BIOCONSERVACIÓN DE PESCADO FRESCO EMPACADO AL …empacado refrigerado. En este trabajo se evaluaron 10 extractos antimicrobianos ... La producción nacional de peces de cultivo concierne

BIOCONSERVACIÓN DE PESCADO FRESCO EMPACADO AL VACÍO MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE EXTRACTOS

ANTIMICROBIANOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

Sebastián Salazar G., Esteban Uribe A., Catalina Aguilar R. y Bernadette Klotz C.

Facultad de Ingeniería., Universidad de La Sabana, Campus Puente del Común, Autopista Norte km 21, Chía, Cundinamarca, Colombia.

[email protected]

RESUMEN A nivel mundial, Colombia ocupa el undécimo lugar en producción de filetes de tilapia

(40.000 toneladas/año aproximadamente) cuya exportación se proyecta al año 2020 con un crecimiento del 111%. Sin embargo, aunque para el país este mercado sea competitivo y promisorio, aún hace falta mejorar las condiciones de procesamiento y transporte, que permitan garantizar la cadena de frío y que aseguren la calidad e inocuidad del producto, evitando su deterioro prematuro. Como estrategia para incrementar el tiempo de almacenamiento del pescado fresco y asegurar su inocuidad, se contempla con gran potencial la adición de antimicrobianos naturales como bioconservantes en el producto empacado refrigerado. En este trabajo se evaluaron 10 extractos antimicrobianos (sobrenadantes libres de células), obtenidos a partir de cultivos individuales y mixtos de BAL (Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilacti y Leuconostoc mesenteroides) y de cepas aisladas del pescado, con el fin de reducir la carga microbiana de filetes de tilapia frescos refrigerados empacados al vacío. Mediante difusión en placa se determinó que los extractos obtenidos de cultivos individuales y mixtos de L. plantarum generaron los mayores halos de inhibición (más de 15mm de diámetro) contra bacterias patógenas y deteriorativas aisladas del mismo producto, y se observó que después de 10 días de almacenamiento a 8 ºC, con la aplicación de estos extractos sobre los filetes, se redujo la concentración de mesófilos aerobios y coliformes totales en 2,8 y 1,6 ciclos logarítmicos, respectivamente, frente al control. De acuerdo con simulaciones realizadas con el Software Growth Predictor (Combase), esta reducción en la carga microbiana podría significar un incremento de tres días en el tiempo de almacenamiento del producto. Se plantea que la implementación de empaques bioactivos con adición de extractos antimicrobianos, representa claramente una innovación en un sector importante de la industria nacional, que podría impactar directamente el mercado de las exportaciones del pescado fresco.

Palabras clave: Extractos antimicrobianos, cultivos individuales y mixtos, filetes de tilapia frescos, bioconservación.

Vol 20, No 24 (2011), Revista Alimentos Hoy - 8

YURI

Texto tecleado

Recibido 31/10/2010, Aceptado 08/11/2010, Disponible online 22/12/2011

ABSTRACT

At global level, Colombia occupies the 11th place in the production of fresh tilapia fillets

(approximately 40.000 ton per year) and the exports increase for 2020 is estimated in 111%. Nonetheless, though this market is competitive and promising for the country, process and transport conditions need to improve in order to guarantee an unbroken cold chain, as well as the quality and safety of the product. Bioconservation with antimicrobial extracts in packed refrigerated product to extent shelf life and to assure safety of fresh fish is potentially strategic under the conditions described. In the present work 10 different raw, cell-free antimicrobial extracts obtained from single and multi bacterial cultures were tested. Lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilacti and Leuconostoc mesenteroides) and tilapia natural microflora strains were used in the production of the antimicrobial extracts in order to reduce microbial charge on fresh refrigerated vacuum packed tilapia fillets. The antagonic efficacy of the raw extracts was established by agar diffusion technique. The extracts obtained from single and mixed cultures of Lactobacillus plantarum showed the best results against pathogenic bacteria and natural microflora with the biggest inhibition zones (> 15 mm in diameter). Additionally, after 10 days of storage at 8°C and vacuum packaged, a reduction of aerobic mesophilic (2,8 log cycle) and coliform bacteria (1,6 log cycle) was observed on the product treated with the extracts versus the control. Simulations done with the Growth Predictor software (ComBase, http://www.combase.cc/) showed that these reductions in microbial charge represented a shelf life increase for the fresh fish product of three days. The results obtained reinforced the potential and the impact of bioactive packages, especially for high perishable export food products.

Key words: antimicrobial extracts, single and multiple bacterial cultures, fresh tilapia fillets, biopreservation.


http://www.combase.cc/

INTRODUCCIÓN Los productos pesqueros frescos son

altamente perecederos siendo la actividad microbiana la principal responsable de su deterioro. Normalmente, el músculo de un pescado fresco es estéril, pero es fácil de colonizar durante el almacenamiento si las bacterias sobre las superficies empiezan a proliferar. La difusión de enzimas bacterianas hacia el interior del músculo y la difusión externa de nutrientes son causa también importante de deterioro, lo cual repercute directamente sobre la vida útil del alimento (Kilinc y col., 2006). Bacterias Gram positivas como Micrococcus, Lactobacillus, bacilos esporulados y coryneformes, son aislados frecuentemente de productos pesqueros.

Así mismo, bacterias Gram negativas como Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Shewanella, Flavobacterium, Vibrio, Photobacterium y Aeromonas, han sido asociadas al deterioro y disminución de la vida útil de pescados y mariscos (García y col., 2004).

En Colombia, durante los últimos 20

años, la piscicultura ha crecido en producción y tecnificación de manera importante. La producción nacional de peces de cultivo concierne principalmente a las especies de tilapia, trucha y cachama, cuya participación conjunta durante los últimos 12 años ha sido del 96,3% del total de la piscicultura, y del 65,3% de la producción acuícola nacional (Asoacuicola, 2001). Colombia ocupa en el mundo el undécimo lugar en producción de tilapia, con una producción aproximada de 40.000 toneladas/año y cuyo valor corresponde al 62% del pescado continental. La exportación de tilapia se proyecta al 2020 con un crecimiento del 111%, siendo actualmente EE.UU. el principal

importador (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2005).

Sin embargo, aunque la tecnología de

producción de tilapia sea competitiva a nivel mundial, aún falta infraestructura de transporte y comercialización que permita garantizar la cadena de frío y que por lo tanto no ponga en riesgo la inocuidad del producto. En este sentido, como estrategia para incrementar el tiempo de almacenamiento del pescado fresco y asegurar su inocuidad, se contempla con gran potencial la adición de antimicrobianos naturales como bioconservantes en el producto empacado refrigerado (empaque activo).

Algunos investigadores han reportado el efecto antagónico de extractos provenientes de bacterias ácido lácticas (BAL), sobre pescados y otros productos de origen marino empacados (Tomé y col., 2008, Tahiri y col., 2009, Sequeiros y col., 2002, Suárez y col., 2008, Yin y col., 2007).

Sin embargo, hasta el momento no se han encontrado reportes donde estudien el efecto de extractos obtenidos a partir de cultivos mixtos sobre este tipo de productos empacados. Por esto, a través de este proyecto, se propone la aplicación de extractos libres de células obtenidos a partir de cultivos individuales y mixtos de BAL GRAS (Generally recognized as safe), con el fin de extender la vida útil y garantizar la inocuidad de filetes de tilapia frescos refrigerados.

MATERIALES Y MÉTODOS Establecimiento de la línea base de

la flora microbiana de tilapia roja Para este estudio se trabajó con

diferentes marcas comerciales de filetes frescos de tilapia roja empacados al vacio, que estuviesen almacenados en los puntos de venta a temperaturas entre 4 y 8 °C. Para establecer la línea base de


la flora microbiana de los productos, las muestras fueron procesadas en menos de 24 horas después de su compra y mediante recuento en placa sobre agar tripticasa de soya (TSA, Scharlau, ref. 01-200) se realizó la cuantificación de mesófilos aerobios y sobre agar eosina azul de metileno (EMB, Scharlau, ref. 01-068) se efectuó el recuento de coliformes totales. Luego de procesar diez muestras diferentes, cada una por triplicado, se obtuvieron recuentos entre 5,0 y 6,5 log10 UFC/g de mesófilos aerobios y entre 5,0 y 6,0 log10 UFC/g de coliformes totales, con una desviación estándar máxima de 0,3.

Las colonias más representativas

obtenidas a partir de los recuentos microbianos, se caracterizaron mediante tinción de Gram y fueron sembradas en diferentes medios selectivos: Agar Palcam (Scharlau, ref. 01-470), agar Cetrimide (Scharlau ref. 01-160), agar Baird Parker (Scharlau, ref. 01-030), agar EMB (Scharlau ref. 01-068) y agar Papa Dextrosa (PDA, Scharlau, ref. 01-482). Pruebas bioquímicas como catalasa, fermentación de azúcares y pruebas enzimáticas, entre otras, también se realizaron para ampliar la información del tipo de flora presente en las muestras de

pescado y obtener una identificación preliminar.

Finalmente, de la totalidad de aislamientos realizados, se seleccionaron las diez (10) cepas obtenidas con mayor frecuencia de las muestras de pescado, para posteriormente utilizarlas en los ensayos reto con los extractos antimicrobianos. También se tuvo como criterio de selección las características morfológicas de dichas cepas, que fueron diferentes para cada una de ellas. Las cepas seleccionadas se conservaron congeladas en crioviales (CryoBank, Copan) a -70 °C, hasta su uso.

Obtención de extractos libres de

células a partir de cultivos individuales y mixtos de bacterias ácido lácticas

Para obtener los extractos con

potencial antimicrobiano se seleccionaron cuatro (4) cepas diferentes de bacterias ácido lácticas (BAL) con historial de actividad inhibitoria frente a diferentes patógenos aislados de alimentos (Aguilar y Klotz, 2009). En la Tabla 1 se presentan las cuatro cepas utilizadas con sus respectivas fuentes de aislamiento.

Tabla 1. Bacterias ácido lácticas utilizadas para la obtención de extractos antimicrobianos.

Cepas BAL Fuente de

Aislamiento

( A ) Lactobacillus plantarum WS4174 Queso semigraso

( B ) Leuconostoc mesenteroides LM11 Vegetales

( C ) Pediococcus acidilacti P120 Crema de leche

( D ) Lactobacillus plantarum LB279 Suero costeño

Para la obtención de los

sobrenadantes, primero se desarrollaron cultivos individuales de las cuatro BAL en estudio sobre 5 mL de caldo MRS (Scharlau, ref. 01-135) a 37 °C por 24 horas, hasta alcanzar concentraciones aproximadas del orden de 109 UFC/mL. Los cultivos se neutralizaron con NaOH al 0,1 Normal y se centrifugaron a 9335,3

xg por 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes resultantes se filtraron a través de membranas estériles de 0,2 micras (Sartorius, Minisart NML).

El mismo procedimiento fue aplicado

para obtener sobrenadantes libres de células a partir de los cultivos mixtos de las BAL. Para esto se realizaron


diferentes combinaciones (de igual proporción en su concentración celular) de los cultivos de las cuatro BAL con los de las diez cepas aisladas del pescado.

Todos los extractos obtenidos (Tabla 2) se almacenaron a -70 °C hasta su utilización.

Tabla 2. Extractos libres de células obtenidos a partir de los cultivos individuales y mixtos de las BAL.

Extracto

Combinación de cultivos

Composición del extracto: Sobrenadantes de

cultivos de BAL individuales y mixtos

1

4 BAL +

10 cepas aisladas del pescado

Lactobacillus plantarum WS4174 + Leuconostoc

mesenteroides LM11 + Pediococcus acidilacti P120 +

Lactobacillus plantarum LB279 +

Mezcla de las 10 cepas aisladas del pescado

2

4 BAL

Lactobacillus plantarum WS4174 + Leuconostoc mesenteroides LM11 + Pediococcus acidilacti P120

+ Lactobacillus plantarum LB279 +

3

1 BAL +


Lactobacillus plantarum WS4174 +


4

1 BAL +


Leuconostoc mesenteroides LM11 +


5

1 BAL +


Pediococcus acidilacti P120 +


6

1 BAL +


Lactobacillus plantarum LB279 +


7

1 BAL Lactobacillus plantarum WS4174

8

1 BAL Leuconostoc mesenteroides LM11

9

1 BAL Pediococcus acidilacti P120

10

1 BAL Lactobacillus plantarum LB279

- En azul: Sobrenadantes obtenidos a partir de cultivos mixtos.

- En verde: Sobrenadantes obtenidos a partir de cultivos individuales. Evaluación de la actividad

antimicrobiana de los extractos libres de células

La actividad antimicrobiana de los diez extractos previamente descritos se evaluó mediante la técnica de difusión en placa ¨Spot on the lawn¨ (Cintas y col., 1998, Loessner y col., 2003 y Eppert y


col., 1997) frente a las diez cepas aisladas del pescado (Tabla 3) que se utilizaron de manera independiente como cepas reto. Estas últimas se cultivaron en caldo MRS (Sharlau, 02-135) a 37 °C durante 24 horas y luego del periodo de incubación, 1mL de cada cultivo se transfirió de manera independiente a 100mL de agar MRS estéril sin solidificar. Posteriormente, en las placas

homogenizadas y solidificadas se realizaron micropozos de 0,6 mm de diámetro, en los que se inocularon 40μL de cada uno de los extractos. Todas las placas, se incubaron por 48 horas a 37 °C. Las lecturas se efectuaron midiendo el diámetro de los halos de inhibición. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Tabla 3. Caracterización microbiológica de cepas aisladas de las muestras de filetes de tilapia roja.

Cepa Gram Morfología

microscópica Catalasa Otras características

1 ( - ) Bacilo (+) Colonias con brillo metálico en agar EMB, Lactosa (+) e

Indol (+).

2 ( - ) Bacilo (+) Producción de pigmento fluorescente en agar Cetrimide.

3 (+) Bacilo (+) Hidrólisis de esculina en agar Palcam.

4 (+) Estafilococo (+) Colonias negras en agar Baird parker y lipólisis (+).

5 ( - ) Bacilo (+) Colonias moradas sobre agar EMB, Lactosa (+) e indol

(+).

6 ( - ) Bacilo (+) Colonias moradas sobre agar EMB, Lactosa (+) e indol ( -

).

7 ( - ) Bacilo (+) Colonias rosadas sobre agar EMB, Lactosa ( - ) e indol ( -

).

8 (+) coco ( - ) Colonias marrón en agar Baird Parker y lipólisis ( - ).

9 (+) Bacilo ( - ) Colonias grandes y ámbar en agar PCA y crecimiento ( - )

en agar Baird Parker.

10 (+) Levadura (+) Colonias naranja en agar PDA.

- En amarillo: Cepas identificadas mediante pruebas bioquímicas: (1) Escherichia coli, (2)

Pseudomonas sp., (3) Listeria sp., (4) Staphylococcus coagulasa positiva. - En azul: Cepas sin identificar.

Evaluación del efecto inhibitorio de

extractos libres de células sobre la carga microbiana de filetes de tilapia empacados al vacío y almacenados bajo refrigeración

Para realizar este ensayo se

seleccionaron los dos (2) extractos que presentaron mayor actividad inhibitoria en las pruebas de difusión en placa y

posteriormente, para trabajar con volúmenes mayores de extracto, se efectuó el mismo procedimiento descrito anteriormente para la obtención de sobrenadantes libres de células, pero utilizando un volumen de cultivo de 500mL y verificando que las concentraciones celulares también estuvieran alrededor de 109 UFC/mL antes de la centrifugación.


Muestras de filetes de tilapia fresca

(10g) se trataron con cada uno de los dos extractos seleccionados, independientemente y por inmersión durante 30 segundos y posteriormente se empacaron al vacío de manera individual.

Todas las muestras se almacenaron a

8 °C durante 10 días. Como controles se utilizaron filetes empacados bajo las mismas condiciones pero sin la aplicación del extracto. En total, se realizaron tres ensayos independientes, cada uno con tres réplicas. Diariamente, se tomaron muestras de los filetes de pescado para evaluar la concentración de mesófilos y coliformes totales a través del tiempo, mediante recuento en placa sobre agar TSA y EMB, respectivamente.

Con los resultados de los recuentos

microbianos, se generaron curvas de crecimiento que sirvieron para determinar la efectividad de los extractos evaluados frente a los controles. Las diferencias obtenidas en dichas concentraciones se utilizaron para calcular el efecto de la aplicación de los tratamientos, sobre la vida útil del producto, a través de simulaciones realizadas con el Software Growth Predictor (Combined database for predictive microbiology, www.combase.cc).

Análisis estadístico Los datos experimentales se

analizaron mediante ANOVA (P < 0.05) y test de Tukey (nivel de significancia de 5%) con el programa estadístico SPSS (versión 13.0, SSPS Inc, Chicago).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Establecimiento de la línea base de

la flora microbiana de tilapia roja De las diez cepas más representativas

en las muestras de filete de pescado, se

obtuvieron cinco (5) bacterias Gram negativas, cuatro (4) Gram positivas y una (1) levadura. Teniendo en cuenta las características morfológicas y bioquímicas resultantes de los análisis realizados, se sugiere que la identificación de la cepa No. 1 descrita en la Tabla 3, puede corresponder a Escherichia coli, la No.2 a Pseudomonas sp., la No.3 a Listeria sp. y la No.4 a Staphylococcus coagulasa positiva. Adicionalmente, se encontró que las cepas No. 5 y No.6 son coliformes, mientras que la No.7, podría ser una enterobacteria no coliforme. Se sugiere también que la cepa No. 8 podría ser un Enterococcus sp; pero, tanto en éste, como en los demás casos, sería necesario realizar pruebas moleculares que permitieran una identificación definitiva de cada microorganismo. Sin embargo, el propósito de este objetivo era conocer el tipo de flora más representativa en los filetes frescos de tilapia roja (Tabla 3) y establecer la carga microbiana de las muestras, más que lograr la identificación de cada cepa.

Como ya se mencionó, en las

muestras se obtuvieron recuentos entre 5,0 y 6,5 log10 UFC/g de mesófilos aerobios y entre 5,0 y 6,0 log10 UFC/g de coliformes totales, con una desviación estándar máxima de 0,4. Como era de esperarse, la flora Gram negativa fue la más predisponente, lo que puede deberse al hábitat del pescado, a contaminación cruzada con heces fecales y manipulación inadecuada del pescado durante su procesamiento y empaque. La presencia de bacterias deteriorativas como Pseudomonas ssp, así como la de algunos coliformes, afecta directamente la calidad del producto, acortando su vida útil y generando cambios importantes a nivel organoléptico (Kilinc y col., 2006).

Evaluación de la actividad

antimicrobiana de los extractos libres de células obtenidos



Se presentaron diferencias

significativas (α=0,05) entre los diez extractos evaluados y su actividad antimicrobiana frente a las diez cepas aisladas del pescado. Los resultados obtenidos demostraron que seis de las diez cepas aisladas del pescado, retadas en los ensayos de inhibición, presentaron alta sensibilidad a la acción de los sobrenadantes. Solamente las cepas No. 5, 6, 7 y 10 (tres Gram negativas y una levadura) fueron resistentes a los 10 extractos. Estos resultados son consistentes con lo reportado en otros estudios (Aguilar y Klotz, 2008; Cintas y col., 1998, Mah y O´toole, 2001) que demuestran que las bacterias Gram negativas son más resistentes a la acción de metabolitos tipo bacteriocinas, y a otros compuestos producidos por las BAL, debido posiblemente a que este tipo de bacterias, al carecer de ácidos teicoicos y tener una composición lipídica diferente en su pared celular, así como el hecho de expresar menor proporción de receptores de membrana con afinidad a los receptores de estas biomoléculas, hacen que se dificulte la interacción entre ambas (célula y biomolécula) afectando por ende el proceso de inhibición (Zhao y col., 2006).

Adicionalmente, como se observa en

la Figura 1, los extractos No 1, 2, 3 y 7 (barras azul oscuro, verde oscuro, azul claro y gris) fueron los que generaron mayores halos de inhibición (por encima de 15 mm. de diámetro) y los que presentaron un mayor espectro antagónico, ya que inhibieron un mayor número de cepas. Se comprobó en casi todos los casos, que los sobrenadantes obtenidos a partir de los cultivos mixtos de las BAL con la mezcla de las 10 cepas aisladas del pescado, presentaron

mayor actividad antagónica comparada con la que presentaron los extractos obtenidos de sus cultivos individuales. Esto puede deberse al hecho que muchos de los metabolitos producidos por las BAL, como algunas bacteriocinas, son co-inducibles y requieren de factores externos, como la presencia de otras bacterias en el medio, para que se genere su producción y/o activación (Maldonado y col., 2006, Rojo y col., 2007 y Ruiz y col., 2010).

Sin embargo, como ya se reportó en

otro trabajo, la cepa de L. plantarum WS4174, no tiene esta característica de co-inducción y es capaz de producir sustancias antimicrobianas en ausencia de otros microorganismos en el medio, por lo que sus cultivos individuales son efectivos contra diferentes patógenos, demostrando en muchos casos, que tiene mayor potencial antagónico que las otras cepas BAL en estudio (Aguilar y col., 2007). En concordancia con esto, los resultados obtenidos en el presente trabajo, también evidenciaron que el extracto obtenido a partir del cultivo individual de L. plantarum WS4174 (Extracto No.7), fue el que presentó actividad antagónica significativamente mayor (α=0,05), generando halos de inhibición de mayores diámetros (Tabla 4).

Por otro lado, el extracto No.1, obtenido a partir del cultivo mixto de las cuatro BAL y las diez cepas aisladas del pescado, también generó halos de inhibición con diámetros significativamen te (α=0,05) más grandes por encima del resto, por lo que junto con el extracto No.7 también fue seleccionado para evaluar directamente su efectividad sobre filetes de pescado fresco empacados al vacío y refrigerados a 8 °C.


Figura 1. Resultados de los ensayos de inhibición. En la figura se presenta el promedio obtenido a partir de tres ensayos independientes con su correspondiente desviación estándar. Representados por colores y en orden del 1 al 10 aparece cada uno de los 10 extractos evaluados.

0 5 10 15 20

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Cep

as a

isla

das

de

la t

ilap

ia y

ret

adas

con

los

10

ext

ract

os

Diámetro de halos de inhibición (mm)


Tabla 4. Resultados de los ensayos de inhibición. En la tabla se presenta el promedio obtenido a partir de tres ensayos independientes con su correspondiente desviación estándar entre paréntesis.

Extractos

Diámetro de los halos de inhibición en mm.

Cepas reto aisladas del pescado referenciadas en la Tabla 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Extracto 1 4 BAL +


15,0 (0,0)

15,0 (1,0)

15,0 (1,0)

16,0 (1,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

15,5 (0,7)

14,5 (0,7)

0,0 (0,0)

Extracto 2

4 BAL

14,0 (1,0)

15,0 (0,0)

14 (0,0) 15,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

15,5 (0,7)

14,0 (0,0)

0,0 (0,0)

Extracto 3 Lactobacillus plantarum WS4174 +


14,0 (1,0)

14,0 (0,0)

13,0 (1,0)

14,5 (0,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

16,0 (1,0)

15,5 (0,7)

0,0 (0,0)

Extracto 4 Leuconostoc mesenteroides LM11 +


0,0 (0,0)

13,0 (1,0)

12,0 (0,0)

12,5 (0,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

13,0 (1,0)

12,0 (0,0)

0,0 (0,0)

Extracto 5 Pediococcus acidilacti P120 + 10 cepas aisladas del pescado

12,5 (0,7)

12,0 (0,0)

13,0 (0,0)

12,5 (0,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

14,0 (0,0)

14,0 (1,0)

0,0 (0,0)

Extracto 6 Lactobacillus plantarum LB279 +


0,0 (0,0)

10,0 (0,0)

12,5 (0,7)

11,0 (1,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

11,0 (0,0)

10,0 (1,0)

0,0 (0,0)

Extracto 7

Lactobacillus plantarum WS4174

15,0 (0,0)

15,5 (0,7)

14,5 (0,7)

16,0 (1,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

16,0 (1,0)

15,0 (1,0)

0,0 (0,0)

Extracto 8

Leuconostoc mesenteroides LM11

0,0 (0,0)

13,0 (0,0)

11,5 (0,7)

12,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

12,0 (0,0)

12,0 (1,0)

0,0 (0,0)

Extracto 9

Pediococcus acidilacti P120

12,0 (1,0)

12,5 (0,7)

13,0 (1,0)

13,0 (1,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

14,0 (0,0)

11,5 (0,7)

0,0 (0,0)

Extracto 10

Lactobacillus plantarum LB279

0,0 (0,0)

12,0 (1,0)

12,5 (0,7)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

0,0 (0,0)

11,0 (1,0)

11,0 (0,0)

0,0 (0,0)

- En azul: Casos de resistencia a la acción de los extractos evaluados. - En verde: Extractos libres de células con mayor potencial antimicrobiano (representado por halos de

inhibición de mayor diámetro en mm.)

Evaluación del efecto inhibitorio de

extractos libres de células sobre la carga microbiana de filetes de tilapia empacados al vacío y almacenados bajo refrigeración

Los recuentos microbianos obtenidos a partir del muestreo diario de los filetes de pescado refrigerados a 8 °C, se utilizaron para generar curvas de crecimiento que posteriormente fueron normalizadas para eliminar las diferencias inherentes a la concentración


de carga inicial en las muestras evaluadas. De esta forma se logró obtener el incremento exacto (en ciclos logarítmicos), de la población microbiana a través del tiempo (Figuras 2 y 3).

Después de diez días de

almacenamiento, se encontraron diferencias significativas (α=0,05) entre las muestras control y las tratadas con

los extractos. En la Tabla 5 se presenta el incremento final en la concentración de microorganismos mesófilos y coliformes totales, que evidencia que para ambos tipos población microbiana, se produjo en las muestras sin tratamiento un incremento celular significativamente mayor (α=0,05) que el encontrado para las muestras sumergidas en los extractos.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Lo

gU

FC

/g

Tiempo (días)

Recuento de Mesófilos aerobios

Figura 2. Efecto de la aplicación de extractos libres de células sobre la población mesófila de filetes de pescado fresco empacados al vacío y almacenados a 8°C. En verde: Filetes sin extracto. En rojo: Filetes con extracto No.7. En azul: Filetes con extracto No.1.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Lo

gU

FC

/g

Tiempo (días)

Recuento de Coliformes totales

Figura 3. Efecto de la aplicación de extractos libres de células sobre la población de coliformes totales en filetes de pescado fresco empacados al vacío y almacenados a 8°C. En verde: Filetes sin extracto. En rojo: Filetes con extracto No 7. En azul: Filetes con extracto No.1.


Tabla 5. Incremento final en la población microbiana de muestras de filete de tilapia roja empacadas al vacío después de 10 días de almacenamiento a 8 °C

Tratamientos

Microorganismos mesófilos Coliformes totales

Ciclos log: log10 UFC/g

S.D. Ciclos log: log10 UFC/g

S.D.

Filetes de pescado sin tratamiento 4,23 0,19 2,72 0,15

Filetes de pescado tratados con Extracto No. 7* 2,61 0,13 1,82 0,14

Filetes de pescado tratados con Extracto No. 1** 1,42 0,16 1,11 0,03

S.D: Desviación estándar * Extracto libre de células obtenido a partir del cultivo individual de Lactobacillus plantarum WS4174

** Extracto libre de células obtenido a partir del cultivo mixto de las cuatro BAL y las diez cepas aisladas de

pescado.

Cuando las muestras se trataron con

el extracto No. 7, el incremento en la población mesófila fue de 1,62 ciclos logarítmicos menos, que el incremento obtenido en las muestras control; lo que sugiere que el extracto aplicado redujo significativamente la concentración de bacterias en las muestras, lo que podría aumentar su tiempo de vida útil. Así mismo, en los filetes tratados con el extracto No.1, también se generó un incremento significativamente menor en la población de mesófilos. Para este caso la diferencia frente al control fue de 2,81 ciclos logarítmicos menos, lo que también sugiere que este extracto tuvo mayor actividad inhibitoria que el extracto No.7. En la Figura 2 se observan estas diferencias.

Por otro lado, al evaluar la población

de coliformes totales en las muestras, la tendencia fue la misma. Con el extracto No. 7 la concentración celular se incrementó 0,9 ciclos log menos que lo encontrado en las muestras sin tratamiento. Y con el extracto No.1, esta diferencia fue de 1,61 ciclos log menos frente al control, indicando también, en este caso, que el extracto No.1 presentó mayor efectividad. En la Figura 3 se presentan las diferencias en el incremento celular de coliformes totales a través del tiempo.

Estas diferencias en las

concentraciones netas alcanzadas, se utilizaron para calcular el efecto de la aplicación de los tratamientos, sobre la vida útil del producto, a través de simulaciones realizadas con el Software Growth Predictor (Combined database for predictive microbiology, www.combase.cc). Para esto, se seleccionaron en el programa las mismas condiciones ambientales a las que se sometieron las muestras en el laboratorio y mediante ajuste de modelos matemáticos se obtuvieron los parámetros cinéticos que describen el comportamiento microbiano en el producto. Con una tasa de crecimiento de

0,038h-1, que fue la obtenida mediante simulación, se pudo determinar que la diferencia de 1,62 ciclos logarítmicos lograda con la aplicación del extracto No.7, equivale aproximadamente a 42,6 horas más de vida útil para este producto, y que con la aplicación del extracto No 1, la diferencia de 2,81 ciclos log en el incremento final de la concentración celular, equivale aproximadamente a 73, 9 horas más de vida útil. Esto significa que la aplicación de los extractos sobre filetes de tilapia roja empacados al vacío y almacenados a 8 °C logra aumentar significativamente



(α=0,05) su vida útil, en casi dos días con el extracto No.7 y en tres días con el extracto No. 1.

Diferentes autores también han

evaluado el efecto de sobrenadantes libres de células obtenidos a partir de cultivos de BAL, sobre la flora microbiana de filetes de salmón (Tomé y col., 2008, Tahiri y col., 2009), filetes de pejerrey (Sequeiros y col., 2002), cachama (Suárez y col., 2008) y filetes de tiburón azul (Yin y col., 2007) entre otros. Sin embargo, no se han encontrado hasta el momento reportes en los que se utilicen extractos obtenidos a partir de cultivos mixtos, ni tampoco estudios donde se calcule el impacto de las inhibiciones o reducciones logradas sobre la vida útil de este tipo de productos.

Otro de los resultados observados al aplicar los extractos libres de células sobre los filetes de pescado, consistió en el efecto selectivo que presentaron los extractos frente a determinados grupos poblacionales de la microbiota del pescado. Después de cinco días de almacenamiento, en las muestras tratadas, no volvieron a recuperarse colonias típicas de E. coli, ni de Pseudomonas ssp., ni de otros coliformes no identificados (Figura 4). Estos hallazgos son importantes porque algunos de estos grupos microbianos, que resultan principalmente afectados con la aplicación de los extractos, como por ejemplo Pseudomonas spp., han sido asociados al deterioro de cárnicos y pescados por su alta actividad enzimática (García y col., 2004), lo que impacta directamente sobre la calidad y vida útil de estos productos.

a. b.

Figura 4. Fotografías de los recuentos de coliformes totales obtenidos a partir de filetes de tilapia empacados al vacío después de 5 días de almacenamiento a 8 °C. a: Muestra control. b: Muestra con bioconservante.

CONCLUSIONES Los bioconservantes obtenidos a partir

de cultivos individuales y mixtos de BAL, fueron efectivos para inhibir significativamente la flora microbiana presente en muestras de tilapia fresca. Adicionalmente, su aplicación sobre

filetes de pescado empacados al vacio y almacenados a 8 °C, aumentó en tres días su vida útil, inhibiendo el crecimiento de bacterias deteriorativas. Estos bioconservantes, por su gran poder antimicrobiano y por su naturaleza, podrían eventualmente reemplazar los conservantes químicos que se utilizan en


el medio, sin afectar las características organolépticas de los productos.

Con estos resultados se comprueba el

gran potencial que tiene el uso de este tipo de extractos como bioconservantes y se plantea la oportunidad de seguir desarrollando estudios que conlleven a la implementación de empaques bioactivos, lo que representa claramente una innovación para la industria nacional y que podría impactar directamente el mercado de las exportaciones del pescado fresco y de otro tipo de productos frescos empacados.

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AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Fondo de

Investigación de la Universidad de La Sabana por financiar y apoyar este trabajo a través de la Convocatoria para fomentar el desarrollo de proyectos de investigación de semilleros de estudiantes en el marco de la investigación formativa.


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