Wykład II

Wektory plazmidowe

Terapia genowaTerapia genowaGene therapyGene therapy

wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków

Wektorvector

Cząsteczka kwasu nukleinowego, służąca do przenoszenia obcego DNA (transgenu)

Wektory

Plazmidowe Wirusowe

RNA DNA „nagi” DNA

Retrowirusy(w tym lentiwirusy)

AdenowirusyAAV Wirus Herpes

Kompleksy ze związkamikationowymi

Kompleksy z białkami osłonek Wirusowych

Nośnik (Nośnik (vehiclevehicle))

Jon lub związek chemiczny, obdarzony ładunkiem dodatnim, umożliwiający zneutralizowanie ładunku ujemnego kwasu nukleinowego i jego wniknięciedo komórki

- jony Ca2+

- dekstran - liposomy kationowe - polipeptydy- dendrymery

Inne użyteczne terminy Tranformacja Tranformacja bakteriibakterii

Modyfikacja fenotypu bakterii poprzez wprowadzanie genów za pomocą plazmidowego DNA

Transfekcja Transfekcja Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów niewirusowych

Transdukcja Transdukcja

Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów wirusowych

Klonowanie molekularne Klonowanie molekularne

Uzyskiwanie wielu identycznych kopii genów, np. przez powielanie plazmidowego DNA w bakteriach

Terapia genowa

Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca

wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów(np. za pomocą

oligonukleotydów antysensowych)

Nowotwory Choroby układu krążenia

Nowotwory Choroby układu krążenia

Choroby dziedziczne(wrodzone błędy metaboliczne,mukowiscydoza,dystrofia mięśniowa )

Terapeutyczne kwasy nukleinowe Terapeutyczne kwasy nukleinowe

DNA RNA

Sekwencje niekodująceGeny(Wektory DNA) Geny

(wektory RNA)Sekwencje niekodujące

Oligonukleotydy Antysensowe

Pułapki oligonukleotydwe rybozymy siRNA

Rodzaje terapii genowej

- somatyczna - komórek linii płciowej

Ekspresja genów w komórkach eukariotycznych wymaga zastosowania odpowiedniego promotora w wektorze plazmidowym

1. Promotor wirusowy 2. Promotor eukariotyczny

- konstytutywne - indukowane

3. Złożone

Geny reporterowe

Gen używany do badania skuteczności transfekcji. Gen reporterowy powinien być łatwy do wykrycia i nie powinien to być gen naturalnie obecny w transfekowanych komórkach.

Geny reporterowe CAT (acetylotransferaza Chloramfenikolu)

Lucyferaza

β-galaktozydaza

Zielone białko fluorescencyjne (GFP)

Wydzielnicza fosfataza alkaliczna (SEAP)

Ludzki hormon wzrostu

β-glukuronidaza

Wykrywanie ekspresji genów Wykrywanie ekspresji genów reporterowych reporterowych

-testy autoradiograficzne - testy kolorymetryczne

- emisja fluorescencji - emisja chemilumienscencji

-Wykrywanie białka: testy ELISA

Tabela. Geny reporterowe

Gen Testy in vitro Zalety Wady Zastosowanie CAT (acetylotransferaza chloramfenikolu)

Chromatografia, Fluorescencja, immunoassay

Minimalna aktywność endogenna w komórkach ssaków

Praco- i czasochłonne Brak testów in vivo; białko ma okres półtrwania 50 godzin

Lucyferaza a) świetlika

Photinus pyralis

b) żebropława – Renilla reniformis (sea pansy)

Bioluminescencja Nieizotopowe, Wysoka czułośc, niska niepecyficzna aktywność Assay in vivo

Krótki okres półtrwania białka, Kosztowny sprzęt

β-galaktozydaza Kolorymetryczna Fluroymetryczna chemilumienscencyjna

Nieizotopowa, Liczne testy, stosowana jako kontrola do mormalizacji tranefkcji innych genów Assay in vivo

Wysoka endogenna ekresja B-galaktozydaza w wielu typach komórek

Wydzielnicza fosfataza alkalicza (SEAP)

Chemiluminescencyjna, Kolorymetryczna

Nieizotopowa , Białko wydzielnicze Bardzo czuła, możliwośc analizy wielu próbek

Brak testów in vivo

Zielone białko fluorescencyjne (GFP)

Fluorescencja Pozwala na badanie ekspresji w żywych komórkach, fluorescencja jest cechą białka – nie są potrzebne żadne dodatkowe substraty

Czułość może być zbyt mała, ale znane sa mutanty

Ludzki hormon wzrostu (HGH)

Radioimunnoassay Białko wydzielnicze, bezpośrednie wykrywanie białka, prosty test

Test radioaktywny, stosunkowo niska czułość, kosztowny

B-glukuronidaza (GUS)

Kolorymetryczna Fluorescencyjna Chemiluminescencyjna

Test in vivo Nieizotopowa, stabilne białko, bardzo wysoka czułość testu chemiluminescencyjnego

Najczulsze testy wymagają sprzętu

o

CAT katalizuje transfer grup acetylowych z acetylo koenzymu A na chloramfenikol

Enzym prokariotyczny Bialko jest bardzo stabilne (okres półtrwania 50 godzin)

Wykrywanie: Test radioaktywny Rozdział form acetylowanych od nieacetylowanych

za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Możliwa ekstrakcja dla oceny ilościowej Dostępne także testy nieizotopowe: ELISA

Geny reporterowe - β-galaktozydaza

-hydroliza β-galaktozydów, najczęściej X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galaktozyd--może być używana (mierzona) w tym samych ekstraktach co lucyferaza i CAT

-testy kolorymetryczne: ONPG (o-nitrofenyl-B-D-galaktopiranozydfluorymetryczne: MUG – 4-methylumbelliferyl-b-D-galaktozydchemiluminescencyjne – 1,2-dioeksyetan

Możliwy test przyżyciowy – substrat di-B-D-galaktopyranozyd –rozkładany przez β-galaktozydazę, produkt wykrywany przez fluorescencję

Lucyferaza

-świetlika Photinus pyralis i żebropława Renilla reniformis-Reakcja bioluminescencyjna wymaga substratu – lucyferyny – ATP, -Jonów magnezu i tlenu. -Emisja światła – szybko wygasa -Lucyferaza ma krótki okres półtrwania – około 3 godzin -- wysoka czułośc

Lucyferaza żebropława – jako substratu używa celenterazyny

Zielone białko fluorescencyjne

-z Aequorea victoria: ekworyna emituje niebieskie światło po związaniu jonów wapnia. Światło to absorbuje białko GFP, emitując równocześnie światłozielone

Ekspresja GFP w innych organizamach powoduje zieloną fluorescencję po pobudzeniu światłem niebieskim lub UV

Transfekcja przejściowa i stabilna

Transfekcja plazmidem zawierającym gen selekcyjny, np. gen oporności na neomycynę. Po transfekcji komórki są hodowane w pożywce zawierającej neomycynę (lub jej analog, jak G418). Komórki, które nie zostały stransfekowaneplazmidem z genem NeoR, nie produkują enzymu rozkładającego G418 i giną. Przeżywają tylko komórki stabilnie stransfekowane plazmidem z genem selekcyjnym.

Selekcja komórek stabilnie transfekowanych

1. Geny opornościa) na antybiotyki aminoglikozydowe – transferaza neomycyny b) hygromycynę – fosfotransferaza hygromycyny B c) puromycynę d) zeocynę (bleomycyna).

Antybiotyki selekcyjne

Antybiotyk Gen oporności Mechanizm

działania

Stężenie

Genetycyna (G418) APH(3’) I , APH(3’)II Blokuje translację w komórkach eukariotycznych, interefrując z podjednostką rybosomu 80S

50 – 1000 µg/ml

Hygromycyna B Hph Wpływ na translokację, zaburzenia wbudowywania aminokwasów

50-1000 µg/ml

Puromycyna Pac Hamuje translację 1-10 µg/ml Zeocyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,5-1000 µg/ml Fleomycyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,1-50 µg/ml Blasticydyna S Bcs, BCD Hamuje translację 3-50 µg/ml

Sposoby transfekcji plazmidowego DNA

„nagi DNA” (metody fizyczne) nośniki chemiczne

Biolistyczna(strzelba genowa)iniekcja elektroporacja

mikroiniekcja

makroiniekcja

mała objętość Duża objętość(metoda hydrodynamiczna)

Elektroporacja

1. Siła przyłożonego pola elektrycznego- w większości komórek ssaczych maksymalna wydajność transfekcji

jest uzyskiwana kiedy napięcie wynosi od 250V/cm do 750 V/cm Przeżywa około 20-50% komórek

2. Czas trwania impulsu elektrycznego - 20-100 msec

3. Temperatura 0OC lub pokojowa

4. Skład jonowy środowiska Wydajność jest wielokrotnie wyższa gdy komórki są zawieszane w buforowanych roztworach soli (np.. HEPES) niż w roztworach substancji

niejonowych takich jak manitol czy sacharoza

Makroiniekcja

Wstrzyknięcie nagiego DNA do mięśnia szkieletowego -ekspresja β-galaktozydazy

Transfekcja nagiego DNA

1. Rodzaje komórek

2. Maksimum ekspresji – po 14 dniach w mięśniach3. Utrzymywanie DNA we włóknach mięśniowych – większość

w postaci kolistej; ekspresja nawet do 2 lat4. Regeneracja mięśni umożliwia większą ekspresję5. Promotory – wirusowe lepsze niż tkankowo specyficzne 6. Zależność wydajności transfekcji od wielkości zwierzęcia

Nagi DNA – zastosowania

1. Terapia dystrofii mięśniowej Duchenna; myszy mdx2. Transfer genów białek wydzielniczych, np.. VEGF 3. Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych 4. Szczepionki genowe

VEGF - a major angiogenic growth factor

• VEGF stimulates the formation of new blood vessels, acting as amitogen for endothelial cells.

• Insuffcient vascularization leads to heart or peripheral muscleischemia and is an inherent feature of cardiovascular diseases.

•Gene therapy with VEGF has been considered as a way to stimulate angiogenesis and ameliorate the effect of ischemia

•It has been also assumed that gene delivery with relatively weakplasmid vectors will be more safe, producing small amounts of therapeutically effective VEGF, but will not exert the side effects, which may be expected with strong vectors

Uzyskanie plazmidowych wektorów ekspresyjnych z genem czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF)

1. Uzyskanie plazmidów (nie-ekspresyjnych) z cDNA izoform ludzkiego genu VEGF165 oraz VEGF121 2. Uzyskanie dużych ilości plazmidu pGEM-VEGF. Wycięcie cDNA za pomocą enzymu BamH13. Przecięcie za pomocą enzymu BamHI plazmidu pSG5 (Stratagene) (plazmid posiada gen oporności na

ampicilinę). 4. Wklonowanie sekwencji cDNA VEGF do plazmidu VEGF.5. Transformacja bakterii kompetentnych plazmidem („mieszaniną ligacyjną”) 6. Selekcja bakterii na agarze zawierającym amipicilinę 7. Namnożenie w bulionie pojedynczych klonów bakterii wyrosłych na agarze 8. Izolacja plazmidowego DNA 9. Sprawdzenie plazmidowego DNA za pomocą trawienia enzymem retsrykcyjnym BamHI10. Transfekcja uzyskanych plazmidów pSG5VEGF165 oraz pSG5VEGF121 do komórek mięśni gładkich

szczura przy pomocy liposomów.11. Zbadanie produkcji VEGF: test ELISA, barwienie immunohistochemiczne 12. Doświadczenia na zwierzętach.

VEGF VEGF genegene transfer transfer in vitro in vitro • pSG5VEGF165 plasmid (contains human VEGF165 cDNA driven by weak viral SV40 promoter)• transfection in vitro to rat VSMC results in generation of large amounts of human VEGF despite low transfection efficiency, typical for these cells; released VEGF is biologicaly

active and enhances proliferation of endothelial cells

β-gal expressionVEGF production by transfected cells

0

1

2

3

Control βgal

hum

anV

EG

F ng

/ml m

ediu

m

VEGF48 h

VEGF72 h

VEGF expression

Jozkowicz et al., Clin Chim Acta, 1999: 288:1-19Dulak et al, Vasc Med, 2000;5:33-40

Injection of naked humanInjection of naked human VEGF DNA VEGF DNA into rabbit ischemic into rabbit ischemic skeletal muscle results in expression of human transgene skeletal muscle results in expression of human transgene

andand protein protein releaserelease

Human VEGF protein in the blood of transfected rabbits

rabbit VEGF165

rabbit VEGF121

human VEGF165

pSG5VEGF165

0

2

4

6

8

10

VEG

F pg

/ml

RT-PCR - adductor muscle

β-gal pSG5VEGF165Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110

NakedNaked VEGF VEGF genegene transfer transfer increases the number of microvesselsincreases the number of microvesselsin the ischemic rabbit skeletal musclesin the ischemic rabbit skeletal muscles

alkaline phosphatase-positive microvessels in muscle

transfected with control plasmid

microvessels in muscle transfected withVEGF plasmid

Ves

sels

/mm

0

100

200

2β−gal

transfected VEGF

transfected

300

p<0.01

Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110

Nośniki chemiczne plazmidowego DNA

Jony Ca2+

DEAE-dekstran Związki wielkocząsteczkowe

Lipidy i lipsomy

Polipeptydy Polimery dendrymery