1

POTENSI Bacillus sp. PENGHASIL SENYAWA BAKTERIOSIN ASAL TAMBAK UDANG

SEBAGAI PENGHAMBAT Vibrio harveyi

Asahedi Umoro1, Nisa Rachmania Mubarik2*, Widanarni3

1Program studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

2Departemen Mikrobiologi FMIPA Institut Pertanian Bogor

3Departemen Budidaya Perairan FPIK Institut Pertanian Bogor

*Corresponding Author: Telp. 0815 8321 972, Fax. 0251 8622833, email. riknisa9@gmail.com

Running title : Bacillus sp. penghasil Bakteriosin penghambat Vibrio harveyi

Abstract

One of the important bacterial pathogen in shrimp culture is Vibrio harveyi. Application of

Bacillus sp. is alternative solution to control the growth of bacterial pathogen in shrimp culture,

because this bacteria could produce antimicrobial polypeptides such as bacteriocins that can

inhibit growth of other bacteria. The objective of the research was to screen Bacillus sp. as

bacteriocin produce from shrimp farm in Pangandaran, West Java and examined their

antimicrobial activity againts Vibrio harveyi. Five potential bacterial were obtained and all of

bacterial suspect to produce bacteriocins. The LTP 1 isolate has the biggest antimicrobial

activity and selected to identify using 16s RNA, produce of bacteriocins on growth media culture,

and test antagonistic to Vibrio harveyi. The LTP 1 isolate was identified as Bacillus subtilis with

the similarity level 96%. Maximal activity of bacteriocin was recorded during the early stationay

phase. A reduction in antimicrobial activity was recorded after treatment of bacteriocins with

protease K. The 70% ammonium sulfate precipitate of bacteriocin is the highest inhibitory of

activity with index inhibitory 2,7; Activity Unit 2490 mm2/ml and could increase 142 % than

inhibitor zone. The LTP 1 isolate could be used as a potential bacteriocin and reduced growth of

Vibrio herveyi.

Keywords: Bacillus sp., bacteriocins, antimicrobial, Vibrio harveyi, shrimp

2

2

Abstrak

Salah satu bakteri patogen penting didalam budidaya udang ialah Vibrio harveyi. Aplikasi

Bacillus sp. dapat digunakan sebagai alternatif solusi untuk mengontrol pertumbuhan bakteri

patogen pada budidaya udang, dikarenakan bakteri Bacillus sp. dapat menghasilkan senyawa

antimikrob polipeptida seperti bakteriosin yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri

patogen. Tujuan dari penelitian ini adalah mengisolasi Bacillus sp. penghasil bakteriosin asal

tambak udang, Pangandaran, Jawa Barat dan melakukan pengujian aktifitas penghambatan

terhadap Vibrio harveyi. Lima isolat potensial berhasil diperoleh dan diduga sebagai penghasil

bakteriosin. Isolat LTP 1 merupakan isolat dengan aktivitas antimikrob terbesar dan dipilih untuk

analisa molekuler dengan 16s RNA, produksi bakteriosin pada media pertumbuhan, dan uji

antagonis penghambatan terhadap Vibrio harveyi. Isolat LTP 1 telah diidentifikasi sebagai

Bacillus subtillis dengan tingkat kesamaaan 96%. Aktivitas maksimal antimikrob bakteriosin

terjadi pada awal fase stasioner. Penurunan aktivitas antimikrob bakteriosin terjadi setelah

dilakukan perlakuan dengan enzim protease K. Pengendapan bakteriosin dengan amonium

sulfat 70% memiliki aktivitas penghambatan terbesar dengan indeks penghambatan 2,7; aktifitas

unit penghambatan 2490 mm2/ml dan dapat meningkatkan zona penghambatan sebesar 142%.

Isolat LTP 1 dapat digunakan sebagai bakteriosin yang potensial dan menekan pertumbuhan

Vibrio harveyi.

PENDAHULUAN

Udang merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan budidaya di Indonesia,

dengan permintaan dunia yang terus mengalami peningkatan dari tahun ke tahun. Sebagai

salah satu negara penghasil udang, tantangan terbesar yang dihadapi oleh pembudidaya ialah

serangan penyakit. Salah satu penyakit bakterial yang paling serius dan sering menyebabkan

kematian masal pada saat budidaya adalah vibriosis yang disebabkan oleh bakteri patogen

Vibrio harveyi. Alternatif pengendalian penyakit udang yang disebabkan Vibrio harveyi di tambak

udang ialah dengan memanfaatkan Bacillus sp. Bacillus sp. diketahui menghasilkan senyawa

3

antimikrob berupa bakteriosin yang memiliki kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri

patogen gram positif dan gram negatif (Jianhua et el. 2009) dan dapat diisolasi dari sendimen,

lingkungan perairan dan saluran pencernaan udang (Ravi et al. 2007).

Bakteriosin sendiri merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di

ribosom. Proses sintesis ini berlangsung selama masa pertumbuhannya dan umumnya hanya

menghambat galur-galur yang berkerabatan dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin dan

beberapa memiliki aktivitas penghambatan yang berspektrum luas (Drider et al. 2006).

Senyawa aktif bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus sp. diharapkan dapat

menekan dan mengendalikan bakteri patogen Vibrio harveyi yang menyerang udang dan

penyebab kegagalan panen. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menyeleksi bakteri

Bacillus sp. penghasil bakteriosin asal tambak udang Pangandaran Jawa Barat, yang potensial

digunakan untuk menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi.

METODE

Pengambilan Sampel. Pengambilan sampel air dan sendimen lumpur diambil dari tambak

udang daerah Pangandaran Jawa Barat. Sampel air diambil sebanyak 100 ml sedangkan

sedimen diambil kira-kira 100 g kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel. Semua sampel

disimpan di dalam kondisi dingin hingga sampai di laboratorium (Jamilah et al. 2011).

Seleksi Isolat Bacillus sp. Sampel bakteri diencerkan dengan garam fisiologis hingga

pengenceran 10-4-10-6 kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 80 0C selama 15

menit. Sebanyak 0.1 mL sampel kemudian disebar pada media agar-agar SWC (seawater

complete) 50% yang mengandung 1.5 gL-1 bakto pepton, 0.5 gL-1, ekstrak ragi dan 1.5 mL-1,

gliserol dalam campuran air laut dan akuades dengan perbandingan 3:1, kemudian diinkubasi

pada suhu ruang. Metode ini memberi peluang bagi tertapisnya Bacillus (Jamilah et al. 2011).

4

4

Uji Aktivitas Penghambatan Antimikrob. Isolat bakteri Bacillus sp. dan bakteri V. harveyi

diremajakan pada media SWC, kemudian diinkubasi selama ± 2 hari. Untuk mengetahui

kemampuan isolat bakteri Bacillus sp. yang menghasilkan zat antimikrob, dilakukan uji

penghambatan terhadap V. harveyi. Sebanyak 50 µl biakan bakteri V.harveyi dengan kepadatan

sel 106 CFU/ml disuspensikan dalam 50 ml SWC semipadat, kemudian dituang sekitar ± 10 ml

pada permukaan SWC padat dan didiamkan beberapa saat hingga beku. Selanjutnya isolat

bakteri Bacillus sp. yang berumur dua hari digores atau ditotolkan pada SWC agar yang sudah

berisikan bakteri V. harveyi dengan menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu ± 280C

selama 24 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa antimikrob

menunjukan adanya zona bening (zona penghambatan) di sekitar koloni dan dihitung Indeks

penghambatannya dengan menggunakan rumus:

Indeks Penghambatan =

Uji Aktivitas Penghambatan Bakteriosin. Isolat yang sudah diketahui indeks

penghambatannya terhadap V. harveyi ditumbuhkan pada media SWC cair dan diinkubasi

selama 24 jam pada inkubator bergoyang pada suhu ± 280 C, kemudian kultur bakteri

disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm (Sentrifuge Hermle dengan rotor 220.97) selama 5

menit. Supernatan dilakukan penetralan pada pH 7 dengan penambahan 0,1 M NaOH.

Sebanyak 100 µl biakan bakteri V. harveyi dengan kepadatan sel 106 CFU/ml dituang pada

media SWC agar dan dilakukan penggoresan dengan menggunakan cotton bud steril untuk

meratakan. Sebanyak 50-100 µl supernatan di teteskan ke kertas cakram berukuran 5 mm.

Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 280C dan zona bening (zona penghambatan)

yang terbentuk dihitung (Sharma et al. 2011) dan aktivitas unit (mm2/ml) penghambatan

bakteriosin dihitung dengan persamaan (Usmiati & Marwati. 2007).

Akitivitas unit (mm2/ml)=

5

Untuk memastikan bahwa aktivitas penghambatan yang terjadi disebabkan oleh

senyawa polipeptida bakteriosin, maka dilakukan uji kepekaan terhadap enzim proteolitik

dengan menambahkan enzim protease K (1 mg/ml) dan supernatan dengan perbandingan 1:1

dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ± 280C kemudian diuji aktivitas penghambatan terhadap

V. harveyi. (Nguyen et al. 2014).

Kurva Tumbuh dan Penentuan Sintesis Bakteriosin. Satu lup isolat Bacillus sp. terpilih yang

berumur 24 jam dan memiliki aktivitas penghambatan terbesar ditumbuhkan pada 10 ml media

SWC cair kemudian ditumbuhkan selama 12 jam. Kemudian pindahkan sebanyak 1,5 ml kultur

ke dalam media cair 150 ml dan diinkubasi selama 24 jam untuk diamati pertumbuhan sel

dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm setiap 3 jam. Penentuan

sintesis bakteriosin dilakukan setiap 3 jam selama 24 jam dengan diambil sebanyak 3 ml kultur

ke dalam tabung mikro dan dilakukan sentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm (Centrifuge Hermle

dengan rotor 220,97) selama 5 menit kemudian supernatan bebas sel kita uji aktivitas

antimikrobnya terhadap V. harveyi (Lisboa et al. 2006) dan dihitung kadar proteinnya.

Pengendapan Amonium Sulfat, Perhitungan Kadar Protein dan Penentuan Bobot Molekul.

Isolat Bacillus sp. terpilih ditumbuhkan di dalam kultur cair hingga memasuki fase awal stationer,

lalu sel dipisahkan dengan sentrifugasi dan protein di dalam supernatan dilakukan presipitasi

dengan penambahan 10% amonium sulfat secara bertingkat dari 30-80%. Kemudian presipitat

dilarutkan kedalam sodium phospate–buffer saline pH 7 (PBS). Hasil presiptasi ammonium

sulfat kemudian dilakukan pengujian aktivitas antimikrob (Lisboa et al. 2006) dan dihitung

konsentrasi protein. Selanjutnya dilakukan elektroforesis SDS-pages untuk penentuan bobot

molekul. Penentuan bobot molekul ditentukan dengan menggunakan 12% gel pemisah dan 4%

gel penumpuk. Kondisi elektroforesis ialah 50 mA, 100 volt selama 30 menit. Hasil

elektroforesis diwarnai oleh Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250). Bobot molekul sampel

dihitung dengan menggunakan kurva standar bobot molekul protein.

6

6

Karakterisasi Isolat Bakteri. Isolat Bacillus sp. dikarakterisasi berdasarkan ciri-ciri morfologi

dan fisiologi berdasarkan: pewarnaan Gram, dan spora mengikuti Bergey’s Manual of

Determintive Bacteriology.

Identifikasi Molekuler Bakteri Terpilih. Isolasi DNA genom dilakukan menggunakan Geneid

Presto Mini gDNA Bacteria Kit. Primer yang digunakan ialah primer spesifik untuk prokariot, 63f

(5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’)

Komposisi reaksi PCR dengan volume reaksi 50 µl yang mengandung 25 µl mix PCR, 0.8 µl

DNA template, 0.5 µl primer forward (10 pmol), 0.5 µl primer reverse (10 pmol) dan 23.2 µl

ddH2O steril. Kondisi PCR yaitu pradenaturasi (94 0C, 5 menit), denaturasi (94 0C, 1 menit),

annealing (55 0C, 1 menit), elongation (72 0C, 1 menit), dan post elongation (72 0C, 7 menit)

sebanyak 27 siklus. Elektroforesis dengan menggunakan agarosa 1% pada tegangan listrik 80

Volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan di atas UV transluminator menggunakan

pewarna Etidium Bromida (EtBr). DNA hasil amplifikasi disekuen untuk mengetahui urutan basa

nukleotidanya. Urutan basa nukleotida hasil sekuen kemudian disejajarkan dengan data

GeneBank menggunakan program BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida)

dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Analisis filogenetik dilakukan

menggunakan program MEGA 6 dengan metode Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap

1000x.

Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap V. Harveyi. Bakteriosin

hasil pengendapan ammonium sulfat diinokulasi bersama dengan bakteri V. harveyi (106

CFU/ml) pada media SWC cair 50 ml dengan perbandingan 1:1 (50 µl : 50 µl) dan 1:2 (100 µl :

50 µl) dan satu erlemeyer digunakan sebagai kontrol (tanpa penambahan bakteriosin). Inkubasi

dilakukan selama 24 jam pada suhu ± 28 0C untuk menentukan kemampuan penghambatan

bakteriosin terhadap V. harveyi. Jumlah sel V. harveyi yang tumbuh dihitung dengan metode

cawan sebar pada media SWC padat. Sedangkan uji kompetisi Bacillus sp. dengan bakteri V.

harveyi dilakukan dengan menginokulasikan Bacillus sp. dan V. harveyi dengan perbandingan

7

1:1 (50 µl : 50 µl) dan 2:1 (100 µl : 50 µl) diinkubasi selama 24 jam. Kemampuan kompetisi

ditentukan dengan menghitung jumlah V. harveyi dengan metode cawan sebar. Penentuan

persentase penghambatan dihitung dengan persamaan.

Persen Penghambatan =

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin. Sebanyak 22 isolat Bacillus sp. diperoleh dari

sampel sendimen lumpur dan air tambak udang Pangandaran, Jawa Barat. Penapisan Bacillus

sp. dilakukan dengan cara memanaskan sampel dalam larutan garam fisiologis pada suhu 800 C

selama 15 menit. Metode ini sudah menjadi cara yang umum dilakukan untuk menyeleksi

Bacillus dari sampel alam, karena bakteri ini merupakan bakteri penghasil endospora.

Endospora akan tahan terhadap suhu pemanasan dan bakteri yang tertapis ialah kelompok

Bacillus (Jamilah et al. 2011). Bakteri ini memiliki ciri-ciri koloni yang spesifik seperti permukaan

yang berpati, umumnya berwarna krem keputihan atau kekuningan jika ditumbuhkan pada

media padat. Bacillus dari tambak udang diperkirakan termasuk kepada kelompok bakteri

mesofilik. Suhu perairan tambak udang berkisar antara 26-320 C. Pada penelitian ini, sendimen

lumpur merupakan sumber Bacillus yang paling dominan dibandingkan dengan sampel lainnya.

Hal ini dapat disebabkan banyaknya nutrisi dari sisa pakan yang ikut terakumulasi pada

sendimen sebagai sumber nutrisi bagi Bacillus.

Dari 22 isolat yang didapat dilakukan seleksi penghambatan terhadap bakteri Vibrio

harveyi dan diperoleh 12 isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob. Dari 12 isolat yang

mempunyai kemampuan antimikrob kemudian di pilih 5 isolat terbaik yaitu: LTP 1, LTP 4, LTP 6,

LTP 14, dan ATP 2, yang memiliki indeks penghambatan terbesar (Tabel 1) untuk diamati

karakteristik morfologi isolat dan diuji lanjut aktivitas antimikroba bakteriosin.

Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. Hasil uji aktivitas penghambatan sel lima isolat Bacillus

sp. penghasil antimikrob dari tambak udang terhadap V.harveyi (sel 106 cfu/ml) menunjukan

8

8

bahwa indeks penghambatan yang didapat berkisar antara 1,07-1,77 dengan nilai tertinggi pada

isolat LTP 1 dan aktivitas penghambatan supernatan bebas sel untuk kelima isolat berkisar

antara 1,53 – 1,93 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1 (Tabel 2). Faktor yang mempengaruhi

besar kecilnya aktivitas penghambatan zat antimikrob diantaranya adalah aktivitas zat

antimikrob gugus fungsi dari substansi sendiri, resistensi dari bakteri terhadap substansi zat

antimikrob, kadar substansi aktif serta jumlah inokulum atau kepadatan bakteri uji (Noaman et

al. 2014)

Aktivitas unit yang didapat dari kelima isolat Bacillus sp. berkisar antara 1063-1492

mm2/ml, dan berdasarkan pengujian kepekaan enzim proteolitik dengan menggunakan enzim

protease K menunjukan bahwa kelima supernatan bebas sel ternyata sensitif terhadap enzim

protease (Gambar 1). Hal ini ditunjukkan kelima isolat menurun aktivitas penghambatannya

terhadap V. harveyi ketika diuji supernatan bebas sel dengan perlakuan enzim protease K, ini

menunjukan bakteriosin merupakan senyawa polipeptida (protein) yang peka terhadap enzim

protease K dan enzim protease mampu mendegradasi senyawa bakteriosin. Berdasarkan

penelitian Lisboa et al (2006). tingkat sensitivitas pada perlakuan enzim protease terkait dengan

konsentrasi enzim protease pada perlakuan, asam-asam amino, dan rantai peptida yang dimiliki

oleh bakteriosin.

Kurva Tumbuh dan Sintesis Bakteriosin. Isolat LTP 1 yang merupakan isolat dengan

kemampuan penghambatan terbaik sehingga dipilih untuk dilakukan pengamatan terhadap laju

fase pertumbuhan, waktu sintesis bakteriosin, dan pengukuran kadar proteinnya. Sintesis

bakteriosin sudah mulai terjadi pada fase logaritmik, dimana aktivitas penghambatan supernatan

(bakteriosin) mulai terjadi pada waktu pengamatan jam ke-9 dengan zona hambat yang terjadi 8

mm (Gambar 2). Bakteriosin merupkan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di

ribosom, proses sintesis ini berlangsung selama masa pertumbuhannya (Drider et al. 2006).

Perhitungan kadar protein yang didapat selama fase pertumbuhan berkisar antara 16,7 10-2

mg/ml sampai 69,4 x 10-2 mg/ml.

9

Pengendapan Amonium Sulfat dan Perhitungan Bobot Molekul Bakteriosin. Pengendapan

dengan menggunakan amonium sulfat bertujuan untuk meningkatkan konsentrasi protein

sehingga diperoleh zat antimikrob dalam jumlah yang banyak. Pengendapan dilakukan secara

bertingkat dengan penambahan amonium sulfat 10% mulai pengendapan 30%-80%. Hasil

pengendapan 60-70% dan 70-80% menunjukan aktivitas penghambatan tertinggi dengan nilai

penghambatan sebesar 18,5 mm dan 16,5 mm (Gambar 3). Peningkatan zona hambat sebesar

142 % terjadi pada pengendapan 60-70% dengan nilai AU sebesar 2490 (mm2/ml) dan

peningkatan zona hambat sebesar 126 % untuk pengendapan 70-80% dengan nilai AU

1941(mm2/ml) jika dibandingkan dengan ekstrak kasar supernatan sebelum pengendapan

(Tabel 3). Penelitian ini memiliki kesamaan dengan penelitian yang dilakukan oleh Sharma et al.

(2011) bahwa Bacillus subtilis R75 memiliki aktivitas penghambatan bakteriosin tertinggi hasil

pengendapan pada konsentrasi 70% dengan aktivitas penghambatan menunjukkan spektrum

penghambatan yang luas.

Hasil pemisahan protein hasil pengendapan bakteriosin dengan SDS-PAGE menunjukkan

bahwa bobot molekul dari bakteriosin ekstrak kasar dan bakteriosin hasil pengendapan

bervariasi antara 10,03 kDa hingga sekitar 22,46 kDa (Gambar 4). Bakteriosin dengan

pengendapan 80% dan 70% amonium sulfat memperlihatkan adanya 4 pita dengan bobot

molekul yang bervariasi masing-masing sebesar 10,03 kDa, 15,12 kDa, 18,75 kDa, dan 22,46

kDa. Pita hasil pengendapan ammonium sulfat memiliki pita yang lebih tebal dibandingkan

dengan pita hasil ekstrak kasar bakteriosin ini menunjukan semakin tebal pita hasil

elektroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi protein semakin tinggi.

Identifikasi Molekuler. Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S rRNA didapatkan produk pita

yang berukuran 1300 bp yang menunjukkan gen 16S rRNA yang teramplifikasi. Hasil analisis

filogenetik dengan BLASTN isolat LTP 1 menunjukan bahwa isolat LTP 1 mempunyai

kekerabatan dekat dengan Bacillus subtilis galur DSM 10 dengan tingkat kemiripan 96%

10

10

(Gambar 5). Bacillus subtilis merupakan bakteri yang diketahui dapat menghasilkan bakteriosin

jenis subtilisin A (Sharma et al. 2011).

Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap V. Harveyi. Hasil uji

kompetisi penghambatan bakteriosin dan Bacillus LTP 1 terhadap V. harveyi pada kultur cair

selama 24 jam inkubasi menunjukkan adanya kemampuan penghambatan terhadap

pertumbuhan V. harveyi. Persentase penghambatan bakteriosin tertinggi terjadi pada bakteriosin

hasil pengendapan 70 % dengan perbandingan 2:1 yaitu sebesar 59,36 % sedangkan

penghambatan untuk isolat Bacillus LTP 1 terhadap pertumbuhan V.harveyi terbesar terjadi

pada perlakuan konsentrasi 2:1 dengan penghambatan 43,07 % (Gambar 6). Bacillus subtilis

yang banyak terdapat pada lingkungan tambak udang diketahui memiliki kemampuan untuk

menghambat V. harveyi sehinga dapat menurunkan tingkat kematian pada budidaya udang

Litopenaeus vannamei dan dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik dalam akuakultur

(Balcazar & Rojas-Luna, 2007).

SIMPULAN

Bakteriosin yang dihasilkan Bacillus LTP 1 memiliki kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan Vibrio harveyi, persentase penghambatan sebesar 59,36 %. Sintesis bakteriosin

mulai terjadi pada fase logaritmik dengan indeks penghambatan bakteriosin setelah diendapan

dengan ammonium sulfat 70 % yaitu 2,7 dan aktifitas unit 2490 mm2/ml. LTP 1 memiliki

kemiripan 96% dengan Bacillus subtilis galur DSM 10 berdasarkan hasil identifikasi dengan gen

16 sRNA.

DAFTAR PUSTAKA

Balcazar J L, Rojas-Luna T. 2007. Inhibitory Activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126

against Vibrio Species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp (Litopenaeus

vannamei). Current Microbiology 55: 409-412.

11

Drider D, Fimland G, Hechard Y, McMullen M, Prevost H. 2006. The continuing story of class IIa

bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev. 70(2):564-582.

Jamilah IT, Meryandini A, Rusmana I, Suwanto A, Mubarik NR. 2011. Activity of proteolytic and

amylolytic enzymes from Bacillus sp. isolated from shrimp ponds. Microbiol Indones. ISSN

1978-3477

Jienhua X, Zhang R, Shang C, Guo Y. 2009. Isolation and characterization of a bacteriocin

produced by an isolate Bacillus subtilis LFB112 that exhibits antimicrobial activity against

domestic animal phatogens. Afr J Biotechnol vol 8 (20) 5611-5619. ISSN 1684-5315.

Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a

bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloli quefaciens isolated from the Brazilian

Atlantic forest. Int Microbiol (9):111-118.

Noaman N H, Fattah A, Khaleata M, Zaky S H. 2014. Factor affecting antimicrob activity of

Synechococus leopoliensis. Microbiol research 395-402.

Nguyen Daln V, T Pham, T H Thanh Nguyen, T T Xuan Nguyen. 2014. screning of marine

bacteria with bacteriocin – like activities and probiotik potential for ornate spiny lobster (Panuliris

ornatus) juveniles. J Fish Shelfish Immunolo 40 (2014) 49-60.

Sharma N, Kapoor R, Gautam N, Kumari R. 2011. Purification and characterization of

bacteriocin produced by Bacillus subtilis R75 isolated from fermented chunks of mung bean

(Phaseolus radiatus). Food Technol Biotechnol 49 (2) ISSN 1330-9862.

Ravi A V, Musthafa K S, Jegathammbal G, Kathiresan K, Pandian S K. 2007. Screening and

evaluation of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic Vibrios in marine aquaculture.

Lett in App Microbiol (219-223) ISSN 0266-8254.

Usmiati S, Marwati T.2007 Seleksi dan optimasi proses produksi bakteriosin dari Lactobacollus

sp. J. Pascapanen 4 (1) 27-37.

12

12

Tabel 1 Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat Bacillus sp. terpilih

No Morfologi Isolat Bacillus sp. Terpilih

LTP 1 LTP 4 LTP 6 LTP 14 ATP 2

A. Koloni

1 Tepi Utuh Berombak Berombak Berombak Utuh

2 Elevasi Timbul Rata Melengkung Melengkung Timbul

3 Warna Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu

B. Sel

4 Bentuk Batang Batang Batang Batang Batang

5 Gram Positif Positif Positif Positif Positif

6 Endospora Ada Ada Ada Ada Ada

Tabel 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih.

No Asal Isolat Kode

Isolat

Indeks Penghambatan Aktifitas Unit

mm2/ml

Protein

mg/ml

Kepekaan

Protease Sel Supernatan

1 Sendimen LTP 1 1,77±0,93 1,93±0,12 1492 0,0834 +

2 Sendimen LTP 4 1,26±0,16 1,67±0,31 1199 0,0697 +

3 Sendimen LTP 6 1,22±0,38 1,53±0,31 1063 0,0661 +

4 Sendimen LTP 14 1,07±0,81 1,8±0,20 1342 0,0796 +

5 Air ATP 2 1,53±0,35 1,73±0,31 1270 0,0763 +

Tabel 3 Perbandingan aktivitas penghambatan sebelum dan sesudah pengendapan

No Perbandingan

Zona

hambat

(mm)

Indeks

Penghambatan AU (mm2/ml)

Kadar

protein

(mg/ml)

Peningkatan

zona hambat

1 Supernatan 13 1,6 1130 0,0811

2 60-70 % 18,5 2,7 2490 0,0905 142%

3 70-80 % 16,5 2,3 1941 0,0773 126%

Gambar 1 Aktifitas penghambatan bakteriosin pada uji kepekaan enzim protease a) buffer PBS

pH 7, b) supernatan + protease K, c) supernatan

13

Gambar 2 Kurva tumbuh isolat LTP 1 pada media pertumbuhan SWC cair, aktivitas

penghambatan dan kadar protein selama 24 jam pada suhu ±280C.

Gambar 3 Hasil pengendapan amonium sulfat terhadap penghambatan V. harveyi dan kadar

protein hasil pengendapan

Gambar 4 Penentuan bobot molekul bakteriosin isolat LTP 1 dengan SDS-PAGE. 1) Ekstrak

kasar, 2) Pengendapan 70% bakteriosin, 3) Pengendapan 80% bakteriosin

1 2 3

10 kDa

15 kDa

20 kDa

25 kDa

200

kDa

10,03 kDa 15,12 kDa

18,75 kDa

kDakDa

22,46 kDa

14

14

Gambar 5 Hasil amplifkasi 16 sRNA dan kontruksi filogenetik isolat LTP 1

Gambar 6 Uji kompetisi penghambatan bakteriosin dan Isolat Bacillus sp. LTP 1 terhadap V.

harveyi pada media SWC cair

0.02

96

85

78