Bioassay- guided fractionation of methanolic extract of Costus sp.

Carla Stephanie Colón CintrónUniversidad de Puerto Rico en Cayey

Diabetes en Puerto RicoLa diabetes es una enfermedad crónica degenerativa que abarca un grupo de desórdenes metabólicos caracterizados por altos niveles de glucosa en la sangre.

“En Puerto Rico el porcentaje estimado de adultos que alguna vez en su vida han sido diagnosticados con diabetes ha aumentó de 8.5% en el año 2000 a 10.6% en el año 2004. Esto coloca a Puerto Rico en la primera posición, en términos de la prevalencia de diabetes, entre los estados y territorios de los Estados Unidos.”1

1: Orville M. Disdier Flores, BS, MS; Epidemiólogo, Departamento de Salud de Puerto Rico.

“En términos del manejo de la diabetes, aproximadamente el 32.7% de las personas viviendo con diabetes utilizan insulina, el 73.4% toman medicamentos orales y el 29% ha tomado alguna clase o curso sobre como manejar su condición.En Puerto Rico, solamente el 14.5% de los adultos consumen 5 o más servicios de frutas o vegetales al día, más del 61% están obesos o en sobrepeso, el 27% tienen hipertensión y a penas el 17% mantienen algún régimen de ejercicio. Estos son indicadores de que las medidas de prevención, control y tratamiento que se necesitan para lidiar con la diabetes en Puerto Rico requieren de estrategias complejas y multidimensionales.”1

1: Orville M. Disdier Flores, BS, MS; Epidemiólogo, Departamento de Salud de Puerto Rico.

Diabetes en Puerto Rico continuación…

Propuesta InvestigativaEs esta la necesidad que impulsa nuestra investigación, obtener datos favorables para una nueva opción de tratamiento. En esta se estudian extractos metanólicos de plantas pocos estudiadas, en mi caso, Costus spiralis (insulina) con el propósito de crear posibles soluciones terapéuticas, en mi caso el aumento de la capacidad antioxidante.Según estudios realizados Costus spiralis (insulina) ha mostrado alta actividad biológica como diurético, por su alto contenido de flavonoides.Los flavonoides son antioxidantes y ayudan a prevenir algunos de los desórdenes físicos que causa la diabetes.

Importancia de los Flavonoides Usos terapéuticos de los flavonoides2:

Mejoramiento de la acción de la vitamina C,Ayuda contra desórdenes cardiovasculares,Prevención del cáncer,Ayuda contra alergias y enfermedades autoinmunes,Protege el hígado,Es antiflamatrio,Alivia los síntomas de la arteriosclerosis,

Entre otros.

2: Alejandro Martínez M., Químico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia.

Flavonoides utilizadosDurante el estudio de los extractos de Costus spiralis (insulina) se utilizaron tres estándares, todos flavonoides.Estos fueron:

QuercetinaRutinaCatequina

Estándares (flavonoides2)Rutina- Se encuentra en la cáscara de los cítricos; fue considerada como la vitamina P, pero ya no se le conoce como tal. Es utilizada para tratamientos de hipertensión y en geriatría. Tiene efectos anticancerígenos potenciales.Catequina- Se encuentra en frutas como las uvas, ayuda a prevenir enfermedades coronarias e isquemias cardíacas. Presenta un papel importante contra la acción de la morfina.

2: Alejandro Martínez M., Químico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia.

Estándares (flavonoides) continuación…Quercetina 2- A mostrado efectos antiinflamatorios, ya que estabiliza las membranas de las células que liberan histaminas, reduciendo su liberación. Esta también inhibe la enzima que convierte la glucosa en sorbitol, un compuesto que está relacionado con las complicaciones diabéticas, incluyendo las cataratas. La quercetina mejora la secreción de insulina y protege las células pancreáticas del daño por radicales libres. Al igual que Rutina, tiene efectos anticancerígenos potenciales; y al igual que Catequina, presenta un papel importante contra la acción de la morfina. Por último, ayuda contra condiciones cardiovasculares.

2: Alejandro Martínez M., Químico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia.

Cromatografía de capa finaTécnica que permite separar (fraccionar) los componentes de una mezcla sustancias biológicas, basándose en el principio de adsorción selectiva. El término se deriva de chrôma, color, ya que los primeros ensayos del método tuvieron por objeto separar compuestos que eran naturalmente coloreados.En un principio se utilizó se utilizó la cromatografía para fraccionar e identificar moléculas pequeñas, como aminoácidos o azúcares, utilizando cromatografía de partición.

Datos históricosEl botánico ruso Mikhail Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y fue el primero en utilizar este término, es recordado como el padre de la cromatografía.Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de cromatografía de capa fina.Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de capa fina. Estandarizó los procedimentos, equipos y adsorbentes dando un auge a la técnica simple, a bajo costo y eficiente.

Diseño ExperimentalSe proceden a analizar dos extractos metanólicos de Costus sp., previamente preparados en el laboratorio mediante extracción sólido-líquido (soxhlet) y sometidos a cromatografía de columna cada uno por individual. Las fracciones obtenidas por cromatografía de columna se someten a análisis mediante cromatografía de capa fina.Condiciones para realizar cromatografía de capa fina:

- Estandares metanólicos:- Rutina- Quercetina- Catequina

Diseño Experimental- Fase móvil: acetato de etilo, metanol y ácido acético

en una proporción de 80:20:1- Solvente para extractos: Metanol (99.8 + %)- Preparación de cámara de desarrollo:

. Limpiarla y secarla

.Colocar papel absorbente y saturarla con la fase móvil (asegurándose de que quede fase móvil en el fondo).

- Preparación de la placa:. Placa de silica gel 60 F254 TLC, plastic sheet (20 x 20 cm).

Diseño Experimental. Hacer las marcas correspondientes, como se

muestra en el siguiente dibujo:

* Se utiliza a lo largo, obteniendo 19 carriles para muestras (fraccciones).

1 cm

1 cm

Zona donde se colocan las gotas de muestra.

Zona hasta donde llega el solvente.

Identificar cada carril con el número de fracción, e identificar la placa con la fecha y extracto correspondiente.

Diseño ExperimentalDesarrollo de la cromatografía de capa fina:

- Utilizar un tubo capilar para colocar la gotas de muestra en la placa de TLC.- Mientras más pequeñas las gotas mejor.- Esperar a que se sequen las gotas de muestra en la placa.- Colocar la placa dentro de la cámara de desarrollo de manera uniforme.- Tapar la cámara y esperar a que la fase móvil alcance la línea superior de la placa.

Diseño ExperimentalRevelado de la placa de cromatografía de capa fina:

-Remover la placa de la cámara de desarrollo.- Colocarla sobre papel absorbente y esperar a que

se seque (precaución: trabajar dentro de un extractor).- Utilizar una lámpara UV para identificar las manchas en la placa (de haber alguna) y marcarlas con un lápiz.- Colocar la placa sobre un papel y rociarla con una solución de DPPH3 al 0.2% en metanol.- Pueden aparecer algunas manchas amarillas, de ser así, identificarlas con un lápiz.

3: DPPH es: 2,2- Di(4-tert- octylphenyl)-1-picryl-hydrazyl, free radical; sigma- Aldrich, lote 29802 KI (1-3).

ResultadosMasa del Primer extracto de Costus sp.

Masa de Muestra de hojas Liofilizadas = 3.15 ±0.01 gMasa de extracto recolectado = 2.4536 ±0.0001 g

Porciento de extracto por muestra= 77.9%

Número de fracciones Masa de fracciones (± 0.0001 g)

1 y 2 0.0042

3 y 4 0.0533

5 y 6 0.1187

7 y 8 0.8788

9 y 10 0.4887

11 -13 0.6505

14 - 19 0.4626

20 - 22 0.1549Masa total recolectada de las fracciones de Costus sp. = 2.8117 g (Nótese que a algunas fracciones tienen rastros de solvente)

ResultadosMasa del Segundo extracto de Costus sp.Masa del extracto recolectado = 0.8939 ± 0.0001 gA este segundo extracto se le realizó una cromatografía de columna y e obtuvieron 32 fracciones. La masa de cada fracción no se tomó, porque aún tienen solvente. Nos enfocamos en análisis de TLC de las fracciones recolectadas.

Análisis de Fracciones del Primer Extracto de Costus sp.

Análisis de fracciones de la primera cromatografía de columna

Rƒ del TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna)Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha

1 0 N/A

2 0 N/A

3 1 0.78

4 1 0.78

5 1 0.74

6 1 0.78

7 6 0.22, 0.41, 0.53, 0.64, 0.70, 0.76

8 5 0.22, 0.41, 0.55, 0.70, 0.77

9 3 0.21, 0.40, 0.74

10 3 0.20, 0.41, 0.76

11 1 0.20

12 1 0.21

13 1 0.19

14 a la 19 (cada una individual) 0 N/A

Segundo TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Rƒ del TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Número de fracciones Cantidad de manchas Rƒ de cada manchaRutina 1 0.16

Quercetina 0 N/A

Catequina 0 N/A

Extracto de Costus sp.(del: 20-06-08)

3 0.09, 0.27, 0.85

Extracto de Costus sp.(del: 26-09-08)

3 0.1, 0.25, 0.86

Fracción 1 y 2 0 N/A

Fracción 3 y 4 1 0.86

Fracción 5 y 6 1 0.85

Fracción 7 y 8 6 0.28, 0.51, 0.68, 0.74, 0.81, 0.86

Fracción 9 y 10 5 0.27, 0.52, 0.68, 0.81, 0.88

Fracción 11 y 13 1 0.28

14 –19(cada una individual) 0 N/A

Tercer TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Rƒ del TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Número de fracciones Cantidad de manchas Rƒ de cada manchaRutina 1 0.16

Quercetina 1 0.78

Catequina 0 N/A

Extracto de Costus sp.(del: 20-06-08)

3 0.09, 0.27, 0.85

Extracto de Costus sp.(del: 26-09-08)

3 0.1, 0.25, 0.86

Fracción 1 y 2 1 0.86

Fracción 11 y 13 1 0.18

Fracción 14 –19 0 N/A

Cuarto TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Rƒ del TLC (Fracciones1era Cromatografía de columna y estándares)

Número de fracciones Cantidad de manchas Rƒ de cada manchaRutina 1 0.16

Quercetina 1 0.78

Catequina 1 0.52

Fracción 14 – 19 1 0.40

Fracción 20 1 0.93

Fracción 21 1 0.93

Fracción 22 1 0.87

Análisis de fracciones de la Segunda cromatografía de columna (Realizada de la fracción 7-10 del primer extracto)

Análisis de fracciones de la Segunda cromatografía de columna (Realizada de la fracción 7-10 del primer extracto) continuación…

Rƒ del TLC (Fracciones 2da Cromatografía de columna)Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha

1 1 0.80

2 1 0.79

3 3 0.24, 0.53, 0.72

4 3 0.26, 0.54, 0.68

5 3 0.58, 0.68, 0.70

6 3 0.56, 0.69, 0.76

7 3 0.56, 0.71, 0.77

8 3 0.56, 0.71, 0.77

9 2 0.71, 0.76

10 2 0.71, 0.76

11 2 0.71, 0.77

12 2 0.71, 0.77

13 2 0.71, 0.77

14 2 0.71, 0.76

15 2 0.71, 0.77

Rƒ del TLC (Fracciones 2da Cromatografía de columna)Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha

16 2 0.71, 0.76

17 2 0.71, 0.77

18 2 0.71, 0.76

19 3 0.57, 0.71, 0.79

20 2 0.40, 0.66

21 2 0.18, 0.45

22 2 0.18, 0.45

23 2 0.18, 0.45

24 1 0.17

25 1 0.18

26 2 0.09, 0.17

27 2 0.09, 0.21

28 2 0.07, 0.21

29 1 0.21

30 1 0.20

Rƒ del TLC (Fracciones 2da Cromatografía de columna)

Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha31 2 0.07, 0.16

32 2 0.07, 0.23

33 1 0.29

34-38 (cada una por individual)

0 N/A

Análisis de Fracciones del Segundo Extracto de Costus sp.

Análisis de fracciones de la Tercera cromatografía de columna (Realizada del segundo extracto)

Análisis de fracciones de la Tercera cromatografía de columna (Realizada del segundo extracto) continuación…

Rƒ del TLC (Fracciones 3ra Cromatografía de columna)Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha

1 1 0.92

2 1 0.93

3 1 0.92

4 1 0.93

5 1 0.91

6 1 0.92

7 1 0.92

8 1 0.90

9 2 0.69, 0.90

10 2 0.67, 0.86

11 1 0.89

12 2 0.70, 0.89

13 2 0.70, 0.89

14 2 0.71, 0.90

15 2 0.70, 0.86

Número de fracción Cantidad de manchas Rƒ de cada mancha16 1 0.79

17 2 0.65, 0.86

18 1 0.65

19 1 0.66

20 1 0.29

21 1 0.28

22 1 0.32

23 1 0.42

24 1 0.45

25 1 0.47

26 1 0.47

27 2 0.28, 0.46

28 2 0.23, 0.46

29 2 0.19, 0.47

30 1 0.19

31 1 0.20

32 0 N/A

Análisis de Fracciones de ambos extractos de Costus sp.

Análisis de fracciones de las tres cromatografías de columna (Realizada del ambos extractos de Costus sp.)

Rƒ del TLC (Fracciones las tres Cromatografías de columna)Número de fracción Cromatografía de

columna a la cual pertenece

Cantidad de manchas

Rƒ de cada mancha

Fracción 20-22 1era 2 0.62, 0.72

Fracción 19-20 2da 4 0.61, 0.67, 0.74, 0.83

Fracción 33 2da 1 0.31

Fracción 34-38 2da 1 0.32

Fracción 39 2da 0 N/A

Fracción 1-7 2da 1 0.82

Fracción 8 3ra 1 0.81

Fracción 9-10 3ra 3 0.61, 0.73, 0.81

Fracción 11 3ra 3 0.62, 0.76, 0.81

Fracción 12-15 3ra 2 0.61, 0.80

Fracción 16 3ra 3 0.61, 0.74, 0.82

Fracción 17 3ra 2 0.51, 0.75

Fracción 18-20 3ra 3 0.38, 0.52, 0.70

Rƒ del TLC (Fracciones las tres Cromatografías de columna)

Número de fracción

Cromatografía de columna a la cual

pertenece

Cantidad de manchas

Rƒ de cada mancha

Fracción 21-22 3ra 3 0.34, 0.49, 0.73

Fracción 23-26 3ra 2 0.50, 0.75

Fracción 27-29 3ra 2 0.35, 0.46

Fracción 30-31 3ra 4 0.26, 0.45, 0.82

Fracción 32 3ra 1 0.67

ConclusionesEn los primeros TLC no se mostraba presencia de los estándares, se asumió que estaban muy diluidos, y se rotoevaporaron y efectivamente se obtuvieron las manchas. Otro factor que ayudó fue aumentar el número de gotas de muestra en la placa al doble.

Trabajo por realizarLas fracciones que mostraron ser antioxidantes por revelado de DPPH, y a la misma vez tienen Rƒ parecidos o iguales a los estándares utilizados, deben ser analizadas por NMR y/o infrarrojo para comprobar la presencia de los estándares en los extractos.Basado en los resultados se le adjudica o no la actividad biológica antioxidantes a los flavonoides utilizados.En un futuro, se les podría realizar NMR y/o infrarrojo a las fracciones que mostraron ser antioxidantes, pero tenían Rƒ distinto a los estándares establecidos en la investigación.