20

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Universitas

Katolik Widya Mandira Kupang, pada bulan November 2017. Buah pinang

diambil dari Kabupaten Nagekeo.

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

a. Lesung : Untuk menghaluskan buah pinang yang sudah

kering

b. Pisau : Untuk mengupas kulit buah pinang dan

mengiris daging buah pinang

c. Labu Erlenmeyer : Untuk menampung hasil saringan maserasi dan

tempat menyimpan media

d. Tabung reaksi : Sebagai wadah saat pengenceran

e. Gelas kimia : Sebagai tempat maserasi serbuk buah pinang

f. Vortex : Untuk mengaduk/mencampurkan larutan dalam

tabung reaksi sampai betul-betul homogeny

g. Autoclave : Untuk mensterilisasi media

h. Jangka sorong

(mm)

: Untuk mengukur zona bening yang terbentuk

pada kertas cakram.

i. Hot plate : Untuk memanaskan media

j. Bunsen : Untuk memanaskan/mensterilkan jarum ose

21

agar tetap steril saat inokulasi

k. Gunting : Untuk memotong kertas saring

l. Rotary

evaporator

: Untuk menguapkan etanol agar didapatkan zat

aktif murni buah pinang

m. Neraca analitik : Untuk menimbang serbuk buah pinang

n. Micro pipet : Untuk memindahkan biakan E.coli saat

pengenceran dan mengambil biakan E.coli saat

inokulasi

o. Cawan petri : Sebagai wadah untuk pembiakan bakteri yang

akan diteliti zona hambatnya

p. Inkubator : Untuk menginkubasi tabung reaksi saat

peremajaan bakteri dan menginkubasi cawan

petri saat uji antibakteri

q. Jarum ose : Untuk mengambil biakan E.coli dengan cara

menggoreskannya saat peremajaan.

r. Kamera digital : Untuk memotret hasil penelitian berupa zona

hambat yang terbentuk ada cawan petri dan

berbagai perlakuan yang dilakukan saat

penelitian

22

2. Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah :

a. Buah Pinang (Areca catechu L.)

b. Biakan bakteri Escherichia coli

c. Aquades steril

d. Media Nutrien Agar (NA)

e. Alkohol 95%

f. Kapas

g. Kertas cakram 10 mm

h. Tissue

i. Kertas putih

j. Es batu

k. Kertas saring

l. Kertas label

m. Aluminium foil

C. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi : Ekstrak Buah Pinang ( Areca catechu L.)

Sampel : Konsentrasi ekstrak buah pinang ( Areca catechu L.)

yang akan dipakai dalam .penelitian yakni 25%, 50%,

75% dan 100%

D. Variabel Penelitian

Variabel bebas

Variabel terikat

:

:

Pemberian konsentrasi ekstrak buah pinang

( Areca catechu L.) 25%, 50%, 75%, 100%

Pertumbuhan bakteri Escherichia coli

E. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL);

menggunakan desain Posttest Only Control Group Design, dengan 4 perlakuan

dan 1 kontrol. Dimana konsentrasi P1=25%, P2=50%, P3=75%, P4=100%, yang

akan diulang sebanyak 3 kali ulangan, serta aquades sebagai kontrol negatif

23

Bagan 3.1 Bagan desain penelitian

Keterangan :

RAL : Rancangan acak lengkap

P1-P4 : Perlakuan dengan ekstrak buah pinang

O1-O5 : Observasi atau pengamatan buah pinang

Tabel 3.1 Rancangan Acak Lengkap

P12 P31 P23

P41 P23 P43

P23 P42 P32

P41 P31 P42

P1

P2

P3

P4

K

RAL

P12

P13

P21

P22

P23

P31

P32

P33

P41

P42

P43

K1

K2

K3

O1

O1

O2

O2

O2

O3

O3

O3

O4

O4

O4

OK

OK

OK

P12

O1

24

F. Prosedur Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan dengan tahapan sebagai berikut :

1. Tahap persiapan

a. Sterilisasi alat

1. Alat-alat yang akan disterilkan, dibungkus dengan kertas, lalu dimasukkan

dalam autoclave dan disterilkan pada suhu 121℃ selama 15 menit.

2. Setelah sterilisasi, dikeluarkan dari autoclave, dan dikeringkan di oven

b. Pembuatan media Nutrien Agar (NA)

1. Ditimbang 40 g bubuk Nutrien Agar (NA) menggunakan neraca analitik

2. Dilarutkan dalam 1000 ml aquades steril

3. Dipanaskan larutan pada hot plate sambil diaduk-aduk sampai mendidih dan

disterilkan dalam autoclave pada suhu 121o C selama 15 menit.

2. Menyiapkan bahan uji

a. Persiapan sampel

Buah pinang (Areca catechu L.) diambil yang sudah tua, lalu dikupas

dengan menggunakan pisau bersih, kemudian diiris tipis-tipis, dan dikering

anginkan. Irisan buah pinang yang sudah kering dihaluskan (ditumbuk

mengunakan lesung) untuk mendapatkan serbuk (simplisia). Hasil yang diperoleh

digunakan sebagai sampel penelitian.

b. Ekstraksi buah pinang dengan Metode Maserasi

1. Ditimbang serbuk atau bubuk buah pinang sebanyak 500 g dimasukkan ke

dalam Labu Erlenmeyer, ditambahkan alkohol 95% sebanyak 500 ml dan

diaduk. dimaserasi selama dua (2) hari.

25

2. Kemudian disaring menggunakan corong Buchner.

3. Larutan hasil penyaringan diendapkan dan dipisahkan antara meseret dari

endapan dengan hati-hati.

4. Hasil maserasi diuapkan dalam cawan porselen di atas pemanas air atau

penguap putar (ratavapor) pada suhu 45-50o C dengan tekan rendah

(±mmHg) hingga diperoleh ekstrak kental, (Ningsi, et al. 2009 dalam

Lalong, P. 2015)

c. Pembuatan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan 100%

Pembuatan konsentrasi ekstrak mengadopsi dari (Zaenab et al, 2004 dalam

Sine 2012)

Pembuatan konsentrasi dengan rumus:

% Konsentrasi = 𝑚

𝑉 × 100%

Keterangan:

% konsentrasi = Proporsi konsentrasi ekstrak yang terdapat di dalam pelarut.

M = Berat/ massa dari ekstrak (gram)

V = Jumlah total antara ekstrak dan pelarut setelah ditambahkan

pelarut (mL).

1. Konsentrasi 0% hanya menggunakan aquades sebanyak 10 ml tanpa ekstrak

(kontrol negatif).

2. % = 𝑚

𝑣 × 100%

25% = 𝑚

10 𝑚𝑙 × 100%

25% = 100% × 𝑚

10 𝑚𝑙

26

100% 𝑚 = 25% × 10 𝑚𝑙

100 ×𝑚 = 250

m = 250

100

= 2,5 gram

Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 25% adalah 2,5 gram.

3. % = 𝑚

𝑣× 100%

50% = 𝑚

10 𝑚𝑙× 100%

50% = 100% × 𝑚

10 𝑚𝑙

100% ×𝑚 = 50% × 10 𝑚𝑙

100 ×𝑚 = 500

m = 500

100

= 5 gram

Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 50% adalah 5 gram.

4. % = 𝑚

𝑣× 100%

75% = 𝑚

10 𝑚𝑙× 100%

75% = 100% × 𝑚

10 𝑚𝑙

100% ×𝑚 = 75% × 10 𝑚𝑙

100 ×𝑚 = 750

m = 750

100

= 7,5 gram

Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 75% adalah 7,5 gram.

27

5. % = 𝑚

𝑣× 100%

100% = 𝑚

10 𝑚𝑙× 100%

100% = 100% × 𝑚

10 𝑚𝑙

100% ×𝑚 = 100% × 10 𝑚𝑙

100 ×𝑚 = 1000

m = 1000

100

= 10 gram

Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 100% adalah 10gram.

3. Tahap persiapan bakteri uji Escherichia coli

a. Peremajaan biakan murni

Peremajaan biakan murni bertujuan mendapatkan suatu biakan murni

tanpa kontaminasi dari jenis bakteri lain dan diperoleh biakan bakteri yang baru

dan segar. Biakan murni bakteri diremajakan pada media Nutrien Agar (NA)

miring dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri

Escherichia coli secara aseptis yaitu dengan mendekatkan mulut tabung pada

nyala api saat menggoreskan jarum ose. Kemudian tabung reaksi ditutup kembali

dengan kapas dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃ dalam inkubator.

b. Membuat seri pengenceran

Tujuan Membuat seri pengenceran adalah bertujuan agar populasi mikroba

yang tumbuh pada media tidak terlalu padat sehingga akan lebih mudah dalam

mengidentifikasinya mikroba.

Tahapan-tahapan membuat seri pengenceran adalah sebagai berikut:

28

1. Mengencerkan biakan Escherichia coli sebanyak 4 kali. Pengenceran 10-1

dapat dilakukan dengan cara diambil Escherichia coli dalam media Nutrien

Agar (NA) sebanyak 1 ose, kemudian dimasukkan kedalam aquades 9 ml

kemudian divortex sampai homogen.

2. Pengenceran 10-2

, diambil 1 ml larutan pengenceran 10-1

lalu masukkan ke

dalam aquades 9 ml kemudian kocok sampai homogen. Pengenceran 10-3

sampai 10-4

akan dilakukan seperti 10-1

dan 10-2

dan yang akan diambil adalah

serial pengenceran keempat.

c. Tahap Uji Antibakteri

1. Kertas cakram steril direndam dalam ekstrak buah pinang untuk konsentrasi

0%, 25%, 50%, 75% dan 100% selama 30 menit

2. Bakteri Escherichia coli diinkubasikan pada media Nutrien Agar (NA)

dengan cara ambil 0,1 ml biakan bakteri Escherichia coli yang telah

diencerkan dan dimasukkan ke dalam petridish dengan teknik pour plate lalu

tuangkan Nutrien Agar (NA) dan biarkan sampai membeku setelah itu kertas

cakram yang telah direndam dalam ekstrak ditempelkan pada media Nutrien

Agar (NA) yang sudah diinokulasi bakteri Escherichia coli, kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃.

3. Zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram, diukur diameternya.

4. Teknik pengambilan data

Teknik pengambilan data dengan mengukur besarnya zona bening ekstrak

buah pinang dalam menghambat bakteri Escherichia coli adalah dengan cara

mengukur zona bening (zona dimana terjadinya penghambatan pertumbuhan

29

bakteri) yang terbentuk oleh kertas cakram pada media yang telah diinkubasi

selama 24 jam dengan menggunakan jangka sorong.

G. Analisis Data

Teknik analisa data yang digunakan adalah analisis varians (ANAVA) satu

arah untuk mengetahui ada tidaknya kemampuan antibakteri ekstrak buah pinang

(Areca catechu L.) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan apabila

terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata

Terkecil (BNT) dengan tingkat signifikan 1% (0,01).

Dibawah ini adalah tahapan-tahapan teknik analisis varians (ANAVA)

1. Tahapan-tahapan Anava

a. Menentukan Derajat Bebas Perlakuan (DB)

1. DB Total = (t . r) -1

2. DB Perlakuan = t – 1

3. DB Galat = DBT – DBP

b. Menentukan Faktor Koreksi (FK)

𝐹𝐾 =𝑇𝑖𝑗

2

𝑟. 𝑡

c. Menentukan Jumlah Kuadrat (JK)

1. Jumlah Kuadrat Total (JKT)

𝐽𝐾𝑇 = ( 𝑃1)2 +⋯ ( 𝑃𝑛)2 − 𝐹𝐾

2. Jumlah Kuadrat Perlakuan (JKP)

𝐽𝐾𝑃 = ( 𝑇𝐴)2 + ( 𝑇𝐵)2 + ( 𝑇𝐶)2 + …+ ( 𝑇𝑉)2

𝑟− 𝐹𝐾

30

3. Kuadrat Galat (JKG)

JKG = JKT – JKP

d. Menghitung Kuadrat Tengah (KT)

1. Kuadrat Tengah Perlakuan (KTP)

𝐾𝑇𝑃 = 𝐽𝐾𝑃

𝐷𝐵𝑃

2. Kuadrat Tengah Galat (KTG)

𝐾𝑇𝐺 = 𝐽𝐾𝐺

𝐷𝐵𝐺

e. Menentukan Fhitung

𝐹ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 = 𝐾𝑇𝑃

𝐾𝑇𝐺

f. Ftabel (0.05) dan (0.01)

Nilai Ftabel (0.05) = (0.05.dbP,dbG)

Nilai Ftabel (0.01) = (0.01.dbP,dbG)

Tabel 3.2 Format Hasil Analisis varians (ANAVA) Uji Kemampuan

Antibakteri Ekstrak Buah Buah Pinang ( Areca catehu L.)

Terhadap Pertumbuah Bakteri Escherichia coli

Sumber Variasi DB JK KT F hitung F tabel

00.01 00.01

Perlakuan

Galat

Total

F hitung > F Tabel, menyatakan adanya pengaruh nyata pada setiap

konsentrasi ekstrak Buah Pinang, maka dilanjutkan uji BNT

31

2. Tahapan-tahapan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT)

Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) taraf Sig. 1 %

BNT α = t.α 2KTG

r

Tabel 3.3 Format Hasil uji lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT) pengaruh

ekstrak buah pinang ( Areca catechu L.) terhadap pertumbuhan

bakteri Escherichia coli pada taraf signifikan 0,01

Konsentrasi

Ekstrak

(perlakuan)

Rerata BNT

1% 0 1

2 3 4

0%

25%

50%

75%

100%

Keterangan : * : Berbeda nyata, tn : Tidak berbeda nyata, (c=c) : Tidak

ada perbedaan antara kedua perlakuan (50% dan 75%)

tersebut