8
Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia C. Y. LEE, J. HEMINGWAY*, H. H. YAP and N. L. CHONG Vector Control Research Unit, School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia, Penang, Malaysia, and * School of Biosciences, University of Wales, Cardiff, U.K. Abstract. The possible insecticide resistance mechanisms of four Malaysian ®eld- collected strains of the German cockroach, Blattella germanica (Linnaeus) (Dictyoptera: Blattellidae), were characterized with biochemical assays and native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Elevated esterase activity (at low to moderate frequency) and altered acetylcholinesterase (low frequency) were detected in all ®eld strains, while elevated glutathione S-transferase levels were present in only two strains. Seven esterase bands were separated by native PAGE; a greater intensity occurred in three bands in the resistant strains compared to the susceptible strain. Inhibition studies using speci®c inhibitors on polyacrylamide gels suggested that the slowest of these three esterases is a cholinesterase, while the other two are carboxylesterases with a preference for b- over a-naphthyl acetate. Key words. Blattella germanica, carboxylesterase, cholinesterase, elevated esterase, elevated glutatione S-transferase, multi-resistance, Malaysia. Introduction The development of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, is a common problem for the pest control industry. German cockroaches are resistant to all major groups of insecticides (Cornwell, 1976; Cochran, 1995). Most reports of B. germanica resistance involved dose± response bioassays (Bennett & Spink, 1968; Batth, 1977; Rust & Reierson, 1991; Zhai & Robinson, 1991), but do not detail underlying resistance mechanisms. Resistance mechanisms involving both increased metabo- lism [elevated monooxygenase, esterase and glutathione S- transferase (GST) activities] and target site insensitivity [altered acetylcholinesterase (AChE) and altered sodium channel (kdr-type) resistance] have been detected in B. germanica. Scott & Matsumura (1981, 1983) found kdr-type resistance in a DDT-selected strain of B. germanica. Increased monooxygenase and esterase activity in organophosphate- and carbamate-resistant strains were detected through biochemical assays and in vivo and in vitro metabolism studies (Siegfried et al., 1990; Siegfried & Scott, 1991, 1992; Hemingway et al., 1993a). Hemingway et al. (1993b) reported elevated cyto- chrome P 450 monooxygenase content of > 2-fold in seven of 15 pyrethroid-resistant strains studied. Recently, Valles & Yu (1996) reported increased activities of monooxygenases, aldrin epoxidase, phorate sulfoxidase, methoxyresoru®n O-deethy- lase, GSTs, esterases, cytochrome P 450 and cytochrome b 5 , and cytochrome c reductase in a resistant strain of B. germanica from Georgia, U.S.A. Earlier, we found that propoxur resistance levels in 10 Malaysian B. germanica strains reverted following pre- application of piperonyl butoxide and S,S,S-tributyl-phosphor- otrithioate (DEF) (Lee et al., 1996). Biochemical assays using a microtitre plate reader were used to obtain endpoint and kinetic readings for non-speci®c esterase assays in four of these strains. Esterases were further separated and character- ized by native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The possible involvement of AChE and GST resistance mechanisms were also studied. This is the ®rst report on resistance mechanisms in B. germanica from South East Asia. Materials and methods Cockroach strains Four ®eld strains of the German cockroach (Melia II, ChilliPadi I, TsimShaShui and HangTuah) were collected from Correspondence: Professor Janet Hemingway, School of Bios- ciences, University of Wales Cardiff, PO Box 915, Cardiff, CF1 3TL, U.K. E-mail: [email protected] # 2000 Blackwell Science Ltd 11 Medical and Veterinary Entomology (2000) 14, 11±18 Medical and Veterinary Entomology (2000) 14, 11±18

Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

  • Upload
    c-y-lee

  • View
    215

  • Download
    2

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

���������� ������������� �� � ��������� ������ ��� ��� ���� ��������� ��������� �������� ����������

� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � ��� � � � � � � � � ������� ������� �������� �� �� !����� �" # ���$ ��� !� ������ �� %��� � !� �� ���&� �� �����$� ���&� �� ��� �!����� �"

# ��� ������ �� %��� �& �" ����� ���� ""� ��'�

�������� (�� )��� *�� ����� � �� ��� ������ +����� �+� �" "�,� ���&� �� -���.

��������� ���� �� �" ��� ���+�� ���/������ ��������� ������� 0� ����,�1

02 ��&�)����3 #������� ���1� 4��� ��������� 5�� 4 �� * ����+ ��� ����&� ��� ��� %�

)��&���&��+ �� $�� �������)����� � 0����1� ���%���� �������� ��� % �& 0�� ��4 ��

+������� "��6,���&1 ��� ������� ����&����� ��������� 0��4 "��6,���&1 4��� ��������

� ��� -��� ���� ��� 4� �� ���%���� $�,���� ��� !.�����"����� ��%��� 4��� )������ �

���& �4� ���� ��� !�%�� �������� *���� 4��� ��)������ *& ��� %� ����7 � $������

����� �& ���,���� � ����� *���� � ��� ��� ����� ���� �� ��+)���� �� ��� �,���)� *��

���� �� �� * � �� ��,� �� ,� �$ �)�� -� �� * ���� �� )��&���&��+ �� $��� �,$$�����

���� ��� ���4��� �" ����� ����� ��������� � � ���� ���������� 4� �� ��� ����� �4� ���

���*�8&���������� 4 �� � )��"������ "�� �. �%�� �.��)���&� ��������

��� ����� ��������� �������� ���*�8&���������� ���� ���������� ���%����

��������� ���%���� $�,��� ��� !.�����"������ +,�� .��� ������� ���&� ��

� ��������

(�� ��%���)+��� �" ����� � �� ��� ������ � ��� ���+��

���/������ ��������� �������� � � ��++�� )��*��+ "�� ���

)��� ������� ��,���&� ���+�� ���/������� ��� ��� ����� �� ���

+�9�� $��,)� �" ����� � ��� 0����4���� :;<=7 �������� :;;>1�

��� ��)���� �" �� ������� ��� ������ �%��%�� ����?

���)���� * �����&� 0#������ @ !) �/� :;=A7 #����� :;<<7

�,�� @ �� ������ :;;:7 B�� @ ��* ����� :;;:1� *,� �� ���

���� � ,�����& �$ ��� ������ +����� �+��

��� ������ +����� �+� �%��% �$ *��� �������� +���*�.

� �+ C���%���� +����8&$������ �������� ��� $�,���� ��� !.

�����"����� 0�!(1 ��� % � ��D ��� ���$�� � �� ����� � % �&

C������� ����&����� ��������� 0����1 ��� ������� ��� ,+

������� 0 ��.�&)�1 ��� ������D ��%� *��� �������� � ��

�������� !���� @ ���,+,�� 0:;A:� :;AE1 "�,�� ��.�&)�

��� ������ � � 22(.�������� ���� � �" �� �������� ��������

+����8&$����� ��� �������� ��� % �& � ��$���)���)����. ���

���*�+���.��� ����� ���� �� 4��� �������� ����,$� * ����+ ���

����&� ��� ��� ��� ���� +���*�� �+ ��,� �� 0! �$"� ��

�� ���� :;;F7 ! �$"� �� @ !����� :;;:� :;;G7 ��+ �$4�& �� ����

:;;E�1� ��+ �$4�& �� ��� 0:;;E*1 ��)����� ���%���� �&��.

����+� �H>F +����8&$����� ������� �" I G."��� � ��%�� �" :>

)&������ �.��� ����� ���� �� ��,� ��� �������&� ������ @ �,

0:;;=1 ��)����� �������� ��� % � �� �" +����8&$������� ���� �

�)�8 ����� )������ �,�"�8 ����� +����8&�����,-� �.�����&.

����� �!(�� ���������� �&������+� �H>F ��� �&������+� *>� ���

�&������+� � ���,����� � � ��� ����� ���� � �" �� �������

"��+ ����$ �� ��!���

���� ��� 4� "�,�� ���� )��)�8,� ��� ������ ��%��� � :F

���&� �� �� ������� ���� �� ��%����� "����4 �$ )��.

�))� ��� �� �" ) )����&� *,��8 �� ��� �����.�� *,�&�.)���)���.

��� �� ���� 02�J1 0��� �� ���� :;;=1� # ����+ ��� ����&� ,� �$

� + ���� ��� )���� ������ 4��� ,��� �� �*�� � ���)� �� ���

/ ��� � ���� �$� "�� ���.�)�� -� �������� ����&� � "�,� �"

����� ���� ��� ��������� 4��� ",����� ��)������ ��� ���������.

5�� *& ��� %� )��&���&��+ �� $�� �������)����� � 0����1�

(�� )��� *�� �%��%�+��� �" ���� ��� �!( ��� ������

+����� �+� 4��� ���� ��,� ��� (� � � ��� -��� ��)��� ��

��� ������ +����� �+� � �� ������� "��+ !�,�� ���� �� ��

������� � � �������

��� ����� �����

J�,� -��� ���� �� �" ��� ���+�� ���/����� 0�� � �

�� �� ��� � (� +!��!�, ��� ���$(,��1 4��� ��������� "��+

������)�������3 ���"����� ����� ��+ �$4�&� !����� �" # ��.

� ������ �� %��� �& �" ���� ���� ""� �� #�8 ;:>� ���� ""� �J:

E(�� ��'� �.+� �3 ��+ �$4�&K���� ""����,/

� GFFF #���/4��� !� ���� ��� ::

������ �� �������� ��������� 0GFFF1 ��� ::?:A������ �� �������� ��������� 0GFFF1 ��� ::?:A

Page 2: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

����� ��� �����,����� � ',��� �,+),�� ���&� � 0��� �� ����

:;;=1� (�� � ��� ������ )��-��� ��� ���4� � (�*�� :� �

�,���)� *�� ���� � 0�1 "��+ B����� �$�����+ ����� ��������

� ��� ��'�� 4�� ,��� "�� ��+)�� ����

��������� ������

��,�� +��� �� ������� �$�� G?H 4��/� 4��� "��5�� �� ?

<F�� )� �� �� * ����+ ��� ����&�� J�� ���� ����&�� ��� ����

�" ���� ����� 4�� ��+�$�� 5�� � GFF�� �" :L (� ��� M.:FF

)���)���� *,""��� F�: � )� <�= 0(� ��� *,""��1� J�� ��� �����

* ����+ ��� ����&�� ��� ��+� ���� �" ��� ����� 4�� ��+�.

$�� 5�� � >FF�� �" � �� ���� 4����� ���� ��+�$����� 4��

� �,��� >�� �),� �� :F FFF � "�� G + � ��� ��� ���,�� �$

�,)�������� ,��� �� ��� ��5&+� ��,����

����� ���.�)�� -� ��������� ��� �!( ����&� 4���

)��"��+�� �� ����� *�� *& ��+ �$4�& �� ��� 0:;;E�1� J�� ���

���� ����&� G� G>�� �" �� % �,�� ��+�$����� 4��� �����

�� + ���� ��� )���� 4���� ��� ��� %��,+�� 4��� +��� ,) ��

:=F�� 4 �� (� ��� *,""��� "����4�� *& :F�� �" F�F: >�>.

� �� �* �.G.0� ���*��5� � �� �1� (� ��� -��� ��)� ����� G>��

F�F: ����&��� ����� �� �� �� 0�(�1N)��)�8,� 0;�AA +�

�(� O F�:G +� F�: )��)�8,�1 4�� ������ 4� �� �� ���

������ ��)� ����� ���& G>�� F�F: �(� 4�� ������ (��

/ ��� � ���� �" ����,� "��+�� �� � ���� 4��� 4�� +���,��� ��

HF> �+ "�� > + � ,� �$ � ��+�8 ' ��� � ���)���� ������

0����,��� 2�% ��� ���)�� �/ �$��+� ��'�1�

���.�)�� -� �������� ��� % �& 4�� +���,��� 4 �� ���

�,*������� �.� �.��)���&� ������� 0��1 ��� �.� ���)���&�

������� 0����1� J�� �� ����&�� G� GF�� ��)� ����� �"

+ ���",$�� �,)�������� �" ���� ����� 4��� ,���� (� ��� -���

��)� ����� GFF�� �" F�E + �.�� � )���)���� *,""�� F�FG

0)� <�G1 4�� ������ ��� �� ��� ������ ��)� ����� GFF�� �"

F�E � �.��� �"��� > + � ��,*�� ��� >F�� J��� #�,� #

���,� �� 0= + J��� #�,� # � E�>L ��� ,+ ��,�&� �,�)����1

4�� ����� ��� ��� + 8�,�� ��,*���� "�� > + �� (��

���������� �� �" )���,��� 4��� �����+ ��� �� ><F �+ �� ��

���)� ��� ����,����� "��+ � �������� �,�%� �" �. �� �.��)������

J�� ��� ���� ����&� :F�� �" + ���",$�� �� �������

�,)�������� 4�� ����� �� ��� + ���� ��� )���� ��� GFF�� �"

���� 4��/ �$ ���,� �� 0EFF�� F�: ���� � ������ �� ��

O G;�< +� F�F> )���)���� *,""�� )� <�H1� (�� )���� 4�� ����

�� HF> �+ "�� G + �� (�� ���� �" "��+�� �� �" �.� ���)�����

4�� �����+ ��� / ��� ����& ��� ���%����� ��� �*���,�� ,� ��

*���� �� )���� � ���������� �� ��� ��� )���,�� �8� ��� ��

���"-� ��� �" =�>E�?: 0������� �� "�� )��� ���$��1�

�!( ��� % �& 4�� +���,��� *& ��� �$ GFF�� �" :.������.

G�H.� � ���*��5��� 0�2�#1N���,��� $�,���� ��� 0�!�1 4��/.

�$ ���,� �� 0GE�<> +� F�F: �!� )���)���� *,""�� F�: �

)� =�> O :�G> +� F�F=E �2�# � +�������1 ��� G�� �" >�� �,��� �,)��������� (�� ����� �� 4�� ���� ���� �� EHF �+ "��

> + �� ��� ��� ��� % �& �" �!( 4�� ����,����� ��� �*���,��

,� �� *���� �� ��� �8� ��� �� ���"-� ��� >�<= +?:

0��+ �$4�& �� ���� :;;E�1�

����� � ����&� 4��� *���� �� ��� +����� �" #���"���

0:;<=1� ���",$�� ��+�$����� 0:F ��1 "��+ ���� ����� 4��

����� �� EFF�� # �.��� ����� � ����& ���$��� 0� �,��� >�"��+ ����/1� ��,*���� "�� > + �� ��� ���)� �� �*���*����

+���,��� �� ><F �+� ����� � ���������� �� 4�� �����+ ��� *&

���%��� �$ ��� �*���*���� ��� ���������� �� *���� �� �

*�% �� ���,+ ��*,+ � �������� �,�%��

����� ����

���,)� �" :F ��,�� +���� 4��� ��+�$�� 5�� � E +�

)���)���� *,""�� 0)� <�=1 ��� �),� �� :: FFF � "�� :F + � ��

H��� (�� �,)�������� 4�� ,��� �� ��� ��5&+� ��,����

��� �������)����� � 4�� )��"��+�� �� � <�>L %��� ���

)��&���&��+ �� �,�� �$ $��� (�� ��+)��� 4��� )��)���� *&

��� �$ GF�� �" >L 8&���� �&���� +��/�� �� >F�� �,)���������

(� �N�2(�N*�� � �� � ���,� ��� F�: 0)� A�F1 4�� ,��� �� ���

��������� *,""��� �������)����� � 4�� )��"��+�� 4 �� � # �.

��� � ������� �������)����� � �&���+� (�� + ���� ���� �"

��+)�� 4�� ������ ��� ���� 4��� ��� ��� $��� 4��� �,� ��

:>F � ,�� � ��� +��/�� 4�� 4 �� � : �+ �" ��� $�� *���� ����

4��� ��,*���� � :FF +� �" =FF + �" �. ��� �.�� �

)���)���� *,""�� "�� > + � ��� ��� ��� 4 �� ��� ��� � �� �"

: +� F�F> J��� #�,� #�

�� * � �� ��,� �� 4��� ���� *& ��,*�� �$ ��� �������)���.

���� $�� � ;= +� �" :F?H )��)�8,� � )���)���� *,""��

0)� <�=1 "�� :F + �� �"��� ��,*�� ��� G +� ���� �" F�FE �.

��� �.�� 4��� ����� ��� ",����� ��,*���� "�� > + � *�"���

: +� �" F�F> J��� #�,� # 4�� ������ �8)�� +���� 4���

��)����� "�� ����� ����� � ��� 0)����8��� +����8��� )��+�.

��� � ��� �&)��+���� �1 �� ��� ��+� ���������� ���

���� "��6,��� �� 0�J1 4��� ��� +���� "�� ������� �����

���%���� �������� ��� �!( *& ���,+ �$ ��� )�),��� ��� 4���

� ����&? � �*,�$ �6, � *� ,+ 0J�������� :;A:1 ,� �$ ���

+���,��� "��6,���& �" ��+�5&$�,� �,���)� *��� � ����

���� ��

���� �� ��� ������ )��-��� 0"��+ ��� �� ���� :;;=1 �" "�,� ��� �����

���� �� �" ���+�� ���/������� ,��� � �� � ��,�&�

��� ������ ��� � �� �2>F 0��>F1

����� � ��

O �&���$ �� �� � �� �� )�� (� +!��!�� ���$(,��

���)�8,� >E�: E=�E <�> E;�<

O �#� E�G G�E :�G =�;

O 2�J ;�E >�< H�: >�>

#��� ����* I =:�H HA�A ::�E I =G�A

�����)&� "�� H�G H�< G�F H�G

�&)��+���� � :E�: A�E >�; GG�F

O �#� G:�E GH�G A�E ?

O 2�J GE�: :E�: <�F ?

���+���� � :H�G :H�> <�H ?

O �#� :<�F :<�: :>�E ?

O 2�J G:�E G:�E H�: ?

�������� � ? >G�E :>�> ?

2����+���� � :;�A GE�A >�= ?

22( I =�G I =�> I =�E

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

:G �� � !�� �� ���:G �� � !�� �� ���

Page 3: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

������

���� �����

2 ��� *,� �� )������� �" )�������$� )��)�8,� �� * � �� �"

���� ��� % �& � "�,� ��� ����� ���� �� 0"+�� � P E�E<:;�

"�� �� ��� P :E�:;EG� "(� +!��!�, P A�GE;A ��� "���$(,�� P

E�:>E>1 4��� � $� -�����& � ""����� 0� Q F�F:1 "��+ ����� �"

��� �,���)� *�� ���� � 0J $� :1� (�� � )�������$� ��� % �& ����

���$�� 4 ���&� �� ��� �$ ������$���,� )�),��� ���� (�� +���

)�������$� ���� ��� % �& ��+� � �$ � ��� )��)�8,�. �� * ���

"���� ��� 4��� � $���� � �� �� ��� ��� ���$(,�� ���� ���

"����4�� *& ��� �� � ��� (� +!��!�, ���� ��� !�+�

�� % �,��� � ��� ��� ����� ���� �� ���4�� )�������$� ����

��� % � �� �" I :FFL � ��� )��)�8,�. �� * ��� "���� ��� (��

���,��� �,$$��� � ��4 "��6,���& �" ������� ���� � ��� ��� �����

���� �� *���� �� ��� �8)����� ==�>?AFL )��)�8,� �� * � �� �"

���� ��� % �& � �,���)� *�� �� % �,����

��#����$� �������� ������

��� ���� �� ��+��������� � $� -�����& 0"�� � P :E�H>>A�

"�� �� ��� P <�>:F=� "(� +!��!�, P G�AAFF� "���$(,�� P :�<EH<=7

�Q F�F:1 ���%���� ���.�)�� -� �������� ��� % � �� 4 �� �.��

��+)���� �� ��� �,���)� *�� ���� � 0J $� G1� �������� ��� % �&

���$�� "��+ F�FFH �� F�:>A �+�� �.��)����� )���,��� + �?:

+$?: )���� � � ��� �,���)� *�� ���� �� � ��� ��� ����� ���� ���

�������� ��� % �& 4�� � ��� ���$� F�F:=?F�A:G� F�F>=?F�>H<�

F�F:A?F�HG> ��� F�F;E?F�E=G �+�� �.��)����� )���,��� + �?:

+$?: )���� � � �� � � �� �� ��� � (� +!��!�, ���

���$(,��� ���)��� %��&� (���� 4 ��� ���$�� ��R��� ���

������$��� �& �" ��� ��� ����� ���� ���

�� �.��� � $� -�����& � $��� 0"+�� � P ;�:AG;�

"�� �� ��� P <�>E;F� "(� +!��!�, P :�>>=E� "���$(,�� P G�:;F>7

� Q F�F:1 �������� ��� % �& 4�� ���� �������� � ��� ��� �����

���� �� �%�� ��� �,���)� *�� ���� � 0J $� E1� 2 ��� *,� �� )�������

�" ��� ��� ����� ���� �� ���� � ""���� � $� -�����& 0"�� � P

:>�F;>:� "�� �� ��� PA�F<G=� "(� +!��!�, P G�AH<A ���

"���$(,�� P >�G:A>7 � Q F�F:1 "��+ ��� �,���)� *�� ���� � 4���

����&�� �$� ��� ���� 0J $� H1�

#���,�� ��+�$����� "��+ ��� ��+� �� % �,��� 4��� ,��� �

��� ����& 4 �� *��� �. ��� �.��� ��+)�� ���� *��4���

�&����&� � ��� % �& ��� )��� *��� ���.�)�� -� �������� �" ���

�,���)� *�� ��� ����� ��� ����� ���� �� ��+��������� � $� -.

�����& $������ 0�� P GF�A>>H� ��� �� ��� P >�H:G:� �(� +!��!�, P

G�<F>H ��� ����$(,�� P <�G<>F7 � Q F�F:1 �&����&� � ��� % �&

�$� ��� �.�� ���� �.��� ��4�%��� �� � $� -���� � ""������

0�P :�GA;E7 � P F�:;AE1 *��4��� �&����&� � ��� % � �� 4 �� ���

�4� �,*������� 4�� �������� "�� ��� �� � ���� ��

��� �������� ��� % �& ��� )��)�8,� ��� ������ ��%��� 4���

4��� ���������� 4��� �,*9����� �� ��$���� �� ����&���� �� �.

��� ��� ����� ���� ) *��4��� �������� ��� % �& ��� )��)�8,�

��>F� 4�� �P 0F�F;F� F�F:<1 O 0F�FFH� F�FF:1%� 4����

�P �+�� �.��)����� )���,��� + �?: +$?: )���� � ��� %P )��.

)�8,� ��>F7 &G P F�AG<=7 � P F�FEG:� � $��� �������� ��

�!� �� ����&����� ��������� �� * � �� )��-��� "�� �,���)� *�� 0�1 ��� ��� ����� ���� �� �" ��� ���+�� ���/�����

0�8)������ �� )�������$� ����&����� ��������� ��� % �& � ��� )��)�8,�. �� * ��� "���� ��1�

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :E��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :E

Page 4: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

�!� "� �������� ��� % �& )��-��� � )�),��� ��� �" �,���)� *�� 0�1 ��� ��� ����� ���� �� �" ��� ���+�� ���/�����

4 �� ��� +���� �,*������ �.��)���&� ��������

�!� #� �������� ��� % �& )��-��� � )�),��� ��� �" �,���)� *�� 0�1 ��� ��� ����� ���� �� �" ��� ���+�� ���/�����

4 �� ��� +���� �,*������ �.��)���&� ��������

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

:H �� � !�� �� ���:H �� � !�� �� ���

Page 5: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

*��4��� �������� ��� % �& ��� )��)�8,� ��>F ���� ���,����

4 �� �.�� C� P 0F�:=:� F�FF>1 O 0F�FFE=� F�FFFG1%� 4����

�P �+�� �.��)����� )���,��� + �?: +$?: )���� � ��� % P )��.

)�8,� ��>F7 &G P F�;<E>7 �P F�FF:;� �� ���� ��� ����� ��.

�� ) 4�� �P 0:H�AE� :�EA1 O 0F�H>� F�FH1%� 4���� �P�+�� �.

� ���)����� )���,��� + �?: +$?: )���� � ��� %P )��)�8,�

��>F7 &G P F�AA;;7 �P F�F:=F�

��) �����

2 ��� *,� �� )������� �" �!( ��� % �& � ��� �,���)� *�� ���� ��

4��� ��+)���*�� �� ���� � ��� (� +!��!�, ���� � 0" P :�H;A<7

�I F�F>1� *,� � $� -�����& � ""����� "��+ ����� �" ��� �� �

0"P :=�=<HE7 � Q F�F:1 ��� ���$(,�� 0"P :E�:::;7 �Q F�F:1�

4� �� ��� $������ ��� % � �� 0J $� >1� (�� � ��� *,� �� )������ �"

��� �,���)� *�� ���� � 4�� ���� � $� -�����& � ""�����

0"P :�A:EF7 � Q F�F:1 "��+ ���� �" ��� �� �� ��� ���� �� 4� ��

��� ��4�� �!( ��� % �&� (�� �!( ��� % �& � ��� *,� ��� �" ���

�� (� +!��!�, ��� �� �� ��� ���� �� "��� 4 �� � � �����4

���$�� +)�& �$ ���� ��� )�),��� �� ��� ��+�$���,�� �" ���

���� ��� ��� ���$(,�� ���� � ��� ��� � $���� +��� �!( ��� % �&�

"����4�� *& ��� �� � ���� ��

�������� *��� ������� �� ������� �*�� ��+���

!�%�� �������� *���� 4��� �������� �� ��� %� ���� � ���

���� ��� #���� �:� �> ��� �< �" �� � � �� �� ��� ���

���$(,�� 4��� +��� ������ 4��� ��+)���� 4 �� ����� �" ���

�,���)� *�� ���� � 0J $� =1� #���� �> ��� �< �" �� � ���

�� �� ��� 4��� ���% �& ��� ���� (�� ��� � �$ ����� �& �"

�������� *���� �" (� +!��!�, 4��� 6, �� � + ��� �� ����� �"

��� �,���)� *�� ���� �7 ���& ��� �< *��� 4�� +��� ���% �&

��� ����

��� �,*9����� �� )��)�8,� 0:F?H 1 �� * � �� *�"���

��� � �$� ��� �: ��� �G *���� �" ��� ���� �� � ��))������ 4� ��

*��� �< ��� ���,��� ��� � �$ 0J $� =1� #���� �E?�= � ���

���� �� 4��� ��� �� * ��� *& )��)�8,�� ����8�� �� :F?H

�� * ��� *���� �:?�H� ��� )��� ���& �� * ��� *���� �>?�< �

��� ��� ����� ���� ��� #��� �< �" ��� �,���)� *�� ���� �

� ��))����� �"��� +����8�� �� * � ��� �����8�� �� :F?H

������& �� * ��� ��� �������� *����� ���� �" ��� *���� 4���

�� * ��� *& :F?H )��+���� � �� �&)��+���� ��

���� "��6,��� �� �" ������� ����� ���%���� �������� ���

�!( � ��� ��� ����� ���� �� 4��� ��� +���� *���� �� ���

"��6,���& �" �,���)� *�� ��+�5&$����� ������� ���� ������

"��6,��� �� � ��� "�,� ��� ����� ���� �� 4��� ��4� ���$ �$ "��+

F�FE �� F�FA 0(�*�� G1� �� � ��� ��� � $���� "��6,���& �"

���%���� ��������� (�� � $���� ���%���� �!( "��6,���& 4�� �

��� ���$(,�� ���� � 0F�=A1� "����4�� *& ���� �" ��� �� �

���� � 0F�:<1� 4� �� ��� ����� �4� ���� �� 0�� �� ��� ���

(� +!��!�, 1 ���& ����� ��� �,���)� *�� ��%��� �" �!(

��� % �&�

$��������

(�� ���,��� "��+ �� � ��,�&� ��� ��� �� ��� 0:;;=1� �,$$��� ���� �

���$� �" ��� ������ +����� �+� ���,� � "�,� ��� ����� ��

�!� %� �������� ��� % �& )��-��� � )�),��� ��� �" �,���)� *�� 0�1 ��� ��� ����� ���� �� �" ��� ���+�� ���/�����

4 �� ��� +���� �,*������ �.� ���)���&� ��������

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :>��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :>

Page 6: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

������� ���� �� "��+ ���&� �� (�� �� � � ���$(,���

�� �� ��� ��� (� +!��!�, ���� �� ��+��������� +,�� )��

��� ������ +����� �+�� ��� ������� ����� ���%���� ��������

��� +����8&$������ ��� �4� �" ��� ���� �� ��� ���%���� �!(

��� % �&� � ",����� ���.+���*�� � ��� ������ +����� �+ 0��$�

��.�&)�1 +�& *� )������ � ��� "�,� ���� ��� �,$$����� *& ���

� $� ��%��� �" 22( ��� )&������ � �����.��� ������� 4� �� �

��� �""����� *& �&���$ ��� 0��� �� ���� :;;=1�

� ��� ��� ����� ���� ��� �� ������� ���� ���,���� �� � %��&

��4 "��6,���& 0Q :FL1� (� � �,$$���� ���� �� � ��� ������

+����� �+ � +��� ��++�� � ���&� �� -��� )�),��� ���

���� ����� "��+ ����� ���� ������ ��+ �$4�& �� ��� 0:;;E�1

�������� ��� ���� � 4� �� )�������� �� ������� ���� � :>

���� �� ���� 4��� �8�+ ���� (�� ��4 ��$���)���)���� ��� � $�

���*�+��� ��� ������ ��������� �� �� �" �� � ���� � 4��� %��&

� + ��� �� ����� �" ��� ��� ����� ���� �� ,��� � �� � ��,�&� ���$.

���+ )��)�8,� ,�� � ���&� � 0I :F &���� 4 �� * .4��/�& ��

+�����& �))� ��� ��1 )��*�*�& ����,��� "�� ��� � $���

"��6,���& �" ������� ���� "�,�� � ��� ���� �� ,��� � �� �

��,�&� ���� ��� ! �$"� �� @ !���� 0:;;F1 � � ��� -�� �� �

+����� �+ � ����� +,�� )�� ��$���)���)����. ��� ���*�+���.

��� ����� ��!��� ���� ��� #& ��������� ������� ���� � ��++��

� ����� ����� )���� �,�� �� +��6, ����� ���"��))��� ���

��,��R �� 0��+� @ 4���� :;<:� :;<A7 (� )��� @ �S#� ���

:;<E7 ��+ �$4�& �� ���� :;A=7 ��&+��� �� ���� :;A=1�

���%���� �������� ��� % �& ��� *��� +,�� ��)����� �� �

��� ������ +����� �+ � �� ������� 0! �$"� �� @ !����� :;;G7

��+ �$4�& �� ���� :;;E�7 ���)�,$� �� ���� :;;H7 ��� �� ����

:;;H7 !����� �� ���� :;;=1� � �� � ��,�&� ����� ���.�)�� -�

�������� ��� % �& 4�� ��,� �� ,� �$ ��,�� +��� ���+��

���/�������� ���%���� �������� ��� % �& 4�� �������� � ��� �����

���� �� 4��� ��+)���� �� ���� �" ��� �,���)� *�� ���� �� (� �

+�& *� �,� �� �������� �����&� � �"-� ���& �� �%��)���,�� ��

�" ��������� ����,$� $��� �+)� -��� �� �� �%��.�8)���� ��

0��+ �$4�& @ '��,�������� :;;A1� ���,��� � �*���,�� ,� ��

"�� ��� �,���)� *�� ���� � 4 �� �. ��� �.�� 4��� � + ��� �� �����

�" ��+ �$4�& �� ��� 0:;;E�1� 4�� ,��� -���. ����� �&+)���

�,$$��� �$ ���� ����� � �� ���$� � ""������ � �������� ��� % �& �

��� �,���)� *�� ���� �� ������ �� ��� 0:;;H1 ���� "�,�� ��

� $� -���� � ""������ � �������� ��� �!( ��� % �& ���

�&������+� �H>F ������� *��4��� ���� ������ ��� ��,�� +�����

���.�)�� -� �������� � ��� �,���)� *�� ���� � ��� �����

��� ����� ���� �� ��+��������� $������ �&����&� � ��� % �&

��4���� �.��� �� ��+)���� �� �.��� (� � -�� �$ ����,��

4 �� ��+ �$4�& �� ��� 0:;;E�1� 4���� -%� �" :> ���� �� �"

���+�� ���/����� )��"����� �� �&����&�� �.�� ������ ���� �.

��� 4� �� :F ",����� ���� �� ���4�� �6,�� �������� ��� % �&

*��4��� ��� �4� �,*�������� (� � )����+���� ��� ���� *���

�*���%�� � ��.��� ����� ��+�+� �����+� 0��+ �$4�&

�� ���� :;A;*1� (���� ���.�)�� -� �������� ��� % �& ����������

4��� 4 �� )��)�8,� ��� ������ ��%���� (� � ��� ���� *���

�*���%�� � ��+� ���� �� �" �����)&� "��.��� ����� �� �������

0��+ �$4�& �� ���� :;;E�1�

���%���� �!( ��,��� 22( ��� ������ � ��,��R �� 0����/ @

!��+���� :;AH1 ��� � ����� ���� 4 �� 22( ��� ��$���)��.

�)���� ��� ������ � +��6, ���� 0��+ �$4�& �� ���� :;;:7

������ �� ���� :;;<1� ���%���� �!( ��� % �& 4�� ��� ����������

4 �� �����)&� "�� ��� ������ � ���&� �� �� �������� �� 4�

�!� &� ��,���� ��� !.�����"����� ��� % �& )��-��� � )�),��� ��� �" �,���)� *�� 0�1 ��� ��� ����� ���� �� �" ��� ���+�� ���/������

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

:= �� � !�� �� ���:= �� � !�� �� ���

Page 7: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

)��% �,��& ��)����� "�� �����)&� "��.��� ����� �� �������

"��+ ��� ��!��� 0��+ �$4�& �� ���� :;;E�1� ������� �!(

��� % �& �������� � �� � ��� ���$(,�� +�& *� ���� *,���

�� 22( ��� �������

!�%�� �������� *���� 4��� �������� *& ���.�����,� �$

)��&���&��+ �� �������)����� � � ��� ���� ��� �� ��� � ����

��5&+�� 4��� �������� � ��& �" ��� ���� ��� ���*��/���� @

'�+*�� 0:;;E1 ���� �� ��)����� :F �������� *����� (��

��� � ���� ����� *���� "�,�� *& ����� �,����� +�& *� �,� ��

� ""����� $�� ��� � �$ �� ��� )������� �" (� ���.M:FF � ��� �

��+�$�� 5�� �� *,""���

�������� *��� ��������� 5�� �� *& ���*��/���� @ '�+*��

0:;;E1 �,$$����� ���� ��� :F *���� 0�:?�:F1 ��)������ *����$

�� ���� ��������� 0*���� �:?�>1� )���)������ 0�=?�<1 ���

���*�8&��������� 0�A?�:F1 $��,)�� (�� ����� *����� 4� ��

4��� ��� �������� � �,� ��,�&� )��*�*�& *����$ �� ���

���� ��������� $��,) �� �8)������ $ %�� ��� ���/ �" � �����$���

� �,� ��+�$�� 5�� �� *,""���

� ��� �,����� ��,�&� ����� � �� � ���� �% ����� �� ���4

4� �� �������� ��5&+�� ��� �%��%�� � ����� � �� ��� �������

�����,$� *���� �:� �> ��� �< ���4�� +��� ������ *��� �$

)������� � ��� ��� ����� ���� ��� ���*��/���� @ '�+*�� 0:;;H1

�,$$����� ���� ��� �������� *��� 0�=1 � �%��%�� 4 ��

����� � �� ��� ������� (� � 4�� ��� +��� ��� %� ��5&+� ���

4�� �������� �� ����� �����."��� � �)�� -� ��� % �& 4���

��+)���� �� ��� ��5&+� � ��� �,���)� *�� ���� ��

��� ����� ���.�)�� -� �������� ��� % �& 4 �� ��� �,*������

���� �� ��� �,���)� *�� ���� � 4�� +,�� � $��� ���� ����

��)����� *& ���)�,$� �� ��� 0:;;H1 ��� ���*��/���� @ '�+*��

0:;;E1� (���� ��� �4� )��� *�� �������3 )� �" ��� ����& ��� ���

����& +����� ,���� � �� � ��,�&� ��� )� ,��� � ��� ��������

����& 4�� <�=� ��+)���� �� <�F �� <�H � ����� ��,� ��

0���*��/���� @ '�+*��� :;;E7 ���)�,$� �� ���� :;;H1�

2 ""������� � )� ��� �""��� �������� ��� % �& � �+��%

,+,+�(�����+� 0��+ �$4�& @ '��,�������� :;;A1 ��� �

�� ������� 0���*��/���� @ '�+*��� :;;E1� � ��� � ��� ���

� �$�� ����� + ���)���� ����� 6,� ,��� � �� � ��,�& �

)��*�*�& +��� ���� � %� ���� ��� �)�����)����+��� � +�����

,��� *& ���*��/���� @ '�+*�� 0:;;E1� 4� �� ��6, ��� $��,)�

�" �� ����� :F ������ )�� ����&�

��� ����!��� ��

������ 4�� �,))����� *& ��� ��� ��� �,�� �" �� �� ��)��� ���

���� *& ��� ��&�� !�� ��&� � ����/ B����� �$�����+ �����

��'� "�� �,))��� �$ ��� 4��/ �" ������ �� ��� �� %��� �& �"

����� ���� ""7 '��� (�� 0�� %��� � !� �� ���&� �1 "�� � �

������,�� %� �� � � �+� �� �� � +��,��� )�� (� � )�)�� ���.

�� �,��� � )��� �� �" ��� ��2 (��� � �" ������ �,*+ ���� �� ���

����,��� !����� �" �� %��� � !� �� ���&� �� � ����/ 2� ��

!+��� "�� ����� ��� ��� �������

����� ���

���)�,$�� 2�2�� ����� ����� '������� ����� ���$���� �� @ ���� ���

0:;;H1 ,�� )�� +����� �+� �" )&������ � ��� ������ � ��� ���+��

���/������ ��������� ������� 0��1� ������� ���������� ��

���������� ��� :EA?:HA�

#����� !�!� 0:;<<1 � �,�%�& �" ����� �� )�),��� ��� �" ��� ���+��

���/����� "�� ��� ������ �� ����� � ���� ����� �����������

���� H;?>G�

#������� �� � @ !) �/� �(� 0:;=A1 ����� � �� ��� ������ �" ���+��

���/������� "��+ %�� �,� ����� �" ��, � ���� -�+��� �( ������

���������� ��� HG=?HE:�

#���"���� �� 0:;<=1 � ��) � ��� ���� � %� +����� "�� ���

6,��� ��� �� �" + ���$��+ 6,��� � �� �" )���� � ,� � 5 �$ ���

)� �� )�� �" )���� �.�&� * �� �$� �������� ����������� ��

GHA?G><�

����/� ���� @ !��+���� ���� 0:;AH1 �% ����� ���� 22(.���&���.

����� ���� "��+ ��� ��,�� R& � � $�,���� ��� !.�����"������

������� ���������� �� ���������� � GH;?G=:�

�������� 2��� 0:;;>1 ����� � �� ��� ������� .�������� ��

�������� ��� ����� ��� ����� 0��� *& � '� �,��� �� �

�4��� ��� 2� �� �� �����1� ))� :<:?:;G� �8"��� �� %��� �& ������

��4 ���/�

����4���� ��#� 0:;<=1 )�� ��� ������ /������� �� ��� �����

������� � ����� ���� #,� ���� ���$��++��� �������

J�������� 2�!� 0:;A:1 /����+��� �� 0+������� ������� G��� ����

���$+�� ������ ��4 ���/�

��+�� �� @ 4���� (� 0:;<:1 ����� � %� ���� ��������� � ���

��/�$�4��� ���� � �" ��� $���� � �� ���"��))��� ���������%

������� ����� 0��+ )����3 � ������ ���1� �� ��,�� �" ��� ������

�� ���*�+��� ����� � ���� ������ ��������� �� 1������� ��

:AE?:;:�

��+�� �� @ 4���� (� 0:;<A1 !�,� �� �� ��� ���� ����� �" ���*�+���.

��� ������ � ��� $���� � �� ���".��))��� ���������% ������� �����

0��+ )����3 � ������ ���1� ����� ���� ) *��4��� ����� � % �& �"

����&����� ��������� ��� �����.��� ������ �� ���*�+��� ��� ��$���.

)���)���� ����� � ���� ������ ��������� �� 1������� �� :;F?

GFG�

��+ �$4�&� ��� !+ ��� ��� ��&�4������� '���� @ ������� ������

0:;A=1 J ��� ��� ��*������& ������ �� �" ��� ������� ����&����� ���.

������ ��� ������ $���� 4� �� ���"�� ��$���)���)���� ��� ���*�.

���� #� ��� +���� $��� "��6,��� �� �" ��+� )��� *�� ��� ������ +����� �+�

� "�,� ���� �� �" ���+�� ���/����� "��+ ��� ��,��� ���&� ��

� ������ "��6,���& 0�!�1

��� ������

+����� �+ �� � �� �� ��� (� +!��!�, ���$(,��

������� ���� F�F> F�FA F�FE F�FA

���%���� ��������� F�=> F�H< F�GF F�>F

��,���� ��� !.�����"����� F�:< F F F�=A

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :<��������� ���������'��� �( �������� �������� ����� ��� ������� :<

Page 8: Biochemical characterization of insecticide resistance in the German cockroach, Blattella germanica, from Malaysia

+��� ��� ������ � +��6, ����� �+���� �( ����������� &��������

��� :GE?:EF�

��+ �$4�&� ��� �����$���� �� @ ',���/� 2��� 0:;A;1 (�+�)���

��� ������ � ��+�+� �����+�3 � ��+)���� %� ��,�& *��4���

���%�� ��� ��,��� �" ��� "����� ��� ��%���� ���� �� �" �� � �)�� ��

��+)��8� �+���� �( ����������� &�������� ��� =>;?==;�

��+ �$4�&� �� @ '��,�������� !������� 0:;;A1 ��6, �� ���*�8&���.

�������� � ��% �4 �" ��� +����,��� * ���$& ��� * ����+ ���& �" �

+�9�� ��� ������ +����� �+� ������ �� �������� ����������

�� :?:G�

��+ �$4�&� ��� &�+���� �� @ ������� ������ 0:;;:1 � )��� *�� ��%��

� �/ *��4��� ��$���)���)���,� ��� 22( ����� � �� ��� ������

$���� � ��������3 �,))��� �$ �% ����� "��+ "�� ����� �� +���.

*�� �+ ��,� ��� ������� ���������� �� ���������� �� H;?>=�

��+ �$4�&� ��� !+���� ���� @ ����� ���� 0:;;E�1 ���� *��

+����� �+� �" ��$���)���)���,� ��� ���*�+��� ����� � ��

��� ������ � ���+�� ���/������� 02 ��&�)����3 #������� ���1 "��+

� ""����� $��$��)� ��� ������ -�+��� �( ������ ���������� ���

:=GE?:=EF�

��+ �$4�&� ��� 2,�*��� !���� ����� ���� @ !+���� ���� 0:;;E*1�

�&������ � ��� ������ � ���+�� ���/������� 02 ��&�)����3

#������� ���13 ��� ������ ��%��� ��� ,�����& �$ +����� �+��

-�+��� �( ������ ���������� ��� :=E:?:=EA�

���� ����� ��)� ����� ����$� ���� @ ���� ��!�(� 0:;;=1 ����� � ��

��� ������ ��� �&���$ �+ � -��� ��������� ���+�� ���/�������

02 ��&�)����3 #������� ���1 � ��� ��,��� ���&� �� �+���� �(

����������� &�������� ��� =<>?=AG�

���� ����� ' +� �� �� #��$� ���� @ ��� � '�!� 0:;;H1 !�,� �� �� ���

������ ���� ��� ����� ��� ������ ��� ��� �������� ��� % �& � ��� ���� �

�" ���+�� ���/������ ��������� ������� 0��1 �������� 4 ��

� �����%��� 2���� -�+��� �( ������ ���������� � <H?AF�

���*��/����� !�'� @ '�+*��� !�(� 0:;;E1 ��� % �& ��� �������)����� �

��������� 5�� �� �" ��������� � ����� � ��.��� ����� ��� �,���)� *��

���� �� �" ���+�� ���/����� 02 ��&�)����3 #������� ���1� -�+��� �(

������ ���������� ��� :FF;?:F:E�

���*��/����� !�'� @ '�+*��� !�(� 0:;;H1 !,*����,��� � ��� *,� �� ���

��������� 5�� �� �" �������� ����5&+�� "��+ ����� � ��.��� �����

��� �,���)� *�� ���� �� �" ���+�� ���/����� 02 ��&�)����3

#������� ���1� -�+��� �( ������ ���������� ��� >H:?>H>�

������� ��� ������� ��� J�,�� ��� 2�� ��,$���� ��� ���� ��� J��� @

��+ �$4�&� �� 0:;;<1 ���� �$ ��� ����� ��� �� �" � $�,���� ��� !.

�����"����� ����� $��� "��+ �������� ���*��� -�+��� �(

�������� ��������� �� >H=H?>H=A�

��&+���� �� J�,�� ��� 2�� #� ��� ���� �,��&� ��� #��$�� ��� �$� ��

� @ �����,�� �� 0:;A=1 ���� -��� �� �" ��� ������ +����� �+� �

�+��% ���� 02 )����3 �,� � ���1 "��+ !�,����� J�����3 ����� .

� %� ����&����� ��������� ��� ����8 "& �$ �8 ������ -�+��� �(

������ ���������� ��� :H>G?:H>A�

�,��� �'� @ �� ������ 2��� 0:;;:1 �����)&� "�� ��� ������ � ���+��

���/������� 02 ��&�)����3 #������� ���1 "��+ �����,������ -�+��� �(

������ ���������� ��� <E=?<HF�

!����"� ���� ��+ �$4�&� ��� �� �� #���� !+���� ���� @ #������� �� �

0:;;=1 (�8 ����$ ��� ��� * ����+ ��� ��������� 5�� �� �" ����� .

� �� ��� ������ � � -���.��������� ���� � �" ��������� �������

02 ��&�)����3 #������� ���1� -�+��� �( ������ ���������� ���

EGG?EE:�

!����� ���� @ ���,+,��� J� 0:;A:1 ��������� �� �� �" � 22(. ��,���

���� �" �����.��� ������ �� )��+���� � � ��������� ��������

������� ���������� �� ���������� ��� G:?G<�

!����� ���� @ ���,+,��� J� 0:;AE1 �% ����� "�� �4� �&)�� �" ��8 �

��� ��� �" )&������ �� �� �,���)� *�� ��� 22(.��� ����� ���+��

���/�������� ������� ���������� �� ���������� ��� :H:?:>F�

! �$"� ��� #�2� @ !����� ���� 0:;;F1 ���)��� �� ��� �� * � �� �"

����&����� ��������� � ��� ����� ��� �,���)� *�� ���+�� ���/.

������� 0��������� ������� ��1� ������� ���������� ��

���������� �� :GG?:G;�

! �$"� ��� #�2� @ !����� ���� 0:;;:1 ����� �+ ���)��� *�� "��

)��)�8,� ��� ������ � ��� ���+�� ���/������ ��������� �������

0��1� ������� ������ � :EE?:H=�

! �$"� ��� #�2� @ !����� ���� 0:;;G1 # ����+ ��� ��������� 5�� �� �"

�&����&� � ��� �8 ��� %� ��5&+�� � ����� � �� ��� ����� ���

�,���)� *�� ���� �� �" ��� ���+�� ���/����� 02 ��&�)����3

#������� ���1� -�+��� �( ������ ���������� ��� :F;G?:F;A�

! �$"� ��� #�2�� !����� ����� ��,��� ��(� @ B� ������ #��� 0:;;F1

# ����+ ���& ��� $���� �� �" �����)&� "�� ��� ������ � ��� ���+��

���/������ ��������� ������� 0��1� ������� ���������� ��

���������� �� ::F?:G:�

(� )��� � ��'� @ �S#� ��� ��2� 0:;<E1 ����� � % �& �" ����&����� ���.

������ �� � "����� � ��� ������ �" ��,�� R �� �� ��� ��$���)���)����

��*��� ������� ���������� �� ���������� � H;>?H;A�

������� !�� @ �,� !��� 0:;;=1 2����� �� ��� * ����+ ��� ���������.

5�� �� �" ����� � �� ��� ������ � ��� ���+�� ���/�����

02 ��&�)����3 #������� ���1� -�+��� �( ������ ���������� ���

G:?G=�

������� !��� �,� !��� @ '������� ���� 0:;;H1 2���8 "& �$ ��5&+�� �

��,��� ��� �&+)�� �" ��� ���+�� ���/�����3 �% ����� "�� � ""�����

+ �����+�� +����8&$����� �&���+�� ������� ���������� ��

���������� ��� :AE?:;F�

B�� � �� @ ��* ����� ��� 0:;;:1 �&������ � ��� ������ � � -���

)�),��� �� �" ���+�� ���/������ ��������� ������� 0��1�

-������ -�+��� �( ������ 1������� �� GH:?GHH�

����)��� :G �,�� :;;;

� GFFF #���/4��� !� ���� ���� ������ �� �������� ���������� ��� ::?:A

:A �� � !�� �� ���:A �� � !�� �� ���