4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II. 1 Uraian Tanaman Kakao

II.1.1 Klasifikasi (13,14)

Regnum : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Subkelas : Dialypetalae

Bangsa : Malvales

Suku : Sterculiaceae

Marga : Theobroma

Jenis : Theobroma cacao L.

Kakao (Theobroma cacao L.) adalah tanaman yang berasal dari suku

sterculiaceae. Ada 22 spesies dalam marga Theobroma (suku

sterculiaceae). Theobroma cacao di klaim sebagai satu-satunya jenis yang

telah diusahakan secara komersial dan tentunya paling populer untuk

dipasarkan. Jenis tanaman kakao yang sebagian besar diusahakan di

Indonesia adalah jenis kakao lindak dengan sentra produksi utama adalah

Sulawesi Selatan, Sulawesi Tenggara dan Sulawesi Tengah (13).

5

II.1.2 Buah Kakao

Buah kakao secara garis besar terdiri dari 3 bagian, yaitu kulit buah

75,67%, daging buah (pulpa) 2,59% dan biji kakao 21,74%.

Pada dasarnya ada 2 macam warna buah kakao, yaitu (13):

a. Buah yang ketika muda berwarna hijau, bila sudah masak berwarna

kuning.

b. Buah yang ketika masih muda berwarna merah, bila sudah masak

berwarna kuning orange.

Buah kakao akan masak setelah berumur 5-6 bulan, di dalam buah,

biji tersusun dalam 5 baris mengelilingi poros buah, jumlahnya beragam

antara 20-50 biji.

Pada penampakan melintang biji kakao, akan terlihat dua kotiledon

yang saling melipat dan pangkalnya menempel pada embrio axis. Warna

kotiledon kakao ada yang berwarna putih (pada jenis Criollo) dan ada yang

berwarna ungu (pada jenis Forastero). Biji kakao dilindungi oleh daging

buah (pulpa) yang berwarna putih, ketebalan pulpa bervariasi. Rasa daging

buah kakao cenderung asam-manis dan mengandung zat penghambat

perkecambahan.

II.1.3 Kandungan Kimia

Biji kakao mengandung total polifenol 12-18% dari bobot kering,

antara lain katekin, epikatekin, antosianin, proantosianidin, asam-asam

fenolat, tannin terkondensasi, flavonoid lainnya dan beberapa komponen

minor (13).

6

Katekin Epikatekin

KA

Gallokatekin Epigallokatekin

Gambar 1. Beberapa senyawa polifenol dari Theobroma cacao L. (Sumber : Wahyudi T. 2008. Panduan Lengkap Kakao. Penebar Swadaya. Jakarta, hal. 38)

Kulit buahnya mengandung komponen fenolik 1,82%. Hasil ekstraksi

diperoleh kadar total polifenol kulit buah kakao 12,6%, kandungan isinya

antara lain polimer epikatekin (13).

II.1.4 Kegunaaan

Kandungan polifenol kakao meningkatkan aktivitas antioksidan

plasma manusia yang ditunjukkan dengan adanya peningkatan kadar

vitamin C plasma, peningkatan antiradikal bebas plasma, serta penurunan

nilai malondialdehid plasma yang merupakan produk metabolit hasil

oksidasi senyawa radikal (15). Selain itu,efek antioksidan memberi-kan

manfaat besar terhadap kesehatan manusia, seperti dalam peng-obatan

dan pencegahan kanker dan penyakit lainnya (16). Aktivitas antioksidan

pada kakao, dapat meningkatkan kesehatan dan menurunkan resiko

terserang penyakit, termasuk penyakit kardiovaskular. Flavonoid sebagai

7

antioksidan bekerja secara langsung menetralisasi radikal bebas,

mengkhelat logam-logam (Fe2+ dan Cu+), menginhibisi enzim yang

berperan dalam produksi oksigen reaktif (17).

Beberapa manfaat lain dari polifenol kakao adalah antikarsinogen,

antiaterogenik, antiulser, antitrombotik, antiinflamasi, imunomodulator,

antimikroba, vasodilator, dan analgesik (18).

II.2 Ekstraksi

Ekstraksi ialah penarikan zat pokok yang diinginkan dari bahan

mentah obat dengan menggunakan pelarut yang dipilih dimana zat yang

diinginkan larut didalamnya. Hasil dari proses ekstraksi ialah ekstrak (19).

Ekstrak ialah sediaan kering, kental atau cair yang diperoleh dengan

mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani

menggunakan pelarut dan cara yang sesuai, kemudian semua atau hampir

semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan

sedemikian rupa hingga memenuhi baku yang telah ditetap-kan (20).

Ada beberapa jenis metode ekstraksi yang dapat digunakan di

antaranya (21) :

1. Maserasi

Adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan proses

perendaman dimana dilakukan dengan memasukkan serbuk ke dalam

pelarut dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar.

8

2. Perkolasi

Adalah ekstraksi dengan cara mengalirkan pelarut melalui serbuk

simplisia. Sampel dibasahi secara perlahan dalam perkolator. Metode ini

membutuhkan waktu yang lama.

3. Digesti

Adalah ekstraksi dengan cara maserasi yang dikombinasikan dengan

pemanasan. Metode ini cocok untuk bahan aktif yang tahan pada

pemanasan.

4. Refluks

Adalah ekstraksi dengan cara memasukkan secara bersamaan sampel

dan pelarut ke dalam labu yang dihubungkan dengan kondensor. Pelarut

dipanaskan hingga mencapai titik didih.

5. Soxhlet

Adalah ekstraksi yang dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel

dalam sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam klong-

song yang ditempatkan di atas labu dan di bawah kondensor.

6. Distilasi Uap

Adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari

bahan (segar atau simplisia). Selama pemanasan, uap terkondensasi

dan destilat (terpisah sebagai 2 bagian yang tidak saling bercampur)

ditampung dalam wadah yang terhubung kondensor.

9

II.3 Frezee Drying

Frezee drying atau liofilisasi merupakan metode pengeringan yang

dapat digunakan untuk membuat sediaan farmasi dan biologis yang tidak

tahan panas atau jika tidak stabil dalam larutan air untuk waktu

penyimpanan yang lama, tetapi stabil dalam keadaan kering. Frezee drying

adalah metode dengan proses tahapan, yang terdiri dari sublimasi dan

pengeringan. Sublimasi vakum dilakukan untuk menghilangkan kristal es.

Pemanasan dilakukan selama proses pengeringan untuk menyerap air.

Metode liofilisasi dilakukan dengan suatu alat pendingin mekanik pada

temperatur dibawah- 40ºC (22,23).

Keuntungan penggunaan freeze drying adalah proses pengeringan

dilakukan pada suhu rendah sehingga mengurangi resiko terjadinya

degradasi produk yang sensitif terhadap panas, kadar air dapat dikontrol

selama proses pengeringan, dan prosuk akhir memiliki bentuk yang

menarik berupa serbuk dengan luas permukaan yang spesifik. (24).

II.4 Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Tikus memiliki beberapa keuntungan sebagai hewan coba penelitian

diantaranya yaitu; perkembangbiakan yang cepat, mudah dipelihara dalam

jumlah banyak, tempramen cukup baik, dan tahan terhadap arsenik tiroksid.

Tikus putih yang digunakan dalam skala penelitian meliputi 3 jenis yaitu

Sprague Dawley, Long Evans dan Wistar. Namun yang paling sering

digunakan adalah tikus putih galur wistar dengan pengendalian variabel

biologis (25).

10

II.5 Kanker

Kanker merupakan penyakit sel yang memiliki ciri-ciri gangguan atau

kegagalan mekanisme pengatur fungsi homeostatis lainnya pada

organisme multiseluler.

Ciri-ciri dari penyakit kanker adalah sebagai berikut :

1. Pertumbuhan berlebihan umumnya berbentuk tumor.

2. Bersifat invasif, artinya mampu tumbuh di jaringan sekitarnya.

3. Bersifat metastatik, artinya menyebar ke tempat lain dan menyebabkan

pertumbuhan baru.

4. Gangguan diferensiasi dari sel dan jaringan.

Beberapa terapi yang digunakan untuk pengobatan penyakit kanker,

di antaranya pembedahan, radioterapi, dan penggunaan agen kemoterapi.

Pembedahan merupakan terapi utama untuk penyakit kanker, seperti

kanker padat, sedangkan penggunaan agen kemoterapi adalah terapi

utama untuk kanker yang mengalami metastatis. Ada berbagai jenis agen

kemoterapi, diantaranya antagonis hormon, obat yang berikatan spesifik

dengan molekul penyebab kanker, serta obat sitotoksik seperti

doksorubisin. Obat sitotoksik merupakan obat kemoterapi yang paling

sering digunakan (26,27).

II.6 Doksorubisin

II.6.1 Pengertian Doksorubisin

Doksorubisin adalah salah satu obat antikanker yang digolongkan

sebagai antibiotika antrasiklin dan pertama kali diisolasi dari Streptomyces

11

peucetiusvar caesius. Doksorubisin merupakan analog daunorubisin yang

terhidroksilasi dan secara luas digunakan pada berbagai penyakit kanker

dan leukemia akut (28).

Obat-obat sitotoksik pada kelompok ini memiliki bagian kuinon dan

hidrokuinon pada cincin yang berdekatan.Adapun struktur kimia

doksorubsin, sebagai berikut (29).

Gambar 2: Struktur kimia doksorubisin(Sumber : Bertram, G. Katzung. 1997.Farmakologi Dasar dan Klinik. Ed. 1. Jakarta: Penerbit EGC.)

II.6.2 Mekanisme Kerja

II.6.2.1 Interkalasi di dalam DNA

Mekanisme kerja doksorubisin yaitu menghambat sintesis DNA dan

RNA. Hal ini dapat diketahui dengan adanya pembentukan kompleks DNA

dan interkalasi dengan molekul DNA melalui enzim topoisomerase II. Enzim

topoisomerase II merupakan nuklear enzim yang bertanggung jawab

terhadap struktur DNA. Enzim topoisomerase akan memediasi proses

kondensasi dan dekondensasi dari untaian DNA. Pada proses sintesis

DNA, dikenal istilah cleavable (initial-enzyme-DNA) complex. Doksorubisin

dan golongan antrasiklin lainnya menghambat aktivitas topoisomerase II

12

dengan meningkatkan dan menstabilkan cleavable (initial-enzyme-DNA)

complex, yang menyebabkan pemecahan pada protein dan terikat pada

untaian ganda DNA yang akan memberikan efek toksik (29).

II.6.2.2 Ikatan pada membran sel

Mekanisme kerja ini yaitu mengubah fungsi proses pengangkutan

yang berhubungan dengan aktivasi fosfatidilinositol.

II.6.2.3 Pembentukan radikal oksigen

Radikal bebas hasil metabolisme doksorubisin membentuk radikal

intermediate semiquinon yang dapat bereaksi dengan oksigen dan

menurunkan kadar O2 molekuler sehingga menghasilkan radikal anion

superoksida yang selanjutnya menghasilkan hidrogen peroksida dan

radikal hidroksil yang menyerang DNA.

Gambar 3. Mekanisme pembentukan radikal bebas doksorubisin Bagian kuinon pada cincin C doksorubisin dapat membentuk semi kuinon dan secara cepat menghasilkan reactive oxygen species (ROS) seperti anion oksigen (O2·-) atau H2O2. Siklus ini didukung oleh NAD(P)H- oksidoreduktase (Minnoti et al., 1999).

Semikuinon

13

II.6.3 Penggunaan Klinis

Doksorubisin merupakan obat antikanker yang digunakan untuk

terapi utama pengobatan berbagai penyakit kanker, seperti kanker

payudara, kanker ovarium, kanker paru, juga digunakan untuk terapi

leukemia dan sarkoma. Umumnya obat ini digunakan untuk pemakaian

tunggal maupun dikombinasikan dengan obat antikanker lainnya (30).

II.6.4 Farmakokinetik

Doksorubisin diberikan secara IV karena obat ini diinaktifkan dalam

saluran cerna. Doksorubisin terdistribusi secara luas dan tidak menembus

sawar darah otak. Obat ini mengalami metabolisme hepatik secara luas.

Umumnya obat ini dan metabolitnya dikeluarkan dalam cairan empedu dan

sekitar seperenam dikeluarkan melalui urin (30).

II.6.5 Efek Samping

Doksorubisin memiliki efek samping yaitu mual, muntah, diare,

stomatitis, anemia, dan hiperurisemia. Doksorubisin pada dosis tinggi dapat

menyebabkan kardiotoksisitas dan hepatotoksisitas. Kardiotoksik dan

hepatotoksik dapat terjadi karena akibat adanya radikal bebas yang

terbentuk dari hasil metabolisme doksorubisin (30).

Berdasarkan penelitian,penggunaan doksorubisin meningkatkan

stres oksidatif pada ginjal dan hati yang ditandai dengan penurunan tingkat

GSH (Gluthation) pada jaringan dan aktivitas katalase, serta dapat

meningkatkan produk lipid peroksidasi.

14

II.7 Radikal Bebas

II.7.1 Pengertian Radikal Bebas

Radikal bebas adalah salah satu bentuk senyawa oksigen reaktif

yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Adanya

elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut memiliki

sifat yang sangat reaktif untuk mencari pasangan dengan cara mengikat

dan menyerang elektron yang berada disekitarnya (31).

Radikal oksigen dan turunannya dapat mematikan sel. Radikal

hidroksil menyebabkan kerusakan oksidatif terhadap membran protein, dan

komponen sel lainnya. Superoksida dismutase mengeluarkan radikal bebas

superoksida sedangkan katalase dan glutation mengeluarkan hidrogen

peroksida dan proksida lemak. Enzim tersebut merupakan pertahanan

alami sel terhadap spesies oksigen reaktif, namun stres oksidatif dapat

timbul apabila kecepatan pembentukan spesies oksigen reaktif melebihi

kapasitas sel mengatasi spesies oksigen reaktif (32).

II.7.2 Kerusakan Akibat Serangan Radikal Bebas

Ada beberapa kerusakan yang ditimbulkan akibat adanya radikal

bebas, diantaranya (33) :

1. Membran Sel :Komponen penyusun membran sel berupa asam lemak

tak jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan protein. Serangan

radikal hidroksil pada asam lemak tak jenuh dimulai dengan interaksi

oksigen pada beberapa rangkaian sehingga terbentuk lipid hidro-

peroksida yang merusak bagian sel tempat lipid hidroperoksida.

15

2. Kerusakan DNA: Radikal bebas merupakan salah satu faktor dari

banyak faktor yang menyebabkan kerusakan DNA.

3. Peroksida Lipid: Lipid atau lemak adalah molekul yang dianggap paling

sensitif terhadap serangan radikal bebas sehingga dapat terbentuk lipid

peroksidasi. Terbentuknya lipid peroksidasi ini dapat menyebabkan

kerusakan sel, dimana kerusakan sel adalah salah satu penyebab

terjadinya berbagai penyakit degeneratif.

II.8 Antioksidan

II.8.1 Pengertian Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat atau

menangkal dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja

dengan cara mendonorkan elektron kepada senyawa yang bersifat oksid-

an sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut terhambat. Penyebab

utama kerusakan oksidatif di dalam tubuh adalah senyawa oksidan, baik

yang berbentuk radikal bebas ataupun bentuk senyawa oksigen reaktif lain

yang bersifat sebagai oksidator. Kerusakan oksidatif terjadi karena

rendahnya antioksidan di dalam tubuh sehingga tidak dapat mengimbangi

reaktivitas senyawa oksidan (31).

II.8.2 Klasifikasi Antioksidan

Secara umum, antioksidan dapat dikelompokkan menjadi 2, yaitu

antioksidan enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis meliputi

enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase.

Sedangkan, antioksidan non enzimatis dibagi menjadi 2, yaitu antioksidan

16

larut lemak (flavonoid, tokoferol, dan karotenoid) dan antioksidan larut air

(asam askorbat, protein pengikat logam, asam urat). Antioksidan enzim-atis

dan non enzimatis bekerja menghambat aktivitas senyawa oksidan dalam

tubuh (31).

II.9 Peroksidasi Lipid

Kerusakan oksidatif pada senyawa lipid terjadi ketika senyawa

radikal bebas bereaksi dengan senyawa PUFA (poly unsaturated

fattyacids).

Peroksida lipid (ROOH) bersifat tidak stabil. Peroksidasi lipid dalam

membran akan mendegradasi asam lemak tak jenuh secara selektif,

kemudian mengakumulasikannya menjadi aldehid, hidrokarbon, dan

produk-produk cross-linking. Umumnya, produk akhir peroksidasi lipid

dapat ditentukan melalui pengukuran kadar malondialdehida (MDA) dan

hidrokarbon, seperti etana dan etilen (31).

Oksidasi lipid dapat terjadi melalui tiga tahapan, yaitu inisiasi,

propagasi,dan terminasi (34) :

1. Tahapan Inisiasi

Inisiasi merupakan tahapan dimulainya produksi asam lemak radikal.

Terjadinya serangan radikal bebas umumnya spesies oksigen reaktif

(OH•)terhadap partikel lemak dan menghasilkan air (H2O) dan asam

lemak radikal.

2. Tahapan Propagasi

Hasil dari tahap inisiasi yaitu terbentuknya asam lemak radikal yang

17

bersifat tidak stabil dan mudah bereaksi dengan molekul oksigen akan

menghasilkan suatu peroksi radikal asam lemak yang juga bersifat

sangat tidak stabil. Peroksi radikal asam lemak ini akan bereaksi dengan

asam lemak bebas lainnya untuk menghasilkan asam lemak radikal

yang baru dan menghasilkan peroksida lemak. Siklus ini dinamakan

propagasi.

3. Tahapan Terminasi

Tahapan ini disebut juga sebagai mekanisme reaksi rantai. Apabila

suatu radikal bereaksi dengan non radikal maka akan menghasilkan

radikal baru. Reaksi radikal akan berhenti bila terdapat dua radikal yang

saling bereaksi dan menghasilkan suatu spesies non radikal.

Gambar 4. Peroksidasi lipid asam lemak jenuh menjadi malondialdehida (Sumber : Murray RK, Granner DK, dan Rodwel VW, 2009. Biokimia Harper. Ed. 27, Jakarta).

II.10 Malondialdehida (MDA)

Malondialdehida (MDA) merupakan produk oksidasi asam lemak

tidak jenuh oleh radikal bebas. Konsentrasi MDA yang tinggi dapat

menunjukkan adanya proses oksidasi dalam membran sel. Kadar MDA

diukur dengan metode TBARS (thiobarbituric acid reactive substance).

Malondialdehid Endoperoksid Hidroperoksid ROOH

18

TBARS adalah indikator peroksidasi lipid yang digunakan dalam penelitian

dengan menggunakan subjek manusia maupun hewan percobaan. Hasil

pengukuran tersebut ditentukan menggunakan spektrofotometer dengan

dasar penyerapan warna yang terbentuk dari rekasi TBA dan MDA (31).

II.11 Vitamin C

Vitamin C atau L-asam askorbat merupakan antioksidan yang larut

dalam air. Sebagai antioksidan, vitamin C memiliki mekanisme kerja yaitu

sebagai donor elektron dengan cara memindahkan satu elektron ke

senyawa logam dan dapat menyumbangkan elektron ke dalam reaksi

biokimia intaseluler dan ekstraseluler. Vitamin C mampu berinteraksi

dengan Fe-ferritin. Di luar sel, vitamin C mampu menghilangkan senyawa

oksigen reaktif, mencegah terjadinya LDL teroksidasi, mentransfer elektron

ke dalam tokoferol teroksidasi, dan mengabsorpsi logam ke dalam saluran

pencernaan (31).

Vitamin C juga dapat mereduksi radikal superoksida, hidroksil, dan

oksigen reaktif. Antioksidan vitamin C mampu bereaksi dengan radikal

bebas dan mengubahnya menjadi radikal askorbil (31).

II.12 Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang meng-

amati interaksi radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suati

zat kimia. Teknik yang sering digunakan spektroskopi serapan ultraviolet,

cahaya tampak, infra merah, dan serapan atom (35).

19

Panjang gelombang spektrofotometer UV-Vis diukur dalam

nanometer (nm),dimana 1 nm = 10-9 m. Absorbsi cahaya ultraviolet atau

cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-

elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital

keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Panjang gelombang dari cahaya

tampak yaitu 400-750 nm. Panjang gelombang ini diantranya memberikan

warna biru, hijau, kuning oranye dan warna-warna antara. Sedangkan, sinar

radiasi UV tidak terlihat oleh mata dengan panjang gelombang berkisar 100-

400 nm (35).

20

BAB III

PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Alat dan bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah aluminium foil, batang

pengaduk, beaker glass (pyrex®), cawan porselin, gelas ukur (pyrex®), gelas

erlenmeyer (pyrex®), labu tentukur (pyrex®), pipet tetes, sendok tanduk,

timbangan analitik (sartorius®), mikropipet (socorex®), mikrotube

(Evendorf®), spoit 1 mL dan 3 mL (Onemed®), pipa kapiler, tabung

vakutainer Na2EDTA. (BD Vacutainer®), waterbath, bejana maserasi,

sentrifuge (Hettich®), spektrofotometer Uv-Vis (Agilent®), rotary evaporator,

freeze dryer, dan kanula.

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kain saring,

aquades (Water One®), ekstrak kulit buah kakao (Theobroma cacao L.), etanol

70%, TBA (thiobarbituric acid) reagent, TCA (trichloroacetate) reagent, TMP

(1,1,3,3-tetramethoxypropane), NaCl 0,9% dietil eter, doksorubisin 50 mg,

dan vitamin C.

III.2 Cara Kerja

III.2.1 Penyiapan Sampel

Sampel kulit buah kakao (Theobroma cacao L.), diambil dari

Kelurahan Batu-Batu, Kecamatan Mario Riawa, Kabupaten Soppeng,

21

Provinsi Sulawesi Selatan. Buah kakao yang diambil yang sudah masak,

ditandai dengan mulai menguningnya buah saat dipetik. Buah yang sudah

dipetik dibiarkan dahulu selama kurang lebih 5 hari agar memudahkan

terpisahnya biji kakao dari kulit buahnya. Kulit buah kakao dibersihkan dari

pengotornya. Setelah itu, kulit buah kakao yang segar ditumbuk meng-

gunakan lumpang batu hingga ukuran partikelnya menjadi kecil, dan

disimpan dalam wadah tertutup.

III.2.2 Pembuatan Ekstrak

Sebanyak 500 g kulit buah kakao yang telah ditumbuk, lalu

diekstraksi secara maserasi menggunakan etanol 70% dengan

perbandingan sampel-pelarut (1:2). Lama maserasi 2-3 hari, ekstraksi

diulang 3 kali sampai filtrat bening. Filtrat dikumpulkan lalu diuapkan

dengan rotary vacum evaporator dan dilanjutkan dengan freeze drying

sehingga diperoleh ekstrak kental.

III.2.3 Pemilihan dan Penyiapan Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih

(Rattus norvegicus) sebanyak 15 ekor dengan berat rata-rata 200-250

gram. Hewan uji di adaptasikan dengan situasi dan kondisi lingkungan

kandang laboratorium dengan pemberian pakan dan air minum selama 14

hari. Hewan uji ditimbang dan dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan.

22

III.2.4 Pembuatan Larutan Uji

III.2.4.1 Pembuatan Larutan Doksorubisin

Doksorubisin tersedia sebagai sediaan serbuk steril 50 mg yang

siap untuk direkonstitusi dalam vial dengan NaCl 0,9% steril hingga volume

10 mL sehingga diperoleh konsentrasi 5 mg/mL. Dosis yang akan diberikan

kepada tikus putih (Rattus norvegicus) adalah 20 mg/kg BB.

Dosis = 20 mg/kg BB

Untuk tikus dengan berat 200 g = 4 mg/ 200 g BB

Jadi, untuk tikus dengan berat X gram

=𝑥 𝑔𝑟𝑎𝑚

200 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑥 2 𝑚𝐿

III.2.4.2 Pembuatan Sediaan Uji

Ekstrak kulit buah kakao dibuat suspensi dengan tiga variasi dosis

60 mg/kg BB, 80 mg/kg BB, dan 120 mg/kg BB. Ekstrak ditimbang sesuai

dengan variasi dosis, kemudian disuspensikan dengan NaCMC 1% hingga

10 mL dalam labu ukur sehingga diperoleh dosis yang diinginkan.

III.2.4.3 Pembuatan larutan Asam Trikloroasetat (TCA) 10%

Sebanyak 10 g asam trikloroasetat di larutkan dengan akuades di

dalam labu tentukur hingga volume 100 mL.

III.2.4.4 Pembuatan larutan asam tiobarbiturat (TBA) 0.067%

Sebanyak 0.067 g asam tiobarbiturat dilarutkan dengan akuades di

dalam labu tentukur hingga volume 100 mL.

23

III.2.4.5 Pembuatan larutan vitamin C

Sebanyak 250 mg vitamin C didispersikan dengan NaCMC 1%

hingga 10 mL ke dalam labu tentukur.

III.2.5 Perlakuan Terhadap Hewan Uji

Hewan uji dibagi ke dalam 5 kelompok, tiap 1 kelompok terdiri dari

3 ekor tikus. Adapun 5 kelompok tersebut yaitu: kelompok 1 kontrol negatif

(diinjeksikan doksorubisin 20 mg/kg BB). kelompok 2 kontrol positif

(pemberian vitamin C 250 mg/kg BB). Tikus pada kelompok 2 diberi

perlakuan dengan pemberian vitamin C selama 7 hari berturut-turut secara

peroral. Sedangkan tikus pada kelompok 3,4, dan 5 diberi perlakuan yaitu

dengan memberi ekstrak selama 7 hari berturut-turut secara peroral.

Kelompok 3 (ekstrak kulit buah kakao 60 mg/kg BB), kelompok 4 (ekstrak

kulit buah kakao 80 mg/kg BB), dan kelompok 5 (ekstrak kulit buah kakao

120 mg/kg BB). Setelah perlakuan hari ke 7, masing-masing kelompok tikus

1,2,3,4, dan 5 diinjeksikan secara intraperitoneal doksorubisin 20 mg/kg BB

setelah 5 jam perlakuan.

III.2.6 Pengambilan Darah dan Pengumpulan Plasma

Pengambilan darah dilakukan setelah 24 jam doksorubisin

diinjeksikan, hewan uji di anestesi menggunakan dietil eter. Sampel darah

diambil melalui vena ekor tikus, diambil sebanyak 1 mL dan disentrifugasi

selama 20 menit pada kecepatan 2500 rpm.

24

III.2.7 Analisis Kadar Malondialdehida (MDA) Plasma

III.2.7.1 Penetapan Panjang Gelombang Spektrum Maksimum

Sebanyak 2 mL akuades ditambah 1 mL TCA 20% dan 2 mL TBA

0,67% digunakan sebagai blanko. Sebagai standar digunakan 200 µL MDA

baku ditambah dengan akuades sampai 2 mL kemudian ditambah 1 mL

TCA 20% dan 2 mL TBA 0,67%. Larutan dicampur homogen dan

dipanaskan pada air mendidih selama 20 menit, lalu didinginkan. Setelah

dingin disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Supernatan berwarna merah muda kemudian diukur serapannya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 400-800 nm. Penentuan

panjang gelombang maksimum untuk menentukan panjang gelombang

dengan serapan tertinggi. Diperoleh panjang gelombang maksimum

sebesar 530 nm.

III.2.7.2 Penyiapan Larutan Standar Tetrametoksipropana (TMP)

Sebanyak 10 µL larutan stok Tetrametoksipropana (TMP) dipipet

ke dalam tabung dan dicukupkan dengan larutan Akuades:TCA:TBA (2:1:2)

hingga 10 mL lalu dihomogenkan, sehingga diperoleh larutan stok 1000 bpj.

Dipipet 0,5 ml dari larutan stok 1000 bpj ke dalam labu tentukur kemudian

dicukupkan 10 ml dan diperoleh laruta stok 50 bpj. Dari larutan stok 50 bpj

kemudian diencerkan, dengan cara dipipet (0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5

mL; dan 3 mL) kedalam labu tentukur dan dicukupkan hingga 5 mL,

sehingga diperoleh variasi konsentrasi larutan stok standar (0,5 bpj; 0,10

bpj; 0,15 bpj; 0,2 bpj; 0,25 bpj; dan 0,3 bpj).

25

III.2.7.3 Analisis Kadar MDA Plasma

Sebanyak 0,5 ml plasma dimasukkan ke dalam tabung vakutainer

lalu ditambahkan 1 mL TCA 10% dan 2 mL TBA 0.067%, kemudian

dipanaskan diatas penangas pada suhu 100˚C selama 20 menit. Setelah

itu, disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit, kemudian didinginkan pada

suhu kamar. Selanjutnya, dianalisis menggunakan spektrofotometri UV-Vis

dengan panjang gelombang 530 nm.

III.2.8 Analisis Data, Pembahasan, dan Kesimpulan

Data hasil pengamatan yang diperoleh dianalisis secara statistik

menggunakan software SPSS 16,0. Dilakukan pengujian distribusi data

dengan metode Shapiro Wilk Test. Data yang terdistribusi normal dianalisis

dengan uji Anova satu arah dan dilanjutkan dengan Post-Hoc Test Tukey

HSD. Hasil dinyatakan sigifikan apabila nilai p<0,05.

Pembahasan dilakukan berdasarkan hasil penelitian dan analisis

data, serta pengambilan kesimpulan diambil berdasarkan hasil

pembahasan.

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Penelitian

IV.1.1 Hasil Ekstraksi Sampel Kulit Buah Kakao

Hasil ekstraksi dari 500 gram kulit buah kakao dengan metode

maserasi menggunakan etanol 70% diperoleh ekstrak dalam bentuk serbuk

sebanyak 22,5 gram dan rendemen sebesar 4,5%.

IV.1.2 Penentuan Kurva

Tabel 1. Data Serapan Larutan Baku TMP Pada Panjang Gelombang 530 nm

Gambar 5. Grafik Kurva Baku

Gambar 5. Grafik Kurva Baku Larutan TMP

No Konsentrasi (µg/mL) (C)

Absorbansi (A)

1 0,05 0,061

2 0,10 0,196

3 0,15 0,328

4 0,20 0,530

5 0,25 0,762

6 0,30 0,894

A = 3,465C - 0,144R = 0,9901

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Ab

sorb

ansi

(A)

Konsentrasi µg/mL (C)

27

IV.1.3 Hasil Analisis Kadar MDA Plasma

Kadar malondialdehida (MDA) sampel plasma tius putih diukur

dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis. Kadar sampel diperoleh

dengan memplot data absorbansi sampel ke dalam kurva standar panjang

gelombang optimal yang dihasilkan dari penentuan kurva standar adalah

530 nm.

Tabel 2. Profil Kadar MDA Sampel Plasma Tikus Putih Setelah Perlakuan

Perlakuan Replikasi

Kadar MDA (µg/mL)

setelah pemberian protektor

(a)

Hari ke-1 setelah induksi

(b)

peningkatan setelah induksi

(b-a)

Hari ke-3 setelah induksi

(c)

penurunan setelah induksi

(b-c)

Kontrol Negatif

1 0,094 0,221 0,127 0,219 0,002

2 0,098 0,226 0,128 0,221 0,005

3 0,097 0,218 0,121 0,214 0,004

rata-rata 0,096 0,222 0,127 0,218 0,004

Kontrol Positif

1 0,092 0,103 0,011 0,096 0,007

2 0,089 0,101 0,012 0,092 0,009

3 0,091 0,104 0,013 0,093 0,011

rata-rata 0,089 0,103 0,012 0,094 0,009

Ekstrak 60 mg/kg BB

1 0,090 0,098 0,008 0,089 0,009

2 0,089 0,100 0,011 0,090 0,010

3 0,087 0,097 0,010 0,091 0,006

rata-rata 0,088 0,098 0,010 0,090 0,009

Ekstrak 80 mg/kg BB

1 0,087 0,095 0,008 0,083 0,012

2 0,085 0,091 0,006 0,081 0,010

3 0,084 0,089 0,005 0,082 0,007

rata-rata 0,085 0,092 0,007 0,082 0,010

Ekstrak 120 mg/kg

BB

1 0,082 0,086 0,004 0,074 0,012

2 0,079 0,082 0,003 0,071 0,011

3 0,080 0,082 0,001 0,073 0,009

rata-rata 0,080 0,086 0,003 0,076 0,011

28

Gambar 6. Rerata Peningkatan kadar MDA (malondialdehida) plasma tikus putih

Gambar 7. Rerata Penurunan kadar MDA (malondialdehida) plasma tikus putih

IV.2 Pembahasan

Secara fisiologis, aktivitas peroksidasi lipid biasanya terjadi karena

tubuh menghasilkan spesies reaktif oksigen dari metabolisme sel.

Pembentukan radikal bebas merupakan proses yang dapat memicu

terjadinya peroksidasi lipid. Pada keadaan normal, peroksidasi lipid di

dalam tubuh masih dapat diatasi oleh antioksidan alami (antioksidan

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

negatif positif ekstrak 60mg/kg

ekstrak 80mg/kg

ekstrak 120mg/kg

Ko

nse

ntr

asi µ

g/m

L

Kelompok Perlakuan

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

negatif positif ekstrak 60mg/kg

ekstrak 80mg/kg

ekstrak 120mg/kg

Ko

nse

ntr

asi µ

g/m

L

Kelompok Perlakuan

29

endogen) seperti katalase, glutation peroksidase, dan superokside

dismutase (33).

Pengukuran kadar malondialdehida (MDA) pada plasma darah

menggunakan metode Wills, dimana plasma yang akan dianalisis

ditambahkan dengan aquadest sebanyak 2 ml, kemudian direaksikan

dengan reagen TCA 10% dan TBA 0.067% dengan perbandingan 1:2 mL.

Penambahan TCA bertujuan untuk mempresipitasi protein yang terdapat

dalam plasma darah sehingga tidak mengganggu pengukuran, sedangkan

penambahan TBA bertujuan untuk mengikat malondiladehida yang terdapat

dalam plasma darah sehingga membentuk kromogen yang memberikan

warna merah muda yang dapat terbaca pada panjang gelombang visibel

yaitu 400-800 nm. Kadar MDA diukur menggunakan alat spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 530 nm. Sebelum melakukan

pengukuran, terlebih dahulu dilakukan penentuan panjang gelombang

serapan maksimum dan penentuan kurva baku. Penentuan kurva baku

dibuat dengan 6 seri konsentrasi TMP yaitu 0,05 µg/mL; 0,10 µg/mL; 0,15

µg/mL; 0,20 µg/mL; 0,25 µg/mL; dan 0,30 µg/mL, kemudian didapatkan nilai

absorbansi dan diperoleh hasil regresi linear A = 3,465C + 0,144 dengan

R2 sebesar 0,990 (lihat tabel 1 dan gambar 4).

Kadar MDA sampel diperoleh dengan memplot data absorbansi ke

dalam kurva standar. Adapun hasil yang diperoleh dari pengukuran kadar

MDA plasma tikus ditunjukkan pada (tabel 2).

30

Berdasarkan hasil penelitian ini, kelompok kontrol negatif yang telah

diinjeksikan dengan doksorubisin 20 mg/kg BB, diperoleh rata-rata kadar

MDA sebesar 0,221 µg/mL pada hari ke-1 dan pada hari ke-3 sebesar 0,219

µg/mL. Kelompok kontrol negatif mengalami peningkatan kadar MDA

setelah induksi doksorubisin hari ke-1 dan mengalami penurunan setelah

induksi hari ke-3 (lihat tabel 2). Hal ini menunjukkan terjadinya peroksidasi

lipid oleh doksorubisin sehingga meningkatkan jumlah radikal bebas di

dalam tubuh hewan coba.

Kelompok kontrol positif yang diberi perlakuan vitamin C sebelum

induksi doksorubisin diperoleh rata-rata kadar MDA sebesar 0,089 µg/mL

dan mengalami peningkatan setelah induksi doksorubisin pada hari ke-1

dengan rata-rata kadar sebesar 0,103 µg/mL. Akan tetapi, pada hari ke-3

mengalami penurunan kadar MDA dengan perbedaan yang tidak jauh yaitu

sebesar 0,094 µg/mL. Hal ini menujukkan bahwa pemberian vitamin C

dapat mencegah terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh tikus akibat

efek samping doksorubisin.

Kelompok yang diberikan ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 60

mg/kg BB diperoleh rata-rata kadar MDA sebelum induksi doksorubisin

sebesar 0,088 µg/mL dan mengalami peningkatan setelah induksi

doksorubisin dengan rata-rata kadar MDA sebesar 0,098 µg/mL. Tetapi,

mengalami penurunan kadar MDA sebesar 0,090 µg/mL.

Kelompok yang diberikan ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 80

mg/kg BB diperoleh rata-rata kadar MDA sebelum induksi doksorubisin

31

sebesar 0,085 µg/mL dan mengalami peningkatan setelah induksi

doksorubisin dengan rata-rata kadar MDA sebesar 0,092 µg/mL. Tetapi,

mengalami penurunan kadar MDA sebesar 0,082 µg/mL.

Kelompok yang diberikan ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 120

mg/kg BB diperoleh rata-rata kadar MDA sebelum induksi doksorubisin

sebesar 0,080 µg/mL dan mengalami peningkatan setelah induksi

doksorubisin dengan rata-rata kadar MDA sebesar 0,086 µg/mL. Tetapi,

mengalami penurunan kadar MDA sebesar 0,076 µg/mL.

Kelompok perlakuan kontrol negatif memiliki rata-rata kadar MDA

lebih besar dibandingkan dengan kelompok perlakuan kontrol positif

(pemberian vitamin C) dan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah kakao

dengan dosis 60 mg/kg BB, 80 mg/kg BB, serta 120 mg/ kg. Hal ini

menunjukkan bahwa kelompok perlakuan vitamin C dan ekstrak kulit buah

kakao memiliki efek protektif dalam mencegah terbentuknya radikal bebas

akibat pemberian doksorubisin. Kelompok kontrol positif dengan kelompok

ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 60 mg/kg BB dan 80 mg/kg BB

memiliki kadar MDA yang tidak berbeda signifikan. Artinya efek protektif

vitamin C hampir sama dengan efek protektif ekstrak kulit buah kakao

dengan dosis tersebut. Sedangkan, ekstrak kulit buah kakao dengan dosis

120 mg/kg BB memiliki perbedaan yang signifikan.

Untuk menunjang data tersebut, dilakukan analisis statistik terhadap

peningkatan dan penurunan kadar MDA menggunakan software SPSS 16,

dilakukan pengujian, seperti uji distribusi data dengan metode Shapiro-Wilk

32

test, dan One Way Anova test. Pengujian yang pertama dilakukan yaitu uji

distribusi data menggunakan metode Shapiro-Wilk test. Uji distribusi data

dilakukan untuk mengetahui data tersebut terdistribusi normal atau tidak.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa data peningkatan dan penurunan

kadar MDA terdistribusi secara normal (p>0,05) Data yang terdistribusi

normal dilanjutkan dengan uji One Way Anova untuk mengetahui

signifikansi dari data tersebut. Berdasarkan hasil analisis, terjadi

peningkatan dan penurunan kadar MDA pada masing-masing kelompok

perlakuan namun tidak berbeda signifikan.

Data peningkatan kadar MDA diperoleh dari selisih kadar sebelum

induksi doksorubisin dengan kadar induksi setelah 24 jam. Kelompok

perlakuan yang mengalami peningkatan terbesar yaitu kelompok kontrol

negatif (tidak diberikan protektor) dengan rata-rata kadar sebesar 0,127

µg/mL dan yang mengalami peningkatan terendah adalah kelompok

perlakuan ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 120 mg/kg BB (lihat

gambar 5). Hasil analisis statistik uji Anova satu arah menunjukkan adanya

perbedaan secara signifikan antara kelompok perlakuan, sehingga

dilanjutkan dengan uji Tukey HSD. Pada uji ini terlihat bahwa kelompok

kontrol negatif signifikan terhadap kelompok kontrol positif dan ketiga

kelompok perlakuan ekstrak kulit buah kakao. Sedangkan kelompok kontrol

positif tidak signifikan terhadap kelompok perlakuan ekstrak kulit kakao

dengan dosis 60 mg/kg BB dan 80 mg/kg BB, tetapi signifikan terhadap

ekstrak dengan dosis 120 mg/kg BB. Adanya perbedaan yang tidak

33

signifikan antara kelompok pemberian vitamin C (kontrol positif) dengan

kelompok pemberian ekstrak kulit buah kakao dengan dua variasi dosis di

atas berarti bahwa efek protektif yang dimiliki oleh kedua protektor tersebut

sama.

Setelah 72 jam terinduksi doksorubisin (hari ke-3), kadar MDA

mengalami penurunan pada semua kelompok perlakuan. Data penurunan

kadar MDA diperoleh dari selisih kadar 72 jam (hari ke-3) dengan kadar 24

jam (hari ke-1) setelah induksi doksorubisin. Kelompok yang mengalami

penurunan Penurunan kadar MDA antara kelompok negatif dengan

kelompok yang diberikan protektor berbeda signifikan, dengan perbedaan

yang kecil. Pada kelompok positif (pemberian vitamin C) memiliki

perbedaan yang tidak signifikan dengan kelompok perlakuan ekstrak kulit

kakao dengan dosis 60 mg/kg BB, 80 mg/kg BB, dan 120 mg/kg BB.

Penurunan kadar MDA pada 72 jam setelah induksi doksorubisin

diperkirakan terjadi karena radikal bebas yang menginduksi peningkatan

kadar MDA dapat dinetralkan oleh antioksidan endogen dengan bantuan

antioksidan eksogen pada kelompok yang berikan protektor.

Berdasarkan hasil tersebut, dapat dijelaskan bahwa ekstrak kulit

buah kakao dengan dosis 60 mg/kg BB, 80 mg/kg BB, dan 120 mg/kg BB

memberikan efek yang tidak signifikan, meskipun kelompok kontrol positif

memberikan efek yang berbeda nyata (signifikan) terhadap dosis 120

mg/kg BB, tetapi perbedaannya sangat kecil, sehingga untuk pengobatan

34

alternatif cukup menggunakan dosis 60 mg/ kg BB untuk menghindari

adanya efek toksisitas pada dosis yang tinggi.

35

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:

1. Pemberian ekstrak kulit buah kakao dengan variasi dosis 60 mg/kg BB,

80 mg/kg BB, dan 120 mg/kg BB dapat menurunkan kadar MDA pada

tikus putih setelah diinduksi dengan doksorubisin.

2. Ekstrak kulit buah kakao dengan variasi dosis 60 mg/kg BB, 80 mg/kg

BB, dan 120 mg/kg BB memiliki efek yang tidak berbeda nyata dengan

kontrol positif (pemberian vitamin C), sehingga untuk alternatif obat

cukup menggunakan dosis 60 mg/kg BB untuk menghindari adanya efek

toksisitas pada dosis yang lebih tinggi.

V.2 Saran

Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui

senyawa aktif dalam kulit buah kakao yang berperan terhadap penurunan

kadar MDA plasma serta dilakukan penelitian terhadap uji toksisitas untuk

dosis tertinggi ekstrak kulit buah kakao.

36

DAFTAR PUSTAKA

1. Kumalanigsih S. Antioksidan Alami Penangkal Radikal Bebas, Sumber Manfaat, Cara Penyediaan dan Pengolahan.:Trubus Agrisarana. Surabaya .2010

2. Cattherjee K., Zhang J., Honbo N., & Karliner J.S. Doxorubicin

Cardiomiopaty. Cardiology. 2010;115(2). pp.155-162 3. Knight L., Cynthia A., Christal G.Y., David LB., Zhao Yong Hu., & Dale

Uyeminami. Cigarette smoke exposure and hypercholesterolemia increase mitochondrial damage in cardiovascular tissues. Circulation. 2011;105(7). pp. 849–854

4. Souza T.P., Oliveira P.R., & Pereira B. Physical exercise and oxidative

stress effect of intense physical exercise on urinary chemiluminescence and plasmatic malondialdehyde. Rev Bras Med Esporte. 2007. Vol.11 no. 1. pp. 97-101

5. Childs A.C., Phaneuf S.L., Dirks A.J., Philips T., & Leeuwenburgh C.

Doksorubisin Treatment in vivo Causes Cytochrome c Release and Cardiomyocyte Apoptosis, As Well As Increased Mitochondrial Effeciency, Superoxide Dismutase Activity, and Bcl-2. Cancer Research. 2011. Vol.62(16). pp 4592-4598

6. Yagmurca M., Bas O., Mollaglu H., Sahin O., Nacar A., & Karaman O.

Protective Effect of Erdosteine on Doxorubicin Induced Hepatoxicity in Tats. Archives of Medical Research. 2010. Vol.32(4). pp. 413-426

7. Hoskins W.J., Perez C.A., Young R.C., Barakat R., Markman M., &

Randall M. Principle and Practice of Gynecologic Oncology. Ed. 4. Philadelphian. USA. 2005. pp. 507-508

8. Emily G.A., Helen L., Kotxe, & Kaye J.W. Correlation-Based Network

Analysis of Cancer Metabolism : A New System Biology Approach in Metabolomics.Springer New York Heidelberg ordrecht. London. 2009. pp. 49-51

9. Dewhirst M.W., Cao Y., & Moeller. Cycling Hypoxia and Free Radicals

Regulate Angiogenesis and Radiotherapy Response. Nat Rev Cancer. 2009;8(6). pp. 425

10. Othman A., Ismail A., Ghani N.A., & Adenan I. Antioxidant Capacity and

Phenolic Content of Cocoa Bean. Food Chemstry. 2007. pp. 1523

37

11. Sartini, Djide N., & Alam G. Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Limbah Kulit Buah Kakao dan Pengaruhnya Terhadap Akivitas Antioksidan dan Antimikroba. Makassar. Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. 2007

12. Oktiari Y. Pengaruh Ekstrak Kulit kakao (Theobroma cacao L.)

Terhadap Hepatoksisitas Paracetamol. Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. Surakarta. 2010

13. Wahyudi T. Panduan Lengkap Kakao. Penebar Swadaya. Jakarta.

2009. pp. 42-57 14. Backer, C.A., and Bakhuizen Van Den Brink. Flora of Java

(Spermatophytes Only).Wolter-Noordhoff NPV. Groningen.1963. Vol.1. pp.405

15. Matsumoto M., Tsuji M., Okuda J., Sasaki H., Nakano K., Osawa K.,

Shimura S., & Ooshima. Inhibitory effect of cacao bean husk extract on plaque formation in vitro and in vivo. Eur J Oral Sci. 2004. pp. 249-252

16. Osman H, Nasarudin R, & Lee SI. Extracts of cocoa (Theobroma cacao

L.) leaves and their antioxidation potential. Food Chemistry Elseivier.

2003. pp. 41-46

17. Yuliatmoko W, Fransiska Z, & Feri K. Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak Terhadap Aktivitas Antioksidan Flavonoid Pada Plasma Manusia. Jur Mat Sains & Tek. 2008. Vol.9 no. 2. pp. 102-113

18. Misnawi. Changes in procyanidins and tannin concentration as affected

by cocoa liquor roasting. Pelita Perkebunan. 2009. hal. 3 19. Ditjen POM. Farmakope Indonesia Ed. 5. Departemen RI. Jakarta.

1995. hal 5

20. Akhbar B. Tumbuhan Dengan Kandungan Senyawa Aktif Berpotensi

Sebagai Bahan Anti Fertilisasi. Adabla Press. Jakarta. 2010. pp.4

21. Seidel V. Initial and Bulk Extraction. Di dalam Sarker SD, Latif Z & Gray

AI. Editors. Natural Product isolation. 2nd ed. Humana Press Inc. Totowa

(New Jesrey). 2006. pp.31-35

22. Day JG, & Stacey GN. 2007. Cropresentative and Freeze-Drying

Protocols Ed. 2. Humana Press. New Jersey.

38

23. Labconco.. A Guide To Freeze Drying to The Laboratory. Labconco Coporation. USA. 2009

24. Oetjen G.W., & Hasele P. Freeze-Drying, Second, Completely Revised

and Extended Edition. Lubeck Germany. 2010. pp. 14-15 25. Ridwan E. Etika pemanfaatan hewan percobaan dalam penelitian

kesehatan. Journal Indonesia Med. Association. 2013. Vol.63(3) 26. Lehne A.R. Pharmacology for Nursing Care. 8th Ed. Elsevier Inc. USA.

2013. pp. 1257

27. Skeel R.T., & Khleif S.N. Handbook of Cancer Chemotherapy.

Philadelphia. Lippincott. 2007

28. Champe P.C., & Harvey R.A. Lippincott Illustrated Review

Pharmacology. 6th Ed. Wolters Kluwer. Philadelphia. 2015. pp. 561-562

29. Bertram G.K. Basic and Clinical Pharmacology. 12th Ed. Mc Graw Hill.

New York. 2012

30. Goodman and Gilman. The Pharmacological Basic of Therapeutics. 11th

Ed. Mc Graw Hill. New York. 2007

31. Winarsi, Hery. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta:

Kanisius; 2011. pp. 12, 50, 5-54. 32. Marks D.B., Marks A.D., & Smith C.M. Basic Medical Biochemistry: A

Clinical Approach. EGC. Jakarta. 2009. pp. 313

33. Pratimasari D. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Buah Carica

papaya dengan Metode DPPH dan Penetapan Kadar Fenolik serta

Flavonoid Totalnya. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah.

Surakarta. 2009.

34. Adnyana I.B.P. Kadar Malondialdehida (MDA) Pada Abortus Spontan.

Bagian/Smf Obstetri dan Ginekologi. Fakultas Kedokteran Unud/Rsup

Sanglah Denpasar. 2013. 22-29

35. Fessenden R.J., & Fessenden J.S. Kimia Organik. Jil. I, diterjemahkan

oleh Pudjaatmaka, A.H. Penerbit Erlangga, Jakarta. 2008. pp. 436-444

39

LAMPIRAN I

Skema kerja Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Kakao terhadap Penghambatan Lipid Peroksidasi Plasma Tikus yang diinduksi

Doksorubisin

- Di aklimatisasi selama 2 minggu - Dikelompokkan menjadi 6

kelompok

Pengambilan sampel darah

Pengambilan sampel darah melalui vena ekor tikus, 24 jam dan 72 jam setelah pemberian doksorubisin

Hewan Coba Tikus Putih

(Rattus norvegicus)

Kelompok I ( Kontrol – )

Akuades

Kelompok III Ekstrak kulit buah kakao 60 mg/kg BB

Dilakukan selama 7 hari berturut-turut

Pembahasan

Kesimpulan

Kelompok IV Ekstrak kulit buah kakao 80 mg/kg BB

Kelompok V Ekstrak kulit buah kakao

120 mg/kg BB

mg/KgBB+

doksorubisin

20mg/KgBB

Kelompok II (Kontrol +)

VitaminC 250mg/kg BB

Pemberian Doksorubisin 20 mg/kg BB secara Intraperitoneal

Pengambilan Sampel Darah

Analisis Kadar MDA Plasma

40

LAMPIRAN II

Penyiapan Larutan Baku

Zat Baku 1,1,3,3 – tetrametoksipropana

Dipipet 10 µL Larutan TMP

Dicukupkan dengan Aquadest:TBA:TCA

(2:1:2) hingga 10 mL

Larutan Stok 1000 bpj Dipipet 1 mL ad 10 mL

Larutan stok 100 bpj

Dipipet 0,5 mL ad 10 mL

Larutan stok 5 bpj

0,05 mL ad 5 mL (0,05 bpj)

0,10 mL ad 5 mL (0,10 bpj) 0,15 mL ad 5 mL (0,15 bpj) 0.20 mL ad 5 mL (0,2 bpj) 0,25 mL ad 5 mL (0,25 bpj) 0,30 mL ad 5 mL (0,3 bpj)

Analisis dengan Spektrofotometri UV-Vis 530 nm

41

LAMPIRAN III

Analisis Kadar MDA Plasma

Dicukupkan dengan Aquadest:TBA:TCA

(2:1:2) hingga 5 mL

- Dipanaskan didalam penangas

air suhu 100oC selama 20 menit

- Disentrifugasi dengan kecepatan

3000 rpm selama 10 menit

- Didinginkan pada suhu kamar

Sampel

Analisis menggunakan Spektrofotometri UV-Vis 530 nm

Perhitungan Absorbansi

Perhitungan Kadar MDA plasma

Sampel Plasma 0,5 mL

Perubahan warna menjadi merah muda

42

LAMPIRAN IV

Spektrum Panjang Gelombang untuk Serapan Maksimum

Keterangan : Pada Spektrum, terlihat bahwa serapan 0,169 maksimum tertuju pada panjang gelombang 530 nm dengan larutan baku 50 ppm

Panjang Gelombang (nm)

Se

rap

an (

A)

Wavelength (nm)

43

LAMPIRAN V

Spektrum Serapan Larutan Baku Berbagai Konsentrasi Pada Panjang Gelombang 530 nm

No Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi

1 0,05 0,061

2 0,10 0,196

3 0,15 0,328

4 0,20 0,530

5 0,25 0,762

6 0,30 0,894

Panjang Gelombang (nm)

Se

rap

an (

A)

A = 3,465C - 0,144R= 0,9901

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi µg/mL

Wavelength (nm)

44

LAMPIRAN VI

Perhitungan Kadar Malondialdehida (MDA)

A. Setelah 6 hari pemberian protektor

1. Kontrol Negatif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,18171+0,144

3,465= 0,094 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,19557+0,144

3,465= 0,098 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,19210+0,144

3,465= 0,097 µg/mL

2. Kontrol Positif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17478+0,144

3,465= 0,092 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16439+0,144

3,465= 0,089 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17131+0,144

3,465= 0,091 µg/mL

3. Ekstrak Kulit Buah Kakao 60 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16785+0,144

3,465= 0,090 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16439+0,144

3,465= 0,089 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,15745+0,144

3,465= 0,087 µg/mL

4. Ekstrak Kulit Buah Kakao 80 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,15745+0,144

3,465= 0,087 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,15052+0,144

3,465= 0,085 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14706+0,144

3,465= 0,084 µg/mL

5. Ekstrak Kulit Buah Kakao 120 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14013+0,144

3,465= 0,082 µg/mL

45

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,12973+0,144

3,465= 0,079 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,13320+0,144

3,465= 0,080 µg/mL

B. Setelah Pemberian Doksorubisin Hari Ke-1

1. Kontrol Negatif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,62176+0,144

3,465= 0,221 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,63909+0,144

3,465= 0,226 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,61137+0,144

3,465= 0,218 µg/mL

2. Kontrol Positif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,21289+0,144

3,465= 0,103 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,20596+0,144

3,465= 0,101 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,21636+0,144

3,465= 0,104 µg/mL

3. Ekstrak Kulit Buah Kakao 60 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,19557+0,144

3,465= 0,098 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,20250+0,144

3,465= 0,100 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,19210+0,144

3,465= 0,097 µg/mL

4. Ekstrak Kulit Buah Kakao 80 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,18517+0,144

3,465= 0,095 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17131+0,144

3,465= 0,091 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16439+0,144

3,465= 0,089 µg/mL

46

5. Ekstrak Kulit Buah Kakao 120 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,15399+0,144

3,465= 0,086 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14013+0,144

3,465= 0,082 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14013+0,144

3,465= 0,082 µg/mL

C. Setelah Pemberian Doksorubisin Hari Ke-3

1. Kontrol Negatif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,61483+0,144

3,465= 0,219 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,62176+0,144

3,465= 0,221 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,59751+0,144

3,465= 0,214 µg/mL

2. Kontrol Positif

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,18864+0,144

3,465= 0,096 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17478+0,144

3,465= 0,092 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17824+0,144

3,465= 0,093 µg/mL

3. Ekstrak Kulit Buah Kakao 60 mg/kgBB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16438+0,144

3,465= 0,089 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,16785+0,144

3,465= 0,090 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,17131+0,144

3,465= 0,091 µg/mL

4. Ekstrak Kulit Buah Kakao 80 mg/kg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14013+0,144

3,465= 0,082 µg/mL

47

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,13666+0,144

3,465= 0,081 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,14013+0,144

3,465= 0,082 µg/mL

5. Ekstrak Kulit Buah Kakao 120 mgkg BB

a. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,11241+0,144

3,465= 0,074 µg/mL

b. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,10201+0,144

3,465= 0,071 µg/mL

c. X = 𝑦−𝑎

𝑏 =

0,10894+0,144

3,465= 0,073 µg/mL

48

LAMPIRAN VII

Perhitungan Dosis

a. Dosis Doksorubisin

Dosis doksorubisin yaitu 20 mg/kg BB, maka untuk tikus dengan bobot

200 g, yaitu :

20 𝑚𝑔

1000 𝑔=

𝑥 𝑚𝑔

200 𝑔

𝑥 =20 𝑚𝑔

1000 𝑔𝑥 200 𝑚𝑔 = 4 𝑚𝑔

Jadi, dosis doksorubisin yang akan dibuat adalah 4 mg/200 g bobot

tikus

b. Pembuatan larutan stock doksorubisin

Doksorubisin dalam vial rekonstitusi = 50 mg

Volume pemberian intraperitoneal tikus : 1 mL untuk 100 g

bobot tikus, maka volume pemberian untuk dosis tersebut yaitu 4 mg/2

mL atau 2 mg/mL, sehingga :

50 𝑚𝑔

𝑥 𝑚𝐿= 2 𝑚𝑔/𝑚𝐿

𝑥 =50 𝑚𝑔

2 𝑚𝑔/𝑚𝐿= 25 𝑚𝐿

Jadi, NaCL 0,9% yang dibutuhkan untuk melarutkan 50 mg

doksorubisin yaitu sebanyak 25 mL.

c. Pembuatan suspensi ekstrak kulit buah kakao dosis 60 mg/kg BB

dengan bobot tikus 100 g, yaitu :

60 𝑚𝑔

1000 𝑔=

𝑥 𝑚𝑔

100 𝑔

𝑥 =60 𝑚𝑔

1000 𝑔𝑥 100 𝑚𝑔 = 6 𝑚𝑔

49

Jadi, tikus dengan bobot 100 g diberikan dosis sebesar 6 mg. d. Pembuatan suspensi ekstrak kulit buah kakao dosis 80 mg/kg BB

dengan bobot tikus 100 g, yaitu :

80 𝑚𝑔

1000 𝑔=

𝑥 𝑚𝑔

100 𝑔

𝑥 =80 𝑚𝑔

1000 𝑔𝑥 100 𝑚𝑔 = 8 𝑚𝑔

Jadi, tikus dengan bobot 100 g diberikan dosis sebesar 8 mg.

e. Pembuatan suspensi ekstrak kulit buah kakao dosis 120 mg/kg BB

dengan bobot tikus 100 g, yaitu :

120 𝑚𝑔

1000 𝑔=

𝑥 𝑚𝑔

100 𝑔

𝑥 =120 𝑚𝑔

1000 𝑔𝑥 100 𝑚𝑔 = 12 𝑚𝑔

Jadi, tikus dengan bobot 100 g diberikan dosis sebesar 12 mg.

f. Pembuatan larutan stock untuk 10 mL

Sesuai Ketentuan, untuk tikus dengan bobot 100 g, volume

pemberiannya yaitu sebesar 1 mL. misalnya, untuk dosis 60 mg/kg BB,

yaitu :

6 mg/1 mL = x/10 mL

x = 60 mg

Jadi, untuk membuat suspensi sebanyak 10 mL, ditimbang ekstrak

sebanyak 60 mg.

Sebagai contoh, bobot tikus sebesar 180 g, sehingga :

180 𝑔

100 𝑔𝑟 𝑥 1 𝑚𝐿 = 1,8 𝑚𝐿

50

LAMPIRAN VIII

Data Statistik SPSS 16,0

Tabel 3. Uji Distribusi Normal Peningkatan dan Penurunan Kadar MDA

Tabel 4. Uji Anova Satu Arah Peningkatan Kadar MDA

Peningkatan Jumlah

Kuadrat

Derajat

Bebas

Kuadrat

Tengah F Hitung F Tabel Signifikan

Kelompok Perlakuan 0,033 4 0,008 18,95 5,76 S

Galat 0,000 10 0,000

Total 0,033 14

Ket : F Hitung > F Tabel = Signifikan SS : Sangat Signifikan

Tabel 5. Uji Anova Satu Arah Penurunan Kadar MDA

Ket : F Hitung > F Tabel = Siginifikan S : Signifikan

Perlakuan

Shapiro-Wilk

Statistik Derajat Bebas Signifikan

Peningkatan Kelompok Negatif 0,855 3 0,253

Kelompok Positif 1,000 3 1,000

Ekstrak 60 mg 0,964 3 0,637

Ekstrak 80 mg 0,964 3 0,637

Ekstrak 120 mg 0,964 3 0,637

Penurunan Kelompok Negatif 0,964 3 0,637

Kelompok Positif 1,000 3 1,000

Ekstrak 60 mg 0,923 3 0,463

Ekstrak 80 mg 0,987 3 0,780

Ekstrak 120 mg 0,964 3 0,637

Penurunan Jumlah

Kuadrat

Derajat

Bebas

Kuadrat

Tengah F Hitung F Tabel Signifikan

Kelompok Perlakuan 0,000 4 0,000 5,707 3,95 S

Galat 0,000 10 0,000

Total 0,000 14

51

Tabel 6. Uji Lanjutan Tukey HSD Peningkatan Kadar MDA

(I) Perlakuan

(J) Perlakuan Selisih

(I-J) Standar

Eror Signifikan

95% Taraf Kepercayaan

Batas Terendah

Batas Tertinggi

Kontrol Negatif

Kontrol Positif 0,113* 0,002 0,000 0,108 0,119

Ekstrak 60 mg 0,116* 0,002 0,000 0,109 0,121

Ekstrak 80 mg 0,119* 0,002 0,000 0,113 0,125

Ekstrak 120 mg 0,123* 0,002 0,000 0,117 0,128

Kontrol Positif

Ekstrak 60 mg 0,002 0,002 0,668 -0,003 0,008

Ekstrak 80 mg 0,006 0,002 0,051 -0,000 0,011

Ekstrak 120 mg 0,009* 0,002 0,002 0,004 0,015

Ekstrak 60 mg

Ekstrak 80 mg 0,003 0,002 0,362 -0,002 0,009

Ekstrak 120 mg 0,007* 0,002 0,015 0,001 0,013

Ekstrak 80 mg

Ekstrak 120 mg 0,004 0,002 0,282 -0,002 0,009

Tabel 7. Uji Lanjutan Tukey HSD Penurunan Kadar MDA

(I) Perlakuan (J) Perlakuan Selisih

(I-J) Standar

Eror Signifikan

95% Taraf Kepercayaan

Batas Terendah

Batas Tertinggi

Kontrol Negatif

Kontrol Positif -0,005* 0,002 0,048 -0,011 -0,000

Ekstrak 60 mg -0,005 0,002 0,091 -0,009 0,001

Ekstrak 80 mg -0,006* 0,002 0,025 -0,011 -0,001

Ekstrak 120 mg -0,007* 0,002 0,010 -0,012 -0,002

Kontrol Positif

Ekstrak 60 mg 0,001 0,002 0,993 -0,005 0,006

Ekstrak 80 mg -0,001 0,002 0,993 -0,006 0,005

Ekstrak 120 mg -0,002 0,002 0,832 -0,007 0,004

Ekstrak 60 mg

Ekstrak 80 mg -0,001 0,002 0,915 -0,007 0,004

Ekstrak 120 mg -0,002 0,002 0,611 -0,008 0,003

Ekstrak 80 mg

Ekstrak 120 mg -0,001 0,002 0,282 -0,007 0,005

52

LAMPIRAN IX

Kunci Determinasi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)

Kunci determinasi tanaman kakao (Theobroma cacao L.)

berdasarkan pedoman pustaka buku Flora Of Java, (Backer, C.A., and

Bakhuizen, R.C.1963) sebagai berikut :

Suku : 94. Sterculiaceae

1b…6b…10b…12b…15b…17b. (9. Theobroma)

Marga : 9. Theobroma

Jenis : 1. Theobroma cacao L.

Berdasarkan hasil determinasi tersebut maka diperoleh kepastian

bahwa tumbuhan yang dideterminasi dan akan digunakan dalam penelitian

ini adalah Theobroma cacao L.

53

LAMPIRAN X

Dokumentasi Penelitian

Gambar 8. Buah kakao Gambar 9. Maserasi sampel Kulit buah kakao

Gambar 10. Penyaringan hasil Gambar 11. Ekstrak kulit buah kakao ekstraksi

54

Gambar 12. Hewan uji dipisahkan Gambar 13. Penimbangan hewan uji berdasarkan kelompok

perlakuan Gambar 14. Pemberian perlakuan Gambar 15. Injeksi doksorubisin secara intraperitoneal

55

Gambar 16. Pengambilan darah melalui Gambar 17. Sampel plasma 0,5mL+ vena ekor hewan uji TCA 10% 1 mL+TBA 0,0067% 2 mL

Gambar 18. Alat sentrifugasi Gambar 19. Alat spektrofotometer UV-Vis

56

LAMPIRAN XI

Rekomendasi Persetujuan Kode Etik

57

LAMPIRAN XII

Hasil Determinasi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)