Upload
lamxuyen
View
223
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
25
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan
menggunakan metode post test only control group design.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan Februari 2018
selama kurang lebih 36 hari.
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar
dewasa dengan jenis kelamin jantan, berat badan 150-250 gram, dengan umur 2-
3 bulan, Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang tebal
berwarna putih serta matanya jernih (Smith dan Mangkuwidjojo, 1998).
4.3.2 Sampel
Sampel diambil dari populasi tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar
jantan sebagai hewan coba. Sampel terdiri atas 4 kelompok.
4.3.3 Besar Sampel
Estimasi besar replikasi yang digunakan pada penelitian ini adalah dengan
rumus berikut:
(r – 1)(p – 1) ≥ 15
(r – 1)(4 – 1) ≥ 15
4r – 3 ≥ 15
r ≥ 4,5 (Supranto, 2007)
26
E = total number of animal – total number of group
= (5x4) – 4 = 16
n’ =
=
= 5
( Sudigo dan Sofyan, 2016)
Keterangan:
p = perlakuan
r = jumlah replikasi perlakuan
Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 4
ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang
digunakan adalah 16 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 1 ekor tikus
cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses
adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total tikus yang
digunakan adalah 20 ekor tikus.
4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan teknik pengambilan
sampel simple random sampling.
4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian
a. kriteria Inklusi Tikus Putih:
1) umur 2-3 bulan
2) Berat badan 150-250 gram
3) Jantan, strain wistar
27
4) Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang
tebal berwarna putih serta matanya jernih (Smith dan
Mangkuwidjojo, 1998).
b. Kriteria Drop Out
1) Tikus yang sakit selama penelitian
Jika kondisi diatas tidak terpenuhi, maka tikus menjadi sakit.
Beberapa indikator yang dapat digunakan untuk menilai apakah tikus
sehat atau sakit adalah (Hubrecht dan Kirkwood, 2010):
- Penampilan umum, pada tikus yang sakit dapat terlihat piloereksi,
bulu rontok, kulit kendur, berat badan menurun, kelopak mata
tertutup.
- Feses, feses yang lembek dan diare menunjukkan terjadinya
gangguan pada saluran pencernaan.
- Tingkah laku, tikus yang sakit akan menjadi lebih agresif
awalnya, namun lambat laun akan menjadi pasif.
- Postur, umumnya tikus yang sakit akan sering tiduran di lantai
kandang, dengan posisi kepala menyentuh abdomen.
- Pergerakan, pergerakan pada tikus yang sakit sangat berkurang.
- Suara, tikus yang sakit akan lebih banyak mencicit ketika
dipegang.
- Fisiologi, dapat terjadi bersin, hipotermia, serta penampilan yang
pucat.
2. Tikus yang mati selama adaptasi dan atau perlakuan
28
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Ekstrak Kulit Jeruk Lemon
4.4.2 Variabel Tergantung
Kadar HDL pada tikus putih jantan (Rattus novergicus strain wistar).
4.5 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi
Operasional
Alat Ukur Hasil Ukur Skala
Ukur
1. Ekstrak
kulit jeruk
lemon
(Citrus
limon)
Ekstrak kulit jeruk
lemon adalah
ekstrak kulit jeruk
lemon kering yang
dimaserasi
menggunakan
sistem pelarut
etanol 96% dan
aseton dengan
dosis 125
mg/kgBB, 250
mg/kgBB dan 500
mg/kgBB
Timbangan mg/kgBB Kategorik
2. Kadar
HDL
Kadar HDL tikus
putih normal 35
mg/dl (Rattus
novergicus strain
wistar)
Menggunakan
autoanalyzer
mg/dL Numerik
29
4.6 Bahan dan Instrumen Penelitian
4.6.1 Bahan
a. Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon)
b. Induksi minyak goreng deep frying 1ml/100 gram BB atau sama
dengan 1,5 – 2,5 ml peroral (Sutejo dan Dewi, 2012)
c. Reagen untuk pemeriksaan kadar HDL (High Density Lipid)
d. Diet pakan tikus BR-1
e. Kloroform
(Perret-gentil, M. I., 2007)
4.6.2 Instrumen
a. Alat Pemeliharaan Tikus
1) Kandang tikus
2) Penutup kandang dari anyaman kawat
3) Botol air
4) Timbangan
5) Tempat makan tikus
b. Alat Pembedahan Tikus
1) Gunting
2) Pinset
3) Botol sediaan
4) Handscoon
5) Pengait jaringan
6) Pisau bedah
c. Alat lain
30
1) Sonde
2) Mikroskop
3) Mikrometer square
4) Kamera digital
5) Botol film
6) Spuit injeksi 3 ml
7) Label
(Perret-gentil, M. I., 2007)
4.7 Prosedur penelitian
4.7.1 Pembagian Kelompok Tikus
Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 4
ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang
digunakan adalah 16 ekor. Masing – masing kelompok diberikan 1 ekor tikus
cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses
adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total tikus yang
digunakan adalah 20 ekor tikus.
a. Kelompok 1: diberikan induksi minyak goreng deep frying selama 14
hari tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk lemon, kemudian diberi
pakan standar pada 15 hari berikutnya.
b. Kelompok 2: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1
ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit
jeruk lemon sebanyak 25 mg/ekor/hari selama 15 hari.
31
c. Kelompok 3: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1
ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit
jeruk lemon sebanyak 50 mg/ekor/hari selama 15 hari
d. Kelompok 4: diberikan induksi minyak goreng deep frying
1ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit
jeruk lemon sebanyak 100 mg/ekor/hari selama 15 hari
4.7.2 Adaptasi
Proses adaptasi hewan coba dilakukan selama 7 hari di dalam kandang
agar mencit dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama
adaptasi mencit diberikan pakan standar BR-1 yang mengandung air 13%, protein
23%, lemak kasar 5%, abu 7%, Ca 0,3%, P 0,6%, serat 5%, secara sonde lambung
sebanyak 15g/hari serta minum ad libitum (Zuraida, et al, 2011).
4.7.3 Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Jeruk Lemon
Dosis yang dipakai untuk ekstrak kulit jeruk lemon dengan menggunakan
3 dosis, yaitu 125 mg/kgBB, 250 mg/kgBB dan 500 mg/kgBB (Muhtadi et al,
2015). Berat tikus adalah sekitar 200 gr sehingga ekstrak kulit jeruk lemon yang
diberikan yaitu:
Dosis I = 125 mg/kgBB x 0,2 = 25 mg/ekor/hari
Dosis II = 250 mg/kgBB x 0,2 = 50 mg/ekor/hari
Dosis III = 500 mg/kgBB x 0,2 = 100 mg/ekor/hari
32
4.7.4 Pembuatan Minyak Goreng Deep Frying
Pembuatan minyak goreng deep frying menggunakan minyak goreng
kemasan yang dipanaskan berulang sebanyak lima kali untuk menggoreng ubi.
Proses penggorengan dimulai dengan memasukkan minyak goreng ke dalam
ketel/panci sebanyak ± 2500mL, kemudian ketel dipanaskan hingga mencapai
suhu 180ºC, sebanyak 1kg ubi digoreng dalam minyak tersebut selama 10 menit.
Kemudian minyak didiamkan tunggu hingga dingin dan dilanjutkan pemanasan
berikutnya sampai pemanasan ke-5. Minyak yang digunakan adalah minyak yang
sama (tidak diganti dan tidak dilakukan penambahan volume minyak segar).
Minyak goreng deep frying didapatkan dari membeli minyak goreng di pasar
Mergan dan diberikan kepada penjual makanan cepat saji (Ratih, 2016).
4.7.5 Pemberian Minyak Goreng Deep frying
Pemberian minyak goreng deep frying pada tikus diberikan 1 kali dalam
sehari 1ml/100gr BB tikus atau setara dengan 1,5 – 2,5 ml peroral melalui sonde.
Dalam penelitian sebelumnya menunjukkan pemberian minyak goreng deep
frying dapat menurunkan kadar HDL pada tikus (Sutejo dan Dewi, 2012)
4.7.6 Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon)
a. Pembuatan serbuk kulit lemon
Kulit jeruk lemon yang dikumpulkan, dibersihkan dan dipotong –
potong kecil, dikeringkan, dan diblender menjadi bubuk. Bubuk
kering ditimbang dan siap untuk diekstrak (Mohamed et al, 2009).
33
b. Proses ekstraksi
Ekstrak kulit jeruk lemon disiapkan dengan maserasi atau
perendaman menggunakan sistem pelarut etanol 96% dan aseton
dengan rasio 4:1 yang dijauhkan dari sinar matahari dan diaduk
selama 3 hari. Maserasi lalu difilter dengan corong Buchner. Ampas
yang tersisa dimaserasi kembali dua kali lagi. Filtrasi dari ekstrak
digabungkan dan dipekatkan menggunakan evaporator untuk
mendapatkan ekstrak kering (Mohamed et al, 2009).
Ekstrak kulit jeruk lemon yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah
sebagai berikut:
Dosis 1 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 25 x 7 x 15 = 2.625 mg
Dosis 2 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 50 x 7 x 15 = 5.250 mg
Dosis 3 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 100 x 7 x 15 = 10.500 mg
Jadi, total kebutuhan ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 18.375 mg.
4.7.7 Proses Pengambilan Darah, Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba
a. Proses Anastesi
Tahap ini dilakukan dengan memasukkan hewan coba ke dalam
toples kaca yang sebelumnya sudah diberi kapas yang mengandung
kloroform. Pembiusan dilakukan satu persatu dengan harapan
pembiusan dapat dilakukan secara inhalasi dengan dosis kloroform
0,67ml/hewan coba selama 60 detik yang dihitung menggunakan
34
stopwatch. lalu membiarkan sampai tikus tidak bergerak, tunggu
selama 20 detik, jika hewan coba mengalami recovery maka harus
dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya dengan prosedu
Cervical Dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak dan
vertebrae (Alexandru, 2011; Perret-gentil, M. I., 2007).
b. Proses Pembedahan
Setelah hewan coba teranastesi dengan baik,. hewan coba diletakkan
pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba difiksasi terhadap meja
lilin dengan menggunakan jarum pentul. Dengan menggunakan
gunting bedah, dilakukan pembedahan pada abdomen hingga
setinggi leher. Dengan menggunakan spuit 3 ml, darah hewan coba
diambil dari ventrikel kiri sebanyak ± 3 ml (Alexandru, 2011).
4.7.8 Penguburan Tikus Percobaan
Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba tidak
mengalami recovery. Sebelum dilakukan penguburan hewan coba, dipastikan
bahwa denyut nadi sudah berhenti. Setelah dibedah, hewan coba akan dikuburkan
dengan cara (SEPA,2009) :
1. Tikus dibungkus dengan polibag
2. Tikus dimasukkan ke dalam lubang pada tanah yang kering dengan
kedalaman 1 meter dan jarak minimal 250 meter dari sumber air
3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus
35
4.7.9 Pemeriksaan Kadar High Density Lipoprotein
Pemeriksaan kadar HDL menggunakan sampel serum darah dengan
metode CHOD-PAP (Ratna, 2008).
- Persiapan Sampel 500 µL dan reagen presipitasi HDL 1000 µL
- Presipitasi dengan cara makro
- Campur dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar dan sentrifugasikan
selama 10 menit pada 4000 rpm, atau selama 2 menit pada 12.000 rpm.
- Prosedur Pemeriksaan
Panjang gelombang : Hg 546 nm
Spektrofotometer : 500 nm
Kuvet : diameter dalam 1 cm
Suhu inkubasi : 20 - 25°C atau 37°C
- Bahan
a. Aqua bidestilata : blanko 100 µL
b. Supernatan : sampel 100 µL
c. Larutan reagen kolesterol : blanko 1000 µL sampel 1000 µL
Campur dan inkubasikan selama 10 menit pada suhu 20 - 25°C atau
selama 5 menit pada suhu 37°C kemudian baca absorbansi sampel ( A
sampel ) terhadap Blanko dalam waktu 60 menit.
Kalkulasi
HDL (mg/dl) =
ΔA Standar
ΔA Sampel x Konsentrasi standar (mg/dl)
36
Pembedahan dan pengambilan darah pada jantung tikus menggunakan spuit 3 cc
Pemeriksaan kadar HDL
4.8 Alur Penelitian
Adaptasi hewan coba selama 7 hari (Pengelompokkan hewan coba menjadi 4 kelompok)
Pemberian pakan dan minum standar (BR – 1)
Kelompok I
Induksi minyak goreng deep frying
1ml/100 gram
selama 14 hari
Pemberian perlakuan mulai hari ke-8 sampai hari ke-36
Kelompok II
Induksi minyak goreng deep frying
1ml/100 gram
selama 14 hari
Kelompok III
Induksi minyak goreng deep frying
1ml/100 gram
selama 14 hari
Kelompok IV
Induksi minyak goreng deep frying
1ml/100 gram
selama 14 hari
Kelompok I
Tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk
lemon
Kelompok II
Ekstrak kulit jeruk lemon dengan
dosis 25 mg/ekor/hari
selama 15 hari
Kelompok III
Ekstrak kulit jeruk lemon dengan
dosis 50 mg/ekor/hari
selama 15 hari
Kelompok IV
Ekstrak kulit jeruk lemon dengan
dosis 100 mg/ekor/hari
selama 15 hari
Anestesi dengan inhalasi kloroform dan membunuh tikus dengan cervical dislocation
37
4.9 Analisis Data
Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji
normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji Bonferroni, uji regresi linier yang
diolah menggunakan program SPSS 23 (Statistical Product and Service Solution
versi 23). Uji normalitas dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang
digunakan 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05. Jika hasil p < 0,05
maka data dapat ditransformasi.
a. Uji homogenitas dengan uji Levene digunakan untuk menentukan varian
data sama atau tidak. Apabila distribusi data normal dan homogen
dilanjutkan dengan uji one way ANOVA.
b. Uji one way ANOVA membuktikan adanya perbedaan yang bermakna
antara kontrol dengan perlakuan dengan perubahan kadar HDL. Hasil uji
ANOVA dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika signifikansi (sig)
<0.05
c. Uji post hoc digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna
antara masing-masing kelompok perlakuan dalam penelitian. Uji bonferoni
digunakan bila varian sama, bila varian tidak sama digunakan uji gomes
howel.
d. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa kuat pengaruh antara dosis
ekstrak kulit jeruk lemon terhadap kadar HDL.
(Dahlan, 2016)