Ayrampo Berberis Flexulosa

8/18/2019 Ayrampo Berberis Flexulosa

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SANMARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AM ÉRICA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Departamento Académico de Química Básica yAplicada

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

“Titulación de ácido ascórbico presente enBerberisflexulosa “ayrampo” por Iodometría”

Profesora:

Dra. Norma Angélica Carlos Casas

Alumnos:

Chipana Luján, Jaime Roberto

Limay De La Cruz, Edwin Carlos

Suárez Su, Luis Alfredo

Lima

2015


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Proyecto de investigación de Química Analítica InstrumentalCuantificación de ácido ascórbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometría

Facultad de Farmacia y BioquímicaUniversidad Nacional Mayor de San Marcos

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I.-Introducción

Determinación de vitamina CEl ácido ascórbico o vitamina C (C6H8O6) se puede determinar por medio de unatitulación yodométrica. La vitamina C es un agente reductor suave que reacciona

rápidamente con el ióntriyoduro, en esta práctica se genera un exceso conocido de ion triyoduro ( I3-) por

reacción deyodato con yoduro, se deja reaccionar y luego el exceso de I3

- se titula por retroceso con unasolución de tiosulfato. El método se basa en las siguientes reacciones:

8I- + IO3- + 6H+ →3I3- + 3H2O

C6H8O6 + I3- + H2O→ C6H8O7 + 2H+ + 3I-

Ácido ascórbico ácido deshidroascórbico

I3- + 2(S2O3)-2 → 3I- + (S4O6)-2 Tiosulfato tetrationato


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Volumetría de oxidación - reducción con yodo.

El potencial estándar de reducción para la reacción: I 2 + 2e- 2I- es 0.535 V. Lassustancias con potencial de reducción bastante inferior al del sistema yodo - yoduroson oxidadas por el I2 y pueden valorarse con una solución patrón de yodo. Estasvolumetrías redox llamadas yodimétricas o directas, se utilizan para determinaragentes reductores.

El yoduro I- se oxida a I2 ejerciendo una acción reductora sobre los sistemasfuertemente oxidantes con formación de una cantidad equivalente de yodo. El yodoliberado se titula con la solución valorada de tiosulfato de sodio Na 2S2O3. Estasvolumetrías se llaman yodométricas o indirectas y se utilizan para determinar agentesoxidantes.

8.2.1.1 Volumetrías redox yodométricas o indirectas. Las reacciones generales paradeterminar un agente oxidante (Ag. Oxidante) mediante volumetría yodométrica son:

Ag. Oxidante + I- (exceso) Ag. Reductor + I2

I2 + 2S2O3= 2I- + 2S4O6=

El yoduro I- que se adiciona como NaI o KI, se encuentra en exceso y no es una soluciónpatrón. El I2 formado en la primera reacción es equivalente a la cantidad de agenteoxidante contenida en la muestra que se analiza. El I 2 liberado se titula con unasolución patrón de un reductor, entre los cuales el Na 2S2O3 es el más utilizado.

Las valoraciones deben efectuarse en el menor tiempo posible con el fin de evitar queel I- sea oxidado por el oxígeno del aire. Cuando sea necesario dejar la reaccióndurante algún tiempo, se debe desalojar el aire del recipiente, para lo cual se utiliza ungas inerte como CO2 o NO2. La adición de NaHCO3 a la solución ácida que se valora,proporciona CO2.Las reacciones están afectadas además por la luz, por lo cual el erlenmeyer donde serealiza la titulación se coloca en la oscuridad.

Como los vapores de yodo pueden perderse fácilmente, se acostumbra tapar elrecipiente utilizando un tapón de vidrio. Cuando se determina un oxidante mediantereacciones con yodo, el punto final se alcanza cuando desaparece el color amarillo dela solución. Se aprecia mejor este punto si se añade una solución de almidón, queforma con el yodo un complejo de color azul oscuro. El punto final se alcanza cuandodesaparece el color azul, al agregar un ligero exceso de Na 2S2O3. El indicador almidónse añade cuando se ha consumido la mayor parte del yodo. Si se añade demasiadopronto, el I- se absorbe sobre el indicador y se llega muy lentamente al punto final,siendo muy difícil detectarlo.


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Preparación y valoración de la solución patrón de tiosulfato de sodio.

La solución patrón se prepara por el método indirecto porque el tiosulfato de sodio esuna sal higroscópica; se le agrega una pequeña cantidad de hidróxido de sodio, dada lainestabilidad de la solución en medio ácido.

El tiosulfato de sodio se valora con dicromato de potasio K2Cr2O7 en presencia de I-en medio ácido, titulando el yodo producido con tiosulfato. Las reacciones queocurren, son:

Cr2O7= + 6 I- (exceso) + 14H+ 2Cr+3 + 3I2 + 7H2O

I2 + 2S2O3= 2I- + S4O6=

Para que la reacción entre el Cr 2O7= y el I- sea completa, se debe dejar en reposo porvarios minutos.

8.2.1.2 Volumetrías redox yodimétrica o directa. La valoración yodimétrica o directaimplica el uso de una solución patrón de triyoduro para valorar analitos reductores. Lassoluciones de triyoduro se preparan disolviendo cristales de yodo en solucionesconcentradas de KI y diluyendo en agua. En una solución que contiene exceso de ionesI- el yodo existe esencialmente como iones I3- o I2I- ; sin embargo para facilitar lasecuaciones y loscálculos puedeconsiderarse que elyodo existe en formamolecular como I2.

Es necesario que hayaun exceso de KI para

asegurar eldesplazamiento de lareacción de disoluciónde I2 a I3- :

I2 (s) + I- I3- Experimentalmente seha comprobado que laproporción másadecuada de KI e I2para la disolución de I2 es 20g de KI por cada 12.7gr de I2.

La valoración de los analitos reductores se hace en medio ácido o n eutro. Losreductores fuertes como, los iones sulfuro, sulfito y tiosulfato se determinan en medioácido. Los reductores un poco más débiles como los compuestos de arsénico (III) yantimonio (III) se determinan en medio neutro.


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Se utiliza como indicador el almidón, que forma un complejo de color azul en presenciade exceso de yodo.

8.2.1.2.1 Preparación y valoración de la solución tipo yodo. La solución tipo de yodo seprepara por el método indirecto, disolviendo el yodo en una solución de KI, valorando

con solución patrón de tiosulfato de sodio y utilizando almidón como indicador.Las reacciones que ocurren en la valoración son:

I2 (s)+ 2e- 2I-

2S2O3= 2e- + S4O6=

Las soluciones de yodo son poco estables por la volatilidad del soluto, el ataque delyodo sobre muchos materialesorgánicos y la luz.

8.2.1.2.2 Determinaciónde SO 3

= mediante volumetrías redoxyodimétrica.

La muestra acidificada que contienesulfito, se titula con la soluciónestandarizada de yodo. El yodoreacciona con el SO3=. El punto finalde la valoración se reconoce por elcolor azul resultante de la reacción delprimer exceso de yodo con elindicador de almidón.

Las reacciones que ocurren en lavaloración son:

SO3= + H2O -> 2H+ + SO4= + 2e-

I2 (s)+ 2e- -> 2I-

Control de corrosión en lodos de perforación. La corrosión es el ataquedestructivo de un metal, causada poruna reacción química o electroquímicaentre un metal y su ambiente.

Las causas principales de la corrosiónen las operaciones de perforación son el oxígeno, el dióxido de carbono, y el ácidosulfihídrico contenidos en el lodo. Cualquiera que sea su mecanismo de entrada, elefecto corrosivo de esos gases es también una función de la cantidad de salesdisueltas, del pH, de la temperatura y de la velocidad de flujo del fluido involucrado.


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La corrosión origina fallas prematuras de la tubería de perforación (drill pipe), delrevestimiento (Casing) o de cualquier otro equipo de acero empleado para perforar ocompletar pozos. La industria petrolera dispone de un importante número deproductos químicos para impedir o minimizar el ataque corrosivo. Todas las formas decorrosión aumentan en presencia de oxígeno; los secuestrantes de oxígeno, sirvenpara reducir los efectos de la corrosión. Los sulfitos de amonio o de sodio se utilizancomo depuradores de oxígeno en lodos base agua.

El sulfito reacciona rápidamente con el oxígeno del lodo y lo elimina según la reacción:

2SO3= + O2 -> 2SO4=

La tasa de bombeo del sulfito depende de la concentración de oxígeno presente en ellodo. Se recomienda mantener en el sistema un mínimo de 100ppm de sulfito.


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Clasificación taxonómica

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase. Magnolidae

Orden: Ranunculales

Familia: Berberidaceae

Género: Berberis

Especie: Berberis flexulosa R. & P.

Nombre vulgar: ayrampo


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II.- Obejtivo

Determinar la cantidad de ácido ascórbico presente en el extracto de Berberis flexulosa “ayrampo”

III.- Materiales, reactivos


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IV.- Metodología


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V. Resultados

Preparación de soluciones

Para KIO 3 0,01 N (PM=214,001 g/mol)

Se pesó 0,1071 g en balanza analítica, se agregó esta masa a una fiola de 50 mL y seenrasó con agua destilada c.s.p. 50 mL.

Para Na 2S2O3.5H2O 0,01 N (PM=248,18g/mol)

Se pesó 0,2142 g de Na2S2O3.5H2O en balanza analítica, se agregó a una fiola de 100mL y se agregó agua destilada c.s.p. 100 mL.

0,1071 g de KIO 3

0,2142 g de Na 2S2O3.5H 2O


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Para KI 0,01 N (PM=166 g/mol)

Se pesó 0,1661 g de KI en balanza analítica, se agregó a una fiola de 100 mL y se agregó

agua destilada c.s.p. 100 mL.

Para almidón al 1%

Se pesó 1,0002 g de almidón en balanza analítica y se agregó en una fiola de 100 mL yse agregó agua destilada c.s.p. 100 mL.

0,1661 g de KI

1,0002 g de almidón


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Estandarización de Na 2S2O3 con KIO3

Na 2S2O3 + 2 KIO3 = K2S2O3 + 2 NaIO 3

#mEq Na2S2O3 = #mEq KIO3

10,3mL x N = 10mL x 0,01 N

N Na2S2O3 = 0,0097 N

Na 2S2O3 Gasto: 10,3 mL

1g de KI

10 mL KIO3 0,01 N3mL H 2SO4 2mL de almidón 1%


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Titulación de ácido ascórbico con Na 2S2O3 y KIO3

Ecuaciones en la t it ulación

C6H8O6 + 4KI + 8H+ → C6H12O6 + 4K+ + 4I- + 4H+

6 Na 2S2O3 + 2 I3 → 3 Na 2S4O6 + 6 NaI

Na 2S2O3 Gasto: 6,5 mL

3mL de extracto

10 mL KI 0,01 N

3mL H 2SO4 2mL de almidón 1%


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PM ácido ascórbico = 176,126 g/mol………PEq=88,65………PmEq=0,08865

#mEq Na2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P.

6, 5 mL x 0, 0097 N = á ó

,

g ácido ascórbico = 5,5893 x10-3

g

Cantidad de ácido ascórbico en mg/100mL

X_________100mL

5, 5893 mg________3mL

La iodatometría o método iodométrico indirecto se fundamenta en la reacción de unoxidante con el KI yoduro de potasio reductor para generar yodo que se hace soluble

con la formación del poliyoduro triyoduro: I2 (s) + I-→ I3-

Es este triyoduro el cual es titulado por el tiosulfato, de manera que como el yodogenerado es proporcional a la cantidad de muestra oxidante se puede determinar laequivalencia: #mEq Na2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P.


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VI.- Discusión

VII.- Conclusiones

VIII.- Referencias bibliográficas


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IX.- Anexos


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Proyecto de seminario – Química Analítica Instrumental - 2015

1UNMSM – FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POREL MÉTODO DE HPLC

Autores:

RODRIGUEZ CORDOVA, Angello Gonzalo FERNANDEZ TELLO, Jose Oswaldo MENDDOZA VILCHEZ, Mayra Lucia TEVES GUZMAN, Katerin ROJAS VÁSQUEZ, Victor

Docente:

Dr. CARLOS CASAS, Norma

Lima – Lima – Perú2015

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSUniversidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL


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INDICE

IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL METODO DE HPLC...................... 3

INTRODUCCION ..................................................................................................... 3

OBJETIVOS............................................................................................................. 3

MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 4

I. Berberis flexuosa R. & P. ............................................................................... 4

II. ANTOCIANINAS ............................................................................................ 5

III. HPLC .......................................................................................................... 5 METODOLOGIA ...................................................................................................... 6

I. SOLVENTES .............................................................. .................................... 6

II. COLUMNAS ......................................................... .......................................... 6

III. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-PDA) ............. .................................... 8

IV. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-MS/MS) ......................................... .... 9

RESULTADOS ...................................................................................................... 10

CONCLUSIONES .................................................................................................. 12

ANEXOS ..................................................................................... ........................... 13

FICHA DE CLASIFICACION TAXONÓMICA DE LA MUESTRA VEGETAL ... 13 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 14


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IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR ELMETODO DE HPLC

INTRODUCCIONLas antocianinas pertenecen a un gran y muy distribuido grupo de metabolitossecundarios, que se conocen colectivamente como flavonoides. Las antocianinasnaturales más comunes son las 3-O-glicósidos y las 3,5 di-O-glicósidos. Lasantocianinas son los componentes que otorgan a las plantas colores rojos, azules,morados, particularmente en partes como frutos, flores y hojas . Estos pigmentosfueron consumidos por los hombres a lo largo de incontables generaciones sincausar aparentemente ningún efecto tóxico. El interés por las antocianinas se haincrementado debido a su potencial uso como colorantes naturales y por suspotenciales beneficios en la salud. Últimamente, la seguridad de los pigmentossintéticos ha sido cuestionada, conduciendo a la reducción en el número decolorantes permitidos. Las antocianinas son pigmentos solubles en agua, lo quefacilita su incorporación en los sistemas acuosos alimentarios. Estas cualidadeshacen que estos colorantes naturales sean atractivos como pigmentos naturalesinocuos con considerable potencial en la industria alimentaria de productos con unrango de pH ácido. Además de su color, se ha reportado que las antocianinas tienenbeneficios para la salud como potentes antioxidantes y pueden incrementar laagudeza visual. Se ha observado también que poseen actividad antineoplásica,vasotónica, vasoprotectora, anti - inflamatoria y hepatoprotectora. En el Perú existenmuchas especies silvestres, una de ellas es Lechler, que crece especialmentealrededor de los campos de cultivo a manera de protección, debido a sus espinasgrandes y filudas, sus flores son amarillas y sus frutos morados. Existe informaciónsobre esta especie en Perú desde tiempos de la conquista; especialmente, elcronista Bernabé Cobo describió a esta planta con el nombre común de quisca-quisca, que significa planta espinosa, con unas pequeñas flores amarillas y espinasfiludas , cuyos frutos dan un suave color morado cuando son usados comocolorante. Asimismo, algunas tradiciones orales, sugieren que estos frutos eranusados por las ñustas durante el Incanato para lavar y cuidar sus cabellos a manerade un champú colorante natural.Miranda A, Martín O. Cromatografía Líquida (HPLC). [WebSite] [Disponible en:

http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citadoel 24 de noviembre 2015]

OBJETIVOS


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Determinación e identificación de antocianinas del ayrampo por el método deHPLC.

Identificación de tipos de antocianinas utilizando los métodos de (HPLC-MS/MS) y (HPLC-PDA).

MARCO TEÓRICO

I. Berberis flexuosa R. & P.Arbusto conocido del centro del Perú, de la vertiente del Pacífico y de vallesinterandinos, en ambientes semixéricos. El tipo de esta especie fue recolectada en lacuenca alta del río Huaura, una zona escasamente herborizada. Otras poblacionesprovienen de las cuencas del Santa, Palca y Rimac. Una de las poblaciones esconocida de las laderas con bosques perennifolios en las alturas de Lima. Estasladeras incluyen varios endemismos y deberían recibir atención para suconservación.


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la solución emigran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestoscon la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de loscontenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de lanaturaleza de los compuestos a determinar.

METODOLOGIA

I. SOLVENTESLos frutos secos congelados de Lechler (2,996 g) fueron separados de sus semillas;siendo licuados con una solución agua /acetona (30:70 v/v) y luego se filtró usandoun embudo buchner. La torta residual del filtrado fue nuevamente re-extraída con lasolución agua /acetona (30: 70 v/v) hasta obtener una solución clara. Los filtradosfueron combinados, llevados a una pera de decantación, agregándose cloroformo.La porción acuosa (parte superior) fue colectada y colocada en un rotavapor Büchi a40ºC durante 5 a 10 minutos, hasta que la acetona residual se evapora. El extractoacuoso fue llevado hasta un volumen conocido (100mL) usando agua destilada.

Se extraen con metanol y los extractos resultantes se tratan con 0.1 % HCL. Loscompuestos no polares y flavonoides se separan mediante tratamientos sucesivoscon éter de petróleo y acetato de etilo. La solución resultante se analiza en unacolumna Bondapak C 18 (30 cm x 8 mm d.i.) usando una fase móvil compuesta deagua/ ácido acético/ metanol (71: 10:10) a un flujo de 1.5 mL/ min y la detección serealiza a 530 nm. La delfidina 3.5 diglucósido y la malvidina glucósido fueron los

pigmentos mayoritarios encontrados en las cáscaras de uvas, para un 69 % delcontenido total de las antocianinas. Este método puede ser usado para determinar elcontenido de antocianinas en cualquier tipo de fruto o alimento.

El HPLC es el método más común para realizar el análisis de antocianinas. Lamuestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fracción fenólica(conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; seevaporó el metanol en un rotavapor Büchi, se utilizó agua acidificada con HCl 0,01%para lograr un volumen conocido y se filtró usando un filtro de polipropilenoWhatman de 0,45 m antes de la inyección en el equipo HPLC.

II. COLUMNAS

Para el estudio, caracterización y determinación de Antocianinas se utiliza unaColumna de fase reversa (C18). Esto porque la fase estacionaria debe de ser apolar,las antocianinas que se reconocen en este estudio son del mismo carácter (apolar).La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a supolaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de lacromatografía en capa fina. Aquí la fase estacionaria es una matriz apolar. Por lo


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tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares,tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifáticos.

En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografía ha sido también llamada como

cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En general, este último término se haempleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean sustituyentes ymatrices compatibles con fluidos biológicos.

El sistema C18-HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y unabomba que inyectan líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílicarequieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora serequiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite laaplicación de la muestra.

Es importante distinguir entre dos formatos de fase con enlace distinto. El formatoC18 de tipo monomérico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un único átomode sílice sobre la estructura del gel de sílice. Las columnas de tipo monoméricocomo son las COSMOSIL C18-MS-II y la serie MS tiene una excelentereproducibilidad de síntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodosde tiempo para la estabilización de la fase móvil.

Por otro lado el formato C18 polimérico incorpora un proceso de silanización tri-funcional por el que el grupo octadecil se une a 2 o 3 átomos de sílice sobre laestructura del gel de sílice. Esto aumenta el efecto de la silanización lo queproporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente encondiciones ácidas de la fase móvil. La capacidad de reconocimiento estéricotambién es mucho mayor que las de las columnas C18 del tipo de silanización

monofuncional. COSMOSIL ofrece el formato polimérico en ls AR-II y la seriecompleta AR-300.

En este caso se utilizaría una columna de fase reversa (Supelco AscentisTMC1825cmx4.6mm, 10μm) , debido a su facilidad de mantenimiento y bajo costo.


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III. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS PORCROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-PDA)

El HPLC es el método más común para realizar el análisis de antocianinas.

La separación real de cada componente en la muestra se realiza dentro de unacolumna, sin embargo esta separación tiene que ser “registrada” para que seamos

capaces de verlo. Los detectores se utilizan para este propósito. Los componentesseparados se controlan y se expresan electrónicamente. No hay detector universalque puede controlar todos los compuestos y hay muchos detectores utilizados parael análisis LC.

Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia.Proporcionan una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz anivel ~ pg. Son fáciles de operar y proporcionar una buena estabilidad. El detectorPDA detecta un espectro completo de forma simultánea. Detectores UV y VISvisualizar el resultado obtenido en dos dimensiones (intensidad de la luz y el tiempo),pero PDA añade la tercera dimensión (longitud de onda). Esto es conveniente paradeterminar la longitud de onda más adecuada sin repetir los análisis.

La muestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fracción fenólica(conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; seevaporó el metanol en un rotavapor Büchi, se utilizó agua acidificada con HCl 0,01%para lograr un volumen conocido y se filtró usando un filtro de polipropilenoWhatman de 0,45 m antes de la inyección en el equipo HPLC.

La separación de las antocianinas se llevó a cabo en una columna C-18WatersSymmetry (4,6mm x 150mm, 3,5m) usando un sistema HPLC que constaba de un

Imagen 03. Descripcion de C18 Imagen 04. C-18


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módulo de separación Waters 2695, equipado con un detector con arreglo defotodiodos (PDA) Waters 2996, un software Empower y un automuestreadorWaters717 plus. El rango de flujo fue de 0,8 mL/min; la fase móvil: A, ácido fórmico al 10%en agua grado HPLC; B, acetonitrilo; la gradiente utilizada fue: 0-1 min 95% A y 5%

de B; 2 min 90% A y 10% B; 20 min 80%Ay 20% B y a los 25 min 95%Ay 5% B.Se realizó una detección simultánea a las longitudes de onda: 520 nm paraantocianinas, 280 nm para compuestos fenólicos y a 320 nm para ácidos cinámicos.La identificación de los picos de las antocianinas fue realizado en base a lacomparación de los cromatogramas y tiempos de retención de los extractosconcentrados de antocianinas de las especies (Vistis vinifera) y (Zea mays), corridosbajo las mismas condiciones especificadas anteriormente.

Previamente, se utilizó un espectrofotómetro UV- visible Hewllet Packard 8453; lasmediciones fueron realizadas a 520 (máxima longitud de onda determinada) y a 700nm. (CARACTERIZACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS DE LOS FRUTOS Berberis boliviana Lechler.Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco, Av. De La Cultura 733, Cusco, Perú.)

IV. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS PORCROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-MS/MS)

La espectrometría de masas se basa en la medida directa de la relación de la masacon el número de cargas elementales positiva o negativa de los iones (mz) en la fasegaseosa obtenida de la sustancia a analizar. Esta relación se expresa en unidadesde masa atómica (u), (1u= la doceava parte de la masa de un átomo de carbono 12)o en daltons (1 Da= a la masa del átomo de hidrógeno). En este estudio se hanutilizado, el análisis del ion precursor, análisis del producto iónico, análisis de pérdidaneutral común y la monitorización selectiva de reacción, que son parte de laespectrometría de masas tandem (MS-MS), la cual tiene la ventaja de lograr dosseparaciones de los componentes de la muestra, siendo ambas separacionesiónicas; debido a esta especificidad, esta técnica es usada para lograr análisiscuantitativos de analitos en mezclas simples en cuestión de minutos sin necesidadde una separación cromatográfica u otro tratamiento químico que elimineinterferentes. La caracterización de cada una de las antocianinas se realizóutilizando la monitorización selectiva de reacción (SRM), y el análisis del ionprecursor, el cual detecta todos los iones precursores en una muestra que sefragmenta como un producto iónico común en tanto que el análisis de pérdidaneutral común detecta aquellos iones precursores que se fragmentan para produciriones con una diferencia común en producida por la pérdida de un fragmentocaracterístico de un producto o de una familia de compuestos . La separación de lasantocianinas fue llevada a cabo en una columna C-18 Waters Symmetry (4,6 x 75mm, 3,5m); se usó un túnel de triple cuadrupolo (Quattro Ultima, Micromass, UKLimited, Manchester, UK). El rango de flujo del HPLC se estableció en 1 mL/min, lafase móvil: A, ácido fórmico al 10%; B, acetonitrilo; la gradiente usada; 0-20 min,


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100%-85% A; 20-25 min, 85%-100% A. El espectro de absorción de las antocianinasfue realizado en el rango 200 – 600 nm. Los espectros de masas fueron obtenidosusando la Monitorización Selectiva de Iones (SIM). Aproximadamente 100 L deleluato del HPLC fueron separados por una microválvula y se depositaron en la

fuente ESI. El cuadrupolo fue operado según las siguientes condiciones: Voltajecapilar 3,2 kV, voltaje de cono 35 V, RF lense 1,50 V, temperatura del gas dedesolvación 500ºC con un flujo de 269 L/h, temperatura de la fuente 105ºC, presiónde colisión de gas (argón) 7 psi; la energía de colisión fue establecida en 25 eV.

En algunos casos en los que los pesos moleculares son idénticos y no se puededistinguir entre uno y otro, es necesario acudir a un método que nos pueda aclarar laidentidad de las sustancias; por ejemplo, tanto glucosa como galactosa, sonazúcares presentes en una gran cantidad de antocianinas, tienen el mismo pesomolecular, por lo que a través de un espectro de masas es imposible diferenciarlos,en nuestro caso la diferenciación fue posible gracias al análisis HPLC utilizando

extractos concentrados de antocianinas de variedades conocidas y cuyos perfilesantociánicos están bien establecidos, constituyendo éste un método rápido, sencilloy barato de identificación.

RESULTADOSAl someter el hidrolizado a un análisis HPLC, se verificó la presencia de 5 aglicones;simultáneamente, se realizó la hidrólisis y posterior análisis HPLC de un extractoconcentrado de antocianinas, Vitis vinifera (Uva) para tener patrones decomparación que nos ayuden a identificar los picos del cromatograma. Todas lasmuestras fueron analizadas bajo las mismas condiciones.

Al comparar los cromatogramas (figura 1), el perfil de elución de las antocianidinaspresentes Berberis flexuosa R. & P. coincide exactamente con los frutos de Vitisvinífera, que es una fuente muy conocida y bien estudiada de 5 aglicones: cianidina,delfinidina, malvidina, peonidina y petunidina. Asimismo, se pudieron identificar sólo5 antocianinas como se muestra en el cromatograma, estas son: delfinidina-3-glucósido, cianidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido ymalvidina-3-glucósido.

Berberis flexuosa R. & P.


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Imagen 05. Cromatogramas de comparación obtenidos a 520nm de las especies Berberisflexuosa R. & P. y Vitis vinífera obtenidos luego de haber realizado la hidrólisis ácida

correspondiente. En la especie Vitis vinífera, se encuentran 5 antocianidinas.

En la determinación de antocianinas por cromatografía líquida de alta resolución(HPLC-PDA) se obtuvieron cromatogramas a diferentes longitudes de onda, 280nm,320nm y 520nm con la finalidad de determinar antocianinas, como se muestra en lafigura 2.

Al comparar los cromatogramas (B) y (C) de la figura 2, correspondientes a 520 nm y280 nm, respectivamente, se verifica que las antocianinas serían los únicoscompuestos fenólicos presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P., debido aque no existen diferencias significativas entre ambos cromatogramas; este hecho essumamente importante debido a que se trataría de una fuente natural decomposición exclusivamente antociánica.

Imagen 06. Los cromatogramas obtenidos a diferentes longitudes de onda, nos muestra quelas antocianinas presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P, están casi puras,debido a que a 280nm (C),que es longitud de onda a la cual se pueden identificar otros

Vitis vinífera


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componentes fenólicos sólo aparecen las antocianinas, por lo que se puede considerar aestos frutos como una fuente casi pura de antocianinas.

CONCLUSIONES Se obtuvo antiocianinas del ayrampu por el método de HPLC Se demostró y cuantifico las antiocianinas del ayrampu por los métodos de

HPLC- MS/MS y HPLC-PDA. Se comparó las antiocianinas del ayrampu con la uva por el método de HPLC-

MS/MS.


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ANEXOSFICHA DE CLASIFICACION TAXONÓMICA DE LA MUESTRA VEGETAL


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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Miranda A, Martín O. Cromatografía Líquida (HPLC). [WebSite] [Disponibleen: http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015]

Leal Guadarrama, Esquivel Soto. CROMATOGRAFÍA DEFASE REVERSA. UNAM 2004. [WebSite] [Disponible en:http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_fase_reversa.pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015]

López Ramírez, Winston Quiñones, Fernando Echeverri. PERFILCROMATOGRÁFICO DE LAS ANTOCIANINAS PRESENTES ENALGUNOS FRUTOS COLOMBIANOS. Scientia et Technica Año XIII, No33, Mayo de 2007

Aguilera Ortíz, Reza Vargas, Chew Madinaveitia, Meza Velázquez.

PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS ANTOCIANINAS. Facultad deCiencias Químicas. Universidad Juárez del Estado de Durango. Av.Artículo 123 s/n. Fracc. Filadelfia. 35010. Gómez Palacio, Durango,México.

GARZÓN G, LAS ANTOCIANINAS COMO COLORANTES NATURALESY COMPUESTOS BIOACTIVOS. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 3, 2008.

Biswas, G; Sarkar, S.; Chatterjee, T.K.; Mukherjee, S.P. Determination ofanthocyanins in fruits of Vitis vinifera by HPLC. J. Inst- Chem. 65 (2): p. 52,1993.

Bakker, J; Bridle, P; Bellworthy, SJ. Strawberry juice colour: a study of thequantitative and qualitative pigment composition of juices from 39

genotypes. J. Sci. Food. Agric. 64 (1): p. 31-37, 1994. Gao, L.; Mazza, G. Characterization of acetylated anthocyanins in lowbushblueberries .J. Liq. Chromatogr. 18 (2): p. 245- 259, 1995.

Berberidaceae endémicas del Perú. Rev. peru. biol. Número especial13(2): 171s - 173s (Diciembre 2006). Carmen Ulloa Ulloa , AbundioSagástegui e Isidoro Sánchez. El libro rojo de las plantas endémicas delPerú. Ed.: Blanca León et al. Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM


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1

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSFACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Escuela Académico Profesional de Farmacia y bioquímica

“Farmacia y bioquímica carrera a la vanguardia de las ciencias de la salud, elconocimiento libera nuestras capacidades y la buena enseñanza se reflejará en nuestro

liderazgo profesional”

ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN

ATÓMICA DE Berberis flexuosa

Curso: QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMETAL

Dra. Norma Angélica Carlos Casas

Arredondo Nuñez, Annsy Camila

López Chagua Ayrlton Jhonny

Ocros Meza Katherine Pamela

Quispe Molina, Brayanm Giancarlos Ysmael

Serrano Cervantes Lisbet Karina


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2

ANÁLISIS POR ESPECTROSTROSCOPÍA DEABSORCIÓN ATÓMICA EN MUESTRA

HIDROALCOHOLICA DE Berberis Flexuosa ANALYSIS BY SPECTROSTROSCOPY ATOMIC ABSORPTION IN

HYDROALCOHOLIC SAMPLE OF Berberis Flexuosa

INTRODUCCIÓN

a espectroscopia de absorción atómicaes un método de detección y ladeterminación de elementos químicos, particularmente de elementos metálicos.

Los compuestos para, para su examen, se tienenque romper en los átomos que los constituyen1.

En este caso se usara este tipo de espectroscopia para la determinación y cuantificación de calcioen una muestra de Berberis Flexuosa másconocida como (Ayrampo).La Berberis Flexuosa es un arbusto silvestreque se desarrolla en algunas zonas altoandinasentre los 2500 y 4500 msnm. En la épocaincaica fue utilizada como una planta conmúltiples funciones y usos, principalmente en lamedicina tradicional. Es un arbusto rústico de porte leñoso que crece en difícil condiciones desuelo, agua y temperatura. Se cosecha entre losmeses de abril, mayo y junio, cuando presentaun color guindo o lila muy oscuro y suave. Losfrutos maduros se comen crudos y con ellos se preparan bebidas y mazamorras. Es unaimportante fuente de minerales y vitaminas.Asimismo, es un efectivo febrífugo, laxante ytónico. La infusión de las hojas se utiliza contrael nerviosismo. La infusión de las flores actúacontra el cansancio y la anemia. La infusión dela raíz combate la disentería amebiana. Lainfusión de la raíz machacada estimula laretención de orina2.El método oficial del AOAC 985.35 paracuantificar el contenido de calcio en alimentosutiliza la técnica de espectrometría de absorciónatómica con llama la cual se basa en ladestrucción de la materia orgánica por vía secahasta lograr la digestión del alimento para posteriormente solvatar los residuos con ácidonítrico diluido para la posterior determinación

del o los analitos por Espectrofotometría deAbsorción Atómica con llama3. Con dichométodo se evaluó el contenido de este mineralen la Berberis Flexuosa conocida comoAyrampo.El calcio es un macro mineral indispensable para la formación de huesos y dientes, lacontracción muscular y el funcionamiento delsistema nervioso; también interviene en la

coagulación de la sangre y en la actividad dealgunas enzimas. Sin embargo, la mayoría delcalcio en el organismo se encuentra en loshuesos y en los dientes. Una manera de prevenirla deficiencia de calcio en el organismo es pormedio de una dieta rica en alimentos que locontengan, por ejemplo, productos lácteos(quesos, yogurt), espinacas, mostaza, rábano, brócoli, frijoles y ajonjolí4.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y reactivos: 100 gr. de fruto seco de Ayrampo 1L de Etanol de 70° Ácido nítrico al 65% Cloruro de potasio al 25 % Espectrofotómetro de absorción atómica

Shimadzu AA 7000 con llama de óxidonitroso/acetileno

Patrón de 1000 mg/L de calcio Pipeta de 10 mL. Balones aforados ( 20 mL , 250 mL ,

500 mL ) Bureta de 10 mL Bureta de 50 mL

Métodos

L


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3

La muestra fue recolectada del departamento deAyacucho (Perú), y llevada al laboratorio para preparar el extracto. Se pesó 100 g del frutoseco Ayrampo, el cual fue sometido aextracciones en maceración con etanol de 96o, atemperatura de 25 ºC en un recipiente de vidrio

cerrado y protegido de la luz por una semana; posteriormente se licuó y se dejó por unasemana adicional; se separó la soluciónetanólica del respectivo marco mediantefiltración. Por último, se recolectaron todos losfiltrados en un solo recipiente.5

La parte experimental consistió en siete ensayosen los cuales se corrieron las muestras patrón(curva de calibración), los estándares y lasmuestras naturales (matriz de agua cruda ytratada) y el registro de los resultados para cadagrupo de ensayos.5

1. Fundamento del método

Se basa en la destrucción de la materiaorgánica por vía seca hasta lograr ladigestión del alimento (Ayrampo) para posteriormente solvatar los residuos conácido nítrico diluido para la posteriordeterminación del analito porEspectrofotometría de AbsorciónAtómica con llama.3

2. Método de análisis

El método de análisis para ladeterminación de calcioespectrofotómetro de absorción atómica.Para la realización de este trabajo, seinició con una revisión documental delmétodo, posteriormente se hicieronensayos con patrones y muestras con elobjeto de operar el equipoadecuadamente.5

2.1 Procedimiento estándar

Se prepararán sustancias patrón parala curva de calibración de calcio alas cuales se le agregara ácidonítrico al 65% para la conservaciónde la muestra y cloruro de potasio al25% para evitar las interferencias deotros analitos en la lectura de lasmuestras, a la muestra (muestranatural) que se le va a medir calcio

se le adiciona ácido nítrico al 65% ycloruro de potasio al 25 %, al igualque a las muestras estándares omuestras preparadas, las muestras sevan a leer en el espectrofotómetrode absorción atómica Shimadzu AA

7000 con llama de óxido nitroso-acetileno.5 3. Preparación de soluciones

Solución de cloruro de Potasio(KCl): El cloruro de potasio se prepara disolviendo 25 g de clorurode potasio sólido, en aguadesionizada y se afora en un balónaforado de 100 mL.

Solución madre de Calcio de 500

mg/L: Esta solución se preparatomando 10 mL del patrón de1000mg/L de Calcio con una pipetaaforada de 10 mL, el cual se lleva aun balón aforado de 20 mL y seafora con agua desionizada.

Solución madre de Calcio de 20mg/L: Esta solución se preparatomando 5 mL de la solución de1000 mg/L de calcio por medio deuna pipeta aforada de 5 mL, el cualse lleva a un balón aforado de 250

mL se le adiciona 2,5 mL de ácidonítrico al 65% y se afora con aguadesionizada.

Solución madre de Calcio de 12,5mg/L : Esta solución se preparatomando 12,5 mL de la solución de500 mg/L de calcio por medio deuna bureta de 10 mL, el cual se llevaa un balón aforado de 500 mL y sele adiciona 5 mL de ácido nítrico al65% y se afora con aguadesionizada.

4. Preparación de patrones para la curvade calibración:

Para la validación del calcio se prepararon una serie de patrones deconcentraciones conocidas para la curvade calibración:


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4

Se prepararon una serie de muestras patrón de diferentes concentraciones a partir de una solución madre de calcio, para realizar un análisis de linealidad, para definir el rango óptimo deconcentración de la curva de calibración.

Para esto se realizaron unos ensayos paradefinir estos valores de concentración. El procedimiento para la preparación de lassoluciones patrón para la curva decalibración se muestra a continuación:

Patrón de 0,0 mg/L blanco dereactivos: Esta solución contieneagua desionizada más los reactivos,como son 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácidonítrico al 65% y se afora en un balón

de 250 mL. Patrón de 0,75 mg/L: Se tomaron15 mL de solución madre de Calcioen un balón aforado de 250 mL, sele adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácidonítrico al 65% y se afora.

Patrón de 1,00 mg/L: Se tomaron20 mL de solución madre de 12,5mg/L de Calcio en un balón aforadode 250 mL, se le adiciona 2,5 mL decloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5

mL ácido nítrico al 65% y se afora. Patrón de 1,50 mg/L: Se tomaron30 mL de solución madre de 12,5mg/L de Calcio en un balón aforadode 250 mL, se le adiciona 2,5 mL decloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5mL ácido nítrico al 65% y se afora.

Patrón de 2,00 mg/L: Se tomaron40 mL de solución madre de 12,5mg/L de Calcio en un balón aforadode 250 mL, se le adiciona 2,5 mL decloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5mL ácido nítrico al 65% y se afora.

Patrón de 3,00mg/L: Se tomaron 60mL de solución madre de12,5 mg/Lde Calcio en un balón aforado de250 mL, se le adiciona 2,5 mL decloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5mL ácido nítrico al 65% y se afora.

Patrón de 4,00 mg/L: Se tomaron80 mL de solución madre de 12,5 mg/Lde Calcio en un balón aforado de 250mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácidonítrico al 65% y se afora.

Nota: Todos los volúmenes para la preparación de los patrones se midieroncon una bureta de 10 mL y de 50 mL;menos los del cloruro de potasio y ácidonítrico que se toman con una pipetagraduada.

5. Muestra de análisis

Preparación de las soluciones estándar para el calcio: Se prepararan una serie demuestras estándar a partir de unasolución madre de 12,5 mg/L de calcio,esta es la misma solución madreutilizada en la preparación de lassoluciones patrón, los estándares seutilizaran para la corroboración delmétodo, ya que con el estándar deconcentración baja se calcula el límite dedetección del método, para ladeterminación del calcio porespectroscopia de absorción atómica de

llama y con los otros dos estándares severificara el 50% y el 90% de lasconcentraciones de las soluciones patrón(soluciones de la curva de calibración).Para esto se realizaron unos ensayos paradefinir estos valores de concentración. El procedimiento para la preparación de lassoluciones estándar se muestra acontinuación5

Estándar de 0,5 mg/L: Se tomaron 10mL de solución madre de 12,5 mg/L deCalcio en un balón aforado de 250 mL,se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% yse afora a 250 mL

Estándar de 1,8 mg/L: Se tomaron 36mL de solución madre de 12,5 mg/L deCalcio en un balón aforado de 250 mL,se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al


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5

65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% yse afora a 250 mL.

Estándar de 3,6 mg/L: Se tomaron 72mL de solución madre de 12,5 mg/L deCalcio en un balón aforado de 250 mL,se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al

65%, 2,5 mL de cloruro de potasio al25% y se afora.

6. Digestión de la muestra

Moler y homogeneizar la muestra.3 Si ladigestión es muy fuerte puede presentarse pérdida de muestra y porconsiguiente de analito o se puede presentar sequedad de la muestra y elanalito queda adherido al envasecontenedor y se ocasione disminución ensu concentración.6

7. Medición por Espectrofotometría deAbsorción Atómica:Antes de realizar la determinación de lamuestra mediante Absorción atómicadebemos verificar el buenfuncionamiento del equipo a utilizar.Para ello debemos calibrar el equipo

8. Parámetros instrumentales para ladeterminación de Calcio

Longitud de Onda (λ): 422.7 nm. Ancho de Banda: 0.5 nm. Corriente de lámpara (CH):

100% uso normal. Corrección de Fondo: Ninguno Tipo de llama recomendada:

Óxido Nitroso/Acetileno*. Intervalo flujo de combustible:

4.0 a 4.4 L/min.*Se recomienda la utilización de estetipo de llama puesto que este elemento

(calcio - Ca) tiene un punto de ebulliciónmuy alto y puede formar óxidos con elaire muy estables y difíciles de disociar, por lo que este tipo de llama provee unatemperatura entre (2500 a 3100) °Ccapaz de romper los enlaces formados por este elemento y el aire (oxigeno) yasí poder cuantificar calcio en su estadoiónico elemental.6

9. Metodología utilizada en Cenprofarma

Como no se sabía la concentración delayrampo se tomó 1 ml del extractofiltrado y de ahí se ahí se llevó a unafiola de 50 ml y se agregó el supresor,que en este caso fue el cloruro delantano (LaCl) al 0,1%, para eliminar lainterferencia con otros metales y de ahíse procedió a leer en el equipo.Se hizo la curva de calibración, la cualse trabajó a partir de una solución madrede 1000 ppm se preparóconcentraciones 0,5ppm, 1ppm, 2ppm y4ppm dándonos un coeficiente derelación de 0,99 lo que indicaba que lacurva pasa.Primero se lee el blanco que fue elcloruro de lantano al 0,1% luego pasacada estándar y sale la curva decalibración.Una vez que se tenga la muestra preparada se lee en el equipo y te sale laconcentración de la muestra problema elcual fue 0,650 ppm de acuerdo a eso serealiza los cálculos (se pesó 1ml y se

llevó a una fiola de 50 ml) haciendo loscálculos sale 32,5 µg de calcio/ml deextracto.Se utilizó estándar de calcio puro y eldiluyente para todos fue cloruro delantanoEl espectrofotómetro de absorciónatómica utilizado fue de marca PerkinElmerPara que se produzca la flama senecesita acetileno-aire combustible

comburente para que se produzca laatomización de la muestra.

RESULTADOS


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6

Tabla 1. Resultados de la cuantificación de calcio por elmétodo de espectroscopia de absorción atómica de lamuestra preparada.

DISCUSIÓN

El proyecto partió de 10ml de muestramacerada en dilución hidroalcólica, el cualse sometió a análisis obteniéndose comoresultado de una espectroscopia deabsorción atómica una concentración de3.25mg/100mL de Ca. Se sabe que dichamaceración partió de 100gr. de muestraseca, la cual fue llevada a 1 litro de alcoholde 76° por 4 días, además se puede inferirque la distribución de estos metalescontenidos en la planta se distribuyeron enel solvente de manera homogénea; ademáseste valor obtenido no supone comoreferente al contenido total de calcio de la planta, ya que solo se sometió a estudio parte de dicho macerado; por tanto elresultado obtenido de 3,25mg/100ml de Ca total en la alícuota se aproximó tomandocomo referente el volumen total delmacerado, es decir, si una alícuota de 10 mlde muestra contiene 0,325mg de Ca, así 1litro contendrá 32mg de Ca, esto es en100mg de muestra total. El intervalo dealimentos presuntos como ricos enconcentración de calcio llegan entre 44 a500 mg/100gr de porción consumida8 así lamuestra en estudio no puede serconsiderada como fuente enriquecida deCa; sin embargo más que presencia de solocalcio para la clasificación del alimentotambién es debe dar la evaluación de la presencia conjunta en el alimento del ácido

ascórbico, componente que participa en elmetabolismo activo del calcio quecontribuirá en su retención7.

En el presente estudio se partió de unamuestra macerada en solución hidro-

alcóholica, alternativamente el tratamientose podría haber presentado por un procedimiento por el método AOAC, paraello se debe partir de una muestra secamolida y homogénea, la cual pasará por untratamiento de mufla a una temperatura100°C y luego llevado a 525°C. Luego deello se pasará la digestión de las cenizasque se hará con HNO3 65% y KCl al 25%6;aquí se pretende eliminar todo materialorgánico presente, quedando solo residuosde los minerales en la muestra, así seeliminaría casi en su totalidad losinterferentes que hubiesen necesitado una preparación más trabajosa del placebo.Asimismo, se tiene entendido que el mediohidro-alcólico en un estudio porespectroscopia de absorción atómica no esóptimo por no decir que no es dable9; sinembargo, si la muestra fue llevada a análisisen esas condiciones se concluye que eltratamiento posterior a la muestra enmaceración logró darle las condicionesadecuadas para dicha lectura.

CONCLUSIÓN Es importante la determinación y

cuantificación del Calcio en especiesvegetales que posiblemente tengan uncontenido óptimo de calcio para así poder aprovechar las ventajas de estemineral al consumir plantas como la

Berberis Flexuosa conocida comoAyrampo.

Se determinó y cuantifico el calcio porespectroscopia de absorción atómica enla muestra de Berberis Flexuosa quetiene un valor de 3,25 mg Ca/100Ml deextracto etanólico.

Al determinar la existencia de calcioen la Berberis Flexuosa es posibleaprovechar estos datos para así poder

PRUEBA ESPECIFICACIÓN MÉTODO RESULTADO

CUANTIFICACIÓN:CALCIO

-ABSORCIÓNATÓMICA

3,25 mgCa/100ml de

extractoetanólico deAyrampo


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7

generar un mayor consumo de esta planta.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Frederic Walton H. Reyes J. Análisis

químico e instrumentalmoderno.Barcelona:Reverte; 2005. Pág98

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6. Gómez H. D. Validación de lametodología por el método estándar3111ª – absorción atómica para elanálisis de metales pesados en muestrasde aguas y aguas residuales. Universidadtecnológica de Pereira. Facultad deTecnologías Escuela de TecnologíaQuímica. 2011. Pág.59

7. Fernández A, Sosa P, Setton D. Calcio ynutrición. Buenos Aires: SociedadArgentina de Pediatría; 2011 Julio

(actualizado Jul 2011) Disponible en:http://www.sap.org.ar/docs/calcio.pdf

8. Standard Tables of Food Composition inJapan Fifth Revised Edition. (2001).

Journal for the Integrated Study of Dietary Habits , 12(2), Pág.86-89.

9. Anon, 2015. (Sitio Web). (Citado el: 23de noviembre del 2015). Disponible en:http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8252/4/T7Abasorc.pdf


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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, DECANA DE AM ÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BÁSICA Y APLICADA

ANALISIS ESPECTRAL UV PAR AAN TOC IANI NAS USANDO

REACTIVOS DE DE SPLAZ AMIENTO Alumn os:

Sand r a Ivonn e Ir kñamp a Ga llar do Pedro Aleja nd r o Mesías Sán chez

Deidy Ramírez Ga r ibay

Gr up o: Miércoles 2 a 6 pm

P rof es or:

Norma Carlos Ca sas

2015


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OBJETIVOS

Determinar los diferentes desplazamientos de bandas a través delos diferentes solventes utilizados.

Corroborar los diferentes desplazamientos batocrómicos ehipsocromicos brindada por la bibliografía utilizada.


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Introdu cció n

Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de losflavonoides. Se encuentran en la naturaleza, en algunos frutos que vandel color rojo al azul como los arándanos, las cerezas, las ciruelas olas uvas.

Estos compuestos actúan, por ejemplo, en el organismo humanocomo protectores de los capilares de la retina, desempeñando un papel

fundamental en la buena conservación de la vista. Además parecentener entre otras, propiedades antivirales y hemostáticas, por lo quepueden desempeñar un papel positivo frente a infecciones así comodetener sangramientos en el ser humano. Protegen al corazón deenfermedades cardiovasculares y tienen como el resto de losflavonoides, un valor antioxidante (1).

Su fórmula básica está conformada por dos anillos aromáticos unidospor una estructura de tres carbonos. En su forma natural, estaestructura se encuentra esterificada a uno o varios azúcares, en cuyocaso se denominan antocianinas simples. Si además del azúcar enla molécula existe un radical acilo, entonces son antocianinas aciladas(2).

El presente trabajo es una reseña bibliográfica sobre las característicasespectroscópicas de las antocianinas en la zona visible del espectrode absorción así como diversos métodos espectroscópicos (UV-Visible); esta técnica es usada para identificar el tipo de flavonoides o elmodelo de oxigenación. Este último puede además ser mejor definidopor el uso de reactivos de desplazamientos los cuales, como su nombrelo indica provocan el desplazamiento de las bandas de absorción. Losespectros de los flavonoides son determinados usualmente en soluciónmetanólica.


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METODOLOGÍA

1. MATERIALES

INSTRUMENTOS

• Fiola de100 ml• Fiola de 25 ml• Pipetas de 5ml y 1 ml• Espectrofotómetro Uv –vis• Celdas de vidrio

• Celdas de cuarzo para Uv - visible• Agua destilada

SOLVENTES

• Cloruro de aluminio• Metanol• HCl 1N• Metoxido de sodio


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PARTE EXPERIMENTAL

1. EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS

Para la extracción de antocianinas del frutode Berberis flexuosa más conocida como“ayrampo” se pesó 100 g para macerarloen etanol 76° se dejó reposar por 2 días,

se redujo el tamaño para maximizar el nivelde extracción, se procedió a filtrar ellicuado, conservando el extracto en frascosambar y cubiertos alejados de la luz, paraque las antocianinas no se desnaturalicenpor la presencia de éstas.

Extracto deBerberis flexuosa

Para obtener una mejor resolución en el espectrofotómetro, sellevó acabo la extracción de alcohol del extracto hidroalcohólico,lo cual primero se utilizó una secadora para poder eliminarmenores proporciones de humedad, luego se llevó el extracto a laestufa a una temperatura de 30 °C durante 24 horas.

Extracto en estufa a 30°CSecadora


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Se obtuvo un extracto con un porcentaje bajo de etanol

Extracto con mínima proporciónde etanol en su composición

2. CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS POR MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Se empleó el espectrofotómetro marca Genesys 100S UV-Vishaciendo uso de celdas de cuarzo, con la ayuda de un SoftwareVisionlite.

Espectrofotómetro marca

Genesys modelo 100S UV-Visible


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Se preparó las siguientes soluciones de reserva:

EXTRACTO CON METANOL: Se midió un volumen 0.1 ml del

extracto seco de flavonoide y se disolvió en 10 ml de metanol,llevará por nombreReserva Matriz .

Metanol

METÓXIDO DE SODIO: El siguiente reactivo utilizado fuemetóxido de sodio, durante su preparación se pesó 0.624 g de Nametálico recién cortado y se disolvió en 25 ml de metanol.

Solución de metóxido de sodio


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TRICLORURO DE ALUMINIO: Se Agregó 5.067 gr de AlCl3

anhidro en 100 ml de metanol.

Tricloruro dealuminio (AlCl3) al

5% en metanol

ÁCIDO CLORHÍDRICO: Se utilizó una solución de 1N de HCl.

HCl 1N


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3. ANÁLISIS ESPECTRAL Se preparan 2 celdas de cuarzo una usada para la muestramatriz antes de su uso se lava con unos pocos ml de lasolución de reserva matriz y para la solución blanco sevierte 10 ml de metanol, el espectro muestra un pico a 535nm con una absorción de 0.755.

Medición de volumen de

flavonoide

Medición de metanol

Un tubo de ensayo A contiene la reserva matriz, a esta sele agrega 3 gotas de la solución de metóxido de sodio, y eltubo de ensayo B es preparada para usarla como blanco, selavó una celda con el contenido del tubo A y se vertió

procurando que no enrace, el contenido del tubo B sedestinó para la celda blanco y se procedió a lacaracterización a 525 nm y con una absorción 0.354.


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Adición de 3 gotas de solución demetóxido de sodio a la reservamatriz.

De la reserva matriz se vierte 6 ml a un tubo de ensayo y seagregan 3 gotas de la solución de tricloruro de aluminio y selava una celda destinada para la muestra, y a la celda para

el blanco se lava con la misma proporción 6 ml de metanoly 3 gotas de tricloruro de aluminio, vertiendo el contenidoprocurando que no enrace, se caracterizó a una longitud deonda 555 nm y a una absorción 0.615A.

Inmediatamente después de haber realizado el métodoespectroscópico, agregar a ambas celdas tanto blancocomo muestra tres gotas de HCl, agitar cuidadosamente ysecar con papel tisú, se caracterizó a 525 nm y a unaabsorción de 0.64A.


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RESULTADOS Como consecuencia de las interacciones soluto– disolvente se originan confrecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otrosfenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En estesentido, no es posible hacer predicciones de forma general. Únicamentemencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos espectrales:desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en undesplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores

(este efecto suele producirse en disolventes de alta constante dieléctrica).Desplazamiento hipsocrómico o desplazamiento hacia el azul, es eldesplazamiento hacia longitudes de onda más cortas.

1. Se aplicó la técnica a la Reserva Matriz solución o.1 ml deflavonoide en 10 ml demetanol , se muestra un pico a 535 nm conuna absorbancia 0.755A. El metanol tiene una constante dieléctricaε =32.7 menos que el agua, es menos polar y el grupo CH3 es más

grande y ocasiona mayor aglomeración que el segundo H del agua.


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2. Se aplicó la técnica ahora con el reactivo metóxido de sodio ,compuesto que resulta al reaccionar metanol con sodio, sucomportamiento es completamente diferente al acetato sódico uncompuesto polar formado por iones sodio e iones acetato, esta sales estable frente al agua, en la que simplemente se disocia en susiones, el metilato sódico o metóxido de sodio es descompuesto porel agua dando metanol e hidróxido de sodio. Muestra un pico a unalongitud de onda 525 nm con una absorbancia 0.354 A. Tiene undesplazamiento hipsocrómico.


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3. Ahora se caracterizaría con el reactivo Tricloruro de aluminio , altricloruro de aluminio (AlCl3) tiene una estructura espacial trigonal,siendo simétrica y por lo tanto apolar. Una molécula covalente serápolar, en el caso de que, teniendo enlaces covalentes polares, noposee una simetría, por lo que no se anularan los momentosdipolares de cada uno de sus enlaces y la molécula global tendráun momento dipolar permanente. Por el contrario, si la moléculaposee simetría, se anularán sus momentos dipolares y será apolar.Se observó un desplazamiento hacia el rojo o desplazamientobatocrómico, que sólo se da en disolventes con alta constantedieléctrica, lo cual difiere con las características del solvente.Muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A.


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4. Una vez realizada la espectrofotometría con el disolvente AlCl3,ahora se le agregarían 3 gotas de HCl tanto a la celda de la muestracomo a la celda blanco, se homogenizó y se llevó a barrido, la bandase desplazó a 535 nm con una absorbancia 0.640 A. Con undesplazamiento hipsocrómico.


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Discusiones:

El método más usual para un análisis preliminar de la estructura de unflavonoide es quizás la absorción UV-Vis, esta técnica es usada tanta paraidentificar el tipo de flavonoide como el modelo de oxigenación. Esteúltimo puede además ser mejor definido por el uso de reactivos dedesplazamiento de los cuales, como su nombre lo indica, provoca eldesplazamiento de las bandas de absorción.

Las antocianinas presentan el máximo de absorción cerca de 500-550nm,

muy similar a los de sus agliconas1

. Esto se comprueba en la parteexperimental ya que al poner el extracto en un metanol se observó un picode 535nm.Notese que esos valores cambian con el solvente, son menoresen agua que en metanol y sufren un corrimiento del máximo de absorcióna mayores longitudes de onda en medio acido 2. En el presenta trabajo sele agrego 3 gotas de HCl concentrado a la solución de AlCl3 observándoseuna longitud de onda de 535nm, el cual presentaba un pico parecidocuando estuvo en etanol el extracto. Por ejemplo la cianidina-3-ramnosidaabsorbe a 507,523,535 y 545 nm en agua ,metanol, etanol y etanol-ácidoclorhídrico, respectivamente .Al aumentar el número de OH conjugadoscon el sistema insaturado el máximo de absorción también se desplaza amayor longitud de onda. Este comportamiento a su vez se observacuando se alcaliniza la solución. El espectro UV de compuestos que nocontienen al menos dos grupos OH en posición orto, así como aquellosque no pueden formar quelatos entre el carbonilo C-4 y un OH libre en C-5o C-3 , no son afectados por la adición de cloruro de aluminio, queprovoca la formación de complejos amarillos estables como los que seidentificaron en la figura 1.Estos complejos producen un corrimiento amayores longitudes de onda de la Banda I de 20 a 45 nm y un pocomenor para la Banda II(10-20nm).


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Figura 1

Los OH libres también causan un desplazamiento batocromico ensoluciones alcalinas y este es mayor en la medida que aumente laconjugación a través del sistema enona, como por ejemplo aquellos queestén en la posición 4’.La ionización de los OH en C-3 y C-4 dan lugar aun corrimiento de la Banda I pero no afecta la Banda II3 .

En el laboratorio se agregó 1,25g de AlCl3 anhidro reactivo a 25 ml deetanol, de esta solución se agregaron 3 gotas a 2-3ml del extracto deAyrampo que estaba en 10 ml de metanol. Se pudo observar un

desplazamiento batocrómico (en el cual la longitud de onda de absorciónde una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda mayores) en estecaso de 555nm.

El metoxido de sodio causa ionización de todos los grupos hidroxilos, ladegradación del espectro con el tiempo es un buen indicador de lapresencia de grupos sensibles a álcalis 4 .Al adicionar dos gotas deNaOMe al extracto de Ayrampo con MeOH, se observó un pico de525nm, viéndose un desplazamiento de 535 nm a 525nm.Al cabo detiempo si se la vio la degradación del espectro lo cual indica la presenciade grupos a álcalis.

El acetato de sodio, causa significativamente ionización de únicamente elgrupo hidroxilo más acido del flavonoide y es usado básicamente paradetectar la presencia de un grupo 7-hidroxilo libre5.En la parteexperimental al agregar este reactivo a nuestro extracto con metanolpudimos observar ruidos los cuales no pertenecen a las antocianinas perose estableció un posible pico el cual fue a 305nm.


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Figura 2


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CONCLUSIONES

1. Las antocianinas presentan el máximo de absorción cerca de 500-550nm, las cuales tuvieron un movimiento batocrómico ohipsocrómico al momento de añadir los reactivos conocidos comotambién como solventes. Los cuales determinaron un desplazamientoa nivel de la banda de absorción. Las cuales varían con el pH delmedio y esto permite la determinación de antocianinas.

2. Nuestro extracto muestra un pico con el metanol a 535 nm con unaabsorbancia 0.755 A ; con el reactivo metóxido de sodio muestra unpico a 525 nm con una absorbancia 0.354 A ; con el tricloruro dealuminio muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A y alagregarle HCl la banda se desplazó a 535 nm con una absorbancia0.640 A.


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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Mabry, T.J.; Markham, K.R.; Thomas, M.B. The ultraviolet spectraof flavones and flavonols. In: The systematic identification offlavonoids; Springer Verlag: New York, USA, 1970. pp. 41-164

Ortega G,Guerra M,Separación ,caracterización estructural ycuantificación de antocianinas mediante métodos quimicos-fisicos.Sep 2006;11(3) :4-6

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Ayrampo Berberis Flexulosa