Penilaian perbandingan metode ekstraksi dan estimasi kuantitatif luteolin dalam daun Vitex LegundioLinn. dengan HPLCTujuan: Untuk mengetahui teknik pelarut dan ekstraksi organik yang ideal untuk isolasi luteolin dari daun vitex Legundi Linn. (V. negundo) dengan estimasi kuantitatif luteolin melalui kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Metode: Daun V. negundo diidentifikasi oleh seorang ahli botani, dibersihkan, dikeringkan di tempat yang teduh dan dijadikan bubuk. Maserasi, refluks, Soxhlet dan teknik ekstraksi ultrason assited exctraction techniques yang digunakan untuk ekstraksi luteolin dari daun dengan menggunakan empat pelarut yang berbeda dari berbagai polaritas seperti metanol, etanol, kloroform, dan diklorometana. Sebuah metode HPLC digunakan untuk menentukan jumlah luteolin dalam setiap ekstrak sampel. Hasil: kalibrasi plot luteolin standar menunjukkan hubungan linear pada rentang konsentrasi 100-500 mg / mL dengan koefisien korelasi, r2 dari 0,998. Ekstrak dengan pelarut metanol ditemukan mengandung jumlah tertinggi luteolin dan hasil yang paling efisien menggunakan metode refluks . Kesimpulan: Berdasarkan hasil HPLC, dapat disimpulkan bahwa teknik refluks menggunakan metanol lebih baik dari teknik ekstraksi lain dan harus lebih disukai untuk ekstraksi dan isolasi luteolin dari V. negundo ekstrak daun di laboratorium penelitian atau industri.

Genus Vitex terdiri dari sekitar 250 spesies termasuk pohon dan semak-semak, yang terutama ditemukan di daerah tropis dan subtropis. Sekitar 14 spesies yang ditemukan di India yang telah dilaporkan untuk memiliki obat tertentu dan properti komersial [1,2]. Tanaman Legundi L. (V. negundo) yang dikenal sebagai nirgundi dan milik family Verbenaceae. Dalam bahasa Sansekerta, kata "nirgundi" kata digunakan untuk pabrik atau zat-zat yang dapat melindungi tubuh dari penyakit (s). Kegunaan daritanaman tersebut telah disebutkan di De Materia Medica serta dalam teks dasar Ayurveda (pengobatan tradisional India), Charaka Samhita. Tanaman ini terutama dikenal untuk utilitas dalam gangguan reproduksi wanita seperti sindrom pramenstruasi [3], menopause [4], hiperprolaktinemia [3,5], dll. Menurut Dancel, Legundi Linn adalah semak yang berasal Afghanistan, Bangladesh, Bhutan, Kamboja, China, India, Indonesia, Jepang, Kenya, Madagaskar, Malaysia, Mozambik, Myanmar, Nepal, Pakistan, Filipina, Sri Lanka, Taiwan, Tanzania, Thailand, dan Vietnam. Di Filipina, daun secara tradisional direbus dalam air dan kaldu yang dihasilkan digunakan eksternal untuk membersihkan bisul dan dikonsumsi secara internal untuk mengobati perut kembung, untuk meningkatkan produksi susu dalam keperawatan perempuan. [4]Legundi adalah semak tegak atau pohon kecil yang tumbuh 2-8 meter tingginya. Kulit biasanya berwarna coklat kemerahan. Daunnya bercabang menjadi 3-5 jari seperti selebaran lanset. Setiap daun mudanya sekitar 4 sampai 10 cm, dengan selebaran pusat yang terpanjang dan memiliki tangkai. Daun-ujungnya bergigi atau berlekuk seperti gergaji dan permukaan bawah ditutupi dengan rambut. Bunga-bunga ungu-putih berlebihan ditanggung dalam malai sekitar 10 sampai 20 cm (Gambar 1). Kelopak yang panjang yang berbeda, dengan lobus bawah tengah menjadi yang terpanjang. Baik corolla dan kelopak yang ditutupi rambut lebat [6]. Bunga-bunga yang harum hermafrodit. Berikut ialah gambarnya. [5]

[5] (memiliki baik laki-laki dan organ kewanitaan) di alam dan diserbuki oleh serangga.Kebanyakan kegiatan terapi yang dimiliki oleh V. negundo karena phytoconstituents ada di dalamnya, yaitu friedelin, karoten, casticin, artemisin, luteolin, vitexin, nigunduside, vitexicarpin, linalool, asam strearic, asam, negundin, agnuside, asam vanilat behenic, asam, vitexoside, stigmasterol, sabinene, GardenDi, asam ursolat, asam p-betunilic hydrobenzoic , spathulenol, p-cymene, globulol, virdifloral, hentriacontane, lagundinin, vitedoamine, nishandaside dan sebagainya [6]. V. negundo merupakan tanaman obat secara ekstensif dipelajari dan diketahui memiliki berbagai pilihan aktivitas farmakologi seperti analgesik dan anti-inflamasi [7-9], hepatoprotektif [10], antidiabetes [11], antikonvulsan [7,12], antioksidan [13,14], dll Dalam sistem tradisional India obat (Ayurveda), V. negundo digunakan sebagai antihelmintik dan untuk mengobati gangguan kulit. The Pharmacopoeia Cina mengatur buah V. negundo dalam pengobatan memerah, menyakitkan, dan bengkak mata; sakit kepala dan rematik sendi [15]. Ada daftar besar penyakit yang V. negundo digunakan sebagai obat di Ayurvedic, Unani, Sidhha dan sistem Cina obat [16,17]. Luteolin merupakan konstituen penting dari V. negundo L. Kimia itu adalah 3 ', 4', 5,7-tetrahydroxyflavone (Gambar 1) dan memiliki berbagai kegiatan terapi. Meskipun banyak flavonoid yang hadir dalam tanaman obat ini tapi karena kandungan kecil luteolin dalam obat dan kemanjuran terapi tinggi, analisis kuantitatif menjadi sangat diperlukan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pelarut yang paling sesuai untuk mengoptimalkan metode ekstraksi untuk isolasi luteolin dari daun V. negundo L. dengan penentuan kuantitatif luteolin dalam ekstrak pelarut yang berbeda melalui kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

Gambar 1. Struktur kimia luteolin.2. Bahan dan metode2.1. Bahan tanaman Daun V. negundo Linn. diperoleh dari Herbal Taman Jamia Hamdard University, New Delhi dan disahkan oleh ahli taksonomi, Departemen Botani, Fakultas Sains, Jamia Hamdard, New Delhi. Sebuah surat bukti disimpan di herbarium Departemen Farmakognosi dan Fitokimia, Fakultas Farmasi, Jamia Hamdard, India untuk referensi di masa mendatang. 2.2. Kimia Standard luteolin dibeli di Sigma, USA). HPLC kelas metanol dan air yang diperoleh dari SD Fine Chemicals, India. Semua reagen lain yang digunakan adalah dari kelas analitis dan dibeli dari SD Fine Chemicals, India. 2.3. Ekstraksi luteolin Daun V. negundo yang benar dibersihkan untuk menghilangkan benda asing yang menempel dan kemudian dicuci dengan air. Daun dikering udarakan di tempat yang teduh dan dibuat dengan bantuan penggiling negeri (Usha Lexus 2753, India). Permukaan daun kemudian digunakan untuk ekstraksi luteolin. Ekstraksi dilakukan dengan empat metode yaitu. maserasi, refluks, soxhelation dan USG dibantu ekstraksi (UEA) dengan empat pelarut yang berbeda yang memiliki kepolaran yang berbeda juga termasuk etanol, metanol, kloroform, dan diklorometana. Hasil ekstraksi (massa ekstrak / massa bubuk kering) digunakan sebagai indikator untuk membandingkan efektivitas teknik ekstraksi. Semua ekstrak yang telah siap menjadi sasaran uji kimia Shinoda untuk memastikan adanya flavonoid di dalamnya. Skema ekstraksi oleh keempat metode yang dijelaskan secara singkat di bawah ini. 2.3.1. Ekstraksi secara maserasi Secara total, 5 g bubuk daun direndam dalam 50 mL pelarut [pelarut: rasio obat = 10: 1 (mL / g)] selama 72 jam pada suhu kamar. Campuran tersebut kemudian disaring dan filtrat diuapkan untuk mendapatkan residu menggunakan rotary evaporator (Hahn SHIN, HS-2005V-N) pada 40 C. Residu ditimbang dan dilakukan pengenceran yang tepat dibuat estimasi kuantitatif luteolin dalam ekstrak. 2.3.2. Ekstraksi dengan refluks ekstraksi pelarut panas dilakukan dengan menggunakan alat refluks selama 2 jam pada suhu 50 C dengan menggunakan pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g). Pengolahan lebih lanjut dari ekstrak dilakukan dengan cara yang sama seperti yang dibahas di atas dalam kasus maserasi. 2.3.3. Ekstraksi soxhletsekstraksi pelarut panas soxhlet dilakukan dengan menggunakan alat soxhlet selama 2 jam pada suhu 50 C dengan menggunakan pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g). Pengolahan lebih lanjut dari ekstrak dilakukan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya. 2.3.4. Ekstraksi melalui (UEA) USG dibantu ekstraksi dilakukan selama 20 menit dengan pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g) pada 50 C dalam sonikator (TOSCHON, SW7). Pengolahan lebih lanjut dari ekstrak dilakukan dengan cara yang sama dibahas di atas.2.4.1. Persiapan larutan standar Larutan stok standar luteolin disiapkan di HPLC kelas metanol pada konsentrasi 1 mg / mL. Deret standar dibuat pada konsentrasi 100, 125, 175, 200 dan 500 mg / mL dengan metanol dan disimpan pada suhu -20 C. Sebelum digunakan lebih lanjut, larutan dibawa ke suhu kamar. Setiap larutan standar disaring melalui 0,2 m filter membran (Axiva) dan kemudian diukur pada analisis HPLC untuk mendapatkan ketinggian puncak pada waktu retensi statis untuk setiap I larutan standar. Kurva kalibaras kemudian dibuat hubungan konsentrasi (mg / mL) dengan daerah puncak. Persamaan linear dari kurva standar digunakan untuk menentukan konsentrasi luteolin pada sampel uji.

2.4.2. Larutan sampel persiapan Sepuluh miligram berbagai ekstrak pelarut dari daun V. negundo L. dibuat dengan metode ekstraksi yang berbeda, ditimbang dan dilarutkan dalam HPLC kelas metanol untuk mendapatkan konsentrasi akhir 1 mg / mL. Solusi kemudian disaring melalui 0,2 um membran filter dan 20 uL larutan yang dan diukur analisis HPLC. Konsentrasi akhir luteolin dalam ekstrak dihitung dengan menggunakan persamaan linear pada kurva kalibrasi.

2.4.3. Kromatografi analisis kondisi Analisis HPLC dari ekstrak daun v dilakukan dengan HPLC Kuarter System (Shimadzu, Jepang) yang terdiri dari LC- 10AT VP pompa (Shimadzu, Jepang), panjang gelombang tunggal yang diprogram secara UV-detektor, dan sistem pengendali. Sampel disuntikkan dengan menggunakan injektor Rheodyne dilengkapi dengan 20 uL lingkaran tetap. Standar dan solusi sampel disaring melalui 0,2 m jarum suntik penyaring (Axixa) sebelum injeksi. Pemisahan dicapai dengan menggunakan kolom dengan 25 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 m, LiChrospher C18 kolom fase terbalik (Merck, Jerman). Penentuan luteolin dilakukan dengan fase gerak yang terdiri dari metanol dan 1% larutan asam asetat (99: 1 v / v) dengan laju alir 1,0 mL / menit. Pemisahan optimal di HPLC dicapai pada 30 C dan absorbansi diukur pada 289 nm.

3. Hasil3.1. Pengujian fitokimia Beberapa survei fitokimia telah dilakukan, termasuk pendekatan sampling secara acak yang melibatkan beberapa macam tanaman yang dikumpulkan dari seluruh penjuru dunia. Zat kimia utama yang menarik dalam survei fitokimia ini ialah alkaloid dan steroid sapogenins (saponin). Selain itu, terdapat juga senyawa fitokimia alami lain yang beragam seperti flavonoid, tanin, sterol tak jenuh, triterpenoid, minyak esensial, dll juga telah dilaporkan. (http://ijpr.sbmu.ac.ir/index.php/daru/article/view/article_16_0.html). Analisis fitokimia yang dilakukan pada ekstrak tumbuhan digunakan untuk mengungkapkan adanya konstituen sebagai aktifitas fisiologis obat (RNS Yadav dan Munin Agarwala 2011). [1]Pengujian fitokima yang dilakukan menggunakan dengan pelarut metanol, etanol, kloroform dan diklorometana pada semua ekstrak. Hasil Shinoda test menunjukkan adanya flavonoid. Tes Shinoda merupakan uji kualitatif penentuan flavonoid yang dilakukan dengan cara sebanyak 0,5 gram dari setiap contoh dilarutkan dalam pelarut hangat dan kemudian disaring. Magnesium selanjutnya ditambahkan ke filtrat diikuti oleh beberapa tetes HCl pekat. Terbentuknya warna jingga, merah muda, atau merah-keunguan menunjukkan adanya flavonoid. [6]

3.2. Ekstraksi luteolin oleh berbagai teknik ekstraksi Luteolin diekstraksi dari daun oleh empat teknik ekstraksi yang berbeda seperti maserasi, soxhlet, refluks dan UEA menggunakan etanol, metanol, kloroform dan diklorometana sebagai pelarut. Maserasi juga disebut ekstraksi dingin. Proses maserasi digunakan untuk memisahkan konstituen yang berbeda dan bahan-bahan tanaman dalam bentuk ekstrak kasar (Irshad dkk 2012). [2] Metode ekstraksi Ultrasoun-Assisted Extraction (UAE) telah diterapkan untuk bahan bioaktif dan minyak dari sumber tanaman sebagai cara yang efektif dan biaya yang efisien untuk beberapa tahun lalu. Seperti yang telah disertifikasi oleh Bimake et al. (2012), keuntungan dari UAE diantaranya yaitu waktu ekstraksi yang cepat, serta prosedurnya mudah dan menghasilkan hasil ekstraksi yang tinggi. Kekuatan ekstraksi UAE yaitu dalam ekstra getaran dalam molekul sampel, meningkatkan permukaan kontak dan kavitasi antara matriks dan pelarut cair, akibatnya meningkatkan hasil ekstraksi (yield) dalam waktu singkat. Selain itu, perangkat UAE dilengkapi dengan pengendalian suhu dengan pemulihan bahan thermo yang sensitive [3]

Selama percobaan, waktu ekstraksi, suhu ekstraksi dan obat: rasio pelarut dijaga konstan untuk semua pelarut. Hasil persen hasil dalam pelarut yang berbeda dengan berbagai teknik ekstraksi telah disajikan pada Tabel 1. Seperti yang diharapkan, berbagai jumlah hasil ekstrak diperoleh dengan pelarut yang berbeda dan teknik ekstraksi. Hasil maksimum dan minimum untuk ekstrak etanol (14,5% dan 5,2%) diperoleh dengan soxhlet dan teknik UEA masing-masing. Namun hasil ekstrak metanol ditemukan menjadi yang tertinggi dengan teknik UEA. Jumlah yang cukup kloroform dan diklorometana ekstrak diperoleh dengan refluks dan teknik soxhlet masing-masing. Secara umum, hasil dari ekstrak dengan refluks dan metode ekstraksi soxhlet (sistem pelarut panas) ditemukan lebih besar dari maserasi dan teknik UEA. Tabel 1

3.3 Estimasi kuantitatif dari luteolin dengan metode HPLC Larutan standar luteolin dan ekstrak sampel diukur dengan teknik HPLC menggunakan metanol dan 1% larutan asam asetat (99: 1 v / v) sebagai fase gerak, dalam mode isokratik (1 mL / menit). Percobaan linearitas menghasilkan kurva kalibrasi dari luteolin dibuat dengan lima pengenceran larutan standar pada konsentrasi berkisar 100-500 mg / mL. Persamaan regresi linier diperoleh dalam bentuk y = mx + c, di mana y dan x sesuai dengan area di bawah kurva dan konsentrasi masing-masing (Gambar 2). Persamaan regresi dan koefisien korelasi adalah sebagai berikut: y = 18.78x-1072; r2 = 0,998. Linieritas dari prosedur analitis adalah kemampuannya (dalam kisaran tertentu) untuk mendapatkan hasil tes yang berbanding lurus dengan konsentrasi (jumlah) analit dalam sampel. [7]. Jumlah relatif luteolin dalam ekstrak disiapkan kemudian dihitung dari persamaan ini dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Waktu retensi luteolin di HPLC kromatogram diamati pada 3,883 menit (Gambar 3 dan 4).Gambar 2. Kalibrasi plot luteolin.

Gambar 3. HPLC kromatogram luteolin standar (175 ug / mL).

Gambar 4. HPLC kromatogram ekstrak daun V. negundo metanol dengan teknik refluks.

Kuantifikasi ekstrak dengan metode yang berbeda dari V. negundo L. melalui HPLC mengungkapkan bahwa metanol adalah pelarut terbaik untuk ekstraksi luteolin. Kandungan luteolin dalam ekstrak metanol diperoleh melalui maserasi, soxhelation, refluks dan teknik UEA ditemukan 1.020%, 1.075%, 6,340% dan 0,640% masing-masing (Tabel 1). Dalam etanol, kandungan luteolin diekstraksi dengan berbagai teknik tidak setinggi dalam kasus metanol. Seperti terlihat, dalam pelarut lain seperti, kloroform dan diklorometana mengandung kisaran yg sgt sedikit yaitu di kisaran 0,5% -0.6%. Selain itu, ia juga mengamati bahwa di antara berbagai teknik yang digunakan untuk ekstraksi dan isolasi luteolin, teknik refluks ditemukan untuk menjadi yang paling efisien. Jelas, hasil penelitian kami menunjukkan bahwa metanol adalah pelarut yang paling sesuai untuk ekstraksi luteolin.

4. Diskusi Luteolin (3 ', 4', 5,7-tetrahidroksi-flavon) adalah salah satu flavonoid yang paling bioaktif yang ada di banyak jenis tanaman seperti peterseli, thyme, peppermint artichoke, daun perilla dan teh chamomile. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa luteolin memiliki berbagai sifat biokimia dan farmakologi, termasuk anti-platelet, anti-ulkus, anti-inflamasi, perlindungan kardiovaskular, anti-bakteri dan sifat antivirus [3-7]. Studi terbaru telah lebih lanjut menunjukkan bahwa hal itu bisa masuk ke inti sel dan menekan kerusakan oksidatif DNA, lipid, protein, dan karbohidrat [8, 9]. Oleh karena itu, control dan memantau dosis luteolin sangat penting dalam bidang klinis. Sampai saat ini, banyak metode telah dilaporkan untuk penentuan luteolin flavonoid, termasuk highperformance kromatografi cair (HPLC) [10-12], elektroforesis kapiler [13, 14], spektrofotometri [15], kromatografi gas (GC) [16] dll. [8]. Selama beberapa dekade banyak teknik ekstraksi baru terakhir telah dikembangkan untuk isolasi komponen bioaktif dari tanaman obat. Namun beberapa penelitian telah melaporkan bahwa aktivitas biologis ekstrak dipengaruhi oleh teknik ekstraksi yang digunakan. Oleh karena itu, penting untuk memilih pelarut yang cocok serta metode ekstraksi, yang paling dipengaruhi oleh adanya zat campur, berdasarkan sifat kimia dan fisika contoh matriks [19]. Luteolin merupakan konstituen penting dari V. negundo dan diketahui memiliki banyak manfaat terapeutik. Oleh karena itu, kandungan dari tanaman ini perlu diketahui. Luteolin hadir dalam jumlah yang sangat kecil sekali dalam daun tanaman ini. Oleh karena itu teknik HPLC digunakan untuk kuantifikasi nya. HPLC adalah teknik kromatografi yang umum digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif flavonoid dalam bahan tanaman karena dianggap metode yang paling mudah [20]. Juga pemisahan jauh lebih cepat daripada metode klasik dan memberikan resolusi tinggi dan sensitivitas. Hasil panen ekstrak bervariasi dengan pelarut dan / atau teknik ekstraksi tetapi maksimum% yield diperoleh dengan teknik refluks. Perbedaan hasil% daun ekstrak bisa disebabkan perbedaan dalam ketersediaan komponen diekstrak dengan teknik pelarut / ekstraksi yang berbeda [21]. Hal ini dapat disimpulkan bahwa metode ekstraksi pelarut panas adalah pilihan yang lebih baik untuk persiapan ekstrak dari leveas V. negundo dibandingkan dengan metode non thermal seperti maserasi atau UEA. Juga, hasil analisis HPLC menunjukkan bahwa kandungan luteolin merupakan yang tertinggi dalam ekstrak metanol terlepas dari teknik ekstraksi yang digunakan, yang berarti bahwa metanol adalah pilihan yang menguntungkan pelarut untuk ekstraksi luteolin. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa prosedur ekstraksi dan pelarut tidak mempengaruhi isolasi dan hasil luteolin dari V. negundo ekstrak daun. Hasil penelitian ini juga akan membantu para peneliti dalam memilih pelarut yang sesuai dan teknik ekstraksi yang tepat untuk isolasi luteolin dari daun ekstrak V. negundo, yaitu metanol dan refluks metode. Juga luteolin dapat digunakan sebagai biomarker dalam standardisasi dan pengawasan mutu daun ekstrak obat ini dalam industri herbal sebagai metode HPLC ini sederhana, selektif, sensitif dan cepat. Konflik pernyataan bunga Kami menyatakan bahwa kita tidak memiliki konflik kepentingan.

Ucapan Terima Kasih Penulis berterima kasih kepada Kepala, Departemen Farmakognosi dan Fitokimia, Jamia Hamdard, New Delhi, India untuk menyediakan fasilitas penelitian yang diperlukan untuk melaksanakan proyek ini. Para penulis juga ingin mengucapkan terima kasih AICTE, Pemerintah. India untuk mendukung proyek penelitian hibah lebar No. AICTE / M.PHARM / SS / 2011-2013).