquosas so teis quando

proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando solues de DNA necessitam ser concentradas. O protocolo bsico apropriado para purificao de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml.

1. Extrao fenlica e precipitao etanlicaUm dos mtodos mais teis e usados para isolamento e concentrao de cidos nucleicos de solues aquosas a extrao com fenol/clorofrmio seguida de precipitao com etanol. Durante a extrao orgnica, as proteinas contaminantes so denaturadas e mantidas na fase orgnica ou na interface entre as fases orgnica e aquosa, enquanto que os cidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol danifiquem os cidos nucleicos. Alcool amlico frequentemente adicionado mistura fenol/clorofrmio quando ocorre a formao excessiva de espuma durante a extrao. Durante a precipitao com etanol, os sais e outros solutos como os resduos da extrao fenol/clorofrmio permanecem em soluo enquanto os cidos nucleicos formam um precipitado que pode ser facilmente separado por centrifugao. Na presena de altas concentraes de ctions monovalentes (0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transio estrutural nas molculas de cido nucleico promovendo a agregao e precipitao das mesmas. Entretanto, como vrios sais e pequenas molculas orgnicas so solveis em etanol a 70%, a precipitao etanlica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora cloreto de sdio, acetado de sdio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitao, mais difcil remover cloreto de sdio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a maioria das aplicaes de rotina deste mtodo o acetato de sdio a 0,3 M (concentrao final), que mais solvel em etanol que cloreto de sdio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitvel com a amostra de cido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sdio (SDS), o sal recomendado cloreto de sdio 0.2 M, pois o SDS solvel em etanol nessas condies. Solues de DNA diludas: quando solues de DNA esto diluidas (< 10 g/mL) ou quando menos que 1 g de DNA est presente, deve-se aumentar a proporo de etanol para o volume aquoso 16

(3:1) e aumentar o tempo de precipitao (4 a 16 horas), incubando-se a -20 oC (ou em gelo seco). A centrifugao para separao do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o mximo de recuperao do DNA dessas solues. Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um cido nucleico carreador, como o tRNA de E. coli, levedura ou fgado bovino, em concentraes de 10 g/mL. Nessa condio o DNA coprecipitado com o tRNA. O tRNA no interfere com a maioria das reaes enzimticas, mas ser eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotdeo quinase e no poder ser usado se esta enzima for usada em marcaes subsequentes. Recuperao de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e oligonucleotdeos pode ser aumentada pela adio de cloreto de magnsio a uma concentrao inferior a 10 mM antes da adio do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de solues mais concentradas que 10 mM de ons magnsio ou fosfato so dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitao com etanol. Se a amostra de DNA est em baixa concentrao em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela extrao repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a gua removida com essa extrao, todos os solutos e sais so concentrados com os cidos nucleicos. Aps essa etapa, o cido nucleico deve ser extraido com fenol/clorofrmio e precipitado com etanol. DNA em grandes volumes aquosos: a extrao pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo procedimento. (tubos de poliestireno no resistem a mistura fenol/clorofrmio). As etapas de centrifugao temperatura ambiente no podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5 minutos. O precipitado etanlico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforada por 15 minutos em fotor de angulo fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4oC. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperao de pequenas quantidades de DNA (< 10g). Remoo de oligonucleotdeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotdeos (< 30 bp) e nucleotdeos no incorporados usados na marcao ou outras reaes de modificao do DNA podem ser efetivamente removidos das solues contendo DNA por duas etapas de precipitao com etanol na presena de acetato de amonia. Este procedimento no suficiente para remover completamente grandes quantidades de ligadores (linkers) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia no recomendvel se a amostra de cido nucleico for fosforilada na extremidade 5 pela T4 quinase ou na extremidade 3 com a transferase terminal, pois os ons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas. Variaes do procedimento de precipitao: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se deseja manter mnimo o volume dos cidos nucleicos precipitados. O isopropanol menos voltil que o etanol e , portanto, mais difcil de remover por evaporao. Alguns sais so menos solveis em para eliminar isopropanol, e podem ser precipitados com os cidos nucleicos. recomendado que a precipitao com isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitao onvencional com etanol isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de ltio pode ser usado como o sal de precipitao, pois o cloreto de ltio muito mais solvel no etanol e o precipitado resultante relativamente isento de sal. Cloreto de ltio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a transcrio reversa aps precipitao. Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por duas etapas de precipitao seletiva com cloreto de ltio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitao convencional com etanol. 17

Solues concentradas de cidos nucleicos: se a concentrao de cidos nucleicos muito alta ( > 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitao etanlica. Se um precipitado visvel formado, no necessrio esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar o precipitado por centrifugao.

2. Fracionamento dos cidos nucleicosGeralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento dos cidos nculeicos. Tcnicas cromatogrficas so apropriadas para algumas aplicaes e podem ser usados para separao dos plasmdeos do DNA genmico, bem como separao de DNA genmico dos debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resoluo que mtodos alternativos e geralmente o mtodo de fracionamento de escolha. As separaes eletroforticas podem ser analticas ou preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que 108 Da. Uma variedade de sistemas eletroforticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de variao. Alm disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridizao aps a separarao eletrofortica de uma mistura complexa (Southern blot). Este mtodo tem contribuido grandemente para ao mapeamento e identificao de sequencias de cpia nica ou mltipla em genomas complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.

3. Purificao e isolamento de DNAOs protocolos utilizados para purificao de DNA so geralmente divididos em trs categorias: (1) eluio do DNA de um gel de agarose por dilise, (2) dissoluo do gel de agarose e recuperao do DNA por ligao a partculas de vidro, e (3) eluio pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fuso a 70oC, e recuperao do DNA pela extrao fenlica e precipitao etanlica ou usando uma matrix que liga especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, h vrios sistemas de purificao de fragmentos de DNA no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de cido nucleico que pode ser eficientemente isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgnicos e de outras substncias na eficincia de ligao da matriz; e no tipo de solvente que usado para eluir o oligonucletdeo ou o polinucleotdeo da matriz. Matriz de slica (vidro) - na presena de iodeto de sdio, DNA e RNA ligam-se seletivamente matriz de slica. Outras substncias presentes (sais, solventes, nucleotdeos, proteinas, nucleotdeos etc) so lavados com uma soluo de etanol tamponada. O polinucleotdeo ligado eluido em um reduzido volume de tampo Tris-EDTA (TE) ou gua. Resina de purificao - uma resina de purificao com propriedades similares aos sistemas de matriz de slica (Magic1, Promega). Esta matriz liga polinucleotdeos de dupla fita mais eficientemente que os de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp ou oligonucleotdeos. Adsoro - um sistema de purificao de cidos nucleicos, que contm um adsorvente estvel (NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotdeos contendo menos que 12 resduos. A ligao no afetada por altas concentaes de sais,

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ureia, ou outras substncias, mas inibida por alguns solventes orgnicos. O material no ligado removido com gua e o DNA ou RNA (mas no proteinas) quantitativamente eluido com um solvente alcolico. Gel filtrao - os cidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas de gel filtrao ou colunas de centrifugao (spin columns).

QUANTIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOSA concentrao de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absoro no UV ou a

concentrao de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plstico ou vidro podem ser usadas para a regio do visvel. Um mtodo alternativo o mtodo de placa de brometo de etdio agarose. . Literatura recomendada Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994, Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p. Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

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Aula nmero 3

PRINCPIOS DE ELETROFORESEProf. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

INTRODUOEletroforese uma tcnica de separao que envolve o movimento de partculas com cargas em

soluo, sob ao de um campo eltrico. Portanto, qualquer partcula ou molcula carregada pode se mover nessas condies, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas. A separao eletrofortica das partculas pode ser realizada em meio lquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte. A carga eletrica aplicada sob a soluo realizada atravs de eletrodos que so colocadas na soluo. Um ion migra atravs da soluo na direo ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partcula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partculas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).

PRINCPIOS BSICOS DA ELETROFORESE

Terminologia:nion: partcula carregada negativamente ou on ction: partcula carregada positivamente tampo: Uma mistura de substncias que doam e aceitam proton com a funo de manter a concentrao do proton (pH) constante ou dentro de um valor prximo. Um tampo pode ser feito com uma mistura de um cido fraco com o respectivo sal. Ex: cido actico e acetato de sdio. Condutividade: a propriedade de uma substncia conduzir a corrente eltrica. Numa soluo inica, a soma do produto da concentrao da carga e a mobilidade da mesma. eletrodos: substncias em contato com um condutor. A substncia esto conectadas a fonte eltrica. Fonte eltrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contnua, que possa ser a tenso eltrica (em Volts), a corrente controlada por um potenciometro, que permite variar a tenso, a corrente, a carga eltrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir eltrica(Amperagem), e a potncia eltrica (Watts). eletro-osmose; tendncia da soluo se mover em relao a uma substncias estacionria adjacente, quando uma diferena de potencial aplicada. fora inica: a soma da concentrao de todos ions na soluo, medido pelo quadrado de suas cargas. mobilidade: a velocidade de uma partcula ou ion que dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa de quanto rpido um ions se movimenta em um campo eltrico. 20

Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substncia sob certas condies. Geralmente menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistncia do suporte ou meio. poder de resoluo: E a habilidade de separar substncias que migram muito prximas. gel: uma malha de fibras, ou de polmeros que slida, mas retm uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas.

FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAO E MOBILIDADE ELETROFORTICA

A aplicao de um campo eltrico a uma soluo que contm partculas carregadas pode separlos. A separao depende de vrios fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Fora aplicada nas partculas (voltagem), carga da partcula, pH do meio, condutividade do meio, resistncia da matrix, conformao da partcula, fora inica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc 1. Fora na partcula A fora exercida em uma partcula carregada depende do campo eltrico, voltagem ou volts por centmetro, e a carga da partcula, Q. A fora sob a partcula carregada o produto:

Feletrica=QVA fora eltrica, Feletrica, quando exercida na partcula, causar o seu movimento. No entanto, o movimento da partcula no solvente ser tambm influenciado pela resistncia, devido a viscosidade, a resistncia, a qual exerce uma fora proporcional a velocidade:

Fresistncia= fvA constante de proporcionalidade, f chamada de coeficiente de frico (medida de resistncia de uma partcula oferece quando em movimento em um solvente). 2. Coeficiente de frico depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partcula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimtrica a partcula, menor seu movimento atravs do solvente. O coeficiente de frico de uma grande partcula tais como proteinas uma propriedade caracterstica de cada elemento. 3. Mobilidade da partcula Quando um campo eltrico aplicado em uma partcula carregada, ela inicia a migrao. A fora eletrofortica e a fricional se ope uma a outra, e a velocidade dessa aumenta at as foras se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcana em um campo eltrico, V, determinado por duas propriedades das partculas - sua carga e seu coeficiente de frico. Consequentemente, o valor de v/V tambm uma propriedade caracterstica das partculas e importante o suficiente para receber o seu prprio nome: mobilidade. 4. Efeito do pH do meio 21

Cada on possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a soluo contm uma substncia a qual o pK prximo do pH do meio, esta substncia ocorre em ambas as formas: a carregada e a no carregada. A frao com uma carga ser dependente do pK da substncia e o pH da soluo. Quando o pH igual ao pK de um cido fraco, somente 50% das partculas estaro carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partculas estaro sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substncia varia com o pH, a sua mobilidade efetiva tambm varia com o pH. O pH da soluo escolhido de tal forma, que a partcula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado mximo de carga, para sua mxima separao. Os tampes so substncias inicas por si, portanto, exercem a funo de manterem o pH o mais prximo possvel da ideal e fazem parte do processo. 5. Condutividade e movimento dos ons Em qualquer sistema eltrico, a corrente produzida proporcional a voltagem aplicada;

V = resistncia X Corrente

ou

V =

corrente___ condutividade

Na eletroforese, a corrente um fluxo de ons(em ambas direes). A condutividade a soma das concentraes multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um on com maior mobilidade efetiva carreia uma maior frao da corrente A voltagem, condutividade, e a corrente portanto esto todos relacionados. Se a condutividade est aumentada pelo aumento da concentrao salina a corrente se mantm constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a fora eltrica, Feletrica, nas partculas carregadas, diminuindo o movimento das macromolculas. O aumento do tempo seria necessrio para uma separao, e a resoluo diminui devido ao aumento da difuso. Se a condutividade est aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor eltrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distrbios convectivo nas solues, a qual distorce o padro eletrofortico e pode tambm desnaturar as macromolculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletrio, resultados timos podem ocorrer quando se conserva a concentrao dos ions e portanto a condutividade em valores moderados. 6. Carga e conformao Como j se discutiu, o que determina a migrao eletrofortica a carga da partcula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuio das cargas no esto desvinculadas a sua conformao estrica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partcula dependendo de sua conformao, principalmente em se tratando de macromolculas. As macromolculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrlitos ligados fortemente, portanto levando a uma alterao na sua mobilidade. 7. Atmosfera inica e o potencial zeta Contra-ons, ou ons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar prximos a grupos carregados das macromolculas. No entanto, eles no chegam a neutralizar as cargas das macromolcuals mas, por sua vez esto localizados prximos dos grupos carregados das macromolculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera inica. 22

As macromolculas movem-se com a camada de hidratao e com os contra ions. Esses reduzem a carga efetiva das macromolculas, a um nvel dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromolculas na superfcie de contato, que a regio limite do complexo macromolecular na soluo e o material que o est envolvendo. 8. Suportes A grande meta da eletroforese a separao de uma mistura heterognea de substncias inicas seja ela macromolculas ou ons simples, em zonas completamente identificveis. Os suporte devem permitir a penetrao do material a ser separado o mximo possvel e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princpio determinando o tamanho do poro para o movimento eletrofortico das macromolculas. O tubo capilar tambm exerce esse efeito. 9. Eletroendosmose O suporte no deve interagir com as molculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a separao. Uma interao comum que pode ocorrer, no a adsoro usual do material. Mais comumente o efeito dos grupos carregados que esto ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como exemplo tpico temos o suporte gar, que muito utilizado na eletroforese. O gar uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um nmero relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-ons. Se o campo eltrico for aplicado, os contra-ons iro se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) no migraro. Os contra-ons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direo, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes denominado de endosmose.

TIPOS DE SUPORTE

Os tipo de suporte podem variar desde uma soluo de sacarose at em substncia pouco solveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contnuo mais comuns so: agar, agarose, poliacrilamida e amido. A porosidade ou a mdia do tamanho do poro em alguns suportes fixo. Entretanto, em alguns suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudana da concentrao do gel de agarose, agar e amido, pode mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromolculas est em torno de 5% a 10%, que separam protenas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga eltrica.

TIPOS DE ELETROFORESE.

a. Dependendo da matrix Eletroforese livre de Tiselius Eletroforese em acetato de celulose Eletroforese em gel de agar Eletroforese em gel de agarose Eletroforese capilar

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b. pH de separao pH cido pH neutro pH alcalino

APLICAES DA ELETROFORESE NAS TCNICAS MOLECULARES1. Gel de AgaroseUm dos mtodos eletroforticos mais comuns utilizados na prtica diria em biologia molecular a de gel em agarose. Essa tcnica muito simples, rpida, prtica e apresenta boa resoluo na separao dos fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separao por ultracentrifugao em gradiente de densidade de sacarose. Uma boa separao eletrofortica do DNA utilizando gel de agarose depende de vrios fatores: 1.1. Tamanho molecular do DNA. As molculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular atravs do gel de agarose. 1.2. concentrao da agarose. O fragmento do DNA migra em diferentes proporo atravs do gel contendo diferentes concentrao da agarose. Existe uma relao linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentrao do gel que baseada numa equao matemtica(Helling e cols , 1974) figura 1. Log=logo- Kr Onde o a mobilidade eletrofortica livre e Kr o coeficiente de retardamento, = a constante que relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molcula em migrao. Baseada nessa correlao podemos separar vrias molculas de DNA (de variado tamanho) nas diferentes concentraes de agarose. Porcentagem de agarose 0,3% 0,6% 0,7% 0,9% 1,2% 1,5% 2,0% intervalo da efficincia da separao da molcula de DNA em Kb 5 a 60 1 a 20 0,8 a 10 0,5 a 7 0,4 a 6 0,2 a 4 0,1 a 3

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1.3. Conformao do DNA A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a mesmo peso molecular migra atravs do gel de agarose em diferentes posies (Thorne, 1966, 1967). A mobilidade relativa das 3 formas so dependentes primariamente da concentrao do gel, mas so tambm influenciados pela corrente aplicada, fora inica do tampo e da densidade superhelicoidal da toro na forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condioes, a forma I do DNA migra mais rpido que a forma III, em outras condies pode ser de ordem inversa. Um mtodo geral para identificar as diferentes conformaes do DNA utilizar na corrida eletrofortica em agarose diferentes concentraes de brometo de etdio(concentrao crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As tores superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vo sendo progressivamente removida e seu ndice de migrao diminui. Numa concentraao crtica do corante livre, onde no permanece a forma superhelicoidal, o ndice de migrao da forma I do DNA esta no seu mnimo valor. Se ainda mais brometo de etdio for adicionado, tores superhelicoidais positivas so gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA so diferentemente diminuidas como consequncia da neutralizao da carga e da maior tenacidade dada ao DNA pelo brometo de etdio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentrao critica do brometo de etdio livre de 0,1 a 0,5 g/ml A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razo da migrao dos fragmentos de DNA linear proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga eltrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separao do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a mxima resoluo dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no mximo 5V/cm Composio das bases e temperatura: O comportamento eletrofortico do DNA em gel de agarose no significantemente afetado pela composio das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletrofortica dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos no muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis de agarose so submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentraes muito baixas (0,5%) os gis so pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses gis ganham mais firmeza, da mesma forma os gis de agarose de baixo ponto de fuso(low melting agarose).

1.4. Tampes utilizados Existem uma variedade de tampes que podem ser utilizados para separao eletrofortica de DNA. 25

TAMPES Tris-acetato (TAE)

CONCENTRAO 0,04M Tris acetato 0,01M EDTA 0,08M Tris-fosfato 0,002M EDTA 0,089M Tris borato 0,089M ac. brico 0,002M EDTA

FORMULAO 50X 242g tris base 57,1 ml cido actico 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) 10X 108 g Tris Base 15,5ml de ac. fosfrico 85% 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) 5X 54g Tris-base 27,5g c. brico 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)

Tris-fosfato (TPE)

Tris-borato (TBE)

1.5. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose esto disponveis, o que se recomenda para uso dirio o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose que possue contaminantes de polissacrides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilizao muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reaes com essas enzimas 1.6. Colorao do DNA em gel agarose O mtodo mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose a colorao por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contm um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posio fixa do grupo e sua proximidade s bases causa uma ligao do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescncia comparada com o corante em soluo sob a forma livre. A radiao UV absorvida pelo DNA a 260 nm transmitida para o corante, ou a irradiao absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, emitido a 590nm na regio da cor vermelho alaranjada, do espectro visvel. O brometo de etdio pode detectar tanto os cidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples relativamente baixa, e a fluorescncia emitida fraca. Geralmente o brometo de etdio incorporado no tampo de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas est reduzida na presena do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento a possibilidade de visualizar o gel durante a separao eletrofortica, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da colorao posterior basta imergir o gel numa soluo de brometo de etdio, no prprio tampo de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descolorao normalmente dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA muito reduzida, a pouca fluorescncia do brometo de etdio pode interferir na visuallizao da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma soluo de sulfato de magnsio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente 26

1.7. Documentao: O gel de agarose facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantnea ou sistema automatizado de captura de imagem. Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. O filme mais sensvel para essa finalidade fornecida pela Sob a luz UV de no mnimo 2500uW/cm 2 e uma boa mquina ,

utilizando filtro laranja, expe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a mquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronizao tente vrios tempos de exposio com vrias aberturas.

2. Gel de poliacrilamidaO gel de poliacrilamida um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separao e caracterizao de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerizao da acrilamida, que o monmero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reao de "cross linking" ou reao cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerizao ocorre por ligao vinlica, sob ao de catalisadores, o perssulfato de amnia, cuja fonte de radicais livres o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxignio um inibidor da reao. O polmero formado so cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reao cruzada entre elas dada pela bisacrilamida. O comprimento mdio das cadeias determinado pela concentrao relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relao entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades fsicas do gel, que daro subsdios para separao nesse tipo de gel. O gel de poliacrilamida utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentrao (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separao e identificao. ACRILAMIDA (%) 3,5 5,0 8,0 12,0 20,0 INTERVALO DE SEPARAO (NUCLEOTDEOS) 10-1000 80-500 60-400 40-200 10-100

Os gis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigncio para se polimerizar. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura at 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza-se 0,75 a 1,5 mm.

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Literatura recomentada Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

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Aula nmero 4

REAO DE POLIMERIZAO EM CADEIA (PCR)Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

PRINCPIOS DA REAO DE PCRA reao de polimerizao em cadeia (Polimerase chain reaction, PCR) a tcnica que permite a amplificao do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reao enzimtica catalizada pela polimerase (enzima termoestvel) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: Melting(ou desnaturao que consiste na separao da dupla fita do DNA a ser amplificado), annealing( anelamento ou hibridizao- ligao do iniciador ou primer ao DNA a ser amplificado) e extension(extenso ou seja a polimerizao propriamente dita) Metodologicamente a tcnica de PCR requer trs passos (SAIKI et al., 1.988): 1. Desnaturao - Inicialmente necessrio que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevao da temperatura entre 90 a 95 C promove a separao da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento chamado Desnaturao ou melting, e muitas vezes a temperatura de desnaturao determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funes, isto , anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA j ligado na regio previamente escolhida. A soluo, ento, demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, soluo, os primers ou iniciadores que so pequenos fragmentos sintticos de DNA de fita simples, oligonucleotdeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que so sintetizados in vitro baseado na sequncia do DNA a ser amplificado sendo eles complementares seqncia do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqncia procurada naturalmente pr-requisito para a sntese dos primers. Os primers perseguem na reao as regies, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se s seqncias complementares nas duas fitas simples (usualmente 5). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridizao dos primers descrito como Annealing (do ingls), deve ser feito a uma tempertura inferior da desnaturao (45 a 60 C). 3. Extenso - Quando os primers encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNAPolimerase pode assumir sua funo. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do primer), incorporando um a um os nucleotdeos correspondentes, isto , as bases juntamente com as molculas de acar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotdeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extenso). A DNA-Polimerase no 29

reconhece apenas o bloco de incio como tambm consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3 e 5). Ela inicia a reao sempre pela extremidade 3 do primer, completando a fita simples da em diante, portanto, sempre na direo do fragmento procurado. Os fragmentos de DNA recm-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqentes, no entanto, com regio j determinada, resumindo, temos uma reao em cadeia. Aps cada ciclo, o nmero de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e ento novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por: N = No 2n N = nmero de molculas amplificadas No = nmero de molculas iniciais n = nmero de ciclos de amplificao O modelo terico considera que a eficincia do processo de amplificao corresponde a 100%, o que no observado na prtica. Experimentalmente, a eficincia da reao est abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente aps 20 ciclos tm-se cerca de um milho; aps 30 ciclos, cerca de um bilho de cpias do fragmento de DNA de interesse. Automao da PCR O procedimento da PCR foi to aperfeioada desde a sua primeira descrio, que na atualidade transcorre de forma totalmente automtica. Uma importante condio para isto foi a substituio da DNAPolimerase originalmente utilizada (extrada de E. coli) por uma DNA-Polimerase termoestvel extrada da bactria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta forma, os vrios ciclos transcorrem, seguidamente, em um nico tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupo para a adio de nova DNA-Polimerase ativa. Todos os reagentes necessrios (o DNA-template, os primers, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) so misturados com uma soluo tampo que ajusta o pH timo da reao. Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar incio para que transcorra a amplificao. Um ciclo dura em mdia trs minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milho de cpias e, em menos de duas horas, cerca de um bilho de cpias da seqncia de DNA de interesse. O produto amplificado pode alcanar aproximadamente 106 cpias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2 horas. A PCR uma ferramenta na biologia molecular to poderosa quanto a descrio das enzimas de restrio e o Southern blot. Anunciado na Conferncia da Sociedade Americana de Gentica Humana de 1985, a tcnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um nmero crescente de publicaes por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). Tcnicamente muitas mudanas tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilizao. No entanto, preciso salientar que para cada situao experimental, novas modificaes tm de ser introduzidas, de tal forma que muito 30

difcil descrever um nico procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, fundamental o conhecimento bsico das etapas envolvidas na tcnica, para um desenho experimental com sucesso. A utilizao de PCR to ampla que podem ser editados compndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnstica. Na aplicao diagnstica e, particularmente, na Microbiologia a atuao da biologia molecular muito ampla, apesar de estar ainda no cunho de afirmao e de uso restrito pesquisa e ao ensino. Porm, muitas doenas infecciosas dependem de um diagnstico rpido e seguro, que com certeza a nica soluo est na PCR. A liberao para uso rotineiro no laboratrio clnico ainda no permitido para toda as possveis aplicaes, no entanto, a necessidade de meios mais sensveis e precisos faro com que a tcnica de PCR se torne uma ferramenta impressindvel e quase obrigatria no diagnstico precoce de vrias doenas, apesar do custo ainda estar um pouco elevado. A tcnica de PCR to sensvel que capaz de amplificar uma simples molcula de DNA e tal a sua especificidade, que uma simples cpia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da sequncia genmica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Como se pode notar, a sensibilidade e a especificidade que o mtodo pode oferecer algo singular. A PCR utilizando DNA polimerases termoestveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n 4.683.195, em julho de 1987 e n 4.683.202. Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicaes do PCR para a comunidade cientfica e atualmente inesgotvel a sua aplicao prtica tanto na pesquisa bsica como na aplicada. Em termos prticos, podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com a ressalva da necessidade da optimizao para cada tipo de aplicao. Os principais problemas citados na literatura para a padronizao pode-se assim resumir: No deteco do produto, baixo rendimento do produto desejado, presena de bandas no especficas devido a mispriming ou misextension dos primers, formao de dmeros dos primers que competem pela amplificao com o produto desejado, mutao ou heterogeneicidade devido a erro de incorporao. Primer: um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequncia j conhecida do cido nucleico, geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automticos, que podem ser adquiridos no comrcio para fins j definidos ou se escolhe a regio desejada do DNA ou RNA a ser amplificada. Sonda (probe): um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas, substratos antigenicos, substncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequncia complementar do cido nucleico alvo (escolhido).

PROTOCOLO GERAL PARA PCR31

1. A reao pode ser realizada no volume de 100l ou 50l. Escolha o volume a ser usado. 2. Para o volume de 100l, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento hermtico. 2.1. DNA a ser amplificado 105 a 106 molculas(target DNA ou Template) 2.2. 20 pmol de cada primer (ou iniciadores,Tm>55C preferido) 2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20C) 2.4. MgCl 2 1,5 mM 2.5. Kcl 25 mM 2.6. Tween 20 a 0,05% 2.7. 100g/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease 2.8. 50 M de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase 3. Pr-incubar (se for DNA genmico) 10 minutos a 94o C 4. Programar o termociclo em: Desnaturao: 96 C (pode variar de 94 a 96C), por 15 segundos a 2 minutos Hibridizao (Primer Annealing): 55 C (pode variar de 45 a 62C), por 30 segundos a 2 minutos Polimerizao (Extension): 72C(pode variar de 55 a 72C) por 1,5 minutos Extenso final do programa: de 25 a 30 ciclos, de 72C por 5 a 10 minutos Estabilizao e parada de reao: 4C ou adio de 10 mM de EDTA.

FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR1. Atividade enzimtica da Taq polimerase Se os outros componentes da reao estiverem optimizados, de 1 a 2,5 U so suficientes

para uma boa amplificao em 100l de volume total. Quando em etapa de optimizao, as quantidades da enzima a serem utilizadas coompreendem o intervalo maior entre 0,5 a 5 U/100l. Obs: A quantidade de enzima necessria varia com as caractersticas do template e do primer. Se a concentrao de enzima for muito alta, ocorre o aparecimento de produtos inespecficos que podem se acumular; e ao contrrio, se baixo, a quantidade de produto desejado ser insuficiente.

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A origem comercial da Taq polimerase um importante fator, se a aquisio for de vrios fornecedores, pode-se obter resultados diferentes, devido as diferentes formulaes, diferentes condies de ensaio e pode diferir na definio da unidade. 2. Deoxinucleotdeo trifosfato: Se a soluo de uso for preparada a partir de soluo estoque necessrio neutralizar para pH 7,0, seguida de determinao espectrofotomtrica da concentrao. A soluo primria deve ser preparada a 10mM, distribuida em alquotas e estocada a -20C. A soluo de trabalho recomendada de 1mM de cada dNTP. A estabilidade dos dNTPs aps os vrios ciclos de amplificao permanece em aproximadamente 50% da concentrao inicial. Na reao, a concentrao recomendada varia de 20 a 200M para um resultado com boa especificidade e reprodutibilidade. Deve-se utilizar as mesmas concentraes de dNTP ou valores equivalentes, isto minimiza os erros de incorporao. Quanto menor a concentrao de dNTPs menor o risco de mispriming ou erro de incorporao de nucleotdeos. A quantidade mnima recomendada de 20M de cada dNTP para 100l de reao, quantidade suficiente para sintetizar 2,6 g de DNA ou 10pmol de uma sequncia de 400bp. Ultimamente se estabeleceu que 2M foi capaz de dar uma alta sensibilidade de deteco e amplificao de pontos de mutao do gene ras. De qualquer modo, para cada experimento deve-se encontrar uma quantidade tima. 3. Concentrao de Magnsio. A concentrao de magnsio bastante importante, pois afeta a hibridizao(annealing), a temperatura de separao do DNA alvo (melting), o produto de PCR, a especificidade do produto, a atividade da enzima Taq, leva formao de dimerizao de primer, prejudicando a fidelidade do experimento. A concentrao dos ions Mg++ deve estar entre 0,5 a 2,5 mM acima da concentrao total do dNTPs. Sempre deve-se considerar a concentrao de EDTA na amostra que pode interferir na concentrao dos ons Mg++. 4. Outros componentes O tampo recomendado para o PCR o TRIS-HCl na concentrao de 10 a 50 mM com pH entre 8,3 a 8,8 medido a 20C. Este tampo dipolar tem um pKa de 8,3 a 20C e um pKa de -0,0021/C, portanto, o pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8,3 a 20C varia de 7,8 e 6,8 durante as condies de termociclagem. Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reao para facilitar a hibridao dos primer. O Cloreto de sdio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase. O DMSO (dimetilsulfoxido) util para a reao de amplificao com Klenow fragmento de E. coli DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%, apesar de Chamberlain e cols. o recomendarem para amplificao de sequncias multiplas, na mesma reao.

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A gelatina, a protena (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente no inico como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua utilizao.

5. HIbridao dos iniciadores (Primer Annealing) A temperatura e tempo requerido para o hibridao de primer depende da composio em bases, do comprimento e da concentrao. A temperatura bsica aplicvel seria de 5C abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extenso dos primers ocorrer em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridao. O intervalo de ao da atividade enzimtica varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85C. A temperatura de annealing no intervalo de 55 a 72C, geralmente d melhor resultado. Numa concentrao tpica de primers(0,2M), o annealing s requer poucos segundos. O aumento da temperatura de annealing aumenta a discriminao contra os erros de hibridizao dos primers mispriming, reduzindo a extenso ou polimerizao dos nucleotdeos incorretos no final 3 dos primers. Portanto, as temperaturas de annealing mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poder aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade mxima, no incio dos ciclos aumenta-se a temperatura de annealing e adiciona-se a Taq polimerase aps a primeira etapa de desnaturao e annealing do primer. Baixas temperaturas de etapas de extension com altas concentraes de dNTPs favorecem os erros de polimerizao, ou seja, os nucleotdeos so incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilizao de primers mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As temperaturas so de 55 a 75C para annealing e extension e 94 a 97C para desnaturao e separao de cadeias. 6. Extenso (ou polimerizao) O tempo de polimerizao ou extension tambm depende de alguns fatores como a concentrao e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extenso dos primers tradicionalmente realizada a 72C, porque esta temperatura prxima do timo para extenso de primers no modelo de DNA do M13. A mdia de incorporao dos nucleotdeos a 72C varia de 35 a 100 nucleotdeos por seg-1 dependendo do tampo, pH, concentrao salina e natureza do DNA alvo. O tempo de 1 minuto a 72C considerado suficiente para a extenso de produtos de at 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser teis em casos de poucos ciclos e se a concentrao do substrato for muito baixa e tambm em ciclos prolongados quando a concentrao do produto ultrapassa a concentrao da enzima. 7. Tempo e temperatura de desnaturao 34

A maioria das causas de insucesso do PCR a incompleta desnaturao do DNA a ser amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura tpica de desnaturao 95C por 30 segundos, ou 97C por 15 segundos, porm, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos so necessrios para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porm, um maior tempo necessrio para se atingir a temperatura dentro do tubo de reao. Seria desejvel a monitorao da temperatura dentro do tubo de reao utilizando uma sonda trmica de medida exata. A desnaturao incompleta reduz a possibilidade hibridizao entre o DNA alvo e os primers, diminuindo o rendimento do produto do PCR. Por outro lado, a desnaturao por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de atividade da Taq polimerase, que maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95 e 97,5C, respectivamente. 8. Nmero de ciclos. O nmero de ciclos depender da quantidade de DNA inicial, quando todos os parmetros esto optimizados. Um erro comum que se comete um excesso de nmero de ciclos. Segundo Kary Mullis Se voc tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cpia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de produtos no especficos. Obviamente, um nmero muito baixo dar um baixo rendimento do produto desejado. 9. Iniciadores (Primers) A concentrao dos primers entre 0,1 a 0,5 mM so, na maioria das vezes, satisfatrios. Concentraes maiores podem promover mispriming e acmulo de produtos no especficos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do template denominado de primerdimer(dimerizao de primer). Produtos no especficos e dimerizao de primer so por si s substratos para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto desejado. Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28 nucleotdeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composio. A temperatura de melting (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propsito, pode-se usar a regra da prtica de 2C para o A ou T e 4C para o G ou C. Dependendo da aplicao, o Tm entre 55C e 80C so os recomendados. Deve tambm evitar a complementaridade na poro 3 do par de "primers", pois isso pode promover a formao de artefatos de dimerizao de primers e reduzir a produo do produto desejado. Outra observao evitar trs ou mais C+G na poro 3 dos primers que pode promover mispriming na sequncia rica em G+C. Deve-se evitar, quando possvel, a presena de sequncias palindrmicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, salutar ento tentar outro par de primers. Uma razo menos bvia para alguns primers falharem a presena de estrutura secundria no DNA template. Neste caso, substituir com 7-deasa-2deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers 35

para propsitos especiais tambm podem ser elaborados tais como a adio de stios de enzimas de restrio, mutao in vitro, ATG start codon, e outros. 10. Efeito Plateau O termo efeito plateau usado para descrever a atenuao exponencial da taxa de formao de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das condies da reao e da ciclagem trmica, um ou mais parametros podem ser afetados: 1)utilizao dos substratos (dNTP ou primers), 2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas), 3)inibio por produto formado(pirofosfato,DNA duplex), 4)competio por reagentes pelos produtos inespecficos ou dimerizao de primers, 5) reannealing de produto especfico na concentrao acima de 10-8 (pode diminuir a eficincia da extenso ou o processamento da Taq DNA p