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V o l . 1 5 6 , N o . 3O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , D e c . 1 9 8 3 , p . 1 3 6 9 - 1 3 7 20 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 3 / 1 2 1 3 6 9 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C 1 9 8 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

M e t a b o l i s m o f V a r i o u s C a r b o n S o u r c e s b y A z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s eCARL A . WESTBY,* DAVID S . CUTSHALL, AND GALINA V . V I G I L t

D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , S o u t h D a k o t a S t a t e U n i v e r s i t y , B r o o k i n g s , S o u t h D a k o t a 5 7 0 0 7R e c e i v e d 5 A u g u s t 1 9 8 3 / A c c e p t e d 2 6 S e p t e m b e r 1 9 8 3

A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e S p 7 a n d t w o m u t a n t s w e r e e x a m i n e d f o r 1 9 c a r b o nm e t a b o l i s m e n z y m e s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h i s n i t r o g e n f i x e r u s e s t h e E n t n e r -D o u d o r o f f p a t h w a y f o r g l u c o n a t e d i s s i m i l a t i o n , l a c k s a c a t a b o l i c b u t h a s a na n a b o l i c E m b d e n - M e y e r h o f - P a r n a s h e x o s e p h o s p h a t e p a t h w a y , h a s a m p h i b o l i ct r i o s e p h o s p h a t e e n z y m e s , l a c k s a h e x o s e m o n o p h o s p h a t e s h u n t , a n d h a s l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e , m a l a t e d e h y d r o g e n a s e , a n d g l y c e r o k i n a s e . T h e m u t a n t s a r es e v e r e l y d e f i c i e n t i n p h o s p h o g l y c e r a t e a n d p y r u v a t e k i n a s e a n d a l s o h a v es o m e w h a t r e d u c e d l e v e l s o f o t h e r c a r b o n e n z y m e s .

An i m p o r t a n t r e l a t i o n s h i p e x i s t s i n A z o s p i r i l -l u m s p p . b e t w e e n n i t r o g e n f i x a t i o n a n d c e r t a i no r g a n i c a c i d s ( e . g . , m a l a t e ) a n d s u g a r s s u p p l i e di n n a t u r e b y h o s t g r a s s e s . T h e s e c o m p o u n d so c c u r i n C - 4 g r a s s r o o t e x u d a t e s ( 1 9 , 2 2 ) , e x e r t ac h e m o t a c t i c e f f e c t o n A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e( 1 8 ) a n d s t i m u l a t e n i t r o g e n a s e a c t i v i t y ( 1 6 ) . C a r -b o n m e t a b o l i s m a n d r e g u l a t i o n i n t h i s n i t r o g e nf i x e r h a v e r e c e i v e d l i t t l e a t t e n t i o n ( 1 5 , 1 7 ) .A . b r a s i l e n s e S p 7 (ATCC 2 9 1 4 5 ) , t h e w i l dt y p e , w a s o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p eC u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M d . M u t a n t sCW-1 (ATCC 3 5 2 1 2 ) a n d CW-2 (ATCC 3 5 2 1 3 )w e r e i s o l a t e d o n n u t r i e n t a g a r p l a t e s a f t e r 4 5 m i no f e x p o s u r e o f S p 7 t o d i e t h y l s u l f a t e a t 1 . 5 a n d3 . 0 % f o r CW-1 a n d C W - 2 , r e s p e c t i v e l y . T h em u t a n t s w e r e s o u g h t s o a s t o h a v e o n e m o r e t o o l( b e s i d e s S p 7 ) f o r s t u d y i n g t h e r e g u l a t i o n o fc a r b o n p a t h w a y s i n A . b r a s i l e n s e .D o b e r e i n e r - D a y - N H 4 C I ( D D N ) m e d i u m ( p H6 . 8 ) u s e d t h r o u g h o u t c o n t a i n e d i n o r g a n i c s a l t s( 4 ) , 2 . 3 g o f N H 4 C l p e r l i t e r , 5 g o f a s i n g l ec a r b o n s o u r c e ( f i l t e r - s t e r i l i z e d s o d i u m , c a l c i u m ,o r p o t a s s i u m s a l t f o r a c i d s ) p e r l i t e r , a n d w h e r ep l a t e s w e r e r e q u i r e d , 1 5 g o f a g a r p e r l i t e r . I n at y p i c a l e n z y m e r u n , 4 t o 6 f l a s k s ( 2 - l i t e r , w i d e -m o u t h e d , 2 5 0 m l o f m e d i u m p e r f l a s k ) i n o c u l a t e d1 : 1 5 ( v o l / v o l ) w i t h l o g a r i t h m i c - p h a s e c e l l s w e r ei n c u b a t e d a t 3 0 PC o n a r e c i p r o c a l s h a k e r ( 6 4s t r o k e s p e r m i n , 1 0 - c m d i s p l a c e m e n t ) . C u l t u r e sw e r e g r o w n t o a n a b s o r b a n c e o f 0 . 6 t o 1 . 3 a t 5 2 0nm ( 3 x 1 0 8 t o 8 x 1 0 8 C F U / m l ) .A f t e r r e v e r s i o n c h e c k s , c e l l s w e r e h a r v e s t e db y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n a t 4 C ,w a s h e d t w i c e w i t h 0 . 8 5 % N a C l ( 2 5 0 m l p e rf l a s k ) , a n d s u s p e n d e d i n 1 t o 3 m l o f 0 . 0 2 M T r i s -t P r e s e n t a d d r e s s : N i a m e y , D e p a r t m e n t o f S t a t e , W a s h i n g -t o n , D . C . 2 0 5 2 0 .

h y d r o c h l o r i d e b u f f e r , pH 7 . 5 . W a s h e d c e l l s w e r er u p t u r e d b y f o u r 3 0 - s s o n i c b u r s t s ( 4 A ) a t 0 t o4 C w i t h a B r a n s o n m o d e l S - 1 1 0 s o n i f i e r ( s m a l lp r o b e ) . C e n t r i f u g a t i o n a t 3 9 , 9 0 0 x g f o r 3 0 m i na t 0 t o 4 C r e m o v e d p a r t i c u l a t e s , a n d t h e s u p e r -n a t a n t w a s a c r u d e c e l l e x t r a c t .E n z y m e s 1 t o 2 1 , t h e t r i v i a l n a m e s a n d ECn u m b e r s o f w h i c h a r e g i v e n i n t h e l e g e n d t o F i g .1 , w e r e a s s a y e d b y t h e f o l l o w i n g r e f e r e n c e dp r o c e d u r e s : 1 , 2 , 5 , 6 , 1 3 , a n d 1 5 ( 9 , 2 1 ) ; c o u p l e d3 a n d 4 ( 1 2 , 1 3 ) ; 7 a n d 8 ( S i g m a T e c h n i c a lB u l l e t i n ) ; 9 ( 3 ) ; 1 0 ( 7 ) ; 1 1 ( 2 3 ) ; 1 2 ( W o r t h i n g t o nE n z y m e M a n u a l , 1 9 7 2 ) ; 1 4 a n d 1 6 ( 5 ) ; a n d 2 0 a n d2 1 ( S i g m a T e c h n i c a l B u l l e t i n n o . 3 4 0 - U V ) .T h e c a r b o n m e t a b o l i s m o f A . b r a s i l e n s e w a si n i t i a l l y e x p l o r e d b y c h e c k i n g t h e g r o w t h r e -s p o n s e o f t h e w i l d t y p e , S p 7 , a n d t w o m u t a n t s ,CW-1 a n d C W - 2 , t o v a r i o u s s i n g l e - c a r b o ns o u r c e s . T h e r e s u l t s ( T a b l e 1 ) a r e i n g e n e r a la g r e e m e n t w i t h t h e f i n d i n g s o f o t h e r s ( 1 , 1 7 , 2 0 )a n d i n d i c a t e t h a t A . b r a s i l e n s e c a n u s e e i t h e rc e r t a i n s u g a r s o r o r g a n i c a c i d s f o r c a r b o n a n de n e r g y . T h e t w o m u t a n t s g r e w p o o r l y o n o r g a n i ca c i d s , i n d i c a t i n g d e f i c i e n c y i n g l u c o n e o g e n e s i s ;t h i s w a s s u p p o r t e d b y t h e l o n g e r g e n e r a t i o nt i m e s o f t h e m u t a n t s c o m p a r e d w i t h S p 7 o ng l u c o n a t e ( T a b l e 1 ) .To f u r t h e r a n a l y z e c a r b o n m e t a b o l i s m i n S p 7 ,e n z y m e s o f g l u c o n a t e , g l y c e r o l , l a c t a t e , a n dm a l a t e m e t a b o l i s m ( F i g . 1 ) w e r e m e a s u r e d i nc r u d e e x t r a c t s f r o m c e l l s g r o w n s i n g l y o n t h e s es u b s t r a t e s . T h e m u t a n t s w e r e t e s t e d f o r t h es a m e e n z y m e s i n e x t r a c t s f r o m c e l l s g r o w n o ng l u c o n a t e .Some o f t h e e n z y m e s w e r e p r e s e n t i n m a r k e d -l y h i g h e r a m o u n t s i n S p 7 u n d e r c e r t a i n g r o w t hc o n d i t i o n s ( T a b l e 2 ) . T h i s w a s t h e c a s e f o rg l y c e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e(NADP+) ( n o . 8 ) , e n o l a s e ( n o . 1 1 ) , g l y c e r o k i -

1 3 6 9

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1 3 7 0OTES J.BACTERIOL.O0 - f t * % 00, . OfG u 6 e 1 8 2 ~l u c o s e 8 - 8 G l u c o n a t e 2 - K e t o -/ g g l u c o n a t eB l o s y n t h e s i s / 1 7 1)\, S ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 8 P - 2 - K e t o - \\ l cose4P 6 6 _ P - G l u c o n a t e 2 P l u c o n a t eGlucoselP ' O " +4 5 - O ' 3 2 , 5 - D l k e t o -F r u c t o s e - 6 - P g l u c o n a t e

1 5 P e n t o s P 6 - P - 2 - K e t o - 3e o x y - g l u c o n a t e((14 4 ~ ~ ~ ~ ~ L a c t a t e NF r u c t o s e - 20Krebs1,6-PA c y c l e

3 y e h r d - a P y r u v a t e O a l o -/ ' - c e t a t e M a l a t e

D i h y d r o x y - Ja c e t o n e - P 3 - P - G l y c e r o y l - P P - E n o l p y r u v a t es n - G l y c e r o l - 3 - P

G l y c e r o l 3 - P - G l y c e r a t e 2 - P - G l y c e r a t eF I G . 1 . C a r b o n m e t a b o l i s m o f A . b r a s i l e n s e . E n z y m e s a r e n u m b e r e d a s f o l l o w s : 1 , g l u c o n o k i n a s e ( E C2 . 7 . 1 . 1 2 ) , 2 , g l u c o n a t e 2 - d e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 9 9 . 3 ) , 3 , p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r a t a s e ( E C 4 . 2 . 1 . 1 2 ) , 4 ,

p h o s p h o - 2 - k e t o - 3 - d e o x y g l u c o n a t e a l d o l a s e ( E C 4 . 1 . 2 . 1 4 ) , 5 , p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 4 4 ) , 6 ,g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 4 9 ) , 7 , g l y c e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( N A D + ) ( E C1 . 2 . 1 . 1 2 ) , 8 , g l y c e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( N A D P + ) ( E C 1 . 2 . 1 . 1 3 ) , 9 , p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e ( E C2 . 7 . 2 . 3 ) , 1 0 , p h o s p h o g l y c e r a t e m u t a s e ( E C 2 . 7 . 5 . 3 ) , 1 1 , e n o l a s e ( E C 4 . 2 . 1 . 1 1 ) , 1 2 , p y r u v a t e k i n a s e ( E C 2 . 7 . 1 . 4 0 ) ,1 3 , f r u c t o s e - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e ( E C 4 . 1 . 2 . 1 3 ) , 1 4 , f r u c t o s e b i s p h o s p h a t a s e ( E C 3 . 1 . 3 . 1 1 ) , 1 5 , 6 - p h o s p h o f r u c -t o k i n a s e ( E C 2 . 7 . 1 . 1 1 ) , 1 6 , g l u c o s e - p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( E C 5 . 3 . 1 . 9 ) , 1 7 , g l u c o k i n a s e ( E C 2 . 7 . 1 . 2 ) , 1 8 , g l u c o s ed e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 4 7 ) , 1 9 , g l y c e r o k i n a s e ( E C 2 . 7 . 1 . 3 0 ) , 2 0 , l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 2 7 ) , 2 1 ,m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( E C 1 . 1 . 1 . 3 7 ) . D a s h e d a r r o w s c o r r e s p o n d t o r e a c t i o n s t h a t a r e m i s s i n g i n t h i s b a c t e r i u m o ra r e d e t e c t a b l e a t o n l y v e r y l o w l e v e l s i n e x t r a c t s . U n n u m b e r e d s o l i d a r r o w s c o r r e s p o n d t o r e a c t i o n s n o t t e s t e d i nt h e p r e s e n t s t u d y . T h e a s t e r i s k a t p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e ( n o . 9 ) a n d p y r u v a t e k i n a s e ( n o . 1 2 ) i n d i c a t e s t h e m o s tp r o b a b l e s i t e o f m u t a t i o n i n CW-1 a n d C W - 2 .

TABLE 1 . G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f A . b r a s i l e n s e f r o m D D N - g l u c o n a t e o r BHI c u l t u r e s , t h e p l a t e s w e r eS p 7 a n d m u t a n t s CW-1 a n d CW-2 i n c u b a t e d a t 3 2 C f o r 3 t o 4 d a y s b e f o r e b e i n g s c o r e dG r o w t h o n s i n g l e - c a r b o n s o u r c e s aC a r b o n s o u r c e b S p 7 C W - 1 C W - 2

D - G l u c o n a t e + + + ( 5 . 2 ) - + + + ( 7 . 3 ) + + + ( 7 . 4 )D - A r a b i n o s e ++ + +D - F r u c t o s e +++ +++ +E t h a n o l + + + + + +G l y c e r o l + + ( 1 1 . 2 ) + + + +F u m a r a t e , 2 - ++/+++ +/+ + + / + +k e t o g l u t a r a t e ,p y r u v a t e , o rs u c c i n a t eD L - M a l a t e + + + ( 3 . 0 ) + +D L - L a c t a t e +++ ( 2 . 9 ) + +2 - K e t o g l u c o n a t e +++ + + I+ +a T h e c a r b o n s o u r c e s w e r e s i n g l y p r e s e n t i n DDNa g a r p l a t e s a t 5 g f l i t e r . A c i d s w e r e p r e s e n t a s s o d i u m ,c a l c i u m , o r p o t a s s i u m s a l t s . A f t e r s t r e a k i n o c u l a t i o n

f o r s u r f a c e g r o w t h . S y m b o l s f o r g r o w t h o n a g a r :+ + + , e x c e l l e n t g r o w t h ; + + , f a i r g r o w t h ; a n d + , l i t t l eg r o w t h .b T h e f o l l o w i n g p e r m i t t e d l i t t l e o r n o g r o w t h o f S p 7o r m u t a n t s : a c e t a t e , o - g a l a c t o s e , D - g l u c o s e , g l y c e r a t e ,D - m a n n i t o l , D - m a n n o s e , D - r i b o s e , a n d D - x y l o s e .c N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e g e n e r a t i o n t i m e s( h o u r s ) a t 3 0 t PC i n DDN l i q u i d m e d i u m u n d e ra e r o b i c c o n d i t i o n s w i t h t h e c a r b o n s o u r c e a t 5 g / l i t e r .

n a s e ( n o . 1 9 ) , l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( n o . 2 0 ) ,a n d m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( n o . 2 1 ) .O u r e n z y m e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e E n t n e r -D o u d o r o f f p a t h w a y i s a m a j o r r o u t e o f g l u c o n a t ed i s s i m i l a t i o n i n A . b r a s i l e n s e . L e v e l s o f t h et h r e e E n t n e r - D o u d o r o f f e n z y m e s , 1 , 3 , a n d 4( F i g . 1 ) , i n g l u c o n a t e - g r o w n c e l l s ( T a b l e 2 ) w e r e

J . B A C T E R I O L .3 7 0 NOTES

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TABLE 2 . C a r b o n p a t h w a y e n z y m e s i n A . b r a s i l e n s e S p 7 a n d m u t a n t s CW-1 a n d CW-2S p a c t o n g i v e n g r o w t h s u b s t r a t e ( m U / m g o f p r o t e i n ) a

E n z y m e ( n o . ) ' S p 7 C W - 1 C W - 2G l y c e r o l L a c t a t e M a l a t e G l u c o n a t e G l u c o n a t e G l u c o n a t e

G l u c o n o k i n a s e ( 1 ) 0 o 0 . 2 0 1 9 . 1 2 0 . 4 2 3 . 0G l u c o n a te 2 - d e h y d r o g e n a s e ( 2 ) 0 . 8 1 . 0 2 . 1 1 . 2 0 . 7 0 . 5P h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r a t a s e - 6 - 6 9 . 9 1 2 1 8 1 . 9 9 2 . 7 4 1 . 0 5 6 . 0p h o s p h o - 2 - k e t o - 3 - d e o x y g l u c o n a t ea l d o l a s e ( 3 a n d 4 ) dP h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( 5 ) 0 0 0 0 0 0G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( 6 ) ' 0 . 5 1 . 6 0 . 3 0 . 2 0 . 3 0 . 2G l y c e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e 2 , 2 2 3 1 , 5 7 3 1 , 2 6 2 2 , 5 1 4 1 , 1 9 7 1 , 1 4 6( N A D + ) ( 7 )G l y c e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e 3 . 7 2 3 . 5 2 . 9 2 4 . 3 2 . 7 3 . 0( N A D P + ) ( 8 )P h o s p h o g l y c e r a t e k i n a g e ( 9 ) 1 0 7 6 1 . 4 6 6 . 7 1 7 2 1 2 . 9 1 9 . 9P h o s p h o g l y c e r a t e m u t a s e ( 1 0 ) 1 6 . 6 3 6 . 3 1 7 . 4 2 6 . 5 1 6 . 0 1 5 . 2E n o l a s e ( 1 1 ) 3 8 . 8 3 8 3 4 4 5 3 7 9 4 0 3 2 8 5P y r u v a t e k i n a s e ( 1 2 ) f 5 2 . 8 7 2 . 0 1 3 6 . 9 1 3 6 1 4 . 9 3 4 . 0F r u c t o s e - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e ( 1 3 ) 1 5 . 5 2 2 . 0 1 3 . 5 3 6 . 0 1 2 . 8 1 4 . 9F r u c to s e b i s p h o s p h a t a s e ( 1 4 ) 2 8 . 0 2 9 . 0 2 0 . 0 4 1 . 0 3 3 . 0 3 5 . 06 - P h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( 1 5 ) 0 0 0 0 0 0G l u c o s e - p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( 1 6 ) 6 9 . 0 1 3 4 7 7 . 5 6 1 . 0 5 2 . 5 7 3 . 3G l y c e r o k i n a s e ( 1 9 ) 1 7 . 5 1 . 2 2 . 1 1 . 1 1 . 2 0 . 6L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( 2 0 ) 1 . 3 2 1 . 6 2 0 . 6 2 . 6 9 . 0 1 1 . 1M a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( 2 1 ) 7 , 2 3 3 1 0 , 9 6 1 5 , 1 6 7 2 1 , 7 1 2 6 , 0 2 0 6 , 3 3 1a E a c h s u b s t r a t e w a s t e s t e d s i n g l y i n a m e d i u m w i t h t h e b a s a l s a l t s o f D o b e r e i n e r a n d D a y ( 4 ) a n d 2 . 3 g o fN H 4 C l p e r l i t e r . C u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a e r o b i c a l l y a t 3 0 M C . Enzyme a c t i v i t i e s i n c r u d e c e l l e x t r a c t s w e r em e a s u r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e , a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . O n e e n z y m e u n i t i s t h e a m o u n t o f e n z y m e w h i c h

c a t a l y z e s t h e f o r m a t i o n o f 1 , . m o l o f p r o d u c t p e r m i n u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e a s s a y . S p e c i f i c a c t i v i t i e sr e p r e s e n t a v e r a g e s o f a c t i v i t i e s f r o m a t l e a s t t w o e x t r a c t s f r o m s e p a r a t e c e l l b a t c h e s . A l l a s s a y s f o r e a c h e x t r a c tw e r e i n t r i p l i c a t e . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e e x t r a c t s w a s d e t e r m i n e d b y t h e B i o - R a d p r o c e d u r e .b G l u c o k i n a s e ( n o . 1 7 ) a n d g l u c o s e d e h y d r o g e n a s e ( n o . 1 8 ) w e r e n o t a s s a y e d . T h e f o l l o w i n g m i l l i m o l a re x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e u s e d t o c a l c u l a t e e n z y m e a c t i v i t i e s : NAD(P) a n d NAD(P)H a t 3 4 0 n m , 6 . 2 2 ( 9 ) ;NADH a t 3 6 6 n m , 3 . 4 ( 2 ) ; p h o s p h o e n o l p y r u v a t e a t 2 3 0 n m , 3 . 0 ( 9 ) , a n d 1 . 7 5 a t 2 4 0 n m , ( 8 ) ; a n d t h e f o r m a z a np r o d u c t o f 3 - ( 4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y l ) - 2 , 5 - d i p h e n y l - 2 H - t e t r a z o l i u m b r p m i d e r e 4 4 p t i o n a t 5 5 0 n m , 8 . 1 ( 9 ) .U n d e t e c t a b l e a c t i v i t y ; < 1 . 5 mU f o r g l u c o n o k i n a s e a n d p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( 9 ) ; < 0 . 8 mU f o r 6 -p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( 9 ) . Y e a s t p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( t y p e V ; S i g m a C h e m i c a l C o . ) a n d r a b b i t 6 -p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( t y p e I I I ; S i g m a ) w e r e r u n a s p o s i t i v e c o n t r o l s t o v e r i f y t h e a s s a y p r o c e d u r e s .d C o m b i n e d a c t i v i t y o f t w o e n z y m e s w a s m e a su r e d .' Y e a s t g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( t y p e X V ; S i g m a ) w a s r u n a s a p o s i t i v e c o n t r o l t o v e r i f y t h ea s s a y .f I t w a s n e c e s s a r y i n t h e a s s a y t o u s e 7 . 1 mM p h o s p h o e n o l p y r u v a t e i n s t e a d o f t h e p r e s c r i b e d 0 . 7 1 mM t oo b t a i n a n t i c i p a t e d a c t i v i t y .c o m p a r a b l e t o i n d u c e d l e v e l s f o u n d i n P s e u d o -m o n a s s p p . ( 9 ) a n d R h i z o b i u m s p p . ( 1 1 ) , w h e r et h i s p a t h w a y h a s b e e n s h o w n t o b e i m p o r t a n t i ng l u c o n a t e c a t a b o l i s m . T h e a b s e n c e o f p h o s p h o -g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( n o . 5 ) i n A . b r a s i l e n s e( T a b l e 2 ) i n d i c a t e s t h e a b s e n c e o f t h e h e x o s em o n o p h o s p h a t e s h u n t ( 1 1 ) ( F i g . 1 ) . T h i s o b s e r -v a t i o n a n d t h e p r e s e n c e o f o n l y v e r y l o w l e v e l so f g l u c o n a t e 2 - d e h y d r o g e n a s e ( n o . 2 ) ( T a b l e 2 )e m p h a s i z e s t h e i m p o r t a n c e o f t h e E n t n e r - D o u -d o r o f f p a t h w a y . A . b r a s i l e n s e S p 7 a p p e a r s t oh a v e a 2 - k e t o g l u c o n a t e p a t h w a y b e c a u s e i t c a ng r o w o n 2 - k e t o g l u c o n a t e a s t h e s o l e c a r b o ns o u r c e ( T a b l e 1 ) .G l u c o k i n a s e ( n o . 1 7 ) a n d g l u c o s e d e h y d r o g e -n a s e ( n o . 1 8 ) ( F i g . 1 ) a r e a s s u m e d t o b e a b s e n t i n

A . b r a s i l e n s e o r u n i m p o r t a n t c a t a b o l i c a l l y b e -c a u s e t h e o r g a n i s m c a n n o t u s e g l u c o s e a s a s o l ec a r b o n s o u r c e ( 2 0 ) . A g l u c o k i n a s e ( n o . 1 7 ) , e v e ni f i t w e r e p r e s e n t , w o u l d b e o f l i t t l e a s s i s t a n c ef o r g l u c o s e d i s s i m i l a t i o n i n A . b r a s i l e n s e b e -c a u s e t h e n e c e s s a r y f o l l o w - u p e n z y m e s , 6 - p h o s -p h o f r u c t p k i n a s e ( n o . 1 5 ) a n d g l u c o s e - 6 - p h o s -p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( n o . 6 ) a r e m i s s i n g ( T a b l e2 ) . T h e a b s e n c e o f 6 - p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( n o .1 5 ) i n d i c a t e s t h e a b s e n c e o f a c a t a b o l i c Emb-d e n - M e y e r h o f - P a r n a s h e x o s e p h o s p h a t e r o u t e( F i g . 1 ) ( 9 , 2 1 ) i n t h i s o r g a n i s m . On t h e o t h e rh a n d , t h e p r e s e n c e o f f r u c t o s e - b i s p h o s p h a t e a l -d o l a s e ( n o . 1 3 ) , f r u c t o s e b i s p h o s p h a t a s e ( n o . 1 4 )a n d g l u c o s e - p h o s p h a t e i s o m e r a s e ( n o . 1 6 ) i n a l lo f t h e e x t r a c t s ( T a b l e 2 ) t e s t i f i e s t o a n o p e r a t i o n -

NOTES 1 3 7 1O L . 1 5 6 , 1 9 8 3

8/14/2019 azoscarbon

4/4

1 3 7 2 NOTESa l a n a b o l i c h e x o s e p h o s p h a t e E m b d e n - M e y e r -h o f - P a r n a s r o u t e ( 6 ) ( F i g . 1 ) .A l l o f t h e E m b d e n - M e y e r h o f - P a r n a s t r i o s e -p h o s p h a t e e n z y m e s ( n o . 7 t o 1 2 ) w e r e p r e s e n t i ns u b s t a n t i a l a m o u n t s i n g l u c o n a t e - g r o w n c e l l s o fA . b r a s i l e n s e ( T a b l e 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e t r i o s ep a r t o f g l y c o l y s i s i s f u n c t i o n a l . T h i s t r i o s e p a t h -w a y i s m o s t l i k e l y u s e d a n a b o l i c a l l y w h e n m a -l a t e o r l a c t a t e i s a v a i l a b l e a n d i n d e e d t h e t r i o s ee n z y m e s w e r e p r e s e n t w h e n t h e s e s u b s t r a t e sw e r e t h e s o l e s o u r c e o f c a r b o n f o r S p 7 ( T a b l e 2 ) .Among t h e s u b s t r a t e s t e s t e d i n A . b r a s i l e n s e ,t h e s h o r t e s t g e n e r a t i o n t i m e s w e r e w i t h m a l a t ea n d l a c t a t e ( T a b l e 1 ) , s u g g e s t i n g a n a c t i v e K r e b sc y c l e . T h i s c y c l e h a s i n f a c t b e e n s h o w n t o b ep r e s e n t t h r o u g h r e s p i r o m e t r y e x p e r i m e n t s ( W .H . - T . L o h , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . F u r t h e r -m o r e , we h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e n e c e s s a r ye n t r y e n z y m e s , m a l a t e ( n o . 2 1 ) a n d l a c t a t e d e h y -d r o g e n a s e ( n o . 2 0 ) , a r e p r e s e n t a n d i n d u c i b l e( T a b l e 2 ) . A n o t h e r e n t r y e n z y m e , g l y c e r o k i n a s e( n o . 1 9 ) , i s i n d u c e d b y g l y c e r o l i n A . b r a s i l e n s e( T a b l e 2 ) b u t g r o w t h h e r e i s v e r y s l o w ( T a b l e 1 ) .I f m u l t i p l e m u t a t i o n s a r e d i s c o u n t e d a s t h ec a u s e f o r t h e a s s o r t e d e n z y m e d e f e c t s i n CW-1a n d CW-2 ( T a b l e 2 ) , a n d t h i s s e e m s l i k e l y ( 1 0 ,1 4 ) , t h e n e i t h e r p h o s p h o g l y c e r a t e ( n o . 9 ) , o rp y r u v a t e k i n a s e ( n o . 1 2 ) c a n b e c o n s i d e r e d t h el o g i c a l t a r g e t o f t h e m u t a t i o n i n t h e m u t a n t sb e c a u s e t h e s e t w o e n z y m e s a r e t h e m o s t s e v e r e -l y a f f e c t e d ( T a b l e 2 ) . I t w o u l d b e p r e m a t u r e a tt h i s p o i n t t o s u g g e s t t h a t r e p r e s s i o n o r s o m eo t h e r s e c o n d a r y r e s p o n s e a r i s i n g f r o m a s i n g l em u t a t i o n c a u s e d t h e o t h e r e n z y m e d e f i c i e n c i e si n t h e m u t a n t s ( T a b l e 2 ) . M u l t i p l e g e n e l e s i o n sh a v e n o t y e t e x p e r i m e n t a l l y b e e n r u l e d o u t .W e t h a n k W. H . - T . L o h f o r p r o v i d i n g u s e f u l i n f o r m a t i o nc o m p l e m e n t a r y t o o u r r e s u l t s . W e a r e g r a t e f u l t o J u n e E r i c k -s o n f o r t y p i n g t h i s m a n u s c r i p t a n d e a r l i e r d r a f t s .

LITERATURE CITED1 . A l b r e c h t , S . L . , a n d Y . O k o n . 1 9 8 0 . C u l t u r e s o f A z o s p i r i l -l u m . M e t h o d s E n z y m o l . 6 9 : 7 4 0 - 7 4 9 .2 . B e l s e n h e r z , G . , T . B u c h e r , a n d K . H . G a b a d e . 1 9 5 5 . aG l y c e r o p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e f r o m r a b b i t m u s c l e .M e t h o d s E n z y m o l . 1 : 3 9 1 - 3 9 7 .3 . C a m p b e l l , A . E . , J . A . H e l l e b u s t , a n d S . W. W a t s o n . 1 9 6 6 .R e d u c t i v e p e n t o s e p h o s p h a t e c y c l e i n N i t r o c y s t i s o c e -a n u s . J . B a c t e r i o l . 9 1 : 1 1 7 8 - 1 1 8 5 .4 . D o b e r e i n e r , J . , a n d J . M. D a y . 1 9 7 6 . A s s o c i a t i v e s y m b i o -s i s i n t r o p i c a l g r a s s e s : c h a r a c t e r i z a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m sa n d d i n i t r o g e n - f i x i n g s i t e s , p . 5 1 8 - 5 3 8 . I n W . E . N e w t o n

a n d C . J . Nyman ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e F i r s t I n t e r n a -t i o n a l S y m p o s i u m o n N i t r o g e n F i x a t i o n . W a s h i n g t o nS t a t e U n i v e r s i t y P r e s s , P u l l m a n .5 . G a l e , N . L . , a n d J . V . B e c k . 1 9 6 7 . E v i d e n c e f o r C a l v i nc y c l e a n d h e x o s e m o n o p h o s p h a t e p a t h w a y i n T h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s . J . B a c t e r i o l . 9 4 : 1 0 5 2 - 1 0 5 9 .6 . G o t t s h a l k , G . 1 9 7 9 . B a c t e r i a l m e t a b o l i s m . S p r i n g e r - V e r -l a g , I n c . , Ne w Y o r k .7 . G r i s o l i a , S . 1 9 6 2 . P h o s p h o g l y c e r i c a c i d m u t a s e . M e t h o d sE n z y m o l . 5 : 2 3 6 - 2 4 2 .8 . G r i s o l i a , S . , a n d J . C a r r e r a s . 1 9 7 5 . P h o s p h o g l y c e r a t em u t a s e f r o m y e a s t , c h i c k e n b r e a s t m u s c l e , a n d k i d n e y( 2 , 3 - P G A - d e p e n d e n t ) . M e t h o d s E n z y m o l . 4 2 : 4 3 5 - 4 5 0 .9 . H e a t h , H . E . , a n d E . T . G a u d y . 1 9 7 8 . R e l a t i o n s h i p b e -t w e e n c a ta b o li sm o f g l y c e r o l a n d m e t a b o l i s m o f h e x o s e -p h o s p h a t e d e r i v a t i v e s b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . J .B a c t e r i o l . 1 3 6 : 6 3 8 - 6 4 6 .1 0 . I r a n i , M . , a n d P . K . M a l t r a . 1 9 7 4 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r -i z a t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i m u t a n t s d e f e c t i v e i n e n z y m e so f g l y c o l y s i s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 5 6 : 1 2 7 -1 3 3 .

1 1 . K e e l e , B . B , J r . , P . B . H a m i l t o n , a n d G . H . E l k a n . 1 9 7 0 .G l u c o n a t e c a t a b o l i s m i n R h i z o b i u m j a p o n i c u m . J . B a c t e r -i o l . 1 0 1 : 6 9 8 - 7 0 4 .1 2 . K o v a c h e v i c h , R . , a n d W. A . W o o d . 1 9 5 5 . C a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m b y P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s . I I I . P u r i f i c a -t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r a s e . J .B i o l . C h e m . 2 1 3 : 7 4 5 - 7 5 6 .1 3 . K o v a c h e v i c h , R . , a n d W. A . W o o d . 1 9 5 5 . C a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m b y P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s . I V . P u r i f i c a -t i o n a n d p r o p e r t i e s o f 2 - k e t o - 3 - d e o x y - 6 - p h o s p h o g l u c o n a t ea l d o l a s e . J . B i o l . C h e m . 2 1 3 : 7 5 7 - 7 6 7 .1 4 . L a m , K . - B . , a n d J . M a r m u r . 1 9 7 7 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e g l y c o l y t i c p a t h -way m u t a n t s . J . B a c t e r i o l . 1 3 0 : 7 4 6 - 7 4 9 .1 5 . N o v i c k , N . J . , a n d M . E . T y l e r . 1 9 8 2 . L - A r a b i n o s e m e t a b o -l i s m i n A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e . J . B a c t e r i o l . 1 4 9 : 3 6 4 - 3 6 7 .1 6 . O k o n , Y . , S . L . A l b r e c h t , a n d R . H . B u r r i s . 1 9 7 6 . F a c t o r sa f f e c t i n g g r o w t h a n d n i t r o g e n f i x a t i o n o f S p i r i l l u m l i p o -f e r u m . J . B a c t e r i o l . 1 2 7 : 1 2 4 8 - 1 2 5 4 .1 7 . O k o n , Y . , S . L . A l b r e c h t , a n d R . H . B u r r i s . 1 9 7 6 . C a r b o na n d a m m o n i a m e t a b o l i s m o f S p i r i l l u m l i p o f e r u m . J . B a c -t e r i o l . 1 2 8 : 5 9 2 - 5 9 7 .1 8 . O k o n , Y . , L . C a k m a k c i , I . N u r , a n d I . C h e t . 1 9 8 0 .A e r o t a x i s a n d c h e m o t a x i s o f A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e .M i c r o b . E c o l . 6 : 2 7 7 - 2 8 0 .1 9 . R o v i r a , A . D . 1 9 6 9 . P l a n t r o o t e x u d a t e s . B o t . R e v . 3 5 : 3 5 -3 7 .2 0 . T a r r a n d , J . J . , R . N . K r i e g , a n d J . D o b e r e l n e r . 1 9 7 8 . At a x o n o m i c s t u d y o f t h e S p i r i l l u m l i p o f e r u m g r o u p , w i t hd e s c r i p t i o n s o f a new g e n u s , A z o s p i r i l l u m g e n . n o v . a n dt w o s p e c i e s . A z o s p i r i l l u m l i p o f e r u m ( B e & e r i n c k ) c o m b .n o v . a n d A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e s p . n o v . C a n . J . M i c r o -b i o l . 2 4 : 9 6 7 - 9 8 0 .2 1 . T i w a r i , N . P . , a n d J . J . C a m p b e l l . 1 9 6 9 . E n z y m a t i cc o n t r o l o f t h e m e t a b o l i c a c t i v i t y o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n -o s a g r o w n i n g l u c o s e o r s u c c i n a t e m e d i a . B i o c h e m .B i o p h y s . A c t a. 1 9 2 : 3 9 5 - 4 0 1 .2 2 . V a n c u r a , V . 1 9 6 4 . R o o t e x u d a t e s o f p l a n t s . I . A na l ys i s o fr o o t e x u d a t e s o f b a r l e y a n d w h e a t i n t h e i r i n i t i a l p h a s e s o fg r o w t h . P l a n t S o i l 2 1 : 2 3 1 - 2 4 8 .2 3 . W e s t h e a d , W. W. 1 9 6 6 . E n o la s e f r o m y e a s t a n d r a b b i tm u s c l e . M e t h o d s E n z y m o l . 9 : 6 7 0 - 6 7 9 .

J . B A C T E R I O L .