MASARYKOVAKOVA UNIVERZITA

Přírodovědecká fakulta

Ústav biochemie

Nové poznatky z molekulární patologie multiformního glioblastomu a jejich

využití v diagnostické a prediktivní onkologii.

Bakalářská práce

Brno 2009 Jana Nováková

Děkuji touto cestou RNDr. Ondřeji Slabému, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady, které mi

poskytl při tvorbě této bakalářské práce. Dále děkuji Tamaře Šmerdové za pomoc při práci

v laboratoři.

Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Ondřeje

Slabého, Ph.D. za současného použití literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny

citovány v práci a uvedeny v seznamu literatury na konci práce.

V Brně 28. 4. 2009 ...........................................

Jana Nováková

1

Obsah

Seznam použitých zkratek........................................................................................................................4

1. ÚVOD...................................................................................................................................................6

2. TEORETICKÁ ČÁST..........................................................................................................................7

2.1. Klinický úvod.............................................................................................................................7

2.1.1. Historie.......................................................................................................................7

2.1.2. Klasifikace astrocytárních nádorů..............................................................................7

2.1.3. Epidemiologie............................................................................................................8

2.1.4. Diagnostika.................................................................................................................9

2.1.5. Léčba..........................................................................................................................9

2.1.6. Histopatologie..........................................................................................................10

2.2. Molekulární patologie glioblastomu........................................................................................11

2.2.1. EGFR/PTEN/AKT/mTOR dráha.............................................................................11

2.2.2. PDGFR.....................................................................................................................12

2.2.3. Gen DCC..................................................................................................................12

2.2.4. p53/MDM2/p21/p14ARF dráha..................................................................................14

2.2.5. p16INK4a/CDK4/RB1/E2F dráha................................................................................14

2.2.6. Změny na úrovni chromosomů................................................................................15

2.2.7. Methylace promotoru MGMT..................................................................................16

2.2.8. Telomerasová aktivita..............................................................................................16

2.2.9. Cílená terapie............................................................................................................17

2.3. MikroRNA...............................................................................................................................18

2.3.1. Biogeneze a biologická funkce mikroRNA.............................................................18

2.3.2. Význam mikroRNA v onkologii..............................................................................19

2.3.3. Zapojení mikroRNA do signálních drah..................................................................20

2.3.4. Úloha mikroRNA v apoptotických drahách............................................................21

2.3.5. Diagnostický a prediktivní význam mikroRNA v onkologii...................................22

2.4. Úloha mikroRNA v patogenezi glioblastomu..........................................................................24

2.4.1. miR-21......................................................................................................................24

2.4.2. miR-221/222.............................................................................................................26

2.4.3. miR-181a a miR-181b..............................................................................................26

2.4.4. miR-451....................................................................................................................27

2.4.5. miR-124 a miR-137.................................................................................................27

2

2.4.6. miR-7........................................................................................................................28

2.4.7. miR-128....................................................................................................................29

2.4.8. Ostatní mikroRNA s pozměněnými hladinami v glioblastomech............................29

2.5. Kvantitativní zpětná PCR v reálném čase................................................................................31

3. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE..........................................................................................................33

4. MATERIÁL A METODY..................................................................................................................34

4.1. Soubor pacientů........................................................................................................................34

4.2. Izolace a kontrola kvality RNA................................................................................................34

4.3. MikroRNA-specifická reversní transkripce.............................................................................35

4.4. Stanovení exprese vybraných mikroRNA pomocí kvantitativní PCR v reálném čase............36

4.5. Statistické vyhodnocení výsledků............................................................................................36

5. VÝSLEDKY STUDIE........................................................................................................................37

5.1. Srovnání hladin mikroRNA v glioblastomech a nenádorové mozkové tkáni..........................37

5.2. Korelace léčebné odpovědi pacientů na chemoradioterapii s temozolomidem.......................37

6. DISKUSE............................................................................................................................................39

7. SOUHRN............................................................................................................................................41

8. SUMMARY........................................................................................................................................42

Citovaná literatura...................................................................................................................................43

3

Seznam použitých zkratek

CDH kadherin

CDK cyklin dependentní kinasa

cDNA komplementární DNA (complementary DNA)

EGFR receptor pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor)

FGF fibroblastový růstový faktor (fibroblast growth factor)

Gy gray [J.kg-1]

IGFR insulin-like growth factor receptor

JNK c-JunN-terminální kinasa

LOH ztráta heterozygotnosti (loss of heterozygosity)

MAPK mitogenem aktivovaná protein kinasa

MGMT O6- Methylguanin-DNA methyltransferasa

miRNA mikroRNA (microRNA)

MMP matrixová metaloproteinasa

MR magnetická rezonance

mRNA mediátorová RNA

PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

PDGF destičkový růstový faktor (platelet-derived growth factor)

PDGFR receptor pro destičkový růstový faktor (platelet-derived growth factor

receptor)

PI3K fosfatidylinositol-3-kinasa (phosphoinositide 3-kinase)

PIK3CA katalytická alfa podjednotka fosfatidylinositol kinasy (phosphoinositide-3-

kinase, catalytic, alpha polypeptide)

PIP2 fosfatidylinositol bisfosfát (phosphatidylinositol biphosphate)

PIP3 fosfatidylinositol trisfosfát (phosphatidylinositol trisphosphate)

pre-miRNA prekurzorová mikroRNA

pri-miRNA primární transkript mikroRNA

RISC RNA – induced silencing complex

RTK tyrosin-kinasový receptor (receptor tyrosin kinase)

RT-PCR zpětná PCR (reverse transcriptase PCR)

RT/TMZ chemoradioterapie s temozolomidem

S6K S6 kinasa

SDS dodecylsíran sodný

TGFBR receptor pro transformující růstový faktor beta (transforming growth factor

beta)

4

TGF transformující růstový faktor (transforming growth factor)

TNF tumor nekrotizující faktor

TIMP tkáňový inhibitor metaloproteinas

UTR netranslatovaná oblast mRNA (untranslated region)

VEGF vaskulární endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor)

WHO Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)

5

1. ÚVOD

Multiformní glioblastom je nejčastějším typem mozkových nádorů u lidí s incidencí přibližně

3 nemocných (incidence znamená nové případy) na 100 000 obyvatel za rok. Je řazen mezi

astrocytární nádory nejvyššího stupně malignity. V naší studii se budeme zabývat primárním

glioblastomem vyskytujícím se de novo na rozdíl od sekundárního glioblastomu vyvíjejícího se

postupně z astrocytomů nižšího stupně malignity. I přes pokroky v moderní medicíně a komplexní

terapeutický přístup skládající se z chirurgického odstranění tumoru a chemoradioterapie, naprostá

většina pacientů umírá do jednoho roku od stanovení diagnózy.

Navzdory shodné histopatologické charakteristice, můžeme primární glioblastomy odlišit od

sekundárních na základě jejich genetického profilu. Amplifikace genu pro epidermální růstový faktor

je nejčastější genetickou změnou primárního glioblastomu. Naproti tomu sekundární glioblastom je

charakterizován mutací genu pro nádorový supresor p53. Rozdílů v genetickém profilu glioblastomu

ve srovnání s nenádorovou mozkovou tkání a mezi primárními a sekundárními glioblastomy

samotnými je však daleko více.

Jedním z moderních přístupů ve studiu molekulární biologie nádorů je výzkum krátkých RNA

– mikroRNA. MikroRNA (miRNA) jsou jednořetězcové nekódující RNA o délce 18 – 25 nukleotidů

tvořící nedávno objevenou skupinu regulátorů genové exprese, jejichž deregulace byla potvrzena jako

jedna z kauzálních událostí v kancerogenezi mnoha nádorových onemocnění. Jedná se o evolučně

velmi starou skupinu post-transkripčních regulátorů vyskytující se jak u rostlin, tak i u živočichů.

Podle odhadů bioinformatických analýz tvoří miRNA přibližně 3% genů a mají potenciál regulovat asi

třetinu lidských genů. Stále více důkazů svědčí o zásadní roli miRNA v kontrole buněčné proliferace a

přežívání, tedy procesů bezprostředně souvisejících s kancerogenezí. miRNA mohou mít funkci jak

onkogenu, tak i nádorového supresoru v závislosti na charakteru cílových kódujících mRNA. Změny

v expresních profilech miRNA byly pozorovány také u glioblastomů.

Cílem naší studie bylo analyzovat metodou kvantitativní RT-PCR expresi vybraných miRNA

(miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-128a, miR-181a-c), korelovat získaná data s  odpovědí

pacientů léčených chemoradioterapií s alkylačním činidlem temozolomidem a rozšířit tak prediktivní

možnosti onkologie u pacientů s primárním glioblastomem.

6

2. TEORETICKÁ ČÁST

2.1. Klinický úvod

2.1.1. Historie

Glioblastom jako tumor gliálního původu poprvé identifikoval R. Virchow v roce 1863.

Termín glioblastoma multiforme byl zaveden v roce 1914 F. B. Mallorym a pod tímto názvem figuruje

již v první klasifikaci mozkových nádorů z roku 1926 (1).

2.1.2. Klasifikace astrocytárních nádorů

Nádory astrocytárního původu patří mezi neuroepitelové nádory vycházející z mozkové gliální

tkáně. Tato skupina zahrnuje široké spektrum nádorů lišících se mnohými faktory, jako jsou lokalizace

v centrální nervové soustavě, morfologické rysy, výskyt v závislosti na věku a pohlaví, invazivita

růstu, sklon k recidivám, klinický průběh a v neposlední řadě genetické alterace, ke kterým dochází

v nádorových buňkách a podle kterých mohou být jednotlivé typy odlišeny.

Podskupinou astrocytárních nádorů jsou difúzní infiltrativně rostoucí astrocytomy, které tvoří

samostatnou klinicko-patologickou jednotku a mezi něž patří i multiformní glioblastom. Astrocytomy

se dále dělí dle stupňující se malignity na základě histopatologických charakteristik, jako jsou atypie

jader, mitotická aktivita, celularita, vaskulární proliferace a nekrózy. Toto dělení tvoří tzv. „grading“

systém. V současné době je nejrozšířenější klasifikace podle Světové zdravotnické organizace (WHO)

publikovaná v roce 2007 (tab. 1), dalším možným klasifikačním schématem astrocytomů je St. Anne–

Mayo system (1988) (2).

Tabulka 1: WHO „grading“ systém astrocytárních nádorů.

WHO stupeň WHO název kritériaII Difúzní astrocytom Jaderná atypieIII Anaplastický astrocytom Jaderná atypie a mitotická aktivita

IV Glioblastoma multiformeJaderná atypie, mitotická aktivita,

mikrovaskulání proliferace a/nebo nekrózy

Z hlediska klinického, ale i molekulárně-patologického, můžeme glioblastomy dále dělit na

primární, které se vyvíjejí velmi rychle, de novo, bez předchozího nálezu méně maligní formy nádoru

a jakékoliv anamnestické minulosti a glioblastomy sekundární pozvolna se vyvíjející z astrocytomů

nižšího stupně malignity (3).

7

2.1.3. Epidemiologie

Glioblastom je nejčastějším typem mozkových nádorů u lidí. Tvoří 12-15% všech

intrakraniálních nádorů (4). Vyskytuje se u mužů s četností 3 - 4 nových případů na 100 000 obyvatel

za rok. U žen je incidence nových případů nižší, oproti mužům přibližně v poměru 2:3 (5-7).

Daleko častější je primární glioblastom, který činí 60 – 95% onemocnění (4-6). Incidence

astrocytárních nádorů nižšího stupně je ve srovnání se sekundárním glioblastomem přibližně 2 – 3krát

vyšší. To může být vysvětleno částečně tím, že velká část pacientů podlehne astrocytárnímu nádorů

nižšího stupně předtím, než dojde k progresi k sekundárnímu glioblastomu. Některá onemocnění

s velmi rychlou progresí k sekundárnímu glioblastomu mohou být naopak špatně klasifikována jako

primární glioblastom. Navzdory těmto skutečnostem tvoří sekundární glioblastom poměrně vzácné

onemocnění oproti primárnímu glioblastomu (3). Průměrný věk u pacientů s primárním glioblastomem

je 62 let, zatímco u sekundárního typu je to 45 let (5,6).

Primární glioblastom se projevuje po krátké klinické anamnéze ve většině případů (68%)

kratší než 3 měsíce (tab. 2). Průměrná doba od prvních příznaků k histologicky ověřené diagnóze je

6,3 měsíců (5,6). Průměrná doba progrese z anaplastického astrocytomu na glioblastom je přibližně 2

roky, z difúzního astrocytomu je to asi 5let (6).

Tabulka 2: Srovnání incidence, věku, pohlaví, klinické anamnézy a doby přežití u primárního a

sekundárního glioblastomu.

Primární glioblastom Sekundární glioblastom referenceIncidence (na 100 000

lidí za 1 rok)i 3,531 0,199 (3)

Průměrný věk 62 let 45 let (6)Poměr muži/ženy 1,33 0,65 (6)

Klinická anamnéza < 3 měsíce 68%3 – 6 měsíců 16%> 6 měsíců 16%

(průměr 6,3 měsíců)

Z WHO st. II:5,3 roky

Z WHO st. III:1,4 roky

(6)

Doba přežití Medián 4,7 měsíce Medián 7,8 měsíců (5)i Incidence vztažená na evropskou populaci

Průměrná doba přežití pacientů s diagnostikovaným sekundárním glioblastomem je 7,8

měsíců, zatímco u nemocných s primárním glioblastomem je to 4,7 měsíce. Z velké části je tento

rozdíl dán tím, že se sekundární glioblastom vyvíjí v mladším věku a právě věk je významným

prediktivním faktorem doby přežití. S přihlédnutím k tomuto faktoru není v délce přežití u pacientů

s primárním a sekundárním glioblastom významný rozdíl a naprostá většina pacientů podlehne do

jednoho roku (5,6).

8

2.1.4. Diagnostika

Častým prvním klinickým příznakem je epileptický záchvat, následují organický

psychosyndrom a obvykle rychlý rozvoj syndromu nitrolební hypertenze. Ke stanovení diagnózy

slouží především dvě metody. Základní metodou je počítačová tomografie s podáním kontrastní látky.

Její možnosti jsou ovšem limitované. Pro definitivní diagnózu se v současné době nejvíce používá

magnetická rezonance (obr. 1). Mezi moderní metody využívané pro zpřesnění diagnózy patří funkční

magnetická rezonance a pozitronová emisní tomografie (8).

Obrázek 1: Glioblastoma multiforme (MR po podání kontrastní látky)

2.1.5. Léčba

Komplexní terapeutický přístup se skládá z chirurgického odstranění nádoru, chemoterapie a

radioterapie. Cílem chirurgické léčby je co nejradikálnější odstranění nádoru. Úplná resekce většinou

není možná vzhledem k nepřesnému ohraničení nádoru oproti zdravé tkáni, které je dané invazivní a

difúzní povahou růstu. Proto je nezbytné doplnit neurochirurgický výkon adjuvantní léčbou v podobě

chemoterapie a radioterapie. Ozařuje se celý mozek dávkou 2 Gy (5dní/týden) po dobu šesti týdnů.

Současně je podáváno jako chemoterapeutikum alkylační činidlo temozolomid. Ten je podáván

perorálně a po vstřebání spontánně konvertuje v extracelulární tekutině na vlastní cytostaticky aktivní

metabolit – monomethyl triazenoimidazol karboxamid. Proniká do centrální nervové soustavy a v

likvoru dosáhne koncentrace odpovídající 30% plazmatické koncentrace. Mechanismus působení

9

spočívá v methylaci bází kyseliny deoxyribonukleové a následném zabránění replikace DNA a tím

pádem i buněčné proliferaci.

2.1.6. Histopatologie

Glioblastom je tumor s extrémně variabilním histopatologickým nálezem. Jedná se o

anaplastický gliom složený ze špatně diferenciovaných nádorových buněk s výraznou jadernou atypií,

vysokou mitotickou aktivitou, mikrovaskulární proliferací a nekrózami (viz obr. 2). Distribuce těchto

elementů je variabilní, obvykle však větší nekrotické oblasti zabírají centrální části nádoru (až 80%),

zatímco živé nádorové buňky se akumulují na periferii. Velmi častým nálezem je perivaskulární

infiltrace lymfocyty. Mikrovaskulární proliferace se vždy vyskytují v oblasti nekrózy a vedou

k intravaskulární trombóze (1).

Obrázek 2: Histopatologický snímek glioblastomu (převzato z http://commons.wikimedia.org)

Glioblastomy patří mezi gliální nádory, které postrádají pouzdro. Jejich růst má invazivní

charakter. Navzdory faktu, že glioblastom patří mezi nejzhoubnější lidské nádory, nemetastazuje.

Vzácné je šíření buněk likvotvorovými cestami, které může vést k zakládání nových ložisek v CNS

(9). Oproti ostatním nádorům CNS se vyznačuje mimořádnou rychlostí růstu.

10

2.2. Molekulární patologie glioblastomu

Mnoho studií zabývajících se genetickými změnami v nádorových buňkách ukázalo, že

morfologicky různé nádory mají také odlišné genetické profily. Stejně tak je tomu i u gliomů. Difúzní

astrocytomy, anaplastické astrocytomy, primární a sekundární glioblastomy mohou být od zdravé

tkáně a od sebe navzájem odlišeny na základě srovnání klíčových genů podílejících se na vzniku

nádorového bujení.

V procesu transformace normální buňky na nádorovou hrají velmi důležitou roli dva typy

genů, které se účastní regulace buněčného cyklu. Onkogeny, které vznikly mutací z protoonkogenů,

aktivují buněčný cyklus nebo v širším slova smyslu podporují nádorovou transformaci. Aktivační

mutace jsou zpravidla dominantní. Naopak geny označované jako nádorové supresory brzdí buněčný

cyklus a zabraňují nežádoucímu dělení buněk. Jejich inaktivační mutace jsou recesivní. Produkty

těchto genů na sebe působí ve složitých signálních drahách, které v sobě zahrnují desítky až stovky

vzájemně závislých komponent.

Ztráta heterozygotnosti (LOH) 10q je nejčastější změnou jak v primárních, tak i v

sekundárních glioblastomech. Amplifikace genu pro receptor epidermálního růstového faktoru

(EGFR) a mutace nádorového supresoru PTEN jsou genetické alterace typické pro primární

glioblastomy, zatímco mutace genu TP53 je častá genetická změna vedoucí k rozvoji glioblastomu

sekundárního typu (tab. 3). Nejčastější genetické změny vedoucí k primárnímu nebo sekundárnímu

glioblastomu shrnuje obrázek 4.

2.2.1. EGFR/PTEN/AKT/mTOR dráha

Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) patří mezi tyrosin kinasové receptory rodiny

ErbB. K jeho aktivaci dochází po vazbě specifických extracelulárních ligandů, kterými jsou růstové

faktory jako například epidermální růstový faktor (EGF) nebo transformující růstový faktor-α (TGF-

α). Po vazbě ligandu na extracelulární doménu dojde k dimerizaci receptoru a následné

autofosforylaci tyrosinových zbytků na intracelulární doméně. Takto aktivovaný receptor způsobí

aktivaci fosfatidylinositol-3-kinasy (PI3K), která dále fosforyluje membránově vázaný

fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP2) na příslušný trisfosfát (PIP3). PIP3 aktivuje další efektorové

molekuly, jako je AKT (neboli proteinkinasa B) patřící mezi serinové/threoninové proteinkinasy. AKT

působí na další molekuly účastnící se kontroly programované buněčné smrti nebo též působí na úrovni

transkripce jejich genů. Výsledkem této signalizační kaskády je inhibice apoptózy (10). Dále se

účastní regulace buněčného cyklu, metabolismu a angiogeneze. Jednou z molekul, kterou AKT

aktivuje je mTOR („mammalian target of rapamycin“). Výsledkem regulačního účinku mTOR je

posílení buněčného růstu, proliferace, angiogeneze a produkce růstových faktorů. Fosfatasa PTEN

(phosphatase and tensin homolog) defosforyluje PIP3, tím jej inaktivuje a negativně tak reguluje dráhu

AKT (viz obr. 3). Gen PTEN, kódující příslušný protein, se nachází na chromosomu 10q23.3 (3).

11

Tato signální dráha hraje klíčovou roli ve vývoji primárního glioblastomu. V 63% primárních

glioblastomů byla identifikována alespoň jedna změna v genech EGFR, PTEN nebo PIK3CA

(katalytická alfa podjednotka PI3K), což bylo signifikantně více oproti sekundárním glioblastomům,

kde se tyto změny vyskytovaly u 31% (p < 0,001) případů (11). Zvýšená exprese genu EGFR se

nachází u více než 60% primárních glioblastomů, zatímco pouze u 10% sekundárních glioblastomů

(12). Amplifikace genu EGFR se vyskytuje u 36% primárních glioblastomů, ale pouze u 8%

sekundárních glioblastomů (5). Všechny primární glioblastomy s amplifikovaným EGFR vykazují

zvýšenou expresi EGFR, ale jen 70 – 90% primárních glioblastomů se zvýšenou expresí EGFR

vykazuje zároveň i amplifikaci tohoto genu (13). Amplifikace genu EGFR koreluje s věkovým

rozložením pacientů s primárním glioblastomem. Amplifikace tohoto genu nebyla detekována u

pacientů mladších 35 let (5). Přítomnost amplifikace EGFR je často spojena také s mutacemi tohoto

genu. Nejčastější mutací je delece exonů 2 až 7, tzv. varianta 3 (EGFRvIII). Takto mutované receptory

se fosforylují nezávisle na extracelulárních ligandech a dochází tak k nepřetržité aktivaci receptoru,

což má za následek zvýšenou mitogenní aktivitu buněk. Tato mutace se vyskytuje pouze

v glioblastomech, kde je zároveň přítomna amplifikace běžně se vyskytujícího genu EGFR (14). Gen

PTEN je mutován v 25 – 35% glioblastomů (15,16), téměř výhradně se jedná o primární typ (5).

2.2.2. PDGFR

Receptor pro destičkový růstový faktor (PDGFR) je dalším transmembránovým receptorem

působícím na pochody v buňce mimo jiné prostřednictvím dráhy PI3K/AKT. Tvoří jej dva typy

receptorů PDGFR α a β. Jeho ligandem je růstový faktor PDGF, vyskytující se v pěti modifikacích

v závislosti na kombinaci řetězců. Vazbou ligandů dojde k homodimerizaci nebo heterodimerizaci

receptoru (1). PDGFR je zapojen do molekulárních mechanismů angiogeneze. Amplifikace genu pro

PDGFR α byla zjištěna u méně než deseti procent, zatímco zvýšená exprese PDGFR až u jedné

čtvrtiny glioblastomů (17). Zvýšená exprese PDGFR a jeho ligandu je asociována se ztrátou genu pro

nádorový supresor TP53, charakteristickou pro sekundární glioblastom (viz níže) (18).

2.2.3. Gen DCC

Gen DCC (deleted in colorectal carcinoma) se nachází na chromosomu 18q21.3 a kóduje

protein působící jako transmembránový receptor na povrchu buněk. V nervovém systému je

exprimován ve velkém množství. Jeho ligandem jsou netrin-1 a heparin. Oproti většině

membránových receptorů vysílá DCC signál do buňky i v nepřítomnosti ligandu netrinu-1. V případě,

že je ligand navázán na receptor, je vyslán signál do buňky, který může vést k  proliferaci buňky nebo

migraci. Pokud není přítomen ligand, signál indukuje apoptózu a zástavu buněčného cyklu

v kontrolním bodě G2.

Exprese DCC klesá v průběhu progrese od astrocytomů nižšího stupně po glioblastomy

(19,20). Také je patrný výrazný rozdíl mezi primárními a sekundárními glioblastomy. Zatímco ztráta

12

exprese DCC se u primárních glioblastomů vyskytovala s četností 23%, u sekundárních to bylo 53%.

Z toho vyplývá, že inaktivace DCC hraje roli v pozdní fázi progrese astrocytomů a je součástí cesty

k sekundárnímu glioblastomu (20).

Obrázek 3: Hlavní signální dráhy účastnící se patogeneze  glioblastomu (upraveno podle Ohgaki a

Kleihues (3))

13

2.2.4. p53/MDM2/p21/p14ARF dráha

Gen TP53 se nachází na chromosomu 17p13.1. Jeho produktem je nádorový supresor p53,

který funguje jako transkripční faktor a hraje významnou roli v regulaci buněčného cyklu, apoptózy a

angiogeneze. TP53 je aktivován v odpovědi na poškození buněčné DNA a jeho produkt spouští

transkripci celé řady genů vedoucích k zástavě buněčného cyklu a indukci apoptózy, například genu

p21. Protein p21 se váže na další molekuly - cyklin-dependentní kinasy - důležité pro přechod z G1

do S fáze buněčného cyklu, tím je inaktivuje a zastavuje tak buněčný cyklus. Jako negativní zpětnou

vazbou indukuje protein p53 transkripci genu MDM2. MDM2 se váže na p53 a inhibuje tím jeho

transkripční aktivitu. Protein p14ARF produkovaný příslušným genem se váže na MDM2 a tím inhibuje

jeho funkci vázat se na p53 (obr. 3). Z toho vyplývá, že ztráta normální funkce proteinu p53 může být

způsobena nerovnováhou vyvolanou deregulací kteréhokoli z genů TP53, MDM2, nebo p14ARF (3).

Dráha proteinu p53 hraje významnou roli ve vývoji sekundárního glioblastomu. Mutace genu

TP53 se vyskytuje u dvou třetin difúzních astrocytomů, anaplastických astrocytomů a z nich se

vyvíjejících sekundárních glioblastomů (5,12). Mutace tohoto genu se objevuje také u primárních

glioblastomů, ale s výrazně nižší frekvencí (5). Bylo zjištěno, že u více než poloviny mutovaných

TP53 genů sekundárních glioblastomů byla změna lokalizována na kodonech 248 a 273, zatímco

mutace tohoto genu u primárních glioblastomů se nacházela rovnoměrně na všech exonech. Tato

odlišnost naznačuje, že mutace TP53 je časnou genetickou změnou vedoucí k vývoji sekundárního

glioblastomu, zatímco málo specifická mutace u primárních glioblastomů může být následkem

celkové genetické nestability nádoru (5).

Amplifikace genu MDM2 se vyskytuje u méně než 10 % glioblastomů a to výhradně

v primárních glioblastomech, které nemají mutovaný gen TP53 (21). Zvýšená exprese proteinu

MDM2 je registrovatelná u více než 50% primárních glioblastomů nezávisle na amplifikaci

příslušného genu. Je tedy schopný uniknout regulaci proteinem p53 (22). K zastavení exprese genu

p14ARF dochází methylací promotoru nebo homozygotní delecí tohoto genu. Methylace promotoru

p14ARF je častější u sekundárních glioblastomů, nicméně četnost těchto změn u jednotlivých typů

glioblastomu není statisticky významná. Ztráta exprese proteinu p14ARF byla zjištěna u 76%

glioblastomů (23).

2.2.5. p16INK4a/CDK4/pRb/E2F dráha

Produktem genu RB1 (retinoblastoma 1) je protein pRb, který kontroluje přechod buněčného

cyklu z G1 do S fáze. pRb je konečným cílem kinasové aktivity komplexu CDK4/CDK6-cyklin D.

Fosforylovaný pRb uvolní transkripční faktor E2F, na který byl navázán. E2F potom aktivuje geny

nutné pro průběh buněčného cyklu. Protein p16INK4a se váže na CDK4 a tím inhibuje komplex nutný

pro aktivaci pRb (obr. 3). Z toho vyplývá, že ztráta funkce pRb může být zapříčiněna změnou exprese

kteréhokoli z genů RB1, p16INK4a nebo CDK4 (3).

14

Homozygotní delece genu p16INK4a byly častější u primárních glioblastomů, nicméně celková

frekvence změn (methylace promotoru a homozygotní delece) se u jednotlivých typů glioblastomu

nelišila (23). Methylace promotoru genu RB1 byla častější u sekundárních glioblastomů (43%) než u

primárních (14%). Tento jev koreloval se ztrátou exprese proteinu pRb. U astrocytomů nižšího stupně

nebyla methylace promotoru genu RB1 detekována. Což značí, že k této mutaci dochází až v pozdější

fázi vývoje sekundárního glioblastomu (24).

2.2.6. Změny na úrovni chromosomů

LOH 10q je nejčastější genetickou změnou objevující se jak v primárních, tak v sekundárních

glioblastomech s podobnou frekvencí (60 – 80%) (3,5). LOH 10p se vyskytuje daleko častěji u

primárních glioblastomů a také celková ztráta chromosomu 10 je typická pro primární glioblastom.

Byla identifikována často deletovaná místa na chromosomu 10 (jedním z nich je 10q23-24, které je

lokusem pro gen PTEN), což naznačuje, že se zde mohou nacházet nádorové supresory, které mohou

hrát roli v patogenezi glioblastomů. Častá je rovněž delece v oblasti 10q25-qter. Zde se nachází

několik genů, suspektních nádorových supresorů, jejich funkce v patogenezi glioblastomu však zatím

není známa a jejich mutace byly v glioblastomech detekovány jen vzácně (3).

LOH 22q je daleko častější u sekundárních glioblastomů (82%) než u primárních (41%) (25),

objevuje se nicméně u gliomů všech stupňů. Také v tomto místě se předpokládá existence genů pro

nádorové supresory, které hrají roli v časných stádiích astrocytárních nádorů.

LOH 19q se vyskytuje častěji u sekundárních glioblastomů (54%) než u primárních (6%),

stejně tak LOH 13q byla častější u sekundárních glioblastomů a delece zahrnovala lokus pro RB1 (26).

Obrázek 4: Genetické změny vedoucí k primárnímu a sekundárnímu glioblastomu.

15

DIFÚZNÍ ASTROCYTOM

WHO st. II

Astrocyt nebo prekurzorová kmenová buňka

PRIMÁRNÍ GLIOBLASTOM

↑ exprese EGFR ↑ exprese MDM2

Mutace PTENLOH 10qLOH 10p

WHO st. IV

ANAPLASTICKÝ ASTROCYTOM

WHO st. IIISEKUNDÁRNÍ

GLIOBLASTOMMutace TP53

↑ exprese PDGFRMethylace promotoru

MGMTLOH 10q LOH 22q

WHO st. IV

2.2.7. Methylace promotoru MGMT

O6-Methylguanin-DNA methyltransferasa (MGMT) je reparační protein, jež dokáže opravovat

poškozenou DNA, ve které došlo k alkylaci guaninu v pozici O6 . Opravuje tak chyby způsobené

cytostatiky účinkujícími na bázi alkylačních činidel. Methylace promotoru genu pro MGMT, jejímž

důsledkem dochází k zastavení exprese tohoto genu, byla zjištěna u 75% sekundárních glioblastomů a

36% primárních glioblastomů (27).

Cytotoxická funkce chemoterapeutika temozolomidu, běžně používaného k léčbě pacientů

s glioblastomem, spočívá právě v alkylaci DNA a navození apoptózy tímto mechanismem. Naopak

MGMT dokáže takto poškozenou DNA reparovat. Bylo zjištěno, že u pacientů s glioblastomem,

jejichž nádorové buňky vykazovaly methylaci promotoru MGMT, léčba temozolomidem signifikantně

prodloužila délku života ve srovnání s pacienty s nemethylovaným promotorem (28). Methylační

status promotoru MGMT je proto jedním z potenciálních prediktivních faktorů odpovědi na léčbu

temozolomidem u pacientů s glioblastomem.

Tabulka 3: Frekvence genetických změn v primárních a sekundárních glioblastomech

Genetické změnyPrimární glioblastom

Sekundární glioblastom

Reference

Mutace TP53 28% 65% (5)Amplifikace EGFR 36% 8% (5)Mutace PTEN 25% 4% (5)Delece p16INK4a 31% 19% (5)LOH 10q 70% 63% (5)LOH 10p 47% 8% (29)LOH 22q 41% 82% (25)LOH 19q 6% 54% (26)Methylace promotoru RB1 14% 43% (24)Methylace promotoru MGMT 36% 75% (27)↑ exprese EGFR 63% 10% (12)↑ exprese MDM2 52% 11% (22)↑ exprese PDGFR 24% (17)Ztráta exprese DCC 23% 53% (20)Ztráta exprese p14ARF 76% (23)Telomerázová aktivita 62% (28)

2.2.8. Telomerasová aktivita

Telomerasa je neobvyklý ribonukleoprotein, který syntetizuje telomery. Telomery jsou dlouhé

opakující se sekvence DNA ("TTAGGG"), které pomáhají udržet genetickou stabilitu chromosomů. V

lidském organismu pouze zárodečné buňky vykazují telomerasovou aktivitu. Normální zralé

somatické buňky tuto schopnost postrádají. Telomery se s každou replikací zkracují, až dojde buňka

16

do stavu, že už se dále nemůže replikovat, přechází do stadia senescence a umírá v  procesech

spojených s proteiny, jako jsou pRb, p53, p21 a jiné. Nádorové buňky mohou dosáhnout v jistém

smyslu „nesmrtelnosti“ právě aktivací telomerasy, resp. její katalytické podjednotky hTERT. Bylo

zjištěno, že navzdory převažujícímu trendu, kdy methylace promotoru určitého genu způsobí jeho

vyřazení z funkce, hypermethylace promotoru hTERT naopak expresi tohoto genu aktivuje a tím může

aktivovat i funkci telomerasy (30).

62% glioblastomů vykazovalo telomerasovou aktivitu. U sekundárních glioblastomů byla tato

aktivita výrazně častější, což korelovalo s mutací genu TP53 (28).

2.2.9. Cílená terapie

Molekula mTOR hraje klíčovou úlohu v metabolismu buňky, proliferaci, kontrole buněčného

cyklu, angiogenezi a apoptóze. Z těchto důvodů je tato molekula zkoumána jako potenciální

terapeutický cíl při vývoji cílené biologické léčby. V nádorové buňce by mohlo blokování této

molekuly způsobit inhibici exprese genů řídících buněčný cyklus a inhibovat angiogenní růstové

faktory, potřebné k přežívání buněk v nádorové tkáni. Nejslibněji se zatím jeví kombinovaná inhibice

mTOR a PI3K pomocí preparátu PI-103 (31).

Vazba ligandu na EGFR způsobuje nejen aktivaci PI3K/AKT dráhy (viz výše), ale také

RAS/MAPK signální dráhy (obr. 3). U glioblastomů není malý G-protein RAS přímo cílem mutací,

k nadměrné stimulaci této signální dráhy dochází hyperaktivací EGFR (32). Funkcí dráhy

RAS/MAPK je kontrola proliferace buněk, diferenciace, adheze, migrace a apoptózy. Již byly

provedeny první klinické pokusy s inhibitory kinasy EGFR (erlotinibem a gefitinibem) na pacientech

s maligními gliomy (31). RAS protein je posttranslačně modifikován připojením lipidových skupin,

tzv. prenylací. Cílená terapie změřená na RAS protein spočívá v inhibici farnesyltransferasy, enzymu

nezbytnému pro proces prenylace (31).

Každý nádor větší než 2 mm3 je závislý na vytvoření cévní sítě, která jej zásobuje kyslíkem a

živinami. Exprese vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF), klíčového pro proces

angiogeneze, vzrůstá se zvyšujícím se stupněm malignity gliomu. U 32 % glioblastomů byl

radiograficky pozorován efekt působení bevacizumabu, monoklonální protilátky proti proteinu VEGF,

v kombinaci s inhibitorem topoisomerasy I irinotecanem (33). Dalšími možnými cílovými molekulami

nové terapie mohou být receptory pro PDGF, VEGF a IGF, proteinkinasa C a jiné (31).

V posledních 5-ti letech došlo k prudkému rozvoji nové tzv. cílené léčby nádorových

onemocnění. První generace testovaných cílených léčiv nevykazovala plošně u pacientů významný

přínos (31). Nicméně pacienti, u kterých by se prokázala specifická genetická změna v buňkách

nádoru, na kterou je léčivo zacílené, by z této léčby mohli mít užitek. Nejdůležitější podmínkou cílené

léčby je právě vytipování těch pacientů, u kterých bude mít léčba efekt. Potom by mohl být každý

pacient léčen na základě vlastního genetického profilu.

17

2.3. MikroRNA

Jedním z dalších možných biomarkerů s potenciálním diagnostickým a prediktivním

významem jsou mikroRNA (miRNA). Jedná se o krátké (přibližně 20-25 nukleotidů) nekódující

jednořetězcové RNA podílející se na post-transkripční regulaci genové exprese. Právě schopnost

ovlivňovat translaci onkogenů a nádorových supresorů je předurčuje k zapojení do procesu

kancerogeneze. Poprvé byla miRNA lin-4 popsána v roce 1993 u hlísta Caenorhabditis elegans (34).

V roce 2001 byly miRNA poprvé pozorovány také u savců. V současné době bylo jen u člověka

objeveno již přes 700 různých miRNA (35). Podle bioinformatických analýz tvoří geny kódující

miRNA asi 3% lidského genomu a mají potenciál regulovat přibližně jednu třetinu lidských genů (36).

Mezi těmito geny mohou být jak nádorové supresory a onkogeny, tak geny kontrolující buněčný

cyklus, apoptózu, nádorovou invazivitu nebo lékovou rezistenci.

2.3.1. Biogeneze a biologická funkce mikroRNA

Geny pro miRNA jsou rozmístěny na všech chromosomech kromě mužského Y. Přibližně

50% miRNA genů se nachází na fragilních částech chromosomů, jejichž ztráta nebo amplifikace je

často detekována u nádorových onemocnění (37). Více než polovina miRNA genů se nachází v oblasti

intronů jiných definovaných transkripčních jednotek (38).

Biogeneze miRNA z prekurzorových molekul je několikastupňový proces (viz obr. 5). Geny

pro miRNA jsou transkribovány pomocí enzymu RNA polymerasy II. Vznikají tak primární

trankripty (pri-miRNA), které jsou dlouhé i několik kilobází a obsahují vlásenkovou strukturu. Tak

jako mediátorová RNA (mRNA), je pri-miRNA polyadenylována na 3’ konci, má čepičku na 5’ konci

a může podléhat sestřihu. Tato pri-miRNA je v jádře dále zpracovávána enzymovým komplexem

skládajícím se z RNasy III zvané Drosha a  dvouřetězcovou RNA vázajícím proteinem Pasha (neboli

DGCR8). Z pri-miRNA tak vzniká pre-miRNA o délce asi 70 nukleotidů vytvářející nedokonalé

vlásenkové struktury (34,36). Ta je poté exportována z jádra do cytoplasmy pomocí transportního

proteinového komplexu exportinu 5, kde podléhá štěpení další RNasou III označovanou jako Dicer.

Ten tvoří z pre-miRNA finální miRNA duplexy dlouhé přibližně 22 bází. Jedno z vláken je ihned

degradováno, zatímco druhé je inkorporováno do multiproteinového komplexu RISC (RNA – induced

silencing complex), jehož centrální část tvoří proteiny rodiny Argonaute (u lidí AGO1, AGO3 a

AGO4) (36). RISC komplex s konkrétní miRNA se váže na cílovou mRNA a znemožňuje její translaci

(viz obr. 5). Podle nových poznatků je tento děj v cytoplasmě lokalizován v tzv. P – tělíscích

(„processing bodies“), ve kterých může být mRNA uchována nebo degradována pomocí exonukleas

(39).

Regulace hladin miRNA je uskutečňována více mechanismy. Maturace miRNA může být

znemožněna ve všech fázích jejího vývoje. Většina mechanismů regulace hladin miRNA je specifická

pro konkrétní miRNA. Některé principy již byly popsány, nicméně spousta jich zatím zůstává skryta.

18

Mezi známé mechanismy patří vazba jaderných nukleoproteinů na pri-miRNA umožňující zpracování

enzymem Drosha, editace pri- a pre-miRNA (zejména konverze nukleotidů A na I), přítomnost

inhibičních proteinů, změněné hladiny enzymů Drosha a Dicer a také byla prokázána souvislost

regulace hladin miRNA ve spojení se signální dráhou růstového faktoru TGF-β (34).

Mechanismus post-transkripční regulace miRNA závisí na míře její komplementarity s cílovou

sekvencí. Pokud je tato vazba dokonale komplementární, dochází k jevu zvanému RNA interference,

kdy je cílová mRNA degradována ribonukleasami nacházejícími se v RISC komplexu (40). miRNA se

váže na kódující sekvenci nebo v oblasti otevřeného čtecího rámce. Tento mechanismus se uplatňuje

převážně u rostlin. Naopak u živočichů není funkce miRNA spojená s degradačními procesy. Zde se

miRNA váže na nedokonale komplementární sekvence nacházející se v netranslatovaných oblastech

(UTR) cílových mRNA. Dříve se předpokládalo, že se miRNA váže pouze na 3’ UTR, nyní je známo,

že k vazbě může dojít i na 5’ UTR (34). Znemožnění translace mRNA je pravděpodobně způsobeno

inhibicí iniciace tohoto procesu (34). Tento mechanismus je tedy doprovázen poklesem hladiny

kódovaného proteinu, zatímco hladina cílové mRNA není ovlivněna (36). Již byl popsán případ, kdy

vazba miRNA měla opačný efekt - indukci translace cílové mRNA (41), nicméně tento mechanismus

je vzhledem k dosavadním poznatkům považován za výjimku.

Mechanismus nedokonale komplementární vazby umožňuje každé jednotlivé miRNA

inhibovat translaci více cílových mRNA. Pomocí bioinformatických algoritmů lze předpovědět cílové

mRNA pro danou miRNA. Na základě výpočtu termodynamické stability vznikajícího duplexu a

sekvenční konzervativnosti vazebné oblasti dané mRNA je možné posléze vyjádřit míru

pravděpodobnosti vzniku jejich vzájemného regulačního vztahu (40). Funkční studie působení miRNA

byly provedeny pouze pro malou skupinu proteinů, část z nich souvisí s procesem kancerogeneze.

2.3.2. Význam mikroRNA v onkologii

miRNA jako post-transkripční regulační faktor ovlivňuje celou řadu dějů v buňce, mezi které

patří buněčná proliferace, diferenciace, buněčné přežívání a apoptóza (36). Všechny tyto procesy

bývají v nádorových buňkách narušeny. Mnoho studií již prokázalo významné rozdíly v expresi

miRNA v buňkách nádorové tkáně oproti tkáni normální (42). Z analýzy  expresního profilu 228

miRNA v šesti různých typech solidních nádorů byla vybrána skupina 21 miRNA, jejichž exprese byla

změněná ve většině zkoumaných typů nádorů (43).

Molekuly miRNA můžeme rozdělit na základě jejich cílových mRNA na miRNA

s charakterem onkogenu a miRNA s charakterem nádorového supresoru (viz obr. 5). miRNA

s charakterem onkogenu budou reprimovat translaci nádorových supresorů. Hladina těchto miRNA

bude v nádorových buňkách zvýšena, což zapříčiní snížení hladiny nádorových supresorů v buňce.

Naopak hladina miRNA s charakterem nádorového supresoru, reprimující translaci onkogenů, bude

v nádorových buňkách snížena (36).

19

Obrázek 5: Biogeneze a možné biologické funkce miRNA. (převzato ze Slabý et al. (40))

2.3.3. Zapojení mikroRNA do signálních drah

Jedním z významných představitelů miRNA s funkcí nádorového supresoru je rodina miRNA

označovaná jako let-7 negativně regulující onkogeny RAS, CDK 6 a cyklin D. Snížení její exprese má

za následek zvýšení hladiny těchto onkogenů, což vede k nekontrolované proliferaci buněk (44).

Mezi miRNA ,jejichž exprese je snížená v nádorových buňkách, patří také miR-143 a miR-

145. Bylo zjištěno, že hladiny příslušných prekurzorových miRNA však ovlivněny nebyly. Je tedy

patrné, že  deregulace je zapříčiněna až v některé fázi maturace těchto miRNA (45). Cílovou

molekulou miR-143 je jedna z mitogenem aktivovaných proteinkinas (MAPK) ERK5, která je součástí

signální dráhy RAS/MAPK (viz obr. 3). ERK5 působí jako transkripční faktor mnoha dalších genů

účastnících se kontroly buněčného cyklu, proliferace a buněčného přežívání, mezi něž patří onkogen

20

MYC. Cílovými molekulami miR-145 jsou pravděpodobně jiné MAPK (45). Transfekce těchto

miRNA do vybraných buněčných linií odvozených od kolorektálního karcinomu signifikantně

inhibovala jejich proliferaci (45).

Skupina sedmi miRNA-17-92, jejichž geny se nacházejí v oblasti 13q31.3, je transkripčně

aktivována onkogenem MYC. MYC indukuje také transkripci onkogenu E2F1, se kterým vytváří

pozitivní zpětnou vazbu. Právě E2F1 je však reprimován některými miRNA z této skupiny, konkrétně

miR-17-5p a miR-20a (viz obr. 6). Jejich onkogenní funkce je dána skutečností, že v případě

neregulované hyperaktivace E2F1 se jeho proliferační signál mění na signál apoptotický a dochází

k buněčné smrti (42).

Další miRNA spojenou s onkogenem MYC je miR-155. Její pri-miRNA byla původně

identifikována jako BIC (B-cell integration cluster), transkript odvozený od inzerčního místa retroviru

u buněk lymfomů indukovaných virem ptačí leukózy, kde byl schopen přes onkogen MYC akcelerovat

tvorbu lymfomů. Až stonásobně zvýšená exprese miR-155 byla zjištěna u některých lymfoidních

malignit a také u nádoru plic. Naopak snížená exprese byla detekována u nádorů slinivky (46).

Zvýšené hladiny miR-372 a miR-373 byly detekovány v buněčných liniích germinálních

tumorů varlat. Tyto miRNA mají schopnost zabránit senescenci buněk indukovanou proteinem p53

v odpovědi na inadekvátní signalizaci RAS proteinu. Mechanismus jejich onkogenního působení

spočívá pravděpodobně v inhibici nádorového supresoru LATS2, který zprostředkovává inhibici

CDK2 indukovanou proteinem p53. Inhibicí CDK2 dochází k zastavení buněčného cyklu. Zajímavá je

skutečnost, že u miR-373 byla prokázána pro miRNA ojedinělá schopnost indukovat translaci

kadherinu CDH1 vazbou na promotor (41). Nezávislá studie zkoumající expresní profil této molekuly

v germinálních tumorech varlat detekovala zvýšené hladiny tohoto kadherinu v séru korelující se

stupněm malignity tohoto nádorového onemocnění (47). Možné vysvětlení spočívá právě ve

schopnosti miR-373 indukovat translaci CDH1 a deregulaci její hladiny během vývoje tohoto

onemocnění.

Rodina miR-34a až c je pod přímou transkripční kontrolou proteinu p53. Ektopická exprese

těchto miRNA je schopna indukovat zastavení buněčného cyklu v primárních i nádorových buněčných

liniích, fungují tedy jako nádorové supresory. Tyto miRNA jsou zapojeny do apoptotických signálních

drah spojených s proteinem p53 (48).

2.3.4. Úloha mikroRNA v apoptotických drahách

Apoptóza buňky může být indukována extracelulárním signálem přes vazbu ligandu na

receptor smrti, tzv. FAS – receptor. Tím dojde k aktivaci prokaspasy-8, kterou zprostředkovává

adaptorový protein FADD (viz obr. 6). Následně je iniciována kaspasová kaskáda, jejímž důsledkem

je programovaná smrt buňky zapříčiněná štěpením buněčných proteinů efektorovými kaspasami (10).

21

Obrázek 6: Zapojení vybraných miRNA do typických signálních apoptotických drah. (převzato

ze Slabý et al. (40))

Pokud jsou buňky narušeny nebo ve stresových podmínkách, může být apoptóza vyvolána

vnitřním signálem buňky, tzv. mitochondriální cestou (viz obr. 6). Elektronový přenašeč cytochrom c,

který se nachází na vnitřní membráně mitochondrií, je uvolněn do cytosolu. Zde aktivuje adaptorový

protein Apaf-1, který následně aktivuje prokaspasu-9, tím je vyvolána kaspasová kaskáda, která má

stejný efekt jako při extracelulární aktivaci (10). Protein p53 se účastní aktivace této dráhy jako

transkripční faktor proapoptotických genů, mezi něž patří gen pro protein BAX, nezbytný k uvolnění

cytochromu c z mitochondrie. Aktivita proteinu BAX je inhibována antiapoptickým proteinem BCL2

(40). Cílem regulačních aktivit miR-15a a miR-16-1 je právě tento onkogen (49), řadíme je tedy mezi

miRNA s charakterem nádorového supresoru. U pacientů s chronickou lymfatickou leukémií byla

přibližně v polovině případů zjištěna delece oblasti 13q14, která nese mimo jiné geny kódující miR-

15a a miR-16-1, jejichž snížené hladiny byly s tímto onemocněním asociovány (50).

Naproti tomu antiapoptické vlastnosti vykazuje miR-21, má tedy charakter onkogenu. Její

zvýšené hladiny byly pozorovány u různých nádorových onemocnění (43). Poprvé však byly její

účinky a zvýšená hladina popsány právě u buněk glioblastomu (51). Jednou z funkcí této miRNA je

regulace nádorového supresoru PTEN (52). Zvýšená hladina miR-21 vede ke snížení hladiny proteinu

PTEN a tím k posílení signální dráhy PI3K/AKT, která má za následek inhibici apoptózy.

2.3.5. Diagnostický a prediktivní význam mikroRNA v onkologii

Za posledních 8 let bylo na poli výzkumu miRNA provedeno mnoho významných objevů,

které odhalily post-transkripčně regulační funkci miRNA a jejich zapojení do procesů spojených

s rozvojem nádorových onemocnění. Nyní je nezbytné převést tyto poznatky do klinické praxe.

Expresní profily miRNA mohou být použity za účelem klasifikace nádorů, stanovení jejich původu a

22

určení stupně malignity. Lu et al. (53) ve své práci použil expresních profilů asi 200 genů pro miRNA

ke klasifikaci různých málo diferencovaných nádorů. Ve většině případů zařazení korelovalo

s klinicky stanovenou diagnózou, na rozdíl od pokusu klasifikovat tyto nádory pomocí expresních

profilů asi 16 000 genů pro mRNA (53), což dokládá významný diagnostický potenciál miRNA.

Úspěšné využití miRNA jako prediktivního faktoru bylo dále zjištěno u pacientů s chronickou

lymfatickou leukémií, difúzním velkobuněčným B-lymfomem a karcinomem plic (40).

23

2.4. Úloha mikroRNA v patogenezi glioblastomu

2.4.1. miR-21

První studie zabývající se expresí miRNA odhalila v glioblastomech a odvozených buněčných

liniích zvýšenou expresi miR-21 (51). Navíc vyřazení miR-21 z funkce pomocí modifikovaných

komplementárních oligonukleotidů vedlo k aktivaci kaspas a tím k posílení apoptózy (51). Zvýšená

hladina miR-21 byla pozorována i u astrocytomů II. stupně (54), které jsou charakteristické nízkou

rychlostí proliferace a delší dobou přežití v porovnání s glioblastomem, což naznačuje, že právě

defektivní mechanismus apoptózy, který je spojován se zvýšenou expresí miR-21 hraje významnou

roli v patogenezi tohoto onemocnění. Jako cíle miR-21 byly popsány nádorové supresory PTEN (52),

TPM1 (tropomyosin 1) a maspin (55) v nádorových buněčných liniích, nicméně toto působení nebylo

zatím prokázáno v glioblastomech. miRNA-21 působí na dráhy p53, TGF-β a apoptózu vyvolanou

mitochondriální cestou v buňkách glioblastomu (56).

Přímými cíly miR-21 jsou p63 (homolog proteinu p53), aktivátory p53 JMY, TOPORS,

TP53BP2, DAXX a HNRNPK, které stabilizují p53 interakcí s MDM2 anebo působí jako transkripční

kofaktory asistující p53 při transaktivaci genů indukujících apoptózu a zástavu buněčného cyklu. Tyto

proteiny jsou nezbytné pro správnou aktivitu nádorového supresoru p53, proto miR-21 působením na

tyto geny vyřadí z funkce p53 (56). miR-21 reprimovala indukci apoptózy zprostředkovanou

proteinem p53 v odpovědi na chemoterapeutikem (doxorubicinem) indukované poškození DNA. miR-

21 se takto podílí na lékové resistenci glioblastomů (56). Represe p53 dráhy indukovaná miR-21 může

hrát roli ve všech nádorových onemocněních, kde se tato miRNA vyskytuje ve zvýšené míře.

Mechanismus jejího působení se může uplatňovat právě v nádorových buňkách se standardní formou

p53, jako je primární glioblastom. Přímými cíly TGF-β dráhy jsou receptory TGFBR2/3 a

zprostředkovatel apoptózy DAXX. DAXX stabilizuje také p53, účastní se tedy regulace obou těchto

drah a může hrát klíčovou roli v narušení jejich spolupráce.

miR-21 se dále podílí na zhoubnosti gliomů snížením hladin inhibitorů matrixových

metaloproteinas. Matrixové metaloproteinasy (MMP) jsou peptidasy degradující extracelulární matrix.

Jejich hladiny jsou v gliomech zvýšené, což souvisí s invazivitou buněk a angiogenezí. miR-21

reguluje tyto metaloproteinasy skrze jejich inhibitory RECK a TIMP3. Přímým cílem se jeví pouze

RECK, nicméně i hladiny TIMP3 klesají v souvislosti se vzrůstající hladinou miR-21 (57). miR-21

reguluje expresi RECK a TIMP3 a tím i aktivitu MMP a invazivitu gliomů (57).

Dalším cílem miR-21 je nádorový supresor PDCD4. Nádorový supresor PDCD4 interaguje

s iniciačními faktory translace eIF4A a eIF4G a inhibuje translaci, aktivuje rovněž p21, skrze který

inhibuje proliferaci (80). Přímá inhibice translace proteinu PDCD4 zprostředkovaná miR-21 byla

potvrzena pouze u buněčné linie T98G (58). Interleukinem 6 je skrze transkripční faktor STAT3

indukována exprese miR-21. Zvýšená aktivita STAT3 je detekována u různých typů nádorů (59-61).

24

STAT3 indukuje také expresi MMP (62). STAT3 může být regulován miR-21 ve zpětnovazebné

smyčce (57).

Obrázek 7: Zapojení miR-21 do signálních drah spojených s patogenezí glioblastomu.

miR-21 má mnoho specifických cílů, jejichž deregulace vede k rozličným biologickým

procesům spojeným s kancerogenezí (viz obr. 7). Toto široké spektrum dějů umožňuje miRNA

působit jako klíčový onkogen modulující buněčný růst, znecitlivění buněk vůči apoptotické signalizaci

a zástavě buněčného cyklu. Zvýšení hladin miR-21 může být jednou z klíčových událostí v onkogenezi

glioblastomu, ale i jiných typů nádorových onemocnění. Cílené snížení hladin miR-21 v lidských

nádorech by proto mohlo sloužit také k terapeutickým účelům.

25

2.4.2. miR-221/222

Další miRNA, jejíž hladina je v glioblastomech zvýšená, je miR-221 (54,63,64). Zvýšená

hladina byla pozorována jak v tkáňových vzorcích, tak ve všech deseti zkoumaných buněčných liniích

(64). Na rozdíl od miR-21 se vyskytuje pouze u astrocytomů vysokého stupně (54). Její funkce byla

zkoumána spolu s funkcí miR-222. Jejich exprese je koregulována a obě vykazují stejnou specifitu.

Reprimují expresi regulačního proteinu buněčného cyklu p27Kip1 (65). Tento protein patří mezi

inhibitory cyklin-dependentních kinas (CDK). Váže se na komplex CDK2 s cyklinem E a zabraňuje

tím přechodu z G1 do S fáze buněčného cyklu (viz obr. 8). Podle bioinformatických analýz jsou

možnými cíly miR-221 faktory modifikující protein Bcl-2 (63), jejich interakce však musí být ještě

ověřena experimentálně.

Podle bioinformatických analýz je možným aktivátorem transkripce miR-221 molekula CDK4.

Inhibicí této molekuly dochází k vzrůstu hladiny p27Kip1, který by mohl být způsoben poklesem

hladiny miR-221 (65). Aktivita CDK4 je inhibována proteinem p16Ink4a, jehož delece je často

pozorována u glioblastomů (5), což může vést právě ke zvýšení hladiny miR-221. Zvýšení hladiny

miR-221 v glioblastomech souvisí se ztrátou kontroly buněčného cyklu a vysokou rychlostí buněčné

proliferace charakteristickou pro glioblastomy.

2.4.3. miR-181a a miR-181b

Hladiny miR-181a a miR-181b jsou v glioblastomech a odvozených buněčných liniích sníženy

oproti nenádorové mozkové tkáni (64,66). Do této rodiny patří i miR-181c. Tyto miRNA se vyskytují

v normální mozkové tkáni ve zvýšené míře. Pokles exprese všech tří členů rodiny miR-181

v glioblastomech nasvědčuje tomu, že mají pravděpodobně společné cílové molekuly, jejichž hladiny

regulují. Snížení hladin rodiny miR-181 se vyskytuje i u jiných nádorových onemocnění. Exprese miR-

181 záporně koreluje s WHO stupněm gliomu (66). Rozdíl v expresi miR-181b nebyl patrný mezi

gliomy WHO st. III a WHO st. IV, nicméně byl zjištěn statisticky významný rozdíl v její expresi při

srovnání gliomů vyššího (st. III a IV) s gliomy nižšího stupně (WHO st. II) (66).

miR-181a a miR-181b inhibují proliferaci buněk gliomu. Buněčné linie s transfekovanou miR-

181a nebo miR-181b ztrácejí schopnost růstu nezávislého na ukotvení. V některých buněčných liniích

odvozených od glioblastomu indukovaly miR-181a a miR-181b apoptózu. Signifikantně více

apoptotických buněk bylo zjištěno u linií transfekovaných miR-181b. Zdá se tedy, že miR-181a a

miR-181b mají schopnost indukovat apoptózu skrze různé signální dráhy. miR-181a a miR-181b

snižují rovněž invazivitu gliomových buněk (66).

miR-181 hrají klíčovou roli v řízení buněčné diferenciace a vývoje thymocytů. Tyto miRNA se

navíc vyskytují ve zvýšené míře až u dospělých myší, oproti embryonálním a časným post-natálním

stádiím. Další možná funkce miR-181 tedy spočívá v regulaci diferenciace gliálních buněk (66).

26

2.4.4. miR-451

Existuje hypotéza, že nádory obsahují malé populace nádorových kmenových buněk, které

iniciují nádorové bujení a umožňují jeho propagaci. Tento koncept byl prokázán u leukemií, nádorů

prsu, střev, plic, prostaty a mozku (68). Kmenové buňky glioblastomu se liší od částečně

diferencovaných buněk glioblastomu exprimovaným povrchovým markerem CD133 (67). Bylo

zjištěno, že miR-451 inhibuje buněčný růst a tvorbu tzv. „neurospher“ (struktury tvořené nervovými

kmenovými buňkami in vitro). Imatinib mesylat inhibuje formování těchto „neurospher“ v primárním

glioblastomu a také inhibuje růst buněčných linií glioblastomu. Kombinace miR-451 a Imatinyb

mesylatu byla aplikována na buněčné linie a vzorky primárních glioblastomu. Byl prokázán jejich

synergistický efekt v inhibici formování „neurospher“ (67).

miR-451 je aktivována transkripčními faktory SMAD 3 a 4. miR-451 je kódována v oblasti

chromosomu 17q11-12 v těsné blízkosti genu HER2 a TRAF4 (TNF receptor-associated factor 4).

TRAF4 je podjednotka receptoru pro TNF, který interaguje s TGF-β1. Tato oblast zahrnující miR-451

je amplifikována v některých typech nádorů. Je pravděpodobné, že miR-451 se účastní také vývoje

mozku (67).

2.4.5. miR-124 a miR-137

Hladiny těchto miRNA byly signifikantně sníženy u anaplastického astrocytomu a

glioblastomu. Tyto miRNA indukují zástavu buněčného cyklu buněk glioblastomu a indukují

diferenciaci buněk odvozených od kmenových buněk glioblastomu (CD133 pozitivních)

v nepřítomnosti růstových faktorů (69).

Cílovou molekulou miR-124 je PTBP1 (PTB/hnRNP I) globální represor alternativního

sestřihu pre-mRNA řídící diferenciaci nervových buněk (70). miR-124 a miR-137 přímo inhibují

expresi CDK6 (69), která reguluje buněčný cyklus i diferenciaci (viz obr. 8).

Možný mechanismus suprese miR-124 a miR-137 v nádorových a kmenových nervových

buňkách souvisí se signalizací růstových faktorů. Odstranění EGF a FGF z růstového media způsobilo

vzrůst hladin miR-124 a miR-137 v dospělých nervových kmenových buňkách. Změny signálních

drah růstových faktorů se podílí na vzniku glioblastomu, z toho důvodu jsou možné spekulace, že

jedním z mechanismů, kterým růstové faktory napomáhají tvorbě mozkových nádorů, je suprese

exprese miR-124 a miR-137 (69). miR-124 je hypermethylována v různých typech nádorů. I

v astrocytomech vyššího stupně je jedním z epigenetických mechanismů podílející se na supresi

exprese miR-124 a miR-137 methylace jejích promotorů (69). Schopnost miR-124 a miR-137

indukovat diferenciaci a zástavu buněčného cyklu u buněk glioblastomu nabízí možnost využití pro

terapeutické účely.

27

Obrázek 8: Zapojení vybraných mikroRNA do signálních drah spojených s patogenezí glioblastomu.

2.4.6. miR-7

miR-7 je potenciálním nádorovým supresorem v glioblastomech. miR-7 silně potlačuje expresi

EGFR, a dále pak nezávisle inhibuje AKT dráhu skrze její aktivátory IRS-1 a IRS-2 (71) (viz obr. 8).

Její hladina je v glioblastomech snížená vzhledem k okolní tkáni. Ke snížení její hladiny dochází

během maturace této miRNA (71). miR-7 se vyskytuje ve třech isoformách. miR-7-1 se nachází

v oblasti intronu genu HNRNPK, miR-7-3 v oblasti intronu PDGSF1, miR-7-2 je intergenní (71).

PGSF1 vykazoval sníženou expresi, nicméně HNRNPK vykazoval srovnatelnou nebo zvýšenu expresi

v glioblastomech. To značí, že snížená exprese miR-7-1 není způsobena na úrovni transkripce

příslušného genu. Ani mutace nebo delece v oblastech genů pro miR-7 nebyly nalezeny. Hladiny pri-

miR-7 byly srovnatelné v glioblastomech a v okolní tkáni, zatímco hladiny pre-miR-7 byly sníženy.

Transfekce miR-7 do buněčných linií glioblastomu způsobovala snížení životaschopnosti buněk a

jejich invazivity (71).

28

miR-7 může představovat nový přístup k terapii glioblastomu. Vnesení miR-7 do buněk by

nemuselo být nebezpečné, vzhledem k tomu, že se v normální mozkové tkáni vyskytuje. Její

terapeutický potenciál se testuje na zvířecích modelech.

2.4.7. miR-128a

miR-128a se vyskytuje ve zvýšené míře v normální mozkové tkáni, avšak její hladina je

snížena jak v glioblastomech (64), tak i gliomech nižšího stupně (72). Zvýšení její exprese má za

následek snížení proliferace buněk gliomu (72,73). miR-128a negativně reguluje expresi

transkripčního faktoru E2F3a podílejícího se na průběhu buněčného cyklu v gliomech (72). Další

cílovou molekulou miR-128a je onkogen Bmi-1, který má schopnost regulovat nádorové supresory

jako jsou p53 a p16Ink4a (74). Bmi-1 je také nezbytný pro obnovování nervových kmenových buněk

(viz obr. 8). Zvýšení exprese miR-128a v gliomových buňkách s charakteristikou kmenových buněk

blokovalo jejich obnovování v souladu s poklesem hladiny Bmi-1 (73). Z toho vyplýva, že miR-128a

reguluje samoobnovování nervových kmenových buněk a podílí se tak na vývoji mozku.

Tabulka 4: Přehled mikroRNA účastnících se patogeneze glioblastomu.

miRNA Lokalizace Změna hladiny v glioblastomech

Cílové molekuly v glioblastomech

Reference

miR-21 17q23.2 ↑ p63, JMY,TOPORS, TP53BP2, DAXX, HNRNPK, TGFBR2/3; RECKPDCD4

(56)

(57)(58)

miR-221 Xp11.3 ↑ p27Kip1 (65)miR-124 8p23.1 ↓ CDK6 (69)miR-137 1p21.3 ↓ CDK6 (69)miR-7 9q21.32,

15q26.1, 19p13.3

↓ EGFR, IRS-1, IRS-2

(71)

miR-128a 2q21.3 ↓ E2F3Bmi-1

(72)(73)

miR-181a, miR-181b 1q31.3 ↓ ? (66)

2.4.8. Ostatní mikroRNA s pozměněnými hladinami v glioblastomech

miR-10b je další miRNA, jejíž hladina je v glioblastomech zvýšená (64,69). Vyskytuje se ve

zvýšené míře také v nádorech prsu, kde je její výskyt spojen se zvýšenou metastatickou aktivitou a

invazivitou. Její exprese je indukována transkripčním faktorem Twist (75). Její působení

v glioblastomech však doposud nebylo prozkoumáno. Snížené hladiny miRNA v glioblastomech byly

29

pozorovány také u miR-129, miR-139 a miR-218 (69). Ani jejich funkce ve spojení s patogenezí

glioblastomu není známa.

30

2.5. Kvantitativní zpětná PCR v reálném čase

Metoda „real-time“ PCR (kvantitativní PCR s detekcí v reálném čase) je založena na principu

klasické polymerázové řetězové reakce. Tato varianta PCR umožňuje přímou kvantifikaci produktu

v průběhu reakce prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu. Zpětná PCR (RT-

PCR) je metoda určená k amplifikaci molekul RNA. Spojením těchto metod a jejich modifikací pro

miRNA můžeme specificky stanovovat množství miRNA ve vzorku.

Prvním krokem RT-PCR je reversní transkripce. RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR,

proto musí být izolovaná RNA nejdříve převedena na komplementární DNA (cDNA) reversní

transkripcí. Použitá TaqMan microRNA reversní transkripce využívá specifické primery se strukturou

podobnou vlásenkové, tzv. „stem-loop“ RT primery (viz obr. 9). Dvouvláknová struktura primeru

zabraňuje hybridizaci s prekurzorovými miRNA nebo jinými dlouhými molekulami RNA a stabilizuje

strukturu duplexu miRNA a DNA (76).

Obrázek 9: Real-Time PCR systém pro detekci mikroRNA společnosti Applied Biosystems.

Produkty reversní transkripce se použijí pro kvantitativní PCR. Množství cílových sekvencí

cDNA se stanovuje pomocí sond TaqMan-MGB. Tyto sondy nesou na svém 5’-konci fluorofor FAM

(6-karboxyfluorescein), který má funkci zářiče. Na 3´-konci nesou zhášeč (quencher „Q“) TAMRA

(5-karboxytetramethyl-rhodamin) se srpkovitou molekulou MGB (minor groove binder), která

stabilizuje svým sklopením do menšího žlábku vazbu duplexu sonda - vlákno. V reasociační

(„annealing“) fázi PCR dojde k hybridizaci sondy na vnitřní část amplifikované sekvence. Při elongaci

je sonda rozložena 5’ exonukleázovou aktivitou Taq polymerasy, čímž je ukončen efekt zhášení a

31

dochází k emisi fluorescence. S každou vytvořenou molekulou amplikonu narůstá intenzita záření.

V závislosti na počtu cyklů je možné stanovit množství určité miRNA ve vzorku (77).

Při měření „real-time“ PCR můžeme pracovat buď s absolutními hodnotami, potom mluvíme

o absolutní kvantifikaci, při které vycházíme z kalibrační křivky vytvořené na základě amplifikace

známé koncentrační řady, nebo s hodnotami relativními, kdy hladiny měřeného vzorku vztahujeme

k nějaké endogenní kontrole, zpravidla referenčnímu „housekeepingovému“ genu, potom se jedná o

kvantifikaci relativní.

U systémů fluorescenčních sond platí, že nárůst fluorescence je přímo úměrný množství

specificky amplifikovaného produktu. Na amplifikační křivce pozorujeme tři fáze, počáteční lag fázi,

kdy je fluorescenční signál pod detekovatelným limitem detektoru, exponenciální fázi zvyšující se

fluorescence a tzv. plateau fázi, kdy fluorescence dále nevzrůstá. Během exponenciální fáze lze vztah

mezi počáteční koncentrací DNA templátu a jeho koncentrací v kterémkoli cyklu vyjádřit rovnicí

Nc = N(1 + E)c ,

kde Nc je koncentrace produktu v cyklu c, N je počáteční koncentrace, c je číslo cyklu a E je účinnost

systému. Za prahový (treshold) cyklus CT je považován cyklus, při kterém detekované fluorescenční

signály začnou vykazovat exponenciálnímu růst. CT je závislý na koncentraci do PCR vstupujícího

DNA templátu, čím nižší je CT, tím bylo větší množství templátu (77).

32

3. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

1) Ze souboru přibližně 20 vzorků primárních glioblastomů a 6 kontrolních tkání izolovat RNA a

ověřit její čistotu a kvalitu.

2) Na vybraném souboru vzorků nádorové tkáně a několika tkáních nenádorových stanovit hladiny

vybraných mikroRNA (miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-128a a miR-181a-c) metodou

kvantitativní PCR.

3) Integrovat získaná data s odpovědí na léčbu.

4) Navrhnout možné využití získaných dat v diagnostické a prediktivní onkologii.

33

4. MATERIÁL A METODY

4.1. Soubor pacientů

Retrospektivní studie zahrnovala 22 pacientů s primárním glioblastomem, kteří podstoupili

chirurgický zákrok na Neurochirurgické klinice Fakultní nemocnice Brno. Po resekci nádoru byli

pacienti léčeni na Masarykově onkologickém ústavu podle standardních protokolů radioterapií (2 Gy

po dobu 6 týdnů, s celkovou dávkou 60 Gy) s konkomitantní chemoterapií temozolomidem (RT/TMZ)

s denní dávkou 75 mg/m2 po dobu 6 týdnů. Odpověď na léčbu byla vyhodnocena pomocí obrazu

magnetické rezonance po jednom měsíci konkomitantní RT/TMZ. Zvětšení léze bylo pozorováno u 11

pacientů (50%), druhá polovina pacientů vykazovala stabilizaci onemocnění nebo odpověď na léčbu.

Tito pacienti podstoupili adjuvantní chemoterapii temozolomidem (150–200 mg/m2 po dobu 5 dnů

v čtyřtýdenních cyklech).

4.2. Izolace a kontrola kvality RNA

22 vzorků glioblastomů a 6 vzorků nenádorové tkáně pocházející z okolní tkáně cévních

malformací, které byly fixovány v parafinových bločcích, bylo rozřezáno a vloženo do

mikrozkumavek. Celková RNA bohatá na frakci krátkých RNA byla izolována pomocí kitu mirVana

(Ambion, USA) dle následujícího postupu:

1. k nařezanému parafinovému bločku o rozměrech přibližně 1 x 1 x 5 mm přidat 800 µl xylenu,

inkubovat 5 min a protřepat

2. přidat 400 µl ethanolu a protřepat, centrifugovat 2 min maximální rychlostí, odstranit supernatant

3. zbavit se zbylého ethanolu obrácením zkumavky, následně sušit pelet 10min při teplotě 55°C

4. přidat 100 µl lyzačního pufru (Paraffin Tissue Lysis Buffer), 16 µl 10% SDS a 40 µl

Proteinkinase K working solution do každého vzorku, vortexovat 3 x 5 s

5. inkubovat při 55°C přes noc

6. přidat 325 µl roztoku Binding Buffer, vortexovat

7. přidat 120 µl roztoku Binding Enhancer, vortexovat 3 x 5 s

8. napipetovat lyzát na kolonku High Pure filter tube umístěnou ve sběrné zkumavce

9. centrifugovat 30 s při 13 000 g

10. k roztoku ve sběrné zkumavce přidat 205 µl roztoku Binding Enhancer a vortexovat

3 x 5 s

11. napipetovat celou směs na novou kolonku High Pure filter tube umístěnou ve sběrné zkumavce

12. centrifugovat 30 s při 13 000 g a vylít roztok ve sběrné zkumavce

13. přidat 500 µl Wash Buffer working solution, centrifugovat 30 s při 13 000 g, vylít roztok ve

sběrné zkumavce

34

14. přidat 300 µl Wash Buffer working solution , centrifugovat 30 s při 13 000 g, vylít roztok ve

sběrné zkumavce

15. centrifugovat 1 min při 13 000 g za účelem vysušení filtru na kolonce

16. umístit kolonku High Pure filter tube do nové mikrozkumavky, přidat

100 µl Elution Buffer a inkubovat 1 min při 15 – 25°C, poté centrifugovat 1 min při 13 000 g

k eluci RNA

17. roztok RNA uložit do – 20°C až do zpracování

Koncentrace byla změřena a čistota ověřena spektrofotometricky pomocí přístroje Nanodrop

ND-1000 (Thermo Scientific, USA) a nekontaminovaná RNA (A260/A280 > 2; A260/A230 > 1,8)

byla dále zpracována.

4.3. MikroRNA-specifická reversní transkripce

Ke specifické reversní transkripci byl použit kit TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit

a stem-loop RT primer, který je součástí TaqMan MicroRNA Assay pro stanovení dané mikroRNA,

dle následujícího postupu:

Složení RT směsi

dNTP mix (100mM total) 0,15 µl

MultiscribeTM RT enzyme (50U/ µL) 1 µl

10x RT Buffer 1,5 µl

RNase Inhibitor (20 U/ µL) 0,19 µl

Nuclease free water 4,16 µl

Specific MicroRNA RT primer 3 µl

Celková RNA (konc. 2ng/ml) 5 µl

Celkový objem reakční směsi 15 µl

Pro reversní transkripci v přístroji TGradient thermal cycler (Biometra) byl použit teplotní profil

doporučený výrobcem kitu:

16°C/30min

42°C/30min

85°C/5min

4°C/∞.

Získaná cDNA byla ihned dále zpracována, případně archivována při -20°C do dalšího zpracování.

35

4.4. Stanovení exprese vybraných mikroRNA pomocí kvantitativní PCR v

reálném čase

Ke stanovení exprese miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-128a, miR-181a-c a RNU6B

jako endogenní kontroly byla použita technologie TaqMan MicroRNA Assays. Reakce kvantitativní

PCR byla provedena na přístroji Applied Biosystems 7000 Sequence Detection System (Applied

Biosystems, USA).

Složení reakční směsi

1 x TaqMan (NoUmpErase UNG) Universal PCR Master Mix 10 µl

TaqMan MicroRNA Assay (20X) (směs primerů a sondy) 1 µl

RT produkt 1,3 µl

Nuclease free water 7,7 µl

Celkový objem reakční směsi 20 µl

Pro PCR reakci byl použit teplotní profil doporučený výrobcem:

95°C/10 min

95°C/15s

60°C/10 min

Veškerá měření byla provedena v triplikátech. Výsledná relativní exprese analyzovaných genů byla

vyjádřena poměrem mezi průměrným počtem kopií sledovaného a referenčního genu (RNU6B).

4.5. Statistické vyhodnocení výsledků

Statistické rozdíly mezi hladinami miRNA v glioblastomech a nenádorových tkáních a rozdíly

v odpovědi na terapii ve vztahu k hladinám miRNA byly vyhodnoceny pomocí neparametrického

Mann – Whitneyova U testu. Pro statistické zpracování získaných dat byl použit software Statistica

verze 6.0 (StatSoft Inc., USA).

36

40cyklů

5. VÝSLEDKY STUDIE

5.1. Srovnání hladin mikroRNA v glioblastomech a nenádorové mozkové

tkáni

Z 22 vzorků glioblastomu a 6 kontrolních vzorků získaných z operací cévních malformací

byla izolována RNA v potřebné kvalitě. Ve všech vzorcích byly v triplikátech stanoveny hladiny

vnitřní kontroly RNU6B a miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-128a a miR-181a-c. Mediány

relativních hodnot exprese miRNA, 25. a 75. percentil a jejich míra signifikance ve vztahu k  odpovědi

na konkomitantní RT/TMZ jsou shrnuty v tabulce č. 5. Nebyl pozorován statisticky významný rozdíl

hladin miR-181a a miR-125b v glioblastomech oproti nenádorové mozkové tkáni. Hladiny miR-21

byly signifikatně zvýšeny (až osmkrát) v glioblastomech ve srovnání s kontrolní mozkovou tkání.

Oproti tomu hladiny miR-221, miR-222, miR-181b a miR-181c byly statisticky významně sníženy (viz

tab. 5). Největší rozdíl byl pozorován u miR-128a, která vykazovala v glioblastomech až 40x nižší

hladiny oproti nenádorové kontrolní tkáni.

Tabulka 5: Srovnání hladin mikroRNA v glioblastomech a kontrolní mozkové tkáni a jejich

souvislost s léčebnou odpovědí na chemoradioterapii s temozolomidem.

Glioblastom vs. mozková tkáň Odpověď na RT/TMZ*

miRNA Glioblastom

n = 22

Kontrolní mozková tkáň

n = 6

P ** odpovídající

n = 11

neodpovídající

n = 11

P

miR-2212,26***

(1,43-6,90)8,88

(8,21-21,76)0,016

1,85 (1,60-3,40)

2,85 (1,15-9,86)

0,562

miR-2224,81

(2,29-13,06)22,01

(9,25-42,62)0,038

4,62 (1,50-7,09)

10,34 (2,42-29,90)

0,243

miR-181a1,97

(0,99-3,87)4,89

(2,83-7,84)0,073

1,52 (0,68-2,82)

2,88 (1,32-5,22)

0,116

miR-181b6,28

(3,23-15,09)22,62

(7,46-50,39)0,036

5,17 (2,78-6,77)

12,59 (6,59-18,43)

0,016

miR-181c 0,57

(0,21-1,05)1,95

(0,58-2,52)0,043

0,33 (0,14-0,72)

0,91 (0,50-1,54)

0,047

miR-125b50,36

(22,50-84,76)34,76

(17,79-56,30)0,502

45,5 (10,98-76,41)

55,2 (33,92-84,82)

0,519

miR-128a0,02

(0,01-0,06)0,76

(0,12-1,16)0,001

0,02 (0,01-0,04)

0,04 (0,01-0,06)

0,652

miR-21219,26

(75,24-562,87)26,26

(18,68-30,84)<0,001

266,87 (79,29-424,53)

165,04 (76,87-830,85)

0,747

* Léčebná odpověď na konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem ** Mann-Whitneyův U test, tučné značí statisticky významný rozdíl (P < 0,05) *** Medián relativní exprese (25. - 75. percentil)

37

5.2. Korelace léčebné odpovědi pacientů na chemoradioterapii

Potenciální souvislost konkrétních miRNA s léčebnou odpovědí na RT/TMZ byla

vyhodnocena srovnáním exprese každé miRNA u skupiny pacientů odpovídajících na léčbu se

skupinou pacientů, u kterých došlo k progresi nádorového onemocnění. U pacientů odpovídajících na

léčbu byly pozorovány statisticky významně nižší hladiny miR-181b a miR-181c než u pacientů

s progresivním onemocněním (viz tab. 5, obr. 10). Na druhou stranu nebyla pozorována žádná

souvislost mezi odpovědí na léčbu a hladinami miR-221, miR-222, miR-181a, miR-125b, miR-128a a

miR-21 (viz tab. 5).

Obrázek 10: Korelace hladin miR-181b a miR-181c s léčebnou odpovědí na konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem.

.

38

39

6. DISKUSE

miRNA se jeví jako vhodný předmět výzkumu zaměřeného na molekulární patologii nádorů.

Je známo, že miRNA ovlivňují celou řadu procesů spojených s kancerogenezí, jako jsou buněčný růst,

buněčná proliferace, invazivita a apoptóza (36). Jejich výhodou je krátká délka a vlásenková struktura,

která je činí stabilnějšími a méně podléhajícími degradačním procesům během fixace a zpracovávání

vzorků při výzkumu. Tato vlastnost také přináší možnost retrospektivních studií vzorků uchovávaných

v parafinových bločcích v archivech na patologiích. Hladiny miRNA mohou být stanovovány pomocí

různých metod, mezi něž patří Northern blotting, metody založené na principu miRNA arrays, PCR a

další. Hlavní výhodou mikroRNA specifické „real-time“ PCR je její vysoká citlivost, tato metoda tedy

vyžaduje pouze malé množství (10-25 ng) celkové RNA z archivovaných vzorků. Navíc nabízí plně

standardizované protokoly a není u ní potřeba dalších validací jinými metodami, jako je tomu jiných

vysoce-účinných metod.

V naší studii jsme proto stanovovali hladiny miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-128a,

miR-181a-c v klinickém materiálu pomocí metody kvantitativní PCR v reálném čase. Potvrdili jsme

zvýšenou hladinu miR-21 ve tkáni glioblastomu, která byla pozorována již v dřívějších studiích

(51,54,56,57). miR-21 vykazovala až osminásobné zvýšení hladiny oproti nenádorové kontrolní tkáni.

Chen et al. (58) prokázali, že snížení hladiny miR-21 pomocí transfekce syntetickou anti-miR-21 vede

k aktivaci kaspas a k indukci  apoptózy. miR-21 má mnoho prokázaných cílových genů, jejichž

vyřazení z funkce inhibuje apoptózu a ovlivňuje buněčnou proliferaci a invazivitu nádoru. miR-21 má

schopnost potlačovat funkci nádorového supresoru p53 skrze jeho transkripční kofaktory (56). Bylo

prokázáno, že miR-21 potlačuje indukci apoptózy zprostředkovanou právě proteinem p53 (56).

Mechanismus jejího působení se může uplatňovat právě v nádorových buňkách se standardní formou

p53, která se vyskytuje u primárního glioblastomu. Tato miRNA zasahuje rovněž do TGF-β dráhy,

která je spojená s indukcí apoptózy (56). miR-21 ovlivňuje invazivitu gliomů skrze inhibitory

matrixových methaloproteinas RECK a TIMP3 (57). Nádorový supresor PDCD4 je další potvrzenou

cílovou molekulou miR-21 (58). Tento protein interaguje s iniciačními faktory translace eIF4A a

eIF4G a inhibuje tak translaci. PDCD4 také aktivuje nádorový supresor p21 indukující zástavu

buněčného cyklu. Všechna tato pozorování naznačují velký význam miR-21 v patogenezi

glioblastomu. Zvýšení hladin miR-21 může být jednou z klíčových událostí v onkogenezi

glioblastomu, ale i jiných typů nádorových onemocnění. Cílené snížení hladin miR-21 v nádorech by

mohlo sloužit k terapeutickým účelům.

Nepozorovali jsme zvýšení hladin miR-221/222, na rozdíl od dřívějších studií prokazujících

zvýšenou expresi těchto miRNA v glioblastomech (54,63,65), na druhou stranu jsou naše výsledky

konsistentní se studií Silbera et al. (69), ve které rovněž nebylo nepozorováno zvýšení hladiny této

miRNA v glioblastomech. Hladiny miR-221/222 byly přibližně 4x nižší oproti kontrolní tkáni (tab. 5).

40

V naší studii jsme použili jako kontrolní tkáň mozkovou tkáň z okolí cévních mozkových malformací.

Je možné, že tato kontrolní tkáň obsahovala stopy endoteliální tkáně vlásečnic. Je známé, že miR-

221/222 se vyskytují ve zvýšené míře právě v endoteliální tkání (78). To by mohlo vysvětlovat, proč

se v naší studii jevila relativní hodnota miR-221/222 snížená oproti kontrolní tkáni. K objasnění těchto

rozdílných výsledků by mohla pomoci rozsáhlejší studie zaměřená na expresi miR-221/222

v glioblastomech. Je prokázáno, že se tyto miRNA zapojují do procesu kancerogeneze vyřazením

z funkce nádorového supresoru p27Kip1 regulujícího posun buněčného cyklu z G1 do S fáze (65).

Ciafre et al. (64) pozorovali zvýšenou hladinu miR-125b v tkáňových vzorcích, ale sníženou

hladinu této miRNA v buněčných liniích. My jsme nepozorovali statisticky významnou změnu hladiny

miR-125b v glioblastomech oproti kontrolní tkáni. Nicméně jsme potvrdili snížení hladiny miR-128a

poprvé publikované těmito autory. miR-128a vykazovala přibližně 40x nižší hladinu. Funkcí miR-

128a je regulace buněčného cyklu zprostředkovaná inhibicí transkripčního faktoru E2F3a (72) a

inhibice translace onkogenu Bmi-1 (73), který má schopnost regulovat nádorové supresory jako jsou

p53 a p16Ink4a a je nezbytný pro obnovování nervových kmenových buněk. Godlewski et al. (73)

prokázali, že zvýšení exprese miR-128a v gliomových buňkách s charakteristikou kmenových buněk

blokuje jejich obnovování v souladu s poklesem hladiny Bmi-1. Z toho vyplývá, že snížení hladin

miR-128a s funkcí nádorového supresoru vede, alespoň částečně, k onkogenezi glioblastomu.

miR-181a a miR-181b, jejichž hladiny jsou v glioblastomech snížené (64,66), mají funkci

nádorových supresorů indukujících apoptózu a ovlivňujících invazivitu buněk (66). V naší studii jsme

pozorovali snížení hladin členů rodiny miR-181, u miR-181b a miR-181c bylo toto snížení statisticky

významné. Nižší hladiny miR-181b a miR-181c však pozitivně korelovaly s léčebnou odpovědí

pacientů na RT/TMZ. Nakajima et al. (79) demonstroval podobné výsledky u pacientů

s kolorektálním karcinomem reflektující prospěšnost fluoropyrimidinového chemoterapeutika S-1.

Statisticky významně nižší hladiny miR-181b byly pozorovány u pacientů odpovídajících na léčbu

chemoterapeutikem S-1 (79). Rodina miR-181 může jistým molekulárním mechanismem indukovat

expresi některých genů pro reparační proteiny v odpovědi na akutní stres a tím snižovat účinnost

chemoterapie či radioterapie. Pro objasnění molekulárních mechanismů působení miR-181b a miR-

181c spojených s citlivostí buněk glioblastomu na alkylační činidla a radioterapii je nezbytné provést

další studie.

Naše studie jako první prokazuje negativní korelaci mezi hladinami miR-181b a miR-181c a

léčebnou odpovědí pacientů na RT/TMZ. Naše pozorování potvrzují význam miR-21 a miR-128a

v patogenezi glioblastomu. Po provedení rozsáhlejších studií by mohla být rodina miR-181 využita pro

predikci účinnosti léčby RT/TMZ pacientů s  glioblastomem, což by pomohlo onkologům s včasnou

indikací správné léčby a následně prodloužilo život pacientům s primárním glioblastomem.

41

7. SOUHRN

Východisko: Glioblastom je nejčastějším a nejzhoubnějším typem mozkových nádorů u lidí.

Naprostá většina pacientů podlehne tomuto onemocnění do jednoho roku od stanovení diagnózy.

Primární glioblastom je charakterizován mnohočetnými genetickými změnami. MikroRNA (miRNA)

jsou endogenní nekódující regulační RNA. V minulosti byly prokázány významné změny na úrovni

exprese určitých miRNA v glioblastomech.

Metody: V naší studii jsme stanovovali hladinu miR-21, miR-221, miR-222, miR-125b, miR-

128a, miR-181a-c ve 22 vzorcích primárního glioblastomu a 6-ti nenádorových mozkových tkáních

metodou kvantitativní zpětnou PCR v reálném čase. Hladiny miRNA byly rovněž korelovány

s léčebnou odpovědí na konkomitantní chemoradioterapii s  alkylačním činidlem temozolomidem

(RT/TMZ).

Výsledky: Hladiny miR-21, miR-128a, miR-221/222, miR-181b a miR-181c se signifikantně

lišily mezi nádorovou a nenádorovou tkání. Hladina miR-21 (P < 0,001) byla zvýšená, zatímco hladiny

miR-128a (P = 0,001), miR-221 (P = 0,016), miR-222 (P = 0,038), miR-181b (P = 0,036) a miR-181c

(P = 0,043) byly snížené. Nejvýraznější změnu vykazovala miR-128a s přibližně čtyřicetinásobně

sníženou hladinou. Hladiny miR-181b (p = 0,016) a miR-181c (p = 0,047) negativně korelovaly

s léčebnou odpovědí pacientů na RT/TMZ.

Závěr: Naše studie potvrzuje výraznou změnu v expresi miR-21 a miR-128a u primárního

glioblastomu, což naznačuje jejich význam v molekulární patologii tohoto onemocnění. Byla

pozorována souvislost mezi snížením hladin miR-181b a miR-181c a léčebnou odpovědí pacientů na

chemoradioterapii s temozolomidem. Tohoto poznatku by mohlo být v budoucnosti využito k predikci

účinnosti této terapie a individualizaci terapie pacientů s glioblastomem.

42

8. SUMMARY

Objectives: Glioblastoma is the most frequent and most malignant human brain tumor. The

vast majority of patients succumb to this disease within one year after diagnosis. Primary glioblastoma

is characterized by multiple genetic alterations. MicroRNAs (miRNAs) are endogenously expressed

regulatory non-coding RNAs. Previous studies showed altered expression levels of several miRNAs in

glioblastomas.

Methods: In our study, we examined the expression levels of miR-21, miR-221, miR-222,

miR-181a-c, miR-125b and miR-128a in 22 primary glioblastomas and six specimens of adult brain

tissue by real-time PCR method. The miRNAs expression levels were also correlated with response to

concomitant chemoradiotherapy with temozolomide (RT/TMZ).

Results: The expression levels of miR-21, miR-128a, miR-221/222, miR-181b and miR-181c

significantly differed among tumors and adult brain tissue. miR-21 (P < 0.001) was overexpressed in

glioblastoma, whereas miR-128a (P = 0.001), miR-221 (P = 0.016), miR-222 (P = 0.038), miR-181b (P

= 0.036) and miR-181c (P = 0.043) were downregulated. The most significant difference was observed

in miR-128a with levels in glioblastomas approximately 40 times lower than in normal brain tissue.

The expression levels of miR-181b (p = 0,016) and miR-181c (p = 0,047) were negatively correlated

with response to RT/TMZ in glioblastoma patients. Patients who responded to RT/TMZ tended to

have lower expression levels of miRNA-181 family members than those with progressive disease.

Conclusion: Our study confirmed a significant change of the expression levels of miR-21 and

miR-128a in primary glioblastoma, which supports the importance of these miRNAs in pathogenesis

of this disease. We suggest that after more extensive validation, microRNA-181 family might be used

for prediction of RT/TMZ response in clinical practice, thereby helping oncologists in the treatment

decision and in consequence improving survival of glioblastoma patients.

43

Citovaná literatura

1. Kozler, P. et al.: Intrakraniální nádory. 1. vydání. Praha: Nakladatelství Galén, 2007. str. 33 - 58

ISBN 978-80-7262-452-2.

2. Louis, D. N., Ohgaki, H., Wiestler, O. D. et al.: The 2007 WHO classification of tumours of the

central nervous system. Acta Neuropathol. 2007, 114(2):97-109.

3. Ohgaki, H. a Kleihues, P.: Genetic Pathways to Primary and Secondary Glioblastoma.

The American Journal of Pathology. 2007, 170(5):1445-1453.

4. Bruce, J.: Glioblastoma multiforme. [online]: eMedicine Journal, 2001.

5. Ohgaki, H., Dessen, P., Jourde, B. et al.: Genetic pathways to glioblastoma: a population - based

study. Cancer Res. 2004, 64(19):6892-6899.

6. Ohgaki, H a Kleihues, P.: Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic

alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropatol Exp Neurol. 2005, 64(6):479 -

489.

7. Schwartzbaum, J. A., Fisher, J. L., Aldape, K. D. a Wrensch, M.: Epidemiology and molecular

pathology of glioma. Nat Clin Pract Neurol. 2006, 2(9):494-503.

8. Klener, P.: Klinická onkologie. Praha: Galén, Karolinum, 2002. str. 349 - 356. ISBN 8072621513.

9. Cho, P. P. a Shapera, S.: What's your call? Drop metastases. Canadian Medical Association

journal. 2006, 175(5):475, 477.

10. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. et al.: Molecular biology of the cell. 4. vydání. New York:

Garland Science, 2002. str. 883 - 906. ISBN 0-8153-4072-9.

11. Kita, D., Yonekawa, Y., Weller, M. a Ohgaki, H.: PIK3CA alterations in primary (de novo) and

secondary glioblastomas. Acta Neuropathol. 2007, 113(3):295-302.

12. Watanabe, K., Tachibana, O., Sata, K. et al.: Overexpression of the EGF receptor and p53

mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas. Brain

Pathol. 1996, 6(3):217-223.

13. Biernat, W., Huang, H., Yokoo, H., Kleihues, P. a Ohgaki, H.: Predominant expression of mutant

EGFR (EGFRvIII) is rare in primary glioblastomas. Brain Pathol. 2004, 14(2):131-136.

14. Ekstrand A. J., Sugawa, N., James, C. D. a Collins, V. P.: Amplified and rearranged epidermal

growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding

portions of the N- and/or C-terminal tails. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89(10):4309–4313.

15. Knobbe, C. B., Merlo, A. a Reifenberger, G.: Pten signaling in gliomas. Neuro Oncol. 2002,

4(3):196-211.

16. Dahia, P. L.: PTEN, a unique tumor suppressor gene. Endocr Relat Cancer. 2000, 7(2):115-129.

44

17. Fleming, T. P., Saxena, A., Clark, W. C. et al.: Amplification and/or overexpression of platelet-

derived growth factor receptors and epidermal growth factor receptor in human glial tumors. Cancer

Res. 1992, 52(16):4550-4553.

18. Shiha, A. a Holland, E.C.: Platelet-derived growth factor (PDGF) and glial tumorigenesis. Cancer

Lett. 2006, 232(2):139-147.

19. Hara, A., Saegusam, M., Mikami, T. a Okayasu, I.: Loss of DCC expression in astrocytomas:

relation to p53 abnormalities, cell kinetics, and survival. J Clin Pathol. 2001, 54(11): 860–865.

20. Reyes-Mugica, M., Rieger-Christ, K., Ohgaki, H. et al.: Loss of DCC expression and glioma

progression. Cancer Res. 1997, 57(3):382-386.

21. Reifenberger, G., Liu, L., Ichimura, K., Schmidt, E. E., Collins, V. P.: Amplification and

overexpression of the MDM2 gene in a subset of human malignant gliomas without p53 mutations.

Cancer Res. 1993, 53(12):2736-2739.

22. Reifenberger, G., Liu, L., Ichimura, K., Schmidt, E. E. a Collins V. P.: Amplification and

overexpression of MDM2 in primary (de novo) glioblastomas. J Neuropathol Exp Neurol. 1997,

56(2):180-185.

23. Nakamura, M., Watanabe, T., Klangby, U. et al.: p14ARF deletion and methylation in genetic

pathways to glioblastomas. Brain Pathol. 2001, 11(2):159-168.

24. Nakamura, M., Yonekawa, Y., Kleihues, P. a Ohgaki, H.: Promoter hypermethylation of the RB1

gene in glioblastomas. Lab Invest. 2001, 81(1):77-82.

25. Nakamura, M., Ishida, E., Shimada, K. et al.: Frequent LOH on 22q12.3 and TIMP-3 inactivation

occur in the progression to secondary glioblastomas. Lab Invest. 2005, 85(2):165-175.

26. Nakamura, M., Ishida, E., Shimada, K. et al.: Loss of heterozygosity on chromosome 19 in

secondary glioblastomas. J Neuropathol Exp Neurol. 2000, 59(6):539-543.

27. Nakamura, M., Watanabe, T., Yoekawa, Y., Kleihues, P. a Ohgaki, H.: Promoter

hypermethylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G: C

→ A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene. Carcinogenesis. 2001, 22(10):1715-1719.

28. Harada, K., Kurisu, K., Tahara, H. et al.: Telomerase activity in primary and secondary

glioblastomas multiforme as a novel molecular tumor marker. J Neurosurg. 2000, 93(4):618-625.

29. Fujisawa, H., Reis, R. M., Nakamura, M. et al.: Loss of heterozygosity on chromosome 10 is

more extensive in primary (de novo) than in secondary glioblastomas. Lab Invest. 2000, 80(1):65-72.

30. Guilleret, I. a Benhattar, J.: Demethylation of the human telomerase catalytic subunit (hTERT)

gene promoter reduced hTERT expression and telomerase activity and shortened telomeres. Exp.

Cell Res. 2003, 289(2):326-334.

31. Sathornsumetee, S. a Rich, J. N.: Designer therapies for glioblastoma multiforme. Ann N Y Acad

Sci. 2008, 1142:108-132.

32. Linoa, M. a Merlo, A.: Translating biology into clinic: the case of glioblastoma . Curr Opin Cell

Biol. 2009, 21:1–6.

45

33. Vredenburgh, J. J., Desjardins, A., Herndon, J. E. 2nd et al.: Phase II trial of bevacizumab and

irinotecan in recurrent malignant glioma. Clin Cancer Res. 2007, 3(4):1253-1259.

34. Schmittgen, T. D.: Regulation of microRNA processing in development, differentiation and cancer.

J Cell Mol Med. 2008, 12(5B):1811–1819 .

35. Griffiths-Jones, S.: The microRNA Registry. Oxford University Press. 2004, 32(Database

issue):D109-11. miRBase http://microrna.sanger.ac.uk/.

36. Esquela-Kerscher, A. a Slack, F. J.: Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer.

2006, 6(4):259-269.

37. Calin, G. A., Sevignani, C., Dumitru, C. D. et al:. Human microRNA genes are frequently located

at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004,

101(9):2999-3004.

38. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L. a Bradley, A.: Identification of Mammalian

microRNA Host Genes and Transcription Units. Genome Res. 2004, 14(10A):1902-1910.

39. Eulalio, A., Behm-Ansmant, I. a Izaurralde, E.: P bodies: at the crossroads of post-transcriptional

pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007, 8(1):9-22.

40. Slabý, O., Krekáč, D., Hrstka, R. et al.: Zapojení mikroRNA do patogeneze nádorových

onemocnění a možnosti jejich využití v diagnostické a prediktivní onkologii. Čas. Lék. čes. 2008,

147(1):25-31.

41. Place, R. F., Li, L. C., Pookot, D., Noonan, E. J. a Dahiya, R.: MicroRNA-373 induces expression

of genes with complementary promoter sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(5):1608-

1613.

42. Cho, W. C.: OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer. 2007,

6:60.

43. Volinia, S., Calin, G. A., Liu, C. G. et al.: A microRNA expression signature of human solid

tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(7):2257-2261.

44. Johnson, C. D., Esquela-Kerscher, A., Stefani, G. et al.: The let-7 MicroRNA Represses Cell

Proliferation Pathways in Human Cells. Cancer Res. 2007, 67(16):7713-7722.

45. Akao, Y., Nakagawa, Y. a Naoe, T.: MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-

microRNAs in human cancers. Oncol Rep. 2006, 16(4):845-850.

46. Wiemer, E. A.: The role of microRNAs in cancer: No small matter. Eur J of Cancer. 2007,

43(10):1529-1544.

47. Sonne, S. B., Hoei-Hansen, C. E., Nielsen, J. E. et al.: CDH1 (E-cadherin) in testicular germ cell

neoplasia: suppressed translation of mRNA in pre-invasive carcinoma in situ but increased protein

levels in advanced tumours. APMIS. 2006, 114(7-8):549-558.

48. He, L., He, X., Lim, L. P., de Stanchina, E. et al.: A microRNA component of the p53 tumour

suppressor network. Nature. 2007, 447(7148):1130-1134.

46

49. Cimmino, A., Calin, G. A., Fabbri, M. et al.: miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting

BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102(39):13944-13949.

50. Calin, G. A., Dumitru, C.D., Shimizu, M. et al.: Frequent deletions and down-regulation of micro-

RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A.

2002, 99(24):15524-15529.

51. Chan, J. A., Krichevsky, A. M. a Kosik, K. S.: MicroRNA-21 Is an Antiapoptotic Factor in

Human Glioblastoma Cells. Cancer Res. 2005, 65(14):6029-6033.

52. Meng, F., Henson, R., Wehbe-Janek, H. et al.: MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN

tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology. 2007, 133(2):647-658.

53. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A. et al.: MicroRNA expression profiles classify human cancers.

Nature. 2005, 435(7043):834-838.

54. Conti, A., Aguennouz, M., La Torre, D. et al.: miR-21 and 221 upregulation and miR-181b

downregulation in human grade II-IV astrocytic tumors. J Neurooncol. 2009.

55. Zhu, S., Wu, H., Wu, F. et al.: MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and

metastasis. Cell Res. 2008, 18(3):350-359.

56. Papagiannakopoulos, T., Shapiro, A. a Kosik, K. S.: MicroRNA-21 targets a network of key

tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res. 2008, 68(19):8164-8172.

57. Gabriely, G., Wurdinger, T., Kesari, S. et al.: MicroRNA 21 promotes glioma invasion by

targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol Cell Biol. . 2008, 28(17):5369-5380.

58. Chen, Y., Liu, W., Chao, T. et al.: MicroRNA-21 down-regulates the expression of tumor

suppressor PDCD4 in human glioblastoma cell T98G. Cancer Lett. 2008, 272(2):197-205.

59. Watson, C. J. a Miller, W. R.: Elevated levels of members of the STAT family of transcription

factors in breast carcinoma nuclear extracts. Br J Cancer. 1995, 71(4):840-844.

60. Niu, G., Bowman, T., Huang, M. et al.: Roles of activated Src and Stat3 signaling in melanoma

tumor cell growth. Oncogene. 2002, 21(46):7001-7010.

61. Ni, Z., Lou, W., Leman, E. S. a Gao, A. C.: Inhibition of constitutively activated Stat3 signaling

pathway suppresses growth of prostate cancer cells. Cancer Res. 2000, 60(5):1225-1228.

62. Xie, T. X., Wei, D., Liu, M. et al.: Stat3 activation regulates the expression of matrix

metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis. Oncogene. 2004, 23(20):3550-3560.

63. Lukiw, W. J., Cui, J. G., Li, Y. Y. a Culicchia, F.: Up-regulation of micro-RNA-221 (miRNA-

221; chr Xp11.3) and caspase-3 accompanies down-regulation of the survivin-1 homolog BIRC1

(NAIP) in glioblastoma multiforme (GBM). J Neurooncol. 2009, 91(1):27-32.

64. Ciafrè, S. A., Galardi, S., Mangiola, A. et al.: Extensive modulation of a set of microRNAs in

primary glioblastoma. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 334(4):1351-1358.

65. Gillies, J. K. a Lorimer, I. A.: Regulation of p27Kip1 by miRNA 221/222 in glioblastoma. Cell

Cycle. 2007, 6(16):2005-2009.

47

66. Shi, L., Cheng, Z., Zhang, J. et al.: hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors

in human glioma cells. Brain Res. 2008, 1236:185-193.

67. Gal, H., Pandi, G., Kanner, A. A. et al.: MIR-451 and Imatinib mesylate inhibit tumor growth of

Glioblastoma stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008, 376(1):86-90.

68. Ward, R. J. a Dirks, P. B.: Cancer stem cells: at the headwaters of tumor development. Annu Rev

Pathol. 2007, 2:175-189.

69. Silber, J., Lim, D. A., Petritsch, C. et al.: miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of

glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Med. 2008,

6:14.

70. Makeyev, E. V., Zhang, J., Carrasco, M. A. a Maniatis, T.: The MicroRNA miR-124 promotes

neuronal differentiation by triggering brain-specific alternative pre-mRNA splicing. Moll Cell. 2007,

27(3):435-448.

71. Kefas, B., Godlewski, J., Comeau, L. et al.: microRNA-7 inhibits the epidermal growth factor

receptor and the Akt pathway and is down-regulated in glioblastoma. Cancer Res. 2008,

68(10):3566-3572.

72. Zhang, Y., Chao, T., Li, R. et al.: MicroRNA-128 inhibits glioma cells proliferation by targeting

transcription factor E2F3a. J Mol Med. 2009, 87(1):43-51.

73. Godlewski, J., Nowicki, M. O., Bronisz, A. et al.: Targeting of the Bmi-1 oncogene/stem cell

renewal factor by microRNA-128 inhibits glioma proliferation and self-renewal. Cancer Res. 2008,

68(22):9125-9130.

74. Itahana, K., Zou, Y., Itahana, Y. et al.: Control of the Replicative Life Span of Human Fibroblasts

by p16 and the Polycomb Protein Bmi-1. Mol Cell Biol. 2003, 23(1):389-401.

75. Ma, L., Teruya-Feldstein, J. a Weinberg, R. A.: Tumour invasion and metastasis initiated by

microRNA-10b in breast cancer. Nature. 2007, 449(7163):682-688.

76. Schmittgen, T. D., Lee, E. J., Jiang, J. et al.: Real-time PCR quantification of precursor and

mature microRNA. Methods. 2008, 44(1):31-38.

77. Wilhelm, J. a Pingoud, A.: Real-Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem. 2003,

4(11):1120 - 1128.

78. Kuehbacher, A., Urbich, C., Zeiher, A. M. a Dimmeler, S.: Role of Dicer and Drosha for

endothelial microRNA expression and angiogenesis. Circ Res. 2007, 101(1):59-68.

79. Nakajima, G., Hayashi, K., Xi, Y. et al: Non-coding MicroRNAs hsa-let-7g and hsa-miR-181b are

Associated with Chemoresponse to S-1 in Colon Cancer. Cancer Genomics Proteomics. 2006,

3(5):317-324.

80. Göke, R., Barth, P., Schmidt, A., Samans, B. a Lankat-Buttgereit, B.: Programmed cell death

protein 4 suppresses CDK1/cdc2 via induction of p21(Waf1/Cip1). Am J Physiol Cell Physiol. 2004,

287(6):C1541-6.

48