Bedeutung der Calcium - Versorgung für die ... · Technische Universität München Lehrstuhl für Ökophysiologie der Pflanzen Department für Ökologie Bedeutung der Calcium - Versorgung

Technische Universität München

Lehrstuhl für Ökophysiologie der Pflanzen

Department für Ökologie

Bedeutung der Calcium - Versorgung für die Holzdifferenzierung

sowie die elektrische Signalleitung in der Pappel

Silke Lautner

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für

Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung

des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigten

Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Jörg Fromm

Prüfer der Dissertation:

1. Univ.-Prof. Dr. Rainer Matyssek

2. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Oßwald

Die Dissertation wurde am 28. April 2005 bei der Technischen Universität München

eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung,

Landnutzung und Umwelt am 20. Juli 2005 angenommen.

I

Vorwort

Die vorliegende Arbeit entstand zwischen August 2002 und April 2005 am Lehrstuhl

Ökophysiologie der Pflanzen und am Fachgebiet Angewandte Holzbiologie der Fakultät

Wissenschaftszentrum Weihenstephan (WZW) an der Technischen Universität München. Das

Projekt wurde über ein Promotionsstipendium der TU München sowie über die Deutsche

Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Pappelforschergruppe finanziert.

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Rainer Matyssek, und Herrn

Prof. Dr. Jörg Fromm für die Themenstellung, ihre Anregungen und ihre stete Unterstützung

bei der Durchführung der Versuche. Herrn Prof. Dr. Wolfgang Oßwald möchte ich für die

Übernahme des Zweitkorrektorats danken. Des weiteren möchte ich PD Dr. Thorsten Grams

für seine Unterstützung und Diskussionsbereitschaft danken, die mich über weite Teile der

Arbeit begleitet haben, und allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Ökophysiologie der Pflanzen

und der Fachgebiete Pathologie der Waldbäume und Angewandte Holzbiologie, insbesondere

Dr. F. Fleischmann, Dr. M. Arend, Herrn T. Feuerbach, Frau A. Vieler, Frau M. Rinas und

Herrn R. Rosin. Für die Hilfestellung bei der FTIR-Spektroskopie möchte ich mich beim

Chemielabor des Lehrstuhls für Holzkunde und Holztechnologie der TUM unter der Leitung

von Frau Dr. E. Windeisen herzlich bedanken.

Dank geht auch an meine Familie und meine Freunde, die mich stets unterstützten.

II

Inhaltsverzeichnis

Vorwort................................................................................................................................. I

Inhaltsverzeichnis................................................................................................................. II

Abkürzungsverzeichnis........................................................................................................ V

1 Einleitung........................................................................................................ 1

1.1 Die Bedeutung von Calcium für die Pflanze.................................................... 2

1.2 Charakteristika elektrischer Signale................................................................. 4

1.2.1 Aktionspotentiale.............................................................................................. 5

1.2.2 Variationspotentiale........................................................................................... 7

1.3 Grundlagen der Holzbildung............................................................................. 8

1.4 Zielsetzung.................................................................................................... 10

2 Material und Methoden................................................................................. 11

2.1 Pflanzenanzucht................................................................................................ 11

2.1.1 Anzucht von Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx. ...………...11

2.1.1.1 Agarkultur……………………………………………………………………. 11

2.1.1.2 Hydrokultur...................................................................................................... 13

2.1.1.3 Anzucht der Pappeln unter unterschiedlicher Nährstoffversorgung………….13

2.1.2 Anzucht von Populus trichocarpa.................................................................... 16

2.2 Zuwachsmessungen.......................................................................................... 17

2.3 Anatomische Untersuchungen.......................................................................... 17

2.3.1 Anfertigung von Gewebeschnitten für lichtmikroskopische Untersuchungen..17

2.3.2 Mazeration.........................................................................................................18

2.3.3 Histometrische Auswertung..............................................................................19

2.3.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).................................................. 19

2.4 Chemische Analysen........................................................................................ 20

2.4.1 Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) - Spektroskopie.........................................20

2.5 Elementanalysen................................................................................................22

2.5.1 Energiedispersive Röntgenanalyse (EDXA) am

Rasterelektronenmikroskop (REM)...................................................................22

2.6 Elektrophysiologische Untersuchungen............................................................23

2.6.1 Membranpotentialmessungen im Mesophyll................................................. 24

III

2.6.2 Membranpotentialmessungen im Phloem.........................................................24

2.7 Blattgaswechselmessungen...............................................................................26

2.8 Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz..........................................................28

3 Ergebnisse...................................................................................................... 30

3.1 Bedeutung der Calciumernährung für den Phänotyp der Pappel.................... 30

3.1.1 In Hydrokultur................................................................................................. 30

3.1.2 Im Freiland...................................................................................................... 33

3.2 Bedeutung der Calciumernährung für den Calciumhaushalt der Pappel........ 37

3.3 Bedeutung der Calciumernährung für die Anatomie der Pappel.................... 41

3.3.1 In Hydrokultur................................................................................................ 41

3.3.2 Im Freiland...................................................................................................... 45

3.4 Bedeutung der Calciumernährung für die Ultrastruktur

und die Zellwandchemie der Pappel................................................................ 47

3.4.1 Ultrastruktur des Cambiums und des Blattes................................................... 47

3.4.2 Chemie der Zellwand...................................................................................... 50

3.5 Elektrische Signalleitung der Pappel.............................................................. 55

3.5.1 Signalleitung an Populus trichocarpa............................................................. 55

3.5.1.1 Kältereizung mittels Eiswasser........................................................................ 56

3.5.1.2 Hitzereizung mittels offener Flamme............................................................... 57

3.5.1.3 Unterbrechung der elektrischen Signalleitung durch einen Kälteblock........... 60

3.5.1.4 Signalleitung an mit TEA+ behandelten Pappeln............................................ 61

3.5.2 Signalleitung an Calcium-mangelversorgten Pappeln

(P. tremula x P. tremuloides)……………………………………………… 62

3.6 Ionengehalte in geöffneten und geschlossenen Pappelstomata...................... 64

3.7 Der Einfluss der elektrischen Signalleitung auf den Blattgaswechsel der

Pappel.............................................................................................................. 67

3.7.1 Bei getopften Populus trichocarpa - Pflanzen................................................ 67

3.7.2 Bei unterschiedlicher Calciumernährung von

Populus tremula x Populus tremuloides…………………………………….. 71

3.8 Auswirkung der elektrischen Signalleitung auf die

Lichtreaktionen der Photosynthese der Pappel................................................ 74

IV

4 Diskussion...................................................................................................... 78

4.1 Bedeutung der Calciumernährung für die Holzdifferenzierung...................... 78

4.1.1 Ausblick auf die Bestandesebene.................................................................... 84

4.2 Signalleitung in der Pappel............................................................................. 85

4.2.1 Bedeutung elektrischer Signalleitung für den Baum....................................... 94

5 Schlussfolgerung............................................................................................. 96

6 Zusammenfassung.......................................................................................... 99

7 Literatur........................................................................................................ 102

8 Anhang.......................................................................................................... 116

V

Abkürzungsverzeichnis ABA Abszissinsäure

ALVPD Wasserdampfsättigungsdefizit des Blattes (Air to Leaf water Vapor

Pressure Deficit) [mbar / bar]

AP Aktionspotential

APW artificial pond water

BF projizierte Blattfläche [m²]

Ca2+ Calcium

[Ca2+]cyt freies Calcium im Cytoplasma

ce molare CO2-Konzentration vor der Küvette (≡ im Referenzgas); korrigiert

um Nullpunktverschiebung und Verzerrung des Infrarotgasanalysators (IRGA)

CO2 Kohlendioxid

∆C Differenz der CO2-Konzentration zwischen Referenzgas und Messgas;

korrigiert um Nullpunktverschiebung und Verzerrung des

Infrarotgasanalysators (IRGA)

DNP 2,4-Dinotrophenol

EDXA energie-dispersive Röntgenanalyse (Energy Dispersive X-ray Analysis)

ER endoplasmatisches Retikulum

FTIR Fourier - Transform - Infrarot - Spektroskopie

gH2O stomatäre Leitfähigkeit für Wasser

H2O Wasser

JCO2 Nettophotosyntheserate

JH2O Transpirationsrate [mmol m-2s-1]

KBr Kaliumbromid

KCl Kaliumchlorid

KOH Kalilauge

KSCN Kaliumthiocyanat

MES 2-Morpholinoethan-Sulfonsäure Monohydrat

n Stichprobenumfang

PAM Puls Amplituden-Modulation

PIN Proteinaseinhibitor-Gen

PPFD photosynthetisch aktive Photonenflussdichte

PS II Photosystem II

VI

REM Rasterelektronenmikroskop

Rubisco Ribulose-1,5-Biphosphat-Carboxylase/Oxygenase

svp Sättigungsdampfdruck (saturated vapor pressure) bei angegebener

Temperatur [mbar]

TEM Transmissionselektronenmikroskop

TL Blatttemperatur [°C]

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

ue molarer Gasstrom am Küvetteneingang [µmol s-1]

VP Variationspotential

wa Molenbruch des Wasserdampfes in der Küvette

we molare Feuchtekonzentration vor der Küvette (≡ im Referenzgas)

wi Molenbruch des Wasserdampfes in den Interzellularen des Mesophylls

wo molare Feuchtekonzentration hinter der Küvette (≡ im Messgas)

Yield Electon Quantum Yield; Quantenausbeute am Photosystem II

Einleitung

1

1 Einleitung

Die mineralische Ernährung besitzt im pflanzlichen Metabolismus spezifische wie auch

essentielle Funktionen. Der heute weithin geläufige Begriff der essentiellen Nährelemente

wurde 1939 erstmals von Arnon und Stout geprägt. Nach ihrer Aussage lässt sich demnach

ein Nährelement als essentiell klassifizieren, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:

1. Die Pflanze kann in Abwesenheit dieses Elementes ihren Lebenszyklus nicht

abschließen.

2. Die Funktion dieses Elementes kann nicht durch ein anderes mineralisches Element

kompensiert werden.

3. Das Element muss in den Pflanzenmetabolismus direkt involviert oder für einen

definierten Stoffwechselvorgang (z.B. enzymatische Reaktion) unabdingbar sein.

Nach dieser doch sehr strikten Definition würden Mineralelemente, die toxische Effekte

kompensieren oder solche, welche in weniger spezifischen Funktionen, wie z.B.

Osmoseregulation, andere Mineralelemente ersetzen, nicht als essentiell eingestuft werden.

Sie würden lediglich als „vorteilsbringende“ Nährelemente eingestuft werden. Selbst heute ist

nicht endgültig geklärt, welche Elemente in der Pflanzenernährung ausschließlich als

essentiell zu klassifizieren sind; diese Problematik wird vor allem dann deutlich, wenn man

zwischen höheren und niederen Pflanzen unterscheidet. Essentielle Nährstoffe werden dabei,

je nach Bedarf für das pflanzliche Wachstum, generell in Makronährstoffe und

Mikronährstoffe unterteilt. Zu den Makronährstoffen höherer Pflanzen, wie den Bäumen,

gehören Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Magnesium, Kalium und Calcium. Zu deren

Mikronährstoffen zählen Eisen, Mangan, Zink, Kupfer, Bor, Molybdän, Chlorid und Nickel;

als „vorteilsbringende“ Elemente werden bei höheren Pflanzen Natrium, Silizium und Kobalt

angesehen (Marschner, 1995). Bei dieser Art der Nährstoffklassifizierung wird jedoch nicht

deutlich, dass jedes Nährelement in der Pflanze verschiedenartige Funktionen ausüben kann,

welche wiederum häufig nur recht schwach bezüglich ihrer quantitativen oder

physiologischen Bedeutung miteinander korreliert sind. So kann ein mineralischer Nährstoff

dabei gleichzeitig als Grundbaustein einer organischen Struktur wie als Aktivator

enzymatischer Vorgänge, als Ladungsträger oder als Osmoseregulator fungieren (Marschner,

1995).

Einleitung

2

1.1 Die Bedeutung von Calcium für die Pflanze

Calcium gilt mit einem Ionenradius von 0,412 nm als ein relativ großes divalentes Kation; es

bildet zudem nur schwache Bindungen zu Wasser aus. Die Aufnahme von Calcium aus dem

Boden in den Apoplasten der Wurzel erfolgt passiv und der Transport dieses Nährelements

findet nahezu ausschließlich über den Transpirationsstrom in acropetaler Richtung statt, somit

kann dieses Ion als weitgehend Phloem-immobil angesehen werden.

Im Unterschied zu anderen Makronährelementen findet sich ein Grossteil des Calciums in der

Pflanze im apoplastischen Raum wieder. Dieses Phänomen ist hauptsächlich in der Fülle von

calciumbindenden Strukturen in der Zellwand begründet, aber auch in der beschränkten Ca-

Aufnahme des Protoplasten. Besonders in der Mittellamelle ist reichlich Calcium zu finden;

hier liegt es an den Carboxylgruppen der Pektine in gebundener, für die Pflanze nicht mehr

verfügbarer Form vor. Eine weitere Art der Calciumspeicherung in Pflanzen besteht in der

Bildung von Calciumoxalat-Kristallen. Die Anzahl selbiger steigt mit zunehmender Ca2+-

Versorgung der Pflanze an und findet in Angiospermen meist in den Vakuolen der Blattzellen

statt (Borchert, 1990). In Nadelbäumen jedoch wurden die Ca2+-Oxalat-Kristalle meist in den

Zellwänden oder den Interzellularräumen detektiert (Fink, 1991 a-c). In Pflanzenarten mit

einer geringen Calciumbindungskapazität an den Carboxylgruppen des Pektins der Zellwand

kann die Ausfällung von Ca2+-Oxalaten im Apoplasten, alternativ zur Vakuole des

Symplasten, somit als Ersatzmechanismus zur Bindung und Speicherung dieses Ions dienen

(Marschner, 1995). An der Pappel (P. tremula) wurden in der Rinde des Stammes neben

einzelnen Oxalatkristallen zudem sog. „Kristallkammerfasern“ beobachtet; letztere finden

sich in der Umgebung von Phloem-Fasern und sind in ihrer ganzen Länge mit Calcium-

Oxalat- Kristallen gefüllt (Trockenbrodt, 1995).

In voll entwickelten Geweben mit hoher Kationen-Austauschrate lassen sich Bereiche mit

hoher Ca2+-Konzentration deutlich von solchen mit niedriger Ca2+-Konzentration

unterscheiden (Abb. 1.1). Hohe Calcium-Konzentrationen finden sich im Apoplasten in den

Bereichen der Mittellamelle und an der Außenseite der Plasmamembran, im Symplasten in

der Vakuole und im endoplasmatischen Retikulum (ER), aber auch in den Chloroplasten. Im

Apoplasten ist Calcium teils fest, teils reversibel gebunden an den Außenseiten der

Membranen und in der Mittellamelle der Zellwände zu finden. Hier fallen dem Calcium

vornehmlich zwei Funktionen zu. Zum einen die Erhaltung der Membranstabilität, welche

einerseits durch eine Anlagerung des Ions an den Phosphatköpfen der membranbildenden

Einleitung

3

Phospholipiden, andererseits durch eine Brückenbildung zwischen Phospholipiden und

Proteinen an der Membranoberfläche geschieht und somit zu einer Stabilisierung der

Membranen führt. Zum anderen dient Calcium der Zellwandstabilisierung, indem es durch

Bindung an Pektinketten der Mittellamelle diese vernetzt und somit den Zellwänden Stabilität

gewährt. Unter reduzierter Ca2+-Konzentration in der Mittellamelle steigt dort die

Polygalakturonase-Aktivität, wodurch es zu der typischen Calciummangelerscheinung einer

Gewebedestabilisierung, bis hin zu einem Gewebekollaps kommen kann (Bussler, 1963).

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Ca2+-Verteilung (Ca2+ = ●) in benachbarten Zellen;

Schema in Anlehnung an Marschner, 1995.

Im Gegensatz zum Apoplasten ist die Konzentration von freiem Calcium im Cytoplasma

([Ca2+]cyt) äußerst gering; sie erreicht hier nur Werte zwischen 0,1 und 0,2 µM (Felle, 1988;

Evans et al., 1991; Hirschi, 2004). Die geringe Konzentration an freiem Ca2+ im Cytoplasma

wird einerseits durch eine generell geringe Ca2+-Permeabilität der Plasmamembran,

andererseits durch aktiven Export des Ions mittels Membrantransporter erreicht. Als solche

fungieren an der Plasmamembran und am ER Calcium-ATPasen (Ca2+/H+ Antiporter) (Kasai

und Muto, 1990; Jones et al., 1993), ebenso am Tonoplasten, wo sie zusätzlich durch PPiasen

energetisiert werden können. Auf diese Weise kann zwischen der Konzentration freien

Calciums im Cytosol und in der Vakuole ein bis zu 105-facher Konzentrationsunterschied

aufgebaut werden (Schumaker und Sze, 1990).

Calcium erfüllt im Cytoplasma vorrangig die Funktion eines sekundären Botenstoffes.

Veränderungen im [Ca2+]cyt -Gehalt treten während einer großen Bandbreite von biotischen

und abiotischen Einflüssen auf. Als biotische Stimuli wurden dabei vor allem die Hormone

Abszissinsäure und Gibberellinsäure untersucht, aber auch Elicitoren von Pilzen und

Einleitung

4

Nodulationsfaktoren (Marschner, 1995); abiotische Stimulatoren umfassen Licht, niedrige

und hohe Temperatur, Berührung sowie hyperosmotischen und oxidativen Stress (Sanders et

al., 1999; Knight, 2000; Anil und Rao, 2001; Knight und Knight, 2001; Rudd und Franklin-

Tong, 2001).

Die intrazellulären Funktionen des Calciums lassen sich dabei in drei Bereiche unterteilen.

Zunächst kann man recht allgemein postulieren, dass Calcium im Cytoplasma auf ionischen

Stress ausgleichend wirkt. Auch intrazellulär wirkt es membranstabilisierend und reduziert

durch diese Festigung der Membranen potentielle passive Ioneneinströme (White und

Broadley, 2003).

Des weiteren treten [Ca2+]cyt - Veränderungen häufig bei einer Enzymaktivierung in

Erscheinung. Allein in den Chloroplasten sind beispielsweise mehrere Ca-abhängige Proteine

(z.B. wasserspaltende Enzyme, Calmodulin-stimulierte NAD-Kinase, Thioredoxine,

Ferredoxine und Stromaenzyme des Calvin-Zyklus) angesiedelt (Plieth, 2005).

Schließlich kommt dem Calcium noch eine herausragende Bedeutung in der Aktivierung,

bzw. Blockierung von Ionenkanälen in Membranen zu. So konnte nachgewiesen werden, dass

bei Dunkelheit Ca2+ aus den Chloroplasten ins Cytoplasma strömt und dieser Ca2+-Einstrom

die auswärtsgerichteten K+-Kanäle der Plasmamembran aktiviert; dieser K+-Ausstrom hat

eine transiente Veränderung des Membranpotentials zur Folge (Plieth et al., 1998).

1.2 Charakteristika elektrischer Signale

Bereits seit über 100 Jahren ist das Phänomen elektrischer Signale in Pflanzen bekannt. Schon

Burdon-Sanderson (1873) und Charles Darwin (1875) konnten die Existenz der elektrischen

Signalleitung in insektivoren Pflanzen nachweisen. Dennoch fristete dieses Forschungsgebiet

über lange Jahre hinweg ein unbeachtetes Dasein. Darwin wandte sich in seiner weiteren

botanischen Forschung verstärkt der Circumnutation und der damit verbundenen chemischen

Signalleitung in Pflanzen zu (Darwin 1881). Aus bislang ungeklärten Gründen wurden diese

Arbeiten so in den Vordergrund gestellt, dass die Ergebnisse zur elektrischen Signalleitung

darüber in den Hintergrund gerieten und die Pflanzenphysiologie sich verstärkt auf die

chemische Signalleitung fokussierte. Aus diesem Trend entwickelte sich mit der Zeit die

Ansicht, dass elektrische Signale, später auch chemische Signale, in tierischen Systemen der

Reizübertragung dienen, wohingegen die Signalleitung im pflanzlichen System auf

chemischer Signaltransduktion beruhe. Erst Forschungsergebnisse von Bose (1924) und

Einleitung

5

später von Sibaoka (1966, 1969) und Pickard (1973) rückten die Existenz von elektrischen

Signalen in der Pflanzenphysiologie weltweit wieder in das Bewusstsein und in das Interesse

von Botanikern. Man begann, zwischen den verschiedenen Arten der Signaltransduktion, dem

Aktionspotential und dem Variationspotential zu unterscheiden.

1.2.1 Aktionspotentiale

Auch bei der elektrischen Signalleitung ist der [Ca2+]cyt -Wert von ausschlaggebender

Bedeutung bei der Entstehung von Aktionspotentialen entlang der Plasmamembran. Erst

durch einen vorübergehenden starken [Ca2+]cyt Anstieg von ~ 0,1µM auf ~1µM werden zuerst

Cl-- und anschließend K+- Kanäle geöffnet, welche zu der typischen De- bzw. Repolarisierung

der Plasmamembran während eines Aktionspotentials führen (Abb. 1.2). Ob der Anstieg von

[Ca2+]cyt durch Ca-Einstrom aus dem Apoplasten oder durch Ca2+-Einstrom aus

cytoplasmatischen Speicherorten genährt wird, ist noch nicht gänzlich geklärt. Entgegen der

herkömmlichen Meinung eines apoplastischen Einstroms sprechen allerdings erste

Beobachtungen, die das ER als Ca2+-Quelle für den [Ca2+]cyt -Anstieg sehen (Thiel et al.,

1997; Wacke et al., 2001; Plieth, 2005).

Einleitung

6

Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines Aktionspotentials an der Plasmamembran von Chara, in

Anlehnung an Nultsch (2001). Das Ruhepotential beträgt hier -190 mV. Durch einen an der Plasmamembran auftreffenden Reiz (Pfeil) strömt Ca2+ in das Cytoplasma ein und bewirkt dadurch die

Öffnung auswärtsgerichteter Cl--Kanäle; dies führt zur Depolarisation der Plasmamembran bis hin zum Spitzenpotential (hier: +40 mV). Durch die Positivierung des Cytoplasmas werden

spannungsabhängige auswärtsgerichtete K+-Kanäle aktiviert, welche ihrerseits durch einen Ausstrom die Repolarisierung der Membran bis hin zu ihrem Ruhepotential bewirken.

Abszisse: Zeit in Sekunden; Ordinate: Membranpotential in mV.

Spannungsänderungen an den pflanzlichen Plasmamembranen gleichen in vielem den

Aktionspotentialen, wie sie schon seit langem in tierischen Systemen bekannt sind.

Aktionspotentiale werden durch an der Plasmamembran auftretende Reize, die ein

„Schwellenpotential“ überschreiten, ausgelöst; daraufhin erfolgt selbsttätig eine

Depolarisation bis hin zum Spitzenpotential, gefolgt von der Repolarisation zurück zum

Ruhepotential. Der Zustand, der bei der Überschreitung des Schwellenpotentials eintritt, wird

auch „Erregung“ genannt. Eine Erregung führt immer zu einem voll ausgebildeten

Aktionspotential, es gilt ein „Alles oder Nichts - Gesetz der Erregung“ (Dudel et al., 1996).

Aktionspotentiale können in Pflanzen durch Berührungs- oder Kältereize ausgelöst werden;

ihre Ausbreitungsgeschwindigkeit ist etwa um den Faktor 105 langsamer im Vergleich zu

tierischen Systemen (Burdon-Sanderson und Page, 1876; Sibaoka, 1991). In höheren Pflanzen

entwickeln Aktionspotentiale eine Ausbreitungsgeschwindigkeit zwischen 1 mm s-1 und

20 mm s-1; in sensitiven Pflanzen, wie z.B. der Mimose oder der Venusfliegenfalle, sogar bis

zu 200 mm s-1 (Sibaoka, 1969).

Einleitung

7

1.2.2 Variationspotentiale

Im Gegensatz zum Aktionspotential wird durch Verwundung (Flamme, Schnitt) von

pflanzlichem Gewebe ein sich langsam ausbreitendes Variationspotential mit irregulärer Form

ausgelöst (Pickard, 1973). Die Fortpflanzung eines Variationspotentials erfolgt nicht

selbsttätig, vielmehr handelt es sich um eine lokale elektrische Antwort auf eine chemische

Substanz, die im Xylem transportiert wird (Houwink, 1935; Sibaoka, 1966, 1969; Pickard,

1973). Diese chemischen Substanzen, als Reaktion auf die Verwundung hin gebildet,

gelangen an der Verwundungsstelle ins Xylem und werden durch hydraulische Ausbreitung

fortbewegt. Sie lösen in allen lebenden Zellen, die kontaktiert werden, elektrische

Spannungsänderungen an den Plasmamembranen aus; besonders ausgeprägt sind diese

Reaktionen in den Xylem-umgebenden Zellen. Ricca behauptete 1916 erstmals, dass das

Signal chemischer und nicht elektrischer oder hydraulischer Signatur ist, da es ihm gelang

über eine „Wasserfalle“ hinweg eine chemische Signalweiterleitung entlang des

Mimosensprosses nachzuweisen. Diese chemische Substanz wurde forthin „Ricca-Faktor“

genannt. Das Variationspotential ist somit in der Lage, auch über abgestorbenes

Sprossgewebe hinweg fortgeleitet zu werden. Malone (1994) überprüfte Riccas Theorie und

konnte ebenfalls an Mimosa bestätigen, dass eine hydraulische Ausbreitung von

Verwundungsstellen in acropetaler wie auch in basipetaler Richtung stattfindet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Mechanismus eines Variationspotentials

folgendermaßen stattfindet: an der Verletzungsstelle gebildete Wundsubstanzen werden durch

hydraulische Ausbreitung über das Xylem im Pflanzenkörper fortgepflanzt. Ein

Variationspotential lässt sich daher durch folgende Eigenschaften charakterisieren: I.) es kann

totes Gewebe passieren; II.) sein Entstehen hängt vom vorherrschenden Wassergehalt der

Pflanze ab. Ein stark negatives Wasserpotential in den Xylemgefäßen führt zu einer schnellen

Ausbreitung; bei gesättigtem Wasserzustand ist die Gefäßspannung vernachlässigbar gering

und das Variationspotential kann nicht fortgepflanzt werden.

Im Gegensatz zum Variationspotential sollte ein Aktionspotential durch totes Gewebe in

seiner Ausbreitung geblockt werden; auch ist es nicht abhängig von hydraulischen Prozessen

im Xylem.

Einleitung

8

1.3 Grundlagen der Holzbildung

Neben Kalium gilt auch Calcium als sehr wichtiges Nährelement für die cambiale Aktivität in

Gehölzpflanzen (Eschrich und Blechschmidt-Schneider, 1992; Dünisch und Bauch, 1994a).

Beide Elemente sind für Vorgänge der Zellteilung und Zelldifferenzierung im cambialen

Meristem von besonderer Bedeutung. Calcium spielt dabei vor allem durch seine

versteifenden Eigenschaften an der dehnbaren Primärwand und der Mittellamelle im sich

differenzierenden Xylemgewebe eine wichtige Rolle (Brett und Waldron, 1996; Guglielmino

et al., 1997). Auch für die osmotische Regulation in der Vakuole ist es während der

Differenzierungsphase von herausragender Bedeutung.

Das Cambium ist ein laterales Meristem, das für die Bildung von sekundärem Xylem und

Phloem verantwortlich ist. In Bäumen wird so durch cambiale Zellteilung und

Zelldifferenzierung nach innen hin der Rohstoff Holz (sekundäres Xylem), nach außen hin

das sekundäre Phloem und die Rinde gebildet (Chaffey et al., 1997). Das vaskuläre Cambium

der Gehölze ist ein sekundäres Meristem, welches aus dem Procambium hervorgeht, das

seinerseits wiederum dem Apikalmeristem entspringt. Es besteht aus zwei verschiedenen

Zelltypen: aus den fusiformen Initialzellen, die sich anatomisch durch eine schmale und

langgestreckte äußere Form sowie durch eine starke Vakuolisierung von dem zweiten Zelltyp

unterscheiden, den Strahlinitialen (Raven, 1987). Diese sind in ihrer vertikalen Ausprägung

sehr kurz und stellen den Ausgangspunkt für die das Phloem wie auch das Xylem in radialer

Richtung durchziehende Strahlen dar. Das Strahlparenchym besteht aus lebenden Zellen, über

die eine Nährstofftranslokation zwischen Phloem und Xylem stattfinden kann (Mellerowitcz

et al., 2001).

Die cambiale Aktivität ermöglicht den Gehölzpflanzen durch ständig wiederkehrende Bildung

von Phloem und Xylem ihre mehrjährigen Lebenszyklen. Anatomisch unterteilt sich die sog.

cambiale Zone in das eigentliche Cambium, welches streng genommen aus nur einer

Zellschicht, den Initialzellen, besteht, und in dessen Derivate, den Phloem- und den

Xylemmutterzellen, welche wiederum aus den sich periklin teilenden Initialzellen

hervorgehen. Die Teilungsgeschwindigkeit der Xylemmutterzellen ist dabei bedeutend

schneller als die der Phloemmutterzellen. Aus Phloemmutterzellen gehen bei Angiospermen

wie der Pappel die Siebröhrenelemente (sieve elements/SEs) und die Geleitzellen (companion

cells/CCs) hervor, welche im ausdifferenzierten Phloemgewebe sog. SE/CC-Komplexe

bilden. Im Gegensatz zu den Xylemzellen schließen die Phloemzellen ihre Entwicklung nicht

Einleitung

9

mit der Autolyse des Protoplasten ab. Die Siebröhrenelemente behalten ein rudimentäres,

membranständiges Cytoplasma, ER, einige Mitochondrien, Plastiden und phloemspezifische

Proteine (van Bel et al., 2003); sie besitzen allerdings keinen Zellkern mehr. Die mit ihnen

durch zahlreiche Plasmodesmata verbundenen Geleitzellen hingegen bleiben im Besitz ihres

vollwertigen Cytoplasmas.

Aus den Xylemmutterzellen können sich bei Angiospermen Gefäße, Tracheiden, Parenchym-

und Faserzellen bilden. Der Holzaufbau der Pappel besteht in axialer Richtung nur aus

Gefäßen und Fasern, in radialer Richtung nur aus Parenchym. Die Ausdifferenzierung der aus

den Initialzellen hervorgehenden Xylemzellen umfasst drei Phasen: Zellstreckung,

Sekundärwandbildung mit Lignifizierung und Autolyse des Protoplasten (Abb. 1.3). Bei

einigen Baumarten kann es im Laufe des Lebenszyklus’ auch noch zu einer vierten Phase

kommen, der sog. Kernholzbildung (Plomion et al., 2001).

Abb. 1.3: Lichtmikroskopischer Querschnitt durch einen Pappelstamm im Sommerzustand. Von außen nach innen: Phloemgewebe (Ph); cambiale Zone (CZ), die sich aus fusiformen Initialen,

Strahlinitialen und deren Derivaten zusammensetzt; Expansion der Xylemzellen (Exp); Sekundärwandbildung (Sek), einhergehend mit Lignifizierung und abschließenden Zelltod. Des weiteren ist das radiale Strahlparenchym (S), entlang dessen sich häufig Gefäße (G) entwickeln,

deutlich zu erkennen.

Einleitung

10

Um mit einhergehender Umfangserweiterung des Stammes den cambialen Ring nicht

unterbrechen zu müssen sind die Initialzellen auch in der Lage, sich antiklin zu teilen und

somit durch in tangentialer Richtung neu eingefügte Initialzellen einen durchgehenden

cambialen Ring zu erhalten.

1.4 Zielsetzung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen, die Bedeutung der Calciumversorgung für die

Entwicklung und das Wachstum der Pappel herauszuarbeiten. Ein besonderes Augenmerk

sollte in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung des cambialen und des Xylemgewebes

liegen; besonders holzanatomische und holzchemische Veränderungen in Abhängigkeit der

Calcium-Ernährung galt es hierbei zu untersuchen. Die für diese Arbeit untersuchten

Pappelarten versprachen aufgrund ihrer Wüchsigkeit und ihrer relativ unkomplizierten

Anzucht, sei es in Hydrokultur oder im Stecklingsverfahren, das geeignete Pflanzenmaterial

zu sein.

Ein zweites Ziel dieser Arbeit lag darin, Charakteristika und Funktionen möglicher

elektrischer Signale an Bäumen zu untersuchen. Auch hier sollten die Untersuchungen in

einem Zusammenhang mit der bestehenden Calcium-Ernährung dargestellt werden. Bisher

durchgeführte Versuche auf diesem wissenschaftlichen Gebiet fanden bis auf wenige

Ausnahmen an niederen oder krautigen Pflanzen statt. Diese Arbeit sollte bisher gewonnene

Erkenntnisse der Signalleitung sowie deren Auswirkungen auf die Photosyntheserate nun

auch für Bäume, in diesem Fall die Pappel, verifizieren.

Material und Methoden

11

2 Material und Methoden

2.1 Pflanzenanzucht

2.1.1 Anzucht von Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx.

2.1.1.1 Agarkultur

Der Hybrid-Pappel-Klon Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx. T89, welcher

freundlicherweise von Prof. Hedrich, Universität Würzburg, zur Verfügung gestellt wurde,

wurde über Kallusbildung mit Hilfe von Hormonen aus dem Sprossgewebe steril vermehrt.

Das erste Anzuchtstadium erfolgte in Petrischalen, dauerte etwa drei bis vier Wochen und

bewirkte eine Kallusbildung mit einsetzender Sprossbildung (in Medium I). Nach Umsetzen

der Sprosse in mit Medium II beschickte Magenta-Gefäße entwickelten sich die Sprosse für

weitere drei bis vier Wochen, bevor sie in Weckgläser mit Medium III überführt wurden, in

welchem sie für die Dauer von vier bis sechs Wochen Wurzeln ausbilden konnten (Abb. 2.1).

Abb. 2.1: Sterilkultur P. tremula L. x P. tremuloides Michx.;

Bewurzelung in Weckgläsern.

Die Sprossinduktion in den Medien I und II erfolgte im Licht/Dunkel-Wechsel von 8 h : 16 h

(25 W, 230 V OSRAM; TL70, F32T8/TL741, Philips) unter Temperaturen von 22°C während

der Licht- und 16°C während der Dunkel-Phase. Für die Spross und Wurzelbildung im

Medium III wurden die Pappeln unter 16 h Licht bei 22°C (TLD 58W/840 Super 80, Philips)

und 8 h Dunkelheit bei 17°C kultiviert.


12

Nährmedien für die Agarkulturen (pro 1 l)

Agarkultur Medium I: 4,4 g MS-Medium (Murashige and Skoog, Makro- und

Mikroelemente, Duchefa)

0,2 mg BAP (6-Benzylaminopurin, Sigma)

0,1 mg IBA (Indolbuttersäure, Duchefa)

0,01 mg TDZ (Thidiazuron, Duchefa)

20 g Sacharose

pH 5,8 (1 M KOH)

7g Agar (Roth, # 4508.1), autoklavieren

Agarkultur Medium II: 4,4 g MS-Medium

0,2 mg BAP

0,1 mg IBA

20 g Sacharose

pH 5,8 (1M KOH)

7g Agar, autoklavieren

Agarkultur Medium III: 4,4 g MS-Medium

10 g Sacharose

pH 5,8 (1 M KOH)

7 g Agar, autoklavieren

Die Anzucht der Pappeln in Agarkultur fand mit freundlicher Unterstützung der AG Hedrich,

Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg, statt.


13

2.1.1.2 Hydrokultur

Um die bewurzelten Pappeln der Sterilkultur in ein Raumklima zu überführen, wurden die

Pflanzen in mit Flüssigmedium gefüllte, abgedunkelte Kolbengläschen gegeben. Der

beblätterte Spross war dabei in der ersten Woche noch von einer kleinen Klarsichtbedeckung

umgeben, welche im Lauf der zweiten Woche Schritt für Schritt angehoben und schließlich

ganz entfernt wurde.

Hydrokultur Medium: 1,5 mM KH2PO4

2,0 mM KNO3

1,0 mM CaCl2

1,0 mM MgSO4

18 µM FeNaEDTA

8,1 µM H3BO3

1,5 µM MnCl2

pH 6,0

2.1.1.3 Anzucht der Pappeln unter unterschiedlicher Nährstoffversorgung

Um den Einfluss von Calcium auf verschiedene Prozesse der Holzbildung zu untersuchen,

wurden die aus dem Kallusgewebe gewonnenen Pappeln unter verschiedener

Calciumversorgung in Hydrokulturen angezogen. Dazu wurden sie in zehn Liter

Nährstofflösung fassende Curver-Boxen gegeben und über Tetratec®AP50 Luftpumpen (Tetra

Werke, 49324 Melle, Deutschland) mit Sauerstoff versorgt (Abb. 2.2). Um eine Veralgung

der Nährlösungen zu vermeiden und gleichzeitig den Pflanzen Stabilität zu gewährleisten

wurde die Lösungsoberfläche mit einer Styroporplatte abgedeckt.


14

Abb. 2.2: Anzucht von P. tremula x P. tremuloides unter verschiedenen

Ca2+-Regimen in Hydrokultur

Als Ausgangsnährlösung für die Hydrokulturen wurde sich an der Hoagland’schen

Nährlösung orientiert, die in ihrer Rezeptur 5 mM Ca2+ vorsieht (Hoagland and Arnon, 1950).

Diese Nährlösung wurde in zwei von insgesamt drei Versuchsreihen zum Vergleich auf

Calcium-Gehalte von 0 mM und 10 mM modifiziert (Tab 2.1), im dritten Durchlauf wurden

die Calciumgehalte der Nährlösungen von 5mM Ca2+ der Optimalversorgung auf 1 mM Ca2+

reduziert und auf 0,1 mM Ca2+ minimiert (Tab. 2.2). Zur Erhöhung des Calciumgehaltes der

Ausgangslösung wurde die Ca(NO3)2 -Konzentration erhöht, wobei die Mg(NO3)2-

Konzentration entsprechend erniedrigt wurde. Zur Reduktion von Calcium wurde der

Ca(NO3)2 -Anteil der Ausgangslösung durch entsprechende Anteile von Mg(NO3)2 ersetzt

(Tab. 2.1 und 2.2); der pH-Wert der Nährlösungen wurde auf 5,8 eingestellt. Durch

elementanalytische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Magnesium nicht in der

Holzbildungszone akkumuliert wird und daher davon ausgegangen werden kann, dass es bei

der Holzbildung keine bedeutende Rolle einnimmt. Ein erhöhter Gehalt dieses Ions in den

modifizierten Nährlösungen hat somit auf Interpretationen zur calciumabhängigen

Holzbildung keinen Einfluss.

Die Nährlösungen wurden wöchentlich ausgetauscht.


15

Ca-Entzug

0 mM Calcium

Ca-normal

5 mM Calcium

Ca-Überfluss

10 mM Calcium

KNO3 5 mM 5 mM 5 mM

Ca(NO3)2 - 5 mM 10 mM

Mg(NO3)2 10 mM 5 mM -

MgSO4 2 mM 2 mM 2 mM

KH2PO4 1 mM 1 mM 1 mM

KCl 50 µM 50 µM 50 µM

Fe-EDTA 40 µM 40 µM 40 µM

H3BO3 25 µM 25 µM 25 µM

MnSO4 5 µM 5 µM 5 µM

ZnSO4 2 µM 2 µM 2 µM

CuSO4 0,5 µM 0,5 µM 0,5 µM

Tab. 2.1: Zusammensetzung der in ihrem Ca2+-Gehalt modifizierten Nährlösungen

der ersten beiden Versuchsreihen der Pappelanzucht in Hydrokultur

Ca-minimiert

0,1 mM Calcium

Ca-reduziert

1 mM Calcium

Ca-normal

5 mM Calcium

KNO3 5 mM 5 mM 5 mM

Ca(NO3)2 0,1 mM 1 mM 5 mM

Mg(NO3)2 4,9 mM 4 mM -

MgSO4 2 mM 2 mM 2 mM

KH2PO4 1 mM 1 mM 1 mM

KCl 50 µM 50 µM 50 µM

Fe-EDTA 40 µM 40 µM 40 µM

H3BO3 25 µM 25 µM 25 µM

MnSO4 5 µM 5 µM 5 µM

ZnSO4 2 µM 2 µM 2 µM

CuSO4 0,5 µM 0,5 µM 0,5 µM


der dritten Versuchsreihe der Pappelanzucht in Hydrokultur


16

2.1.2 Anzucht von Populus trichocarpa

Stecklinge eines intraspezifischen Hybrids von Populus trichocarpa x Populus trichocarpa

(cv Trichobel) wurden vom Bayerischen Amt für forstliche Saat- und Pflanzenanzucht,

Teisendorf, bezogen. Dabei handelte es sich um einjährige, unverzweigte Apikaltriebe von

80 cm Länge mit einem Mitteldurchmesser von etwa 5 mm. Die Stecklinge wurden vor

Knospenaustrieb in ein möglichst nährstoffarmes Bodensubstrat gegeben, welches aus einem

Gemisch aus Quarzsand (2,0–2,5 mm Körnung) und einem handelsüblichen Weißmoostorf

(Europlant®, Fa. Euroflor GmbH, Raubersried, Deutschland) bestand. Dieses Gemisch wurde

vor dem Überführen der Stecklinge zweimal mit destilliertem Wasser durchgespült und in

Pflanztöpfe mit einem Fassungsvolumen von 25 Litern gegeben. In jeden Pflanztopf wurden

sieben Apikaltriebe je ca. 20 cm tief gesteckt (Abb. 2.3); die Töpfe wurden im Freiland

aufgestellt und stets von Verunreinigungen (Laub etc.) freigehalten.

Abb. 2.3: Im Freiland angezogene Populus trichocarpa - Pflanzen

während der Wachstumsperiode

Um den Einfluss von Ca2+ auf die Holzbildung der im Freiland gewachsenen Pappeln zu

bestimmen, wurden pro Nährstoffvariante zwei Töpfe regelmäßig mit den entsprechenden

Lösungen gegossen, so dass die gebildeten Wurzeln stets mit ausreichend Nährlösung

versorgt waren. Die Nährlösungen entsprachen den in Tab. 2.2 beschriebenen Lösungen einer

Optimalversorgung, einer Ca2+ reduzierten- und einer Ca2+ minimierten Variante. Für

anatomische Untersuchungen wurden die Pappeln in einem vierwöchigen Turnus beerntet.


17

2.2 Zuwachsmessungen

Um den Einfluss von Ca2+ auf die phänotypische Entwicklung der Pappeln über eine

Wachstumsperiode hinweg zu beobachten, wurden zu Beginn der Versuchsreihe fünf getopfte

Populus trichocarpa Stecklinge pro Variante ausgewählt; den Pappeln war allen eine Höhe

von 60 cm und ein Stammfußdurchmesser von ca. 5,8 mm gemeinsam. Sie wurden im

einwöchigen Turnus hinsichtlich ihres Blattflächenzuwachses, ihres Trieblängenzuwachses

und ihres Durchmesserzuwachses in 30 cm Höhe vermessen.

Da die jungen Triebe von P. trichocarpa Korkleisten aufweisen, wurde der Durchmesser

jeweils zweimal um 90° versetzt aufgenommen und der daraus resultierende Mittelwert als

Mitteldurchmesser gewählt. Bei den Messungen des Trieblängenzuwachses wurden der

zugewachsenen Länge des Terminaltriebes die der Seitentriebe zuaddiert. Um den

Blattflächenzuwachs innerhalb der verschiedenen Varianten zu bestimmen, wurde die

Blattanzahl der einzelnen Bäume wöchentlich aufgenommen. Die Blätter wurden am Ende

der Wachstumsperiode geerntet und den einzelnen Bäumen zugewiesen; aus dem Gewicht

und der Blattfläche einer Mischprobe aus zehn Blättern jeder Variante wurde der

Blattflächenzuwachs der einzelnen Messtermine rückwirkend berechnet.

2.3 Anatomische Untersuchungen

2.3.1 Anfertigung von Gewebeschnitten für lichtmikroskopische Untersuchungen

Für die Anfertigung von Gewebeschnitten für die Lichtmikroskopie wurden 1 cm lange

Proben in einer Fixierlösung mit 1% Formaldehyd, 1 mM EGTA, 50 mM Cacodylat-Puffer

und 5% Glutaraldehyd im Exicator infiltriert und für 2 Stunden bei Raumtemperatur fixiert.

Anschließend wurden die Proben mehrmals mit Cacodylat-Puffer gespült und in einer

ansteigenden Ethanolreihe (25% / 50% / 75% / 100%) entwässert. Die Proben wurden sodann

mit LR-White Acrylharz infiltriert und in Gelatinekapseln eingebettet. Die Polymerisation in

den Kapseln erfolgte für 24 Stunden bei 60°C in einem Trockenschrank.

Aus den eingebetteten Gewebeproben wurden mittels eines Mikrotoms (MT-X, RMC Inc.)

Semidünnschnitte von 1 µm Schnittdicke angefertigt, auf Objektträger übertragen und mit

Toluidin O angefärbt. Die solchermaßen präparierten Schnitte konnten nun im


18

Lichtmikroskop (Axiophot, Zeiss) betrachtet und mittels einer digitalen Camera (Axiocam,

Zeiss) fotographisch festgehalten werden.

2.3.2 Mazeration

Um die Länge der Libriformfasern bestimmen zu können, wurde der Zellverband des

Holzgewebes zunächst aufgelöst. Dazu wurde von ca. 1,5 cm langen Sprosstücken zunächst

die Rinde entfernt, sodann wurden mittels einer Rasierklinge Späne aus dem Holzkörper

abgeschabt, welche in eine Mazerationslösung gegeben wurden. Bei dieser Lösung handelt es

sich um das so genannte „Jeffrey’sche Gemisch“, welches aus 10%iger Salpetersäure (HNO3)

und Chromsäureanhydrid (CrO3) in einer 10%igen Lösung im Verhältnis 1:1

zusammengesetzt ist. Die Xylemspäne wurden in der Lösung in einem Wärmeschrank

(Memmert U30) für ca. 50 Minuten bei 60°C mazeriert. Anschließend wurden die weitgehend

aus dem Faserverband gelösten Libriformfasern durch einen Filter dekantiert und mit H2O

(bidest.) säurefrei gespült. Die Fasern konnten nun in einem Tropfen Glycerin eingeschlossen

auf dem Objektträger fixiert, im Lichtmikroskop (Axiophot, Zeiss) betrachtet und mit einer

digitalen Camera (Axiocam, Zeiss) fotografiert werden (Abb. 2.4).

Abb. 2.4: Für die Faserlängenmessung mazerierte Holzfasern


19

2.3.3 Histometrische Auswertung

Die histometrische Auswertung erfolgte an den digitalen Aufnahmen der Gewebeschnitte,

sowie an den Aufnahmen der mazerierten Fasern unter Verwendung der digitalen

Messfunktionen der Kamerasoftware Axio Vision 3.1 von Zeiss. Dabei wurden neben der

Länge der mazerierten Fasern auch der Holzzuwachs und die Gefäßgrößen anhand der

Stammquerschnitte gemessen.

2.3.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Sprossproben von 1 cm Länge wurden axial geviertelt und für zwei Stunden bei

Raumtemperatur in Fixierlösung gegeben (Lösung vgl. Kapitel 2.3.1). Nachdem sie mehrmals

in Cacodylat-Puffer gespült wurden, wurden sie über Nacht bei 4°C in einer Lösung mit 2%

Osmiumtetroxid in Puffer nachfixiert. Die Proben wurden sodann zweimal mit H2O (bidest.)

gespült und in 3 % Uranylacetat in 20% Ethanol für eine Stunde nachkontrastiert. Danach

erfolgte eine Entwässerung durch eine ansteigende Ethanolreihe (50% / 75% / 2x 100%) und

eine 1 : 1 Tränkung der Proben mit 100% Ethanol und einem Epoxydharz, dem Spurr’s

Gemisch (Spurr, 1969). Im Anschluss daran fand die Einbettung in reines Epoxydharz mit

einer zwölfstündigen Polymerisation bei 70°C statt. Für TEM-Untersuchungen wurden aus

den polymerisierten Proben an einem Ultramikrotom (Ultratome Nova, LKB)

Ultradünnschnitte von 80 - 100 nm angefertigt; diese wurden auf mit Formvar beschichtete

Kupfergrids (100 mesh) übertragen und mit alkalischer Bleicitratlösung (Reynolds, 1963) für

zehn Minuten unter CO2-Ausschluss bei Raumtemperatur nachkontrastiert. Die Beobachtung

der Ultradünnschnitte erfolgte am Transmissionselektronenmikroskop (EM 10 C, Zeiss) bei

einer Beschleunigungsspannung von 80 kV und 2.500 bis 100.000facher Vergrößerung. Für

die photographischen Aufnahmen wurde ein AGFA SCIENTIA EM Planfilm verwendet.


20

2.4 Chemische Analysen

2.4.1 Fourier-Transform-Infrarot (FTIR) - Spektroskopie

IR-spektroskopische Charakterisierungsmethoden haben seit der Entwicklung von

Routinegeräten in den 50er Jahren und besonders mit der Weiterentwicklung zur sog. Fourier-

Transformation eine große Bedeutung erlangt. Zu ihren Vorteilen gehören eine geringe

benötigte Substanzmenge und ein hoher Erkennungswert für bereits spektroskopierte und

entsprechend katalogisierte Substanzen. Aus den bisherigen FTIR-spektroskopischen

Untersuchungen haben sich bislang folgende Absorptionsbanden als für Holz charakteristisch

gezeigt (Faix 1992, Fengel und Ludwig 1991):

Wellenummer [cm-1] Funktionelle Gruppe Kommentar

3490 / 3330 O-H Bindungen

C-H Bindungen in CH3, CH2

2050 S=C=N Interner Standard

1740 C=O Bindungen (nicht-konjugiert) z.B. in Acetyl- Gruppen und Carboxylestern

1640

1652

C=O Bindungen (konjugiert)

Coniferyl-Aldehyd

Bereich oft unspezifisch, da hier adsorbiertes H2O bei 1635 überlagert, allerdings ist diese Bande bei Rinde signifikant

1600 / 1505 aromatische Schwingungen von Lignin

1515 phenolische Gruppen

1460 C-H Deformation z.B. in CH3, CH2

1425 C-H Deformation (und aromatische Schwingungen)

1380 C-H Bindung z.B. in CH3 der Acetyl-Gruppen, nicht in OCH3


21

Wellenummer [cm-1] Funktionelle Gruppe Kommentar

1330 C-O aus Aryl-Alkyl-Ether, z.B. Ar-O-CH3,

hier: S-Lignin

1240 C-O Bindung der Acetyl- Gruppen

in Verbindung mit 1740

1160 C-O-C antisym. Bindung

1110 asym. Ringbindung

1050 C-O Bindung, C-H Deformation

900 - 1300 Funktionelle Gruppen der Kohlenhydrate

898 C-H Deformation (Pyranring)

Tab. 2.3: Auswahl an spezifischen FTIR-Absorptionsbanden und den entsprechenden funktionellen Gruppen.

Die FTIR-Spektren wurden mit einem Gerät der Firma Biorad (FTS-40) erstellt. Die

Gewebeproben (Holz- und Rindenproben) wurden dafür nach der Kaliumbromid-Preßling-

Methode präpariert. Dazu wurde 1 mg einer zu untersuchenden Probe viermal für 1,5 Minuten

mit 300 mg Kaliumbromid (KBr) in einer Perkin Elmer Schwingmühle homogenisiert. Um

die Proben auf einen internen Standard zu eichen, wurde ihnen Kaliumthiocyanat (KSCN)

10%ig beigefügt; um eine Wasseranlagerung an das zugegebene KSCN zu vermeiden wurden

die Proben vorsichtig unter Vakuum getrocknet. Das Gemisch wurde anschließend zu einer

durchstrahlbaren Tablette gepresst. Pro Variante wurden auf diese Weise fünf Tabletten

zwischen 4000 und 450 cm-1 mit einer Auflösung von 4 cm-1 und 16 Scans IR-

spektroskopisch untersucht.


22

2.5 Elementanalysen

2.5.1 Energiedispersive Röntgenanalyse (EDXA) am Rasterelektronenmikroskop

(REM)

Das Prinzip der Röntgenmikroanalyse beruht auf der Interaktion zwischen den energiereichen

Elektronen des Strahls eines Elektronenmikroskops und den Atomen eines biologischen

Präparates. Energetisch niedrigere Elektronen der beschossenen Atome werden aus den

inneren Schalen geschleudert und durch Elektronen mit höherem Energieniveau aus den

äußeren Schalen ersetzt. Die dabei freiwerdende Energiedifferenz wird unter anderem als

Röntgenstrahlung emittiert. Da die Atomradien und die Anzahl der Elektronenschalen von der

unterschiedlichen Kernladung der jeweiligen Elemente abhängig sind, ist die freiwerdende

Röntgenstrahlung spezifisch für das betroffene Element. Die Röntgenstrahlung gibt aufgrund

kernnaher Emissionen jedoch keine Auskunft über den chemischen Status des betroffenen

Atoms.

Um EDX-Analysen an Pappel-Geweben durchzuführen, wurden frische Proben mit einer

Rasierklinge zugeschnitten, mittels in Flüssig-Stickstoff gekühlten Isopentans schockgefroren

und zur Trocknung für einen Tag an eine Gefriertrocknungsanlage (GT2-E, LYOVAC)

angeschlossen. Um die Kontrastierung der Proben im REM zu verbessern und gleichzeitig

eine elektrische Aufladung zu vermeiden wurden die gefriergetrockneten Proben in einem

Sputtergerät (K 575, EMITECH) für eine Minute und zehn Sekunden bei 90 mA mit Chrom

beschichtet. Die semiquantitative Ionenbestimmung der Gewebeproben erfolgte am

Rasterelektronenmikroskop (REM AMR 1200 B, Leitz), an welches eine energiedispersive

Röntgenanalysevorichtung (EDXA, KEVEX 4000) angeschlossen ist. Diese EDX-Anlage

ermöglicht eine Registrierung aller Elemente ab der Ordnungszahl 9 (Fluor).

Die Elementanalyse wurde unter einer Beschleunigungsspannung von 15 kV und bei

1000facher Vergrößerung der zu messenden Gewebeprobe durchgeführt. Nach einer

Analysendauer von 200 Sekunden wurde das resultierende Röntgenspektrum von einem

Analogschreiber aufgezeichnet; durch die Bestimmung des Verhältnisses der

elementspezifischen Röntgenstrahlung zum unspezifischen Hintergrund (peak:background

ratio) konnte eine relative Maßzahl für die Massenkonzentration des jeweiligen Ions ermittelt

werden (Abb 2.5).


23

0 10,24 keV

Abb. 2.5: Auswertungsbeispiel der energiedispersiven Röntgenspektren durch Bestimmung des peak : background Verhältnisses

2.6 Elektrophysiologische Untersuchungen

Ein Membranpotential lässt sich messen, indem die Elektroden eines Spannungsmessers mit

dem intrazellulären und mit dem extrazellulären Raum verbunden werden; die sich dabei

ergebende Differenz nennt man Membranpotential. Bei den Messungen an Pappel wurde ein

zweikanaliger Verstärker (750 Dual Micro-Probe, World-Precision Instruments, Sarasota,

Florida, USA) verwendet, der über eine Mikroelektrode und eine Referenzelektrode mit der

zu bemessenden Zelle verbunden war. Um den intrazellulären Raum nicht zu sehr zu

beschädigen wurden die Mikroelektroden aus Glaskapillaren gewonnen, die den

erforderlichen Spitzendurchmesser von ca. 1 µm gewährleisten konnten. Dazu wurden an

einem Vertikalpuller (PP-830, Narishige, Japan) 12 cm lange und 1,5 mm

(Außendurchmesser) breite Filament-Borosilikatglas-Kapillaren (Kwik-Fil, WPI, Sarasota,

Florida, USA) auf die erforderliche Spitzengröße ausgezogen, welche anschließend mit einer

3 M KCl - Lösung blasenfrei gefüllt wurden. Zur Messung im extrazellulären Raum wurde

eine RC-Referenzelektrode mit einem Ag-Ag/Cl Pellet verwendet (WPI, Sarasota, Florida,

USA), welche mit dem Masseneingang des Verstärkers verbunden war. Die

Membranpotential-Veränderungen konnten durch ein Digital-Multimeter (Keithley 173A,

Cleveland, USA) abgelesen und mittels eines angeschlossenen Schreibers (BBC SE 460,


24

Schütt, Göttingen) aufgezeichnet werden. Da die Messungen nicht an isolierten Zellen

durchgeführt wurden, wurden die abgetrennten Triebspitzen mit ihrer Schnittstelle in

künstliches Teichwasser (artificial pond water: APW; nach Weisenseel et al., 1992) gestellt

und fixiert; die Referenzelektrode befand sich zur Bemessung des extrazellulären Raums in

der APW - Lösung.

Artificial pond water (APW): 1,0 mM NaCl

0,1 mM KCl

0,1 mM CaCl2

1,0 mM MES

pH mit TRIS auf 6,0 eingestellt

Während der Messungen befanden sich alle Geräte, mit Ausnahme des Verstärkers, des

Multimeters und des Schreibers unter einem Faraday’schen Käfig und waren somit von

äußeren elektrischen Einflüssen abgeschirmt.

2.6.1 Membranpotentialmessungen im Mesophyll

Vor Beginn der Membranpotentialmessungen im Mesophyll wurde die Mikroelektrode

zunächst zur Eichung im APW des extrazellulären Raums der Referenzelektrode auf den

Nullwert eingestellt. Danach wurde sie mit Hilfe eines Mikromanipulators durch die

Membran in das Cytoplasma der zu bemessenden Zelle eingeführt. Auf dem Digital-

Multimeter konnte nun das aktuelle Membranpotential abgelesen werden.

2.6.2 Membranpotentialmessungen im Phloem

Während sich Membranpotentialmessungen in peripheren Zellen von Pflanzenorganen durch

Einführung der Mikroelektrode mittels eines Mikromanipulators relativ einfach durchführen

lassen, sind Messungen an tiefer im Gewebe liegenden Zellen schwieriger durchzuführen.

Dies gilt insbesondere für Phloemzellen. Die hier durchgeführten

Membranpotentialmessungen an Phloemzellen basieren auf Messungen an abgetrennten

Rüsseln Phloemsaft-saugender Blattläuse. Diese Methode bot für die Messungen folgende

Vorteile:


25

- Das oft mühselige Suchen nach Siebröhren entfällt, da die meisten Blattläuse

ausschließlich im Phloem saugen (Evert et al., 1973)

- Das Gewebe wird nicht durch das Einführen einer Mikroelektrode verletzt und muß

nicht aufgetrennt werden.

- Das Zurückdrängen des Elektrolyten aufgrund eines hohen Zellturgors („backfiring“)

findet nicht statt, da der austretende Siebröhrensaft turgorlos ist.

Sobald man im Mikroskop eine Laus entdeckt, die dem Objektiv entweder seitlich oder

frontal gegenübersteht (Abb. 2.6 A) und zugleich Honigtau absondert, kann sie mit Hilfe

eines Laserimpulses (Neodym:Glas-Laser, Beck, Neu-Isenburg) von ihrem Rüssel abgetrennt

werden. Die Messelektrodenspitze wird nun mittels des Mikromanipulators mit dem aus dem

Rüssel austretenden Phloemexsudat kontaktiert (Abb. 2.6 B).

Abb. 2.6: Schematische Darstellung der Membranpotentialmessungen im Phloem des Blattleitbündels

unter Anwendung der Aphidentechnik. A: Skizzierte Darstellung einer im Phloem saugenden Blattlaus; zur besseren Darstellung wurde die Skizze um 180° gedreht. B: Photographische

Darstellung eines vom Laser abgetrennten Blattlausrüssels; der Rüssel befindet sich mit dem einen Ende noch im Phloem, die Mikroelektrode kontaktiert das andere Rüsselende mit dem austretenden

Phloemsaft.


26

2.7 Blattgaswechselmessungen

Die Messungen des Blattgaswechsels erfolgten an triebspitzennahen Pappelblättern, die ihr

Blattflächenwachstum im Wesentlichen abgeschlossen hatten.

Als Messgerät zur Erfassung der Photosyntheseleistung und der Transpiration wurde das

Kompakt-CO2/H2O-Porometer CQP 130 der Firma Walz in Effeltrich, Deutschland,

eingesetzt, welches sich aus folgenden Teilen zusammensetzt:

dem Porometermesskopf (inkl. Küvette) (Abb. 2.7),

dem externen Luftfeuchte- und Temperatursensor,

dem Infrarot-Gasanalysator (Binos 100) und

der Zentraleinheit CQP 130 mit mikroprozessorgesteuerter Datenerfassungseinheit.

Die Küvette besteht aus Plexiglas und ermöglicht so eine Beleuchtung des eingeschlossenen

Blattteils. Am Porometermesskopf misst ein Quantum Sensor (LI-190S, LiCor) die

einfallende photosynthetisch aktive Strahlung. Die Küvettentemperatur wird über einen

Pt100-Meßwiderstand und die Blatttemperatur über ein Thermoelement erfasst; mittels einer

kapazitiven Messzelle wird ebenfalls innerhalb der Küvette die relative Luftfeuchte erfasst.

Durch ein Peltieraggregat und einen Ventilator ist eine begrenzte Klimatisierung der

Messküvette möglich, so dass der eingeschlossene Blattteil bei hoher Lichtintensität keiner

Überhitzung ausgesetzt ist.

Abb 2.7: Pappelblatt, in die Küvette des Porometermeßkopfs

von CQP130 eingesetzt


27

Das Messprinzip des CQP 130 gibt vor, dass die dem System zugeführte Luft zunächst in ein

Puffergefäß gelangt, um kurzfristige Luftfeuchtigkeits- und CO2-Schwankungen

auszugleichen. Nach dem Puffergefäß teilt sich der Gasstrom in eine Referenzgasleitung und

in eine Messgasleitung. Das Referenzgas wird über ein Ausgleichsgefäß direkt, das Messgas

über die Küvette in den Gasanalysator geleitet, welcher dann im so genannten

Differenzmessverfahren die Veränderung der Gaszusammensetzung des Messgases relativ

zum Referenzgas bestimmt (Gaswegeplan: siehe Anhang). Zuerst wird die Veränderung des

Wasserdampfgehaltes in einem separaten Kanal gemessen. Danach wird in einem zweiten

Kanal der CO2-Gehalt analysiert. Die bis zu einem Volumenanteil von 1/1000000 (ppm)

genaue Gasanalyse basiert auf der Infrarotabsorption des Wasserdampfes, bzw. der CO2-

Moleküle.

Während der Messungen betrug die CO2-Konzentration der zugeführten Luft etwa 360 µl l-1

(Außenluft). Da die Messungen in einer Klimakammer stattfanden (York GmbH, Mannheim,

Deutschland) konnte von konstanten ca. 65% rel. Luftfeuchte, ca. 27°C und einer PPFD von

ca. 100 µmol m-2 s-1 ausgegangen werden. Mit Hilfe einer Kältefalle konnte die relative

Luftfeuchtigkeit in der Küvette der Umgebung angepasst werden. Die zeitliche Verzögerung

zwischen Veränderungen innerhalb der Küvette und deren Registrierung am Binos ist

abhängig von der Durchflussgeschwindigkeit des Messgases und wurde in den Berechnungen

berücksichtigt.

Die vom Porometer ermittelten Daten der Netto-Photosyntheserate (JCO2; µmol m-2 s-1) und

der stomatären Leitfähigkeit (g H2O; mmol m-2s-1) wurden über das Diagas Programm für CQP

130 folgendermaßen berechnet:

eOHee

CO cJCww

BFu

J **11

*22

0

−∆−−

=

ALVPDwJg OHOH

−−=

122

ue: molarer Gasstrom am Küvetteneingang [µmol s-1]

BF: projizierte Blattfläche [cm²]

we: molare Feuchtekonzentration vor der Küvette (≡ im Referenzgas)


28

w0: molare Feuchtekonzentration hinter der Küvette (≡ im Messgas)

∆C: Differenz der CO2-Konzentration zwischen Referenzgas und Messgas; korrigiert um

Nullpunktverschiebung und Verzerrung des Infrarotgasanalysators (IRGA)

ce: molare CO2-Konzentration vor der Küvette (≡ im Referenzgas); korrigiert um

Nullpunktverschiebung und Verzerrung des Infrarotgasanalysators (IRGA)

JH2O: Transpirationsrate [mmol m-2 s-1]

0

0

1*

2 www

BFu

J eeOH −

−=

ALVPD = wi-wa

wi : Molenbruch des Wasserdampfes in den Interzellularen des Mesophylls

pTsvpw L

i)(

=

svp: Sättigungsdampfdruck (saturated vapor pressure) bei angegebener

Temperatur [mbar]

TL: Blatttemperatur [°C]

wa: Molenbruch des Wasserdampfes in der Küvette

2.8 Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz

Die Messungen der Chlorophyll-Fluoreszenz erfolgten, vergleichbar mit den

Gaswechselmessungen, an triebspitzennahen Blättern, die ihre Blattflächenentwicklung

bereits abgeschlossen hatten. Auch hier fanden die Messungen unter konstanten

Klimabedingungen von ca. 22°C, ca. 65% rel. Luftfeuchte und einer PPFD von

100 µmol m-2 s-1 statt.

Um die räumlichen und zeitlichen Veränderungen der Quantenausbeute der

Energieumwandlung im Photosystem II (PS II) visuell darzustellen, wurde das IMAGING-

PAM Chlorophyll Fluorometer der Firma Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland verwendet.

Mit diesem System ist auf nichtinvasivem Weg möglich, die Quantenausbeute des PSII

mittels sättigender Lichtblitze (Genty et al., 1989; Schreiber et al., 1986) zu bestimmen. Als

gepulstes Messlicht sowie für die aktinische Ausleuchtung und für die sättigenden Lichtblitze

wird bei der Chlorophyll-Fluoreszenz-Messung mit der IMAGING-PAM blaues Licht des

Wellenbereichs 470 nm verwendet. Durch einen hochspezifischen Pulsverstärker ist


29

gewährleistet, dass nur das gepulste Fluoreszenzsignal weiterverarbeitet wird und die

aktinische Lichtintensität ohne Einflussnahme auf die Fluoreszenzmessung verändert werden

kann.

Das zu messende Blatt wurde in einen Probenhalter (IMAGE-USH, Walz GmbH, Effeltrich,

Deutschland) eingespannt (Messfläche 17 x 22 mm) und vor der Reizung für etwa zehn

Minuten an eine PPFD von 100 µmol m-2 s-1 adaptiert. Direkt vor den sättigenden Lichtblitzen

(alle 20 s) wurde jeweils die aktuelle Fluoreszenzausbeute, F, und am Ende der Lichtblitze die

maximale Fluoreszenzausbeute, F´m, erfasst. Hieraus wurde die Quantenausbeute des PSII,

∆F/F´m = (F´m - F) (Nomenklatur nach van Kooten und Snel, 1990), berechnet.

Abb. 2.8: IMAGING-PAM Versuchsaufbau zur Messung der

Chlorophyll-Fluoreszenz an mit Feuer gereizten Pappelblättern

Bereits während der laufenden Messungen können die oben genannten Parameter mittels einer

speziell entwickelten Windows Software (ImagingWin) ermittelt und sowohl in der

Darstellung der gemessenen Blattfläche, als auch in graphischer Form (Abb. 2.8) abgerufen

werden.

Ergebnisse

30

3 Ergebnisse

3.1 Bedeutung der Calciumernährung für den Phänotyp der Pappel

3.1.1 In Hydrokultur

Bereits erste Untersuchungen zum Einfluss der Calciumernährung auf die Holzbildung ließen

eindeutig erkennen, dass sich auch das phänotypische Erscheinungsbild der Pappel bei

Calciummangel verändert. Schon nach sechs Wochen Anzucht von P. tremula x P.

tremuloides in Hydrokultur unter konstanten Bedingungen ließen sich deutliche Unterschiede

in der Biomasseproduktion innerhalb der einzelnen Varianten erkennen (Abb.3.1 A).

B

■■ Wurzel ■ Spross

Abb. 3.1: A: P. tremula x P. tremuloides in Hydrokultur unter verschiedener Ca2+-Versorgung angezogen ; Variante1: 0mM Ca2+, Variante 2: 5mM Ca2+, Variante 3: 10mM Ca2+ .

B: Biomassewerte beziehen sich auf das Frischgewicht der Wurzel (Grob- und Feinwurzeln) und des Sprosses (Spross und Blätter); n=4

0

10

20

30

40

50

60

0 mM Ca 5 mM Ca 10 mM Ca

Bio

mas

se (

FG in

g)

A

Ergebnisse

31

Während die Pappeln, die unter Calciumabstinenz angezogen wurden, kaum Biomasse-

produktion erkennen ließen und bereits nach wenigen Wochen eingingen, erwiesen sich die

Zuwachsunterschiede zwischen der Ca2+-Optimalversorgung und der Ca2+-Überversorgung

als relativ gering (Abb. 3.1 B).

Um zu vermeiden, dass die Pappeln unter völliger Calciumabstinenz noch während der

laufenden Versuchsreihe absterben, wurde eine weitere Versuchsreihe mit leicht veränderten

Nährlösungen gestartet: die minimale Ca2+-Ernährung lag nun bei 0,1 mM Ca2+, eine

reduzierte Variante beinhaltete 1 mM Ca2+ in der Nährlösung, und die optimale Calcium-

Versorgung lag weiterhin bei den in der Hoagland’schen Nährlösung vorgegebenen 5 mM

Ca2+ (vgl. Tab. 2.2). Auch bei dieser Versuchsanordnung konnten schon nach kurzer Zeit

morphologische Unterschiede festgestellt werden. Hatten die Pappeln zu Beginn der

Versuchsreihe alle ein homogenes Erscheinungsbild (Abb. 3.2 A), so konnten bereits nach

zwei Wochen Wachstum in den Hydrokulturen Veränderungen in der Blattausbildung

festgestellt werden: die Blätter der Ca2+-Minimalversorgung zeigten eine deutlich geringere

Blattflächenausbildung und zudem ein Einrollen der Blattränder nach unten (Abb. 3.2 C);

zwischen den verschiedenen Varianten konnte zu diesem Zeitpunkt noch kein Unterschied im

Trieblängenwachstum festgestellt werden (Abb. 3.2 B). Nach einer sechswöchigen

Wachstumsperiode in den modifizierten Nährlösungen war jedoch ein deutlich reduziertes

Trieblängenwachstum bei der minimal Ca2+-versorgten Variante zu erkennen; zwischen der

optimal und der reduziert versorgten Variante hingegen ließ sich zu diesem Zeitpunkt nur ein

geringer Unterschied im Höhenwachstum beobachten (Abb. 3.2 D).

Abbildungen 3.2 A - D:

A

Abb. 3.2 A: P. tremula x P. tremuloides in verschiedenen Nährlösungen am Anfang der Versuchsreihe; homogenes Erscheinungsbild der Pappeln

Ergebnisse

32

B

Abb. 3.2 B: P. tremula x P. tremuloides nach zwei Wochen Wachstum in Hydrokultur;

kein Unterschied im Trieblängenwachstum, jedoch in der Blattausformung der Ca2+-minimierten Variante

C

Abb. 3.2 C: Ca2+-minimierte Pappeln nach zwei Wochen in Hydrokultur;

reduzierte Blattflächen und Wölbung der Blattränder nach unten

Ergebnisse

33

D

Abb. 3.2 D: P. tremula x P. tremuloides nach sechs Wochen Wachstum in Hydrokultur; deutlich reduziertes Trieblängenwachstum unter Ca2+-Minimierung (rechts), leichter Rückgang unter Ca2+-

Reduzierung (mitte) im Vergleich zur Ca2+-Normalversorgung (links). Gleichbleibende Abnormalitäten in der Blattausformung der Minimalvariante.

3.1.2 Im Freiland

Da die Anzucht von Pappeln in Hydrokultur in ihrer zeitlichen Ausdehnung begrenzt ist und

die klimatischen Bedingungen standardisiert sind, lässt sich bei diesem Versuchsaufbau keine

Aussage über eine jahreszeitliche Entwicklung unter verschiedenen Ernährungsvarianten

treffen. Um eine solche Fragestellung zu beantworten wurden Populus trichocarpa - Klone

vor dem Beginn der Vegetationsperiode als Stecklinge in ein nährstoffarmes Bodensubstrat

gebracht und im Freiland unter Ca2+-Minimierung, Ca2+-Reduzierung und Ca2+-

Normalversorgung angezogen. Alle Pflanzen hatten zu Versuchsbeginn ein homogenes

Äußeres. Die Bewurzelung der Stecklinge zum einen, aber auch der kühle und sonnenarme

Frühling 2004 könnten der Grund für einen relativ späten Blattaustrieb der Stecklinge im Juni

sein.

Die optischen Eindrücke (Abb. 3.6 A-C) eines mit steigender Ca2+-Versorgung in der

Nährlösung ebenfalls ansteigenden Zuwachses konnten durch diverse Messungen bestätigt

werden. Der Holzzuwachs, der sich im Zuwachs des Triebdurchmessers widerspiegelt, stieg

während der Vegetationsperiode in direkter Abhängigkeit zur steigenden Ca2+-Versorgung in

den Nährlösungen (Abb. 3.3) an. Die leichten Rückgänge in den Werten der reduzierten und

der optimierten Variante Anfang September sind nicht biologisch zu erklären, sondern

ergeben sich vielmehr aus der Tatsache der Korkleisten an der Rinde der Triebe, die eine

exakte Wiederholbarkeit der Durchmessermessungen erheblich erschwerten; der Mittelwert

Ergebnisse

34

aus zwei Messungen, mit welchem versucht wurde, diese Schwierigkeit zu überwinden,

konnte in diesem Fall die Abweichungen offensichtlich nicht ausreichend bereinigen.

Mitt

eldu

rchm

esse

r in

mm

Juli August September

0

2

4

6

8

10M

ittel

durc

hmes

ser i

n m

m


0

2

4

6

8

10

5 mM Ca1 mM Ca

0,1 mM Ca

5 mM Ca1 mM Ca5 mM Ca1 mM Ca

0,1 mM Ca Abb. 3.3: Durchmesserzuwachs von P. trichocarpa während einer

Vegetationsperiode unter verschiedener Ca2+-Versorgung

Auch bei dem Trieblängenwachstum konnte man zwischen den verschiedenen Ca2+-

versorgten Varianten Wachstumsunterschiede erkennen; ähnlich wie beim

Durchmesserzuwachs wurde auch beim Trieblängenzuwachs ein mit ansteigendem Ca2+-

Gehalt in den Nährlösungen ansteigendes Trieblängenwachstum deutlich. Während der

Zuwachs der Trieblängen bei der optimal mit Calcium versorgten Variante kontinuierlich

anstieg, konnten die reduzierte Variante mit 1 mM Ca2+ in der Nährlösung und die minimierte

Variante mit 0,1 mM Ca2+ in der Nährlösung eine deutliche Zuwachssteigerung erst Mitte

August aufweisen (Abb. 3.4).

Trie

blän

genw

achs

tum

in c

m


0

40

80

120

160

200

Trie

blän

genw

achs

tum

in c

m


0

40

80

120

160

200

5 mM Ca1 mM Ca

0,1 mM Ca


0,1 mM Ca Abb. 3.4: Trieblängenzuwachs von P. trichocarpa während einer


Ergebnisse

35

Der Blattflächenzuwachs, welcher am Ende der Wachstumsperiode rückwirkend über eine

Mischprobe für die Anzahl der während der Vegetationsperiode gemessenen Blätter ermittelt

wurde, zeigte den deutlichsten Unterschied zwischen der Ca2+-Minimalvariante und den Ca2+-

optimal- und Ca2+-reduzierten Varianten; bei nur 0,1 mM Ca2+ in der Nährlösung ergab sich

ein sehr geringer Blattflächenzuwachs während der gesamten Vegetationsperiode. Einen

bedeutend höheren Blattflächenzuwachs konnten die Pappeln der Ca2+-reduzierten Variante

aufweisen, den höchsten jedoch die optimal mit Calcium versorgten Pflanzen. Zwischen den

beiden letztgenannten fand gegen Ende der Vegetationsperiode eine starke Annäherung der

Blattflächenausprägung statt (Abb. 3.5).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Bla

ttflä

che

in c

m²


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Bla

ttflä

che

in c

m²


5 mM Ca1 mM Ca

0,1 mM Ca


0,1 mM Ca Abb. 3.5: Blattflächenzuwachs von P. trichocarpa während einer


Die Standardabweichungen zu den Mittelwerten der oben abgebildeten Grafiken wurden aus

Gründen der Übersichtlichkeit nicht in die jeweilige Grafik integriert, sondern sind im

Anhang in Tabellenform ihren entsprechenden Werten zugeordnet.

Ergebnisse

36

Abbildungen 3.6 A - C:

A

Abb. 3.6 A: P. trichocarpa - Stecklinge im Juli

B

Abb. 3.6 B: P. trichocarpa - Stecklinge im August

Ergebnisse

37

C

Abb. 3.6 C: P. trichocarpa - Stecklinge im September

3.2 Bedeutung der Calciumernährung für den Calciumhaushalt der

Pappel

Der Einfluss der Calciumernährung auf die Calciumgehalte der unterschiedlichen

Pappelgewebetypen wurde mittels energiedispersiver Röntgenanalyse (EDXA) untersucht.

Die dazu durchgeführten Analysen erfolgten auf mikroskopischer Ebene in Kombination mit

der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und ermöglichten so eine ortsgenaue Zuordnung von

einzelnen Messwerten zu den entsprechenden Zellen und Gewebebereichen. Zudem konnte

durch die EDX - Methode ein Überblick über die Elementzusammensetzung der

Gewebetypen gewonnen werden; davon ausgenommen waren jedoch Elemente unterhalb der

Ordnungszahl 9 (=Fluor), die durch die verwendete Methode nicht erfasst werden können.

Um die Auswirkungen der unterschiedlichen Calciumernährung auf den Ionenhaushalt der

Pappel zu untersuchen wurden verschiedene Gewebe der Organe Blatt (Leitbündel), Stamm

(Phloem, Cambium, Xylem-Differenzierungszone) und Wurzel (Zentralzylinder, Cortex) auf

ihre Ca2+-Konzentration in Abhängigkeit zur Nährstoffversorgung untersucht. Als

Ergebnisse

38

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Xylem Phloem

rel.

Calc

ium

geha

lt

Pflanzenmaterial dienten aus Zellkultur gewonnene Populus tremula x Populus tremuloides,

welche unter Calciumabstinenz (0 mM Ca2+), unter normaler Calciumversorgung (5 mM

Ca2+) sowie unter Calciumüberversorgung (10 mM Ca2+) für sechs Wochen in Hydrokulturen

angezogen worden waren.

Bei der Röntgenanalyse der Blattleitbündel konnte zwischen dem Xylem- und dem

Phloemgewebe unterschieden werden; in beiden Geweben des Leitbündels wurde eine

parallel zur Nährstoffversorgung ansteigende Calciumkonzentration festgestellt (Abb. 3.7).

Abb. 3.7: Relativer Gehalt an Calciumionen im Leitbündel von Pappelblättern bei unterschiedlicher Ca-Konzentration in den Nährlösungen; Werte ermittelt durch

Peak:Background [P:B]-Verhältnisse von EDX-Analysen des jeweiligen Gewebes (n=5).

Der nahezu lineare Anstieg im Ca2+-Gehalt mit steigender Ca2+-Versorgung war im Phloem

sogar noch deutlicher ausprägt (P:B 5,0 bei 10 mM Ca2+) als im Xylem (P:B 2,9 bei 10 mM

Ca2+).

Der im Xylem und im Phloem des Blattleitbündels zu findende Calciumanstieg unter

verbesserter Ca2+-Versorgung ließ sich auch in den Transportgeweben des Stammes wieder

finden (Abb. 3.8). Auch hier konnte man im Phloem den deutlichsten Anstieg im P:B-

Verhältnis von ca. 0,4 über 1,0 auf 2,2 beobachten. Etwas verhaltener, aber immer noch

deutlich wirkte sich die in der Nährlösung erhöhte Ca2+-Konzentration auf die

Differenzierungszone des Xylems aus; die Calciumionenkonzentration unter völliger Ca2+-

Abstinenz in der Nährlösung hatte auch in der Differenzierungszone, ebenso wie in der


Ergebnisse

39

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Phloem Cambium Differenzierungszone

rel.

Calc

ium

geha

lt

Cambiumzone, einen P:B-Wert von 0,4 , stieg unter optimaler Ca2+-Versorgung auf 0,8 ,

unter Ca2+-Überfluss jedoch nur weiter auf einen Wert von 1,0 an. Im Cambium des Stammes

zeigte sich auch ein im Vergleich zum Phloem mit zunehmender Ca2+-Versorgung der

Pflanzen geringerer Ca2+-Anstieg (Abb. 3.8).

Abb. 3.8: Relativer Gehalt an Calciumionen im Phloem, im Cambium und in der Differenzierungszone des Xylems im Stammbereich der Pappel bei unterschiedlicher Ca2+-Konzentration in den Nährlösungen; Werte ermittelt durch Peak:Background-Verhältnisse

von EDX-Analysen des jeweiligen Gewebes (n=5).

Anders als bei den Transportgeweben im Blattleitbündel und im Spross der Pappel konnte

man in der Wurzel keine lineare Kausalität der Ionenkonzentration zur Calciumversorgung

der Nährlösungen feststellen. Die Röntgenanalyse der untersuchten Feinwurzeln ergab hierbei

im Zentralzylinder keine signifikante Veränderung des Calciumgehaltes unter

unterschiedlicher Calciumernährung (Abb. 3.9). Sowohl unter Calciumabstinenz in der

Nährlösung, als auch unter optimaler Calciumversorgung wie unter einem

Calciumüberangebot beliefen sich die im Zentralzylinder gemessenen Ionenwerte für Calcium

zwischen 1,2 und 1,5.


Ergebnisse

40

00,5

11,5

2

2,53

3,54

Zentralzylinder Cortex

rel.

Calc

ium

geha

lt

Abb. 3.9: Relativer Gehalt an Calciumionen im Zentralzylinder und im Cortex der Feinwurzel von Pappeln bei unterschiedlicher Ca2+-Konzentration in den Nährlösungen; Werte ermittelt

durch Peak:Background-Verhältnisse von EDX-Analysen des jeweiligen Gewebes (n=5).

Im Wurzelcortex hingegen war ein deutlicher Anstieg der Calciumkonzentration zwischen der

Ca2+-Nullvariante mit ca. 0,5 hin zur Ca2+-Normalversorgung auf ca. 2,7 festzustellen (Abb.

3.9). Bei einem Überangebot in der Nährlösung änderte sich die Konzentration innerhalb des

Cortexgewebes im Vergleich zu der Optimalversorgung jedoch nicht mehr nennenswert.


Ergebnisse

41

3.3 Bedeutung der Calciumernährung für die Anatomie der Pappel

3.3.1 In Hydrokultur

Um einen möglichen Einfluss der Calciumernährung auf die Gewebeanatomie der Pappel zu

überprüfen, wurden verschiedene Gewebetypen von Populus tremula x Populus tremuloides,

welche für sechs Wochen unter verschiedenen Ca2+-Konzentrationen in den Nährlösungen in

Hydrokultur angezogen worden waren, lichtmikroskopisch analysiert und auf ihre

Unterschiede hin verglichen.

Wurzelgewebe:

Das Wurzelgewebe zeigte deutliche Unterschiede in Aufbau und Struktur zwischen der mit

0 mM Ca2+ versorgten Variante und der optimal mit 5 mM Ca2+ versorgten Variante (Abb.

3.10 A und B). Während sich das Cortexgewebe unter Optimalversorgung als ein fest

gebündeltes Gewebe mit nur geringen oder keinen Interzellularen zwischen den Cortexzellen

zeigte und einen klar begrenzten Zentralzylinder aufwies, konnte man in der unter

Calciumabstinenz angezogenen Variante eine sehr lockere Zellstruktur mit ausgeprägten

Interzellularen und einem kaum abgegrenzten Zentralzylinder beobachten. Diese

Unterschiede zeigten sich weitgehend unabhängig von der Art der Wurzelzone.

A B

Abb. 3.10: A: Wurzelquerschnitt einer Pappel aus Hydrokultur unter 0 mM Ca2+-Versorgung; typisch

ausgeprägte Interzellularen und kaum abgegrenzter Zentralzylinder. B: Wurzelquerschnitt einer Pappel aus Hydrokultur unter 5 mM Ca2+-Versorgung;

typische kompakte Gewebestruktur mit deutlich ausgeprägtem Zentralzylinder.

Ergebnisse

42

Blattgewebe:

Auch im Blattgewebe zeigten sich bei der Pappelanzucht ohne Calcium in der Nährlösung im

Vergleich zu Pappeln, die optimal mit Calcium versorgt waren, deutliche Unterschiede in der

Anatomie. Wieder konnten im Grundgewebe des Leitbündels zahlreiche deutlich ausgeprägte

Interzellularen und ein tendenziell lockerer Gewebeverband beobachtet werden (Abb. 3.11

A); die auch hier als Kontrolle dienende Optimalvariante hingegen zeigte wiederum einen

kompakten Zellverband im Grundgewebe des Leitbündels und dadurch kaum Interzellularen

(Abb. 3.11 B).

A B

Abb. 3.11: A: Blattquerschnitt einer Pappel aus Hydrokultur unter 0 mM Ca2+-Versorgung mit

ausgeprägten Interzellularen im Grundgewebe des Leitbündels. B: Blattquerschnitt einer Pappel aus Hydrokultur unter 5 mM Ca2+-Versorgung;

kompakte Gewebestruktur mit kaum Interzellularen im Grundgewebe des Leitbündels.

Cambiales Gewebe und seine Derivate:

Um den Einfluss der Calciumernährung auf das Cambium und seine Derivate zu untersuchen,

wurden die cambiale Zone sowie die Gefäße und Fasern des Xylems an den

Sprossquerschnitten der unter unterschiedlicher Ca2+-Ernährung angezogenen Pappeln

lichtmikroskopisch analysiert (Abb. 3.12, 3.13, 3.14). Dabei konnten deutliche Unterschiede

in der Ausprägung der cambialen Zone und der Zellexpansionszone des Xylems festgestellt

werden. Nach sechs Wochen Wachstum in Hydrokultur unter Calciumabstinenz war die

cambiale Zone dieser Pappeln sehr gering ausgeprägt; sie betrug nur etwa drei Zellreihen in

radialer Richtung (Abb. 3.12 A, Doppelpfeil). Eine Expansionszone des Xylems war in

Ergebnisse

43

diesem Zellverband nicht mehr deutlich abzugrenzen, vielmehr konnte im Anschluss an die

cambiale Zone eine rasch einsetzende Verholzung der Faserzellen durch die

Sekundärwandbildung beobachtet werden (Abb. 3.12 A).

Im Gegensatz zur Nullvariante zeigte die Kontrollvariante mit 5 mM Ca2+ in der Nährlösung

eine deutlich andere Ausprägung des cambialen Meristems und der Expansionszone; die

cambiale Zone umfasste hier etwa sieben bis acht Zellreihen in radialer Richtung (Abb. 3.12

B) und repräsentierte damit eine aktives Cambium, wie es in der Pappel im Frühjahr zu finden

ist. Die Expansionszone, in der die Gefäße und Fasern ihre Länge, ihren Durchmesser und ihr

Volumen festlegen, betrug in der Kontrollvariante etwa sieben im Anschluss an die cambiale

Zone radial aufeinander folgende Zellreihen (Abb. 3.12 B, lang gezogener Doppelpfeil), an

die sich zentripetal die Sekundärwandbildung anschloss.

A B

Abb. 3.12: Querschnitt durch Pappelstamm A: unter Ca2+-Abstinenz in der Nährlösung Reduktion der

cambialen Zone auf ca. drei Zellreihen in radialer Richtung (Doppelpfeil); cambiumnahe Sekundärwandbildung. B: normal mit Ca2+ versorgte Pappel mit ausgeprägter cambialer Zone

(kurzer Doppelpfeil) und ausgeprägter Zellexpansionszone (langer Doppelpfeil) mit anschließender Sekundärwandbildung.

Die lichtmikroskopischen Untersuchungen des neu gebildeten Holzgewebes ergaben neben

einem generellen Rückgang der Holzbildung unter Ca2+-Abstinenz (Abb. 3.13 C) auch eine

Veränderung der Gefäßquerschnittsflächen (Abb. 3.13 A und B). Die Gefäße im Xylem der

Ca2+-Nullvariante waren in direkter Nachbarschaft zu den gehäuft auftretenden Holzstrahlen

zu finden und wiesen eine durchschnittliche Gefäßgröße von nur etwa 400 µm² im

Querschnitt auf, wohingegen die durchschnittliche Gefäßquerschnittsfläche unter normaler

Ca2+-Versorgung der Pappeln mehr als das Doppelte betrug (Abb. 3.13 C).

Ergebnisse

44

A B

C

Abb. 3.13: Veränderungen der Gefäßquerschnittsflächen in Abhängigkeit des Ca2+-Gehalts in der Nährlösung. A: unter 0 mM Ca2+ in der Nährlösung; Gefäßlumina deutlich reduziert. B: unter optimaler Ca2+-Versorgung (5 mM Ca2+). C: graphische Darstellung der Unterschiede in der

Gefäßgröße (n=170) und im Holzzuwachs (n=4) unter Ca2+-Abstinenz und Ca2+-Optimalversorgung.

Calcium-abhängige Veränderungen im Xylem beschränkten sich nicht nur auf die

Gefäßbildung und ~Ausformung, sondern ließen sich auch an den Fasern beobachten.

Mazerierte Libriformfasern aus dem Xylem von Pappeln, welche für sechs Wochen unter

0,1 mM Ca2+, 1 mM Ca2+ oder 5 mM Ca2+ in Hydrokultur angezogen worden waren, ließen

eine deutliche Abhängigkeit zwischen der Ca2+-Versorgung in der Nährlösung und dem

Faserlängenwachstum erkennen (Abb. 3.14). Von durchschnittlichen 0,52 mm Faserlänge der

jungen Libriformfasern unter optimalen Nährstoffbedingungen konnte unter reduzierter Ca2+-

Ernährung ein Rückgang auf 0,47 mm Faserlänge und unter minimierter Ca2+-Ernährung auf

nur durchschnittliche 0,38 mm festgestellt werden. Damit ließ sich ein Einfluss von Calcium

auf die Faserlänge nachweisen, da mit abnehmender Ca2+-Versorgung in der Nährlösung auch

die Faserlänge abnahm.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Gefäßgröße Holzzuwachs

Gef

äßgr

öße

in µ

m²

Hol

zzuw

achs

in µ

m

■ 0 m M Ca

■ 5 mM Ca

Ergebnisse

45

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

5 mM Ca 1 mM Ca 0,1 mM Ca

Fase

rläng

e in

mm

Abb. 3.14: Abhängigkeit der Faserlänge von der Ca2+-Ernährung. Oben: Abnahme der durchschnittlichen Faserlänge mit Abnahme des Ca2+-Gehalts in der Nährlösung (n=120);

Student’scher T-Test: P≤0,1. Unten: Mazerierte Libriformfasern unter dem Lichtmikroskop.

3.3.2 Im Freiland

Vergleichende Untersuchungen zur Gefäßentwicklung an P. trichocarpa - Stecklingen, die

unter den gleichen Nährstoffbedingungen im Freiland angezogen worden waren, ergaben

hinsichtlich der Gefäßgröße ein ähnliches Verteilungsbild. Nachdem zwei Pappeln pro

Variante am Ende der Wachstumsperiode auf die Gefäßquerschnittsflächen im neu gebildeten

Jahrring hin vermessen wurden, jeweils ca. 1050 Gefäße pro Variante, konnte man ebenfalls

eine Tendenz zur reduzierten Gefäßquerschnittsfläche bei Ca2+-Abnahme in der Nährlösung

entdecken (Abb. 3.15). So lag die Querschnittsflächenklasse mit der größten absoluten

Häufigkeit bei der minimal mit Ca2+ versorgten Variante bei 400 µm², wohingegen sie bei der

reduzierten Variante auf 1000 µm² anstieg. Bei der Normalvariante (5 mM Ca2+) lag die

größte absolute Häufigkeit ebenfalls bei 400 µm², jedoch erstreckten sich hier die

Querschnittsflächenklassen mit absoluten Häufigkeiten > 130 auf die Klassen 400 µm² bis

5 mM Ca 1 mM Ca 0,1 mM Ca

Ergebnisse

46

1200 µm² , während sie sich bei der Ca2+-Minimalvariante auf die Klassen 400 µm² bis 800

µm² beschränkten und somit die Tendenz zu kleineren Gefäßgrößen bei abnehmender Ca2+-

Versorgung in der Nährlösung sich wieder bestätigt zeigt.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000

Gefäßgröße in µm²

Häu

figke

it

Ca-normalCa-reduziertCa-minimiert

Abb. 3.15: Häufigkeitsverteilung der Gefäßquerschnittsfläche bei

unterschiedlicher Calciumernährung (n=1050).

Ergebnisse

47

3.4 Bedeutung der Calciumernährung für die Ultrastruktur und die

Zellwandchemie der Pappel

3.4.1 Ultrastruktur des Cambiums und des Blattes

In Ergänzung zu den anatomischen Untersuchungen der Lichtmikroskopie wurden

ultrastrukturelle Untersuchungen am Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

durchgeführt. Zwischen den unter Ca2+-Abstinenz in Hydrokultur angezogenen P. tremula x

P. tremuloides und der entsprechenden Kontrollvariante (5 mM Calcium) ergaben sich dabei

in der Ultrastruktur der cambialen Zellen sowie in den verschiedenen Geweben der Blätter

bemerkenswerte Unterschiede.

Wie die lichtmikroskopischen Untersuchungen bereits andeuteten, war unter optimaler Ca2+-

Versorgung (5 mM) die cambiale Zone mit etwa 7-8 Zellreihen in radialer Richtung stark

entwickelt. Zudem konnte unter elektronenmikroskopischer Betrachtung auch eine

ausgeprägte Vakuolisierung des cambialen Cytoplasmas festgestellt werden (Abb. 3.16 A und

B). Das cambiale Gewebe entsprach mit dieser Ultrastruktur der typischen Erscheinungsform

eines aktiven Cambiums der Pappel (Arend und Fromm, 2003).

Im Gegensatz dazu war unter Ca2+-Abstinenz in der Nährlösung nur eine geringe Ausprägung

der cambialen Zone in radialer Richtung festzustellen; der cytoplasmatische Anteil in diesen

Zellen war deutlich erhöht, die Vakuolen waren zahlreich, aber nur in geringer Größe

vertreten (Abb. 3.16 C und D). Mit diesem Erscheinungsbild entsprach das unter Ca2+-

Abstinenz gebildete cambiale Gewebe eher der typischen Ausprägung eines Pappelcambiums

während der Dormanz (Arend und Fromm, 2003).

Ergebnisse

48

A B

C D

Abb. 3.16: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur cambialer Zellen. A. Ausgeprägte cambiale Zone unter optimaler Ca2+-Versorgung.

B. Unter optimaler Ca2+-Versorgung nimmt die Vakuole nahezu den gesamten Zellraum ein; das Cytoplasma bildet nur einen schmalen Saum an der Innenseite der Zellwände.

C. Reduzierte cambiale Zone unter Ca2+-Abstinenz in der Nährlösung. D. Unter Ca2+-Abstinenz nimmt das Cytoplasma nahezu den gesamten Zellraum ein und beinhaltet

viele kleine Vakuolen. Abkürzungen: CZ - cambiale Zone; Ph - Phloem; V - Vakuole; X - Xylem

Ergebnisse

49

Nicht nur in der Ultrastruktur der cambialen Zellen konnten unter Ca2+-Abstinenz

Veränderungen wahrgenommen werden, sondern auch in der Ultrastruktur der Blattgewebe.

In den primären Leitbündeln der Blätter konnten zwar in der Ausprägung des Phloems und

des Xylems keine signifikanten Veränderungen festgestellt werden, jedoch konnten unter

Ca2+-Abstinenz keine Calcium-Oxalat-Kristalle im Grundgewebe der Blattadern beobachtet

werden, wie sie im Gegensatz dazu in den optimal mit Calcium versorgten Blättern im

Grundgewebe der Blattadern häufig zu finden waren (Abb. 3.17).

A B

Abb. 3.17: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur der Blattadern. A. Querschnitt durch Phloem und Grundgewebe einer optimal mit Calcium (5 mM) versorgten

Blattader; deutliche Ansammlung von Ca2+-Oxalat-Kristallen im Grundgewebe (Pfeile). B. Querschnitt durch Phloem und Grundgewebe einer Blattader unter Ca2+-Abstinenz; im

Grundgewebe sind keine Ca2+-Oxalat-Kristalle festzustellen. Abkürzungen: GG - Grundgewebe der Blattadern; Ph - Phloem der Blattadern.

Ergebnisse

50

Weitere Veränderungen im Blattgewebe ließen sich unter Ca2+-Abstinenz an den

Mesophyllzellen beobachten. Einlagerungen von Stärkekörnern in den Chloroplasten, wie sie

unter optimaler Nährstoffversorgung gehäuft auftraten, waren in den Chloroplasten der unter

Ca2+-Abstinenz gebildeten Mesophyllzellen nicht, bzw. nur sehr selten, zu beobachten (Abb.

3.18).

A B

Abb. 3.18: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur der Mesophyllzellen. A. Typisches Bild der Mesophyllzellen unter optimaler Nährstoffversorgung; in den Chloroplasten

sind häufig Einlagerungen von Stärkekörnern (S) zu beobachten (Pfeile). B. Typisches Bild der Mesophyllzellen unter Ca2+-Abstinenz in der Nährlösung; in den Chloroplasten

sind keine Stärkeeinlagerungen festzustellen.

3.4.2 Chemie der Zellwand

Um einen möglichen Einfluss der Calciumversorgung auf die chemische Zusammensetzung

der Zellwände zu überprüfen, wurden die unter verschiedenen Ca2+-Regimen in Hydrokultur

angezogenen Pappeln (P. tremula x P. tremuloides) mittels FTIR-Spektroskopie untersucht.

Dabei wurde zwischen Proben des Xylemgewebes und der Rinde unterschieden; aus

technischen Gründen konnten Strahl- und Markzellen jedoch nicht aus den Holzproben

separiert werden, ebenso wie die Rindenproben auch das Phloem und Cambium umfassten.

Ergebnisse

51

Die Absorptionsbanden der Proben (n=5) wurden auf der Grundlage der Absorptionsintensität

von Kaliumthiocyanat, welches mit der Wellennummer 2050 cm-1 als interner Standard

fungierte, berechnet (Nakano und Miyazaki 2003, Wiberley et al. 1957, Fraser 1959).

Bei einer Betrachtung der Absorptionsspektren von Xylemproben konnte festgestellt werden,

dass es durchaus eine Abhängigkeit in der chemischen Zusammensetzung der Holzzellwand

von der Calciumversorgung über die Nährlösung gibt. Für den Spektrenbereich zwischen

4000 und 450 cm-1 konnte unter Calciumabstinenz in der Nährlösung im Vergleich zu der

optimal mit Ca2+ versorgten Variante ein Rückgang in der Absorption nahezu aller

funktioneller Gruppen des Xylems beobachtet werden (Abb. 3.19).

Abb. 3.19: Vergleichende Darstellung zweier FTIR-Spektren von Holzproben (n=5) im Wellenzahl-Bereich 4000 cm-1 bis 450 cm-1. Unter Calciumabstinenz in der Nährlösung (schwarze Linie) ist im

Vergleich zur Ca-Optimalversorgung (grüne Linie) ein allgemeiner Rückgang der Zellwandkomponenten zu beobachten. Interner Standard bei 2050 cm-1.

Um die Unterschiede in den funktionellen Gruppen der Holzzellwände besser ersichtlich zu

machen, ist in Abbildung 3.20 ein Ausschnitt (Wellenzahl-Bereich 1800 cm-1 bis 800 cm-1)

der obigen Darstellung gegeben.

Ergebnisse

52

Abb. 3.20: Vergleichende Darstellung zweier FTIR-Spektren von Holzproben (n=5) im Wellenzahl-Bereich 1800 cm-1 bis 800 cm-1. Unter Ca-Abstinenz deutliche Reduktion der Methoxy-Gruppen des

S-Lignins bei Wellenzahl 1330 cm-1 sowie verschiedener Acetylgruppen bei Wellenzahlen 1240 cm-1, 1380 cm-1 und 1740 cm-1.

Die Wellenzahl 1330 cm-1 repräsentiert eine S-Lignin - spezifische Methoxygruppe; der

Rückgang in dieser Bande deutet somit einen Rückgang des S-Ligningehalts in

Holzzellwänden unter Calciumabstinenz in der Nährlösung an. Des weiteren konnten unter

Ca2+-Abstinenz Rückgänge in C-O Doppelbindungen (1740 cm-1), in C-O Bindungen

(1240 cm-1) und in C-H Bindungen (1380 cm-1) von Acetylgruppen festgestellt werden.

Nachdem die Unterschiede im chemischen Aufbau der Holzzellwand zwischen den optimal

mit Ca2+ versorgten und den unter Ca2+-Abstinenz angezogenen Pappeln deutlich

hervortraten, sollte in einem weiteren Schritt untersucht werden, ob es für einen Rückgang der

beobachteten Absorption einen Schwellenwert bei der Calciumernährung gibt. Aus diesem

Grund wurden Holzproben aus minimal mit Ca2+ (0,1 mM) versorgten Pappeln denen aus

Calciumabstinenz gegenübergestellt (Abb. 3.21).

Ergebnisse

53

Abb. 3.21: Vergleichende Darstellung zweier FTIR-Spektren von Holzproben (n=5) im Wellenzahl-

Bereich 1800 cm-1 bis 800 cm-1. Im Vergleich zur minimal mit Ca versorgten Variante ist immer noch ein Rückgang fast aller funktioneller Gruppen unter Ca2+-Abstinenz festzustellen, insbesondere der Methoxy-Gruppen des S-Lignins bei der Wellenzahl 1330 cm-1 sowie verschiedener Acetylgruppen

bei den Wellenzahlen 1240 cm-1, 1380 cm-1 und 1740 cm-1.

Auch bei diesem Vergleich der Infrarotspektren beider Varianten zeigte sich ein Rückgang in

der Absorption zwischen der minimierten und der Abstinenzvariante, wenngleich dieser im S-

Lignin (1330 cm-1) und in der C-H Bindung (1380 cm-1) deutlich schwächer ausgeprägt war

als im Vergleich zur Optimalversorgung.

Jedoch nicht nur im Zellwandaufbau des Holzes ergaben sich calciumabhängige

Veränderungen; auch in der Rinde konnte bei unter Calciumabstinenz gewachsenen Pappeln

ein offensichtlicher Rückgang in der Absorption der Spektren festgestellt werden (Abb. 3.22).

Ergebnisse

54

Abb. 3.22: Vergleichende Darstellung zweier FTIR-Spektren von Rindenproben (n=5) im Wellenzahl-

Bereich 4000 cm-1 bis 450 cm-1. Unter Calciumabstinenz in der Nährlösung (punktierte Linie) ist im Vergleich zur optimal mit Calcium versorgten Variante deutlich ein allgemeiner Rückgang der

Absorption bei fast allen funktionellen Gruppen zu beobachten. Interner Standard bei 2050 cm-1.

Bei den vergleichenden Untersuchungen der Rindenspektren wurde eine signifikante

Reduktion bei der Wellenzahl 1640 cm-1 deutlich. Diese Bande repräsentiert in IR-Spektren

von Zellwänden eine C=O Doppelbindung im Lignin, wie sie beispielsweise in Aryl-Ketonen

vorzufinden ist. In direkter Nachbarschaft zu dieser Wellenzahl absorbiert Coniferylaldehyd

(1652 cm-1), welches somit ebenfalls als unter Ca2+-Abstinenz reduziert gelten kann.

Ergebnisse

55

3.5 Elektrische Signalleitung der Pappel

3.5.1 Signalleitung an Populus trichocarpa

Um die elektrische Signalleitung an der Pappel zu untersuchen, wurden junge Triebe von im

Freiland wachsenden Bäumen (Populus trichocarpa) geerntet und sogleich unter einem

Faraday’schen Käfig mit der Schnittstelle in ein Gefäß mit artificial pondwater (APW)

gestellt. Die für die Messungen geernteten oberen Triebbereiche waren etwa 20 cm lang und

mit mindestens sechs Blättern belaubt, an deren Blattunterseite reichlich für die

Aphidentechnik notwendige Blattläuse zu finden waren. Das oberste Messblatt war stets in

seiner Blattfläche ausgewachsen. Für die Messungen der Signalleitung wurde folgender

Versuchsaufbau eingehalten (Abb. 3.23):

Abb. 3.23: Experimenteller Versuchsaufbau zur Messung der elektrischen Potentiale in der Pappel. Hitzereizung erfolgte durch Stimulation mit einer Flamme an der Spitze von Blatt 1, sowie an der

Blattbasis von Blatt 4. Kältereizung erfolgte durch Stimulation mit Eiswasser an der Blattspitze von Blatt1, sowie an einem tiefer gelegenen Sprossabschnitt. Um die Reizleitung bei Distanzreizen zu

unterbrechen wurde am Spross ein mit Eiswasser gefüllter Trichter (Kälteblock) angebracht.

Ergebnisse

56

Bei Messungen im Mesophyll wurde die Spitze der Mikroelektrode in das Mesophyllgewebe

eingeführt. Das Ruhepotential der Mesophyllzellen lag stets bei den für diesen Gewebetyp

charakteristischen Werten von -80 mV bis -100 mV. Bei Messungen im Phloem wurde die

Mikroelektrodenspitze mit dem aus einem abgetrennten Lausrüssel austretenden Phloemsaft

kontaktiert; das Ruhepotential der Phloemzellen lag dabei stets bei Werten zwischen -116 mV

und -165 mV, was ebenfalls die für das Phloem charakteristische Größenordnung

widerspiegelt (Fromm 1991; Fromm und Bauer 1994).

3.5.1.1 Kältereizung mittels Eiswasser

Wie schon aus vielfachen Versuchen an verschiedenen Pflanzen bekannt ist, kann die

elektrische Erregbarkeit von Pflanzen generell durch Reizung mit Eiswasser überprüft

werden. Am Beispiel der Pappel konnte nun bei einer Stimulation der Blattspitze 1 mit

Eiswasser eine basipetale Signalleitung festgestellt werden (Abb. 3.24). Beide

Mikroelektroden verzeichneten auf die Reizung hin ein elektrisches Signal mit einer

hyperpolarisierenden Amplitude von etwa 25 mV in den Siebröhren des Phloems. Die

Signalleitungsgeschwindigkeit betrug bei diesen Untersuchungen 4 bis 8 mm s-1.

Abb. 3.24: Reizung der Blattspitze von Blatt 1 mit Eiswasser; basipetale Signalleitung

in den Siebröhren mit einer Geschwindigkeit von 4 - 8 mm s-1.

Im Gegensatz dazu konnten bei einer Reizung mit Eiswasser an einem tiefer gelegenen

Sprossabschnitt Aktionspotentiale gemessen werden, für die eine Depolarisation der

Zellmembran charakteristisch sind (Abb. 3.25). Diese bewegten sich über die

Plasmamembranen der Siebröhren mit einer ähnlichen Ausbreitungsgeschwindigkeit acropetal

fort und wiesen dabei Amplituden zwischen 12 und 20 mV auf.

Ergebnisse

57

Abb. 3.25: Reizung am Spross mit Eiswasser; acropetale Signalleitung

in den Siebröhren mit einer Geschwindigkeit von 4 - 8 mm s-1.

Auch hier war drei bis vier Minuten nach der Reizinduktion das Ruhepotential in den

Membranen wiederhergestellt.

3.5.1.2 Hitzereizung mittels offener Flamme

Die Reizungen mit Feuer wurden mittels der offenen Flamme eines Gasfeuerzeugs

durchgeführt; dabei wurde die Flamme für ca. 3 Sekunden so nah an das Gewebe geführt, bis

die von ihr ausgehende Wärme die Zellstruktur sichtlich schädigte (Abb. 3.26).

Abb. 3.26: Beispielhafte Darstellung einer Membranpotentialmessung im Mesophyll bei Feuerreizung an der Blattspitze; Schädigung des Gewebes durch Hitze.

Ergebnisse

58

Bei einem Hitzereiz an der Blattspitze von Blatt 1 konnte sowohl an den beiden

Phloemmesspunkten, als auch im Mesophyll des gereizten Blattes ein basipetal fortlaufendes

elektrisches Signal festgestellt werden. Das Membranpotential hyperpolarisierte mit einer

Amplitude von etwa 25 mV, wobei sich das Signal mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 bis

2 mm s-1 fortpflanzte (Abb. 3.27).

Abb. 3.27: Feuerreiz an der Blattspitze; basipetale Signaltransduktion eines hyperpolarisierenden elektrischen Signals im Phloem und im Mesophyll.

Ergebnisse

59

Bei einem Hitzereiz an der Blattbasis von Blatt 4 konnte sowohl an den beiden

Phloemmesspunkten, als auch im Mesophyll ein elektrisches Signal mit einer unregelmäßigen

Erscheinungsform und einer Amplitude von über 50 mV bei Depolarisation des

Membranpotentials aufgezeichnet werden (Abb. 3.28).

Abb. 3.28: Feuerreiz an der Blattbasis von Blatt 4; acropetale Signaltransduktion

eines depolarisierenden elektrischen Signals im Phloem wie im Mesophyll.

Die Leitungsgeschwindigkeit der Signale betrug auch hier 1 bis 2 mm s-1 und deckt sich somit

mit den basipetal gemessenen Leitungsgeschwindigkeiten nach Feuerreizung.

Bemerkenswert an den obigen Messungen ist unter anderem sicherlich, dass die sich basipetal

fortpflanzenden elektrischen Signale die Membranspannung hyperpolarisieren, wohingegen

sich acropetal fortpflanzende Signale die Plasmamembranen depolarisieren; diese Erkenntnis

gilt unabhängig von der Art der Reizung (Kälte- wie Hitzereiz).

Ergebnisse

60

3.5.1.3 Unterbrechung der elektrischen Signalleitung durch einen Kälteblock

Wie bereits an Mais gezeigt werden konnte, kann die Ausbreitung elektrischer Signale durch

das Anlegen eines Kälteblocks unterbunden werden (Koziolek et al., 2005). Um nach diesem

Prinzip die elektrische Signalleitung bei der Pappel zu unterbrechen wurde am Spross der

Versuchspflanzen oberhalb des zu reizenden Blattes ein Trichter befestigt, welcher mit

Eiswasser gefüllt wurde; somit konnte der jeweilige Sprossabschnitt auf konstante + 4°C

gekühlt werden (Abb. 3.29).

Abb. 3.29: Beispielhafte Darstellung des Versuchsaufbaus bei

Distanzsignalmessungen im Phloem mit angelegtem Kälteblock.

Nachdem die Blattbasis von Blatt 4 mit Feuer gereizt wurde, ergaben die Messungen im

oberhalb des Kälteblocks befindlichen Phloem nur eine leichte Membran-Depolarisierung an

beiden Messpositionen (Abb. 3.30).

Ergebnisse

61

Abb. 3.30: Acropetale Signalleitung nach Feuerreiz;

Messungen oberhalb eines Kälteblocks.

Zusätzlich zu diesen Versuchen an abgetrennten Trieben von P. trichocarpa wurden die oben

beschriebenen Messungen auch an intakten P. tremula x P. tremuloides durchgeführt; diese

unter optimaler Nährstoffversorgung in Hydrokultur angezogenen Pappeln wurden samt ihres

intakten Wurzelwerks in APW gestellt und wiesen bei der Signalleitung die gleichen

Resultate auf wie die oben gezeigten Triebspitzen aus P. trichocarpa.

3.5.1.4 Signalleitung an mit TEA+ behandelten Pappeln

Aufgrund der vom klassischen Signalleitungsmodell (vorübergehende Depolarisation des

Membranpotentials) abweichenden Hyperpolarisierung, wie sie bei basipetal fortlaufenden

elektrischen Signalen in der Pappel auftritt (s.o.), wurden P. trichocarpa - Triebe vor der

Feuerreizung für 24 Stunden mit Tetraethylamoniumchlorid (TEA+) behandelt; es wurde

dafür in 1 mM-Konzentration dem APW beigefügt. TEA+ ist ein Kaliumkanal-spezifischer

Blocker, der bei einem elektrischen Signal den K+-Ausstrom aus dem Cytoplasma unterbindet

(Thiel et al., 1996). Somit sollte getestet werden, ob die Hyperpolarisierung des

Membranpotentials durch einen K+-Ausstrom hervorgerufen wird.

Die mit TEA+ behandelten Pappeln zeigten nach einer basipetal gerichteten Signalinduktion

durch einen Feuerreiz an der Blattspitze 1 keine ausgeprägte Veränderung des

Membranpotentials im Phloemgewebe an den beiden Messpositionen Elektrode A und

Elektrode B (Abb. 3.31).

Ergebnisse

62

Abb. 3.31: Basipetale Signalleitung durch Feuerreizung an der Blattspitze 1 nach TEA+-Behandlung

des Sprosses; lediglich an der Elektrode A ist als Reaktion auf das elektrische Signal eine sehr schwache Hyperpolarisierung im Membranpotential festzustellen.

Mit dieser Versuchsreihe konnte auch für ein hyperpolarisierendes Membranpotential die

Abhängigkeit des elektrischen Signals von der Kaliumkanalaktivität belegt werden.

3.5.2 Signalleitung an Calcium-mangelversorgten Pappeln (P. tremula x P. tremuloides)

Über die Ionenabhängigkeit der pflanzlichen Erregbarkeit sind aus der Literatur zahlreiche

Arbeiten bekannt, z. B. bei Characeen (Tazawa et al. 1987) und der Korbweide (Fromm and

Spanswick, 1993).Um weitere Informationen über die am Aufbau der elektrischen Signale

beteiligten Ionenflüsse bei der Pappel zu bekommen wurden unter Ca2+-Mangel (0,1 mM) in

Hydrokultur angezogene Pappeln hinsichtlich elektrischer Erregbarkeit überprüft.

Der Versuchsaufbau war dabei deckungsgleich mit dem oben beschriebenen, nur dass hier

keine abgetrennten Triebspitzen in APW gegeben wurden, sondern die ganze Pflanze mit

intaktem Wurzelsystem.

Nach einer Stimulation durch einen Hitzereiz an der Blattspitze von Blatt 1 konnte an keiner

der beiden im Phloem messenden Elektroden ein elektrisches Signal gemessen werden (Abb.

3.32).

Ergebnisse

63

Abb. 3.32: Basipetale Signalleitung nach Feuerreiz an der Blattspitze von Blatt 1; die gemessenen

Pappeln waren für sechs Wochen unter Calcium-Mangel in Hydrokultur angezogen worden.

Nach einer Feuerreizung an der Blattbasis von Blatt 4 waren im Gegensatz dazu jedoch

Signale, wenngleich auch mit wesentlich geringer Amplitude, im Phloem festzustellen (Abb.

3.33).

Abb. 3.33: Acropetale Signalleitung nach Feuerreiz an der Blattbasis von Blatt 4; die bemessenen

Pappeln waren für sechs Wochen unter Calcium-Mangel in Hydrokultur angezogen worden.

Diese Resultate sind ein Hinweis darauf, dass Calciumflüsse am Aufbau der elektrischen

Signale an der Pappel beteiligt sind.

Ergebnisse

64

3.6 Ionengehalte in geöffneten und geschlossenen Pappelstomata

Untersuchungen über die Öffnungsgeschwindigkeit von Stomata der Pappel im Vergleich zu

anderen, krautigen Pflanzen (Tabak, Ackerschmalwand und Saubohne) haben gezeigt, dass

die Pappel sehr schnell mit ihrem Spaltöffnungsapparat auf veränderte Umweltbedingungen

reagieren kann. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass die stomatäre

Öffnungsgeschwindigkeit unter CO2 - freier Luft bis zu fünf mal schneller ablief als bei

Nicotiana tabacum, und sich auch die Schließgeschwindigkeit mit durchschnittlichen

2,3 µmol m-2 sec-2 als noch deutlich schneller erwies als bei Tabak (1,4 µmol m-2 sec-2)

(Langer et al., 2004). P. tremula x P. tremuloides erwies sich somit im Vergleich zu anderen

höheren Pflanzen als sehr reaktionsstark in der stomatären Apparatur. Nach unseren

Erkenntnissen begründet sich die rasche Gaswechselreaktion dieses Pappelklons zum einen

auf die hohe stomatäre Dichte der Blattoberfläche, zum anderen auf das optimale Verhältnis

zwischen der Schließzellenoberfläche und ihrem Volumen (Abb. 3.34).

A B

Abb. 3.34: Schließzellenanatomie von P. tremula x P. tremuloides. A Rasterelektronische Aufnahme der Blattunterseite; hohe stomatäre Dichte.

B Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme eines Querschnitts durch einen Schließzellenapparat.

Die Anzahl der Schließzellen pro mm² beträgt bei dem P. tremula x P. tremuloides Klon T89

auf der Blattunterseite etwa 190 und ist damit in etwa gleich mit der Schließzellenanzahl pro

mm² von Arabidopsis thaliana ; auch in der Größe des Schließzellenapparates ist diese Pappel

mit 267 µm² durchaus mit Schließzellen der Ackerschmalwand, welche etwa 390 µm²

Ergebnisse

65

messen, vergleichbar (Langer et al., 2004). Dennoch beträgt die Öffnungsgeschwindigkeit bei

Pappel das etwa 2,5-fache von Arabidopsis. Um den Mechanismus der

Schließzellenbewegung bei Pappel näher zu untersuchen und Ursachen für die schnelle

Öffnungsgeschwindigkeit zu erforschen, wurden die Ionengehalte der Pappelschließzellen im

geöffneten sowie im geschlossenen Zustand mittels EDXA untersucht. Die Proben der

geöffneten Stomata wurden von Blättern während der Lichtphase aus CO2-freier Luft

geerntet; die Proben der geschlossenen Stomata wurden, zwei Stunden nachdem sie mit

100 µM ABA besprüht worden waren, von Pappeln während der Dunkelphase geerntet (Abb.

3.35).

Abb. 3.35: EDX-Analyse an Pappelschließzellen. Die abgebildeten Spektren spiegeln die relative

Ionenkonzentration in den geöffneten, bzw. geschlossenen Schließzellen wieder. Cr-Peaks resultieren aus der Chrombesputterung der Proben.

Die elementspezifischen Röntgenspektren für Kalium, Chlorid, Calcium und Phosphor

wurden für geöffnete und für geschlossenen Stomata bestimmt (n=5); dabei zeigten sich in

Ergebnisse

66

den Kalium- sowie in den Chloridgehalten der Schließzellen zwischen den beiden

physiologischen Zuständen deutliche Unterschiede (Abb. 3.36).

Abb. 3.36: Relative Kalium- und Chloridgehalte der Stomata im geöffneten und im geschlossenen

Zustand, berechnet aus den Peak-Werten von je fünf Spektren. Im geschlossenen Zustand senkte sich die Chloridkonzentration auf 70%, die Kaliumkonzentration auf 60% des Gehaltes im geöffneten

Zustand.

Beide Ionengehalte lagen in geschlossenen Stomata mit deutlich niedrigerer Konzentration

vor als in geöffneten Stomata. Der Kaliumgehalt in den offenen Schließzellen belichteter

Blätter betrug demnach die 1,6-fache Konzentration dessen der geschlossenen Schließzellen;

der Chloridgehalt in den Stomata betrug im geöffneten Zustand das 1,4-fache des

Chloridgehaltes bei Dunkelheit. Diese Unterschiede in den Ionenkonzentrationen zwischen

beiden Zuständen zeigen, dass K+ und Cl- eine große osmotische Bedeutung bei der

Schließzellenbewegung haben. Die schnelle Öffnungsgeschwindigkeit der Pappel-

schließzellen lässt sich durch die elektrischen Eigenschaften der K+-Aufnahmekanäle

erklären. Mikroelektrodenmessungen in Schließzellen von intakten Blättern zeigten, dass die

K+-Einwärtsströme eine hohe Stromdichte von 4,4 pA µm-2 Schließzellenoberfläche hatten.

Diese Stromdichte sowie die Zahl der aktiven K+-Kanäle ist wesentlich höher als in

Schließzellen anderer Pflanzenarten (Langer et al., 2004).

Ergebnisse

67

3.7 Der Einfluß der elektrischen Signalleitung auf den Blattgaswechsel

der Pappel: stomatäre Leitfähigkeit für Wasserdampf und

Dunkelreaktion der Photosynthese

3.7.1 Bei getopften Populus trichocarpa - Pflanzen

Um die Auswirkungen der elektrischen Signale auf den Blattgaswechsel der Pappel zu

untersuchen wurden triebspitzennahe, bereits vollständig ausdifferenzierte Blätter getopfter

Populus trichocarpa in einer Klimakammer gemessen. Auch hier wurde wieder zwischen

basipetal gerichteten Kurzstreckensignalen innerhalb desselben Blattes und zwischen

acropetalen, sich über den Spross hinweg fortpflanzenden Distanzsignalen unterschieden. Die

im Folgenden dargestellten Messungen stehen repräsentativ für alle im Anhang aufgeführten.

Bei einer Verwundung des Blattgewebes durch einen Hitzereiz an der Messblattspitze mit

einer Distanz von 3 cm zur Gaswechselküvette (Abb. 3.37 A) konnte 30 Sekunden nach

Stimulation ein starker Abfall der CO2 - Aufnahmerate (JCO2) festgestellt werden (Abb. 3.37

B); innerhalb von 200 Sekunden fiel JCO2 von etwa 1,6 µmol m-2 s-1 auf Werte um -0,4 µmol

m-2 s-1, bevor sie sich nach etwa einer Minute wieder in Richtung auf ihren Ausgangszustand

hin erholte. Die ursprünglichen Werte konnten im Laufe der Messung jedoch nicht wieder

erreicht werden. Weiteren Beobachtungen zufolge stellten sich diese jedoch nach etwa 30

Minuten wieder ein.

Im Gegensatz zu der CO2 - Aufnahmerate konnte für die stomatäre Leitfähigkeit für

Wasserdampf (g H2O) nach Stimulation der Blattspitze durch einen Hitzereiz keine signifikante

Änderung in den Gaswechselwerten festgestellt werden. Auch nach der Reizung bewegten

sich hier die Werte zwischen 110 und 125 mmol m-2 s-1 (Abb. 3.37 B).

Ergebnisse

68

A

B

Abb. 3.37: Einfluss von Kurzstreckensignalen aus Hitzereizung auf den Gaswechsel des gereizten Blattes. A: Versuchsaufbau; basipetale Signalleitung durch Hitzereiz an der Messblattspitze zum

Zeitpunkt 0. B: Gaswechselmessung; 30 s nach Stimulation deutlicher Abfall von JCO2.

Bei einer acropetalen Signalleitung über den Spross konnten ähnliche Reaktionen im

Gaswechsel des triebspitzennahen Messblattes festgehalten werden. Nach Verwundung der

Blattbasis des unteren Blattes in über 10 cm Entfernung durch einen Hitzereiz (Abb. 3.38 A)

konnte 140 Sekunden nach der Stimulation am oberen Messblatt ein starker Abfall der CO2 -

Aufnahmerate verzeichnet werden. Auch hier bewegte sich JCO2 gegen Null und verharrte für

etwa zwei Minuten auf diesem Tiefpunkt, bevor sich der Wert wieder langsam seinem

ursprünglichem Niveau von 1,4 µmol m-2 s-1 näherte (Abb. 3.38 B). Ähnlich wie bei der

Kurzstreckensignalleitung wurde auch hier im Gegensatz zur CO2 - Aufnahmerate keine

signifikante Änderung der stomatären Leitfähigkeit festgestellt; die Werteskala für gH2O

bewegte sich auch während dieses Versuchs unverändert zwischen 110 und 125 mmol m-2 s-1.

Ergebnisse

69

A

B

Abb. 3.38 : Einfluss von Distanzsignalen aus Hitzereizung auf den Gaswechsel des >10 cm entfernten Messblatts. A: Versuchsaufbau; acropetale Signalleitung durch Hitzereiz an der Blattbasis eines

unteren Blattes zum Zeitpunkt 0. B: Gaswechselmessung; 140 s nach Stimulation deutlicher Abfall von JCO2 des Messblatts.

Ergebnisse

70

Die interne CO2-Konzentration stieg während des Rückgangs in der CO2-Aufnahme sowohl

bei acropetal, wie auch bei basipetal gerichteter Signalleitung um circa 25 ppm

antiproportional zu JCO2 an (Abb. 3.39).

A B

Abb. 3.39: Interne CO2-Konzentration (ci) bei Kurzstreckensignalen (A) sowie bei Distanzsignalen (B) aus Hitzereizung. Werte resultieren aus den gleichen Messungen wie

Abb. 3.37 B, bzw. Abb. 3.38 B.

Um die Abhängigkeit des rapiden Abfalls von JCO2 von der elektrischen Signalleitung nach

Verwundung durch einen Hitzereiz zu überprüfen, wurde am Sprossabschnitt zwischen dem

zu verletzenden Blatt und dem Messblatt eine Kälteblock angelegt; hierfür wurde ein mit

Eiswasser gefüllter Trichter an dem Sprossabschnitt befestigt und dieser somit auf konstante

+ 4°C gekühlt (Abb. 3.40 A). Bei einer Hitzereizung der Blattbasis des unteren Blattes wurde

dadurch die elektrische Signalleitung in acropetale Richtung reduziert (Abb. 3.30); die CO2 -

Aufnahmerate sowie die stomatäre Leitfähigkeit für Wasserdampf des Messblattes zeigten

daraufhin keine Veränderung (Abb. 3.40 B). Damit konnte der kausale Zusammenhang des

Abfalls von JCO2 mit der elektrischen Signalleitung eindeutig in Verbindung gebracht werden.

Ergebnisse

71

A

B

Abb. 3.40: Auswirkung eines Kälteblocks auf den Gaswechsel bei acropetaler Signalleitung nach Reizinduktion durch Verwundung eines Blatts. A: Versuchsaufbau; Feuerreizung an der Blattbasis

des unteren Blattes. Das elektrische Signal wird durch einen Kälteblock am Spross gehemmt. B: Gaswechselmessung; keine signifikanten Veränderungen in JCO2 nach Stimulation

des unteren Blattes zum Zeitpunkt 0.

3.7.2 Bei unterschiedlicher Calciumernährung von Populus tremula x Populus

tremuloides

Um die Erkenntnisse der Auswirkungen der elektrischen Signalleitung auf den Gaswechsel

um den Einfluss der Calciumernährung zu erweitern, wurden unter verschiedenen Ca2+-

Regimen in Hydrokultur angezogene P. tremula x P. tremuloides untersucht. Bei den beiden

untersuchten Varianten handelte es sich um eine Calcium-Minimalversorgung (0,1 mM Ca2+)

und um eine Calcium-Normalversorgung (5 mM Ca2+). Da die Blätter bei diesen in

Hydrokultur angezogenen Pappeln unter Calciummangel sehr klein waren, musste auf eine

Ergebnisse

72

Gaswechselmessung bei basipetaler Signalleitung durch Hitzereiz an der Messblattspitze

verzichtet werden.

Die unter normaler Ca2+-Versorgung angezogenen Pappeln zeigten bei einer Hitzereizung an

der Blattbasis des unteren Blattes im Gaswechsel des Messblatts einen Abfall in der CO2-

Aufnahmerate von ursprünglichen 1,5 µmol m-2 s-1 auf nur mehr 0,7 µmol m-2 s-1 (Abb. 3.41

B). Diese Reaktion, ebenso wie die zeitliche Verzögerung von 120 Sekunden zwischen

Stimulation und Reaktion im Gaswechsel, korrelierten somit sehr gut mit den an getopften P.

trichocarpa beobachteten Reaktionen. Auch bei den in Hydrokultur angezogenen Pappeln

konnte eine Veränderung der stomatären Leitfähigkeit durch ein elektrisches Signal nicht

festgestellt werden. Die generell niedrigen Werte für g H2O von etwa 25 mmol m-2 s-1 lassen

sich durch die Anzucht in einem geschlossenen Raum unter Lichtbedingungen von

ca. 100 µmol m-2 s-1 PPFD erklären.

A

B

Abb. 3.41: Einfluss eines acropetalen Distanzsignals aus Hitzereizung auf den Gaswechsel von normal versorgten Pappeln aus einer Hydrokultur (5mM Ca2+). A: Versuchsaufbau; acropetale

Signalleitung durch Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren Blattes zum Zeitpunkt 0. B: Gaswechselmessung; 120 s nach Stimulation deutlicher Abfall von JCO2 des Messblatts.

Ergebnisse

73

Im Gegensatz zu der obigen Reaktion zeigten Hydrokulturpflanzen, welche unter einer

minimalem Ca2+-Versorgung angezogen wurden, auf eine acropetales Distanzsignal über den

Spross hinweg keine Veränderungen im Blattgaswechsel (Abb. 3.42 B). Sowohl die CO2-

Aufnahmerate, als auch die stomatäre Leitfähigkeit zeigten nach der Stimulation zum

Zeitpunkt 0 keine signifikanten Änderungen und verblieben weiterhin in ihren

Wertebereichen von etwa 1,7 µmol m-2 s-1 (JCO2), bzw. 40 mmol m-2 s-1 (g H2O).

A

B

Abb. 3.42: Einfluss eines acropetalen Distanzsignals aus Hitzereizung auf den Gaswechsel von

minimal mit Calcium versorgten Pappeln aus einer Hydrokultur (0,1mM Ca2+). A: Versuchsaufbau; acropetale Signalleitung durch Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren Blattes.

B: Gaswechselmessung; keine signifikante Änderung von JCO2 und g H2O nach Stimulation durch einen Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren Blattes zum Zeitpunkt 0.

Ergebnisse

74

3.8 Auswirkung der elektrischen Signalleitung auf die Lichtreaktionen

der Photosynthese der Pappel

Der Einfluss von elektrischen Signalen auf verschiedene Prozesse der Pflanzenphysiologie ist

seit ihrer Entdeckung ein Forschungsbereich, der weltweit schon viele Botaniker faszinierte.

Jedoch erst in jüngster Vergangenheit gelang es anhand von Mimosa pudica einen

Zusammenhang zwischen elektrischen Signalen und der Photosynthese aufzudecken

(Koziolek et al., 2004).

Um mögliche Auswirkungen der elektrischen Signale auf die Lichtreaktionen der

Photosynthese der Pappel zu überprüfen, wurde ein Chlorophyll Fluorometer der Firma Walz

(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland), das Imaging-PAM, verwendet. Mit Hilfe dieses

Gerätes konnte die Quantenausbeute der Energieumwandlung des Photosystems II räumlich

wie zeitlich aufgelöst werden.

Die noninvasiven Messungen wurden an triebspitzennahen, ausdifferenzierten Blättern

intakter Pflanzen (Populus trichocarpa) durchgeführt, die in ihrer Position mit der Skizze

3.23 in Kapitel 3.5.1 vergleichbar waren.

Mittels einer Flamme wurde die Blattspitze des Messblattes (Blatt 1) gereizt. Die Distanz zur

gemessenen Blattfläche in der Messblattmitte betrug ca. 3 cm. Dort wurde 80 Sekunden nach

der Stimulation an der Blattspitze eine einsetzende Abnahme in der photosynthetischen

Quantenausbeute des PSII deutlich, welche sich innerhalb von 160 Sekunden von den

ursprünglichen Werten um 0,6 , in der Falschfarbendarstellung blau angezeigt, auf Werte um

0,2 , in der Falschfarbendarstellung gelb angezeigt, substanziell reduzierte (Abb. 3.43). Die

photosynthetische Reaktion auf das sich basipetal fortsetzende elektrische Signal zeigt somit

eine deutliche Verzögerung zu dem eigentlichen elektrischen Signal, welches an der

Elektrode A bereits zwei Sekunden, an der Elektrode B 60 Sekunden nach der Stimulation der

Blattspitze aufgezeichnet werden konnte. Nachdem die Quantenausbeute ihr Minimum nach

etwa 300 Sekunden erreicht hatte, begann sie wieder in Richtung auf ihren Ausgangswert

anzusteigen.

Ergebnisse

75

Abb. 3.43: Räumliche und zeitliche Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute des PSII; ∆F/F´m. Die Bildausschnitte (22 x 17 mm) zeigen die Blattmitte des Messblattes 1. Stimulation der Messblattspitze durch Hitzereiz zum Zeitpunkt 0s; Distanz 3 cm. Erste Veränderungen in ∆F/F´m

nach 80 Sekunden.

Die Abbildung 3.44 zeigt im Gegensatz dazu die photosynthetischen Reaktionen im

Pappelblatt auf ein Distanzsignal. Nachdem die Blattbasis von Blatt 4 mit einem Hitzereiz

stimuliert wurde, war 240 Sekunden später in der Blattmitte von Blatt 1 ein Rückgang der

photosynthetischen Quantenausbeute festzustellen. Dabei wurde beobachtet, dass die

Blattadern von Blatt 1 zuerst auf das Signal reagierten, die Intercostalfelder zeitlich verzögert

(Abb. 3.45 B), was darauf schließen lässt, dass sich das acropetal fortpflanzende elektrische

Signal über die Blattadern ins Mesophyll ausbreitet; dort konnte nach 360 Sekunden eine

Reduktion der Quantenausbeute von ca. 0,6 auf ca. 0,2 festgestellt werden. Auch bei diesem

Distanzsignal konnte eine deutliche Verzögerung der Reaktion in der Fluoreszenz im

Vergleich zum elektrischen Signal, welches bereits 80 Sekunden nach Stimulation an der

Elektrode A aufgezeichnet werden konnte (vgl. Kapitel 3.5.1.2, Abb. 3.28), gemessen werden.

Die Reaktion in der Fluoreszenz erreichte auf der einen Blattseite von Blatt 1 ihr Maximum

etwa 420 Sekunden nach der Stimulation (Abb. 3.44, offener Pfeil), bevor sie sich wieder

ihrem Ursprungswert annäherte.

Getrennt durch die Mittelrippe erreichte die gegenüberliegende Blattseite ihren minimalen

Wert in der photosynthetischen Quantenausbeute erst nach etwa 600 Sekunden, welcher dann

ebenfalls bei 0,1 bis 0,2 lag (Abb. 3.44, geschlossener Pfeil).

Ergebnisse

76

Abb. 3.44: Räumliche und zeitliche Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute des PSII; ∆F/F´m. Die Bildausschnitte (22 x 17 mm) zeigen die Blattmitte von Blatt 1. Stimulation der Blattbasis von Blatt 4 durch Hitzereiz zum Zeitpunkt 0 s; Distanz 11 cm. Erste Veränderungen in

∆F/F´m nach 240 Sekunden.

Bei näherer Betrachtung des basipetal laufenden Kurzstreckensignals und des acropetal

laufenden Distanzsignals wird hinsichtlich der zeitlichen Reaktion in der Fluoreszenz ein

weiterer Unterschied deutlich. Wie in Abbildung 3.45 A ersichtlich ist, löst das durch

Hitzereiz an der Messblattspitze induzierte elektrische Signal eine simultane Reaktion in der

Ergebnisse

77

Fluoreszenz, sowohl in der Blattnervatur, als auch in den Intercostalfeldern, aus; in beiden

Bereichen des Blattes wird in 4 cm Entfernung zum verwundeten Blattgewebe nach 160

Sekunden ein gleichzeitig einsetzender Rückgang der photosynthetischen Quantenausbeute

gemessen. Ein anderes Bild jedoch lässt sich bei genauerer Betrachtung des acropetal

laufenden Distanzsignals erkennen. Hier war nach Reizung der Blattbasis von Blatt 4 in der

Blattmitte von Messblatt 1 deutlich zu erkennen, dass die Reaktion in der Fluoreszenz zuerst

in den Blattadern erfolgte, bevor sie auf die benachbarten Intercostalfelder überging (Abb.

3.45 B, vergrößerter Ausschnitt). Sie trat dort mit einer ca. 60-sekündigen Verzögerung auf.

Abb. 3.45: Kinetik der Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute des PSII, ∆F/F´m,

gemessen mittels Fluoreszenz Imaging-PAM in der Blattmitte von Messblatt 1. Die Graphen repräsentieren in ihren Farben die Flächen von Adern und angrenzenden Intercostalfeldern, wie sie in

den unteren Darstellungen abgebildet sind. A Hitzereiz an der Messblattspitze zum Zeitpunkt 0. B Hitzereiz an der Blattbasis von Blatt 4 zum Zeitpunkt 0. Die Verzögerung der Reaktion zwischen Blattadern und Intercostalfeldern ist hier durch eine Vergrößerung der relevanten Zeitpunkte in der

Grafik hervorgehoben.

Der Unterschied in der Fluoreszenzreaktion auf das Distanzsignal und auf das im Messblatt

induzierte elektrische Signal zeigt damit eindeutig, dass bei einer Distanzsignalleitung die

elektrischen Signale über die Blattadern in die Intercostalfelder weitergeleitet werden,

während bei den basipetalen Kurzstreckensignalen die durch die Verwundung

hervorgerufenen Signale sowohl über das Mesophyll, als auch über die Blattadern mit der

selben Geschwindigkeit weitergeleitet zu werden scheinen.

Diskussion

78

4 Diskussion

4.1 Bedeutung der Calciumernährung für die Holzdifferenzierung

Obwohl die Bedeutung von Bäumen als Lieferanten eines der weltweit wichtigsten Rohstoffe,

dem Holz, immer stärker ins öffentliche Bewusstsein rückt, so war dennoch die cytologische

Erforschung des Cambiums in seiner Funktion als holzbildendes Meristem über lange Zeit

hinweg relativ unpopulär. Erst seit einigen Jahren, einhergehend mit technischen Fortschritten

in der Molekularbiologie, wird man sich bewusst, dass eine mögliche Modifizierung des

Holzwachstums auch von immensen wirtschaftlichen Vorteilen sein könnte. Pionierarbeiten

auf diesem Gebiet anhand der Modellbaumart Populus betrafen Untersuchungen zur

Ligninreduzierung sowie dessen leichtere Extrahierbarkeit. Lignine sind Zellwand-Polymere,

die in höheren Pflanzen für mechanische Festigkeiten, für den Wassertransport und für

Pathogenabwehr essentiell sind. Die Entfernung dieses Polymers aus den Holzfasern stellt den

entscheidenden Schritt bei der Zellstoff- und Papierherstellung dar. Wegen seiner

Wasserunlöslichkeit und der starken Vernetzung in den Fasern ist man bei der kostspieligen

Delignifizierung zudem auf den Einsatz von umweltschädigenden Chemikalien angewiesen.

Wissenschaftliche Untersuchungen stützten sich fortan vorwiegend auf genetische

Modifikationen der Ligninbiosynthese. Als problematisch stellt sich dabei nicht nur die

Ausbringung der genetisch veränderten Pflanzen unter ökologischen Gesichtspunkten, vor

allem Aspekte der Fertilität der Bäume betreffend, dar, sondern auch die eigentliche

Modifizierung an dem komplexen Polymer Lignin (Campbell und Sederoff, 1996; Lewis,

1999; Boerjan et al., 2003). Einhergehend mit einer immer tieferen Erkenntnis über die

Ligninbiosynthese wurde offenbar, um welch sensiblen und verzweigt arrangierten Vorgang

es sich dabei handelt. Heute ist man sich darüber einig, dass eine Vielzahl von Enzymen und

Substraten in enger Zusammenarbeit mit Regulatorproteinen nötig ist, um in einem

spezifischen Pflanzengewebe eines bestimmten Entwicklungsstadiums den erforderlichen

Lignintyp bereitzustellen (Ranocha et al., 2000).

Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse beruhen nicht auf genetischen Veränderungen

des untersuchten Organismus’, jedoch zeigen auch diese Pappeln Veränderungen in ihrem

Ligningehalt in den Holzzellwänden. So konnte durch FTIR-Spektroskopie gezeigt werden,

dass sich bei stark reduzierter Calcium-Ernährung eine deutliche Reduktion der Syringyl-

Einheiten ergab; da in Pappeln das G/S - Verhältnis recht stabil ist (Hu et al., 1999) kann

daraus geschlossen werden, dass sich die gesamte Ligninkonzentration in diesem Holzgewebe

Diskussion

79

im Vergleich zur Calcium-Optimalversorgung verändert. Die exakte Einflussnahme von

Calcium auf die Ligninbiosynthese ist bislang noch nicht vollständig bekannt, jedoch stimmen

die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse mit Beobachtungen von Eklund und

Eliasson überein, die für die Ligninbiosynthese in jungen Bäumen eine notwendige

Versorgung mit Calcium feststellen konnten (Eklund und Eliasson, 1990). Eine

Erklärungsmöglichkeit für das Phänomen der Ligninreduktion unter Calciummangel gibt sich

auch aus Untersuchungen an apoplastischen Peroxidasen, welche über eine Ca2+-Pektat-

Bindungsstelle verfügen (Carpin et al., 2001). Nachdem die Mittellamelle und die

Zellwandecken die ersten Bereiche einer einsetzenden Lignifizierung darstellen und eben

diese Bereiche im Normalfall über eine hohe Ca2+-Pektat-Konzentration verfügen, ließe sich

daraus ableiten, dass diese Ca2+-Pektat - gebundenen Peroxidasen eine nicht zu

unterschätzende Auswirkung auf die räumliche Verteilung der Lignindeposition ausüben.

Änderungen in der apoplastischen Ca2+-Konzentration könnten damit Änderungen in der

Peroxidaselokalisation und dadurch in der Ligninsynthese nach sich ziehen (Carpin et al.,

2001).

Eine weitere Calciumabhängigkeit der Ligninbiosynthese wurde bereits in den 80er Jahren

von Westermark (1982) untersucht. In ihren Arbeiten hat sie in vitro einen möglichen

Oxidationsmechanismus für Coniferyl-Alkohol durch ein Superoxid-Radikal erforscht, eine

Reaktion, die bei einer apoplastischen Calcium-Konzentration von ≥ 50 mM gefördert wurde.

Mit abnehmender Ca2+-Versorgung ging auch eine Abnahme in der Reaktionsintensität

einher; unter Calcium-Abstinenz konnten nurmehr etwa 60% des Coniferyl-Alkohols mit

Superoxid reagieren. Durch diese Untersuchungen ergab sich auch eine zusätzliche

Erklärungsmöglichkeit für die erhöhten Calcium-Konzentrationen in den Wandbereichen

noch unlignifizierter Zellschichten verglichen mit bereits lignifizierten Zellwandschichten

(Wardrop, 1976); diese wären somit für die Bildung von Radikalen aus Coniferylalkohol

förderlich. Die im Rahmen dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse weisen ebenfalls auf eine

mit Rückgang der Ca2+-Versorgung rückgängige Lignin-Biosynthese hin; insofern lassen sich

durchaus Parallelen zu Westermarks Untersuchungen ziehen.

Neben calciumabhängigen Veränderungen des Ligningehaltes in den Zellwänden konnten die

FTIR - Untersuchungen auch noch Veränderungen anderer funktioneller Gruppen darlegen.

Besonders bemerkenswert erscheint hier ein unter Calcium-Mangel genereller Rückgang der

Absorptionsbanden in dem Wellenbereich 1300 cm-1 bis 900 cm-1, welcher für funktionelle

Gruppen der Carbohydrate steht (Williams und Fleming, 1980). Diese Wellenbereiche

gewinnen an Bedeutung, wenn man sie Ergebnissen einer Arbeitsgruppe gegenüberstellt, die

Diskussion

80

FTIR - Spektren an Zellsuspensionen der Karotte gemessen haben (McCann et al., 1993). In

dieser Arbeit gelang es den Autoren, gewichtige Veränderungen in der

Zellwandzusammensetzung während des Streckungswachstums der untersuchten Zellen

festzustellen. Demnach enthielten die Zellwände noch nicht gestreckter, runder Zellen

deutlich mehr Proteine, Ester und Phenole pro gemessenen Zellwandausschnitt als die

Zellwände bereits gestreckter Zellen, welche ihrerseits einen signifikant höheren Anteil an

Carbohydraten enthielten. In der vorliegenden Arbeit haben Untersuchungen zur

Xylemfaserlänge der Pappel in Abhängigkeit der Calciumernährung ergeben, dass mit

abnehmender Calcium-Versorgung ein Rückgang in der Faserlänge einhergeht. Ebenso

konnte mittels FTIR - Spektroskopie unter Calcium-Optimalversorgung ein im Vergleich zur

Ca2+-Abstinenz stark erhöhter Anteil an Carbohydraten festgestellt werden. Diese Korrelation

zwischen optimaler Calcium-Versorgung, dem Carbohydratanteil der Zellwand und der

Faserlänge ist demnach in einigen Punkten mit den Ergebnissen von McCann et al. an

Karottenzellen übereinstimmend und bekräftigt somit die Aussagen zum calciumabhängigen

Streckungswachstum der Faserzellen.

Dennoch darf bei allen Übereinstimmungen nicht außer Acht gelassen werden, aus welchem

Meristem die Faserzellen der Pappel entspringen und wieweit sie sich überhaupt longitudinal

entwickeln können. So liegt der erste große Unterschied in der Ausgangsform der Faserzellen

von Angiospermen; diese ist nach der Differenzierung aus den cambialen Mutterzellen bereits

lang gestreckt. Im Vergleich zu den oben genannten Karottenzellen tritt auch noch ein sog.

intrusives Spitzenwachstum auf. Dieses Längenwachstum der Libriformfasern kann wiederum

in verschiedenen Laubbaumarten unterschiedlich intensiv ausgeprägt sein (Tab. 4.1).

Diskussion

81

Baumart

Durchschnittslänge cambiale Initialen

(mm)

Durchschnittslänge Libriformfasern

(mm)

Acer rubrum 0,49 0,84

Alnus incana 0,6 1,89

Betula populifolia 0,94 1,31

Fraxinus americana 0,29 0,96

Populus sp. 0,49 0,9

Quercus alba 0,53 1,0

Robinia pseudoacacia 0,17 0,87

Tab. 4.1: Durchschnittliche Länge cambialer Initialzellen und Xylemfasern

ausgewählter Laubbaumarten; nach Bailey, 1920.

Neben einem baumartenspezifischen Faserlängenwachstum ist zudem noch eine

altersabhängige Veränderung in den jeweiligen Gewebeexpansionen festzustellen. Demnach

nimmt sowohl die Länge der cambialen Initialzellen, als auch die Länge der aus ihnen

hervorgehenden Xylemfaserzellen im juvenilen Holz (≤ 30 Jahre) mit steigendem Alter des

Baumes zu. Dieses Phänomen gilt für Gymnospermen genauso wie für Angiospermen, kann

jedoch wieder baumartenabhängig unterschiedlich stark ausgeprägt sein (Bailey und Shepard,

1915; Shimaji, 1950).

Neben der Zunahme der Faserlänge mit zunehmendem Baumalter lassen sich auch saisonale

Veränderungen des intrusiven Spitzenwachstums der Libriformfasern feststellen. Bissett und

Dadswell fanden bereits in den 50er Jahren heraus, dass in allen 28 von ihnen untersuchten

Laubbaumarten innerhalb eines Jahrrings deutliche Schwankungen der Faserlänge existieren

(Bissett und Dadswell, 1950): zwischen den ersten Fasern des Frühholzes und den

spätgebildeten des Spätholzes findet ein kontinuierlicher Anstieg in der Faserlänge statt; an

einer Spätholzgrenze zum nächsten Jahrring hin konnte ein steiler Abfall in der Faserlänge

gemessen werden.

Zieht man die altersabhängigen sowie die intrasaisonalen Abhängigkeiten des

Spitzenwachstums in Betracht, so lassen sich auch die relativ kurzen Faserlängen der in dieser

Arbeit vorgestellten mazerierten Pappelfasern erklären; die Proben stammten von einjährigen

Diskussion

82

Pappeln aus der Frühholzbildung und betrugen zwischen 0,35 mm und 0,6 mm. Trotz einer

möglichen biologischen Schwankung kann die calciumabhängige Reduzierung im

Spitzenwachstum aufgrund der hohen Stichprobenanzahl (n = 120) dennoch als signifikant

angesehen werden.

Im Gegensatz zu den Xylemfasern findet bei den Gefäßen der Angiospermen kaum ein

Spitzenwachstum statt; sie behalten demnach meist die Länge ihres Ursprungsmeristems, der

cambialen Initialzellen bei (Larson, 1994). Durch ihre perforierten stumpfen Enden können

Gefäße axial miteinander vernetzt sein und so Verbindungen bis zu mehreren Metern Länge

(z.B. Ringporer) bilden. Aufgrund ihrer Funktion des Wassertransports ist die radiale

Ausprägung der Gefäße von großer Bedeutung für den Baum. Eine Vergrößerung des

Gefäßdurchmessers vergrößert die Effizienz des Wassertransportes infolge eines rückläufigen

Wasserwiderstandes deutlich, vermindert jedoch gleichzeitig den Selbstschutz des Systems

vor z.B. Folgen von Kavitationen (Aloni, 1987). In der vorliegenden Arbeit kann bei dem

Gefäßweitenwachstum ein calciumabhängiger Trend von Gefäßen mit großem Durchmesser

bei Optimalversorgung hin zu Gefäßen mit reduziertem Durchmesser bei Minimalversorgung

festgestellt werden. Diese Beobachtung ließe sich erklären, wenn man die Auswirkungen

einer ebenfalls unter Calcium-Mangel rückläufigen Blattflächenentwicklung in Betracht zieht.

Wie sowohl Biomasseuntersuchungen der in Hydrokultur angezogenen Pappeln, als auch

Blattflächenmessungen im Freiland angezogener Pappeln zweifelsfrei zeigen konnten, sank

die Biomasseproduktion und damit auch die Blattflächenbildung mit abnehmender Calcium-

Versorgung im Nährmedium, bzw. Bodensubstrat. Parallel zur reduzierten Blattfläche sinkt

damit auch die Transpirationsrate der einzelnen Probebäume, womit auch die Notwendigkeit

für einen maximalen Gefäßdurchmesser nicht mehr gegeben ist.

Eine weitere Möglichkeit für das unter Calcium-Mangel reduzierte Gefäßweitenwachstum

könnte in einer allgemeinen Stressreaktion der Pappel auf Nährstoffmangel liegen. In der

vorliegenden Dissertation konnte anhand von ultrastrukturellen Untersuchungen gezeigt

werden, dass die cambiale Zone unter Calcium-Mangel in ihrer radialen Ausprägung

erheblich rückläufig ist; anstelle der ca. acht Zellreihen der Kontrolle war die cambiale Zone

auf etwa drei Zellreihen beschränkt. Das Cytoplasma wies auch nicht die typische starke

Vakuolisierung eines aktiven Cambiums auf, sondern zeigte ein sehr dichtes Cytoplasma mit

reduzierten Vakuolen. Mit diesem Erscheinungsbild ähnelten sie sehr einem typischen

angiospermen Cambium während der Winterruhe (Farrar und Evert, 1996; Krabel, 2000;

Diskussion

83

Arend und Fromm, 2003). Da Calciumstress auf das cambiale Meristem einen ebenso

gearteten Einfluss auszuüben scheint, könnte die beobachtete Gefäßflächenreduzierung auch

auf ein nahezu inaktives Cambium zurückzuführen sein. Einen weiteren, diese Theorie

unterstützenden Hinweis liefern die elektronenmikroskopischen Beobachtungen der

Chloroplasten. Auch hier ergaben sich im Vergleich zu der Kontrolle deutliche Unterschiede

in der Ultrastruktur. In der Kontrolle deutlich sichtbare Stärkeeinlagerungen, wie sie bereits

vielfach als chloroplastentypisch und ~notwendig charakterisiert wurden, fehlen in den unter

Calcium-Mangel gewachsenen Pappelblättern nahezu vollständig. Dieser Mangel an Stärke in

den Chloroplasten könnte ebenfalls auf eine Reaktion der Pappel auf Calciumstress hindeuten,

die in ihrer Ausprägung der Vorbereitung zur Seneszenz sehr ähnelt. Die zur Vorbereitung auf

den Laubfall typischen Vorgänge im Blatt beinhalten unter anderem eine Translokation

mobilisierbarer Nährelemente in den Stamm, in dessen Zug auch Stärke abgebaut wird (Mohr

und Schopfer, 1992). Ein Abbau von Chlorophyll, wie er ebenfalls bei der Blattalterung

auftritt, konnte bei den durchgeführten Versuchen jedoch nicht festgestellt werden. Wie in der

Arbeit gezeigt werden konnte, wurden in vergleichenden Gaswechselmessungen unter

Calcium-Mangel keine Unterschiede in der Photosyntheseleistung gemessen.

Als dritter Aspekt für die Tendenz eines rückläufigen Gefäßdurchmessers unter Calcium-

Mangel wäre die mit Calcium-Mangel einhergehende Reduktion der Phloembe- und

~entladung in Betracht zu ziehen. Wie mikroautoradiographische Untersuchungen an 14C-

markierten Photoassimilaten bereits zeigen konnten, fand bei unter Calcium-Abstinenz

angezogenen Pappeln eine drastisch reduzierte Phloembeladung in den Blättern und keine

Entladung von Photoassimilaten aus dem Phloem des Stamms in das Cambium statt (Schulte-

Baukloh und Fromm, 1993). Da dieser Effekt bei vergleichenden Untersuchungen unter

Kalium-, bzw. Magnesium-Mangel nicht gezeigt werden konnte, kann davon ausgegangen

werden, dass die Phloementladung im Stamm möglicherweise calciumspezifisch reguliert

wird. Da die cambialen Zellen unter Calcium-Mangel demnach nicht mehr mit Kohlenstoff

versorgt werden, könnte die Tendenz zu den geringer ausgeprägten Gefäßdurchmessern auf

den C-Mangel zurückgeführt werden. Ein weiteres Argument, das für eine Funktion des

Calciums bei der Phloementladung spricht sind die in dieser Dissertation dargestellten

Calciumgehalte in den verschiedenen Geweben des Stamms. Wie mittels energiedispersiver

Röntgenanalyse gezeigt werden konnte, steigt der Gehalt an Calcium im Phloem, im

Cambium und in der Differenzierungszone des Xylems mit steigender Calcium-Versorgung in

der Nährlösung ebenfalls an. In allen drei bemessenen Geweben bleibt die Ionenkonzentration

Diskussion

84

pro Ernährungsvariante dabei etwa gleich stark ausgeprägt, lediglich bei einem Überangebot

von Calcium steigt die Konzentration im Phloem überproportional an, was wiederum auf eine

phloemspezifische Funktion des Calciums hinweist. Da Calcium relativ Phloem-immobil ist,

muss es sich dabei um eine apoplastische Verlagerung über den Transpirationsstrom handeln.

Eine ähnliche Situation mit erhöhten Calcium-Vorkommen im Phloem lässt sich auch

während der „Prä-Aktivierungs-Phase“ des Cambiums im Frühjahr feststellen. Wie Follet-

Gueye et al. anhand von Untersuchungen an der Buche mittels sekundärer Ionen-

Massenspektronomie (SIMS) zeigen konnten, sind die Calciumgehalte insbesondere im

Phloem zu dieser Zeit außerordentlich erhöht (Follet-Gueye et al., 1998). Da diese

Beobachtungen jedoch vor Einsetzen des Transpirationsstroms gemacht wurden, wird das

benötigte Calcium in diesem Fall entweder aus in der Rinde lokalisierten Oxalatkristallen

oder durch basipetale Diffusion aus den calciumreichen Apikalmeristemen geliefert,

einhergehend mit der ebenfalls basipetal verlaufenden auxingesteuerten cambialen

Reaktivierung (Lachaud und Bonnemain, 1982).

4.1.1 Ausblick auf die Bestandesebene

Die Effektivität, mit der ein Baum auf die unterschiedlichsten auf ihn einwirkenden Kräfte

reagieren kann, ist die im Bestandesalltag unserer Waldbäume eigentlich relevante Größe. In

diesem Zusammenhang kann Calcium-Mangel die mechanischen Fähigkeiten von Holz

negativ beeinflussen; dies kann sich in einer reduzierten Zugfestigkeit, einer reduzierten

Bruchresistent sowie eines reduzierten Elastizitätsmoduls äußern (Brady, 1969; Panshin und

DeZeeuw, 1980; McLaughlin und Wimmer, 1999).

Über die rein mechanischen Auswirkungen auf den Rohstoff hinaus kann sich Calcium-

Mangel natürlich auch auf das Stützgewebe des biologischen Systems der Pflanze auswirken.

Das kann zum einen eine Lockerung des Zellverbandes nach sich ziehen, wie es bereits 1929

von Albrecht und Davis am Spross der Sojabohne beobachtet wurde und wie es in der

vorliegenden Arbeit auch an elektronenmikroskopischen Aufnahmen für Wurzel- und

Blattgewebe bestätigt werden konnte. Zum anderen kann Calcium-Mangel auch, wie an der

Kiefer gezeigt werden konnte, zu einer erhöhten Brüchigkeit des Stamms führen (Davies,

1949).

Eine geringe Calcium-Verfügbarkeit in stark sauren Böden kann als mögliche Konsequenz

einen Rückgang in der Lignifizierung des Holzgewebes zur Folge haben (Eklund und

Diskussion

85

Eliasson, 1990). Dieser Rückgang wäre aufgrund der ausgeprägten Bindungsmöglichkeiten

entlang des Transpirationsstroms im apoplastischen Raum vor allem in den Kronenbereichen

älterer Bestände vorstellbar, wenn man davon ausgeht, dass nur noch ein Bruchteil der im

Wurzelraum aufgenommenen Ionen den Kronenraum erreicht. Gerade bei

Nadelholzbeständen wäre im Kronenraum eine ausreichende Calciumversorgung jedoch

unbedingt nötig, da Lignin dort eine stützende Funktion bei der Astbildung innehat

(Druckholzbildung) und somit stark zur Stabilität des Baumes beiträgt (McLaughlin und

Wimmer, 1999). Im Stammbereich könnte Calcium-Mangel zu einem weniger stabilen und

damit brüchigen Xylem führen und damit zu einer höheren Anfälligkeit, mechanischen

Belastungen wie Wind oder Schnee nicht mehr standhalten zu können (McLaughlin und

Wimmer, 1999).

4.2 Signalleitung in der Pappel

Die Entwicklung molekularbiologischer Techniken ermöglichte eine über die deskriptive

Ebene hinausgehende Erforschung der elektrischen Signalleitung, insbesondere ihrer Rolle

bei inter- sowie in intrazellulären Vorgängen. Besonders die Entwicklung von Calcium-

spezifischen Farbstoffen hat es erlaubt, räumliche und zeitliche Abläufe bei der Signalleitung

aufzudecken (Webb et al., 1996). Dadurch wurde der Weg geebnet, den Prozess der

Signalentstehung, der Signalausbreitung und den pflanzenphysiologischen Reaktionen darauf

zu entschlüsseln (Trewavas und Malho, 1997; McAnish und Hetherington, 1998; Snedden

und Fromm, 1998; Plieth et al., 1998). Anfang der 80er Jahre des letzten Jahrhunderts gelang

es beispielsweise Davies und Schuster (1981) an der Erbse, Auswirkungen von elektrischen

Signalen auf die Genexpression nachzuweisen. 1992 veröffentlichten Wildon et al. einen

wegweisenden Artikel, der die Aktivierung von Proteinaseinhibitor (PIN) - Genen durch

Hitzereiz - induzierte elektrische Signale beschrieb.

Wenn man die Reaktion einer Pflanze auf diverse Umwelteinflüsse betrachtet kann man

erkennen, dass auch unter ökophysiologischen Gesichtspunkten elektrischen Signalen eine

Schlüsselrolle zukommt. Ihr Aktionsradius erstreckt sich dabei von einzelnen Zellen bis hin

zu verschiedenen Organen der Pflanze (Volkov und Mwesigwa, 2001). So konnte

beispielsweise anhand von Untersuchungen an der Sojabohne festgestellt werden, dass 2,4-

Dinitrophenol (DNP), welches in seinen Auswirkungen auf Mensch und Umwelt als durchaus

Diskussion

86

bedenklich eingestuft wird, in der Pflanze verstärkt Aktionspotentiale hervorruft und

gleichzeitig einen Rückgang im Variationspotential bewirkt (Mwesigwa et al., 2000).

Gleichermaßen wurde für Pentachlorphenol, ein weiteres Umweltgift, das die oxidative

Phosphorylierung entkoppelt, eine Induktion von Aktionspotentialen ebenfalls an der

Sojabohne nachgewiesen (Volkov et al., 2000).

Es sind sicherlich noch nicht annähernd alle einzelnen Auswirkungen von elektrischen

Signalen auf die unterschiedlichen Aspekte der Pflanzenphysiologie erforscht. So konnten

beispielsweise erst in jüngerer Vergangenheit Forschungsergebnisse zur Signalleitung an der

sensitiven Pflanze Mimosa pudica eine Einflussnahme der elektrischen Signale auf die

Photosyntheseleistung aufzeigen (Koziolek et al., 2004).

Die hier vorgestellte Arbeit bestätigt diese Erkenntnisse nun auch für die Gattung Populus;

darüber hinaus unterscheidet sie noch zwischen verschiedenen Arten und Positionen der

Signalinduktion und den dadurch hervorgerufenen Reaktionen in der Photosyntheseleistung.

Dabei wurde zwischen Veränderungen in der Lichtreaktion der Photosynthese, welche mittels

zweidimensionaler Bildanalyse der Chlorophyllfluoreszenz gemessen wurde, und

Veränderungen in der Dunkelreaktion der Photosynthese, welche durch Schwankungen von

JCO2 im Blattgaswechsel detektiert wurden, unterschieden.

Die elektrischen Signale, die in der vorliegenden Arbeit dargestellt sind, wurden überwiegend

mittels der sog. Aphidentechnik in Phloemzellen gemessen. Dieser Zelltyp stimmt in vielen

grundlegenden Eigenschaften mit Nervenzellen des tierischen Systems überein, wie z. B. der

elektrischen Erregbarkeit der Zellmembranen, durch die elektrische Signale von Zelle zu

Zelle weitergegeben werden können. Wenngleich es in tierischen Nervenzellen auch

Natrium- und Kaliumströme sind, die für die Entstehung eines Aktionspotentials

verantwortlich sind, so basieren die Mechanismen der Erregbarkeit in pflanzlichen

Zellemembranen auf einem Calciumeinstrom und auf einem Chlorid- und Kaliumausstrom

(Beilby und Coster, 1979; Kikuyama und Tazawa, 1983; Lunevsky et al., 1983; Tsutsui et al.,

1986; Fromm und Spanswick, 1993).

In der Pappel konnte nun bei den Veränderungen des Membranpotentials gezeigt werden, dass

die Art der Spannungsänderung des fortlaufenden Signals von der Richtung abhängig ist, in

der es sich fortbewegt. Sowohl bei Hitze- als auch bei Kältereiz zeigten basipetal laufende

Signale durch negative Spannungsänderungen an der Plasmamembran eine Hyperpolarisation

Diskussion

87

der Membranpotentiale, wohingegen sich acropetal fortpflanzende Signale durch eine

kurzzeitige Depolarisierung der Membran charakterisieren ließen.

Der Ionenmechanismus, der hinter einer Depolarisation der Membran steht, basiert auf einem

Calcium-Einstrom in das Cytoplasma, welcher einen Chlorid-Ausstrom in den Apoplasten

induziert, dem wiederum ein Kalium-Ausstrom folgt (Beilby und Coster, 1979; Kikuyama

und Tazawa, 1983; Kikuyama, 1987; Lunevsky et al., 1983; Tsutsui et al., 1986; Fromm und

Spanswick, 1993). Weniger genau definiert ist jedoch die Entstehung der Hyperpolarisation

der Zellmembran. Um die bei der basipetalen Signalleitung beobachtete Hyperpolarisation auf

ihre Kalium-Kanal - Abhängigkeit zu überprüfen, wurden daher die Kalium-Kanäle in den

Pappeltrieben mit Tetraethylammoniumchlorid (TEA+), einem K+-Kanal - spezifischen

Hemmstoff, geblockt. Da TEA+ in den meisten Fällen apoplastisch appliziert wird, hemmt

dieser Wirkstoff in den meisten Untersuchungen ausschließlich die einwärtsgerichteten

Kalium-Kanäle (z.B. Langer et al., 2002). Untersuchungen, bei denen TEA+ intrazellular

injiziert wurde konnten jedoch belegen, dass es im intrazellularem Raum auch

auswärtsgerichtete Kalium-Kanäle blockt (Wong und Adler, 1986; Ochi und Nishiye, 1974);

TEA+ wirkt demnach generell auf alle K+-Kanäle, die von der jeweiligen Position

transmembran gerichtet sind. In der vorliegenden Arbeit wurden abgetrennte Pappeltriebe für

einen Tag in eine mit TEA+ versetzte Nährlösung (APW + TEA+) gegeben. Der Hemmstoff

konnte sich somit nicht nur über den Transpirationsstrom im apoplastischen Raum

ausbreiten, sondern auch über die Schnittstelle in den intrazellularen Raum des

Phloemgewebes eindringen. Auf diese Weise konnten die K+-Kanäle auf beiden Seiten der

Membran geblockt werden. Ein sich durch einen Hitzereiz an der Blattspitze basipetal

ausbreitendes elektrisches Signal konnte nach einer TEA+-Behandlung nicht mehr detektiert

werden (Abb. 3.31). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass auch bei einer Hyperpolarisation

der Plasmamembran das sich ausbreitende Signal über einen K+- Efflux aus den Phloemzellen

verursacht wird, insbesondere wenn weitere Arbeiten zum Mechanismus der

Hyperpolarisation herangezogen werden. So konnten Schönknecht et al. an der einzelligen

Grünalge Eremosphaera viridis eine vorübergehende Hyperpolarisation feststellen, nachdem

die photosynthetische Elektronenaufnahme durch kurzzeitiges Abdunkeln unterbrochen

wurde (Schönknecht et al., 1998). Mittels ionenspezifischer Farbstoffe gelang es den Autoren

nachzuweisen, dass die Hyperpolarisation durch einen intrazellulären Calcium-Anstieg

induziert wurde, welcher seinerseits einen K+-Efflux bewirkte. Dass dieser

Hyperpolarisationsmechanismus im Pflanzenreich jedoch nicht der einzige ist, konnten

jüngste Untersuchungen an einem Phytoplankton zeigen, bei welchem durch einen Chlorid-

Diskussion

88

Einstrom eine Hyperpolarisation ausgelöst wird (Taylor und Brownlee, 2003). An höheren

Pflanzen wurde bislang jedoch der Calcium-Kalium -Mechanismus bestätigt.

Die vorliegenden Ergebnisse an unter Calcium-Minimalversorgung angezogenen Pappeln

zeigen bei einer Hitzereizung der Blattspitze, dass die Erregbarkeit der Phloemzellen bei

einem basipetal laufenden elektrischen Signal gänzlich unterdrückt wurde. Daraus lässt sich

zum einen schließen, dass bei einer basipetalen Signalleitung Calcium-Kanäle involviert sind;

ein Schluss, der die bisher bekannte Funktion von Calcium-Kanälen und -Transportern als

Angelpunkt für ein vielseitiges Netzwerk intrazellularer Signalverarbeitung unterstützen

würde (Trewavas und Malho, 1997; Trewavas, 2000). Zum anderen lässt sich unter

Berücksichtigung der TEA+ geblockten K+-Kanäle schließen, dass unter optimaler

Nährstoffversorgung der Pappel ein K+-Efflux für das Entstehen der Hyperpolarisation

entlang der Phloemzellen verantwortlich ist. Dieser verläuft mit hoher Wahrscheinlichkeit

auch in Bäumen nach dem aus Eremosphaera bekannten Prinzip der Calcium-Induktion

(Schönknecht et al., 1998).

Die vorliegenden Ergebnisse zur Distanzsignalleitung erlauben eine weitere Unterscheidung

zwischen basipetal und acropetal gerichteten Signalen. Die Phloemmessungen an unter

Calcium-Mangel angezogenen Pappeln haben gezeigt, dass unter identischen Bedingungen

das in acropetaler Richtung laufende Signal trotz erheblichen Calcium-Mangels noch leicht

ausgeprägt war, wohingegen in basipetaler Richtung keine Amplitude mehr festgestellt

werden konnte (Abb. 3.32). Diese Beobachtung deutet auf eine Präferenz der Signalleitung

hin, die ihre Ursprünge in der Funktion der Informationsweiterleitung vom Wurzelsystem /

Stamm zum Kronenraum haben könnte. Anhand der Wasserpflanze Azolla konnte ein

ähnliches Phänomen festgestellt werden (Overall und Gunning, 1982); elektrophysiologische

Messungen in den Wurzeln haben auch hier gezeigt, dass über die Plasmodesmata die

elektrische Kopplung zwischen zwei Zellen in acropetaler Richtung deutlich ausgeprägter war

als in basipetaler. Die Signalweiterleitung im Phloem der Pappel findet durch die in diesem

Gewebetyp häufig auftretenden Siebporen von Siebelement zu Siebelement statt. Da die recht

großen Siebporen (bis zu 1 µm Durchmesser) an den Querwänden der Siebelemente bei der

Phloemdifferenzierung aus Plasmodesmata hervorgehen, scheinen sie bei der elektrischen

Signalleitung eine entscheidende Rolle zu spielen.

In dieser Arbeit wurden an der Pappel elektrische Signale durch zweierlei Reize induziert:

zum einen durch Kältereizung und zum anderen durch Hitzereizung. Die durch Kälte

induzierten, acropetal fortgeleiteten Signale wiesen in ihrer Geschwindigkeit ebenso wie in

Diskussion

89

ihrer Amplitude die für pflanzliche Aktionspotentiale typischen Merkmale auf und stimmen

in diesen Punkten mit bereits bekannten Reaktionen in Mais (Fromm und Fei, 1998) und in

Weide (Fromm und Spanswick, 1993) überein. Generell gilt, dass Aktionspotentiale sich mit

einer konstanten Geschwindigkeit fortbewegen. Bisherige Erkenntnisse lassen darauf

schließen, dass sie in ihrer Ausbreitung von spannungsabhängigen Ionenkanälen abhängig

sind und sich entlang der Plasmamembran durch Plasmodesmata lebender Zellen oder durch

Siebporen der Siebröhren fortpflanzen. Im Gegensatz dazu lösen Reizungen durch

Gewebeverwundung, insbesondere durch Hitzereizung, sich langsamer ausbreitende und

unregelmäßig verlaufende Variationspotentiale aus (Sibaoka, 1966; Sibaoka, 1969; Pickard,

1973). Sie galten bislang nicht als sich selbständig fortpflanzende Signale, sondern vielmehr

als lokale elektrische Reaktionen, die auf einen chemischen Reiz erfolgen, welcher wiederum

am Ort der Verletzung entsteht und sich hydraulisch über das Xylem fortpflanzt. Tinz-

Füchtmeier und Gradmann führten zur hydraulischen Signalleitung mittels Elektrometer und

Interferometer Messungen an der Mimose durch, welche dieser Theorie der hydraulischen

Signalleitung nach einer Hitzereizung jedoch entgegenstehen (Tinz-Füchtmeier und

Gradmann, 1990).

Grundsätzlich ist es durchaus möglich, dass hydraulische Signale bei der Erregbarkeit der

Pappel eine Rolle spielen. Nachdem die Messungen zu den hier vorgestellten Daten jedoch im

Phloem stattfanden und es dort gelang, die durch einen Hitzereiz induzierten Signale zu

messen, stellte sich die Frage, ob Druck- oder chemische Veränderungen im Xylem

Ionenkanäle des Phloems aktivieren können, und zwar in dem Ausmaß, dass daraufhin in

diesem Gewebe die Variationspotentiale hervorgerufen werden könnten. Zur Klärung dieser

Frage wurden Kontrollmessungen durchgeführt, die deutlich zeigen, dass durch das Anlegen

eines Kälteblocks am Spross sowohl die charakteristische Signalleitung unterbrochen ist, als

auch dass die Reaktion im Gaswechsel unterbleibt. Es erwies sich als ausschlaggebend, das

elektrische Signal von einem hydraulischen mittels eines Kälteblocks unterscheiden zu

können. Da auf das Anbringen eines Kälteblock hin keine Veränderung in der CO2-

Austauschrate oder in der stomatären Leitfähigkeit im Gaswechsel festzustellen war, konnte

das Distanzsignal eindeutig als elektrisches bestätigt werden, da es den gekühlten

Sprossabschnitt offensichtlich nicht passieren konnte. Für ein hydraulisches Signal würde ein

Kälteblock kein Hindernis darstellen, da die Transduktion über die toten Zellen des Xylems

hinweg erfolgen würde.

Diskussion

90

Somit konnte bei den an Pappel durchgeführten Messungen ausgeschlossen werden, dass bei

der Signalweiterleitung in acropetaler Richtung hydraulische Signale einen Einfluss auf den

Gaswechsel haben. Zudem gelten hydraulische Signale als stark abhängig vom

Bewässerungsstatus der Messpflanze. Dabei gilt, dass bei einem wassergesättigten Zustand

des Sprosses, wie er bei den in dieser Arbeit untersuchten Pappeln vorlag, die

Xylemspannung vernachlässigbar gering ist und damit hydraulische Signale sich kaum

ausbreiten könnten. Diese Punkte sprechen dafür, dass die hier gemessenen Wund-Signale im

Pappel-Phloem sich eigenständig fortbewegen und nicht von sich im Xylem fortpflanzenden

hydraulischen Signalen beeinflusst sind.

Es ist nicht auszuschließen, dass auch chemische Signale einen Einfluss beispielsweise auf die

Photosynthese haben können. Die Transportgeschwindigkeit für chemische Signale in

Pflanzen liegt jedoch bei Werten zwischen 50 und 100 cm h-1 (Canny, 1975) und erweist sich

damit als bei weitem zu langsam, um an den Reaktionen der vorliegenden Messungen

beteiligt zu sein.

Im Hinblick auf eine Beeinflussung der photosynthetischen Primärprozesse durch elektrische

Signale konnte die nicht-invasive Bildanalyse der Chlorophyllfluoreszenz zeigen, dass

innerhalb eines Blattes Kurzstreckensignale, welche durch einen Hitzereiz an der Blattspitze

hervorgerufen wurden und sich somit basipetal ausbreiteten, in den Blattadern und in den

Intercostalfeldern einen simultanen, deutlichen Rückgang der Quantenausbeute im

Photosystem II hervorrufen. Im Gegensatz dazu konnte bei Distanzsignalen, an einem unteren

Blatt hervorgerufen und sich somit acropetal zum Messblatt fortpflanzend, eine eindeutige

zeitliche Verzögerung im Rückgang der Quantenausbeute des PSII zwischen sekundären

Blattadern und den sich direkt anschließenden Intercostalfeldern beobachtet werden. Diese

Tatsache lässt darauf schließen, dass sich das Distanzsignal über das Phloem des Stammes

und der Blattadern, welche zuerst reagieren, in das Mesophyllgewebe des Blattes ausbreitet.

Diese Beobachtung unterstützt die mittels Aphidentechnik gemessene Signaltransduktion, die

ebenfalls eine Ausbreitung über das Phloem charakterisierte.

Bei der photosynthetischen Reaktion auf ein elektrisches Signal ist zu vermuten, dass dabei

Veränderungen der Ionenströme innerhalb der Chloroplasten eine beachtliche Rolle spielen

könnten. Für weiterführende Forschungen könnte es also als erfolgversprechend gelten, wenn

ein Hauptaugenmerk auf die Ionentranslokation in den Mesophyllzellen und ihren

Chloroplasten gelegt werden würde. Hinweise auf eine veränderte Enzymtätigkeit als

Reaktion auf signalverursachende Änderungen der Ionenkonzentrationen in der Zellwand, in

Diskussion

91

den Plasmodesmata sowie im Cytoplasma liegen bereits vor (Davies, 1987). Bulychev et al.

(1986, 1987) berichteten bereits in den 80er Jahren von Änderungen der

Chlorophyllfluoreszenz in intakten Chloroplasten als Reaktion auf ein verändertes

Membranpotential. Aus diesen Gründen scheint es wahrscheinlich zu sein, dass der schnellen

Reaktion in der CO2-Aufnahmerate und nachfolgend in der Chlorophyllfluoreszenz in den

Pappelblättern lokale Schwankungen der Ionenkonzentration zugrunde liegen.

Für die Reduktion der Quantenausbeute am PS II wären dabei jedoch Ionenkonzentrations-

änderungen über die Thylakoidmembran hinweg entscheidend. Zieht man dabei die

Membranständigkeit der Chloroplasten in Betracht, so scheint es durchaus möglich zu sein,

dass so deutliche Spannungsänderungen an der Plasmamembran, wie sie bei einem

elektrischen Signal auftreten können, auf die direkt benachbarten Chloroplasten und auch auf

deren Thylakoidmembranen übergreifen könnten.

Anhand von Messungen an isolierten Thylakoidmembranen von Spinat gelang es bereits, eine

direkte Calcium-Abhängigkeit der Photolyse im Photosystem II nachzuweisen (Vrettos et al.,

2001); die Autoren legten dabei die dringend notwendige Präsenz von Calcium für diesen

Vorgang dar. Durch Störungen des intrastromatären Calcium-Gehalts aufgrund von

eintreffenden und auf die Chloroplasten- und Thylakoidmembran überspringenden

elektrischen Signalen, wäre es denkbar, dass die O2 - Bildung aufgrund lokaler Calcium-

Flüsse kurzfristig unterbrochen ist. Dadurch würden der Elektronentransportkette des PS II

die bei der Photolyse freiwerdenden Elektronen fehlen, wodurch die Vorgänge in den

Primärprozessen der Photosynthese gehemmt werden würden. Im intakten System der

Pappelblätter muss dieser Möglichkeit jedoch eine untergeordnete Rolle zugewiesen werden,

da trotz einer Unterbrechung der Photolyse die Elektronen weiterhin auf das PS II eintreffen

würden und in dem Fall, dass sie nicht abtransportiert werden könnten, am Chlorophyll

Schäden anrichten würden. In den vorliegenden Ergebnissen konnte jedoch keine Schädigung

des Chlorophylls beobachtet werden, da es sich um reversible Reaktionen am PS II handelte.

Die ersten Veränderungen in der CO2-Aufnahmerate, und damit in der Dunkelreaktion der

Photosynthese, erfolgten bei einer Verwundung des Blattgewebes an der 3 bis 4 cm zur

Meßküvette entfernten Blattspitze bereits 30 s nach Feuerreizung. Als bemerkenswertes

Phänomen ist im Gaswechsel zu beobachten, dass die stomatäre Leitfähigkeit sich trotz des

transienten Rückgangs in JCO2 nicht verändert. Entgegen der an Mimose beobachteten

Reaktion, dass auf ein elektrisches Signal hin die stomatäre Leitfähigkeit einhergehend mit

dem Abfall in JCO2 rückläufig war (Koziolek et al., 2004), blieb sie in der Pappel trotz

Diskussion

92

ebenfalls rückläufigen JCO2 in etwa auf ihrem Ursprungsniveau. Der Grund, weshalb trotz

steigendem ci-Werte die Stomata nicht schlossen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht

untersucht werden. Aufgrund der generell hohen Öffnungs- und Schließgeschwindigkeit der

Pappel im Allgemeinen und des verwendeten Klons T89 im besonderen (Langer et al., 2003)

kann eine Trägheit des Schließzellenapparates als Ursache jedoch ausgeschlossen werden.

Nach Nobel (1991) sind die in wässriger Lösung vorkommenden Konzentrationen von CO2

temperaturabhängig und pH-sensitiv. Die Temperaturabhängigkeit bestimmt dabei vor allem

die Unterschiede der CO2-Konzentration zwischen der wässrigen Lösung und der

angrenzenden Gasphase, die Gleichgewichtskonzentration zwischen Bicarbonat und gelöstem

CO2 ist hingegen vorwiegend durch den pH-Wert beeinflusst. In der wässrigen Lösung

reagiert CO2 mit OH- und bildet so Bicarbonat, welches wiederum durch das Anhängen eines

Protons einen Kohlensäure-Komplex bilden kann. Die Umwandlung von CO2 zu H2CO3 wird

durch die Aktivität des Enzyms Carboanhydrase deutlich beschleunigt; da in diesem Prozess

Protonen involviert sind, gilt der pH-Wert als bedeutender Faktor der Katalysation (Nobel,

1991). Da die Gleichgewichtskonzentration für Kohlensäure nur etwa 1/400 des gelösten

Kohlendioxids entspricht, liegt bei diesem Vorgang der Schwerpunkt auf der Umwandlung

von CO2 zu Bicarbonat. Der Anstieg des ci-Wertes könnte nun aus Veränderungen des pH-Wertes im Cytoplasma

resultieren. Bei einem durch Hitze induziertem Signal, das wie bereits mehrfach erwähnt, in

seiner Repolarisation sehr träge ist und dadurch ein zeitlich lang anhaltendes Spitzenpotential

vorherrscht, welches seinerseits wiederum mit einem ansteigenden [Ca2+]cyt - Gehalt

einhergeht, könnte sich der intrazellulare pH-Wert deutlich ändern. Bush berichtete bereits

1995 von einer Vielzahl abiotischer und biotischer Stimuli, welche Veränderungen des

cytoplasmatischen Calciumgehaltes bewirkten und dadurch eine Veränderung des

cytoplasmatischen pH-Wertes nach sich zogen (Bush, 1995). Zieht man nun in Betracht, dass

die Aktivität des Enzyms Carboanhydrase stark pH-abhängig ist, könnte man daraus

schlussfolgern, dass die Enzymaktivität durch einen veränderten [Ca2+]cyt - Wert gehemmt

wird. Eine Hemmung der Carboanhydrase hätte zur Folge, dass an den Chloroplasten keine

Rückumwandlung von Bicarbonat in CO2 stattfinden kann. Geht man nun davon aus, dass die

Aufnahmefähigkeit von Bicarbonat im Cytoplasma begrenzt ist, würde sich demnach die

CO2-Konzentration in der Atemhöhle gleichfalls „zurückstauen“, was den Rückgang von JCO2

und damit auch den parallel dazu erhöhten ci-Wert erklären würde.

Diskussion

93

Der Rückgang der Quantenausbeute im PSII als Reaktion auf elektrische Signale ist bereits an

Mimose (Koziolek et al., 2004) und als Reaktion auf diverse abiotische Reize, wie z.B. das

Anlegen eines elektrischen Stroms, an Tomate (Herde et al., 1999) beobachtet worden; bei

den Untersuchungen an Tomate wurde dieser Rückgang jedoch erst nach fünf Stunden

gemessen. Dies steht im deutlichen Widerspruch zu den hier vorliegenden Beobachtungen

eines transienten Rückgangs im PS II, wie auch im JCO2 der Pappelblätter. Auch konnten die

Autoren bei Untersuchungen an der Tomate keinen zeitlichen Unterschied zwischen

Veränderungen im JCO2 und PS II feststellen; die Reaktionen, die mittels

Gaswechselmessungen ebenfalls einen Rückgang in JCO2 zeigten, wurden als zeitlich

übereinstimmend mit den Reaktionen im PS II erkannt.

In den hier dargestellten Ergebnissen an der Pappel wiesen die Photosynthesereaktionen

jedoch in ihrer Kinetik bemerkenswerte zeitliche Differenzen zwischen der Lichtreaktion und

der Dunkelreaktion auf. Im Vergleich zwischen den ersten auftretenden Reaktionen an JCO2

im Gaswechsel und denen der Chlorophyllfluoreszenz ist eindeutig zu beobachten, dass der

Rückgang in JCO2 um mindestens 120 Sekunden schneller einsetzte als der Rückgang der

Quantenausbeute im PS II. Diese Beobachtung konnte sowohl für basipetal gerichtete

Kurzstreckensignale, als auch für acropetal gerichtete Distanzsignale gezeigt werden. Beide

Systeme haben jedoch gemeinsam, dass sie nur für kurze Zeit in ihrem jeweiligen Minimum

verweilen, bevor sie sich wieder in Richtung auf ihren Ausgangswert erholen.

Die genauen Mechanismen, die bei dem Rückgang der Quantenausbeute im PS II über ein

elektrisches Signal ausgelöst werden, müssen erst noch aufgedeckt werden. Wenn man den

oben beschrittenen Gedankengang der Carboanhydrase-Blockierung weiterverfolgt, kommt

man zu der Schlussfolgerung, dass für das Enzym Rubisco im Stroma der Chloroplasten kein

CO2 mehr als Substrat zur Verfügung steht. Daraus folgt, dass im Calvin-Zyklus kein ADP

mehr frei wird. Durch ein Fehlen von ADP wiederum kann an der Thylakoidmembran der

sich ständig aufbauende Protonengradient nicht mehr abgebaut werden, es kommt zu einem

Anstieg des Protonengradienten. Als Reaktion auf einen daraus resultierenden niedrigen pH-

Wert im Thylakoidinnenraum tritt eine Veränderung im Xanthophyllzyklus auf (Schäfer und

Schmid, 1993).

Biotische und abiotische Stressfaktoren wie sehr starke Strahlungsintensität, aber auch

Verwundung und Stromfluss (Herde et al., 1999; Bergantino et al., 2003) konnten bereits als

ausschlaggebende Faktoren charakterisiert werden, die verschiedene Schutzmechanismen an

dem PS II hervorrufen. Ein solcher Schutzmechanismus ist der Xanthophyllzyklus, in

welchem daraufhin durch das Enzym Violaxanthin-Oxidase vermehrt Zeaxanthin über die

Diskussion

94

Zwischenstufe Antheraxanthin auf Kosten von Violaxanthin gebildet wird. Dieser

Mechanismus kann innerhalb weniger Minuten (ab 1,5 Minuten, nach Schäfer und Schmid,

1993) in Kraft treten, ist reversibel und einhergehend mit einem Anstieg des

nichtphotochemischen Quenchings der Chlorophyllfluoreszenz (Bergantino et al., 2003;

Schäfer und Schmid, 1993). Indirekt proportional zum nichtphotochemischen Quenching

verhält sich das photochemische Quenching, welches in den vorliegenden

Fluoreszenzmessungen an Pappelblättern entsprechend rückläufig war. Es resultiert ein

Rückgang der Quantenausbeute am PS II. Neben der zeitlichen Übereinstimmung dieser

Reaktion mit den gemessenen Daten und der beobachteten Reversibilität, sprechen für diese

Reaktion auf elektrische Signale auch Ergebnisse an Tomate, welche auf Verwundung einen

Anstieg von Zeaxanthin auf Kosten von Violaxanthin bestätigen konnten (Herde et al., 1999).

Die Autoren weisen in diesem Zusammenhang darauf hin, dass das Zeaxanthin bei

Stressreaktionen mit Lipiden der Thylakoidmembran interagieren könnte und auf selbige

gleichsam stabilisieren und schützen wirken könnte.

4.2.1 Bedeutung elektrischer Signalleitung für den Baum

Bei der Frage nach den Ursprüngen der pflanzlichen Signalleitung weiß man heute, dass man

die Evolution sehr weit zurückverfolgen muss; bereits Bakterien, die als Vorläufer der

Pflanzen wie auch der Tiere gelten, zeigen auf bestimmte Reize hin präzise elektrische

Aktivitäten entlang ihrer Oberfläche ( Szmelcman und Adler, 1976). An der einzelligen

Grünalge Acetabularia konnten Aktionspotentiale gemessen werden, die vermutlich

osmotische Funktionen haben (Mummert und Gradmann, 1976). Bei den höheren Pflanzen

haben sich im Laufe der Evolution hochspezialisierte und hochsensitive Systeme entwickelt,

die selbst heute noch erstaunen. Eines der berühmtesten dieser Art ist wohl die

Klappbewegung der Venusfliegenfalle. Der lange Weg vom relativ einfachen System des

Bakteriums zu den komplexen höherer Pflanzen war stets geprägt von der bestmöglichen

Anpassung an den Lebensraum. Die ersten Pflanzen benutzten elektrische Signale unter

anderem als Antrieb für Schwimmbewegungen im Wasser und, wie bei Dinoflagellaten, zur

Biolumineszenz. Seit die Pflanzen das Land eroberten nutzen sie ihre latente Erregbarkeit auf

vielfältige Art und Weise, ihre Immobilität zu kompensieren, beispielsweise durch das Öffnen

und Schließen der Stomata oder durch Blattbewegungen, wie bei der Mimose zu sehen.

Diskussion

95

Durch ihr ausgeprägtes vertikales Wachstum mussten Bäume verschiedene Mechanismen

entwickeln, um ihren Wasser- und Nährstoffhaushalt an ihr Wuchsverhalten anzupassen. Die

Differenzierung des Xylem- und des Phloemgewebes aus den cambialen Initialzellen löste

dieses Problem meisterlich. Wie die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, nutzen Bäume

das Phloemgewebe bei weitem nicht nur zum Assimilattransport; vielmehr ermöglicht ihnen

auch dieser spezielle Gewebetyp mit seinen langgestreckten, lebenden Zellen und seinen

typischen Siebporen in den Siebelementen, mittels elektrischer Signale Informationen

innerhalb kürzester Zeit über verschiedene Pflanzenorgane zu übermitteln. Die spezifischen

Reaktionen auf diese „Warnsignale“ sind bei Bäumen noch nicht ausschöpfend geklärt. Im

Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten als baumphysiologische Antwort

Veränderungen in verschiedenen Prozessen der Photosynthese dargestellt werden.

Vergleichbare Untersuchungen an krautigen Pflanzen, wie beispielsweise die Proteinase-

Inhibitor (PIN) - Genaktivierung (Wildon et al., 1992; Rhodes et al., 1996; beide an Tomate),

die auf Phloem - weitergeleiteten elektrischen Signalen basiert, bieten jedoch eine reiche

Inspirationsquelle für weitergehende Untersuchungen der Reaktionen der Bäume auf

elektrische Distanzsignale.

Schlussfolgerung

96

5 Schlussfolgerung

Für die pflanzliche Entwicklung ist eine ausreichende Versorgung mit Calcium dringend

notwendig. Die dargelegten Ergebnisse konnten zeigen, dass sowohl der apoplastische, als

auch der symplastische Calciumgehalt für verschiedene Prozesse in der Pappel limitierend

sein kann. Die Größenordnungen der notwendigen Versorgung gehen dabei allerdings weit

auseinander. Wenn bei der apoplastischen Calciumversorgung in der vorliegenden Arbeit 5

mM Ca2+ als Optimalversorgung angesehen werden, betragen die Konzentrationen für freies

Ca2+ im Cytoplasma nur etwa 0,1 bis 0,2 µM. Bereits dieser Gradient deutet auf eine

grundsätzlich verschiedene Funktion des Nährelements in den verschiedenen Zellbereichen

hin. Wie in dieser Studie gezeigt werden konnte, kommen dem Calcium im apoplastischen

Raum diverse Funktionen zu:

- Es stabilisiert die Mittellamellen und übt somit auf den gesamten Zellverband der

jeweiligen Gewebe eine stützende Funktion aus

- Es nimmt Einfluss auf die Ligninbiosynthese; ob es dabei im Zellwandbereich oder an

der Außenseite der Plasmamembranen verfügbar sein muss, konnte jedoch nicht mit

Sicherheit prognostiziert werden.

- Bei dem intrusiven Spitzenwachstum von Fasern wirkt eine verbesserte

Calciumversorgung wachstumsfördernd.

Auch im Cytoplasma der cambialen Zellen hat die Konzentration an freiem Calcium einen

Einfluss auf die Strukturbildung des sekundären Xylems. Wie die vorliegenden Ergebnisse

zeigen, kann man unter minimierter Calciumversorgung einen allgemeinen Rückgang der

Teilungsrate der Xylemmutterzellen erkennen; der Holzzuwachs sinkt somit rapide. Auch die

unter reduzierter Calcium-Versorgung tendenzielle Rückläufigkeit im Gefäßdurchmesser

könnte auf einen reduzierten [Ca2+]cyt -Wert zurückführbar sein.

Die deutlichsten physiologischen Veränderungen auf einen Rückgang des [Ca2+]cyt -Werts

ließen sich jedoch bei der Signalweiterleitung in den Siebröhren des Phloems feststellen.

Gerade die Untersuchungen an Calcium-verarmten Pappeln ließen für die Signalweiterleitung

den Schluss zu, dass die Richtung, in die sich das Signal fortpflanzt, von entscheidender

Bedeutung für die elektrische Leitfähigkeit der Phloemzellen ist. Die Fähigkeit, elektrische

Schlussfolgerung

97

Signale in ihrer Ausbreitung zu unterstützen könnte durch sich schnell öffnende bzw.

schließende Plasmodesmata sowie Siebporen reguliert werden. Wo Calcium als limitierender

Faktor ins Spiel kommt, scheint die Informationsweiterleitung eines elektrischen Signals nur

noch acropetal zu funktionieren. In Anbetracht der strukturellen und der funktionellen

Übereinstimmungen zwischen Siebporen und Plasmodesmata ist zu vermuten, dass die

elektrische Signalleitung entlang des Phloems für Langstreckensignale optimiert wurde,

wobei in anderen Gewebetypen die elektrische Signalleitung zur Kommunikation über kurze

Strecken von Zelle zu Zelle über Plasmodesmata abläuft (Abb. 5.1).

Abb. 5.1: Schematische Darstellung der elektrischen Signalleitung über kurze und weite Distanzen im

Baum am Beispiel eines typischen Aktionspotentials. Ein Reiz wie z.B. Eiswasser (Stern) induziert einen Ca2+-Einstrom in eine Mesophyllzelle des Blattes (MC). Das Membranpotential depolarisiert

über den Schwellenwert hinaus, so dass sich zunächst Cl--Auswärtskanäle öffnen (Depolarisation) und anschließend K+-Auswärtskanäle (Repolarisation). Die Ausbreitung des induzierten Aktionspotentials erfolgt von Zelle zu Zelle über Plasmodesmata (P) im Rahmen einer Kurzstreckenleitung. Erreicht das

Signal das Phloem, kann es über die Geleitzellen (CC) und deren Plasmodesmata in eine Siebröhre (SE) gelangen und dort bidirektional über weite Distanzen fortgepflanzt werden.

Aufgrund des reich verzweigten Leitbündelsystems ist davon auszugehen, dass viele Reize, wie z. B. Hitze direkt vom Phloem aufgenommen werden und weitergeleitet werden.

Weitere Abkürzung: PA, Parenchymzelle

Schlussfolgerung

98

Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die Signalweiterleitung über das Phloem

schließlich im Mesophyllgewebe des Blattes endet. Die mit leichter zeitlicher Verzögerung

gemessenen transienten Rückgänge in der CO2-Aufnahmerate der Dunkelreaktion und der

Quantenausbeute des Photosystems II lassen darauf schließen, dass die über das Phloem

transportierte Information des Distanzsignals einen Schutzmechanismus des photosynthetisch

aktiven Gewebes in den Blattorganen der Pappel hervorrief. Der Anstieg des

nichtphotochemischen Quenchings, einhergehend mit dem Abfall des photosynthetischen

Quenchings deutet auf eine Veränderung in dem Xanthophyllzyklus als Schutzreaktion hin.

Zusammenfassung

99

6 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der Calcium-Versorgung für die

Holzdifferenzierung und die elektrische Signalleitung an der Pappel untersucht. Dafür

wurden zwei verschiedene Pappelklone, Populus tremula x Populus tremuloides T89 und ein

intraspezifischer Hybrid aus Populus trichocarpa x Populus trichocarpa cv Trichobel, in

Hydrokultur bzw. in Bodensubstrat unter verschiedener Calciumernährung angezogen.

Vergleichende Untersuchungen an unterschiedlich mit Calcium versorgten Pappeln (0 mM,

0,1 mM, 1 mM, 5 mM und 10 mM Calcium) haben gezeigt, dass die Calciumernährung

sowohl die Struktur, als auch die Chemie des gebildeten Holzes erheblich beeinflusst:

- Die cambiale Zone war unter Calcium-Mangel in ihrer radialen Ausprägung deutlich

reduziert; im Vergleich zur Optimalversorgung reduzierte sich die cambiale Zone um

etwa die Hälfte auf drei bis vier Zellreihen in radialer Richtung. Die Ausprägung der

Zellexpansionszone war ebenfalls deutlich rückläufig. Die cambialen Zellen selbst

zeigten unter Calciummangel eine deutliche Limitierung in der Ausprägung ihrer

großen Zentralvakuole; im Gegensatz zur Optimalversorgung konnte unter Calcium-

Mangel ein dichtes Cytoplasma mit vielen kleinen Vakuolen beobachtet werden.

- Die aus den cambialen Xylemmutterzellen sich ausdifferenzierenden Libriformfasern

zeigten einhergehend mit einer reduzierten Calciumversorgung einen signifikanten

Rückgang in der Faserlänge. Chemische Analysen der Holzzellwände konnten zudem

darlegen, dass unter minimierter Calciumversorgung der Anteil an S-Lignin rückläufig

ist; es kann somit von einer Reduktion der Ligninsynthese unter Calcium-Mangel

ausgegangen werden. Bei der Ausprägung der Gefäßquerschnittsflächen wurde unter

abnehmender Calciumversorgung eine Tendenz zu kleineren Durchmessern

deutlich.

- Elementanalysen zeigten eine Zunahme von Calcium im Phloem, Cambium und

Xylem des Stammes mit ansteigender Calcium-Versorgung. Diese Beobachtung zeigte

sich besonders deutlich im Phloem.

Zusammenfassung

100

- Bei saisonalen Untersuchungen im Verlauf einer Wachstumsperiode wurde deutlich,

dass mit abnehmender Calciumversorgung ein Rückgang im Trieblängenwachstum,

im Blattflächenzuwachs sowie im Holzzuwachs einhergeht. Demnach wird die

Biomasseproduktion mit abnehmender Calciumversorgung gehemmt.

Die Untersuchungen zur elektrischen Signalleitung sollten zeigen, ob calciumabhängige

Signale über weite Distanzen im Baum fortgeleitet werden, welches Gewebe dem

Ferntransport dient und ob elektrische Signale einen Einfluss auf die Photosynthese ausüben.

Die Durchführung der elektrophysiologischen Untersuchungen an der Pappel erfolgte mit der

Mikroelektrodentechnik im Mesophyll oder mittels der Aphidentechnik im Phloem. Durch die

Aphidentechnik konnte gezeigt werden, dass die gemessenen elektrischen

Spannungsänderungen über die Plasmamembran der Siebröhren über weite Distanzen

fortgeleitet werden. Bei den Untersuchungen wurde zwischen basipetaler und acropetaler

Signalleitung unterschieden. Dabei wiesen die Reaktionen auf die beiden Reiztypen Eiswasser

und Verwundung durch Hitzereizung sowohl Gemeinsamkeiten als auch signifikante

Unterschiede auf. Die wesentlichen Resultate lassen sich wie folgt zusammenfassen:

- Im Phloem konnten als Reaktion auf Kältereizung mittels Eiswasser in acropetaler

Richtung typische Aktionspotentiale, auf Verwundung von Blattgewebe mittels

Hitzreizung hingegen Variationspotential - ähnliche Signale aufgezeichnet

werden. Dabei unterschied sich die acropetal gerichtete Signalleitung mit einer

Depolarisation der Plasmamembran in den Siebröhren deutlich von der basipetal

gerichteten Signalleitung, die an den Plasmamembranen eine Hyperpolarisation

auslöste. Diese Reaktionen konnten auch für das Mesophyllgewebe bestätigt

werden.

- Unter Calcium-Mangel konnte eine Signalweiterleitung lediglich bei acropetal

gerichteten Distanzsignalen festgestellt werden; die Amplitude der Signale fiel unter

Calcium-Mangel zudem deutlich geringer aus als unter Optimalversorgung. Eine

basipetal gerichtete Signalweiterleitung konnte unter Calcium-Mangel nicht detektiert

werden. Dieser Umstand deutet auf eine Selektivität der Signaltransduktion im

Phloemgewebe der Pappel hin.

Durch Applikation von TEA+, einem Kaliumkanal-Blocker, konnten

hyperpolarisierende Signale eliminiert werden. Aus dieser Feststellung ließ sich

Zusammenfassung

101

folgern, dass ein Kalium-Ausstrom die Hyperpolarisation des Membranpotentials

verursacht.

- Als physiologische Reaktion auf die elektrische Signalleitung konnte in der

Dunkelreaktion der Photosynthese ein transienter Rückgang in der CO2-Aufnahme

festgestellt werden. Diese Beobachtung konnte bei basipetal gleichsam wie bei

acropetal gerichteter Signalweiterleitung in den Blättern gemacht werden. Eine

parallel dazu erfolgende Veränderung in der stomatären Leitfähigkeit konnte jedoch

nicht festgestellt werden. Durch Anlage eines Kälteblocks ließ sich weiterhin zeigen,

dass das elektrische, im Phloem fortgeleitete Signal hierdurch geblockt wird und

anschließend keine Veränderung in der CO2-Aufnahmerate stattfindet. Somit konnte

deutlich gezeigt werden, dass die vorübergehende Reduktion der CO2-Aufnahmerate

durch das elektrische Signal ausgelöst wird.

- Einige Sekunden nach Eintreffen des elektrischen Signals im Blatt zeigte sich

zunächst die Reaktion im Gaswechsel. Anschließend konnte an den Blättern ein

transienter Rückgang der Quantenausbeute des Photosystems II beobachtet

werden. Dieser ging einher mit einem dazu indirekt proportionalen Anstieg des

nichtphotochemischen Quenchings und lässt damit auf eine Veränderung im

Xanthophyllzyklus als Reaktion auf ein elektrisches Signal schließen. Die

Signalweiterleitung konnte bei elektrischen Distanzsignalen in acropetaler Richtung

deutlich als von den Blattadern ins Mesophyllgewebe der Intercostalfelder übergehend

gezeigt werden. Im Gegensatz dazu konnte bei basipetaler Signalleitung innerhalb

eines Blattes gezeigt werden, dass die Quantenausbeute des PS II in Blattadern und

Intercostalfeldern gleichzeitig absinkt, was auf eine simultane Signalleitung über

Plasmodesmata des Mesophylls und des Phloems innerhalb eines Blattes hindeutet.

Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass das Kation Calcium in

Angiospermen mehrere wichtige Funktionen erfüllt. Zum einen ist es in Bäumen in zahlreiche

Prozesse wie z.B. der Gewebestabilisierung, der Zellwandbildung und der

Faserdifferenzierung involviert, zum anderen spielt es auch eine wichtige Rolle bei der

elektrischen Informationsweiterleitung innerhalb von Blattorganen sowie über weite

Distanzen zwischen verschiedenen Blättern.

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Anhang

116

8 Anhang

8.1 Gaswegeplan der Porometers CQP 130:

Abb. 8.1: Gaswegeplan des Porometers CQP 130 zur Messung des Blattgaswechsels an Pappel.

8.2 Reaktion im Gaswechsel auf Hitzereiz an der Blattspitze (Populus trichocarpa) A)

Anhang

117

B)

C)

Anhang

118

D)

E)

Abb. 8.2: A - E Repräsentative Reaktionen der Netto-Photosyntheserate (JCO2) und der stomatären Leitfähigkeit (gH2O) in Pappelblättern auf einen Hitzereiz an der Blattspitze des Messblattes. Der

Zeitpunkt der Reizung ist durch Pfeile gekennzeichnet.

Anhang

119

8.3 Reaktion im Gaswechsel auf einen Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren

Blattes (Populus trichocarpa)

A) Distanz 13,5 cm

B) Distanz 12 cm

Anhang

120

C) Distanz 9 cm

Abb. 8.3: A - C Repräsentative Reaktionen der Netto-Photosyntheserate (JCO2) und der stomatären Leitfähigkeit (gH2O) in Pappelblättern auf einen Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren Blattes hin.

Der Zeitpunkt der Reizung ist durch Pfeile gekennzeichnet.

Anhang

121

8.4 Reaktion im Gaswechsel auf einen Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren

Blattes bei unter Calcium-Mangel angezogenen Pappeln

(Populus tremula x Populus tremuloides)

A) Distanz 7,5 cm

B) Distanz 5 cm

Anhang

122

C) Distanz 10 cm

D) Distanz 5,5cm

Anhang

123

E) Distanz 6,5 cm

Abb. 8.4: A - E Repräsentative Reaktionen der Netto-Photosyntheserate (JCO2) und der stomatären Leitfähigkeit (gH2O) in Pappelblättern auf einen Hitzereiz an der Blattbasis eines unteren Blattes hin.

Die bemessenen Pappeln wurden in Hydrokultur unter minimaler Calciumversorgung (0,1 mM) angezogen. Der Zeitpunkt der Reizung ist durch Pfeile gekennzeichnet.

Anhang

124

8.5 Reaktionen in der Quantenausbeute des Photosystems II auf einen Hitzereiz an

der Blattspitze des Messblattes (Populus trichocarpa)

A)

Anhang

125

B)

Anhang

126

C)

Anhang

127

D)

Abb. 8.5: A - D Repräsentative Reaktionen der Quantenausbeute des PS II auf eine Hitzereizung an der Messblattspitze zum Zeitpunkt 0. Distanz jeweils ca. 4 cm. Gleichzeitiger Abfall im Yield-Wert der Adern und der direkt angrenzenden Intercostalfelder auf das basipetal gerichtete Signal hin. Die

unteren Bilder zeigen die Messflächen der oben dargestellten Graphen.

Anhang

128

8.6 Reaktionen in der Quantenausbeute des Photosystems II auf einen Hitzereiz an

der Blattbasis eines unteren Blattes (Populus trichocarpa)

A)

Anhang

129

B)

Anhang

130

C)

Anhang

131

D)

Abb. 8.6: A - D Repräsentative Reaktionen der Quantenausbeute des PS II auf eine Hitzereizung an der Blattbasis eines unteren Blattes zum Zeitpunkt 0. Distanz jeweils 9 - 13 cm. Reaktionen im Yield-Wert der Adern und der direkt angrenzenden Intercostalfelder auf das acropetal gerichtete Signal hin deutlich zeitlich verzögert (vgl. vergrößerte Darstellung). Die unteren Bilder zeigen die Messflächen

der oben dargestellten Graphen.

Anhang

132

8.4 Standardabweichungen zu den Mittelwerten der Zuwachsmessungen an P.

trichocarpa - Stecklingen während der Wachstumsperiode 2004. Für jede

Variante n = 5.

Calcium - minimiert Calcium - reduziert Calcium - normal

Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN in mm in mm in mm

4,56 0,2 5,15 0,2 5,77 0,84,59 0,3 5,26 0,3 6,12 0,94,60 0,3 5,31 0,2 6,15 0,85,09 0,3 5,80 0,4 6,76 15,32 0,4 6,16 0,4 6,97 0,95,50 0,4 6,61 0,4 7,37 0,95,48 0,7 6,13 0,5 7,12 0,95,57 0,6 6,63 0,5 7,38 1,15,70 0,7 7,15 0,5 7,64 1

Tabb. 8.1: Standardabweichungen zu Mittelwerten des Mitteldurchmesserzuwachses


Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN in cm in cm in cm

8,60 6,82 31,45 11,88 47,34 35,6311,70 9,83 45,45 14,26 63,82 42,2514,10 12,15 53,18 16,82 82,18 53,7118,55 14,78 63,95 24,20 110,88 68,6146,43 33,78 99,10 36,80 124,20 74,2460,53 44,61 114,63 43,12 137,38 64,2672,20 50,19 117,40 50,71 148,98 84,4872,53 49,84 140,05 44,92 163,88 79,6970,67 57,07 135,48 36,21 163,70 83,22

Tab 8.2: Standardabweichungen zu Mittelwerten der Summe aus Terminal- und Seitentrieben


Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN Mittelwerte STABWN in cm² in cm² in cm²

134,63 67,66 625,64 86,50 741,65 327,51144,02 77,45 693,65 83,47 854,26 380,85150,28 83,07 752,59 106,13 947,45 425,25165,94 104,54 770,72 89,30 1040,64 513,02200,37 83,70 852,33 100,15 1052,29 511,08250,47 151,32 929,40 109,09 1052,29 513,58300,56 212,78 1069,94 135,10 1087,24 508,51300,56 212,78 1106,21 148,99 1137,71 563,58346,48 268,66 1178,75 90,07 1215,37 494,01 Tab. 8.3: Standardabweichungen zu Mittelwerten der Blattflächen

Anhang

133

8.8 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Ca2+-Verteilung in benachbarten Zellen........... 3

Abb. 1.2: Schematische Darstellung eines Aktionspotentials an der Plasmamembran

von Chara............................................................................................................... 6

Abb. 1.3: Lichtmikroskopischer Querschnitt durch einen Pappelstamm

im Sommerzustand.................................................................................................. 9

Abb. 2.1: Sterilkultur P. tremula L. x P. tremuloides Michx............................................ 11

Abb. 2.2: Anzucht von P. tremula x P.tremuloides unter verschiedenen

Ca-Regimes in Hydrokultur..................................................................................... 14

Abb. 2.3: Im Freiland angezogene Populus trichocarpa-Pflanzen..................................... 16

Abb. 2.4: Für die Faserlängenmessung mazerierte Holzfasern........................................... 18

Abb. 2.5: Auswertungsbeispiel der energiedispersiven Röntgenspektren

durch Bestimmung des peak : background Verhältnisses........................................ 23

Abb. 2.6: Schematische Darstellung der Membranpotentialmessungen im

Phloem des Blattleitbündels unter Anwendung der Aphidentechnik....................... 25

Abb. 2.7: Pappelblatt, in die Küvette des Porometermeßkopfs eingespannt...................... 26

Abb. 2.8: IMAGING-PAM Versuchsaufbau............................................................................. 29

Abb. 3.1: P. tremula x P. tremuloides in Hydrokultur unter verschiedener

Ca2+-Versorgung angezogen….................................................................................. 30

Abb. 3.2 A-D: P. tremula x tremuloides zu Beginn, nach zwei und

nach sechs Wochen Wachstum in Hydrokultur......................................................... 31

Abb. 3.3: Durchmesserzuwachs von P. trichocarpa während einer

Vegetationsperiode unter verschiedener Ca2+-Versorgung....................................... 34

Abb. 3.4: Trieblängenzuwachs von P. trichocarpa während einer


Abb. 3.5: Blattflächenzuwachs von P. trichocarpa während einer


Abb. 3.6 A-C: P. trichocarpa - Stecklinge im Juli, August und September........................ 36

Abb. 3.7: Relativer Gehalt an Calciumionen im Leitbündel von Pappelblättern................. 38

Abb. 3.8: Relativer Gehalt an Calciumionen im Phloem, im Cambium

und in der Differenzierungszone des Xylems im Stammbereich der Pappel........... 39

Anhang

134

Abb. 3.9: Relativer Gehalt an Calciumionen im Zentralzylinder

und im Cortex der Feinwurzel................................................................................... 40

Abb. 3.10: Wurzelquerschnitt unter 0 mM und unter 5 mM Ca2+....................................... 41

Abb. 3.11: Blattquerschnitt unter 0 mM und unter 5 mM Ca2+........................................... 42

Abb. 3.12: Querschnitt durch Pappelstamm unter 0 mM und unter 5 mM Ca2+................. 43

Abb. 3.13: Veränderungen der Gefäßquerschnittsflächen in Abhängigkeit

des Ca2+-Gehalts....................................................................................................... 44

Abb. 3.14: Abhängigkeit der Faserlänge von der Ca2+-Ernährung...................................... 45

Abb. 3.15: Häufigkeitsverteilung der Gefäßquerschnittsfläche........................................... 46

Abb. 3.16: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur cambialer Zellen............. 48

Abb. 3.17: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur der Blattadern................. 49

Abb. 3.18: Einfluss der Calciumernährung auf die Ultrastruktur der Mesophyllzellen....... 50

Abb. 3.19: Vergleichende Darstellung zweier FTIR-Spektren

von Holzproben im Wellenbereich 4000 cm-1 bis 450 cm-1...................................... 51


von Holzproben im Wellenbereich 1800 cm-1 bis 800 cm-1....................................... 52


von Holzproben im Wellenbereich 1800 cm-1 bis 800 cm-1...................................... 53


von Rindenproben im Wellenbereich 4000 cm-1 bis 450 cm-1.................................... 54

Abb. 3.23: Experimenteller Versuchsaufbau zur Messung der elektrischen Potentiale......... 55

Abb. 3.24: Reizung der Blattspitze von mit Eiswasser.......................................................... 56

Abb. 3.25: Reizung am Spross mit Eiswasser........................................................................ 57

Abb. 3.26: Beispielhafte Darstellung einer Membranpotentialmessung im Mesophyll........ 57

Abb. 3.27: Feuerreiz an der Blattspitze.................................................................................. 58

Abb. 3.28: Feuerreiz an der Blattbasis von Blatt 4................................................................ 59

Abb. 3.29: Beispielhafte Darstellung des Versuchsaufbaus bei

Distanzsignalmessungen im Phloem mit angelegtem Kälteblock.............................. 60

Abb. 3.30: Acropetale Signalleitung nach Feuerreiz mit Kälteblock.................................... 61

Abb. 3.31: Basipetale Signalleitung durch Feuerreizung nach TEA+-Behandlung............. 62

Abb. 3.32: Basipetale Signalleitung nach Feuerreiz an Ca2+-mangelversorgten Pappeln..... 63

Abb. 3.33: Acropetale Signalleitung nach Feuerreiz an Ca2+-mangelversorgten Pappeln..... 63

Abb. 3.34: Schließzellenanatomie von P. tremula x P. tremuloides...................................... 64

Abb. 3.35: EDX-Analyse an Pappelschließzellen.................................................................. 65

Anhang

135

Abb. 3.36: Relative Kalium- und Chloridgehalte der Stomata im

geöffneten und im geschlossenen Zustand............................................................... 66

Abb. 3.37: Einfluss von basipetal gerichteten Kurzstreckensignalen aus Hitzereizung

auf den Blattgaswechsel............................................................................................ 68

Abb. 3.38 : Einfluss von acropetal gerichteten Distanzsignalen aus Hitzereizung

auf den Blattgaswechsel.............................................................................................. 69

Abb. 3.39: Interne CO2-Konzentration bei Kurzstreckensignalen sowie bei

Distanzsignalen aus Hitzereizung............................................................................... 70

Abb. 3.40: Auswirkung eines Kälteblocks auf den Gaswechsel bei acropetal

gerichteten Distanzsignalen aus Hitzereizung............................................................. 71

Abb. 3.41: Einfluss eines acropetal gerichteten Distanzsignals aus Hitzereizung auf

den Blattgaswechsel von normal versorgten Pappeln aus einer Hydrokultur ............ 72

Abb. 3.42: Einfluss eines acropetale gerichteten Distanzsignals aus Hitzereizung auf

den Blattgaswechsel von minimal mit Calcium versorgten Pappeln aus

einer Hydrokultur........................................................................................................ 73

Abb. 3.43: Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute

des PSII auf basipetale Kurzstreckensignale aus Hitzereizung.................................. 75

Abb. 3.44: Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute

des PSII auf acropetale Distanzsignale aus Hitzereizung........................................... 76

Abb. 3.45: Kinetik der Veränderungen in der photosynthetischen Quantenausbeute

des PSII zwischen Blattadern und Intercostalfeldern................................................ 77

Abb. 5.1: Schematische Darstellung der elektrischen Signalleitung im Baum................... 97

8.9 Tabellenverzeichnis


der ersten beiden Versuchsreihen............................................................................... 15


der dritten Versuchsreihe............................................................................................ 15

Tab. 2.3: Auswahl an spezifischen FTIR-Absorptionsbanden und den

entsprechenden funktionellen Gruppen...................................................................... 21

Tab. 4.1: Durchschnittliche Länge cambialer Initialzellen und Xylemfasern

ausgewählter Laubbaumarten...................................................................................... 81

Anhang

136

8.10 Veröffentlichungen

Fromm, J., Rockel, B., Lautner, S., Windeisen, E., Wanner, G. (2003) Lignin distribution in

wood cell walls determined by TEM and backscattered SEM techniques. Journal of Structural

Biology 143: 77-84

Langer, K., Levchenko, V., Fromm, J., Geiger, D., Steinmeyer, R., Lautner, S., Ache, P.,

Hedrich, R. (2004) The poplar K+ channel KPT1 is associated with K+ uptake during stomatal

opening and bud development. The Plant Journal 37: 828-838

Lautner, S., Grams, T.E.E., Matyssek, R., Fromm, J. (2005) Characteristics of electrical

signals in poplar and responses in photosynthesis. Plant Physiology 138: 2200-2209

Fromm, J., Lautner, S. (2005) Characteristics and functions of phloem-transmitted electrical

signals in higher plants. In: Communication in Plants - Neuronal Aspects of Plant Life. F.

Baluska, S. Mancuso, D. Volkmann (Eds.). Springer-Verlag, Heidelberg, im Druck

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Bedeutung der Calcium - Versorgung für die ... · Technische Universität München Lehrstuhl für Ökophysiologie der Pflanzen Department für Ökologie Bedeutung der Calcium - Versorgung