Bio-T kit Coxiella burnetii - Biosellal

MU/qFQ/001/FR Révision mai 2019

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MANUEL D’UTILISATION

Bio-T kit® Coxiella burnetii

Cat. N° BioTK016

50 réactions

Détection et quantification de Coxiella burnetii responsable de la

fièvre Q (FQ) par PCR en temps réel (qPCR)

avec contrôle positif interne (IPC) endogène

RUMINANTS

Types de prélèvements

Mucus vaginal/endocervical, cotylédons placentaires prélevés sur écouvillons secs, avec embout viscose et tige souple en plastique,

Organes de fœtus : poumons, foie

Liquide stomacal foetal

Lait

Conservation recommandée des échantillons : à 4°C 7 jours maximum, à -20°C au-delà de 7 jours, voire à -70°C au-delà de 1 an.

Extractions ADN recommandées par BioSellal

Billes magnétiques (ex : BioSellal – BioExtract® SuperBall® Cat. N° BES384)

Colonnes de silice (ex : BioSellal – BioExtract® Column Cat. N° BEC050 ou BEC250, Qiagen - QIAamp®

DNA mini kit Cat. N° 51304)

Données de performances disponibles, contacter le Support Technique. L’utilisation de ces kits d’extraction a été validée par le Laboratoire National de Référence (LNR) pour les matrices de type mucus vaginal, endo-cervical ou de cotylédons placentaires pour les bovins, caprins et ovins prélevées sur écouvillons secs (dossier de validation disponible sur demande).

D’autres kits d’extraction sont utilisables : contacter le Support Technique pour plus d’informations.

Réservé à l’usage vétérinaire


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PRESENTATION

Description du produit Coxiella burnetii, bactérie Gram négatif intracellulaire stricte, est responsable d’avortements chez les

ruminants d’élevage pouvant entrainer des pertes économiques importantes. Elle est l’agent responsable

de la fièvre Q, une zoonose dont les ruminants constituent le réservoir majeur des infections humaines.

Le Bio-T kit® Coxiella burnetii (Cat. N° BioTK016) permet de détecter dans le même puits réactionnel, la

présence :

de Coxiella burnetii grâce à un marquage 6-FAM,

d’un IPC endogène, grâce à un marquage VIC qui permet de confirmer la présence de cellules de

ruminants en quantité suffisante sur les écouvillons, de valider l’extraction des acides nucléiques et

l’absence d’inhibition de la réaction d’amplification.

Ce kit a été développé et validé suivant les prescriptions de la norme NF U47-600-2 éditée par l’AFNOR et les recommandations de l’ANSES de Sophia Antipolis, LNR pour Coxiella burnetii. Le dossier de validation et le mode opératoire ont été examinés par le LNR-FQ, lequel a fourni une attestation de validation, à disposition avec le dossier.

Les Tableaux 1 et 2 ci-dessous présentent le type de détection recommandé en fonction du type

d’échantillons à analyser ainsi que le principe d’analyse dans le cadre d’une détection quantitative absolue

et relative.

Tableau 1. Type d’analyse pour le Bio-T kit® Coxiella burnetii (Cat. N° BioTK016)

Types de prélèvements Espèces Type de détection Type de contrôle positif d’extraction

requis

Lait, organes de fœtus, liquide stomacal fœtal

Ruminants Détection qualitative MRI

(Matériau de Référence Interne)

Ecouvillons endo-cervicaux, vaginaux ou de cotylédons placentaires*

Bovins, Ovins, Caprins

Détection quantitative (absolue ou relative)

MRSI (Matériau de Référence au Seuil

d’Interprétation) * Dossier de validation disponible sur demande auprès du Support Technique.

Le MRSI est constitué par une suspension bactérienne de Coxiella burnetii fournie par le LNR-FQ, diluée dans

du PBS ou dans une suspension d’écouvillons négatifs pour la cible. La concentration bactérienne requise

pour le MRSI dépend du type d’analyse : 104 GE/ml pour les analyses individuelles, 103 GE/ml pour les

analyses de mélanges. Un mélange est constitué soit par 3 écouvillons individuels chez les petits ruminants

soit par 3 écouvillons de cotylédons placentaires d’un placenta chez les bovins.

Les niveaux de 103 et 104 GE/ml correspondent aux seuils fixés pour le diagnostic d’avortement (les

prélèvements devant être réalisés moins de 8 jours après avortement). Le niveau 104 GE/ml est aussi utilisé

pour les investigations épidémiologiques à la suite de cas groupés avérés.


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Le MRI peut être constitué soit par une suspension bactérienne de C. burnetii diluée dans de la matrice

négative (lait, exsudat d’organes, …) pour la cible ou du PBS, comme décrit pour le MRSI, soit par un

échantillon positif pour la cible, caractérisé en terme de valeur de Ct.

Tableau 2. Principe d’analyse pour la détection quantitative

Quantification Objectif Référence

Absolue Détermination de la

concentration de C. burnetii en GE/ml

Gamme d’ADN standard IS1111 (ADN de synthèse) reliant les valeurs de Ct et la concentration de C. burnetii en GE/ml

ADN standard = EPC (contrôle positif externe, fourni à une concentration stock exprimée en GE/ml)*

Relative

Comparaison des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons

avec la valeur de Ct obtenue pour le MRSI extrait.

Déduction de la concentration par rapport à celle du MRSI

Matériau de Référence au Seuil d’Interprétation (MRSI) = suspension bactérienne de C. burnetii fournie par le LNR-FQ,

ramenée à 104 bactéries/écouvillon (104 GE/ml) pour les analyses

individuelles ou 103 bactéries/écouvillon (103 GE/ml) pour les analyses de

mélanges (3 individus ou 3 écouvillons) *L’ADN standard (EPC, contrôle positif externe) est fourni à une concentration stock (exprimée en GE/ml) et doit être dilué pour générer la

gamme étalon. Sa concentration a été raccordée avec celle du Matériel de Référence ADNg Coxiella burnetii, titré et fourni par le LNR-FQ de

Sophia Antipolis.

Description des étapes à suivre de l’échantillon jusqu’au résultat

de la PCR en temps réel (qPCR) Etape 1 :

Préparation des échantillons et Lyse des cellules incluant les bactéries.

Etape 2 :

Extraction/Purification des acides nucléiques.

Etape 3 :

Dépôt du Master Mix dans les puits de la plaque ou des barrettes de qPCR.

Ajout des extraits d’acides nucléiques.

Etape 4 :

PCR en temps réel (qPCR) : amplification et détection simultanée des ADN cibles C. burnetii et IPC avec

quantification relative ou absolue pour les écouvillons.


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Contenu du kit et conditions de conservation

Tableau 3. Descriptif du contenu du kit

Description Référence Volume /tube

Présentation Conservation

Master Mix (MM) Prêt à l’emploi

MMFQ-A 750 µl 1 tube

bouchon blanc Sachet A

-20°C à l’abri de la lumière

Zone « MIX »

External Positive Control (EPC) Contrôle positif d’amplification de Coxiella burnetii

EPCFQ-A 110 µl 1 tube

bouchon orange Sachet B

-20°C Zone « Ajout d’acides

nucléiques »

Eau Rnase/Dnase free

Aqua-A 1 ml 1 tube

bouchon bleu Sachet B

4°C ou -20°C Zone « Ajout d’acides

nucléiques»

Les réactifs du kit sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le sachet, sous réserve du bon respect

des conditions de conservation.

Liste des consommables et réactifs non fournis dans le kit

Tableau 4. Consommables et réactifs non fournis dans le kit

Consommable / Réactif Description Fournisseur Cat. N°

Ecouvillons* Embout viscose, tige plastique souple COPAN

Diagnostics 155C

Tube 1.5 ml* Microtube safelock PP 1,5 ml Eppendorf 0030120086

Tampon ATL Tampon de Lyse BioSellal ATL19076

BioExtract® Column Kit d’extraction ADN/ARN format colonne (50) BioSellal BEC050

BioExtract® Column Kit d’extraction ADN/ARN format colonne (250) BioSellal BEC250

BioExtract® SuperBall® Kit d’extraction ADN/ARN format billes

magnétiques (4 x 96) BioSellal BES384

QIAamp® DNA mini kit Kit d’extraction ADN format colonne (50) Qiagen 51304

* Références données à titre indicatif.

Pour les consommables liés au thermocycleur, se reporter au manuel d’utilisation de l’appareil.


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Principales précautions à appliquer

A réception des prélèvements, désinfecter l’extérieur des contenants à l’aide d’un sporicide avant de stocker et/ou de manipuler sous le PSM.

Lors de l’extraction, il est obligatoire de travailler sous PSM jusqu’à la fin de l’étape de lyse des échantillons, en raison du risque zoonotique associé aux types d’échantillons manipulés et à la présence potentielle de Coxiella burnetii, et ses propriétés aérolisables.

Porter les équipements de protection individuelle appropriés (blouse, gants jetables (système de double paire), lunettes de protection, masque FFP3…).

Travailler dans des zones dédiées et séparées afin d’éviter toute contamination : « Extraction » (stockage des échantillons non extraits, zone avec matériel d’extraction), « MIX » (stockage des Master Mix prêts à l’emploi, préparation de plaques qPCR), « Ajout d’acides nucléiques » (stockage et addition des acides nucléiques extraits et des contrôles dans la plaque qPCR), « PCR » (zone finale, contenant le(s) thermocycleur(s)).

Utiliser des équipements dédiés pour chaque zone de travail (gants, blouse, pipettes, vortex, …).

Décongeler tous les réactifs stockés à -20°C avant utilisation.

Vortexer et centrifuger rapidement (centrifugeuse de paillasse) tous les réactifs avant utilisation.

Utiliser des pointes à filtre.

Il est recommandé de ne pas excéder 3 cycles de congélation-décongélation des réactifs, des échantillons, des lysats et des acides nucléiques extraits. Suivant votre utilisation, nous vous préconisons de faire des fractions aliquotes de volume adéquat.


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EXTRACTION D’ADN

Le processus d’extraction comprend une étape de lyse thermique et enzymatique, avec inactivation de C.

burnetii, suivie de la purification des ADN totaux libérés par adsorption sur colonne de silice ou sur billes

magnétiques coatées. Les ADN purifiés élués sont ensuite stockés à 4°C si la PCR est réalisée dans la journée

ou à -20°C pour un traitement ultérieur.

BioSellal propose deux kits d’extraction :

BioExtract® Column (Cat. N° BEC050 ou BEC250) basé sur l’utilisation de colonnes de silice, préconisé

pour l’extraction de 1 à 12-20 échantillons en parallèle.

BioExtract® SuperBall® (Cat. N° BES384) basé sur l’utilisation de billes magnétiques et l’utilisation

d’automates tels que le KingFisher™ Duo, mL ou Flex, préconisé pour l’extraction en parallèle de 12

échantillons ou plus.

Le kit QIAamp® DNA mini kit de Qiagen (Cat. N°51304, colonnes de silice) a également été validé.

Un protocole simplifié pour chaque méthode vous est proposé ci-après. Pour plus d’informations, contacter

notre Support Technique ou se reporter au manuel d’utilisation dédié sur www.biosellal.com.

Les données de validation pour chacune de ces méthodes, pour les matrices biologiques de types

suspensions de mucus endo-cervical, vaginal ou de cotylédons placentaires, préparées à partir d’écouvillons,

sont présentées dans le dossier de validation du kit, disponible sur demande auprès de notre Support

Technique.

L’extraction des ADN totaux est réalisable avec toute autre technique d’extraction validée.

La mise en place de la méthode peut être accompagnée afin de vérifier les performances attendues. Un

protocole d’adoption pour la méthode complète est disponible sur demande.

Le LNR-FQ, fournisseur du matériau de référence (C. burnetii), peut également être sollicité comme support.

La transmission des données d’adoption au LNR-FQ est encouragée par ce dernier pour permettre un

meilleur accompagnement des utilisateurs des méthodes (fichier de résultats disponible au LNR).


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Préparation des échantillons avant extraction : sous PSM

Contrôles requis

Pour chacune des méthodes d’extraction, il est obligatoire d’inclure au moins un échantillon témoin négatif

d’extraction (NCS), afin de valider l’absence d’inter-contamination des échantillons sur l’ensemble du

processus. Il est placé en dernière position, après les échantillons à extraire, et il est recommandé d’adapter

le nombre de NCS au niveau de risque d’inter-contamination du laboratoire : par exemple, un NCS tous les

7-10 échantillons terrain.

Pour ce contrôle, la prise d’essai de 200 µl de suspension écouvillonnaire est remplacée par 200 µl de PBS

ou d’eau (RNase/DNase free) et est traitée en parallèle des échantillons terrains tout au long du processus

d’extraction.

Un échantillon « contrôle positif » de processus de type « sentinelle », constitué selon les matrices, par le

MRSI ou le MRI, est utilisé pour vérifier l’ensemble de la méthode d’extraction d’ADN et PCR en temps réel

(qPCR) (cf Tableaux 1-2).

Cet échantillon est inclus dans chaque série d’extraction. La valeur quantifiée ou le Ct de ce témoin

d’extraction peut être reporté et suivi dans le temps sur une carte de contrôle. Le fait d’obtenir, après

extraction et qPCR, une valeur quantifiée attendue ou un Ct attendu avec ce témoin positif valide l’ensemble

de la mise en œuvre de la méthode correspondante (quantitative ou relative).


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Echantillons

A partir d’écouvillons

1. Eluer l’écouvillon avec du PBS 1X stérile :

Placer l’écouvillon dans un tube 1.5 ml et couper la tige de l’écouvillon.

Ajouter 1 ml de PBS 1X stérile.

Fermer le tube et vortexer 5 secondes à 2 reprises puis centrifuger rapidement.

Enlever l’écouvillon en le pressant sur les parois pour minimiser les pertes de volume.

2. L’extraction sera réalisée à partir de 200 µl de l’éluat (ou 200 µl de PBS pour le NCS)

Le reste de l’éluat devra être conservé à 4°C temporairement (4h), au-delà il devra être conservé à -20°C

jusqu’à une prochaine extraction si nécessaire.

A partir d’échantillons liquides Après avoir bien homogénéisé l’échantillon (vortexer 5 secondes à 2 reprises puis centrifuger rapidement) :

prélever 200 µl comme prise d’essai et procéder au protocole d’extraction.

A partir d’organes

1. Prélever 20-30 mg d’organe (balance de précision), à déposer sur une boite de Pétri stérile.

2. Hacher finement les 20-30 mg avec scalpel/pince stériles.

3. Transférer dans un tube contenant 250 µl de tampon PBS stérile puis vortexer 1 minute.

Conserver la suspension à 4°C temporairement (4h) sinon à -20°C et procéder de la même façon pour le

reliquat d’organe.

4. Procéder à l’extraction à l’aide des kits BioExtract® Column, BioExtract® SuperBall® ou QIAamp® DNA

mini kit, à partir de 200 µl d’organe dilacéré re-suspendu.


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Extraction sur colonnes

Kit BioExtract® Column (BioSellal) Cat. N° BEC050 ou BEC250

Se reporter au protocole du kit d’extraction pour la préparation des solutions

1. Lyse et Ajustement des conditions d’adsorption Sous PSM, dans un tube de 1.5 ml :

Ajouter 20 µl de Protéinase K,

Ajouter 180 µl de tampon ATL et 1 µl carrier RNA,

Ajouter 200 µl d’échantillon (ex : éluat écouvillonnaire ou PBS pour le contrôle négatif) préalablement vortexé.

Vortexer 2 x 5 secondes et centrifuger brièvement (centrifugeuse de paillasse).

Incuber 30 min à 70°C.

Cette étape permet la lyse des cellules dont les bactéries et conduit à l’inactivation des Coxiella potentiellement présentes

dans l’échantillon. A partir de cette étape, il est possible de travailler hors PSM.

Centrifuger brièvement puis ajouter 350 µl de Buffer LB.

Vortexer puis centrifuger brièvement.

2. Adsorption sur la membrane de silice Transférer délicatement 400 µl de lysat sur la colonne BioExtract® Mini Spin Column (déjà placée dans un tube collecteur

de 2 ml).

Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.

Déposer le reliquat de lysat (environ 350 µl) et reproduire l’étape précédente.

Changer de tube collecteur (Mettre la colonne BioExtract® dans un nouveau tube collecteur et jeter le tube collecteur

contenant le filtrat).

3. Lavages et Séchage de la membrane de silice Ajouter 600 µl de Buffer W1.

Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. Changer de tube collecteur.

Ajouter 600 µl de Buffer W2.


Centrifuger à 20 000 x g pendant 2 min pour sécher la membrane.

4. Elution des acides nucléiques Mettre la colonne BioExtract® Mini Spin Column dans un nouveau tube de 1.5 ml, et jeter le tube collecteur contenant le

filtrat.

Ajouter 200 µl de Buffer EL (à température ambiante) délicatement au centre de la membrane.

Incuber à température ambiante (15–25°C) pendant 1 min.


Conserver l’éluat contenu dans le tube de 1.5 ml et jeter la colonne.

L’ADN extrait peut être conservé à 4°C si la qPCR est lancée dans la journée, sinon il est recommandé de le conserver à

<-20°C.


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Figure 1. Extraction avec le kit BioExtract® Column

(Cat. N° BEC050 ou BEC250, BioSellal)


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QIAamp® DNA mini kit (Qiagen) Cat. N° 51304


1. Lyse et Ajustement des conditions d’adsorption Sous PSM, dans un tube de 1.5 ml :

Ajouter 20 µl de Protéinase K,

Ajouter 180 µl de tampon ATL,

Ajouter 200 µl d’échantillon (ex : éluat écouvillonnaire ou PBS pour le contrôle négatif) préalablement vortexé.



Cette étape permet la lyse des cellules dont les bactéries et conduit à l’inactivation des Coxiella potentiellement présentes dans l’échantillon.

A partir de cette étape, il est possible de travailler hors PSM.

Centrifuger brièvement puis ajouter 200 µl de Buffer AL.


Incuber 10 min à 70°C

Centrifuger brièvement.

Ajouter 200 µl d’éthanol 100%


2. Adsorption sur la membrane de silice Transférer délicatement 400 µl de lysat sur la colonne QIAamp® (déjà placée dans un tube collecteur de 2 ml).


Déposer le reliquat de lysat (environ 400 µl) et reproduire l’étape précédente.

Changer de tube collecteur (mettre la colonne dans un nouveau tube collecteur et jeter le tube collecteur contenant le

filtrat).

3. Lavages et Séchage de la membrane de silice Ajouter 500 µl de Buffer AW1.


Ajouter 500 µl de Buffer AW2.


Centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min pour sécher la membrane.

4. Elution des acides nucléiques Mettre la colonne QIAamp® dans un nouveau tube de 1.5 ml, et jeter le tube collecteur contenant le filtrat.

Ajouter 200 µl de Buffer AE (à température ambiante) délicatement au centre de la membrane.

Incuber à température ambiante (15–25°C) pendant 1 min.


Conserver l’éluat contenu dans le tube de 1.5 ml et jeter la colonne.

L’ADN extrait peut être conservé à 4°C si la qPCR est lancée dans la journée, sinon il est recommandé de le conserver à <-20°C.


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Figure 2. Extraction avec le kit QIAamp® DNA mini kit

(Cat. N° 51304, Qiagen)


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Extraction avec billes magnétiques Kit BioExtract® SuperBall® (BioSellal)

Cat. N° BES384

Pour utilisation avec KingFisherTM Flex, Duo ou mL


1. Lyse cellulaire Sous PSM, dans un tube de 1.5 ml, ajouter :

20 µl de protéinase K,

180 µl de tampon ATL,

200 µl d’échantillon (ex : éluat écouvillonnaire ou PBS pour le contrôle négatif) préalablement vortexé.



Cette étape permet la lyse des cellules dont les bactéries et conduit à l’inactivation des Coxiella potentiellement présentes dans l’échantillon.

A partir de cette étape, il est possible de travailler hors PSM.

2. Préparation des plaques ou barrettes Préparer les consommables pour la série d’extraction :

Flex : 4 plaques Deep-wells et 2 microplaques. Les annoter en fonction de l’élément à ajouter (voir Tableau 6).

Duo : 1 plaque Deep-well et 1 barrette d’élution.

mL: 1 barrette par échantillon. Sortir le plateau coulissant de l’automate et positionner les barrettes dessus.

Préparer la solution LB-SMB-carrier comme indiqué ci-dessous :

Tableau 5. Solution de lyse LB-SMB-carrier

Réactif Nombre d’échantillons*

1 5 10 12 15 48 96

Buffer LB 400 µl 2.2 ml 4.4 ml 5.28 ml 6.6 ml 21.12 ml 42.24 ml

SMB (SuperBall Magnetic Beads)‡

25 µl 137.5 µl 275 µl 330 µl 412.5 µl 1.32 ml 2.64 ml

Carrier RNA (1 µg/µl)

1 µl 5.5 µl 11 µl 13.2 µl 16.5 µl 52.8 µl 105.6 µl

* Pour compenser les erreurs de pipetage, le volume préparé inclut 10% de volume supplémentaire par rapport au volume requis. Le volume de tampon en excès peut être conservé en vue d’une utilisation sous 8 jours ; au-delà de cette durée, il doit être jeté. ‡ Vortexer vigoureusement pendant 3 minutes avant la première utilisation ou 1 minute pour les utilisations suivantes.

Au fond des puits de la « Deep-well Lysat » (Flex), des puits de la ligne A (Duo) ou des puits en position A des barrettes (mL),

transférer :


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400 µl de lysat après avoir vortexé le tube et centrifugé rapidement,

400 µl de solution de lyse LB-SMB-carrier préalablement vortexée vigoureusement (30 sec).

Distribuer les autres réactifs, en suivant les indications présentées dans le Tableau 6 ci-après.

Tableau 6. Volume des réactifs et configuration des automates KingFisherTM Flex, Duo et mL

Position sur la barrette ou la plaque Elément à ajouter

Volume par puits (µl)

Flex Duo* mL

Deep-well Lysat Ligne A Position A Lysat† 800†

Deep-well Wash 1 Ligne E Position B Buffer W1 700

Deep-well Wash 2 Ligne F Position C Buffer W2 700

Deep-well Wash 3 Ligne G Position D Ethanol (96–100%) 750

Microplaque Elution Elution strip Position E Buffer EL 200

Microplaque Peigne (Large 96-Rod Cover)

Ligne B A positionner

manuellement Peigne —

* Les lignes C, D et H sont vides. † Inclut 400 µl d’échantillon prétraité et 400 µl de solution LB-SMB-carrier.

3. Lancement du KingFisherTM

Placer les plaques dans l’automate en ayant sélectionné le programme « BioExtract_KF_Flex», « BioExtract_KF_Duo » ou « BioExtract_KF_mL » et démarrer.

En fin de programme, récupérer les éluats (microplaque Elution pour KingFisher™96/Flex, Elution strip pour KingFisher™ Duo ou puits E pour KingFisher™mL). L’ADN extrait (plaque ou puits fermé ou microtube) peut être conservé à 4°C si la qPCR est lancée dans la journée, sinon il

est recommandé de le conserver à <-20°C.


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Figure 3. Extraction d’ADN avec le kit BioExtract® SuperBall® (Cat. N° BES384, BioSellal)

Pour avoir le programme KingFisher™ adéquat selon la version de l’automate,

veuillez contacter notre Support Technique ([email protected]).


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DETECTION de Coxiella burnetii par qPCR

avec le kit BioTK016

Procédure globale à suivre

1) Etablir un plan de plaque définissant la position de chaque échantillon et incluant les contrôles décrits

ci-dessous:

Contrôle négatif de processus (NCS) : l’eau (ou PBS) remplace l’échantillon depuis le stade initial

d’extraction.

Ce contrôle est obligatoire pour chaque série d’extraction et sera positionné en fin de série, tous les 7 à

10 extraits environ selon les risques d’inter-contamination identifiés par le laboratoire.

Contrôle négatif d’amplification (NC) : 5 µl d’eau RNase/DNase free remplace les 5 µl d’extrait ADN au

moment du dépôt sur plaque qPCR. Le tube Aqua-A (bouchon bleu) fourni peut être utilisé.

Ce contrôle est recommandé lors de la 1ère utilisation du kit ou pour vérifier l’absence de contamination

du Master Mix suite à un résultat non conforme avec le NCS.

Contrôle positif de processus : Il s’agit d’ADN extrait à partir d’un échantillon contenant une quantité

connue de Coxiella burnetii.

Comme présenté dans le Tableau 1 et le § Extraction ADN/Préparation des échantillons, ce contrôle est

constitué par le MRSI à une concentration de 104 GE/ml (analyse individuelle) ou 103 GE/ml (analyse de

mélanges) en quantification relative ou un MRI.

Ce contrôle est obligatoire pour chaque série d’extraction, il permet de valider l’ensemble du processus,

grâce à une carte de contrôle.

Contrôle positif d’amplification de C. burnetii (EPC) : il s’agit d’un ADN synthétique fourni (tube EPCFQ-

A, bouchon orange), titré en GE/ml, contenant la séquence cible de C. burnetii. Il sera sous forme :

o d’un point unique dans le cadre d’une analyse qualitative ou quantitative relative,

o d’une gamme étalon dans le cadre d’une analyse quantitative absolue.

Ce contrôle est obligatoire.

Pour les contrôles positifs de processus et d’amplification, un signal positif doit obligatoirement être détecté,

avec une valeur de Ct en accord avec les valeurs de la carte de contrôle (MRI, MRSI) ou située dans l’intervalle

de tolérance indiqué dans le certificat d’analyse (CA) pour l’utilisation de l’EPC.

ATTENTION : La manipulation du tube EPC représente un risque de contamination, il est recommandé de ne l’ouvrir

et de ne le manipuler que dans une zone délimitée, éloignée des autres composants et de prendre les précautions

nécessaires pour éviter toute contamination croisée avec des échantillons lors du dépôt sur plaque.


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2) Choisir la méthode de quantification (pour les prélèvements de type écouvillons)

La quantification de C. burnetii peut se faire :

en quantification absolue à l’aide de l’EPC titré qui a été raccordé au Matériau de Référence (MR) ADN

fourni par le LNR-FQ, exprimé en GE/ml (plus d’information dans le dossier de validation du kit).

en quantification relative en comparant la valeur de Ct obtenue pour l’échantillon à la valeur de Ct

obtenue pour le MRSI 104 GE/ml (voir § Interprétation des résultats).

Choix 1 : Quantification absolue

L’EPC (bouchon orange), raccordé au MR ADN fourni par le LNR-FQ, est fourni à la concentration de

2.106 GE/ml. Il doit être dilué comme indiqué ci-après (voir § Procédure de dilution de l’EPC et Figure 4) pour

produire une gamme étalon de raison 10 comprenant 5 points de concentration décroissante de 2.106 à

2.102 GE/ml comme indiqué dans le Tableau 7. La concentration la plus faible (2.102 GE/ml) correspond à

la LQPCR et la LDPCR.

Les 5 puits correspondants aux 5 points de gamme devront être qualifiés comme « standard » lors du

paramétrage du logiciel du thermocycleur, et leur attribuer une valeur de concentration en C. burnetii

(GE)/ml.

Pour les protocoles BioExtract® Column et SuperBall®, les concentrations sont imputées d’un facteur

correctif déterminé lors de la validation des méthodes. L’utilisation du kit QIAamp® DNA mini kit ne nécessite

pas de facteur correctif.

Tableau 7. Relation entre le niveau de dilution de l’EPC et concentration en GE / ml

Concentration C. burnetii

(GE/ml)

Facteur de dilution de l’EPC

Non dilué 10-1 10-2 10-3 10-4

Par défaut* 2.106 2.105 2.104 2.103 2.102

Pour BioExtract® Column 9,14.106 9,14.105 9,14.104 9,14.103 9,14.102

Pour BioExtract® SuperBall® 5,38.106 5,38.105 5,38.104 5,38.103 5,38.102

* Concentration à considérer pour l’utilisation du kit QIAamp® DNA mini kit


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Procédure de dilution de l’EPC en vue d’une quantification absolue ATTENTION : risque de contamination

Il faut réaliser 4 dilutions en cascade, chacune au 1/10e (ex : 5 µl dans 45 µl d’eau (tube bouchon bleu) ou TE 1X), en utilisant le tube d’EPC non dilué (bouchon orange) comme tube de départ.

Les dilutions doivent être préparées de façon extemporanée à partir du tube EPC fourni.

Prendre soin de vortexer et centrifuger rapidement chaque tube, entre chaque dilution.

5 µl de chaque dilution (voir Tableau 7) seront utilisés pour la qPCR, selon le plan de plaque défini.

La Figure 4 schématise la procédure de dilutions de l’EPC en vue d’une quantification absolue. Figure 4. Schéma de la procédure à suivre pour la préparation de l’EPC en vue d’une quantification absolue. Les 5 charges d’EPC produites sont utilisées en quantification absolue pour obtenir une droite de calibration reliant les valeurs de Ct en logarithme de la concentration de C. burnetii (GE/ml) comme montré dans cette figure.

La pente « a » de la droite de calibration permet de déterminer l’efficacité E de la PCR en %. L’efficacité moyenne acceptable doit être comprise entre 85 et 115%.

L’établissement de la droite de calibration permet de relier les valeurs de Ct obtenues pour les extraits d’échantillons analysés à la quantité de C. burnetii exprimée en copies de génome équivalent (GE) /

écouvillon (assimilé à 1 ml).


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Choix 2 : Quantification relative

Cette approche nécessite d’extraire, en parallèle des échantillons d’intérêt, un matériau de référence titré

(MRSI), avec une méthode validée. Cet échantillon titré doit être produit à partir du MR bactérien dosé

fourni par le LNR-FQ, à diluer dans du PBS ou une matrice écouvillonnaire négative pour C. burnetii.

La procédure de préparation du MRSI à 104 GE/ml est présentée en Annexe 5 du dossier de validation du

kit, disponible sur demande.

La comparaison entre les valeurs de Ct obtenues pour les échantillons et pour celle du MRSI permet de

déduire la quantité relative de C. burnetii présente dans l’échantillon (voir Tableau 16).

3) Préparation de la plaque

Dans la zone réservée au «MIX »

1. Après décongélation, vortex et rapide centrifugation, transférer 15 µl de Master Mix MMFQ-A (tube

bouchon blanc) dans chaque puits d’intérêt (échantillons et contrôles).

Dans la zone dédiée à l’ajout d’acides nucléiques

2. Ajouter 5 µl d’ADN extrait (ou NCS ou eau ou EPC : tube EPCFQ-A bouchon orange) par puits d’intérêt,

en veillant à les déposer bien au fond du puits, dans le Master Mix et en évitant de faire des bulles.

3. Filmer la plaque ou fermer les tubes avec les capuchons optiques adaptés.

Dans la pièce dédiée à l’amplification PCR

4. Paramétrer le thermocycleur (voir § Paramètres de réglage du thermocycleur, Tableaux 8 et 9).

5. Il est recommandé de centrifuger la plaque avant de la positionner dans le thermocycleur, ceci

permettra d’éviter la présence de gouttes sur les parois et d’éliminer au maximum les bulles.

6. Démarrer le programme. Durée de run approximative de 65 min.


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4) Paramètres de réglage du thermocycleur

Ce kit a été développé sur ABI PRISM® 7500 Fast (Applied BioSystems) en mode Standard et confirmé sur

AriaMx™ (Agilent Technologies) (mode Fast par défaut) et ABI PRISM® 7500 Fast en mode Fast. Pour d’autres

thermocycleurs, contacter notre Support Technique.

ABI PRISM® 7500 Fast AriaMx™

Mode Quantitation – Standard curve Quantitative PCR,

Fluorescence Probe

Ramping Ramping Standard ou Ramping Fast

Ramping Fast par défaut

Référence passive ROX ROX

Tableau 8. Paramètres de réglage du thermocycleur

Cible Détecteurs

Volume final/ puits Reporter Quencher

C. burnetii FAM NFQ-MGB ou None* 20 µl

= 15 µl MM + 5 µl ADN extrait

ou contrôles†

IPC VIC NFQ-MGB ou None*

à attribuer aux échantillons et contrôles†

* Choix variable suivant le modèle de thermocycleur, si besoin contacter le Support Technique de BioSellal ([email protected]). † Les contrôles sont les NC (eau), NCS (eau extraite) et EPC (ADN cible C. burnetii).

Tableau 9. Paramétrage du Programme d’amplification

Programme d’amplification

Ramping Standard ou Fast

Cycles Temps Température

1 cycle 5 min 95°C

40 cycles 15 s 95°C

30 s * + acquisition des données

60°C

* Régler sur 31 secondes pour certains thermocycleurs tels que l’ABI PRISM® 7500.

Notes : Le Programme d’amplification est compatible avec l’ensemble des Bio-T kit® à l’exception des kits

de la gamme PIG.

La réalisation d’une étape de transcription-reverse (RT) préalable à la PCR pour l’amplification des génomes à ARN n’a pas d’incidence sur l’efficacité du Bio-T kit® Coxiella burnetii (données présentées dans le dossier de validation disponible sur demande).


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INTERPRETATION DES RESULTATS Principaux cas de figures

Analyse qualitative : toutes matrices

Lecture des Contrôles

Tableau 10. Différents scénarios de résultats concernant les contrôles

Cibles

Interprétation

C. burnetii (FAM)

IPC endogène (VIC)

NC Contrôle Négatif d’amplification

FACULTATIF

Neg Neg Validé

Neg / Pos Pos Contamination avec un échantillon

négatif/positif lors de la préparation de la plaque ou contamination du Master Mix.

NCS Contrôle Négatif

de processus

OBLIGATOIRE

Neg Neg Validé


négatif/positif lors de l’extraction ou de la préparation de plaque.

EPC Contrôle Positif

d’amplification de C. burnetii

OBLIGATOIRE

Pos Ct conforme au

Certificat d’Analyse Neg Validé

Neg Neg Problème lors de la PCR : Erreur de Master

Mix ? Oubli de l’EPC ?

Pos Pos Contamination lors de la préparation de la

plaque par un échantillon.

MRI/MRSI Contrôle Positif de

processus

OBLIGATOIRE

Pos Ct conforme à la carte

de contrôle

Pos Ct < 35

Validé

Neg Neg/Pos

Oubli d’addition d’ADN extrait ou dépôt non au contact du Master Mix dans le puits réactionnel ?

Dérive du processus : extraction et/ou PCR Dégradation de l’échantillon contrôle ? Problème lors de l’extraction ?

Rappel : L’IPC a pour cible un gène exprimé par les cellules de ruminants, il ne pourra donc pas être détecté en qPCR à partir des NCS, NC et EPC.

L’IPC sera détecté dans le contrôle positif de processus (MRSI/MRI) si celui-ci a été préparé à partir de matrice négative, il ne sera pas détecté si

la matrice a été remplacée par du PBS.


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Lecture des Echantillons

Tableau 11. Différents types de résultats pouvant être obtenus pour les échantillons

Cibles Interprétation C. burnetii

(FAM) IPC endogène

(VIC)

Neg Ct>40 Pos

Ct <35

Négatif ou Non détecté

Pos Ct<40

Positif ou Détecté

Pos Ct<40

Neg ou Ct >35

Positif ou Détecté

Absence de cellules en quantité suffisante

Présence d’inhibiteurs ? * Compétition avec la cible ?

La quantification relative ou absolue n’est pas

possible

Neg Ct>40

Neg ou Ct >35

Ininterprétable

Oubli d’addition d’ADN extrait ou dépôt non au contact du MM lors de la préparation de la plaque ?

Présence d’inhibiteurs dans l’échantillon ? * Problème de prélèvement (cas des écouvillons) : quantité de cellules

insuffisante

* En cas de suspicion d’inhibition, 1) Répéter la qPCR en pré-diluant l’ADN extrait au 1/10 voire au 1/100 dans de l’eau DNase/RNase free ou 2) reprendre l’analyse depuis l’extraction.

Analyse quantitative : matrices analytiques de type écouvillons endo-cervicaux, vaginaux et de cotylédons placentaires

Seuls les échantillons trouvés positifs pour la valence cible (C. burnetii) et présentant une valeur de Ct

conforme pour l’IPC, peuvent être quantifiés (cf Tableau 11).

Absolue

L’analyse quantitative c’est-à-dire la détermination de la concentration de C. burnetii exprimée en GE/ml des

extraits analysés est réalisée en fonction de la droite de calibration établie en parallèle.

Les Tableaux 12 à 14 indiquent les valeurs des différents niveaux de référence et l’interprétation des

résultats en fonction de ces niveaux. Se reporter au dossier de validation pour plus de détails.


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Cibles

Interprétation C. burnetii

(FAM)

IPC endogène

(VIC)


FACULTATIF

Neg Neg Validé




de processus

OBLIGATOIRE

Neg Neg Validé



EPC

= Contrôle Positif d’amplification de

C. burnetii déposé sous

forme de gamme

OBLIGATOIRE

Pos Ct conformes au Certificat

d’Analyse

Droite de Calibration Efficacité de PCR comprise

entre 85 et 115% R2 > 0.9

Neg Validé

Neg Neg Problème lors de la PCR : Erreur de Master

Mix ? Oubli de l’EPC ?



MRSI ou MRI

= Contrôle Positif de processus

OBLIGATOIRE

Pos Quantité conforme dans l’intervalle de

tolérance

Pos Ct < 35

Validé

Neg Neg/Pos

Oubli d’addition d’ADN extrait ou dépôt non au contact du MM dans le puits réactionnel ?



L’IPC sera détecté dans le contrôle positif de processus (MRSI ou MRI) si celui-ci a été préparé à partir de matrice négative, il ne sera pas détecté

si la matrice a été remplacée par du PBS.


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1) Suivre les règles de lecture des échantillons présentées dans le Tableau 11 (cf Analyse qualitative).

2) Interpréter les résultats en fonction de la concentration en C. burnetii déterminée, comme indiqué dans

les Tableaux 13 et 14.

* Mélange de 3 individus ou 3 écouvillons d’1 placenta.

Tableau 13. Interprétation des résultats

Valeurs de concentration (bactéries ou GE/écouvillon

ou ml) Expression des résultats

Interprétation Domaine d’application :

Epidémiologique ou Diagnostique

Aucun signal ou < LDMETHODE

Non Détecté ou inférieur à la LDMETHODE

Négatif ou Inférieur à la LDMETHODE

< LQMETHODE et > LDMETHODE

Détecté en quantité inférieure à la LQMETHODE

Positif faible C. burnetii n’est pas considérée comme étant à

l’origine de l’avortement

< LQMAX et >LQMETHODE

Détecté Valeur déduite de bactéries /

écouvillon

Positif si compris entre LQMETHODE et 104 en individuel ou 103

en mélange* C. burnetii n’est pas considérée à priori comme responsable de l’avortement – à confirmer par

d’autres analyses

Positif fort si ≥ 104 en individuel (ou 103 en mélange*)

C. burnetii est considérée comme étant à l’origine de l’avortement (dans le lot considéré)

> LQMAX Détecté en quantité supérieure

à la LQMAX

Positif fort C. burnetii est considérée comme étant à l’origine de

l’avortement (dans le lot considéré)

Tableau 14. Résumé des caractéristiques de quantification des méthodes validées (GE/ml)

Droite de calibration : R2 >0.9 et Efficacité de PCR entre 85 et 115 %

Valeurs Méthode BioExtract® Column QIAamp® DNA mini kit BioExtract® SuperBall®

LDMETHODE 600 400 400

LQMETHODE 800 500 500

LQMAX 5.106 5.106 5.106


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Relative

L’analyse relative est établie d’après la valeur de Ct obtenue pour le MRSI : Analyse comparative des valeurs

de Ct C. burnetii obtenues pour les échantillons par rapport à la valeur de Ct obtenue pour le matériel de

référence (MR) au seuil de 104 GE/ml pour les analyses individuelles ou de 103 GE/ml pour les analyses de

mélange.



Cibles

Interprétation

C. burnetii (FAM)

IPC endogène (VIC)


FACULTATIF

Neg Neg Validé




de processus

OBLIGATOIRE

Neg Neg Validé



EPC

Contrôle Positif d’amplification de

C. burnetii

OBLIGATOIRE

Pos Ct conforme au Certificat

d’Analyse

Neg Validé

Neg Neg Problème lors de la PCR : Erreur de

Master Mix ? Oubli de l’EPC ?



MRSI

Contrôle Positif de processus et référence de

quantification

OBLIGATOIRE

Pos Ct conforme à l’intervalle

de tolérance (se reporter au dossier de

validation)

Pos Ct < 35

Validé

Neg Neg/Pos

Oubli d’addition d’ADN extrait ou dépôt non au contact du MM dans le puits réactionnel ?



L’IPC sera détecté dans le MRSI si celui-ci a été préparé à partir de matrice négative, il ne sera pas détecté si la matrice a été remplacée par du

PBS.


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1) Suivre les règles de lecture des échantillons présentées dans le Tableau 11 (cf Analyse qualitative).

2) Interpréter les résultats en fonction de la valeur de Ct obtenue pour le MRSI, comme indiqué dans le

Tableau 16.

Tableau 16. Interprétation des résultats qPCR C. burnetii en quantification relative

Résultats qPCR Interprétation

Négatif Non détecté Quantité de GE < LDpcr

Positif

Ct > Ct MRSI Positif* : Quantité de cible < à celle du MRSI

Ct = Ct MRSI Positif: Quantité proche de celle du MRSI

Ct < Ct MRSI Fort Positif* : Quantité de cible > à celle du MRSI

* Se reporter au Tableau 13. En incluant l’intervalle d’incertitude de mesure.

Il est recommandé de suivre la valeur de Ct du MRSI en carte de contrôle pour s’assurer de la fidélité du

processus analytique avec pour limite d’incertitude élargie ± 2.33 Ct.


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Bio-T kit Coxiella burnetii - Biosellal