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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM HIGIENE VETERINÁRIA E PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL
AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BACTERIOLÓCICA DE PEIXES ANCHOVADOS
CECÍLIA RISCADO POMBO
NNIITTEERRÓÓII//RRJJ
22000077
CCEECCÍÍLLIIAA RRIISSCCAADDOO PPOOMMBBOO
AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BACTERIOLÓCICA DE PEIXES ANCHOVADOS
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BBAANNCCAA EEXXAAMMIINNAADDOORRAA
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FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee..
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO, p. 20
2 OBJETIVOS, p. 23 2.1 OBJETIVO GERAL, p. 23
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 23
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, p. 24 3.1 CONSERVAÇÃO DO PESCADO, p. 24
3.1.1 Sal, p. 25
3.2 SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella bralisiensis), p. 28
3.3 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE SARDINHA ANCHOVADA, p. 30
3.3.1 Salga, p. 31 3.3.2 Processo de fermentação, p. 32
3.3.3 Indústria do anchovado, p. 33 3.4 HISTAMINA, p. 33
3.4.1 Mecanismos de formação, p. 35
3.4.2 Atuação da histamina e sintomatologia da intoxicação, p. 37 3.4.3 Padrões nacionais e internacionais, p. 39 3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO, p. 39
3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado, p. 40 3.5.2 Bactérias halófílicas e halotolerantes, p. 41 3.5.3 Bactérias acidoláticas, p. 41 3.5.4 Salmonella spp., p. 42 3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli), p. 43 3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva, p. 44 3.5.7 Enterococcus spp., p. 45
4 MATERIAL E MÉTODOS, p. 47 4.1AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 47
4.1.1 Análises bacteriológicas, p. 48 4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura, p. 49
4.1.1.2 Enumeração de coliformes totais e fecal (Escherichia coli), p. 49
4.1.1.3 Enumeração de Enterococcus sp., p. 51
4.1.1.4 Contagem e Identificação de Staphylococcus coagulase positiva, p. 51
4.1.1.5 Isolamento e identificação de Salmonella sp., p. 52
4.1.2 Análises físico-químicas, p. 54 4.1.2.1 Avaliação de histamina, p. 54
4.1.2.1.1 Método de Cromatografia em Camada Delgada, p. 54
4.1.2.1.2 Método Fluorimétrico, p. 56 4.1.2.2 Análise da produção de Bases Voláteis Totais, p.61
4.1.2.3 Percentual de cloretos, p. 63
4.1.2.4 Atividade de água, p. 65
4.1.2.5 pH, p. 65
4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 65
4.2.1 Processamento usual da empresa, p. 66 4.2.2 Processamento com peixe inteiro, p. 68 4.2.3 Processamento com peixe eviscerado, p. 68 4.2.4 Delineamento experimental, p. 68 4.2.4.1 Matéria-prima, p.69
4.2.4.1.1 Sal, p. 69
4.2.4.1.2 Sardinha fresca, p. 69
4.2.4.2 Produto em fermentação, p. 70
4.2.4.2.1 Análises bacteriológicas, p. 70
4.2.4.2.2 Análises físico-químicas, p. 70
4.2.5 Tratamento estatístico dos resultados, p. 71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO, p. 72 5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 72
5.1.1 Análises bacteriológicas, p. 72 5.1.2 Análises físico-químicas, p. 74 5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 76
5.2.1 Matérias-primas, p. 77 5.2.2 Processamentos tecnológicos A, B e C, p. 77 5.2.2.1 Resultados das análises bacteriológicas, p. 77
5.2.2.2 Resultados das análises físico-químicas, p. 80
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES, p. 87
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 88
8 APÊNDICES, p. 96 8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS, p. 96
8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATÉRIA PRIMA, p. 98
8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAÇÃO, p. 99
9 ANEXOS, p. 100 9.1 FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO, p. 100
9.1.1 Fluxograma do processamento usual da empresa (A), p. 101 9.1.2 Fluxograma do processamento com fermentação do peixe inteiro (B), p. 102 9.1.3 Fluxograma do processamento com fermentação do peixe eviscerado (C), p. 103
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Fig 1 Representação gráfica do Processo de produção do sal, p 27.
Quadro 1 Composição do sal de acordo com as especificações do sal
tipo II da NBR 10888 de dezembro de 1989 (ABNT), p. 27
Quadro 2 Composição química de filés de sardinha (Sardinella
brasiliensis) in natura., p. 29
Fig 2 Figura esquemática da formação de aminas biogênicas a partir
dos respectivos aminoácidos precursores, p. 34
Fig 3 Esquema ilustrativo da detoxificação da histamina e seus
respectivos metabólitos, p. 37
Fig 4 Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no
mercado varejista, p. 48
Fig 5 (A e B) Microtubos tipo “eppendorf” contendo os meios de cultura
Fluorocult ® (A) e Chromocult ® (B), agrupados por amostras,
p. 50
Fig 6 Tubo de ensaio contendo caldo Salmocyst ® suplemento antes
de semeado (A) e após a adição de 10 ml do caldo Salmocyst®
base (B), p. 52
Fig 7 (A, B, C e D) Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach ® a partir
de repique realizado do caldo Salmocyst® suplemento onde,
(A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D)
apresentam crescimento suspeito de Escherichia. spp e
Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de
Proteus spp., p. 53
Fig 8 Placa de sílica (Sigma ®) após revelação com solução de
ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presença de histamina em
todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas, p. 56
Fig 9 Fluorímetro (Sequoia–Turner® Modelo 450) registrando a
leitura de uma das amostras analisadas, p. 57
Fig 10 (A, B e C) Preparação da coluna de filtração, colocando-se primeiro o
papel de filtro (Whaltman nº 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adição de pequena quantidade de lã de vidro
(B) posteriormente adicionando a resina de troca iônica (Dowex
®) previamente convertida a forma alcalina (C), p. 58
Fig 11 Plano cartesiano contendo a “Curva Padrão” da quantificação
de histamina utilizada no método Fluorimétrico, p. 61
Fig 12 (A, B e C) Titulometria de neutralização das bases presentes no
compartimento interno da placa de microdifusão de Conway (A)
onde a adição de solução de ácido clorídrico 0,1 N, com
auxílio de microbureta, vai alterando a cor do conteúdo (B) até
completa viragem do mesmo (C), p. 62
Fig 13 Barricas contendo as sardinhas no período de fermentação do
produto, p. 66
Fig 14 (A, B e C)
Salão com temperatura controlada onde é realizada a
fermentação do produto (A). Destaque para os sensores de
aferição da temperatura (B e C), p. 67
Fig 15 Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura, p. 67
Fig 16
Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores
médios da concentração de histamina dos três lotes de cada
processamento tecnológico trabalhado, p. 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Resultados referentes à contagem de coliformes totais e fecal
(NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella
spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados
provenientes do mercado interno e externo, p. 73
Tabela 2 Resultados obtidos nas análises de Bases Voláteis Totais - BVT
(mg N/100g), histamina (mg / 100g), outras aminas biogênicas,
pH, Atividade de água – Aa e cloretos (%) em peixes anchovados
provenientes do mercado interno e externo, p. 75
Tabela 3 Teor de Bases Voláteis Totais (mg de N/100g) e histamina
(mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e
Fluorimetria (F) em amostras de sardinha (S. brasiliensis)
utilizadas no processamento tecnológico de anchovagem, p. 77
Tabela 4 Resultados das análises bacteriológicas realizadas nas amostras
coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do período de
90 dias de fermentação do produto, p. 78
Tabela 5 Resultados das provas bioquímicas realizadas em colônias
suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird
Parker para o Caldo BHI, p. 80
Tabela 6 Valores médios de N-BVT (mg N/100 g) obtidos nos
processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis)
anchovada através do método de microdifusão em placa de
Conway, por 90 dias, p. 81
Tabela 7 Valores médios de pH obtidos nos processamentos tecnológicos
de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias, p. 82
Tabela 8 Valores médios de Aa obtidos nos processamentos tecnológicos
de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do aparelho
PawKit ®, por 90 dias, p. 83
Tabela 9 Valores médios de cloreto (%) obtidos nos processamentos
tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias,
p. 83
Tabela 10
Ordenação média das concentrações de histamina (ppm) nos
processamentos tecnológicos A, B e C testados e seus
respectivos valores mínimos e máximos, sendo a DMS = 4,58, p.
84
Tabela 11 Concentrações médias de histamina (ppm) dos três lotes de cada
processamento tecnológico estudado, ao longo do período de
fermentação da sardinha (S. brasiliensis), p. 85
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
® marca registrada °Bé grau Baumé °C grau Celsius a. C. antes de Cristo Aa Atividade de água AOAC Association of Official Analitical Chemists ATCC American Type Culture Collection CE Comunidade Européia DAO Diamino Oxidase FAO Food and Agricultura Organization FDA Food and Drug Administration G+ Gram positivo IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente LANARA Laboratório Nacional de Referência Animal M Molaridade MAO Mono Amino Oxidase N Normalidade N-HMT Histamina N-Metiltransferase NMP Número Mais Provável OTMA Óxido de Trimetilamina pH potencial Hidrogeniônico ppm parte por milhão
RDC Resolução da Diretoria Colegiada R.I.I.S.P.O.A. Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos
de Origem Animal RJ Rio de Janeiro rpm rotações por minuto SC Santa Catarina UFC Unidade Formadora de Colônia µg micrograma µL microlitro
RESUMO
A anchovagem do pescado consiste em um processo de fermentação na qual
enzimas tissulares e microbianas agem sobre os hidratos de carbono e proteínas.
Existe uma dificuldade para a normatização do produto pela falta de padrões oficiais
que regulamentem o processamento tecnológico. Assim sendo, o objetivo deste estudo
foi avaliar a qualidade de peixes anchovadas comercializados no mercado interno,
através de parâmetros físico-químicos e bacteriológicos, além de avaliar três
processamentos tecnológicos distintos para compará-los. Foram realizadas a
enumeração de Coliformes e Escherichia coli; de Enterococcus spp., contagem e
identificação de Staphylococcus aureus e isolamento e identificação de Salmonella
spp..Os parâmetros físico-químicos avaliados foram a produção de Bases Voláteis
Totais (BVT), a determinação do pH e a quantificação de cloretos, a presença de
aminas biogênicas foi determinada pelo método de Cromatografia em Camada Delgada
(CCD) e a quantificação de histamina pelo método fluorimétrico (AOAC, 2002). No
produto disponível no mercado varejista, os valores de pH variaram entre 5,08 e 5,73,
de Atividade de água (Aa) entre 0,75 e 0,70. O percentual de cloretos observado foi de
9,78 a 17,50. Bacteriologicamente, as amostras analisadas encontram-se dentro do
padrão oficial, usando como referência a RDC n° 12, em relação à Salmonella spp. e
coliformes termotolerantes. Duas amostras apresentaram maiores valores de
Staphylococcus coagulase positivo. A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista
pela legislação, entretanto os resultados sugerem uma relação entre a presença desta
17
bactéria e a produção de histamina. Ao avaliar os distintos processamentos
tecnológicos, percebeu-se uma diferença significativa (p<0,05) na produção de
histamina entre os lotes acompanhados. Isolou-se Escherichia spp., Klebsiella spp,
Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. e Pseudomonas spp.. No entanto, não
houve isolamento de coliforme termotolerantes e dos gêneros Enterococcus e
Salmonella. O percentual de cloreto variou entre 15,65 e 18,87 % não havendo
diferença significativa entre os processamentos testados (p>0,05). As variáveis Aa e pH
apresentaram diferenças significativas entre os processamentos (p<0,05) e obtiveram
valores entre 0,71 e 0,75, e 5,54 e 5,93, respectivamente. Os valores de BVT variaram
entre 15,1 e 62,1 mgN/100g, apresentando diferenças significativas entre os
processamentos (p<0,05). Concluiu-se que há produção de histamina em
concentrações preocupantes para a saúde coletiva. Nas condições deste estudo, o
processamento tecnológico usual da empresa, mostrou ser o mais adequado para o
processamento do produto pelos parâmetros fisico-químicos analisados apesar de
haver produção de histamina em níveis que poderão, em alguns casos, produzir
sintomatologia de intoxicação em consumidores. No entanto, mais estudos com relação
aos pontos críticos de controle são necessários.
Palavras chaves: Anchovado; Aminas biogênicas; histamina, qualidade, padrões
bacteriológicos.
ABSTRACT
The process to obtain fish anchovies consist on the fermentation of the product in
which microbiological and tissue enzimes act over proteins. There is a difficulty to
standarlizate the product because of the nonexistence of official padrons to
regulamentate the technological process. The aim of this study was avaliate the quality
of fish anchovies comercialized through phisycal-chemical and bacteriological
parameters and compare three differents technological process. The bacteriological
analisys made were: colifornms, Enterococcus spp. and Escherichia coli enumerations,
count and identification of Staphylococcus aureus and isolation ando identification of
Salmonella spp.. The physical-chemical paremeter avaliated were: production of Total
Volatile Base (N-TVB), determination of pH and salt (NaCl) quantification (%). The
presence of biogenic amines were determinated by Thin Layer Cromatography (TLC)
and the quantification of histamine was made by the fluorimetric method. In the
comercialized products the values of pH were between 5,08 and 5,73 and the values of
Activity of water (Aw) were between 0,70 and 0,75. The salt concentration (%) observed
was beteween 9,78 and 17,50 %. Bacteriological results were saticfactory, using as
reference the RDC nº12 legislation (BRASIL, 2001) to avaliatethe presence of
Salmonella spp., E. coli and coliforms. Two samples had counts of S. aureus above the
value stablished by that lagislation. The enumeration of Enterococcus spp. isn´t preview
by RDC nº 12 and the results obtained suggests a relation between the presence of this
bacteria and the formation of histamine. When the different thecnological process were
19
avaliated was stablished a significant difference in the formation of histamine (p<0,05).
Eschericia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. and
Pseudomonas spp. were isolated., but there was no isolation of Salmonella spp. and
Enterococcus spp. The salt percentual values vary between 15,65 and 18,87 % and no
significant difference was stablished (p> 0,05). Aw and pH data have shown significant
differences between the three processes (p<0,05) and obtain values between 0,71 and
0,75, and 5,54 and 5,93 respectively. The values of N- TVB vary between 15,1 and 62,1
mgN/100g. In conclusion, the formation of histamine in this product occours in concern
concentrations for public health. The usual process used by the industry present better
resoults acording to the physical-chemical analises even though had histamine
formation that might produce sintimatology of intoxication on consumer. However, more
studies are necessary.
Keywords: Anchovy, biogenic amines, histamine, quality, bacteriological standards
1 INTRODUÇÃO
Desde épocas muito remotas o homem busca formas de conservar seu alimento.
Com a fumaça produzida pelo fogo, aprendeu a defumar e, com o sol e o ar, aprendeu
a secar sua comida. Também aprendeu a salgar e secar carnes e pescados (acredita-
se que a primeira salga foi realizada enterrando-se o alimento na praia, onde a água do
mar realizava a cura).
Alguns registros mostram que os fenícios, os egípcios e os gregos secavam,
defumavam e salgavam seus peixes para transportá-los na região, que é bastante
quente. Os romanos também consumiam carnes salgadas e caças provenientes de
distantes regiões, conservadas no mel.
Também na civilização oriental, 3000 anos antes de Cristo (a.C.) os chineses já
utilizavam o sal para conservar os peixes acumulados em épocas de fartura e, 1000
anos depois, já haviam desenvolvido tecnologia para a conservação de peixes
utilizando gelo.
Na salga, o produto final pode ser o pescado inteiro, em forma de pasta ou em
forma de molhos. Dentro destas três categorias estão englobados produtos comerciais
característicos de cada região de origem. Quando o produto final mantém a forma
original do pescado o processo é denominado anchovagem.
A anchovagem do pescado consiste, fundamentalmente, num processo de cura
prolongada, no qual as enzimas tissulares e microbianas compartilham suas ações
sobre os diversos subcomponentes. A ação de algumas enzimas autolíticas e de
microrganismos capazes de produzir substâncias bloqueadoras de decomposição atua
sobre os hidratos de carbono e proteínas, conferindo aos alimentos aspecto e aroma
especiais.
21
Os peixes fermentados podem ser considerados uma semiconserva pelo fato de
não sofrerem nenhum tratamento térmico ao longo do processamento tecnológico e
antes de serem consumidos.
Na região sudeste da Ásia (Vietnã, Camboja, Tailândia e Indonésia) os produtos
mais populares são os “bagoongs” (pastas), o “nuoc-man” (molho), o “prahoc”, o “trassi”
(pasta de camarão da Indonésia), o “man-pla” e o “budu”. Alguns destes produtos são
consumidos em larga escala sendo, praticamente, a única fonte de proteína de boa
qualidade, obtidos com tecnologia de baixo investimento.
Na França, Alemanha e países escandinavos, são comercializados produtos com
“flavour” desenvolvido em fermentação por período longo e comercializado em
embalagens pequenas e de alto custo.
Os anchovados autênticos são feitos a partir de engraulídios (Engraulis
encrasicholus, Engraulis ringens, Engraulis mordax). Porém, a sardinha (Sardinella
brasiliensis) pode ser utilizada como matéria prima, pois possui os componentes
biológicos necessários para o desenvolvimento do aroma, do sabor, da cor e da textura
próprios dos anchovados.
A matéria prima desta tecnologia pode ser veiculadora de uma grande variedade
de microrganismos patogênicos, a maior parte deles em função da contaminação
ambiental. Outra fonte de contaminação importante é o manejo do pescado, desde o
momento da captura, ainda nos barcos pesqueiros, até sua destinação final, após
passar por inúmeras fases de processamento e transporte.
Na indústria do pescado, além de microrganismos patogênicos, é importante
lembrar que a produção de histamina é um importante ponto que deve ser avaliado,
pelo fato de ser termoestável e ter sua ação potencializada pela presença de outras
aminas biogênicas. A histamina é produzida pela descarboxilação da histidina e está
envolvida como mediadora primária de reações alérgicas, sendo tóxica em alta
concentração. Peixes da família Scombridae, como a cavala, cavalinha e os atuns, e
também da família Clupeidae, como a sardinha, são freqüentemente envolvidos em
surtos de intoxicação histamínica. O controle do alto nível de histamina presente nestas
espécies deve ser monitorizado a fim de prevenir intoxicações no consumidor.
22
Observando todos os fatores acima expostos e devido a pressões do mercado
para a produção de alimentos mais seguros e de baixo custo, as empresas da área de
alimentos, assim como as de outras áreas, têm reconhecido às limitações dos
programas tradicionais de controle de qualidade e estão implementando novos
sistemas de gerenciamento que permitam produzir alimentos efetivamente seguros e
simultaneamente de melhor qualidade e com menor custo.
No Brasil, o pescado fermentado ainda não se tornou um hábito de consumo
significativo e, pela falta de padrões oficiais que regulamente seu processamento
tecnológico, existe uma dificuldade para a classificação ou normatização do produto.
A legislação em que algumas das indústrias nacionais se baseiam para a
elaboração de sardinhas anchovadas é o Regulamento C.E. n° 2073/2005 de 15 de
novembro de 2005, relativo a critérios microbiológicos aplicáveis aos gêneros
alimentícios.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL:
Avaliar a qualidade de peixes anchovados comercializados no mercado interno,
de origem nacional e internacional, além de avaliar o processamento tecnológico da
anchovagem.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Avaliar a produção de Bases Voláteis Totais, pH, Atividade de água, produção
de aminas biogênicas (histamina, putrescina e cadaverina) e teor de cloreto de sódio.
- Avaliar a presença de Coliformes fecais e totais, Staphylococcus coagulase
positiva, Salmonella spp. e Enterococcus spp.
- Comparar três processamentos tecnológicos: o utilizado pela indústria e outras
duas variações.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 CONSERVAÇÃO DO PESCADO
A conservação tem por objetivo preservar os alimentos ao longo do tempo,
evitando a deterioração para uso futuro. É importante ressaltar que o alimento a ser
conservado precisa chegar à esta etapa com boa qualidade, uma vez que o processo
de conservação não reverte o quadro de deterioração, apenas o retarda (CAMARGO,
2007).
A conservação de alimentos surgiu com a civilização. Entretanto, todos os
processos utilizados até o final do século XVIII foram desenvolvidos de forma
totalmente empírica, sem nenhum conhecimento ou embasamento teórico e,
normalmente, utilizando ou simulando processos existentes na natureza (secagem,
defumação, congelamento), Nessa época, já se sabia que as frutas e algumas
hortaliças podiam ser conservadas em açúcar e certas hortaliças toleravam o vinagre.
Porém, todos esses procedimentos conservavam os alimentos por pouco tempo e com
escassas garantias (BRANDÃO, 2007).
Os índios brasileiros, muito antes do descobrimento, costumavam assar as
carnes, secar os peixes e depois armazená-los em caldo grosso de pimenta. A
conservação por imersão na gordura também era utilizada pelos nossos índios que
deixavam os animais imersos em sua própria gordura. Os Bandeirantes salgavam as
caças para poder transportá-las durante suas expedições (GOURMAND, 2007).
A deterioração do pescado é um fenômeno decorrente da atividade metabólica
de microrganismos e de processos bioquímicos indesejáveis. Por estas razões, para a
preservação, são utilizados processos físicos de controle, como desidratação,
25
armazenamento a baixas temperaturas (refrigeração, congelamento) e processos
térmicos (pasteurização e esterilização) (OGAWA; MAIA, 1999).
Uma das formas de conservação do pescado é a elaboração de semiconservas
que, segundo Huss (1997), são produtos caracterizados por possuírem teor de sal
maior que 6% de NaCl (p/p) na fase aquosa ou pH menor que 5,0.
O Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
– R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a), não possui nenhuma definição e/ou conceituação
referentes as semiconservas.
O artigo 425 do Decreto n° 38.757, do Governo do Estado do Rio de Janeiro,
alínea I, define o “pescado anchovado” como a semiconserva de pescado obtida a partir
da cura prolongada do pescado pelo sal (cloreto de sódio), com ou sem aditivos,
substâncias aromáticas e vegetais, envasada em óleos comestíveis (GOVERNO DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2006).
3.1.1 Sal
É difícil localizar o início do consumo e da utilização do sal pelo Homem. Os
primeiros testemunhos da sua utilização datam de 2000 anos a.C., sendo transportado
como mercadoria pelos fenícios, empregue na salga do peixe consumido pelos
troianos, usado na mumificação dos corpos no Egito e exigido pelo imperador chinês Yu
como tributo aos seus súditos (REIS; CHAVES, 2007).
No entanto, é bastante provável que o início da extração deste produto, pela
criação de perímetros fechados para retenção da água do mar, remonte a períodos pré-
históricos, pois o sal aparece relacionado com todas as manifestações da vida humana.
Foi a causa da riqueza de muitas civilizações a ponto de ter assumido, por vezes,
características monetárias (ibid).
O sal é conhecido, tecnicamente, como cloreto de sódio e sua fórmula química é
o NaCl. Embora a maioria das pessoas esteja familiarizada com os vários usos do sal
na culinária, há o desconhecimento de suas outras aplicações, como a manufatura de
papel e a produção de sabão e detergentes. No norte dos Estados Unidos da América e
na Europa, grandes quantidades de sal são utilizadas para limpar as rodovias do gelo
durante o inverno (WIKIPEDIA, 2007).
26
Outra aplicação importante do sal é feita na conservação de alimentos desde a
antiguidade, quando foi utilizada pela primeira vez na preservação da carne, baseando-
se no fato do sal exercer o efeito de desidratação, tanto no alimento, como nos
microrganismos (JAY, 2005).
Pensando na conservação do pescado, observou-se que a composição química
do sal, o grau de pureza e a constituição microbiológica são elementos fundamentais
para a obtenção de um produto de alta qualidade (CARMO, 1991).
O sal de alta pureza é o que tem teor de cloreto de sódio (NaCl) superior a
96,5%, com menos de 3% de sais insolúveis, tendo como impurezas o cloreto de cálcio
(CaCl2) e o cloreto de magnésio (MgCl2) no sal proveniente de salinas (OETTERER,
2005).
A granulação do sal também é um fator de grande importância. Se esta for muito
fina poderá penetrar excessivamente na parte superficial da carne, havendo, como
conseqüência, rápida perda de água nos tecidos superficiais. Se for muito grossa, pode
deixar escoriações na superfície do pescado (BEIRÃO, 1976; OETTERER, 2005). Esse
ingrediente possui quatro denominações conhecidas que o classifica, quanto a suas
características granulométricas em: sal grosso, sal peneirado, sal triturado e sal
refinado (PARDI, 2001).
O processo de produção do sal inicia em um braço de mar, onde a água salgada
é captada e levada para o primeiro evaporador. Deste evaporador esta é transferida
para os demais evaporadores por gravidade, onde a evaporação natural provocada
pelo sol e vento aumenta gradativamente a concentração dos sais presentes na água,
até o ponto em que a salmoura está quase saturada de cloreto de sódio. Após essa
fase, a água é transferida para os cristalizadores, onde, após a precipitação do sal, a
água é drenada e o sal entra no processo de colheita (SALINA DIAMANTE BRANCO,
2007).
Este sal cristalizado colhido é submetido a uma lavagem com salmoura saturada
para a retirada de impurezas. Após a lavagem o sal é transferido para o pátio de
estoque. A partir da secagem, o sal está pronto para o embarque, como mostra a Figura
1 (SALINA DIAMANTE BRANCO, 2007).
27
Fonte: http://www.salbrasil.com.br/produtos.php
Figura 1 – Representação gráfica do Processo de produção do sal
No quadro 1 pode-se observar a composição do sal, de acordo com as
especificações do sal tipo II da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (Cloreto de Sódio -
Sal para Alimentação Humana) (ibid).
Quadro 1 – Composição do sal de acordo com as especificações do sal tipo II
da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (ABNT).
Parâmetro Unidade Mínimo Máximo Cloreto de Sódio (Base Seca) % NaCl 99,00 - Insolúveis em H2O % m/m - 0,1 Umidade (*) % H2O - 2,5 Cálcio % Ca - 0,1 Magnésio % Mg - 0,03 Sulfato % SO4 - 0,28
Fonte: http://www.salbrasil.com.br/prod-grossoensacado-int.htm
Para que a utilização do sal seja eficiente como matéria prima, as bactérias
putrefativas não devem estar presentes. No entanto, a presença de bactérias halófilas
produtoras de ácido lático podem ser favoráveis à produção (OETTERER; PERUJO,
2003). Oetterer (2005) ainda afirma que as bactérias halofílicas aeróbicas são
contaminantes naturais do sal, sendo a temperatura ótima de crescimento entre 40 °C e
50 °C e de inibição abaixo de 7 °C.
O sal é portador de uma microbiota contaminante, halófila ou haloresistente
considerável, salientando-se entre estes microrganismos as sarcinas, bactérias halófilas
28
cromogênicas causadoras da coloração vermelha indesejável em produtos protéicos
salgados. Nem todos os microrganismos halófilos são prejudiciais aos produtos
salgados, verificando-se entre estes a ocorrência de algumas espécies que contribuem
para a fermentação desses produtos. Entre as espécies de interesse da indústria da
salga, citam-se algumas pertencentes aos gêneros Halobacterium e Micrococus. As
primeiras são halófilos obrigatórios, crescendo em meios com 16 a 32% de cloreto de
sódio, enquanto as Micrococáceas crescem em meios contendo 5 a 15% deste sal
(PINTO, 2007).
3.2. SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella brasiliensis)
A sardinha verdadeira pertence à família Clupeidae e faz parte de um conjunto
de espécies pelágicas (do latim pelagos, que significa o "mar aberto"). São peixes que
vivem em cardumes, nadando livremente na coluna de água, estando adaptados tanto
à água fria como à água quente. São pequenos e podem medir entre 11 e 20 cm de
cumprimento (SIKORSKI, 1990).
A sardinha verdadeira (Sardinella brasiliensis) é o mais tradicional recurso
pesqueiro da região sudeste-sul do Brasil. É uma espécie de ocorrência costeira e de
fácil captura, sendo pescada entre o Cabo de São Tomé (22ºS) /RJ e o Cabo de Santa
Marta Grande (28ºS) /SC, entre 10 e 100 m de profundidade. A espécie exibe grande
sensibilidade às variações ambientais, sendo que esta situação se agrava quando
associada ao intensivo esforço de pesca, o que pode acarretar numa grande redução
do estoque (IBAMA, 2007a).
A sardinha foi capturada acima dos níveis aceitáveis de sustentabilidade do
recurso, sendo sobreexplotada, gerando intensa exploração comercial o que levou a
redução da biomassa (número de peixes) e, conseqüentemente, comprometendo o
potencial de desova. Os estoques pesqueiros de sardinha sofreram queda substancial
e, para recuperar esta biomassa, em julho de 2004, foi implementado o “defeso de
recrutamento” objetivando aumentar a população reprodutiva ou biomassa desovante
(ibid).
29
Para o ano de 2007 foram definidos três períodos de defeso: de 17 de novembro
de 2006 a 24 de fevereiro de 2007, 21 de junho a 09 de agosto de 2007 e 17 de
novembro de 2007 a 24 de fevereiro de 2008 (IBAMA, 2007b).
Existem fatores que interferem na composição química das espécies. Entre estes
fatores, citam-se a idade, estação do ano, sexo, desenvolvimento gonadal e
alimentação, os quais interferem nos teores de água, lipídeos, proteína e minerais.
Assim sendo, o pescado pode ser classificado por grupos, de acordo com a variação
destes componentes (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
A principal classificação utilizada, visto que o teor de gordura influi de forma
decisiva na reprodução, na vida útil do produto e na aceitação geral pelos
consumidores, é: gordo (mínimo de 10%), semi-gordo (entre 2,5 e 10%) e magro
(máximo 2,5 %) (JACQUOT1, 1961 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
No quadro 2, é possível observar a composição centesimal de filés de sardinha,
de acordo como trabalho realizado por Santo et al. (2003), quando avaliou a atividade
bacteriogênica do Lactobacillus sakei na fermentação da sardinha brasileira (Sardinella
brasiliensis).
Quadro 2 – Composição química de filés de sardinha (Sardinella brasiliensis) in natura.
COMPOSIÇÃO CENTESIMAL (g/100g)
A B C X Dp (+/-)
Umidade 72,9 73,5 13,7 73,4 0,39
Lipídios 2,0 3,0 4,2 3,1 0,89
Proteínas 19,7 19,6 17,7 19,0 0,88
Cinzas 2,0 1,9 1,9 1,9 0,01 Fonte: SANTO et al., 2003. A, B, C = Lotes; X = médias; Dp = Desvio padrão.
A estação do ano exerce grande influência na composição centesimal dos peixes
pelágicos, pois estes têm seu teor de gordura aumentado ou diminuído, de acordo com
a disponibilidade sazonal de alimentos. A fertilidade do mar ocorre nas áreas de
1 JACQUOT, R. Organic constituents of fish and other aquatic foods. In: Fish and Food. V. 1. Ed. G. Borgsrom, Academy Press, New York, USA. p. 146-192, 1961
30
ressurgência e quando a luz diurna é maior. Portanto, na região subtropical há maior
abundância de peixes pelágicos na primavera e verão (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
O músculo esquelético do pescado é rico em proteínas e lipídios. As proteínas
são de alto valor nutritivo com um balanceamento de aminoácidos essenciais
comparáveis à proteína padrão da FAO (Food and Agricultura Organization). Os
lipídios, além de fonte energética, são ricos em ácidos graxos polinsaturados da série
ômega 3, especialmente o EPA (ácido eicosapentaenóico) e o DHA (ácido
docosacahexaenóico), que apresentam efeitos redutores sobre os teores de
triglicerídeos e colesterol sanguíneo (OGAWA; MAIA, 1999).
Em relação aos aminoácidos presentes na musculatura do pescado, a histidina
tem destaque em função da media concentração deste aminoácido livre na musculatura
e, em função da sua descarboxilação que gera a histamina, amina biogênica agente de
intoxicação alimentar. As espécies pelágicas, de carne escura e sabor intenso, como é
o caso da sardinha, e possuem valores médios de histidina livre na musculatura que
variam entre 100 – 500 mg% (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
3.3 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE SARDINHA ANCHOVADA
A matéria prima para os anchovados autênticos são os engraulidios, no entanto,
também podem ser elaborados peixes anchovados a partir de sardinhas (Sardinella
brasiliensis, Sardinella aurita), manjubas (Anchoviella sp.), lambaris (Astyanax
fasciatus), cavalas (Scombrer japonicus), peixes-agulha (Belone belone), entre outros.
Para tanto, são feitas adaptações na tecnologia de processamento (BEIRÃO, 1976;
OETTERER, 2005).
O princípio desta tecnologia consiste em um processo misto onde há um
aumento da pressão osmótica do meio fazendo uso de sal e mantendo o sistema em
anaerobiose. Conseqüentemente, ocorre diminuição da atividade de água, controlando
o crescimento microbiano e selecionando o tipo de organismo que exercerá a
fermentação do produto. A anaerobiose freia os processos bioquímicos fermentativos
que deterioram o pescado (OETTERER, 2005).
31
Segundo Sikorski (1990), o cloreto de sódio é um dos componentes mais
importantes, tanto para a determinação do sabor como para os processos químicos da
fermentação ocorrer adequadamente.
No item 4.2.1 do presente trabalho está descrito o fluxograma de anchovamento
da sardinha sendo quatro os Pontos Críticos de Controle (PCC) podendo ser
observados no Anexo 9.1.1.
O primeiro é na recepção do pescado, onde são observadas a presença de
sardinhas deterioradas e a temperatura da matéria-prima, a qual deve estar menor a
4,4 °C (FDA, 2007a). O segundo PCC é no período da fermentação onde se faz o
controle da concentração de sal. Dentro deste PCC, estão inclusos o não re-
aproveitamento das salmouras e a higienização adequada das barricas. O terceiro PCC
é no momento da prensagem, onde se tem o cuidado de retirar o excesso da salmoura,
adequadamente, através do controle da pressão e do tempo. O último PCC é na fase
de embalagem do produto. Neste ponto, é feita a aferição das balanças para que não
ocorra erro na pesagem do produto. O aparelho de vácuo é aferido para que não
ocorram problemas com a vedação das embalagens. E as embalagens prontas são
inspecionadas para averiguar se a vedação esta adequada e/ou existem problemas na
embalagem.
3.3.1 Salga
A salga de pescados é um dos mais antigos meios de conservação de alimentos.
Seu princípio está baseado no emprego do sal que, em concentração adequada,
diminui ou até mesmo impede a decomposição do alimento, quer seja pela autólise,
quer seja pela ação de microorganismos (SETOR 1, 2007).
Na salga a ação do sal é dupla, desidrata o pescado por diferença de pressão
osmótica entre o meio externo e interno, e penetra na carne, baixando a atividade de
água. O tempo em que os pescados são mantidos em contato com o sal ou salmoura é
conhecido como tempo de salga ou de cura. Muitas vezes o processo de salga é
somente uma operação preliminar dos processos de defumação, secagem ou
marinagem, visando nesses casos conferir certo sabor ao produto final (ibid).
32
3.3.2 Processo de fermentação
A fermentação do pescado se inicia através da ação de bactérias, inclusive as
intestinais. Alterações enzimáticas e químicas (como a oxidação das gorduras)
ocorrem mesmo em temperatura de refrigeração. Após utilizarem os compostos
solúveis como a histidina livre, a uréia e o óxido de trimetilamina, as bactérias
degradam as proteínas (OETTERER, 1999). A hidrólise da proteína também é induzida
por enzimas proteolíticas tissulares do peixe, além das enzimas proteolíticas produzidas
por bactérias halofílicas (DISSARAPHONG et al., 2007).
Na fermentação ocorre a conversão das proteínas insolúveis do pescado em
formas solúveis. Neste processo, ocorre a degradação gradual da actomiosina em
peptídeos e aminoácidos, que são solúveis em baixa concentração iônica. Esses
compostos nitrogenados solúveis constituem uma fração precipitada por ácido
tricloracético e uma fração não coagulável. As proteínas degradadas da carne do
pescado se difundem na salmoura, onde ocorre o aumento de nitrogênio amínico e de
nitrogênio não protéico no pescado, enquanto frações de nitrogênio protéico passam
para a salmoura. Ao final do processo de fermentação, estão presentes, entre outros,
os aminoácidos histidina, alanina, leucina, fenilanina, prolina, e ácido glutâmico
(OETTERER, 2005).
Bioquimicamente, a fermentação é o processo metabólico no qual carboidratos e
compostos relacionados são parcialmente oxidados, resultando na liberação de
energia, sem aceptores de elétrons externos. Os aceptores finais de elétrons, no
produto fermentado, são compostos orgânicos produzidos da quebra de carboidratos.
Conseqüentemente, ocorre a oxidação incompleta do composto original, resultando na
liberação de pequena quantidade de energia ao longo do processo (JAY, 2005).
O “flavour” característico do produto é obtido de uma mistura basicamente
constituída de aminas, ácidos orgânicos e aminoácidos. As aminas aparecem no
produto final, pois alguns microrganismos possuem a capacidade de descarboxilar os
aminoácidos. A amônia está presente durante todo o processo, com pequena variação
e, juntamente com a trimetilamina, constitui o nitrogênio volátil total. Além do mais, a
relação entre a concentração de aminas e de aminoácidos é usada como um indicador
33
de qualidade em fermentados líquidos. Uma alta taxa de nitrogênio volátil total indica
deterioração de origem bacteriana e um produto de má qualidade nutricional e
sensorial. O aroma amoniacal excessivo não é desejável e, a presença de
componentes sulfurados como as metilmercaptanas ou o ácido sulfídrico, se presentes,
mesmo em pequenas quantidades, promovem um aroma característico do pescado
fermentado (OETTERER, 2005).
3.3.3 Indústria do anchovado
No Brasil, a produção de anchovados, utilizando como matéria-prima a sardinha
(Sardinella brasiliensis), ocorre em escala industrial pequena. É um produto semelhante
ao produzido em Portugal. O tempo de produção é longo devido a fermentação e a cura
necessárias para o produto atingir as características sensoriais desejáveis
(OETTERER; PERUJO, 2003).
Geralmente o consumo é restrito, pois é um produto vendido como
”delicatessen”, sendo pouco conhecido pela população, a não ser os descendentes de
europeus e orientais que ainda mantém hábitos dos países de origem. O produto em
questão é mais conhecido como “aliche”, utilizados na elaboração de pizzas e produtos
correlatos (ibid).
3.4 HISTAMINA
A histamina é uma amina biogênica formada pela descarboxilação da histidina,
aminoácido essencial para animais em crescimento, que está presente em
concentrações medianas a altas em peixes pelágicos (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
As aminas biogênicas se formam, nos alimentos, pela descarboxilação
microbiana de seus aminoácidos precursores ou se formam, nos seres vivos, como
conseqüência dos processos metabólicos celulares normais (SANCHES – CASCADO,
2005). São compostos orgânicos nitrogenados de caráter básico presentes em animais,
plantas e microrganismos (BRINK2, 1990 apud SANCHES – CASCADO, 2005).
2 BRINK, B.; DAMIRIK, C.; JOOSTEN, H. M. L. J.; HUIS IN’T VELD, J. H. J. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology. v.11. p.73-84, 1990.
34
Marinét-Font et al. (1995) classificaram as aminas biogênicas mais freqüentes
nos alimentos, de acordo com a estrutura química, como: aminas aromáticas
(histamina, β-feniletilamina, tiramina, octopamina, dopamina, serotonina e triptamina),
diaminas alifáticas (putrescina e cadaverina) e poliaminas alifáticas (agmatina,
espermina e espermidina).
Na caracterização física feita por Contreras–Guzman (1994), a histamina possui
peso molecular 111,2, a tiramina 137,18, a triptamina 160,2, a putrescina 88,15, a
cadaverina 102,18, a agmatina 130,2, a espermina 202,35 e a espermidina 145,25.
Na Figura 2, observa-se o esquema simplificado das rotas biossíntéticas,
permitindo verificar os aminoácidos precursores das diferentes aminas biogênicas.
A histamina é um componente natural e fisiológico dos mamíferos, estando
presente nos mastócitos e basófilos. Seus efeitos biológicos são observados quando é
liberada em grande concentração no organismo em conseqüência, principalmente, de
reações alérgicas (LEHANE; OLLEY, 2000; SHALABY, 1996).
Fonte: Sanches – Cascado, 2005. Figura 2 – Figura esquemática da formação de aminas biogênicas
a partir dos respectivos aminoácidos precursores.
Normalmente, a histamina está presente no corpo humano em baixos níveis de
concentração e também é encontrada em alimentos como peixes, queijos, carnes,
vinhos e produtos fermentados (ROSSANO et al., 2006).
Existe grande preocupação com a presença da histamina nos alimentos devido
as suas implicações toxicológicas para a saúde humana quando ingeridas em
35
quantidades que possam causar reações adversas. Estas quantidades variam de
acordo com a sensibilidade de cada indivíduo bem como a presença de outras aminas
biogênicas que podem potencializar a ação intoxicante da histamina (LEHANE; OLLEY,
2000). Uma característica importante a ser destacada em relação a histamina é a sua
capacidade de ser termoestável (HUSS, 1997).
3.4.1 Mecanismos de formação
Aminoácidos livres no músculo e produzidos pela decomposição de proteínas
podem sofrer descarboxilação e desaminação por ação de enzimas bacterianas. A
histidina descarboxilase age sobre o aminoácido histidina transformando-a em
histamina (HUSS, 1997; OGAWA; MAIA, 1999; LEHANE; OLLEY, 2000).
As principais bactérias responsáveis pela formação de histamina pertencem à
família Enterobacteriaceae (HALÁSZ et al., 1994; LEHANE; OLLEY, 2000). No entanto,
outras bactérias também produzem enzimas descarboxilases, podendo ser citadas
algumas bactérias ácido láticas (SUZZI; GARDINI, 2003) como o Enterococcus spp.
(GARDINI et al., 2001; GIRAFFA, 2002) e o Tetragenococcus muriaticus (KUDA et al.,
2006; SATOMI et al., 1997). A histidina descarboxilase está amplamente distribuída nos
gêneros Escherichia, Salmonella, Clostridium, Bacillus e Lactobacillus (HALÁSZ et al.,
1994).
Segundo Níven et al. (1981), a responsabilidade das bactérias que contem a
histidina descarboxilase pode ser difícil de detectar, pois estas fazem parte da minoria
das microbiota do pescado fresco, além de serem facilmente destruídas subseqüentes
ao congelamento.
Contudo, existem alguns fatores que interferem na formação de histamina e de
outras aminas biogênicas como, a disponibilidade de substrato, o pH, a Atividade de
água, a concentração de sal e a temperatura considerados fatores limitantes (BOVER-
CID et al., 2001; GÖKUĜLU, 2003).
O de pH é um fator importante, pois interfere na descarboxilação dos
aminoácidos, que ocorre em maior concentração em meio ácido. O valor ótimo de pH
está entre 4,0 e 5,5, pois nesta faixa a bactéria é estimulada a produzir mais
descarboxilases como forma de defesa ao meio ácido (HALÁSZ et al., 1994). Além do
36
mais, alguns microrganismos, como as bactérias ácido láticas, são favorecidas pelo
meio ácido por promoverem inibição da microbiota acompanhante (FRANCO;
LANDGRAF, 1996).
A alta concentração de cloreto de sódio (NaCl) influencia o metabolismo
bacteriano e gera progressiva alteração na membrana onde estão localizadas as
enzimas de descarboxilação. Concentrações de 3,5 a 5,5% de NaCl podem inibir a
formação de histamina (HENRY e KOEHLER3, 1986 apud SUZZI; GARDINI, 2003).
A temperatura influencia de diferentes maneiras na formação de aminas
biogênicas. São citados ainda como fatores intervenientes a curva de crescimento, o
metabolismo e a atividade enzimática bacteriana. Somado a isto, a temperatura
também influi na atividade proteolítica e de descarboxilação bacteriana, além da inter-
relação da população microbiana. Temperaturas elevadas favorecem a proteólise e a
reação de descarboxilação, resultando no aumento da concentração de aminas (SUZZI;
GARDINI, 2003).
No entanto, Huss (1997) relatou que, para os sistemas enzimáticos, a
temperatura tem dois papéis que podem exercer efeitos opostos na velocidade da
reação enzimática. Ao mesmo tempo em que o aumento da temperatura acelera a
velocidade da reação enzimática, este aumento também pode gerar a desnaturação da
enzima, diminuindo a reação.
A Atividade de água (Aa) influi na formação de aminas biogênicas em função da
diminuição do metabolismo bacteriano. As bactérias necessitam de água de forma
disponível para seu metabolismo e multiplicação (FRANCO; LANDGRAF, 1996).
A adição de sais provoca a redução do valor da Atividade de água, que,
juntamente com a temperatura, influem no metabolismo bacteriano. A Aa, temperatura e
disponibilidade de nutrientes são interdependentes. Assim como o pH, a Aa
desfavoráveis provocam o aumento da fase lag de multiplicação bacteriana (FRANCO;
LANDGRAF, 1996; JAY, 2005). Contudo, quando as células bacterianas crescem em
meio com alta osmolaridade e sem osmoprotetores, esse organismo pode sintetizar
trealose, açúcar que se liga aos fosfolipídios e serve como osmoprotetor (JAY, 2005).
3 HENRY, K. D.; KOEHLER, P. E. Effects of salt concentration and incubation temperature on formation of histamine, phenethilamine, tryptamine and tyramine during miso fermentation. Journal of Food Protection. v.49. p.423-427, 1986.
37
3.4.2 Atuação da histamina e sintomatologia da intoxicação
A histamina é uma amina vasoativa que pode causar alterações na pressão
sangüínea, cefaléia, hipertensão, complicações renais e, em casos mais graves, pode
causar hemorragia cerebral e morte (ANTILA, 1983; KUHN; LOVENBERG, 1982). Em
muitos casos de intoxicação por histamina após o consumo de peixes fermentados não
há comunicação e registro, pois os sintomas da intoxicação muitas vezes são
semelhantes a processos alérgicos (TSAI et al., 2006).
Segundo Huss (1997), o corpo humano pode tolerar uma determinada
quantidade de histamina sem que haja reação, pois duas enzimas (Diamina Oxidase –
DAO e Histamine N-metiltransferase - HMT) atuam sobre a histamina, sendo este o
mecanismo de detoxificação da histamina (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
Para que a histamina possa atuar no organismo humano, esta deve passar pela
barreira intestinal gerada pela enzima DAO, presente no intestino delgado. A DAO age
sobre a histamina através da desaminação oxidativa. Em seguida, esta mesma amina
biogênica tem que ultrapassar a barreira da ação da HMT, enzima presente em todos
os tecidos que possuem como mecanismo predominante a metilação, gerando
compostos como a N – Metil-histamina, o N – Metilimidazol acetoaldeído e o N – Ácido
metil – imidazolacético. (WETTERQVIST4, 1978 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
A Figura 3 demonstra a reação de detoxificação da histamina.
HISTAMINA
N – Acetil Histamina DAO N- HMT N α – Metil Histamina
Imidazol Aceto Aldeído N t – Metil Histamina
Àcido Imidazol Acético + ribose N t – Metilimidazol Acetaldeído
Àcido Ribose – Imidazolacético N t – Ácido Metil Imidazolacético Fonte: TAYLOR5, 1986.
Figura 3 – Esquema ilustrativo da detoxificação da histamina e seus respectivos metabólitos.
4 WETTERQVIST, H. Histamine metabolism and excretion. In: Handbook of Experimental Pharmacology. Vol II. Editora M. Rocha e Silva: Springer-Verlag, New York, p.131-150, 1978.
38
A histamina exerce sua toxicidade interagindo com os receptores de histamina
(H1, H2 e H3) presentes nas membranas celulares. O sintoma mais comum é resultante
da ação cardiovascular da histamina, que gera dilatação dos vasos periféricos,
causando urticária, hipotensão, eritema e cefaléia. A histamina induz a contração da
musculatura intestinal promovendo dores abdominais, diarréia e vômito (TAYLOR5,
1986 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
Mesmo havendo um consenso de que a histamina é o principal agente desta
intoxicação alimentar, não existe nenhuma relação “dose-resposta” estabelecida. Além
do mais, existem fatores individuais que interferem na ação intoxicante da histamina,
como o peso dos indivíduos, as diferenças no metabolismo, a ingestão de
medicamentos que podem interferir nas enzimas DAO e HMT, as reações
idiossincrásicas e as reações verdadeiramente alérgicas (LEHANE; OLLEY, 2000).
Os sinais e sintomas da intoxicação pela histamina podem aparecer minutos ou
horas após o consumo do alimento. Os sintomas normalmente duram algumas horas,
mas podem durar dias. Os primeiros sinais são cutâneos (urticária, eritema, edema),
seguidos por sinais gastrointestinais (náusea, vômito, diarréia) e hemodinâmicos
(hipotensão). Por último aparecem os sinais neurológicos: cefaléia, palpitação,
queimação, prurido, formigamento, tremor e zumbido. Em muitos casos há bronco-
espasmo e alterações respiratórias (SHALABY, 1996; WU et al., 1997)
Muitos pesquisadores relatam que a histamina poderia ter sua ação intoxicante
potencializada em função do bloqueio ou diminuição da ação enzimática sobre a
histamina.
A presença de outras aminas biogênicas como cadaverina, putrescina e tiramina
podem ser responsabilizadas pela potencialização da ação da histamina, pois estas
inibem a DAO e N-HMT aumentando sua absorção intestinal. Algumas substâncias
farmacológicas como a izoniazida (antibiótico usado no tratamento de tuberculose), o
ácido clavulânico, o verapamil (medicamento utilizado em pacientes cardíacos),
medicamentos inibidores da MAO (utilizado em tratamentos de indivíduos depressivos)
5 TAYLOR, S. L. Histamine food poisoning toxicology and clinical aspects. CRC Critical rev. in: Toxicology 17:91-117, 1986.
39
e outros fármacos também podem inibir a ação da enzima DAO, aumentando a
absorção de histamina (LEHANE; OLLEY, 2000; TAYLOR, 1990).
3.4.3 Padrões nacionais e internacionais
O Brasil não possui legislação específica para normatizar a presença de
histamina em sardinhas anchovadas. Por esta razão, algumas indústrias nacionais
fazem uso de legislação européia (C.E. nº 2073/2005 da Comissão de 15 de novembro
de 2005), que estabelece o valor de 400 ppm como limite máximo de histamina
presente e produtos da pesca que tenham sido submetidos a tratamento de
fermentação enzimática em salmoura, fabricados a partir de espécies de peixes
associadas ao elevado teor de histidina.
Após extensa procura, não foi possível encontrar outras legislações
estabelecendo limites para a presença de histaminas em peixes anchovados. Acredita-
se que este fato possa ocorrer pela simples falta desta legislação ou por alguma
restrição lingüística, uma vez que este tipo de produto é muito consumido na Ásia e as
respectivas legislações estejam escritas nos idiomas da região.
O R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a) e a Portaria n° 185 - Regulamento Técnico de
Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL, 1997b) determinam como valor
máximo para a concentração de histamina, 100 ppm. Para o mesmo produto, o FDA
(2007a) estabelece 50 ppm, e a Comunidade Européia, 200 ppm de histamina (C.E.,
2005) como valores limítrofes máximos para produtos da pesca de espécies de peixes
associadas ao elevado teor de histidina.
3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO
Segundo Vieira (2004), o peixe possui microbiota própria que sofre alterações
dependentes de fatores externos como a contaminação ambiental conseqüente do
lançamento de esgotos e cursos de águas poluídas. A biota do peixe reflete a água
onde vive (JAY, 2005).
A microbiota do peixe marinho é predominantemente halofílica. Porém, o uso de
gelo como agente refrigerador promove diminuição da salinidade e permite que a
40
população euraliana (bactérias com habilidade para tolerar larga amplitude de
salinidade) se desenvolva (VIEIRA, 2004).
3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado
Em trabalho realizado por Leitão et al. (1983), com pescado de origem marinha,
foi destacado que as bactérias presentes nos peixes encontram-se,
predominantemente, na superfície da pele e vísceras. Ogawa e Maia (1999) afirmam
que, além da pele e vísceras, as guelras também apresentam contaminação bacteriana
quando o pescado está vivo passando os demais tecidos a serem infectados após a
morte do animal.
Segundo Hagler e Hagler (1991), a maioria das bactérias marinhas são bacilos
Gram negativos, móveis, anaeróbios facultativos e psicrofílicos. Estes autores
afirmaram que os gêneros prevalentes na água do mar são Pseudomonas, Vibrio,
Spirillum, Alcaligenes e Flavobacterium. Outros gêneros que também fazem parte da
microbiota natural do pescado são: Moraxella, Shewanella e Micrococcus (FRANCO;
LANDGRAF, 1996).
Novotny et al. (2004) realizaram um estudo sobre o potencial de contaminação
humana por bactérias patogênicas transmitidas pelos peixes e seu ambiente aquático e
afirmaram que infecções causadas por patógenos transmitidos pelo pescado são
comuns e dependem do habitate, da localização geográfica, da forma como é realizada
a pesca, da temperatura da água, da estação do ano, da qualidade e salinidade da
água e das condições, desde a produção até a comercialização do produto, estação do
ano, além dos hábitos alimentares e do estado imunológico do consumidor.
Dentre as bactérias patógenas associadas ao consumo de peixes e seus
derivados destacam-se: Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae,
Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp.,
Escherichia coli (NOVOTNY et al., 2004).
Observando que o ambiente marinho tem sofrido constante contaminação por
causa da emissão de esgotos ao mar, é importante ter em mente que algumas
bactérias comuns ao trato gastrintestinal dos homens e animais, com capacidade de
resistir a condições adversas, podem estar presentes neste ambiente (GIRAFFA, 2002).
41
3.5.2 Bactérias halófílicas e halotolerantes
As bactérias que conseguem se desenvolver e mesmo necessitam de altas
concentrações salinas são denominados halófilos e aqueles que sobrevivem, mas não
crescem e nem se desenvolvem, são denominados halodúricos (JAY, 2005).
Os microrganismos ligeiramente halófilos, que crescem em meio contendo de 2%
a 5% de sal, são de origem marinha, principalmente dos gêneros Pseudomonas,
Moraxella, Acinetobacter e Flavobacterium. Aqueles que crescem em meios contendo
de 5% a 20% de sal são chamados de moderadamente halófilos tendo como exemplos
as bactérias das famílias Bacillacceae e Micrococcaceae. Bactérias que crescem em
meios contendo concentrações de 20% a 30% de sal são extremamente halófilas como
o Halobacterium spp. e Halococcus spp.. Já os patógenos Clostridium botulinum, C.
perfringens e Staphylococcus aureus são halotolerantes (OETTERER, 2005).
Em altas concentrações de sal a Atividade de água cai, sendo o valor 0,70 o
limite para o desenvolvimento de bactérias halofílicas em pescado. O pH ótimo para
crescimento situa-se entre 0,5 e 7,5 (ibid).
3.5.3 Bactérias acidoláticas
Neste grupo de bactérias, atualmente, estão agrupados 12 gêneros de bactérias
Gram-positivas: Carnobacterium; Enterococcus; Lactococcus; Lactobacillus;
Lactosphaera; Leuconostoc; Oenococcus; Pediococcus; Streptococcus;
Tetragenococcus; Vagococcus e Weissella . Este grupo não possui limites bem
definidos, porém todos apresentam a mesma característica de produzir ácido lático a
partir de hexoses. Este grupo de bactérias fermentadoras é caracterizado por não
possuir sistemas hemiligados funcionais de transporte de elétrons ou de citocromos
(JAY, 2005).
Segundo Vicenzi (2007), as bactérias ácidoláticas são anaeróbias facultativas e
possuem as seguintes características: melhor crescimento em baixa tensão de
oxigênio; são basicamente sacarolíticas; produzem grande quantidade de ácido láctico;
são divididas em homo e heterofermentativas em relação à fermentação da lactose;
possuem mecanismos biossintéticos pobres, sendo necessário o suprimento de
carboidratos, aminoácidos, lipídios, minerais, entre outros, para que se desenvolvam;
42
não usam oxigênio (O2) no seu metabolismo e, por isto, não decompõem
completamente o alimento e seus metabólitos básicos se acumulam no meio; e sua
única forma de metabolismo energético é a fermentação.
Jay (2005) explica que as bactérias que produzem ácido lático como único ou
principal produto da fermentação da glicose são designadas como homofermentativas
e, as bactérias que produzem a mesma quantidade molar de lactato, dióxido de
carbono e etanol, são as heterofermentativas.
3.5.4 Salmonella spp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende
bacilos Gram-negativos não esporulados. São anaeróbios facultativos, produzem gás a
partir de glicose e são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. Este
gênero abriga as espécies causadoras da febre tifóide (Salmonella typhi), das febres
entéricas (S. paratyphi A, B e C) e das enterocolites por Salmonella (salmoneloses)
(DOYLE; CLIVER, 1990; FRANCO; LANDGRAF, 1996).
O pH ótimo para a multiplicação das salmonelas fica próximo de 7,0, sendo que
valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 são bactericidas. Dependendo da natureza do
ácido presente no meio, o pH mínimo pode subir para 5,5. O ácido acético, o ácido
propiônico e o ácido butírico são mais inibitórios que o ácido clorídrico para um mesmo
pH. As salmonelas não toleram concentrações de sal superiores a 9% (FRANCO;
LANDGRAF, 1996).
Como a Salmonella spp. pode se multiplicar facilmente em alimentos de origem
animal e sua dose infectante varia de 10 células a milhões delas, dependendo de
fatores humanos e do tipo de alimento, fatores extrínsecos e intrínsecos, sua ausência
em produtos alimentícios é exigida na maioria dos países (AMSON et al., 2007).
A salmonelose é um sério problema para a saúde coletiva. O gênero reúne mais
de 2300 sorovares diferentes, mas somente uma minoria está relacionada á ocorrência
de infecções no homem (PIGNATO et al., 1995). Os sintomas incluem diarréia, dores
abdominais, vômito, cefaléia, desidratação e febre. A severidade dos sintomas irá variar
de acordo com a imunocompetência do indivíduo intoxicado (DOYLE; CLIVER, 1990).
43
O trato intestinal de animais (pássaros, répteis, animais de granja, homem e
insetos) é o habitat primário da Salmonella spp. Desta forma, os microrganismos são
excretados nas fezes, a partir das quais podem ser transmitidos por insetos e por outros
organismos vivos para variados destinos. Assim sendo, a Salmonella spp. também
pode ser encontrada na água, especialmente a poluída por esgoto. (JAY, 2005), e a
contaminação das águas torna o pescado uma fonte em potencial de bactérias
patogênicas como a Salmonella spp. (NOVOTY et al., 2004).
Existem algumas metodologias descritas, que são demoradas e complexas, para
o isolamento e identificação de Salmonella spp. dos alimentos, podendo levar até sete
dias para realizá-las. No entanto, foi desenvolvido por Rambach (1990) um meio de
cultura que facilita a diferenciação de Salmonella spp. de outros membros da família
Enterobacteriaceae. Pignato et al. (1995), observando as características do meio de
Rambach, desenvolveram metodologia que reduz o isolamento e identificação da
Salmonella spp. em até 48 horas.
3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli)
O grupo dos coliformes totais é composto por bactérias da família
Enterobacteriaceae caracterizados pela capacidade de fermentar a lactose produzindo
gás quando estes são incubados a 35-37 °C, por até 48 horas. São bacilos Gram-
negativos não formadores de esporos. Dentre os pertencentes a este grupo, pode-se
dizer que há predominâncias dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e
Klebsiella. São utilizados como indicadores microbiológicos para a avaliação da
qualidade dos alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996; HARRIGAN, 1998; JAY, 2005).
Os coliformes podem crescer em temperaturas que variam de -2 °C a 50°C. No
entanto, nos alimentos, o crescimento deste grupo é pobre e lento em temperaturas
baixas. Podem crescem na faixa de pH entre 4,4 e 9,0. Uma característica importante
deste grupo e que favorece seu isolamento seletivo é a capacidade de crescimento em
presença de sais biliares, os quais inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas
(JAY, 2005).
Dentro do grupo dos coliformes totais está o grupo dos coliformes fecais que
possuem a capacidade de continuar fermentando a lactose com produção de gás,
44
quando incubadas à temperatura de 45 °C +/- 0,5 °C. O principal representante deste
grupo é a Escherichia coli (FRANCO; LANDGRAF, 1996).
A E. coli é o organismo aeróbio mais freqüente no trato digestivo do ser humano
e dos animais de sangue quente. Em geral, as estirpes de E. coli que colonizam o trato
gastrintestinal são comensais inofensivas ou desempenham um papel importante na
manutenção da fisiologia intestinal (FDA, 2007b; HUSS, 1997). No entanto, mesmo não
sendo patogênicas, podem ser oportunistas e causar infecções em indivíduos
imunocomprometidos. Deve ser registrada ainda a existência de algumas cepas de E.
coli patogênicas que, quando ingeridas, causam infecções gastrintestinais em
indivíduos saudáveis (FDA, 2007b).
Na RDC n° 12 (BRASIL, 2001), do Ministério da Saúde, foi estipulado o valor
máximo de 102 coliformes por grama de alimento, em três, das cinco amostras de
semiconservas de pescado colhidas.
3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva
As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos pertencentes à
família Micrococcaceae. São anaeróbios facultativos, tolerantes a concentrações de
10% a 20% de NaCl, produzem toxinas entre 10 °C a 46 °C, crescem na faixa de pH de
4 a 9,8 e em ambientes com Atividade de água de até 0,83 (FRANCO; LANDGRAF,
1996).
Segundo Vieira (2004) e Novotny et al. (2004), dentre as bactérias causadoras
de intoxicações ligadas ao consumo de pescado, destaca-se o Staphylococcus aureus,
o melhor representante das estirpes enterotoxigênicas de Staphylococcus coagulase
positiva.
Leitão et al. (1983) dissertam que esta última bactéria não faz parte da
microbiota natural do ambiente marinho e do pescado, sendo sua presença neste
alimento oriunda, principalmente, do manuseio ou do contato com superfícies
higienizadas inadequadamente. Nos alimentos, podem se multiplicar e produzir
enterotoxinas a partir de contagens de S. aureus em torno de 106 UFC/g. A ingestão da
enterotoxina pode gerar intoxicação alimentar, tendo como sintomas náusea, vômitos,
dores abdominais, diarréia e sudorese. Em casos mais graves também pode ocorrer
45
cefaléia, calafrios, hipotensão arterial e, raramente, febre (AMSON et al., 2007;
CAMACHO et al., 2007; FRANCO; LANDGRAF, 1996).
Na RDC n° 12 (BRASIL, 2001), do Ministério da Saúde, encontra-se como valor
máximo 5x102 estafilococos coagulase positiva por grama do alimento, em duas, das
cinco amostras de semiconservas colidas para análise. Para a realização desta
contagem, na Instrução Normativa n° 62 (BRASIL, 2003), da Secretaria de Defesa
Agropecuária do Ministério da Agricultura, determinou-se a utilização do meio de Baird
Parker suplementado com solução de gema de ovo.
3.5.7 Enterococcus spp.
Os Enterococcus spp. fazem parte do grupo das bactérias ácidoláticas (KLEIN,
2003; SUZZI; GARDINI, 2003). São cocos Gram positivos, anaeróbios facultativos,
dispostos aos pares ou pequenas correntes (DOMING et al., 2003; TENDOLKAR et al.,
2003). Podem tolerar elevadas concentrações de sal (HUGAS et al., 2003).
O gênero Enterococcus encontra-se dentro da família Enterococcaceae, junto
com os gêneros Melissococcus, Tetragenococcus e Vagococcus. Os membros típicos
do gênero Enterococcus (E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae e E.
mundtii) são facilmente distinguíveis, pois crescem em ambas as temperaturas, 10 e
45°C, em caldo contendo até 6,5% de NaCl, em pH 9,6 e em presença de 40% de bile.
Existem dados na literatura registrando a presença de Enterococcus spp. em pH 5,0
(FRANZ et al., 2003; HUGAS et al., 2003; TENDOLKAR et al., 2003).
Este microrganismo pode ser utilizado como indicador de higiene do alimento,
baseado na capacidade de sobreviver em condições ambientais adversas, somado à
possibilidade de estar presente no trato intestinal de homens e animais e à resistência a
temperaturas elevadas (DOMING et al., 2003; GIRAFFA, 2002).
Infecções do trato urinário, abdômen, endocárdio e vias biliares podem ser
causados pelo Enterococcus spp. Além do mais, outro ponto que vem se tornando
preocupante é a capacidade que esta bactéria vem desenvolvendo, no sentido do
aumento da sua resistência em relação aos antimicrobianos (DOMING et al., 2003).
Porém, Hugas et al. (2003) destacaram que o Enterococcus spp. possui um
papel importante em alimentos fermentados pois algumas espécies podem produzir
46
enterocinas com atividade antimicrobiana que agem sobre a microbiota patogênica
possivelmente presente no alimento.
Em contrapartida, a capacidade de produzir descarboxilases, com conseqüente
formação de aminas biogênicas, também gera preocupação. Fatores como o pH,
temperatura e concentração de NaCl interferem na produção das aminas biogênicas
por intervirem na curva de crescimento do Enterococcus faecalis (GARDINI et al.,
2001).
Sob estes aspectos, os Enterococcus spp. tornaram-se o centro de muitas
atividades de pesquisa e preocupação em relação à saúde coletiva. De um lado,
participam de importantes funções em vários produtos fermentados e, de outro, é
utilizado como indicador de contaminação fecal, além da existência de algumas
espécies que tem algum potencial patogênico (DOMING et al., 2003).
4 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado em duas etapas. A primeira consistiu na avaliação da
qualidade de peixes anchovados disponíveis no comércio varejista, de origem nacional
e importada. Estes produtos foram avaliados através de parâmetros bacteriológicos e
físico-químicos, em um total de vinte amostras.
A segunda etapa do trabalho consistiu no acompanhamento da produção de
sardinhas anchovadas produzidas em uma indústria localizada em Ubatuba–SP,
avaliando-se, através de parâmetros físico-químicos e bacteriológicos, diversas etapas
até o produto final. Também foram elaborados, com participação da indústria, duas
alternativas tecnológicas distintas da usual da empresa as quais foram acompanhadas
pelos mesmos parâmetros anteriormente citados. O acompanhamento dos processos
foi iniciado com a avaliação da matéria prima e finalizado com a avaliação do produto
final.
As amostras foram analisadas nos Laboratório de Controle Microbiológico e
Físico-químico do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Faculdade de
Veterinária da Universidade Federal Fluminense.
4.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA
No mercado varejista, é possível encontrar diferentes marcas de produtos
anchovados de diferentes origens, tanto nacional como importados (Itália, Marrocos,
Peru e Argentina). São produtos elaborados com variadas matérias primas, tais como
sardinhas (Sardinella brasiliensis), anchovas (Engraulis spp.) e anchovetas (Engraulis
ringens).
48
Figura 4 – Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no mercado varejista.
As 20 (vinte) amostras foram adquiridas em supermercados e lojas de
“delicatessen” da cidade de Niterói, Estado do Rio de Janeiro e transportadas para os
Laboratório de Controle Microbiológico de Produtos de Origem Animal e para o
Laboratório de Controle Físico-Químico de Produtos de Origem Animal, nas condições
de comercialização.
Nos estabelecimentos, o produto pôde ser encontrado sob diferentes formas de
comercialização (Figura 4). Dentre estas, foram adquiridas amostras a granel,
enlatadas, embaladas em vidro (com tampa rosqueada ou tampadas a vácuo) e
embaladas em potes de plástico rígido possuindo tampas com lacre.
4.1.1 Análises bacteriológicas
As análises bacteriológicas foram baseadas na resolução RDC nº 12 (BRASIL,
2001), sendo realizadas de acordo com a Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de
2003 (BRASIL, 2003).
Segundo a RDC nº 12 (BRASIL, 2001), para produtos de pesca como
semiconservas de anchovados, são previstas as seguintes análises bacteriológicas:
enumeração de coliformes, contagem e identificação de Staphylococcus coagulase
positiva e isolamento e identificação de Salmonella sp.
A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista na legislação supracitada e
foi realizada devido à resistência da bactéria a condições adversas.
49
4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura
Para a realização das análises bacteriológicas, os meios de cultura foram
preparados de 15 em 15 dias, em quantidades proporcionais a cada amostragem, com
a finalidade de manter as propriedades nutricionais e/ou bioquímicas dos meios de
cultura. Para tanto, as indicações fornecidas pelos fabricantes foram seguidas
fidedignamente.
Foram utilizados materiais esterilizados e descartáveis para a realização dos
procedimentos analíticos, tais como: “eppendorfs”, placas de Petri, ponteiras para
pipetador e sacos de “stomacher”.
Para averiguação da eficiência de esterilização em autoclave (Fabbe ®) foi
utilizado o sistema bioindicador de checagem Sterikon ® da Merck ® (nº 10284),
constituídos de caldo nutriente, glicose, indicador de pH e esporos de Bacillus
stearothermophilus DONK (ATCC 7953), atualmente denominado Geobacillus
stearothermophilus (ATCC 7953).
As ampolas foram colocadas no interior da autoclave juntamente com o material
a ser esterilizado a 121 °C por 15 minutos. Quando o material foi retirado da autoclave,
as ampolas foram incubadas por 24 a 48 horas a 60 °C. Uma ampola não esterilizada
pode ser incubada em conjunto para servir de controle.
Sendo a esterilização adequada, os esporos de Bacillus stearothermophilus
serão destruídos e o conteúdo da ampola ficará com coloração violeta clara (Figura 3).
Se a esterilização não for eficiente, o esporo passará a sua forma vegetativa e o
conteúdo da ampola apresentará coloração amarela em função da produção de ácidos
resultantes da fermentação da glicose. Há também a turvação do meio pelo
crescimento bacteriano.
4.1.1.2 Enumeração de Coliformes totais e fecal (Escherichia coli)
A metodologia utilizada para esta análise bacteriológica (MERCK, 2002
modificada por FRANCO e MANTILLA, 2004) teve por objetivo, além da Enumeração
de Coliformes e Escherichia coli, reduzir o consumo do meio de cultura utilizado, o
Fluorocult ® caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (Merck ® n° 12588), através
da técnica de miniaturização (MERCK, 2002).
50
De cada amostra, foram obtidas subamostras de 25 g, pesadas assepticamente,
acondicionadas em envelope de “stomacher” e homogeneizada com solução salina
peptonada a 0,1 % (SSP 0,1%), em “stomacher” (Seward ®) por dois minutos em
velocidade normal.
A partir da diluição de 225 mL de SSP 0,1% e 25 g da amostra (diluição 10-1)
preparou-se a diluição de 10-2 retirando-se uma alíquota de 100 µL da primeira diluição
previamente homogeneizada e colocando-a em microtubos tipo “eppendorf” esterilizado
contendo 900 µL de SSP 0,1 %. Após homogeneização da segunda diluição, uma
alíquota de 100 µL desta foi retirada e colocada em um terceiro “eppendorf” esterilizado
contendo 900µL de SSP 0,1%. Assim prepararam-se três diluições de cada amostra
(10-1, 10-2 e 10-3).
Destas diluições, retiraram-se três alíquotas de 100 µL e, cada uma delas, foi
distribuída em microtubo tipo “eppendorf” contendo 1 mL de Fluorocult ® previamente
preparado, esterilizado e distribuído em ““eppendorfs” esterilizados de 1,5 mL. Assim
sendo, de cada amostra obtiveram-se três diluições em SSP 0,1%, e, de cada diluição,
três repetições na semeadura do Fluorocult ® (Figura 5), encubando-as por 24 a 48
horas a 35 – 37 °C.
B
A
Figura 5 - Microtubos tipo “eppendorf” contendo os meios de cultura Fluorocult ® (A) e Chromocult ® (B), agrupados por amostras.
O Flourocult ® caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (MERCK, 2002) é um
caldo de enriquecimento seletivo para a identificação simultânea de coliformes total e
51
fecal (Escherichia coli). Para o crescimento de coliformes totais, o meio torna-se verde-
azulado. Se houver a presença de coliforme fecal uma fluorescência azul clara será
observada quando o cultivo é exposto à luz ultravioleta. Para a confirmação de E. coli,
umas gotas do reativo de Kovac’s são adicionadas para observar a presença de indol,
sendo esta reação positiva na ocorrência de coloração vermelho cereja.
4.1.1.3 Enumeração de Enterococcus spp.
A metodologia utilizada para esta análise bacteriológica (MERCK, 2002
modificado por FRANCO e LEITE, 2005) teve por objetivo a Enumeração de
Enterococcus sp. e redução do consumo do meio de cultura utilizado, o Chromocult ®
Enterococci Broth (Cat n° 110294) (MERCK, 2002), através da técnica de
miniaturização.
As três diluições de SSP 0,1% preparadas para a semeadura do Fluorocult®
também foram utilizadas para semear o Chromocult ®. Para tanto, foram realizadas de
cada diluição, três repetições (Figura 5) e os meios semeados foram incubados por 24 a
48 horas a 45 +/- 0,5 °C.
O Chromocult ® é um caldo de enriquecimento seletivo que se torna azul
esverdeado quando houver crescimento positivo. A turbidez do meio pode ser fraca.
4.1.1.4 Contagem e Identificação de Staphylococcus coagulase positiva
A contagem e a identificação de Staphylococcus coagulase positiva foram
realizadas de acordo com a Normativa nº 62 da Secretaria de Defesa Agropecuária do
Ministério da Agricultura (BRASIL, 2003).
As diluições iniciais, anteriormente citadas, também semeadas em placas de
Petri contendo o meio de Agar Baird Parker ® (Merck ® n° 5406).
Inoculou-se uma alíquota de 100 µL de cada diluição na superfície do meio
espalhando-as sobre a superfície de forma homogênea com o auxilio de um bastão de
Hockey. As placas semeadas foram incubadas por 24 a 48 horas a 35 – 37 °C.
O meio de Ágar “Baird Parker” permite o crescimento seletivo de estafilococos
por conter em sua formulação o cloreto de lítio e o telurito de potássio, ambos inibidores
da microbiota acompanhante. A presença de gema de ovo no meio demonstra a
52
característica da produção de enzimas lipolíticas e proteolíticas através da formação de
halos transparentes ao redor das colônias suspeitas que se mostram pretas pela
redução do telurito.
As colônias suspeitas foram repicadas para o meio Ágar BHI (“Brain and Heart
Infusion”) e incubadas por 24 a 48 horas a 35 – 37 °C para a realização de provas
bioquímicas: catalase, coagulase, DNase, Termonuclease, oxidação e fermentação da
glicose e verificação das características morfotintoriais pelo método de Gram.
4.1.1.5 Isolamento e identificação de Salmonella spp.
Para as análises de isolamento e identificação de Salmonella, a metodologia
utilizada foi a proposta por Pignato et al. (1995).
De cada amostra, foram semeadas subamostras de 25g, pesadas
assepticamente, acondicionadas em envelope de “stomacher” e homogeneizada por
dois minutos em velocidade normal com caldo Salmocyst ® base em “stomacher”
(Seward ®), sendo incubado por seis a oito horas a 35 – 37 °C, para obter o
enriquecimento não seletivo.
A partir do caldo base, retirou-se 10 mL do meio crescido transferindo-os para
um tubo de ensaio contendo o caldo Salmocyst ® suplemento (Figuras 6 A e B). Esta
etapa consiste no enriquecimento seletivo. A presença de verde brilhante e sais de bile
bovina na formulação deste suplemento inibem a microbiota acompanhante Gram
positiva. Os tubos foram incubados por 18 horas a 35 - 37 °C.
B A
Figura 6 (A e B) – Tubo de eantes de semeado (A) e após(B).
nsaio contendo caldo Salmocyst® suplemento a adição de 10ml do caldo Salmocyst® base
53
Após o período de incubação do caldo Salmocyst ® suplemento, foi realizado
esfregaço em lâmina de vidro, corada pelo método de Gram, para a observação
microscópica das características morfo-tintoriais dos microrganismos presentes. A partir
do mesmo caldo suplemento, foram semeadas placas de Petri contendo o meio
cromogênico Agar Rambach ® (Merck ® n° 7500) para a realização da etapa de
plaqueamento seletivo e observação das características das colônias. A semeadura foi
realizada através da técnica de esgotamento para obtenção de colônias isoladas com o
auxílio de alça de platina (0,3 mm de diâmetro) fixada em cabo de Coli. As placas foram
incubadas por 24 – 48 horas a 35-37 °C.
AAA
DDDCCC
BBB
Figuras 7 (A, B, C, e D) – Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach ® a partir de repique realizado do caldo Salmocyst ® suplemento onde, (A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D) apresentam crescimento suspeito de Escherichia spp e Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de Proteus spp.
A presença do desoxicolato de sódio na formulação do meio inibe o crescimento
da flora Gram positiva acompanhante. O meio utiliza a habilidade que a salmonela
possui de produzir ácido a partir do propilenoglicol para diferenciá-la das outras
54
enterobacteriáceas (Figuras 7 A, B, C e D). Somado a isto, o meio possui o cromógeno
X-Gal que permite a detecção da β – galactosidase produzida pelas outras
enterobactérias.
Assim, as colônias suspeitas de Salmonella spp. mostram-se com coloração
avermelhada em função da produção de ácido apontada pelo indicador de pH.
4.1.2 Análises físico-químicas
As análises físico-químicas foram realizadas, a partir da musculatura dorsal das
amostras de cada lote. Após separação e cominuição da musculatura dorsal, pesou-se
em balança analítica, as alíquotas de acordo com os protocolos analíticos de cada
análise fisico-química. Em seguida, estas foram embaladas em papel alumínio,
identificadas (data, peso, análise e lote) e congeladas.
4.1.2.1 Avaliação de histamina
Para avaliação da produção de histamina, utilizou-se o método de Cromatografia
em Camada Delgada (CCD) segundo a metodologia proposta por Schutz, Chang e
Bjeldanes (1976). Nas amostras, onde foi constatada a produção de histamina,
realizou-se o método quantitativo fluorimétrico segundo a metodologia preconizada pela
AOAC (2002).
4.1.2.1.1 Método de Cromatografia em Camada Delgada
Pelo emprego desta metodologia, utilizou-se uma alíquota de 1g da porção
muscular transferindo-a para tubo de ensaio e adicionando-se 2mL de metanol. Com o
auxilio de uma espátula fina foram homogeneízadas as duas fases em vórtex
(Certomat ® MV) a fim de aumentar a superfície de contato entre a porção muscular e o
metanol.
O conjunto foi aquecido em banho-maria até fervura. Neste momento, transferiu-
se o tubo de ensaio para centrifuga (Hermle ® Z 360 K) para obtenção de sobrenadante
após dois minutos a 3000 rpm.
A placa de sílica gel (Sigma ®) foi cortada com cuidado para que não houvesse
desprendimento da camada de sílica (SiO2). As marcações dos pontos de aplicações
55
das amostras e dos padrões foram feitas com lápis sobre a sílica a 1,5 cm da borda
inferior. O tamanho da placa variou de acordo com o número de amostras analisadas.
De cada amostra centrifugada retirou-se 10 µL do sobrenadante, com o auxílio
de pipetador automático, aplicando-as na placa de sílica. Foram aplicados, também, os
padrões de 2 µL, 5 µL e 10 µL nos respectivos pontos da placa com o auxílio de
microseringa de 10 µL (Hamilton ®). Estes padrões equivalem aos valores de 2 mg de
histamina/100 g da amostra (20 ppm), 5 mg/100 g (50 ppm)e 10 mg/100 g (100 ppm).
Para a preparação do padrão, foram utilizados 16,6 g da histamina 2 HCL
Sigma® diluídos em 100 mL de metanol, em um balão volumétrico.
As placas aplicadas com os padrões e as amostras foram colocadas em cuba
cromatográfica com tampa, contendo um eluente previamente preparado (20 mL de
Acetona P.A. e 1 mL de Hidróxido de Amônio P.A.– 20:1 v/v). O eluente deve ser o
suficiente para cobrir o fundo da cuba, com espessura de 0,5 a 1,0 cm.
A solução eluente se desloca por capilaridade sobre a placa de sílica até 2 cm da
borda superior carreando as aminas biogênicas (histamina, putrescina e cadaverina)
que, quando presentes, se ligam à sílica em diferentes deslocamentos. Ao ser retirada
da cuba, a placa foi secada com ar fluente quente por um período de 20 minutos e em
estufa à 36 °C, para a eliminação dos vapores de amônia.
Para a visualização das aminas, a placa foi revelada aspergindo-se
uniformemente sobre a mesma, solução de ninhidrina a 0,3 % em metanol. A placa foi
secada novamente com ar fluente quente, para visualização da coloração avermelhada
que aparece em função da complexação da ninhidrina com o radical NH3 das aminas
biogênicas.
A quantificação da histamina foi feita pela comparação visual entre as manchas
formadas pelos padrões e pelas amostras, de mesmo deslocamento, além da
intensidade da cor (Figura 8).
56
Figura 8 – Placa de sílica (Sigma ®) após revelação com solução de ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presença de histamina em todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas.
4.1.2.1.2 Método Fluorimétrico
O método fluorimétrico baseia-se na reação da histamina com o Ortoftaldeído
(OPT), formando um composto fluorescente.
Empregando esta metodologia, utilizou-se 10 g da amostra homogeneizando-a
com 50 mL de metanol em liquidificador (Oster ®). Com o auxílio de um funil de
polipropileno, o homogeneizado foi transferido para um erlenmeyer de 125mL.
Adicionou-se mais 50 mL de metanol no copo do liquidificador com a finalidade de
remover os resíduos da amostra que também foram transferidos para o erlenmeyer,
sendo este tampado com um pequeno quadrado de folha de alumínio.
Este extrato foi submetido a banho-maria por 15 minutos a 60°C, e, decorrido
este período, o conjunto foi filtrado em papel Whatman ® n°1 para balão de 100 mL.
Assim, foi obtido um extrato que pôde ser conservado sob refrigeração até realização
do procedimento analítico.
A purificação do extrato foi feita através da filtração de 1 mL da solução em
coluna de troca iônica. O filtrado foi transferido para um balão de 50 mL contendo 5 mL
de HCl 1N. Após a penetração do extrato na coluna, foram acrescentados 5 mL de
água destilada, deixando-a fluir. Quando o nível do líquido alcançou o nível de 2 mm
acima da resina, foram acrescentados mais 5 mL de água destilada, sucessivamente,
57
até o volume de 35 mL. O fluxo foi interrompido sem permitir que a resina ficasse seca.
O volume do balão foi completado com água destilada e o filtrado homogeneizado e,
em seguida, refrigerado.
Do filtrado refrigerado, retirou-se uma alíquota de 5 mL e transferiu-se para um
erlenmeyer. Em seguida, se adicionou 10 mL de HCl 0,1N, com a finalidade de
homogeneizar a solução. Nas etapas seguintes, foram adicionados 3 mL de hidróxido
de Sódio (NaCl) 1N, 1 mL da solução 0,1 % de OPT e 3 mL de Ácido Fosfórico (H3PO4)
1,78M. Entre uma etapa e outra, sempre se procedeu à homogeneização das soluções,
sendo que após a adição da solução de OPT, a solução foi agitada de forma constante
por 4 minutos.
Também foi elaborada uma solução “branco“ da mesma forma como citado
anteriormente, diferindo somente na não adição do filtrado resfriado. Utilizamos esta
solução para zerar o fluorímetro.
Transferida a solução obtida após a adição do ácido fosfórico para uma cubeta,
foi realizada a leitura no fluorímetro (Sequoia–Turner ® Modelo 450) e os valores
obtidos foram anotados (Figura 9). Após a aplicação destes valores à fórmula para a
obtenção do resultado em ppm, foram comparados os valores obtidos com a curva
padrão.
Figura 9 – Fluorímetro (Sequoia–Turner® Modelo 450) registrando a leitura de uma das amostras analisadas.
58
Preparo da resina e da coluna de troca iônica
Na conversão da resina Dowex ® (Sigma – Aldrich ®) para sua forma alcalina
utilizou-se 15 mL de Hidróxido de Sódio 2M para cada grama de resina. A mistura foi
vagarosamente homogeneizada em béquer e submetida a descanso por 30 minutos.
Após este período, a parte líquida foi dispensada e a resina lavada duas vezes com
água destilada.
A coluna de vidro foi fixada em suporte próprio para vidrarias. Ao fundo desta,
uma pequena circunferência de filtro de papel Whatman n° 1 foi colocada e, em
seguida, uma camada muito fina de lã de vidro, com a finalidade de não permitir o
arraste da resina para o balão. Colocou-se a quantidade de resina suficiente para
formar uma coluna de 8 cm de altura, e esta foi mantida submersa em água destilada
para que não perdesse a sua propriedade de troca iônica (Figura 10 A, B e C).
A B
Figuras 10 (A, B e C) - Preparação da coluna de filtração, colocando-se primeiro o papel de filtro (Whaltman nº 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adição de pequena quantidade de lã de vidro (B) posteriormente adicionando a resina de troca iônica (Dowex ®) previamente convertida a forma alcalina (C).
C
Após o uso, a resina pode ser re-utilizada através de sua regeneração. Este
procedimento é feito da mesma forma que a ativação da resina.
Preparo das soluções
Hidróxido de sódio (NaOH) 1M e 2M
Foram pesados 41,24 g e 82,48 g de NaOH P.A., respectivamente para as
soluções de 1M e 2M, e dissolvidas em 1000 mL de água destilada.
59
Ácido Clorídrico (HCl) 1N e 0,1N
Pipetou-se 93 mL de ácido clorídrico concentrado e transferiu-se para um balão
volumétrico de 1000 mL, completando-se o volume com água destilada, tendo, desta
forma, a solução 1 N.
Pipetou-se 9,3 mL de ácido clorídrico concentrado e transferiu-se para um balão
volumétrico de 1000 mL, completando-se o volume com água destilada, obtendo a
solução 0,1 N.
Ácido Fosfórico (H3PO4) 1,78M
Foram diluídos 243,6 mL de ácido fosfórico para 1 L de água destilada, e
padronizou-se 500 mL do ácido com solução de hidróxido de sódio 1M, usando
fenolftaleína como indicador. Esta concentração pode ser ajustada, se necessário.
Ortoftaldeído (OPT) 0,1%
Foram dissolvidos 25 mg de OPT em 25 mL de metanol. Esta solução foi
armazenada em frasco âmbar e sob refrigeração, com atenção para a sua validade,
que é de uma semana.
Preparo das soluções padrões de histamina
Solução Stock – 1 mg/mL em base livre
Pesou-se 42,3 mg de histamina, transferindo-se para um balão de 25 mL,
dissolvidos e diluídos com ácido clorídrico 0,1 N até completar o volume. A solução foi
mantida sob refrigeração por um período de até uma semana.
Solução intermediária – 10 µg/ mL
Foram pipetados 0,5 mL da solução stock para um balão de 50 mL, com ácido
clorídrico 0,1 N até completar o volume. A solução foi mantida sob refrigeração.
60
Solução padrão de trabalho
Pipetou-se 1 mL da solução intermediária, transferindo-se para um balão de 50
mL e diluindo-se com ácido clorídrico 0,1 N até completar o volume. A partir desta
solução, foram preparadas as seguintes soluções para a curva padrão, observado o
seu preparo no dia de seu uso:
1) 0,1 µg/5 mL - Pipetou-se 0,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-
a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.
2) 0,2 µg/5 mL - Pipetou-se 1 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-a
para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4 mL de ácido clorídrico 0,1N.
3) 0,3 µg/5 mL - Pipetou-se 1,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-
a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.
4) 0,4 µg/5 mL - Pipetou-se 2 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-a
para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3 mL de ácido clorídrico 0,1N.
5) 0,5 µg/5 mL - Pipetou-se 2,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-
a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 2,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.
Obtenção da “Curva Padrão”
As cindo soluções de trabalho foram tratadas em erlenmeyer de 50 mL com
soluções químicas através do mesmo procedimento realizado para o extrato purificado
da coluna de troca iônica das amostras (o filtrado).
Cada solução obtida foi transferida para uma cubeta, sendo realizada a leitura
no fluorímetro e anotados os valores obtidos. Estes valores foram aplicados na fórmula
a seguir para a obtenção do resultado em mg de histamina por Kg da amostra. Os
resultados foram transferidos para um gráfico representado em plano cartesiano de dois
eixos (x e y) por uma reta denominada “Curva Padrão”, como demonstrado na Figura
11.
61
y = 0,217x - 0,0061R2 = 0,9676
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0 0,1 0,2 0,3 0,4
ppm
Figura11 - Plano cartesiano contendo a “Curquantificação de histamina utilizada Fluorimétrico.
Cálculo da quantidade de histamina
Histamina mg / Kg = (Is – b) x 10 P x a Is = leitura da fluorescência no aparelho b = coeficiente linear da reta obtida a partir da “Curva Padrão” P = massa da amostra em g a = coeficiente linear da reta obtida a partir da “Curva Padrão” 1000 = fator de diluição
4.1.2.2 Análise da produção de Bases Voláteis Totais
Para a análise de Bases Voláteis Totais, utilizou-se o
Placas de Conway ®, descrito no Manual do LANARA (BRA
Em liquidificador, foram homogeneizados 10 g da am
de Ácido Tricloroacético (TCA) 10%. Em seguida, foi reali
funil de “Buchner” com papel Whatman ® acoplado à um Ki
extrato.
Com pipeta volumétrica de 2 mL retirou-se uma
colocada no compartimento externo da placa de mic
compartimento interno, adicionou-se 2 mL da solução de ác
Foi colocada vaselina sólida nas bordas da placa d
uma placa de vidro deixando uma pequena área aberta
solução saturada de carbonato de potássio (K2CO3) ao c
com o extrato. Rapidamente, a placa de vidro foi desliza
µg/5 mL
0,5 0,6
va Padrão” da no método
00
método de Microdifusão em
SIL, 1981).
ostra com 10 mL de solução
zada a filtração a vácuo em
tasato, sendo assim obtido o
alíquota do extrato que foi
rodifusão de Conway. No
ido bórico de Conway.
e microdifusão e sobre esta
para a adição de 2 mL de
ompartimento externo, junto
da para tampar a placa de
62
microdifusão, girando-se suavemente o conjunto, com a finalidade de homogeneizar o
conteúdo externo.
As análises foram realizadas em duplicata para cada amostra e as placas
permaneceram por 2 horas em estufa à 36 °C. A última etapa do procedimento analítico
foi a titulometria de neutralização utilizando-se solução de ácido clorídrico 0,1 N com
auxílio de microbureta de 5 mL, para neutralizar as bases migradas para o
compartimento interior da placa (Figura 12).
A B C
Figura 12 (A, B e C) – Titulometria de neutralização das bases presentes no compartimento interno da placa de microdifusão de Conway (A) onde a adição de solução de ácido clorídrico 0,1 N, com auxílio de microbureta, vai alterando a cor do conteúdo (B) até completa viragem do mesmo (C).
O cálculo de mg de N-BVT por 100 g da amostra foi feito através da fórmula:
mg de N-BVT / 100 g = V x N x 14 x 100 (T + U)
Va x P
V = volume de HCL gasto na titulação N = normalidade da solução titulante 14 = equivalente grama do nitrogênio T = volume de TCA utilizado na homogeneização (10 a 50 mL) U = umidade da amostra em gramas Va = Volume do extrato analisado (2 mL) P = peso da amostra analisada (10 a 50 mL)
Preparo das soluções
Solução de Ácido Bórico de Conway
Pesou-se 5 g de acido bórico adicionando-se a 100 mL de álcool etílico e 300 mL
de água destilada. Após dissolução total, adicionou-se 5 mL do indicador de Tashiro.
63
Em seguida, adicionou-se lentamente solução de hidróxido de sódio 0,1 N até produção
de coloração rósea e completou-se o volume a 500 mL .
Indicador de Tashiro
Misturou-se volume por volume de solução de vermelho de metila a 0,2% em
álcool etílico e solução de azul de metileno a 0,1 % em água destilada.
Hidróxido de sódio 0,1N
Dissolveu-se 4 g de NaOH em água destilada, completando o volume a 1000 mL
e, para eliminar o gás carbônico, adicionou-se 1 a 2 g de clotero de bário.
Solução de Ácido Tricloroacético a 10%
Pesou-se 100g de ácido tricloroacético em béquer de 500 mL e adicionou-se
água destilada até total dissolução. Transferiu-se para balão volumétrico e completou-
se o volume com água destilada até 1000 mL.
Solução saturada de Carbonato de Potássio
Pesou-se 120 g de carbonato de potássio em béquer de 500 mL e adicionou-se
100 mL de água destilada, agitando-se até dissolução completa.
4.1.2.3 Percentual de cloretos
A quantificação do teor de cloretos foi realizada pelo método de Möhr, seguindo
os procedimentos descritos no Manual do LANARA (BRASIL, 1981).
Foram utilizados de 2 a 5 g da amostra anotando o valor numérico desta
pesagem, para ser empregado posteriormente na fórmula matemática de cálculo do
percentual de cloreto. Esta massa foi colocada em cadinho de porcelana para
carbonização em bico de Bunsen, e posteriormente em forno mufla a 550 °C para
incineração (obtenção de cinzas claras).
Objetivando facilitar a dissolução das cinzas, adicionou-se ao conteúdo do
cadinho duas a tres gotas de solução de Ácido Nítrico P.A. e água destilada quente
(1:9), preparada momentos antes de sua utilização, e 10 mL de água destilada quente.
Agitou-se com bastão de vidro o conteúdo do cadinho e filtrou-se em papel Whatman ®
para erlenmeyer de 250 mL. O cadinho e o filtro de papel foram meticulosamente
64
lavados com água destilada aquecida. Mensurou-se pH do filtrado, corrigindo-o para 8,0
com solução de hidróxido de sódio 0,1N.
Adicionou-se à solução filtrada 1 mL da solução de Cromato de Potássio
(K2CrO4) a 5% e titulou-se com solução de Nitrato de Prata (AgNO3) 0,1N até o
aparecimento da coloração vermelho tijolo.
O cálculo do percentual de cloretos foi feito com a utilização das variáveis V
(volume de AgNO3 0,1N gasto na titulação) e P (peso inicial da amostra) na fórmula que
também utiliza o fator de correção (f) e a normalidade (N) da solução de AgNO3 0,1N,
descrito a seguir:
% Cloretos = V x f x N x 0,0585 x 100
P
Preparo das soluções
Solução de Ácido Nítrico
Em gabinete de segurança, diluiu-se 1 mL de Ácido Nítrico concentrado em 9 mL
de água destilada quente. A solução foi utilizada imediatamente após o preparo, em
função da alta volatilidade do Ácido Nítrico.
Cromato de potássio 5%
Pesou-se 25 g de Cromato de potássio e diluiu-se em 500 mL de água destilada.
Solução de Nitrato de Prata 0,1N
A solução de nitrato de prata foi preparada e utilizada no dia de realização do
procedimento analítico sendo acondicionado em frasco envolto em papel alumínio. A
solução foi preparada em água destilada de acordo com a fórmula a seguir:
N = massa de Ag NO3
P.M. x V N = normalidade da solução P. M. = peso molecular do nitrato de prata V = volume da solução a ser preparada.
65
4.1.2.4 Atividade de água
Na avaliação da atividade de água fez-se uso do PawKit ® (Decagon ®) que
possui um sensor dielétrico de umidade e faz a leitura da atividade de água diretamente
da amostra.
Para este procedimento foi utilizado 5g da amostra, colocando-a cuidadosamente
no recipiente próprio do aparelho, cobrindo todo o fundo. Tivemos o cuidado para que a
amostra não passasse da metade da altura do recipiente, para evitar que o alimento
entrasse em contato com a célula dielétrica e o aparelho descalibrasse.
Depois de ligado o aparelho, a leitura foi feita automaticamente e, após tres
minutos, foi emitido um sinal sonoro que estabeleceu o fim da leitura. O resultado foi
observado no visor digital onde fica registrada a leitura da atividade de água da
amostra.
4.1.2.5 pH
A determinação do potencial hidrogeniônico foi realizada segundo a metodologia
oficial descrita no Manual do LANARA (BRASIL, 1981).
4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS
As amostras experimentais foram elaboradas por uma indústria localizada no
litoral norte do estado de São Paulo e inspecionada pelo Serviço Federal.
Nesta etapa do trabalho, foram realizados três processamentos tecnológicos de
anchovagem da sardinha (Sardinella brasiliensis), as quais foram acompanhadas
através de analises bacteriológicas e físico-químicas, desde a matéria prima até o fim
da fermentação.
Os processamentos realizados foram os seguintes:
A - Processamento tecnológico usual da empresa (Anexo 9.1.1) ;
B - Processamento tecnológico pelo qual o peixe é fermentado inteiro
(Anexo 9.1.2); e
C - Processamento tecnológico pelo qual o peixe é fermentado eviscerado
(Anexo 9.1.3).
66
Foram acompanhados três lotes de cada processamento, somando um total de
nove lotes, identificados como: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3.
As matérias primas utilizadas para o processamento dos nove lotes foram as
mesmas.
4.2.1 Processamento usual da empresa
No processamento usual da empresa (processamento A), a primeira etapa após
a seleção da matéria prima consiste na lavagem do pescado com água hiperclorada
(5ppm).
Em seguida, a sardinha lavada e, inteira, é disposta em barricas de plástico
rígido com capacidade para 250 kg de peixe, em camadas alternadas de sal grosso,
dando início à etapa da pré-salga. A primeira e última camada devem ser de sal, não
sendo adicionada água. A formação de salmoura ocorre a partir da água da própria
sardinha (Figura 13). O pescado permanece nestas barricas por período que varia de
cinco a dez dias, dependendo do percentual de gordura da sardinha e da demanda da
empresa.
Figura 13 - Barricas contendo as sardinhas no período de fermentação do produto.
Ao ser retirada da pré-salga, a sardinha é descabeçada e eviscerada
manualmente, com o auxílio de uma faca, e passa para a fase de fermentação. Nesta
etapa, o produto em processamento é colocado em outra barrica limpa da mesma forma
como na pré-salga (em camadas alternadas com o sal).
67
O período de fermentação do produto é de, no mínimo, 90 dias. Nesta fase, as
barricas ficam acondicionadas em salão com temperatura ambiente controlada a 25 °C
(Figura 14), e as salmouras são controladas em relação à concentração de sal (mínimo:
24 °Bé).
Figura 14 (A, B e C) - Salão com temperatura controlada onde é realizada a fermentação do produto (A). Destaque para os sensores de aferição da temperatura (B e C).
Seguindo o fluxograma de produção, após o período de fermentação, as
sardinhas são retiradas da salmoura e têm a pele extraída manualmente. Estas são
empilhadas e acondicionadas em caixas de polipropileno rígido e de paredes espessas,
especiais para a prensa. As caixas são colocadas na prensa (Figura 15) para a retirada
do excesso de salmoura e são submetidas à pressão de duas a seis toneladas por 20
minutos.
Figura 15 - Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura.
A B
C
68
Em seguida, é feita a filetagem do produto fermentado e os filés são
acondicionados nas embalagens. As embalagens são pesadas e recebem o óleo de
cobertura, sendo, por fim, fechadas a vácuo.
4.2.2 Processamento com peixe inteiro
O processamento tecnológico B (Anexo 9.1.2) difere do processamento usual da
empresa em relação à fase de pré-salga. Aqui a fase de pré-salga não é realizada.
Lava-se a matéria prima com água hiperclorada submetendo o produto inteiro a
fermentação e não sendo realizada a etapa de descabeçamento e evisceração. A
disposição do sal e da sardinha dentro das barricas limpas é feita da mesma forma
como descrito anteriormente, assim como o restante do processamento.
4.2.3 Processamento com peixe eviscerado
O processamento tecnológico C (Anexo 9.1.3) difere do processamento usual da
empresa (A) em relação à fase de pré-salga e do processamento B, em relação à
evisceração. Neste, a fase de pré-salga não é realizada, além da matéria prima lavada
ser colocada para fermentar totalmente eviscerada e descabeçada. A disposição do sal
e da sardinha dentro das barricas limpas é feita da mesma forma como descrito
anteriormente, assim como o restante do processamento.
4.2.4 Delineamento experimental
Os processamentos tecnológicos foram identificados com A, B e C. Em cada
processamento, foram realizadas três repetições: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3.
As amostras coletadas aleatoriamente pesavam, no mínimo, 500g para a
realização das análises bacteriológicas e físico-químicas.
A primeira coleta foi referente à matéria prima do processamento: o sal e a
sardinha fresca. Assim, foi possível avaliar a qualidade das matérias primas utilizadas
nos processamentos.
A segunda coleta foi realizada no dia em que as sardinhas do processamento
usual da empresa (A) foram retiradas da pré-salga. Nesta mesma data de coleta dos
lotes A1, A2 e A3, também foram coletadas amostras dos lotes B1, B2, B3, C1, C2 e C3. A
69
data desta coleta foi anotada e a partir dela foram colhidas amostras dos nove lotes de
15 em 15 dias, até completar 90 dias de fermentação (Apêndice 8.1). Junto com as
amostras foi enviada uma ficha contendo os dados de cada uma das amostras
(Apêndices 8.2 e 8.3).
4.2.4.1 Matérias-primas
As matérias primas foram coletadas e embaladas em saco plástico limpo e
lacrada em seladora á quente.
A amostra de sardinha não foi lavada antes da coleta e foi colocada em caixa de
polipropileno expandido, envolta por gelo e enviada ao Laboratório de Controle
Microbiológico no dia de chegada da sardinha à indústria. Segundo as informações
enviadas junto com as amostras, a sardinha, comprada de pescadores da região,
chegou à indústria com temperatura igual a 0,6°C.
A amostra de sal foi enviada a temperatura ambiente e tem origem em uma
salineira do Rio Grande do Norte.
4.2.4.1.1 Sal
Para avaliar a qualidade do sal foram realizadas somente análises
bacteriológicas. As análises realizadas foram: Enumeração de Coliformes totais e fecal,
isolamento e identificação de Salmonella sp., Contagem e identificação de
Staphylococcus coagulase positiva, Enumeração de Enterococcus sp. e Contagem
Total de bactérias Halófilas.
A contagem Total de bactérias Halófilas foi baseada na Instrução normativa n° 62
(BRASIL, 2003). E o meio utilizado foi o Bacto Agar Marine 22116 ® da Difco ®.
4.2.4.1.2 Sardinha fresca
A matéria prima foi avaliada, bacteriologicamente, segundo os métodos e
legislações já descritos anteriormente para os produtos adquiridos no mercado
varejista.
70
As análises físico-químicas realizadas para pescado fresco foram a quantificação
de histamina (métodos de CCD e Fluorimetria) e a quantificação de Bases Voláteis
Totais, como já descritos.
Os parâmetros físico-químicos utilizados para a sardinha fresca foram
determinados pela Portaria n° 185 de 13 de maio de 1997 (BRASIL, 1997b).
4.2.4.2 Produto em fermentação
As amostras coletadas dos produtos em fermentação foram embaladas junto
com a salmoura em sacos plásticos limpos. Os sacos foram lacrados em máquina
seladora a quente e acondicionados em potes de plásticos rígidos, com tampa e lacre.
Cada pote foi identificado com os respectivos lotes (A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3)
Os potes das amostras foram envoltos por folhas plásticas com pequenas bolhas
de ar e colocadas em caixa de papelão. A caixa com as amostras foi enviada para a
Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense via SEDEX ®.
4.2.4.2.1 Análises bacteriológicas
As análises bacteriológicas realizadas para o produto em fermentação foram as
mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja,
Isolamento e identificação de Salmonella sp., Enumeração de Enterococcus sp,
Enumeração de Coliformes Totais e Fecal (Escherichia coli) e Contagem e Identificação
de Staphylococcus coagulase positiva.
4.2.4.2.2 Análises físico-químicas
As análises físico-químicas realizadas para o produto em fermentação foram as
mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja,
Avaliação de Histamina (Método de Cromatografia em Camada Delgada e Método
Fluorimétrico), Análise da produção de Bases Voláteis Totais, Percentual de Cloretos,
Atividade de água e pH.
71
4.2.5 Tratamento estatístico dos resultados
Para o tratamento estatístico dos resultados obtidos no experimento, realizou-se
análise de variância em arranjo fatorial de três tratamentos por sete tempos, seguido de
teste de comparação entre médias (Tukey´s Studentized Range) com 5 % de
significância. Para tal, utilizou-se o pacote estatístico SAS (SAS Institute, 1985).
Para o tratamento estatístico da variável quantitativa histamina, utilizou-se o
Teste de Kruskal-Wallis para comparação dos tratamentos por não apresentar
distribuição normal.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seguir serão apresentados os resultados encontrados na presente pesquisa.
Entretanto, após longa e cuidadosa revisão bibliográfica sobre o mesmo tema, houve
grande dificuldade para discutir os resultados em função do reduzido número de
referências.
5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA
Os resultados bacteriológicos e físico-químicos obtidos nas 20 (vinte) amostras
de diferentes marcas, nacionais e importadas (Brasil, Itália, Marrocos, Perú e Argentina)
serão expostos e discutidos nos itens subseqüentes.
5.1.1 Análises bacteriológicas
Os resultados obtidos nas análises bacteriológicas podem ser observados na
tabela 1. Segundo a RDC n° 12 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL,
2001), no que se refere à análise qualitativa de Salmonella spp., 100% das amostras
analisadas encontram-se dentro do padrão estabelecido para as semiconservas de
pescado. Utilizando a mesma legislação como referência, os resultados das análises
para coliformes também se encontram adequados e, dentre as amostras analisadas,
somente uma apresentou resultado inadequado quando avaliada a presença de
Staphylococcus coagulase positivo.
73
Tabela 1 - Resultados referentes à contagem de coliformes totais e fecal (NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.
Amostra Coliforme
Total Fecal NMP/g
Staphylococcus Coagulase +
UFC/g
Salmonella spp.
Enterococcus spp. NMP/g
1 NR NR NR NR
2 Ausente 1,9 x 10 3 Ausente NR
3 Ausente Ausente Ausente NR
4 < 3 <3 Ausente Ausente 2,0 x 10
5 < 3 <3 7,0 x 10 2 Ausente 2,4 x 10 2
6 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3
7 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3
8 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3
9 Ausente Ausente Ausente > 1,1 x 10 3
10 <3 Aus Ausente Ausente Ausente
11 <3 Aus Ausente Ausente Ausente
12 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10
13 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10
14 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10 3
15 Ausente Ausente Ausente 7,0 x 10 4
16 Ausente Ausente Ausente Ausente
17 Ausente Ausente Ausente 7,0 x 10 4
18 <3 Aus 7,0 x 10 2 Ausente < 3
19 Ausente Ausente Ausente Ausente
20 Ausente Ausente Ausente 0,4 x 10 1
NR: Não Realizado
A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista pela RDC n° 12 (BRASIL,
2001). Entretanto, os resultados obtidos sugerem uma relação entre a produção de
histamina e a presença desta bactéria, a qual foi isolada em 76% das amostras nas
quais foram realizadas análises bacteriológicas. Gardini et al. (2001) sugerem que a
74
maior influência na formação de aminas biogênicas advem da atividade proteolítica do
Enterococcus spp. e das enzimas de descarboxilação presentes neste microrganismo.
Ao observar a tabela 1, é possível perceber que o crescimento bacteriano deste
microrganismo é bastante relevante.
5.1.2 Análises físico-químicas
Recordando o fato do produto em questão não possuir padrão de qualidade, foi
utilizada como parâmetro para avaliação das bases voláteis a portaria n° 185 (BRASIL,
1997b), que estabelece um limite de 30 mg N/100 g de amostra para o pescado fresco.
Na tabela 2, é possível observar que todos os resultados referentes às bases voláteis
estão acima do preconizado pela legislação supracitada.
A formação de níveis significativos de aminas biogênicas tem sido observada em
muitos alimentos nos quais ocorre o crescimento bacteriano de Enterococci (como
observado na tabela 1, estando presente em 76% das amostras). No entanto, existem
outros fatores que podem influenciar na formação de aminas biogênicas por estes
microrganismos tais com a temperatura, o pH e a concentração de sal (GARDINI et al;
2001).
Ao avaliar os resultados da presença de histamina obtidos através da técnica de
Cromatografia em Camada Delgada (SCHUTZ, CHANG e BJELDANES, 1976)
constatou-se a presença dessa amina biogênica em todas as amostras. Somado a este
fato, foi constatada a presença de outras aminas biogênicas em 75% das amostras,
caracterizando a possibilidade de potencialização da ação tóxica da histamina
(MÁRSICO, 2002).
Segundo a legislação européia (C.E., 2005), todos os valores determinados por
esta análise estariam dentro do preconizado, no entanto, esta legislação não faz
referências ao fato de outras aminas biogênicas potencializarem a ação intoxicante da
histamina, o que levaria à casos de intoxicação e/ou casos alérgicos em decorrência da
ingestão de menores concentrações.
Na Inglaterra, foram relatados casos com o desenvolvimento de sintomas em
indivíduos que consumiram pescados contendo concentrações pouco superiores a 50
75
ppm (BARTHOLOMEW et al.6 ,1987 apud LEHANE; OLLEY, 2000). Na tabela 2
observa-se que 90 % das amostras apresentaram valores maiores ou iguais a 50 ppm.
Tabela 2 - Resultados obtidos nas análises de Bases Voláteis Totais - BVT (mg N/100g), histamina (ppm), outras aminas biogênicas, pH, Atividade de água – Aa e cloretos (%) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.
Amostra Origem BVT
(mg N/100g)
Histamina(ppm)
Putrescina e
Cadaverina pH Aa
Cloreto %
1 Brasil 52,92 ≈100 Presente 5,17 0,68 10,9
2 Desconhecida 42,8 > 100 Presente 5,73 0,67 17,5
3 Perú 203,8 >> 100 Ausente 5,64 0,68 14,5
4 Perú 63,0 >> 100 Presente 5,31 0,66 14,5
5 Itália 108,4 >> 100 Presente 5,23 0,67 14,8
6 Itália 102,1 > 50 < 100 Presente 5,08 0,67 14,7
7 Itália 124,7 ≈ 100 Presente 5,32 0,67 14,7
8 Marrocos 99,5 >> 100 Ausente 5,49 0,67 16,1
9 Argentina 107,1 >20 < 50 Presente 5,55 0,55 14,7
10 Marrocos 80,3 >100 Presente 5,67 0,70 15,1
11 Argentina 113,4 >> 100 Presente 5,35 0,70 14,7
12 Brasil 88,2 > 100 Presente 5,37 - 12,4
13 Brasil 59,2 > 100 Presente 5,30 - 9,8
14 Brasil 71,8 >> 100 Presente 5,46 - 13,9
15 Perú 71,8 > 100 Ausente 5,40 - 13,0
16 Argentina 66,8 >> 100 Presente 5,55 - 15,7
17 Brasil 56,7 ≈100 Presente - - 13,9
18 Perú 59,2 ≈ 20 Ausente 5,54 - 13,0
19 Argentina 105,8 > 100 Presente 5,68 - 9,4
20 Brasil 65,5 > > 100 Ausente 5,19 - 14,0
> = maior que; >> = muito maior que; ≈ aproximadamente;
Segundo Suzzi e Gardini (2003), o pH pode ser o fator chave que influencia na
atividade de descarboxilação das enzimas formadoras de aminas biogênicas. A mais de
6 BARTHOLOMEW, B. A.; BERRY, P. R.;RODHOUSE, J. C.; GILBERT, R. J.. Scombrotoxic fish poisoning in Britain: Features of over 250 suspect incidents from 1976 to 1986. Epidemiology and Infection. v.99, p. 775-782, 1987.
76
setenta anos atrás, Koesseler et al.7 (1928), citados por Suzzi e Giardini (2003),
sugeriram que a formação de aminas biogênicas seria um mecanismo fisiológico das
bactérias em resposta ao meio ácido. Buncic et al.8 e Maijala et al.9, ambos em 1993 e
citados por Suzzi e Gardini (2003), afirmam que a alta produção de histamina pode
estar relacionada ao decréscimo inadequado do pH nos primeiros dias da fermentação
do produto.
Na tabela 2, pode-se observar que o pH apresentou-se ácido em 100% das
amostras avaliadas, com valores variando entre 5,08 e 5,73.
Os parâmetros físico-químicos citados (pH e percentual de cloretos) parecem
influenciar na formação de aminas biogênicas, fato também sugerido nos estudos
realizado por Gardini et al. (2001) com leite desnatado adicionado com diferentes
concentrações de cloreto de sódio, onde a produção de aminas biogênicas foi menor
quando a concentração de NaCl era maior. Além do mais, a produção de aminas
mostrou-se menor ainda na decorrência de menores valores de pH.
Entretanto, após analisar os valores de pH e percentual de cloreto,
demonstrados na tabela 2, não foi possível estabelecer a mesma relação sugerida por
Gardini et al. (2001) em peixes anchovados.
5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS
A seguir, serão apresentados os resultados das análises realizadas em amostras
coletadas a partir dos três processamentos tecnológicos, após tratamento estatístico
dos dados. Foi avaliado o comportamento dos dados entre os processamentos e dentro
de cada um destes.
7 KOESSELER, K. K.; HANKE,M. T.; SHEPPARD, M. S.. Production of histamine, tyramine, brochospastic and arteriospastic substance in blood broth by pure culture of microorganisms. Journal of Infectious Diseases. v.3, p. 363-377, 1928. 8 BUNCIC, S.; PAUNIVIC, L.; RADISIC, D.; VOJINOVIC, G. SMILJANIC, D.; BALTIC,M. Effects of gluconodeltalactone and Lactobacillus plantarum on the production of histamine and tyramine in fermented sausages. Intrnational Journal of Food Microbiology. v. 17, p. 303-309, 1993. 9 MAIJALA, R.; EEROLA, S.; AHO, M.; HIRN, J. The effect of GDL- induced pH degrease on the formation of biogenic amines in meat. Journal of Food Protection. v.56, p. 125-129, 1993.
77
5.2.1 Matérias-primas
Ao observar os resultados apresentados na tabela 3, pôde-se classificar a
matéria prima sardinha (S. brasiliensis) como adequada para a utilização nos
processamentos tecnológicos. Para tal, foi utilizada como base a Portaria n° 185 que se
refere ao Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL,
1997b).
Tabela 3 – Teor de Bases Voláteis Totais – BVT (mg de N/100g) e histamina (mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Fluorimetria (F) sardinha (S. brasiliensis) utilizados no processamento tecnológico de anchovagem.
Coleta BVT (mg de N/100g) CCD (ppm) F (ppm)
1ª 13,8 ND ND
De acordo com a RDC n° 12 (BRASIL, 2001), os resultados das análises
bacteriológicas realizadas com a sardinha (S. brasiliensis) apresentaram-se dentro do
padrão estabelecido, estando a matéria prima apta para utilização nos processamentos
tecnológicos estabelecidos.
O sal utilizado na elaboração do produto também se apresentou adequado para
uso, pois não houve crescimento bacteriano no que diz respeito à Salmonella spp.,
Staphylococcus coagulase positivo, Coliformes totais e fecal e Enterococcus spp..
5.2.2 Processamentos Tecnológicos A, B e C
A seguir serão apresentados os resultados das análises bacteriológicas e físico-
químicas realizadas nas amostras dos processamentos A, B e C.
5.2.2.1 Resultados das análises bacteriológicas
Ao longo do período de fermentação dos nove lotes, foram realizadas análises
bacteriológicas em amostras coletadas de 15 em 15 dias. Houve crescimento
bacteriano em algumas das análises. Na tabela 4 podem ser observados os resultados.
Houve o crescimento de Proteus spp., Shiguella spp., Escherichia spp.,
Klebsiella spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp..
78
Tabela 4 – Resultados das análises bacteriológicas realizadas nas amostras coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do período de 90 dias de fermentação do produto.
Dias de Fermentação
Lote
s an
alis
ados
0 15 30 45 60 75 90
A1 - - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
- - -
A2Proteus spp.
Shiguella spp. - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
- Citrobacter spp.Crescimento
não identificado
A3Proteus spp.
Shiguella spp. - - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
-
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
B1Proteus spp.
Shiguella spp. - - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
-
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
B2 - - - - - - -
B3Proteus spp.
Shiguella spp. - - - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.-
C1Pseudomona
s spp.
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
Proteus spp.
- - - - -
C2 - -
Escherichia spp.
Klebsiella spp.
- - -
C3 - - - - - Staphylococcus spp.
79
Alguns dos gêneros bacterianos citados podem estar envolvidos na formação de
histamina. Segundo trabalho realizado por Ababouch et al. (1991) foram isoladas 55
espécies bacterianas formadoras de histamina a partir de amostras de sardinha
(Sardinella pilchardus) estocadas em gelo e a temperatura ambiente. Dentre as
espécies isoladas, 51 pertenciam à família Enterobacteriaceae, estando algumas
implicadas na formação de histamina.
Fez-se o isolamento das espécies bacterianas acima citadas no meio de
Rambach ®, na fase de plaqueamento seletivo da metodologia utilizada para o
isolamento e identificação de Salmonella spp.. Sendo assim, não foi possível quantificar
estas espécies nas amostras. Rambach (1990) descreveu este meio de cultura para a
diferenciação da Salmonella spp. de outras espécies da família Enterobacteriaceae.
Alguns dos gêneros bacterianos isolados no presente trabalho são os mesmos
apresentados por Niven et al. (1981), que elaboraram um meio de cultura para a
detecção quantitativa de bactérias formadoras de histamina no qual foram isolados:
Proteus morganii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Enterobacter cloacae, Edwardsiella sp. e Vibrio spp.
Leitão et al. (1983), estudando a ocorrência de bactérias formadoras de
histamina em pescado de origem marinha, constataram a presença de P. morganii, P.
rettgeri, Vibrio spp. Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.,
Enterobacter spp. e Klebsiella spp. como algumas das espécies responsáveis pela
formação da amina em questão.
Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentação, houve crescimento no
meio de Baird Parker® suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificação
da espécie foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: catalase, coagulase,
DNase, Termonuclease e oxidação e fermentação da glicose, além da verificação das
características morfotintoriais pelo método de Gram.
Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentação, houve crescimento no
meio de Baird Parker® suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificação
da espécie foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: catalase, coagulase,
DNase, Termonuclease e oxidação e fermentação da glicose, além da verificação das
características morfotintoriais pelo método de Gram.
80
Segundo o Manual Bergey (1994), o Staphylococcus coagulase positivo é
caracterizado por promover resultados positivos em todas as provas bioquímicas acima
citadas, menos a da fermentação da glicose, que pode apresentar-se negativa, e possui
característica morfotintorial de coco Gram positivo.
Na tabela 5, estão expostos os resultados obtidos das referidas provas
bioquímicas sendo possível verificar que a cultura testada apresentou características
referentes ao gênero Staphylococcus, não sendo o S. aureus.
Tabela 5 – Resultados das provas bioquímicas realizadas em colônias suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird Parker para o Caldo BHI.
Provas bioquímicas
Característica Morfotintorial (método de
Gram) Catalase Dnase
Oxidação da
glicose Fermentação
da glicose Termo-
nuclease Coagulase
Resultado Cocos G+ positivo negativo positivo positivo negativo negativo
Usando como base a RDC nº 12 (BRASIL, 2001), na qual é estabelecido o valor
limítrofe máximo de 5 x 102 UFC/g da amostra para presença de estafilococos, a
amostra C3 apresentou valor inferior estando dentro do padrão estabelecido.
5.2.2.2 Resultados das análises físico-químicas
Na tabela 6, estão registrados os valores médios obtidos das análises físico-
químicas realizadas com os três processamentos tecnológicos. Pode-se observar que
no tempo 1, data de retirada do produto da pré-salga, o valor de BVT mais baixo foi de
18,6 ± 16,9 mg de N/100 g da amostra, referente ao processamento em que a
fermentação ocorreu sem a presença das vísceras, e no tempo 7, após 90 dias de
fermentação, o maio valor de BVT obtido foi de 62,1 mg de N/100 g do processamento
usual da empresa. Ao longo dos três processamentos realizados, os valores de BVT
foram sempre crescentes.
Os resultados da análise de BVT se apresentam de acordo com os resultados
obtidos por Oetterer et al. (2003) em pesquisa realizada no monitoramento do
anchovamento de sardinhas, quando o valor inicial de BVT apresentou-se em 19,32 mg
81
de N/100 g da amostra (sardinha fresca) e o final 56,79 mg de N/ 100 g da amostra,
após 60 dias de fermentação.
Avaliando o comportamento das Bases Voláteis nos três processamentos,
percebe-se que houve variação estatística significante somente ao fim dos 90 dias de
fermentação. Neste momento, os processamentos A e B obtiveram maiores valores de
BVT, fato ocorrido em função da presença das vísceras, pois no trato digestivo há
presença de uma microbiota que influi na decomposição do pescado.
Tabela 6 – Valores médios de N-BVT (mg N/100 g) obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do método de microdifusão em placa de Conway, por 90 dias.
Processamentos A B C
0 23,1± 16,9 a 19,7 ± 16,9 a 18,6 ± 16,9 a
15 23,5 ± 12,7 a 17,6 ± 12,7 a 15,1 ± 12,7 a
30 29,0 ± 8,2 a 29,0 ± 8,2 a 23,9 ± 8,2 a
45 32,3 ± 7,7 a 33,6 ± 7,7 a 30,2 ± 7,7 a
60 39,9 ± 16,3 a 26,5 ± 16,3 a 26,9 ± 16,3 a
75 40,3 ± 15,7 a 31,1 ± 15,7a 34,4 ± 15,7 a
Dia
s de
fe
rmen
taçã
o
90 62,1 ± 17,3 a 50,8 ± 17,3 ab 39,1 ± 17,3 b
Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).
A presença do BVT é resultante do efeito de várias transformações, originando-
se da degradação do OTMA e dos aminoácidos livres por mecanismos diferentes, entre
estes a decomposição pelas bactérias (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).
Oetterer et al. (2003) compararam o processo de fermentação da sardinha (S.
brasiliensis) com e sem vísceras e apresentaram valores bastante semelhantes aos
demonstrados na tabela 9.
Estes resultados apresentaram comportamento análogo ao apresentado por
Dissaraphong et al. (2005), que avaliaram a formação de BVT durante a fermentação
de pescado e obtiveram maiores valores deste parâmetro em presença das vísceras.
Killine et al. (2006) apresentaram valores de BVT superiores ao exposto no
presente trabalho, chegando a 210,58 mg de N em 100 g da amostra ao fim do período
da fermentação. No entanto, o comportamento deste parâmetro foi o mesmo, obtendo
valores crescentes na medida em que o período de fermentação avançava.
82
Os valores de pH, considerando todos os tratamentos, variaram entre 5,54 a
5,93. Inicialmente o valor do pH, no processamento A, foi de 5,67, sofrendo queda até
5,57 quando o produto estava com 45 dias de fermentação. Após este período o pH
aumentou, gradativamente, para 5,93 ao final dos 90 dias de fermentação. O
comportamento destes dados ocorreu da mesma forma como apresentado por Oetterer
et al. (2003).
Tabela 7 – Valores médios de pH obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias.
Processamentos A B C
0 5,67 ± 0,14 a 5,54 ± 0,14 a 5,61 ± 0,14 a
15 5,60 ± 0,17 a 5,56 ± 0,17 a 5,56 ± 0,17 a
30 5,57 ± 0,16 a 5,63 ± 0,16 a 5,56 ± 0,16 a
45 5,64 ± 0,11 b 5,86 ± 0,11 a 5,71 ± 0,11 b
60 5,76 ± 0,14 a 5,81 ± 0,14 a 5,84 ± 0,14 a
75 5,85 ± 0,21 a 5,79 ± 0,21 a 5,80 ± 0,21 a
Dia
s de
fe
rmen
taçã
o
90 5,93 ± 0,23 a 5,84 ± 0,23 a 5,92 ± 0,23 a
Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p< 0,05).
Estatisticamente, as variaões dos valores de pH foram significantes somente aos
45 dias de fermentação.
Os valores médios de pH no processamento B variaram entre 5,54 e 5,86, no
entanto, houve inversão no comportamento do pH quando comparado com o
processamento A. Inicialmente, este parâmetro apresentou valor de 5,54 e foi crescente
até 60 dias de fermentação, quando chegou ao valor máximo de 5,86. Em seguida,
houve ligeiro decréscimo do pH para 5,79 (75 dias de fermentação), chegando ao pH
final de 5,84.
No processamento C, a variação entre o pH inicial e o final foi amaior, estando
entre 5,61 e 5,92. Inicialmente, o pH foi de 5,61 caindo par 5,56 após 15 dias e
aumentando gradativamente até 5,84 aos 60 dias de fermentação. Com 75 dias de
fermentação, houve queda do pH sem significância, seguida de aumento para 5,92 ao
fim de 90 dias de fermentação.
83
Houve variação estatística para os valores de Aa encontrados no processamento
A, como mostra a tabela 8. Alguns dos valores de Aa registrados estão abaixo do
esperado para o produto fermentado em solução saturada, como demonstra Jay (2005),
que relata valores de 0,75 para produtos nesta condição.
Tabela 8 – Valores médios de Aa obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do aparelho PawKit ®, por 90 dias.
Processamentos A B C
0 0,73 ± 0,01 a 0,74 ± 0,01 b 0,75 ± 0,01 c 15 0,74 ± 0,01 a 0,74 ± 0,01 a 0,75 ± 0,01 b
30 0,75 ± 0,02 a 0,75 ± 0,02 b 0,74 ± 0,02 a
45 0,72 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a
60 0,71 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a 0,74 ± 0,02 a
75 0,72 ± 0,01 b 0,73 ± 0,01 ba 0,74 ± 0,01a
Dia
s de
fe
rmen
taçã
o
90 0,72 ± 0,01 b 0,73 ± 0,01 ba 0,74 ± 0,01a
Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).
O percentual de cloreto não apresentou diferença estatística (p>0,05) ao longo
de todo o período de fermentação, nos três processamentos tecnológicos, como pode
ser observado na tabela 9, a seguir:
Tabela 9 – Valores médios de cloreto (%) obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias.
Processamentos A B C
0 15,80 ± 5,79 a 18,17 ± 5,19 a 16,37 ± 5,19 a
15 18,17 ± 2,67 a 17,13 ± 2,67 a 16,26 ± 2,67 a
30 15,87 ± 2,09 a 17,70 ± 2,09 a 18,10 ± 2,09 a
45 18,13 ± 3,25 a 18,73 ± 3,25 a 18,40 ± 3,25 a
60 17,78 ± 0,95 a 18,00 ± 0,95 a 17,60 ± 0,95 a
75 16,90 ± 3,07 a 18,80 ± 3,07 a 18,36 ± 3,07 a
Dia
s de
fe
rmen
taçã
o
90 15,65 ± 4,75 a 16,90 ± 4,75 a 18,87 ± 4,75 a
Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).
Após extensa revisão bibliográfica, não foi possível encontrar resultados de
pesquisas que avaliassem a formação de histamina ao longo da fermentação de
produtos derivados do pescado.
84
O Seafood Network Information Center (centro de informações criado pela
Universidade da Califórnia) apresenta parâmetros sobre fermentação e salga de peixes
e seus derivados. Entretanto, dentre os parâmetros expostos não está prevista a
quantificação de histamina como um procedimento analítico necessário (TOM, 2007).
Na tabela 10, observa-se o comportamento dos valores médios da concentração
de histamina nos diferentes processamentos tecnológicos elaborados, dando destaque
aos valores mínimos e máximos encontrados em cada processamento.
Tabela 10 - Ordenação média das concentrações de histamina (ppm) nos processamentos tecnológicos A, B e C testados e seus respectivos valores mínimos e máximos, sendo a DMS = 4,58.
Concentração de histamina (ppm) Processamentos
A B C
Mediana 11,0 a 6,4 b 1,8 c
Valor Mínimo 0,0 0,0 0,0
Valor Máximo 24,8 197,6 43,3
Medianas na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).
Os valores mínimos encontrados nos três processamentos ocorreram em função
da utilização de matéria prima de boa qualidade. Mas quando observamos os valores
máximos ocorridos, percebe-se que houve uma variação muito elevada dos valores.
Estes intervalos demonstram que a distribuição estatística dos dados da concentração
de histamina não é normal (Curva de Gauss).
Estatisticamente, houve diferença significativa entre os processamentos
tecnológicos, no que se refere à quantificação de histamina.
O processamento A, apesar de ter apresentado o valor mais elevado na mediana
(11,0 ppm), foi o que apresentou menor intervalo dos dados entre a mínima (0,0 ppm) e
a máxima (24,8 ppm). Já o processamento B apresentou o valor máximo (197 ppm)
mais elevado, e mediana (6,4 ppm) inferior ao processamento A. Este elevado valor
está relacionado com o fato deste processamento conter vísceras ao longo de todo o
período de fermentação do produto, possibilitando a presença de bactérias formadoras
85
de histamina, presentes no trato intestinal, víceras e brânquias, como relatam Ogawa e
Maia (1999) e Leitão (1983).
O processamento C apresentou o menor valor da mediana (1,8 ppm), no entanto
o valor máximo encontrado foi superior ao mesmo dado encontrado no processamento
A, lembrando que foi realizada a “toillete” e evisceração da sardinha (S. brasiliensis)
antes do período de fermentação.
A tabela 11 contém os valores médios dos lotes de cada processamento onde
pode ser observado o comportamento da concentração de histamina ao longo do
período de fermentação do produto. Houve a presença de histamina em valores
crescentes ao longo de todos os períodos de fermentação.
No processamento A, a média da concentração de histamina nos lotes (A1, A2 e
A3) apresentou valor inicial médio 2,73 ppm e chegando a 21,73 ppm ao fim de 90 dias
de fermentação.
A histamina foi observada no processamento B em valores médios (B1, B2 e B3)
crescentes variando entre 2,13 ppm e 90,10 ppm. Até 60 dias de fermentação, o
produto apresentou 7,93 ppm de histamina. Em 15 dias este valor foi 2,5 vezes maior
(18,65 ppm) e nos 15 dias finais da fermentação a concentração de histamina
aumentou 4,8 vezes chegando a 90,1 ppm de histamina.
Tabela 11 – Concentrações médias de histamina (ppm) dos três lotes de cada processamento tecnológico estudado, ao longo do período de fermentação da sardinha (S. brasiliensis).
Concentração de histamina (ppm) Processamentos
A B C 0 2,73 2,13 0,00 15 4,87 4,87 0,60 30 7,93 6,40 1,20 45 9,48 7,93 1,8 60 14,07 7,93 1,80 75 14,07 18,67 11,00
Dia
s de
fe
rmen
taçã
o
90 21,73 90,10 32,50
Inicialmente, no processamento C, não foi determinada a presença de histamina
na amostra, havendo, de forma lenta, aumento pouco significativo da concentração
desta amina biogênica até a 5ª coleta. Ao fim de 60 dias de fermentação, a
86
concentração média (C1, C2 e C3) de histamina era de 0,80 ppm, aumentando para 11
ppm aos 75 dias de fermentação. Em 15 dias, a concentração de histamina quase
triplicou, chegando ao fim de 90 dias com 32,5 ppm.
Observando os dados, no que se refere à concentração de histamina ao fim de
90 dias de fermentação, percebe-se que o produto contém concentrações desta amina
em valores que podem causar reações adversas nos indivíduos que consumirem este
produto, lembrando que a resposta fisiológica à presença da histamina é idiossincrásica
e não totalmente elucidada (LEHANE; OLLEY, 2000).
Na Figura 16 pode ser observado o comportamento da concentração média de
histamina dos diferentes processamentos elaborados durante o período de fermentação
através de um Plano Cartesiano.
Concentração de histamina durante o período de maturação em parte por
milhão (ppm)
02040
6080
100
0 15 30 45 60 75 90
Dias
ppm
ABC
Figura 16 – Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores médios da concentração de histamina dos três lotes de cada processamento tecnológico trabalhado.
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES
Ao avaliar a qualidade dos peixes anchovados comercializados no mercado
varejista, despertou-se grande preocupação com relação à presença de histamina, pois
esta ocorreu em elevadas concentrações. Este fato procede para os produtos nacionais
e importados.
Ao avaliar os processamentos tecnológicos, o processamento usual da empresa
com a qual se trabalhou apresentou melhor resultado, em função da baixa
concentração de histamina ao fim do processo de fermentação, não havendo a
necessidade de adequação do processamento.
No entanto, devido ao isolamento de bactérias suspeitas de estarem envolvidas
na formação de histamina, acredita-se que possam existir outros procedimentos que
determinem a melhora do produto final, para tanto, seriam necessários mais estudos
específicos.
Mais estudos sobre este processamento tecnológico são necessários pois ao
observar os resultados da primeira etapa do presente trabalho, no que diz respeito à
concentração de histamina, confrontando-os com os resultados da mesma variável na
segunda etapa, percebe-se que há uma diferença significativa entre os valores. Em
face disto, acredita-se que o processo de produção de histamina continue no produto
pronto, sendo necessário acompanhar o produto ao longo de sua validade comercial
para avaliação, até expirar a data da validade.
Em paralelo ao acompanhamento da formação de histamina no produto pronto,
sugere-se que sejam realizadas mais análises bacteriológicas na tentativa de identificar
a presença de uma bactéria ácidolática que pode estar envolvida na formação da
histamina, o Tetragenococcus muriaticus.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABABOUCH, L.; AFILAL, M. E.; RHAFIRI, S.; BUSTA, F.F. Identification of histamine forming bacteria isolated from sardine (Sardina pilchardus) stored in ice and at ambient temperature (25 ºC). Food Microbiology, v.8, p. 127-136, 1991.
AMSON G. V. ; HARACEMIV S. M. C.; MASSON M. L. Levantamento de dados epidemiológicos relativos à ocorrências/ surtos de doenças transmitidas por alimentos (dtas) no estado do paraná – brasil, no período de 1978 a 2000 disponível em: http://www.editora.ufla.br/revista/30_6/art16.pdf. Acessado em: 3 de setembro de 2007.
ANTILA, P. On the formation of biogenics amines in cheesemaking. Kieler Milchwirtsch, Forschungsber. v. 35, p. 373-375,1983.
AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. Association of Offitial Analytical Chemists: Arlington, VA. 17 ed., 2002.
BEIRÃO, L. M. Parâmetros de avaliação da fermentação de sardinha (Sardinella brasiliensis) no processo de anchovagem. São Paulo, 1976. 101 p. Dissertação (Tecnologia de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de Alimentos Agrícola, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 1976.
BRANDÃO, V. História das Conservas. Disponível em: http://correiogourmand.com.br/ info_culturagastronomica_11.htm. Acessado em: 16 de novembro de 2007.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária (LANARA). Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II – Métodos Físico-Químicos. Brasília, DF, 1981.
. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Decreto número 30.691 de 29 de março de 1952, alterado pelos decretos número 1255 de 25 de julho de 1962, número 1.236 de 02 de setembro de 1994, número 1812 de 08 de fevereiro de 1996 e número 2.224 de 04 de junho de 1997.Aprova o novo Regulamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal - R.I.I.S.P.O.A. Departamento Nacional de Inspeção de Produtos de Origem Animal. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 1997a.
89
. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria n° 185 de 13 de maio de 1997 aprova o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (inteiro e eviscerado). Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 1997b.
. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC nº 12 de 2 de janeiro de 2001.
. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de 2003. Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água, Brasília, DF, 2003.
BOVER-CID, S.; HUGAS, M.; IZQUIERDO-PULIDO, M.; VIDAL-CAROU, M. C. Amino acid-descarboxylase activity of bactéria isolated from fermented pork sausages. International Journal of Food Microbiology. v. 66, p.185-189, 2001.
CAMACHO, N. M.; MARINI, P.; ARMAS, R. D. de; RIBEIRO, G. A.; TESSMANN, C. Determinação de Staphylococcus coagulase positiva e de indicadores higiênico-sanitários em amostras de queijo ralado. Disponível em: http://www.ufpel.edu.br/xiiicic/arquivos/CB_00594.rtf. Acessado em: 24 de setembro de 2007.
CAMARGO, A. C. Conservação de Alimentos. Disponível em: http://www.cena.usp.br/irradiacao/cons_alim.html. Acessado em: 16 de novembro de 2007.
CARDONHA, A. M. S.; CASIMIRO, A. R. S.; Vieira, R. H. S. F. Identificação de bactérias psicotróficas em caudas de lagosta, durante o processo industrial com tripolifosfato de sódio. Higiene Alimentar, v. 8, n. 31, p. 29-34, 1994.
CARMO, R. P. Controle de qualidade da salmoura utilizada na produção de conserva de pescado. Niterói, 1991.113 p. Disseração (Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal) – Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 1991.
C.E. (Comunidade Européia). Regulamento (CE) Nº 2073/2005 da Comissão de 15 de novembro de 2005. Relativo à critérios microbiológicos aplicáveis aos gêneros alimentícios. Jornal Oficial da União Européia. L.338.
CONSTANTINIDO, G. A saúde do pescado depende diariamente da saúde do ambiente. Higiene Alimentar, v. 8, n. 32, p. 5-6, 1994. Apresentado no 1º Seminário de Vigilância Sanitária Pesqueira: Qualidade do Pescado. São Paulo, 1994.
CONTRERAS – GUZMÁN, E. S. Bioquímica de pescado e derivados. Jaboticabal: FUNEP, 1994. 409 p.
90
CORREIO GOURMAND. História da conservação de alimentos. Disponível em: http://correiogourmand.com.br/info_culturagastronomica_12.htm Acessado em: 16 de novembro de 2007.
DISSARAPHONG, S.; BENJAKUL, S.; VISESSANGUAN, W.; KISHIMURA, H. The influence of storage conditions of tuna víscera before fermentation on the chemical, physical and microbiological changes in fish sauce during fermentation. Bioresource Technology. Disponível em: www.sciencedirect.com. Acessado em: 24 de setembro de 2007.
DOMING, K.J.; MAYER, H.K.; KNEIFEL, W. Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp.. 1. Media for isolation and enumeration. International Journal of Food Microbiology. v. 88, p. 147-164, 2003.
DOYLE, M. P.; CLIVER, D. O. Salmonella. In: CLIVER, D. O. Foodborne Diseases. San Diego: Academic Press, Inc. 1990. 392 p. Capítulo 11, p.186-204.
FDA. Fish and Fisheries Products Hazards and Controls Guidance: Scombrotoxin (Histamine) Formation (A Chemical Hazard). Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov/~comm/haccp4g.html. Acessado em: 13 de setembro de 2007, 2007a.
____. Bacteriological Analytical Manual Online Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4.html Acessado em: 13 de setembro de 2007, 2007b.
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Editora Atheneu, 1996, 182 p.
FRANZ, C. M. A. P.; STILES, M. E.; SCHLEIFER, K. H.; HOLZAPFEL, W. H. Enterococci in foods – a conundrum for food safety. International Journal of Food Microbiology. v. 88, p.105-122, dez, 2003.
FUJII, T.; KURIHARA, K.; OKUZUMI, M. Viability and histidine descarboxylase activity of halophilic histamine-forming bacteria during frozen storage. Journal of Food Protection, v. 57, p. 611-613, 1994.
GARDINI, F.; MARTUSCELLI, M.; CARUSO, M. C.; GALGANO, F.; CRUDELE, M.A.; FAVATI, F.; GUERZONI, M.E.; SUZZI, G. Effects of pH, temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of Enterococcus faecalis. International Journal of Food Microbiology. n. 64, p. 105 –117, 2001.
GIRAFFA, G. Enterococci from foods. FEMS Microbiology Reviews. v.26, p. 163-171, 2002.
91
GOVERNO DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO. Secretaria de Agricultura, Pesca, Pecuária e Abastecimento. Decreto n° 38.757 de 25 de janeiro de 2006. Aprova o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal do Estado do Rio de Janeiro – RIISPOA/RJ. Rio de Janeiro, RJ, 2006.
GÖKUĜLU, N. Changes in biogenic amines during maturation of sardine (Sardina pilchardus) marinade. Fisheries Science. v. 69. p. 823-829, 2003.
HALÁSZ, A.; BARÁTH, A.; SIMON-SARKADI, L.; HOLZAPFEL, W. Biogenic amines and their production by microrganinms in food. Trends of Food Science and Thechnology. v.5. p. 42-48, 1994.
HAGLER, L. C. M.; HAGLER, A. N. Microbiologia Aquática. In: ROITMAN, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de microbiologia: volume 2. São Paulo: Editora Manole, 1991. 126 p. Capítulo 4. p. 83-102.
HARRIGAN, W. F. Laboratory Methods In Food Microbiology. 3. ed. San Diego: Academic Press, 1998. 532 p.
HUGAS, M.; GARRIGA, M.; AYMERICH, M. T. Functionalty of enterococci in meat products. International Journal of Food Microbiology, v.88, p. 223-133, 2003.
HUSS, H. H. Garantia da Qualidade dos produtos da pesca. Roma: FAO, 1997. 176 p.
ICMSF. APPCC. Na qualidade e segurança microbiológica de alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1997, 377 p.
IBAMA. Instituto Brasileiro do meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis. O defeso da sardinha no litoral sudeste e sul do Brasil. Disponível em: http://www.ibama.gov.br/cepsul/index.php?id_menu=137&id_arq=5. Acesso em: 14 de agosto de 2007. 2007 a.
______. Instituto Brasileiro do meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis. Definidos os período de defeso da sardinha até 2009. Disponível em: http://www.ibama.gov.br/novo_ibama/paginas/materia.php?id_arq=4626. Acessado em: 19 de junho de 2007. 2007 b.
JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 711 p.
KILINE, B.; CAKLI, S.; TOLASA, S.; DINCER, T. Chemical, microbiological and sensory changes associated with fish sauce processing. European Food Research Technology, n. 222, p. 604-613, 2006.
KLEIN, G. Taxionomy, ecology and antibiotic resistence of enterococci from foods and the gastro-intestinal tract. International Journal of Food Microbiology. v.88, p 123-131, 2003.
92
KUDA, T.; MIHARA, T.; YANO,T. Detection of histamine and histamine-related bacteria in fish-nukazuke, a salted and fermented fish with rice-bran, by simple colorimetric microplate assay. Journal of Food Control. 2006. Disponível em: www.elsevier.com/locate/foodcont. Acessado em: 20 de maio de 2006.
KUHN; D. M.; LOVENBERG, W. Tyramine in mine and beer. Lancet, v. 1, p. 1879, 1982.
LEHANE, L.; OLLEY, J. Review: Histamine fish poisoning revisted. International Journal of Food Microbiology. v. 58, p 1-37, 2000.
LEITÃO, M. F. F.; BALDINI, V. L. S.; UBOLDI EIROA, M. N.; DESTRO, M. T. Bactérias produtoras de histamina em pescado de origem marinha. Coleção ITAL. v. 13, p. 83-98, 1983.
LUDORFF W.; MEYER,V. El pescado y los productos de la pesca. 2. ed. Editora Acribia: Zaragoza,1978. 342 p.
MANUAL BERGEY. Gram-positive cocci. In: Bergey´s Manual os determinative bacteriology. 9 ed. Balltmore: Editora Willians e Wilkins, 1994. 784 p. Cap. 17. p. 527-558.
MARINÉ-FONT, A.; VIDAL-CAROU, M. C.; IZQUIERDO-PULIDO, M.; VECIANA-NOGUÉS,M. T. Aminas biógenas en alimentos: unos microcomponentes de interés múltiple. Rev Esp Nutr Comunitária. v.1 p.138-141, 1995.
MARSIC0, E. Apostila de Tecnologia de Alimentos – pescados. Colégio Brasileiro de estudos Sistêmicos, 2002. 190p.
MERCK, 2002, modificado por: FRANCO, R. M.; MANTILLA, S. P. S. Escherichia coli em cortes de carne bovina (acém): avaliação de metodologia e sensibilidade de antimicrobianos aos sorovares predominantes. XIV Seminário de Iniciação Científica e Premio UFF Vasconcelos Torres de Ciência e Tecnologia, 2004. 08-12 de novembro de 2004 – CD – 1º Lugar na área de Ciências Agrárias.
____________, modificado por: FRANCO, R. M.; LEITE, A. M. O. Enumeração e identificação de Enterococcus spp. e cepas de Escherichia coli patogênico em coxas de frango e estudo de atividade antimicrobiana das cepas isoladas. XV Seminário de Iniciação Científica e Premio UFF Vasconcelos Torres de Ciência e Tecnologia, 2005. 07-11 de novembro de 2005 – CD – Classificado entre os melhores trabalhos científicos da área de Ciências agrárias.
MERCK, Microbiology Manual, Berlin. Germany, 2002. 407 p.
NIVEN, C. F.; JEFREY, M. B.; CORLETT JR., D.A. Differential plating medium for quantitative detection os histamine-forming bacteria. Applied and Enviromental Microbiology. v.4, n.1, p.321-322, 1981.
93
NOVOTNY, L.; DVORSKA, L.; LORENCOVA, A.; BERAN, V.; PAVLIK,I. Fish: a potencial source of bacterial pathogens for human beings. Veterinárni Medicína, República Tcheca. v. 49, n. 9, p. 343-358, set. 2004.
OETTERER, M. Produtos fermentados de pescado. In: OGAWA, M.; MAIA, E. L. Manual de pesca: ciência e tecnologia do pescado. São Paulo: Livraria Varela, 1999. 430 p. seção 16.9, p. 353-354.
OETTERER, M.; PERUJO, S. D. Tecnologia tradicional de bioconversão do pescado – anchovagem. I Worckshop Brasileiro em Aproveitamento de Sub-produtos do Pescado. Universidade do Vale do Itajaí, 04-05 de dezembro de 2003, Itajaí – SC, 2003.
OETTERER, M.; PERUJO, S. D.; GALLO, C. R.; ARRUDA, L. F.; BORGUESI, R.; CRUZ, A. M. Monitoring the sardine (Sardinella brasiliensis). Fermentation process to obtain anchovies. Sciencia Agrícola, v. 60, n.3, p. 511-517, Jul/Set, 2003.
OETTERER, O processo de fermentação do pescado (Anchovamento). USP/ ESALQ. LAN.662. Disponível em: www.esalq.usp.br Acesso em: 01 de outubro de 2005.
OGAWA, M.; MAIA, E. L. Manual de pesca: ciência e tecnologia do pescado. São Paulo: Livraria Varela, 1999. 430 p.
OZKAYA, F. D.; AYHAN, K.; VURAL, N. Biogenic amines produced by Enterobacteriaceae isolated from products. Meat Science, v.58, p.163-166, 2000.
PAN, B.; JAMES, D. Histamine in marine products: production by bacteria, measurement and prediction of formation. FAO Fisheries Technical paper 256, 1985.
PARDI, M. C. et al. Ciência, Higiene e Tecnologia da Carne. 2ª ed.rev. Goiânia: Editora UFG, 2001. v. 2
PIGNATO, S.; MARINO, A. M.; EMANUELE, M. C.; IANNOTA, V.; CARACAPPA, S.; GIAMMANCO, G. Valuation of new culture media for rapid detection and isolation of Salmonellae in foods. Applied and Environmental Microbiology. v. 61, n. 5, p. 1996-1999, 1995.
PINTO, F. S. T. Bactérias halófilas. Serviço Brasileiro de Respostas Técnicas. Disponível em: http:// www.sbrt.ibict.br. Acessado em: 31 e agosto de 2007.
RAMBACH, A. New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. from Proteus spp. and other enteric bacteria. Applied and Environmental Microbiology. Jan. p. 301-303, 1990.
REIS, M.C.; CHAVES, L. A produção de sal. Disponível em: http://www.naturlink.pt/ canais/Artigo.asp?iArtigo=1820&iCanal=1&iSubCanal=3812&iLingua=1. Acessado em: 14 de novembro de 2007.
94
ROSSANO, L.; MASTRANGELO, LUNGARO, N; RICCIO, P. Influence os storage temperature and freezin time on histamine level in the European anchovy Engraulis encrasicholus. (L., 1958): A study by capillary eletrophoresis. Journal of Cromatografy B. jan. v. 830. n. 1. p. 161-164, 2006.
SALINA DIAMANTE BRANCO Ltda. Produtos e processos. Disponível em : http://www.salbrasil.com.br/produtos.php. Acessado em: 15 de agosto de 2007.
SANCHES – CASCADO, S.,P. Estudio de alternativas para la evaluación de la frescura y la caloidad del boquerón ( Engraulis encrasicholus) y sus derivados. Barcelona, 2005. 271 p. Tese (Programa de Doctorado Nutrición, Tecnilogía e Higiene de los Alimentos) – Faculdad de Farmácia, Universitat de Barcelona, Barcelona, 2005.
SANTO, M. L. P. E; BEIRÃO, L. H.; SANT’ANNA, E.; DAMIAN, C.; FRANCO, B. L. Avaliação da atividade bacteriocinogênica do Lactobacillus sakei na fermentação da sardinha verdadeira (Sardinella brasiliensis) utilizando glicose como carboidrato fermentecível. B. Ceppa. V. 21, n. 1, p. 83-98, jan./jun. Curitiba, 2003.
SAS Institute. SAS ® User´s Guide: SAS Institute Inc. Cary, 1985. 959 p.
SATO, T.; FUJII, MASUDA, T.; OKOZIMU, M. Changes in the numbers of histamine-metabolic bactéria and histamine content during storage of common meckerel. Fish science, v. 60, p. 299-302, 1994.
SCHUTZ, D. E.; CHANG, G. W.; BJELDANES, L. F. Rapid thin layer chromatografic method for the detection of histamine in fish products. Chemical indexes. Departement of Nutricion Science; University of Califórnia Berkeley,1976.
SETOR 1. Salga. Disponível em: http://www.setor1.com.br/pescados/sal_gas.htm. Acessado em: 18 de novembro de 2007.
SHALABY, R. A. Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Research International. v. 29, n.7, p. 675-690, 1996.
SIKORSKI, Z. E. Tecnologia de los productos del mar: recursos, composicion nutritiva y conservacion. Editora Acribia: Zaragoza,1990. 330 p.
SUBBURAY, M.; KARUNASAGAR, I. Incidence os histamine-descarboxilation bactéria in fish and market environs. Food Microbiology. v. 1, p. 263-267, 1984.
SUZZI, G.; GARDINI, F. Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. International Journal of Food Microbiology. n. 88, p. 41-54, 2003.
TAYLOR, S. L.; STRATTON, J. E.; NORDLEE, J. A. Histamine poisoning (Scombroid Fish Poisoning): an allergy-like intoxication. Clinical Toxicology, v. 62, p. 225-240, 1989.
TAYLOR, S. L. Other Microbial Intoxications. In: CLIVER, D. O. Foodborne Diseases. San Diego: Academic Press, Inc.,1990. 393 p. pt. 3, cap 9, p. 164-168.
95
TENDOLKAR, P. M.; BAGHDAYAN, A. S.; SHANKAR, N. Pathogenic enterococci: new developments in the 21st century. Cellular and Molecular Life Sciences. v. 60, p. 2622-2636, 2003.
TOM, P. D. Acidified, Fermented, and Salted Fish and Fishery Products. Disponível em: http://seafood.ucdavis.edu/haccp/compendium/chapt01.htm#Fermenting%20processes. Acessado em: 18 de outubro de 2007.
TSAI, Y. H.; LIN, C. Y.; CHIEN, L. T.; LEE, T. M.; WEI, C.;HWANG, D.F. Histamine contents of fermented fish products in Taiwan and isolation of histamine-forming bacteria. Food Chemistry. v. 98. p.64-70, 2006.
VICENZI, R. Biotecnologia de Alimentos. Disponível em: http://www.sinpro-rs.org.br/paginasPessoais/layout2/..%5Carquivos%5CProf_394%5CAPOSTILA%20BIOTECNOLOGIA%20DE%20ALIMENTOS.pdf. Acesso em 13de agosto de 2007.
VIEIRA, R. H. S. F. Microbiologia, higiene e qualidade do pescado: teoria e prática. São Paulo: Livraria Varela, 2004. 380 p.
WIKIPEDIA. Cloreto de sódio. Disponível em: http://pt.wikipedia.org/wiki/ Cloreto_de_s%C3%B3dio. Acessado em: 14 de novembro de 2007.
WU, M. L.; YANG, C. C.; YANG, G. Y.; GER, J.; DENG, J. F. Scombroid Fish Poisoning: an overlloked marine food poisoning. Vet Human Toxicology. v. 39, n. 4, Aug. 1997.
YONGSAWATDIGUL, J.; CHOI, Y. J.; UDOMPORN, S. Biogenic amines formation in fish sauce prepared from fresh and temperature-abuse indian anchovy (Stolephorus indicus). Journal of Food Science, v. 69, n. 4, 2004.
ZICAN, C. Higiene Alimentar. V. 8, n. 31, p. 9-10,. Apresentado no 1º Seminário de Vigilância Sanitária Pesqueira: Qualidade dos Pescados. São Paulo, 1994.
8 APÊNDICES
8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS
97
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98
8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATÉRIA PRIMA
INFORMAÇÃO SOBRE AS AMOSTRAS DE MATÉRIA PRIMA
SARDINHA: Data de coleta:
Origem da matéria prima:
Coletor da amostra (nome):
Condições de transporte até a empresa:
Temperatura da matéria prima na recepção:
Peso mínimo das amostras: 500 gramas.
Observações: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ SAL: Data de coleta:
Origem da matéria prima:
Coletor da amostra (nome):
Peso mínimo das amostras: 500 gramas.
Observações: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
99
8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAÇÃO
INFORMAÇÃO SOBRE AS AMOSTRAS Data de coleta:
Temperatura ambiente:
Coletor da amostra (nome):
Peso mínimo das amostras: 500 gramas. A. Processamento Tecnológico usual da empresa;
B. Processamento Tecnológico maturando peixe inteiro;
C. Processamento Tecnológico maturando peixe eviscerado.
A1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
A2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs: A
A3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
B1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
B2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs: B
B3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
C1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
C2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs: C
C3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):
Obs:
00
9 ANEXOS
9.1 FLUXOGRAMAS DOS PROCESSAMENTOS
1
101
9.1.1 Fluxograma do Processamento usual da empresa (A)
RECEPÇÃO Averiguação da presença de peixes deteriorados e controle da temperatura (< 4°C)
(PCC 1) →
SELEÇÃO
LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)
PRÉ-SALGA (PCC 2) →
TOILLETE (evisceração e descabe
FERMENTAÇÃ(etapa realizada em salmoura saturada por, no m
temperatura controlada
PRENSAGEM (PCC 3) →
FILETAGEM
EMBALAGEM (PCC 4) →
ESTOCAGEM
EXPEDIÇÃO
Utilização de tanques higienizados e Controle da salinidade da salmoura com o mínimo de 24° Bé.
çamento)
Retirada do excesso de salmoura com pressão de 2 a 6 T por 20 minutos.
Aferição do equipamento de formação de vácuo e recravação das embalagens.
O ínimo, 90 dias em ambiente com : 25 °C)
102
9.1.2 Fluxograma do Processamento com fermentação de peixe inteiro (B)
RECEPÇÃO
SELEÇÃO
LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)
FERMENTAÇÃO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mínimo, 90 dias em ambiente com
temperatura controlada: 25 °C)
TOILLETE (evisceração, descabeçamento e retirada da pele)
PRENSAGEM
FILETAGEM
EMBALAGEM
ESTOCAGEM
EXPEDIÇÃO
103
9.1.3 Fluxograma do Processamento com fermentação de peixe eviscerado (C)
RECEPÇÃO
SELEÇÃO
LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)
TOILLETE (evisceração e descabeçamento)
FERMENTAÇÃO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mínimo, 90 dias em ambiente com
temperatura controlada: 25 °C)
TOILLETE
(retirada da pele)
PRENSAGEM
FILETAGEM
EMBALAGEM
ESTOCAGEM
EXPEDIÇÃO