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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA
BRUNA DOS SANTOS SILVA
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES EXTRATOS E FRAÇÕES DE
Rapanea ferruginea
Itajaí, (SC) 2013
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BRUNA DOS SANTOS SILVA
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES EXTRATOS E FRAÇÕES DE
Rapanea ferruginea
Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de farmacêutico pela Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Angela Malheiros
Itajaí, (SC) Junho de 2013
3
4
Dedico esse trabalho aos meus pais, Graça e Jorge, que estiveram ao meu lado durante mais
esse trajeto.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, pelo fôlego de vida e por ter me dado força
nessa longa jornada, me atribuindo missões o qual sabia que seria vencedora.
Agradeço as duas pessoas mais importantes da minha vida, meus pais, que
com certeza são exemplos de perseverança e acreditaram em mim desde os
primeiros passos, me ensinando os valores da vida, contribuindo constantemente
com a minha formação.
Agradeço a minha orientadora, professora Dra. Angela Malheiros pelos
ensinamentos, elogios e correções que com certeza serão espelhados em minha
vida profissional. A nossa conexão telepática fez com que eu economizasse alguns
créditos, e idas e vindas a sua sala.
Agradeço aos professores Dra. Christiane Meyre da Silva Bittencourt e Dr.
Roberto Dalla Vecchia por terem aceito fazerem parte dessa banca, pela paciência e
também por terem sido muitas vezes os meus “Cos” durante a parte prática desse
projeto.
Agradeço aos meus mestres, por terem me transmitido seu conhecimento
com paciência e dedicação, e que com certezas são exemplos de profissionais
dedicados ao que fazem.
Agradeço ao professor Theodoro Marcel Wagner, por estar sempre disposto a
me auxiliar nas análises em CG/EM e ao Pedro do RMN. Vocês no último minuto do
segundo tempo se dispuseram a realizar as últimas análises, por isso obrigada.
Agradeço ao professor Dr. Alexandre Bella Cruz e a doutoranda Adriana
Gasparetto Soletti, por ter me auxiliado de muita boa vontade com os ensaios
bioautográficos.
Agradeço ao professor Dr. Rivaldo Niero, pelo empréstimo de última hora do
nosso caro “amigo” Silverstein.
Agradeço a professora Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva por me ajudar com a
formatação da monografia.
Agradeço aos demais funcionários da UNIVALI que sempre estavam
dispostos à ajudar, não recusando uma mão amiga. Agradeço também ao CNPq/
PIBIC pela concessão da bolsa.
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Agradeço aos meus colegas de laboratório, que compartilharam comigo
alegrias, choros e um rádio antigo – que continua lá por sinal. Sem vocês as tardes
no laboratório não seriam tão animadas.
Agradeço aos meus colegas de turma que estavam ao meu lado durante toda
a minha vida acadêmica, pelos sorrisos, choros e aventuras como ir ao hospital de
Itapema em plena uma da amanhã. Com vocês aprendi não apenas as dificuldades
de conviver em grupo, mas que também a união faz a força.
7
“A persistência é o menor caminho do êxito.” (Charles Chaplin)
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AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES EXTRATOS E FRAÇÕES DE
Rapanea ferruginea
Bruna dos Santos SILVA Orientador: Angela Malheiros, Drª Defesa em: abril de 2013. Resumo: Nos últimos anos tem-se verificado um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas. O gênero Rapanea, conhecido popularmente como “capororoca”, é considerada uma espécie pantropical encontrada no Sul da África e em grande parte do continente americano. Entre os compostos isolados neste gênero destacam-se os derivados de ácidos benzóicos que se destacam por sua atividade anti-inflamatória e antimicrobiana. O presente estudo teve por objetivo analisar a composição química dos extratos de raiz, cascas, folhas e frutos de Rapanea ferruginea e promover reações de esterificação e amidação no extrato dos frutos e avalia-los por ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG/EM), bem como estabelecer o potencial antimicrobiano do extrato amidado e esterificado e frações provenientes dos frutos e cascas através de bioautografia utilizando cepas de Staphylococcus aureus. Para aquisição dos extratos, as diferentes partes de R. ferruginea foram submetidas a maceração em etanol. Posteriormente o extrato dos frutos foi submetido a esterificação com metanol em meio ácido e amidação com dodecilamina, na tentativa de modificar os grupamentos ácidos presentes nos extratos. Posteriormente o extrato amidado foi fracionado, por cromatografia em coluna. Foram realizadas também colunas cromatográficas à partir do extrato clorofórmio das cascas com a finalidade de identificar as substâncias com potencial antimicrobiano. Nos procedimentos cromatográficos foi utilizado sílica-gel como fase estacionária e fase móvel solventes de polaridade crescente. O perfil de todos os extratos e frações foram analisados por RMN antes de serem avaliados por CG/EM. Após análise por RMN 1H pôde perceber que o extrato dos frutos é majoritariamente composto por AMA. O extrato das cascas e da raiz por ácido mirsinoico B (AMB), e o extrato das folhas não apresenta em sua composição nenhum dos ácidos mirsinoicos avaliados. Foi também possível detectar por RMN e CG/EM a esterificação e amidação dos grupamentos ácidos presentes no extrato. Posteriormente extratos e frações de interesse foram analisados por bioautografia. As cromatoplacas com as amostras foram eluídas e colocadas em placa de meio TSA, juntamente com o microorganismo. Após o crescimento bacteriano as placas foram reveladas com Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio e procedeu-se com a leitura dos resultados. Através dessa análise podê-se confirmar a atividade antimicrobiana exercida pelo ácido mirsinoico A (AMA), porém nos extratos que sofreram amidação e esterificação a atividade antimicrobiana não foi observada para os derivados obtidos. Frações provenientes do extrato das cascas apresentaram atividade antimicrobiana, dentre estas, destaca-se a fração denominada 90-102, todavia não foi possível a identificação dessa fração utilizando apenas o RMN de 1H, sendo necessário realizar uma nova análise por RMN de 13C. Esta pesquisa é de grande importância, pois fornece informações sobre a composição química dos extratos de diversas partes da R ferruginea, como para delinear a atividade antimicrobiana exercida pela planta.
Palavras-chave: Rapanea ferruginea. Atividade antimicrobiana. Ácidos mirsinóicos.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Fotografia da espécie R. ferruginea (a) planta inteira (b) partes
aéreas...................................................................................................
20
Figura 2
CCD referente ao RFEFR, RFEFO, RFERA, RFECA de R.
ferruginea..............................................................................................
36
Figura 3 Espectros de RMN ¹H do ácido mirsinóico B (AMB) e ácido
mirsinóico A (AMA) com o extrato de R. ferruginea dos frutos
(RFEFR) ..............................................................................................
38
Figura 4
Espectros de RMN ¹H do ácido mirsinóico B (AMB) e ácido
mirsinóico A (AMA) com o extrato de R. ferruginea da raiz (RFERA)
..............................................................................................................
39
Figura 5
Espectros de RMN ¹H do ácido mirsinóico B (AMB) e ácido
mirsinóico A (AMA) com o extrato de R. ferruginea das cascas
(RFECA) ..............................................................................................
40
Figura 6
Espectros de RMN ¹H do ácido mirsinóico B (AMB) e ácido
mirsinóico A (AMA) com o extrato de R. ferruginea das folhas
(RFEFO) ..............................................................................................
41
Figura 7 CCD da reação de esterificação dos frutos de R.
ferruginea..............................................................................................
43
Figura 8 CCDs da reação de amidação dos frutos de R.
ferruginea..............................................................................................
44
Figura 9 Reação de esterificação do ácido mirsinóico A (AMA) (a) e amidação
do ácido mirsinóico A (AMA) (b)
..............................................................................................................
44
Figura 10
Reação de esterificação (a) e amidação (b) do triglicerídeo ou ácidos
graxos dos frutos de R. ferruginea.......................................................
45
Figura 11
Espectros de RMN 1H do extrato dos frutos da R. ferruginea
amidado (RFEFR-AM) (a) e extrato dos frutos de R. ferruginea
esterificado (RFEFR-ED) (b) com o extrato dos frutos de R.
ferruginea (RFEFR) (c).........................................................................
46
Figura 12 Cromatograma de CG/EM dos frutos de R.
10
ferruginea.............................................................................................. 47
Figura 13
Cromatograma de CG/EM do Glicerídeo esterificado (GLIE) obtido à
partir de R. ferruginea...........................................................................
48
Figura 14 Fluxograma simplificado dos ésteres provenientes do Glicerídeo
esterificado...........................................................................................
49
Figura 15
Cromatograma da fração 45-48 referente à coluna do extrato dos
frutos amidado......................................................................................
50
Figura 16
Espectros de massas do composto correspondente ao pico
1............................................................................................................
51
Figura 17 Espectros de massas do composto correspondente ao pico
2............................................................................................................
52
Figura 18
Espectros de massas do composto correspondente ao pico
3............................................................................................................
53
Figura 19
Sobreposição do cromatograma das frações 45-48 e 49-
52..........................................................................................................
53
Figura 20
Espectro de massas do composto correspondente ao pico 5..... 54
Figura 21
Bioautografia do extrato dos frutos de R. ferrugínea, do extrato
dos frutos esterificado e do extrato dos frutos amidado...............
55
Figura 22
Bioautografia das frações da coluna clorofórmio das cascas...... 56
Figura 23
Espectro de RMN 1H da fração 90-102........................................... 57
Figura 24 Espectro de RMN 1H da fração 4..................................................... 58
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALA – Ácido alfa-linolênico
ALS – Esclerose Lateral Amiotrófica
AMA – Ácido Mirsinóico A
AMB – Ácido Mirsinóico B
AMC – Ácido Mirsinóico C
AME – Ácido Mirsinóico E
AMF – Ácido Mirsinóico F
ARA - Ácido Araquidônico
AcOEt – Acetato de Etila
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CC – Cromatografia em Coluna
CG/EM – Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas
CIM – Concentração Inibitória Mínima
DA – Doença de Alzheimer
DCC – 1,3 - dicicloexilcarbodiimida
DCM – Diclorometano
DHA – Ácido docosahexaenóico
EtOH – Etanol
GLIE – Glicerídeo esterificado
Hex – Hexano
IV – Infravermelho
LA – Ácido Linoleico
MeOH – Metanol
OMS – Organização Mundial da Saúde
PD – Doença de Parkinson
Rf – Fator de Retenção
RFECA – Extrato das cascas de Rapanea ferruginea
RFEFO – Extrato das folhas de Rapanea ferruginea
RFEFR - Extrato dos frutos de Rapanea ferruginea
RFEFRA – Extrato da raiz de Rapanea ferruginea
RFEFR-AM – Extrato dos frutos de Rapanea ferrugínea amidado
12
RFEFR-ED – Extrato dos frutos de Rapanea ferrugínea esterificado
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
TMS – Tetrametilsilano
TTC – Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio
UV – Ultravioleta
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 14
2 OBJETIVOS...................................................................................................
2.1 Objetivo geral............................................................................................
2.2 Objetivos específicos...............................................................................
16
16
16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.........................................................................
3.1 Aspectos gerais sobre plantas medicinais............................................
3.2 Considerações sobre o gênero Rapanea...............................................
17
17
19
3.3 Estudos realizados com a Rapanea ferruginea.....................................
3.3.1 Ácidos graxos........................................................................................
3.4 Bioautografia.............................................................................................
3.5 Técnicas de RMN e CG/EM.......................................................................
4 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
4.1 Material Botânico......................................................................................
4.2 Materiais e reagentes................................................................................
4.3 Equipamentos...........................................................................................
4.4 Obtenção dos extratos.............................................................................
4.5 Reação de amidação.................................................................................
4.6 Reação de esterificação...........................................................................
4.7 Coluna do extrato dos frutos após a reação de amidação...................
4.8 Coluna I: fração 70-72 do extrato clorofórmio das cascas....................
4.9 Coluna II: fração 95-98 do extrato clorofórmio das cascas...................
4.10 Ensaio Biautográfico..............................................................................
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................
5.1 Extratos Etanólico.....................................................................................
5.2 Reações de amidação e esterificação ...................................................
5.3 Avaliação por cromatografia à gás acoplada a espectrometria de
massas (CG/EM)..............................................................................................
5.4 Ensaio bioautográfico..............................................................................
6 CONCLUSÃO................................................................................................
REFERENCIAS................................................................................................
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27
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30
30
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46
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60
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1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais foram os principais componentes das farmacopeias
durante muitos anos, sendo usados até fins do século XIX na forma de chás,
infusões, e outras formulações farmacêuticas, todavia ao término desse século o
isolamento de produtos naturais em forma pura foi um passo decisivo para a criação
da indústria farmacêutica (COSTA, 2009).
Grande parte dos principais produtos medicinais obtidos de plantas e
desenvolvidos industrialmente são baseados na medicina popular. Cerca de 50%
dos medicamentos em geral utilizados para terapias clínicas originam-se de
produtos naturais ou derivados. Entretanto, grande parte das plantas ainda são
pouco exploradas do ponto de vista científico, sendo que, das 250 mil e 350 mil
espécies existentes no mundo, apenas cerca de 15% têm sido estudadas
fitoquimicamente e 6% biologicamente (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Nos últimos anos a pesquisa na área de produtos naturais tem revelado um
grande avanço científico, sendo esta uma das áreas mais tradicionais da química no
Brasil, devido a grande biodiversidade do país o que consequentemente aumenta a
possibilidade de descoberta de princípios ativos, bem como condição ambiental
favorável (BRAZ FILHO, 2010; PUPO; GALLO; VIEIRA, 2007).
Desde a década de 40, o desenvolvimento de fármacos efetivos e seguros
para combater infecções bacterianas revolucionou o tratamento médico, a
morbidade, e a mortalidade. Todavia, o uso indiscriminado de fármacos
antibacterianos cada vez mais efetivos levou ao aparecimento de organismos
resistentes a esses antimicrobianos (RANG et al., 2012). Desde a década de 1990
têm-se testemunhado o aumento no número de bactérias resistentes à fármacos,
impondo por consequência sérias restrições no tratamento de diversas infecções,
revelando a importância na investigação de novos agentes antimicrobianos com
ação contra esses micro-organismos resistentes (RANG et al., 2012).
Considerando a necessidade de se desenvolver novos fármacos para o
tratamento de diversas patologias que ainda não possuem um tratamento eficiente
ou cura, visando preferencialmente a diminuição dos efeitos colaterais indesejáveis,
surge a necessidade de maiores pesquisas na área fitoquímica (BRAZ FILHO,
2010).
15
Estudos já realizados com extratos provenientes das folhas, caules, cascas e
frutos de Rapanea ferruginea demonstraram que as cascas e os frutos possuem
grande quantidade da(s) substância(s) ativa(s) frente à cepas de Staplylococcus
aureus, confirmando assim seu potencial antimicrobiano. Dentre as substâncias
ativas advindas desses extratos podê-se citar os derivados de ácidos benzoicos
conhecidos como ácidos mirsinóicos A e B (AMA e AMB), porém existem outras
substâncias que contribuem com potencial antimicrobiano apresentado, mas que
ainda não foram isoladas (KAZMIERCZAK, 2010).
Portanto, pretende-se avaliar a presença de ácidos mirsinoicos nas diferentes
partes de R. ferruginea utilizando as técnicas de ressonância magnética nuclear e
cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas. Realizar reações de
esterificação e amidação nos extratos para obter os derivados, fracionar diferentes
frações provenientes de coluna das cascas, bem como avaliar a atividade
antimicrobiana dos mesmos e dar continuidade a investigação fitoquímica.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Analisar a composição química dos extratos de raiz, cascas, folhas e frutos de
Rapanea ferruginea e promover reações de esterificação e amidação no extrato dos
frutos para correlacionar com a atividade antimicrobiana através de bioautografia.
2.2 Objetivos específicos
Obter extratos etanólicos da raiz, cascas, folhas e frutos de R. ferruginea e
analisar sua composição por ressonância magnética nuclear (RMN);
Realizar reações de amidação e esterificação à partir de extratos dos frutos e
avaliar os extratos por RMN e cromatografia gasosa acoplada ao espectro de
massas(CG/EM);
Fracionar através de cromatografia em coluna frações de interesse
proveniente da coluna diclorometano das cascas e extrato amidado de R. ferruginea.
Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos e frações de interesse através
de bioautografia utilizando cepas de Staphylococcus aureus ATCC.
17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Aspectos gerais sobre plantas medicinais
Ao longo dos anos, as plantas têm sido utilizadas como principais
componentes das formulações farmacêuticas para alívio ou cura de determinadas
doenças, sendo que, as mesmas constituem uma fonte imediata e viável de
medicamentos para a maioria da população mundial, principalmente nos países
subdesenvolvidos. A importância desses organismos vegetais como fontes
produtivas de substâncias com atividades biológicas, tem despertado interesses
crescentes tanto sociais quanto econômicos nas indústrias farmacêuticas que
buscam novos fármacos preferencialmente sem efeitos colaterais indesejáveis
(BRAZ FILHO, 2010; CALIXTO, 2005; COSTA, 2009).
Dentre os aspectos relativos às pesquisas nesta área vale à pena destacar a
busca de novas substâncias bioativas a partir de fontes naturais, a utilização de
produtos naturais como matéria prima para a obtenção de novos fármacos, a
importância dos estudos de correlação estrutura-atividade para otimização dos
efeitos farmacológicos e a compreensão do modo de ação de determinados
compostos (BUTLER, 2005).
O mercado mundial de medicamentos movimenta em torno de US$ 250
bilhões por ano. Para se ter uma ideia do valor dos produtos naturais, de todos os
medicamentos aprovados nos anos de 1981-2004, aproximadamente 28% eram
derivados de produtos naturais e 37% constituíam produtos biológicos e vacinas. Se
tomar como base os antitumorais, das 128 moléculas descobertas no período de
1981 a 2010, 32 eram de origem natural. Já os antibióticos tiveram um número
inferior de novas substâncias descobertas representando um total de 118, porém 67
eram provenientes de produtos naturais (CALIXTO, 2005; NEWMAN; CRAGG,
2012).
Quando se deseja isolar compostos de uma planta um dos principais
aspectos que deve ser levado em consideração são as informações da medicina
popular. Cerca de 75% dos compostos puros empregados na indústria de
18
medicamentos foram isolados através de recomendações da medicina popular
(CECHINEL FILHO; YUNES, 2001).
Dentre outros aspectos que poderiam ser citados, seria a localização
geográfica do Brasil, fazendo com que este apresente condições favoráveis para o
crescimento de diversas espécies. A grande biodiversidade do país, não só
proporciona a descoberta de novos agentes terapêuticos, mas também estimula a
formação de recursos humanos de alto nível nesta área de pesquisa ainda muito
carente e imprescindível para o desenvolvimento da indústria farmacêutica nacional
(CECHINEL FILHO; YUNES, 2001)
É expressivo o número de medicamentos disponíveis na terapêutica moderna
desenvolvida a partir de plantas medicinais, como por exemplo: a atropina
(anticolinérgico), escopolamina (antiespasmódico), quinina (antimalárico), digoxina e
digitoxina (cardiotônicos), reserpina (antihipertensivo), morfina (analgésico), a
vincristina e vimblastina, (antitumorais), dentre outros (FUNARI; FERRO, 2005;
GURIB-FAKIM, 2006).
No ano de 2002 a Organização Mundial de Saúde (OMS) possuía uma lista
com aproximadamente 251 medicamentos essenciais e básicos à saúde humana,
sendo que 11% eram viabilizados a partir de espécies vegetais. Nos últimos anos,
esse quadro adquiriu um número maior de medicamentos e os medicamentos
derivados de produtos naturais mantiveram-se na lista de medicamentos básicos à
saúde (PINTO et al., 2002; NEWMAN; CRAGG, 2012).
Diversas plantas vem sendo utilizadas para fins profiláticos e curativos de
infecções, dentre elas algumas já encontram-se em fase de estudo, tais como a
Punica granatum (romã) que mostrou-se eficiente contra Staphylococcus aureus
resistente a meticilina, a Artemisia annua inibindo o crescimento da bactéria Gram
positiva Enterococcus hirae, bem como de fungos. Também o óleo essencial de S.
cuminii apresentou excelente atividade, enquanto do S. travancoricum apresentou
atividade intermediária. Outros óleos que se mostraram eficazes do ponto de vista
microbiológico foram os óleos essenciais de Mentha suaveolens Ehrh., Mentha
piperita L. e Mentha arvensis L. sobre bactérias Gram positivas e negativas, tais
como Staphyloccus aureus e Escherichia coli sensíveis e resistentes à ação de
antibióticos (MICHELIN et al., 2005).
19
3.2 Considerações sobre o gênero Rapanea
A família Myrsinaceae apresenta cerca de 40 gêneros e aproximadamente
1400 espécies, entre os quais encontra-se a Rapanea. Há ainda muita divergência
quanto ao nome a ser utilizado para o principal gênero Myrsinaceae no Brasil
(Myrsine ou Rapanea), sendo aqui no Brasil mais utilizado a nomenclatura Rapanea.
As outras nomenclaturas para tal espécie são Myrsine floculosa, Myrsine coriaceae
e Gaballeria ferruginea (MANGURO et al., 2003; PINHEIRO; CARMO, 1993).
O gênero Rapanea é conhecido popularmente como canela, capororoca,
capororocão, capororoca-verdadeira, copororoquinha, capororocaçu, capororoca-
vermelha, capororoca-mirin, canela-azeitona, azeitona-do-mato e pororoca. A
espécie em estudo, a R. ferruginea, é conhecida como canela-azeitona, capororoca,
azeitona-do-mato, camará e capororocaçu (LORENZI, 1992; MONTOVANI et al.,
2009; PINHEIRO; CARMO, 1993).
A R. ferruginea é considerada uma espécie pantropical, sendo encontrada no
sul da África, na Bolívia, México, Argentina, Paraguai, e Uruguai e no Brasil, na
Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul (CARVALHO, 1994; JOLY, 1975).
São árvores de 15 a 20 m de altura de aproximadamente 50 cm de diâmetro,
possuem copa ovalada densa, tronco cilíndrico revestido por casca espessa e folhas
simples concentradas nas pontas dos ramos, brilhantes e nervadas na parte ventral
(CARVALHO, 1994; JOLY, 1975; MONTOVANI et al., 2009). Na figura 1 está
apresentado uma fotografia da espécie em estudo, e outra destacando os frutos.
20
Figura 1 – Fotografia da espécie R. ferruginea a) planta inteira, b) Partes aéreas destacando os frutos.
(a) (b)
Espécies pertencentes ao gênero Rapanea são bastante utilizados pela
medicina popular no tratamento de algumas patologias, entre os quais, processos
inflamatórios e dolorosos, tais como as afecções das vias urinárias e do fígado,
coceiras, erupções, urticárias, eczemas, reumatismo (LORENZI, 1992). Além do uso
medicinal, a espécie também é utilizada para outros fins, como a utilização do tronco
como lenha, na fabricação de carvão, caibros e esteios. Ainda com relação a essa
espécie, os frutos são avidamente consumidos por diversas espécies de pássaros,
fazendo com que esses animais disseminem as sementes em áreas mais afastadas,
o que consequentemente a torne uma planta útil no reflorestamento de áreas
degradadas de preservação permanente (PINHEIRO; CARMO, 1993).
3.3 Estudos realizados com a Rapanea ferruginea
Quimicamente o gênero Rapanea é caracterizado pela presença de um grupo
de ácidos terpeno-p-hidroxibenzóicos e um número de triterpenóides baseados nos
esqueletos oleanano, ursano, damarano e cicloartano (MANGURO et al., 2003;
SOUZA, 2005; GAZONI, 2009)
Os ácidos benzóicos prenilados, denominados ácidos mirsinóicos são a
principal classe de metabólitos secundários isolados no gênero Rapanea, tendo
como exemplos o ácido mirsinoico A (1), ácido mirsinoico B (2) e ácido mirsinoico C
(3). Devido suas características estruturais, estas são moléculas atrativas do ponto
21
de vista químico-farmacológico, sejam como substâncias ativas ou capazes de
serem modificadas. Estudos realizados por Baccarin (2011) demonstrou que o
HPLC-PDA é uma técnica simples, rápida e seletiva para isolamento e quantificação
de AMB à partir de extratos de R. ferruginea, sendo este o composto majoritário
presente nas cascas dos caules (BACCARIN et. al., 2011).
Em estudos prévios, esses compostos demonstraram atividade anti-
inflamatória, antinociceptiva e antiperalgésica (BACCARIN et al., 2011; BLUNT;
CHEN; WIEMER, 1998; ANTONIALLI et. al., 2012)
(1) (2)
(3)
Estudos foram desenvolvidos com extrato da casca da Rapanea ferruginea e
o ácido mirsinóico B (AMB) em vários modelos de dor. Foi detectado atividade
antinociceptiva na dor neuropática causada pela constrição parcial do nervo ciático
em camundongos, e na dor neuropática diabética para o extrato. O AMB também foi
efetivo com relação a essa atividade, interagindo com os sistemas adrenérgico,
colinérgico, oxidonitrérgica e parcialmente com o sistema serotoninérgico (HESS,
2006; HESS et al., 2010; PEREIRA et al., 2004). Também foi constatado que o AMB
além de interagir com as vias serotonérgica, GABAérgica, oxidonitrérgica,
colinérgica, interage também com a via dos glicocorticóides endógenos exercendo
22
uma ação antihipernociceptiva marcante quando administrada oralmente nos
modelos de dor inflamatória induzida pela carragenina (ANTONIALLI et al., 2012).
O extrato bruto da R. ferruginea e o AMB também foram avaliados quanto ao
potencial anti-hiperglicemiante em animais diabéticos induzidos com aloxano, onde
foi observado diminuição da glicose plasmática de jejum (GALVAN, 2007; MATTOS,
2006; MONTEIRO, 2009)
Um estudo detalhado sobre a planta e seus princípios ativos foi desenvolvido
identificando a presença do AMB nas folhas e caules da R. ferruginea, do AMA nos
frutos da mesma, e outros compostos que apresentaram excelentes resultados na
inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), (COSTA, 2011; FILLIPIN, 2010;
GAZONI, 2009).
A atividade citotóxica dos extratos brutos das cascas, folhas e frutos da
Rapanea ferrugínea, bem como dos ácidos mirsinóicos A, B e C foram avaliadas
Tomio (2011), onde demonstraram citotoxicidade significativa frente à linhagens
celulares não tumorais L929 e tumorais HELA, B16F10, K562 e NALM-6 (TOMIO,
2011).
Sabe-se ainda que os ácidos mirsinóicos A e B são ativos para as bactérias
Gram-positivas, assim como frações constituídas por outros compostos apresentam
atividade significativa frente à esses microrganismos, entretanto até o momento não
foi possível o isolamento destes (KAZMIERCZAK, 2010).
Ainda estudos desenvolvidos na linha de pesquisa de compostos com
atividade antitumoral, mostrou que o ácido mirsinoico A e seus análogos foram
eficazes inibidores do fator de crescimento tumoral Heparin-Binding Epidermal
Growth Factor (HB-EGF), sendo este um fator expresso nos mais diversos tipos de
câncer, tais como o ovariano, gástrico, pancreático, renal, pulmonar, de próstata, de
mama e ainda o melanoma e o glioblastoma (LEE; MANDINOVA, 2011; MIZUSHINA
et al., 2005).
Outras linhas de pesquisas utilizando ácidos mirsinoicos têm sido foco de
pesquisas mais recentes, tais como a utilização de ácidos mirsinoicos A, B, C, E (4)
e F (5) como inibidores da enzima metionase presente em bactérias contaminantes
de água e alimentos e em que grande parte são a causa de doenças periodentárias,
sugerindo assim a utilização desses compostos na formulação de produtos
dentários, como por exemplo em enxaguatórios bucais (ITO et al., 2012).
23
Ainda há relatos de isolamento de outros ácidos benzoicos prenilados em
menor quantidade, tais como o ácido mirsinoico E (4) e ácido mirsinoico F (5) os
quais apresentam as mesmas atividades do AMA, AMB e AMC já relatadas por
diversos autores, bem como demonstrou ser eficiente na inibição de DNA
polimerase (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2012; MIZUSHINA et al., 2000).
(4) (5)
No gênero Rapanea outra classe de metabólitos secundários encontrados são
as benzoquinonas. Destas podem ser citadas como principais as benzoquinonas
melanfolona (6), a mirsinona (7), bem como a mirsinaquinona (8) isoladas à partir
dos frutos da espécie R. melanopholoes. Essas três substâncias apresentaram
atividade antialimentação em ensaios com insetos Schistocerca gregaria, inibindo
também o crescimento de larvas do mosquito Aedes aegypti (MIDIWO et al., 1995).
(6)
(7) (8)
24
Pode-se citar também a presença de triterpenos no gênero Rapanea, entre os
quais encontra-se o isolamento da saponina triterpenoídica chamada
sakarasosaponina, com atividade molucicida e antifúngica (OHTANI et al., 1993) e
os terpenóides 24(E)-3-oxo-dammara-20,24-dien-26-al (9) e 24(E)-3-hidroxicicloart-
24-en-26-al (10) (JANUÁRIO et al., 1992). Já na espécie R. laetevirens, foram
encontrados alquil resorcinóis com substituintes monoenóicos C11, C13 e C15 e
ácidos graxos não usuais (MADRIGAL et al., 1977).
(9) (10)
Outros compostos isolados das espécies Myrsine africana e Rapanea
melanophelos, apresentavam atividade anti-helmíntica. Bem como da espécie
Rapanea umbellata foram isolados glicosídeos cianogênicos (FRANCISCO;
PINOTT, 2000; GITHIORI et al., 2003).
3.3.1 Ácidos graxos
Sabe-se que os componentes lipídicos, principalmente os ácidos graxos
linoleico (LA) (11) e alfa-linolênico (ALA) (12) desempenham importantes funções
durante os processos metabólicos, nas membranas das células, na transferência de
oxigênio atmosférico para o plasma sanguíneo, na síntese de hemoglobina, na
divisão celular, regulação de diversos processos metabólicos, de transporte e
excreção, sendo assim denominados de ácidos graxos essenciais, por não serem
sintetizados pelo organismo (MARTIN et al.,2006; TINOCO et al., 2007).
25
(11)
(12)
O LA e o ALA desenvolvem ainda importante função na produção de ácidos
graxos da família n-6 e n-3 no organismo pelas enzimas alongase e dessaturase, ou
ainda estes últimos podem ser obtidos através da dieta. O ácido linoleico pode ser
encontrado também em organismos vegetais (MARTIN et al.,2006).
O ácido araquidônico (ARA) e docosahexaenóico (DHA) são formados na
maioria dos tecidos do organismo, todavia antes do nascimento estes ácidos são
transmitidos ao feto através da placenta e está proporcionalmente relacionado à
dieta rica em ácidos graxos da mãe, principalmente os ácidos linoleico e linolênico
(precursores do ARA e DHA). A carência desses ácidos graxos no organismo
humano pode conduzir a alterações no crescimento, na pele, imunológicas,
neurológicas e sérios transtornos comportamentais (TINOCO et al., 2007).
Doenças neurodegenerativas, tais como a Doença de Alzheimer (DA),
Parkinson (PD) e Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) são caracterizadas pela perda
de células neuronais específicas e a presença de agregados proteicos. Até o
presente momento não se sabe ao certo os mecanismos que induzem a formação
dessa agregação, porém alguns estudos sugerem o envolvimento de fatores, tais
como o estresse oxidativo e também de lipídeos e seus produtos de oxidação nesse
processo (MIYAMOTO et al., 2011).
Estudos que verificaram a diminuição desse ácido graxo em áreas específicas
do cérebro, como o hipocampo, mantendo-se inalterado nas regiões do cortéx e
tálamo (MIYAMOTO et al., 2011).
26
Diversos estudos com ácidos graxos poli-insaturados tem sido realizados nos
últimos anos. Destes, pode-se citar alguns estudos que relacionaram o aumento do
DHA no organismo à melhora de aprendizado e cognição em modelos animais com
Doença de Alzheimer. Todavia muitos estudos epidemiológicos evidenciaram uma
relação inversa entra a ingestão de ômega-3 e incidência de DA, considerando que
os estudos clínicos encontraram pouco ou nenhum efeito pronunciado no estágio
inicial da doença, indicando que a ingestão de DHA seria mais eficaz na prevenção
do que para o tratamento da doença (MIYAMOTO et al., 2011; COSTA, 2011).
Em nota, os trabalhos envolvendo ácidos graxos tais como, o DHA em
diversas doenças, principalmente as neurodegenerativas, mostra que os mesmos
podem desempenhar funções benéficas no organismo, sendo de grande importância
a investigação de novas fontes desses ácidos, tais como a Rapanea ferruginea,
acrescentando a literatura subsídios importantes sobre o tratamento dessas
patologias (COSTA, 2011).
3.4 Bioautografia
Ao longo dos anos, a bioautografia se tornou a técnica mais utilizada para
detecção da atividade antibacteriana, antifúngica, antitumoral e antiprotozoária de
substâncias com atividade biológica (CHOMA et al., 2010).
Basicamente o objetivo da técnica é avaliar qualitativamente a resposta
inibitória do crescimento de micro-organismos frente a substâncias, sendo
considerada uma metodologia prática, rápida, barata, fácil de reproduzir e que não
requere equipamentos sofisticados para tal O resultado dessa metodologia pode ser
influenciado pela técnica de bioautografia escolhida, o micro-organismo escolhido
para ser utilizado no teste, e ainda pela taxa de solubilidade de cada amostra a ser
analisada (CHOMA et al., 2010; SMÂNIA JR. et al., 2007).
Diversos tipos de cromatografia podem ser utilizados na realização dessa
metodologia, tais como, a cromatografia em camada delgada (CCD), umas das mais
utilizadas, e ainda cromatografia em camada delgada de alta performance,
cromatografia em camada delgada sobre alta pressão e eletrocromatografia planar
(CHOMA et al., 2010).
A primeira etapa consiste em testar a susceptibilidade de substâncias puras
que sejam preferencialmente polares, após essa etapa pode ser realizada a
metodologia de disco para detectar quantitativamente substâncias com potencial
27
atividade inibitória do crescimento de micro-organismos, através da medida do alo
de inibição que se forma ao redor do disco caso o composto testado possua efeito
antimicrobiano, gerando um valor denominado de concentração inibitória mínima
(CIM) (CHOMA et al., 2010; SMÂNIA JR. et al., 2007).
Há ainda outra metodologia similar a técnica de disco que poderia ser
utilizada, denominada de E-test, em que ao invés de se utilizar discos se utiliza fitas
no qual a mesma trás diversas concentrações e dependendo do tamanho do alo de
inibição formado será determinada a CIM, sendo esta também considerada uma
metodologia quantitativa (CHOMA et al., 2010).
3.5 Técnicas de RMN e CG/EM
A espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma forma de
espectroscopia de absorção semelhante a espectroscopia de infravermelho (IV) e à
de ultravioleta (UV), ocorrendo uma interação da radiação eletromagnética com a
matéria (SILVA, 2005; SILVERSTEIN et al., 2010).
A absorção da radiação eletromagnética em um espectro de RMN ocorre em
função de determinados núcleos da molécula a ser analisada. Sendo, de forma
abreviada, o RMN considerado um registro gráfico das frequências de picos de
absorção contra suas intensidades (SILVERSTEIN et al., 2010).
Existem basicamente dois tipos de interações da radiação eletromagnética
com a amostra, uma denominada de interações magnéticas que envolvem o
acoplamento magnético nuclear e outro seria as interações de natureza elétrica que
envolve acoplamentos com o momento de quadrupolo elétrico do núcleo. Sendo
algumas das interações magnéticas mais importantes os acoplamentos dipolo-dipolo
homo e hetero nucleares, os acoplamentos dipolar e escalar entre o spin nuclear e
eletrônico, e a interação entre o spin nuclear e os elétrons de condução (SILVA,
2005).
Ainda é possível controlar a radiação eletromagnética (faixa de
radiofreqüência ou RF) e descrever a interação desta radiação com os spins
nucleares do sistema. Isto contribui em grande parte para o desenvolvimento do
grande número de técnicas utilizadas em RMN (SILVA, 2005).
Dentre as vantagens da utilização do RMN na identificação de substâncias
encontra-se a facilidade no preparo da amostra, é uma técnica bastante utilizada em
28
análises de amostras complexas tais como extratos, bem como representa ser uma
análise rápida, reproduzível e estável (QIN et. al., 2012).
Entretanto sabe-se que a espectroscopia de RMN muitas vezes não é
suficiente para a elucidação de uma substância, fazendo-se necessário o uso de
outras técnicas de identificação, tais como a cromatografia gasosa acoplada ao
massa (CG/EM). O acoplamento de um cromatógrafo gasoso com o espectrômetro
de massas é bastante utilizado, em que há uma combinação da alta seletividade e
eficiência de separação da cromatografia com as vantagens da espectrometria de
massas de obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento adicional da
seletividade (CHIARADIA et al., 2008; SILVERSTEIN et al., 2010).
O CG/EM é aplicado para análise de substâncias voláteis e termicamente
estáveis, já que este processo de separação cromatográfico é realizado sobre altas
temperaturas e na presença de gás (CHIARADIA et al., 2008).
O CG pode ser conectado através da saída da coluna capilar à fonte do EM,
uma vez que, o sistema de bombeamento do espectrômetro de massas é capaz de
captar todo o eluente da coluna. Já quando são empregadas colunas recheadas, a
pressão do eluente deve ser reduzida antes da sua entrada na fonte de íons do EM,
sendo assim deve-se utilizar um separador de jato para realizar este
interfaceamento entre os equipamentos (CHIARADIA et al., 2008).
Dentre as vantagens de se utilizar o cromatógrafo gasoso pode-se citar o
excelente poder de resolução e a alta sensibilidade, possibilitando a análise de
várias substâncias presentes em uma amostra inclusive em baixas concentrações,
cerca de 10-12g do composto mL-1 de solução dependendo do tipo de detector
empregado. Esta análise é constituída por fase móvel e estacionária assim como
outras técnicas espectroscópicas, bem como o equipamento possui uma coluna (que
será selecionada de acordo com o tipo de amostra a ser analisado) e detectores,
estes últimos responsáveis por transformarem as variações na composição do gás
de arraste em sinais elétricos (PERES, 2002).
Quanto a espectrometria de massas, esta é bastante utilizada como uma
técnica complementar de identificação. Possui como princípio da metodologia a
ionização do composto em análise, fazendo com que os íons sejam separados na
base da razão massa/carga e o número de íons que correspondem a cada unidade
de massa/carga é registrado na forma de um cromatograma, sendo realizado por fim
uma busca computadorizada para comparação do cromatograma da amostra com
29
uma biblioteca de espectros de massas, o que facilita na identificação de
substâncias. Entretanto a utilização apenas dessa técnica muitas vezes não é o
suficiente como técnica de identificação (SILVERSTEIN et al., 2010; FERARY et. al.,
1995).
Sendo assim, a combinação desses dois equipamentos representam técnicas
bastante eficazes na elucidação de substâncias.
30
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material Botânico
As cascas, folhas, frutos e raízes da Rapanea ferruginea foram coletadas em
Blumenau-SC, na Rua Belo Horizonte, em Abril de 2010. A autenticidade botânica
foi verificada através da comparação entre a exsicata da planta coletada com o
exemplar autêntico depositado no Herbário Barbosa Rodrigues – Itajaí, sobre o
número de exsicata HBR52715.
4.2 Materiais e Reagentes
O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e compostos puros obtidos, foi
realizado com placas de sílica gel 60 GF 254, de 20µm de espessura preparados
sobre folhas de alumínio da Merck. Utilizou-se diversos sistemas de eluentes,
dependendo da polaridade das amostras. O revelador químico específico
empregado na CCD inclui o anisaldeído sulfúrico, para identificação de terpenos e
esteroides.
Para preparo da coluna cromatográfica foi utilizada uma fase estacionária
sílica 60 (Merck) de granulometria 70-230 mesh. O diâmetro e altura das colunas
foram escolhidos de acordo com a quantidade do material a ser cromatografado. A
eluição foi realizada com solventes orgânicos de polaridade crescente. Os solventes
utilizados foram hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt), álcool etílico (EtOH),
metanol (MeOH) e água. As frações coletadas foram reunidas conforme as
semelhanças de fator de retenção (Rf) identificadas na CCD.
Para análise de RMN ¹H e RMN ¹³C foi utilizado como solventes para
solubilizar as amostras clorofórmio e acetona deuterada, proveniente da Cambridge
Isotope Laboratories Inc.
Além dos reagentes citados acima, foram utilizados acetona, clorofórmio e
diclorometano (DCM), na eluição das CCD.
31
4.3 Equipamentos
Para caracterizar os compostos presentes nos extratos, foram utilizados
dados espectroscópicos usuais como Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio
(RMN-1H) e cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/EM).
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H foram realizados em
espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz e BRUKER Avance DPX300 300 MHz.
Para obtenção dos cromatogramas de cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas foi utilizado o equipamento modelo GCMSQP2010S. As
colunas utilizadas possuíam 30 metros de comprimento e diâmetro interno de
0,25mm cada, variando apenas na espessura do filme e no tipo de coluna para cada
amostra. Em que, para análise do Glicerídeo e frações da coluna de amidação
utilizou-se uma coluna RTX1 com espessura de 0,10µm e para análise do extrato
dos frutos a coluna utilizada foi a RTX®-WAX com espessura de 0,25µm.
Para análise do Glicerídeo e extrato dos frutos por CG/EM o modo de injeção
utilizado foi split na razão 50:1, a temperatura da injeção foi de 270°C e o volume da
injeção foi de 1µL. O fluxo de gás Hélio (He) variou conforme a amostra analisada,
em que para análise do Glicerídeo o fluxo foi de 0,7mL/min e para análise do extrato
dos frutos de R. ferruginea o fluxo foi de 0,8mL/min.
Já para análise das frações provenientes da coluna do extrato dos frutos
amidado as condições foram outras. O modo de injeção utilizado foi split na razão
40:1, a temperatura da injeção foi de 300°C e o volume da injeção foi de 1 µL. O
fluxo de gás Hélio (He) foi de 0,78mL/min.
A programação do forno variou conforme o tempo de análise, em que no
início a temperatura foi de 70°C permanecendo nessa temperatura por 1min, em
seguida a velocidade para aumento de temperatura foi de 20°C/min até atingir
210°C, posteriormente foi de 8°C/min até 250°C e por último esta velocidade foi de
10°C/min até 270°C para a análise do Glicerídeo e até 260°C para o extrato dos
frutos, permanecendo então nessa temperatura durante 5 min.
Para a análise das frações, a temperatura inicial foi de 110°C permanecendo
nessa temperatura durante 1 min, em seguida a velocidade para aumento de
temperatura foi de 25ºC/min até 210°C, logo após a velocidade foi de 15°C/min até
atingir 290°C e em seguida a velocidade foi de 12°C/min até 310°C permanecendo
então nessa temperatura durante 10 min.
32
4.4 Obtenção de extratos
Os frutos, cascas, raiz e folhas da R. ferruginea foram secos e moídos, e
posteriormente foi pesado aproximadamente 2g de cada parte separadamente. As
mesmas foram submetidas separadamente a um processo de extração por
maceração com etanol (EtOH) como solvente extrator durante sete dias.
Parte das cascas ainda foram submetidas a um processo de extração com
clorofórmio. Após filtração, o solvente foi removido por destilação em evaporador
rotatório sob pressão reduzida.
Os extratos foram nomeados de extrato dos frutos de R. ferruginea (RFEFR),
extrato das cascas de R. ferruginea (RFECA), extrato da raiz de R. ferruginea
(RFERA) e extrato das folhas de R. ferruginea (RFEFO).
4.5 Reação de amidação
Em um balão acoplado a um condensador de refluxo dissolveu-se 449 mg de
extrato dos frutos secos da R. ferruginea em 217 mg de dodecilamina e 30 mL de
THF, seguido de 129 mg de DCC (Dicicloexildiimida), este último foi adicionado
como catalizador da reação. A mistura foi aquecida sobre refluxo por um período de
3h e monitorada através de cromatografia em camada delgada (CCD) a cada 30
minutos, utilizando como fase móvel hexano:acetato (6:4) e como revelador químico
solução de anisaldeído sulfúrico. Após o término da reação o solvente foi evaporado
em temperatura ambiente e o produto da reação sem purificação prévia foi analisado
por bioautografia.
4.6 Reação esterificação
Em um balão acoplado a um condensador de refluxo dissolveu-se 200 mg de
extrato dos frutos secos da R. ferruginea em 40mL de metanol, seguido de
aproximadamente 8 gotas de ácido sulfúrico, sendo este o catalizador da reação. A
mistura foi aquecida sobre refluxo por um período de 150 min e monitorada por
cromatografia em camada delgada a cada 30 minutos, utilizando como revelador
químico anisaldeído sulfúrico. Após o término da reação o solvente foi evaporado em
temperatura ambiente, solubilizado em Hexano e analisado por CG/EM.
33
4.7 Coluna do extrato dos frutos após a reação de amidação
Cerca de 0,73g do extrato dos frutos de R. ferruginea após a reação de
amidação foi submetido à um processo de purificação por cromatografia em coluna.
Como fase móvel foram utilizados solventes de polaridade crescente, sendo esses:
hexano, acetato de etila e álcool etílico. Foram coletadas 110 frações, e dessas,
aquelas que apresentaram semelhanças de fator de retenção (Rf) através de CCD,
foram reunidas. As frações de interesse foram submetidas a análise por RMN e
CG/EM.
4.8 Coluna I: fração 70-72 do extrato clorofórmio das cascas
À partir do extrato clorofórmio das cascas I da R. ferruginea (73g) foi realizado
uma coluna cromatográfica utilizando como fase estacionária sílica-gel e fase móvel
uma mistura de solventes de polaridade crescente. Esta coluna foi realizada pela
acadêmica do Curso de Farmacia Noliana Backes como parte de seu Trabalho de
Iniciação Científica.
Dentre as frações obtidas, a fração 70-72 proveniente desta coluna (6,006g),
foi submetida a um novo procedimento cromatográfico. Como fase estacionária
utilizou-se sílica e como fase móvel foram utilizados solventes de polaridade
crescente, sendo esses: hexano, acetato de etila e metanol. Foram coletadas 144
frações, onde dessas, aquelas que apresentaram semelhanças de Rf quando
analisadas por CCD, foram reunidas e posteriormente avaliadas por RMN.
4.9 Coluna II: fração 95-98 do extrato clorofórmio das cascas
Outra fração que demonstrou excelente perfil por CCD foi a 95-98, e à partir
desta foi realizado um procedimento cromatográfico utilizando 1,3244g de amostra.
Como fase estacionária utilizou-se sílica e como fase móvel foram utilizados
solventes de polaridade crescente, sendo esses: hexano, acetato de etila e metanol.
Foram coletadas 141 frações, onde dessas, aquelas que apresentaram
semelhanças de Rf quando analisadas por CCD, foram reunidas. As frações de
interesse foram avaliadas por RMN e posteriormente por bioautografia.
34
4.10 Ensaio biautográfico
Para o direcionamento da pesquisa na localização dos componentes com
potencial antimicrobiano foi realizado o ensaio da bioautografia. Para tal foi
preparado um cromatograma com o extrato dos frutos de R. ferruginea (RFEFR), o
extrato dos frutos esterificado (RFEFR-ED) e o extrato dos frutos amidado (RFEFR-
AM) para análise da atividade frente à cepas de S. aureus e localização de
compostos com ação antimicrobiana.
O mesmo teste foi realizado com as frações de interesse provenientes da
coluna cromatográfica da fração 95-98, com o objetivo também de definir a
localização dos compostos com ação antimicrobiana nessas frações.
Durante a realização desse método foi utilizado o TSA como meio de cultura
sólido, onde primeiramente este foi fundido, inoculado com cepas de Staphylococcus
aureus ATCC e aplicado sobre a placa cromatográfica, na qual foi eluído as frações
e os extratos (bruto, amidado e esterificado). As placas foram incubadas
invertidamente por um período de 24h a uma temperatura de 37°C, onde durante a
incubação da placa, os compostos ultrapassam o meio por difusão formando zonas
de inibição do crescimento microbiano (DE SOUZA, 2003). Após foi realizada a
revelação das placas utilizando cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) como agente
revelador, podendo analisar as zonas de inibição das substâncias presentes no
extrato avaliado.
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Extratos Etanólico
Os extratos etanólicos das diferentes partes de R. ferruginea foram
obtidos por maceração. Após a evaporação do solvente foi calculado o
rendimento dos extratos conforme apresentado na Tabela 1, a fim de verificar se
estes apresentavam diferença no rendimento.
Tabela 1 – Rendimento dos extratos dos frutos, das cascas, folhas e raiz de R. ferruginea.
PARTE DA PLANTA QUANTIDADE
PESADA(g)
RENDIMENTO (g) RENDIMENTO (%)
Frutos 2,056 0,2815 13,69
Folhas 2,042 0,3320 16,26
Casca 2,014 0,3038 15,08
Raíz 2,069 0,5830 28,18
Os extratos das folhas e casca de R. ferruginea apresentaram rendimento
bastante semelhantes, com exceção dos extratos dos frutos e da raíz. Sendo que
destes, o que obteve maior rendimento foi o extrato da raiz.
As diferentes partes da planta possuem funções específicas. As folhas por
exemplo, são ricas em clorofila, que tem como função canalizar a luz do sol,
auxiliando assim no processo denominado de fotossíntese. Entretanto as plantas
produzem muito mais energia do que realmente necessitam, fazendo com que este
estoque de energia seja armazenado nas folhas, caules, raízes, frutos ou sementes
para uso posterior. As sementes e frutos ainda estocam grande parte dos nutrientes
(FERNANDO, 2012). Dentre as funções da raiz, encontra-se a fixação e a captação
de água e nutrientes sendo distribuída através do caule e ramificações por toda a
planta (HODGE et al., 2009).
Sabe-se que as membranas biológicas presentes nas plantas, são os
principais alvos da mudança de temperatura. As membranas biológicas são
compostas por lipídeos e proteínas que cercam células e organelas, essenciais no
processo de fotossíntese, respiração e transporte. Devido a esse fator, estudos têm
relacionado a presença de lipídios e ácidos graxos na planta à sensibilidade a
36
mudanças ambientais, tais como a diminuição da temperatura está associada a um
aumento na produção de ácidos graxos poliinsaturados, principalmente o ácido β-
linolênico (ROMÁN et al., 2012).
Os diferentes extratos também foram avaliados por CCD e apresentaram
perfis cromatográficos diversificados. Na figura 2 está apresentado a CCD dos
extratos em comparação aos padrões impuros do AMA e AMB isolados previamente
(COSTA, 2011). Pode-se verificar na raiz, nos frutos e cascas a presença do
composto AMA (Rf= 0,80). Porem o triglicerídeo apresentou Rf idêntico ao do AMA o
que pode levar a resultados duvidos. Já no extrato da raiz e casca houve predomínio
do AMB (Rf= 0,49). O extrato das folhas apresentou perfil diferente os demais
extratos. Neste não ficou evidenciado os ácidos mirsinóicos.
Figura 2 – CDD referente aos extratos provenientes das diferentes partes da R. ferruginea:
extrato da raiz (RFERA) (1), extrato das folhas (RFEFO) (2), extrato dos frutos (RFEFR) (3), extrato das cascas (RFECA) (4), AMA (5), AMB (6), triglicerídeo (TGL). Fase móvel Hexano: Acetato de Etila (6:4).
1 2 3 4 5 6 7
O OH
OH
1
2
34
5
6
7
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
10'9'
1"
2"
3"
4"
5"
AMA
O
O OH
OH1 2
3
4
5
6
71"
2"
1'2'
3'
4'
5'
3"
5"
4"
7'6'
8'
AMB
Os extratos dos frutos folhas e caules foram avaliados por Gazoni (2009),
onde foi possível isolar dos frutos o ácido mirsinóico A. Dos caules e folhas se isolou
o ácido mirsinóico B, o esterol espinasterol, ácidos graxos e alcoóis graxos. Os
frutos também foram avaliados por Costa (2011) onde foi isolado o AMA além de
triglicerídeos e alcoóis graxos. Já das cascas foram obtidos os ácidos mirsinóicos A,
37
B e C alem de ácidos graxos (FRONZA e GIURADELLI, 2009). Estes ácidos
mirsinoicos e o triglicerídeo são de importância, principalmente, devido aos
resultados obtidos frente a enzima acetilcolinasterase e sobre a memória de animais
normais e com DA induzida por estreptozotocina.
Quando comparados estruturalmente, tanto o AMA quanto o AMB apresentam
estruturas bem semelhantes, o qual a principal diferença se encontra no grupamento
fenol encontrado no AMA não representado no AMB. A transformação do AMA em
AMB ocorre através de uma reação de adição de água a dupla ligação adjacente ao
anel aromático.
Os extratos também foram analisados por RMN de 1H, visto que essa técnica
possibilita a análise de todos os hidrogênios presentes na amostra. Na figura 3 está
apresentado o espectro de RMN de 1H do AMB, AMA e do extrato dos frutos
(RFEFR). Foi possível verificar maior semelhança dos deslocamentos químicos do
espectro do extrato com o AMA. Pode-se confirmar tal resultado, através da seleção
de sinais exclusivos de cada composto utilizado para esta comparação. Sendo
assim, pode-se perceber um tripleto na região de 3,45 ppm referente a 4 hidrogênios
atribuídos aos metilenos H-1’ e H-1’’ que são característicos somente da molécula
de AMA. Existe sinais que são característicos para os ácidos mirsinóicos, como o
simpleto na região de 7,75 ppm referente aos hidrogênios do anel aromático
encontrados no AMA e no AMB. Os sinais referentes aos hidrogênios do glicerídeos
são encontrados na região de 0,5 a 2,5 ppm e de 3,0 a 4,5 ppm, mas como o AMA é
o majoritário estes sinais quase não são detectados
38
Figura 3 - Espectros de RMN ¹H ácido mirsinóico B (a) e ácido mirsinóico A (b) e extrato dos frutos de R. ferruginea (RFEFR) (c).
Na figura 4 estão apresentados o espectro de RMN de 1H do extrato etanólico
da raiz e dos ácidos mirsinoicos A e B. Observa-se que o extrato é majoritariamente
composto por ácido mirsinoico B. Isto pode ser comprovado no espectro de RMN 1H
pelo tripleto em 4,74ppm referente ao hidrogênio oximetínico H-2. Outro sinal
relevante nesta análise foi na região entre 5,12 e 5,31ppm com integral para 2
hidrogênios referentes aos hidrogênios olefínicos H-2’’ e H-4’’, assim como o
multipleto em 3,29ppm atribuído aos H-3 e H-1’’. O simpleto na região de 7,75ppm
referente aos hidrogênios aromáticos também foi possível de ser visualizado. Sinais
de glicerídeos e ácidos graxos não foram detectados devido a prevalência dos
ácidos mirsinoicos.
Não há na literatura nenhum trabalho referente a composição química da raíz
da R. ferruginea, porém neste trabalho foi possível concluir que este apresenta uma
composição muito parecida com as cascas.
a)
c)
b)
39
Figura 4 – Espectros de RMN ¹H ácido mirsinóico B (AMB) (a) e ácido mirsinóico A (AMA) (b) e o extrato da raiz de R. ferruginea (RFERA) (c).
Quando comparado ao espectro do AMA e AMB o extrato das cascas (Figura
5) apresentou similaridade ao AMB. O simpleto em 7,70 ppm corresponde aos
hidrogênios aromáticos H-2 e H-6. Além do tripleto na região de 4,80 ppm referente
a 4 hidrogênios atribuídos aos metilenos H-1’ e H-1’’, característicos da molécula do
AMB. Na figura 5 está apresentado o espectro de RMN de 1H das cascas e dos
ácidos mirsinoicos A e B.
a)
c)
b)
40
Figura 5 – Espectros de RMN ¹H ácido mirsinóico B (AMB) e ácido mirsinóico A (AMA) com o extrato das cascas de R. ferruginea (RFECA).
O extrato etanólico das folhas (Figura 6), não apresentou sinais específicos
para determinar a proporção do AMA e AMB dentro do extrato, bem como
apresentou na região de 4,20ppm um sinal não característico de nenhum dos
compostos em análise, confirmando o resultado demonstrado por CCD, o qual esse
extrato apresentava-se ausente de ambos os ácidos mirsinoicos avaliados.
a)
c)
b)
41
Figura 6 – Espectros de RMN ¹H ácido mirsinóico B (AMB) (a) e ácido mirsinóico A (AMA) (b) com o extrato das folhas de R. ferruginea (RFEFO) (c).
Após análise dos sinais presentes nos espectros, os dados foram transpostos
em tabelas para melhor comparação dos extratos com as substâncias. Na tabela 2
estão apresentados os valores de deslocamento dos extratos que coincidem com os
compostos isolados.
a)
c)
b)
42
O OH
OH
1
2
34
5
6
7
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
10'9'
1"
2"
3"
4"
5"
O
O OH
OH1 2
3
4
5
6
71"
2"
1'2'
3'
4'
5'
3"
5"
4"
7'6'
8'
Tabela 2 - Valores de deslocamento do RMN de 1H dos extratos dos frutos (RFEFR), das cascas (RFECA), folhas (RFEFO) e raiz (RFERA) referente ao AMA e AMB.
5.2 Reações de amidação e esterificação
Sabendo que o extrato dos frutos é constituído em grande parte por
substâncias ácidas como o AMA, além de triglicerídeo e ácidos graxos de cadeia
longa (GAZONI, 2009; COSTA, 2011), foi necessário realizar uma reação de
Carbono AMB
AMA
RFEFR RFECA RFEFO RFERA
1 2 4,73;t 7,69;s 7,70;s 4,74;t 3 3,17;m 4 7,75;s 7,75;s 5 6 7,75;s 7,69;s 7,70;s 7,75;s 1’ 3,38;m 4,80;t 2’ 1,54;m 5,34;t 5,34;t 1,54;m 1,58;m 3’ 2,11;m 2,10;m 2,11;m 4’ 5,11;t;5,30 5,11;t;5,30 5’ 2,08;m 2,10;m 6’ 1,62;s 5,12;d 5,07;d 1,62;s 7’ 1,30;s 1,30;s 8’ 1,68;s 1,72;s 1,68;s 1,68;s 9’ 1,74;s 1,77;s 10’ 1,63;s 1,60;s 1’’ 3,29;m 3,40;t 3,40;t 4,80;t 3,29;m 2’’ 5,11;t,5,30 5,34;t 5,34;t 5,11;t;5,30 5,12;t;5,31 3’’ 4’’ 1,72;s 1,74;s 1,77;s 1,72;s 1,73;s 5’’ 1,74;s 1,77;s
COOH
(1) (2)
43
esterificação para que o mesmo pudesse ser analisado por CG/EM. Sendo assim, o
intuito dessa reação era quebrar a cadeia lateral do triglicerídeo para que fosse
possível obter os ésteres metílicos dos ácidos graxos, bem como do AMA, já que os
compostos não podem ser avaliados em sua forma ácida.
A reação foi monitorada por CCD, conforme apresentado na figura 7, que
apresenta o monitoramento após duas horas de reação. Utilizou-se padrões de AMA
e AMB para avaliar o final da reação. Nota-se que a medida que a reação foi
ocorrendo, houve surgimento de novas manchas na placa com Rf de 0,39, 0,45,
0,63, 0,69 e 0,76 respectivamente, bem como ocorreu uma redução das manchas
relacionadas ao AMA. O AMB não foi detectado nesse extrato.
Figura 7 – CDD referente ao monitoramento da reação de esterificação dos frutos de R. ferruginea. Da esquerda para direita: Reação (1), extrato dos frutos de R. ferruginea
(RFEFR) (2), AMA (3) e AMB (4).
A reação de amidação foi realizada no intuito de obter a amida derivada do
AMA, uma vez que amidas derivadas do AMB foram obtidas por Tomio (2011) e
apresentaram valores de concentração inibitória (CI50) para células tumorais
inferiores aos observados para o AMB. Os derivados do AMB também foram
avaliados por biautografia frente a S. aureus, mas não apresentaram halos de
inibição (dados não publicados). Na figura 8 está apresentado a CCD do
monitoramento da reação. Pode-se observar que o AMA foi totalmente consumido
formando a amida de cadeia longa (12 carbonos) do AMA.
4 3 2 1
44
Figura 8 – CDD referente ao monitoramento da reação de amidação dos frutos de R. ferruginea. Da esquerda para direita: extrato dos frutos de R. ferruginea
(RFEFR) (1), Reação (2), AMA (3) e AMB (4).
Na figura 9 e 10 estão apresentados esquema das reações de esterificação e
amidação em relação ao AMA e de triglicerídeo ou ácidos graxos presentes no
extrato.
Figura 9 – Reação de esterificação do ácido mirsinóico A (AMA) (a) e amidação do ácido mirsinóico A (AMA) (b).
1 2 3 4
a)
b)
45
Figura 10 – Reação de esterificação (a) e amidação (b) do triglicerídeo ou ácidos graxos presentes no extrato dos frutos de R. ferruginea.
Assim como os extratos dos frutos, aqueles obtidos após a esterificação e
amidação também foram avaliados por RMN de 1H (figura 11). Os sinais na região
de 3,15ppm, 3,65ppm e 3,85ppm que aparecem como simpletos, referentes aos
hidrogênios de metoxilas confirmam que a esterificação ocorreu no extrato (Figura
11b), já que os mesmos não estão presentes no espectro do extrato. Os sinais na
região de 3,20 ppm e 6,55 ppm presentes no espectro do extrato amidado (figura
11a) confirmam que ocorreu a amidação.
a)
b)
46
Figura 11 – Espectros de RMN ¹H do extrato dos frutos da R. ferruginea amidado (RFEFR-AM) (a) e extrato dos frutos de R. ferruginea esterificado (RFEFR-ED) (b) com o extrato dos frutos de R. ferruginea (RFEFR) (c).
5.3 Avaliação por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de
massas (CG/EM)
O extrato esterificado dos frutos de R. ferruginea foi submetido a análise por
CG/EM com o objetivo de elucidar a cadeia lateral dos triglicerídeos e ou ácidos
graxos presentes no extrato. Esta análise é importante pois um estudo realizado por
Costa (2011), constatou que um triglicerídeo obtido dos frutos apresentou atividade
muito significativa na memória de animais com DA.
Na figura 12 está apresentado o cromatograma obtido do extrato dos frutos
esterificado. Os espectros de massas obtidos de cada pico foram comparados com
os espectros existentes na biblioteca de massas. A cadeia lateral dos ésteres é
constituída pelo ácido palmítico (14), ácido esteárico (15), ácido oléico (16), ácido
linoléico (11) e ácido linolênico (12).
a)
c)
b)
47
Figura 12 – Análise obtida por cromatografia a gás do extrato dos frutos de R. ferruginea.
Na figura 13 está apresentado o cromatograma do triglicerídeo esterificado
isolado anteriormente por COSTA (2011) e que foi possível, somente agora, a sua
avaliação. Pode-se observar composição semelhante aos ésteres de ácidos graxos
obtidos da esterificação direta com o extrato, somente as proporções são diferentes,
bem como a presença do ácido palmitoléico (17) não visualizado no extrato.
48
Figura 13 – Cromatograma de CG/EM do Glicerídeo esterificado (GLIE) obtido à partir de R. ferruginea.
Na tabela 3 estão apresentadas as substâncias constituintes do extrato
esterificado dos frutos de R. ferruginea (RFEFR-ED) em comparação com o
glicerídeo esterificado (GLIE) com suas respectivas proporções. Pode-se observar
semelhança entre as amostras analisadas.
Tabela 3 – Avaliação por CG/EM do Extrato esterificado dos frutos de R. ferruginea (RFEFR-ED) e do Glicerídeo esterificado (GLIE).
Na figura 14 estão representados as estruturas dos ésteres provenientes do glicerídeo após a esterificação.
GLICERÍDEO EXTRATO DOS FRUTOS
Substância Proporção
(%)
Proporção (%)
Ácido palmítico 54,37 19,06
Ácido palmitoleico 1,33 --
Ácido linoleico 32,55 42,29
Ácido oleico 8,06 32,30
Ácido esteárico -- 2,99
Ácido linolênico -- 3,35
49
Figura 14 – Fluxograma simplificado dos ésteres provenientes do Glicerídeo esterificado.
Sabendo que os ácidos graxos possuem influencia diretamente proporcional à
neurodegeneração não apenas na DA, mas também em outras doenças que
envolvem o Sistema Nervoso Central (SNC), esta pesquisa serve de subsídio
complementar à estudos realizados por Costa (2011) que avaliou essa amostra não
esterificada e obteve resultados muito promissores.
Como se pretendia isolar o ácido mirsinóico A e ácidos graxos amidados, foi
realizado uma coluna cromatográfica do produto da reação. Frações de interesse
foram avaliadas por CG/EM.
Na figura 15 está apresentado o cromatograma da fração 45-48 referente à
coluna do extrato dos frutos amidado. Pode-se observar a presença de três picos
majoritários na análise, o qual cada um deles foi analisado pelo espectro de massas
e comparados com os espectros existentes na biblioteca de massas.
MetOH + H2SO4
(13)
(11)
(12)
(14)
(15) (16)
(17)
50
Figura 15 - Cromatograma da fração 45-48 referente à coluna do extrato dos frutos amidado.
O espectro de massas do pico 1(Figura 16) ao ser comparado com a
biblioteca do massas, pode-se perceber que se trata de um dos ácidos graxos em
sua forma amidada. O pico intenso em 43 m/z pode caracterizar a presença da
cadeia lateral (C3H7) (SILVERSTEIN et. al, 2010).
Outro pico indicativo de que este espectro se trata de um dos ácidos graxos
amidado seriam os picos em 169 m/z referente à uma cadeia carbônica contendo 12
carbonos e em 212 m/z referente à cadeia carbônica contendo 12 carbonos mais a
amida. Ainda o pico em 227 m/z referente à uma cadeia carbônica contendo 16
carbonos e o pico em 240 m/z referente à uma cadeia carbônica contendo uma
amida são indicativos de que o pico 1 se trata do ácido linoleico amidado. É
importante ressaltar que a estrutura presente no espectro de massas sugerido pela
biblioteca possui apenas 79% de similaridade com a substância. A figura 16 mostra
os espectros de massa do pico 1 em comparação ao espectro encontrado na
biblioteca.
51
Figura 16 - Espectros de massas do composto correspondente ao pico 1 onde (a) espectro do composto e (b) espectro encontrado na biblioteca.
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
43
11457
86240212
22710071
142 186156353
296169 254 310 324
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
227
43
57240
73
21211486184 254128 296282142 324170156 310
NH
O
No espectro de massas do pico 2 (figura 17) percebe-se que este é bem
similar a substância do pico 1, possuindo os picos iniciais referente a série homóloga
de carbonos e a amida primária proveniente da quebra da ligação da cadeia
carbônica com o carbono da amida. Em 212 m/z também foi possível verificar o pico
referente à amida com 12 carbonos.
A principal diferença seria com relação ao íon molecular o que leva a
conclusão que pode se tratar de um ácido graxo com uma cadeia carbônica mais
longa. Quando comparado a biblioteca do massas a substância sugerida, presente
no espectro de massas da biblioteca, apresentou similaridade de 84% com a
substância em análise. A figura 17 mostra os espectros de massas do pico 2 em
comparação ao espectro encontrado na biblioteca.
b)
a)
52
Figura 17 - Espectros de massas do composto correspondente ao pico 2 onde (a) espectro do composto e (b) espectro encontrado na biblioteca.
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
43
57 114
73
24086 212
128142
184 296
367
254156 324268 338198 310
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
227
43
57367
24073
11486184 254128 296142 268 324156 200 310
NH
O
Por último, o pico 3 (figura 18) apresentou no espectro de massas, sinais
referentes à série homóloga de hidrocarbonetos e o pico referente à amida primária,
bem como o pico em 212 m/z referente à amida contendo 12 carbonos.
Não contendo outros picos que possam diferenciá-lo das substâncias
anteriores encontradas no cromatograma. Quando comparado com o espectro de
massas da biblioteca, a substância em análise apresentou similaridade de 85%.
Todavia através da estrutura química demonstrada sabe-se que o pico 3 não se trata
dessa substância. A figura 18 mostra os espectros de massas do pico 3 em
comparação ao espectro encontrado na biblioteca.
a)
b)
53
Figura 18 - Espectros de massas do composto correspondente ao pico 3 onde (a) espectro do composto e (b) espectro encontrado na biblioteca.
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
57
7143
18321295
109 395
155
50 100 150 200 250 300 3500.00
0.25
0.50
0.75
1.00(x10,000)
18357
43
71
95109
165
O
O
Na figura 19 está apresentado o cromatograma da fração 49-52 em
comparação a fração 45-48 referente à coluna do extrato dos frutos amidado. Pode-
se observar que além das três substâncias que já haviam sido detectadas na fração
anterior, a fração 49-52 conta com a presença de um quinto pico. A espectrometria
de massas do pico 4 foi descartada pelo fato de apresentar baixa similaridade as
substâncias presentes na biblioteca, impossibilitando a comparação. O pico 5 foi
analisado pelo espectro de massas e comparados com os espectros existentes na
biblioteca de massas.
Figura 19 - Sobreposição dos cromatogramas das frações 45-48 e 49-52 provenientes da coluna do extrato dos frutos amidado.
Através do espectro de massas do pico 5 pode-se perceber que esta
substância apresenta picos característicos de amida, tais como o pico em 212 m/z
referente a uma amida com 12 carbonos. Apesar do íon molecular representado no
54
espectro não condizer à estrutura do AMA amidado, podendo este não estar
relacionada a estrutura do composto em questão, um pico importante que
caracteriza esse composto como sendo o ácido mirsinóico A amidado é pico em 325
m/z referente à quebra da cadeia de hidrocarbonetos (12C) com a estrutura do AMA
amidado. Na figura 20 está representado o espectro de massa correspondente ao
pico 5 do cromatograma.
Figura 20 - Espectro de massas do composto correspondente ao pico 5.
50 100 150 200 250 300 350 4000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
212
43
30
71184
85257
114 186128 353 424240156 284 325
5.4 Ensaio Bioautográfico
O ensaio de bioautografia foi realizado para o direcionamento da pesquisa na
localização dos componentes com potencial antimicrobiano. No trabalho de Iniciação
Científica realizado pela acadêmica Katherine (2010) foi verificado halos de inibição
referentes aos ácidos mirsinóicos A e B, e para outras substâncias não identificadas
presentes nos extratos dos frutos e cascas de R. ferruginea frente à cepas de S.
aureus. No presente trabalho os extratos dos frutos esterificado e amidado foram
submetidos ao bioensaio no intuito de avaliar se a troca do grupo ácido por uma
amida influenciaria na atividade biológica. A figura 21 refere-se a este ensaio. O
extrato dos frutos apresentou o halo de inibição referente ao AMA (Rf= 0,76), já o
extrato dos frutos esterificado também apresentou um halo de inibição com o mesmo
Rf do AMA, indicando que a esterificação não foi concluída e esse composto
presente no extrato dos frutos esterificado se trata também do AMA, que confirma o
observado previamente por CCD quando a reação foi realizada. Já o extrato
amidado não apresentou nenhum halo de inibição, confirmando que a troca do
grupamento ácido por um éster ou amida interfere na atividade antimicrobiana.
55
Figura 21 – Bioautografia referente ao extrato dos frutos de R.ferruginea (RFEFR) (1), do extrato dos frutos esterificado (RFEFR-ED) (2) e do extrato dos frutos amidado (RFEFR-AM) (3). Fase móvel: Hexano:Acetato de etila (6:4).
Tendo em vista que diversas frações provenientes da coluna do extrato de
diclorometano das cascas de R. ferruginea realizada pela aluna Katherine
apresentaram atividade antimicrobiana, o qual dentre estas, a fração denominada
95-98 apresentou o melhor perfil antimicrobiano (KAZMIERCZAK, 2010) e foi
submetida a um novo procedimento cromatográfico. A figura 22 refere-se ao ensaio
bioautográfico das frações provenientes da coluna da fração 95-98 do extrato
diclorometano das cascas.
1 2 3
56
Figura 22 - Bioautografia referente às frações da coluna clorofórmio das cascas de R.
ferruginea. Da esquerda para direita: fração 33-39 (1), fração 40-56 (2), fração 65-72 (3), fração 90-102 (4), fração 103-117 (5), fração 131-139 (6), fração 141 (7). Fase móvel: Hexano:Acetato de etila (6:4).
A bioautografia das frações também apresentaram atividade antimicrobiana
para uma substância presente na fração 33-39 com Rf 1(spot 1), sendo necessário
fazer nova análise para confirmação deste resultado, considerando que o valor de Rf
1 não é adequado para análises por CCD, já que mais de uma substância podem
estar contidas na mesma região. Outra fração que apresentou halo de inibição frente
a cepas de S. aureus foi a fração 90-102 (spot 4). Nessa fração foram observados
dois halos de inibição com Rf= 0,04 e Rf=0,32.
Visto que as frações acima mencionadas apresentaram atividade
antimicrobiana surge a necessidade de elucidar a estrutura química desses
compostos com o objetivo de futuramente poder relacionar a estrutura com a
atividade apresentada, bem como demais substâncias purificadas presentes na
coluna.
Na análise espectroscópica por RMN 1H da fração 90-102 (figura 23), o sinal
como multipleto entre 7,5 a 8,0 ppm refere-se a hidrogênios aromáticos. Vários
sinais são encontrados entre 0,5 a 3,0 ppm indicando caráter de hidrocarboneto.
2 4 6 1 7 5 3
57
Entretanto será necessário realizar uma análise de RMN de 13C para tentar
caracterizar a substância.
Figura 23 - Espectro de RMN ¹H da fração 90-102 proveniente da coluna da fração 95-98 do extrato diclorometano das cascas de R. ferruginea.
O extrato das cascas foi previamente submetido a cromatografia em coluna
na tentativa de isolar os compostos de interesse. Algumas frações somente agora
avaliadas.
A fração denominada 70-72 foi submetida a procedimentos cromatográficos
da qual a fração 4 foi submetida a RMN de 1H (figura 24). Foi observado a presença
de dois simpletos próximo a 7,6 ppm atribuídos a hidrogênios de anel aromático.
Outro sinal de destaque são os dois dupletos em aproximadamente 0,7 ppm. Esses
sinais são característicos de anel ciclopropano. Esta informação pode indicar que
esta substância seja da classe das benzoquinonas encontradas no gênero Rapanea.
Faz-se necessário a análise de RMN 13C para identificar esta substância.
58
Figura 24 - Espectro de RMN ¹H da fração 4 proveniente da coluna da fração 70-72 do extrato diclorometano das cascas de R. ferruginea.
59
6 CONCLUSÃO
As análises espectroscópicas por RMN 1H demonstraram que o ácido
mirsinóico A é o composto presente em maior quantidade no extrato dos frutos
(RFEFR), já o ácido mirsinóico B pode ser encontrado em maiores quantidades no
extrato da raíz (RFERA) e também está presente no extrato das cascas (RFECA), já
o extrato das folhas (RFEFO) não apresenta nenhum dos dois compostos. Esses
resultados encontrados possibilita um melhor direcionamento para realização de
pesquisas com esses dois compostos.
Através da análise bioautográfica do extrato, extrato amidado e esterificado
tem como concluir que a troca do grupamento ácido presente na estrutura do AMA
por uma amida ou éster prejudica sua atividade antimicrobiana, fazendo com que a
presença do ácido na estrutura seja essencial para a atividade.
Das frações provenientes da coluna da fração 95-98, e que foram analisadas
por bioautografia, a fração 90-102 foi a que mais apresentou atividade
antimicrobiana, não sendo possível identificá-la através de RMN de 1H até o
momento, sendo necessário realizar uma análise por espectrometria de RMN de 13C.
Quando analisado por CG/EM, o extrato dos frutos (RFEFR) apresentou
resultados promissores, constatando que o mesmo é realmente rico em diversos
ácidos graxos quando em comparação com o GLIE. Os ácidos graxos presentes no
extrato são ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico e ácido
linolênico, sendo dentre estes o ácido linoleico o composto majoritário.
Ainda, através da análise por CG/EM das frações 45-48 e 49-52 referente a
coluna do extrato dos frutos amidados pode-se verificar que foi possível isolar o
ácido linoleico amidado e o AMA amidado respectivamente.
Á partir da coluna das cascas de R. ferruginea foi possível isolar um composto
pertencente da classe das benzoquinonas e outro composto que não se encontra
totalmente elucidado, sendo necessário realizar novas análises.
Os resultados do presente trabalho indicam a necessidade de continuar os
estudos fitoquímicos para que se possa esclarecer a estrutura química das
substâncias não identificadas, bem como esclarecer possíveis mecanismos
envolvidos na atividade antimicrobiana.
60
REFERÊNCIAS
ANTONIALLI, C. S.; SILVA, G. F.; ROCHA, L. W.; MONTEIRO, E. R.; SOUZA, M. M.; MALHEIROS, A.; YUNES, R. A.; QUINTAO, N. L. M. Antihyperalgesic effects of myrsinoic acid B in pain-like behavior induced by inflammatory and neuropathic pain models in mice. Anesthesia & Analgesia, v.115, n. 2, p. 461-469, 2012. ANVISA. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3/mec_animacao.htm. Acesso em: 11 de novembro de 2012. BACCARIN, T.; MUCENEEKI, R. S.; BRESOLIN, T. M. B.; YUNES, R. A.; MALHEIROS, A.; LUCINDA-SILVA, R. M. Development and validation of an HPLC-PDA method for the determination of myrsinoic acid B in the extracts of Rapanea ferruginea Mez. Talanta, v. 85, p. 1221-1224, 2011. BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009. BLUNT, S. B.; CHEN, T. B.; WIEMER, D. F. Prenylated benzoic acids from Rapanea myricoides. Journal of Natural Products, v. 6, n. 11, p. 1400-1403, 1998. BRAZ FILHO. Contribuição da fitoquímica para o desenvolvimento de um país emergente. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 229-239, 2010. BUTLER, M. S. Natural products to drugs: natural product derived compounds in clinical trials. Natural Products Reports, n.22, p. 162-95,2005. CALIXTO, J. B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin América. Journal of Ethnopharmacoly, 2005, n.100, p. 131-134. CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras, recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: Embrapa/CNPF, 1994. p. 640. CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, n. 1, p. 99-105, 1998. CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Breve Análise Histórica da Química de Plantas Medicinais: sua Importância na Atual Concepção de Fármaco Segundo os Paradigmas Ocidental e Oriental. In: Plantas medicinais: sob a ótica da química medicinal moderna.Chapecó: Argos, 2001, p. 18-46. CHIARADIA, M. C.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F. O estado da arte da cromatografia associada à espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas na análise de compostos tóxicos em alimentos. Química Nova, v.31, n.3, p.623-636, 2008. CHOMA, I. M.; GRSELAK, E. M. Bioautography detection in thin-layer chromatography. Journal of Chromatografy A, v.1218, p.2684-2691, 2011. COSTA, P. Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico e triglicerídeo sobre a memória de animais
61
normais e com Alzheimer induzido. 2011. 134 f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011. COSTA, P. R. R. Produtos naturais como ponto de partida para a descoberta de novas substâncias bioativas: Candidatos a fármacos com ação antiofídica, anticâncer e antiparasitária. Revista Virtual de Química, v. 1, n. 1, p. 58-66, 2009. FERARY, S.; AUGER, J.; TOUCHÉ, A. Trace identification of plant substances by combining gas chromatography-mass spectrometry and direct deposition gas chromatography-Fourier transform infrared spectrometry. Talanta, v. 43, p. 349-357, 1996. FERNANDO, W. G. D. Plants: An International Scientific Open Access Journal to Publish All Facets of Plants, Their Functions and Interactions with the Environment and Other Living Organisms. Plants, v. 1, p. 1-5, 2012. FILHO, R. B. Contribuição da fitoquímica para o desenvolvimento de um país emergente. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 229-239, 2010. FRANCISCO, I. A.; PINOTT, M. H. P. Cyanogenic glycosides in plants. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.43, n 5, p. 487-492, 2000. FUNARI, C. S.; FERRO, V. O. Uso ético da biodiversidade brasileira: necessidade e oportunidade. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n.2, p. 178-182, 2005. GALVAN, F. ; MONTEIRO, E.R. ; FRONZA, L. M. ; MALHEIROS, A. ; BÜRGER, C. ; SOUZA, M. M. Antinociceptive Effect Of Rapanea Ferruginea And Myrsinoic Acid B In a Rat Model For Painful Diabetic Neurophaty. In: INTERNATIONAL CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 6., 2007, Ribeirão Preto. Livro de Resumos... Ribeirão Preto, 2007. GAZONI, V. F. Análise fitoquímica e avaliação do efeito anticolinesterásico do extrato e compostos isolados da Rapanea ferruginea. 2009. 84 f. Dissertação (Mestrado) -Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, 2009. GITHIORI, J.B. et al. Anthelmintic activity of preparations derived from Myrsine africana and Rapanea melanophloeos against the nematode parasite, Haemonchus contortus, of sheep. Journal of Ethnopharmacology, v.80, p.187-91, 2002. GITHIORI, J.B. et al. The anthelmintic efficacy of the plant, Albizia anthelmintica, against the nematode parasites H. contortus of sheep and Heligmosomoides polygyrus of mice. Veterinary Parasitology, v.116, p.23-34, 2003. GURIB-FAKIM. Medicinal plants: Traditions of yesterday and drugs of tomorrow. Molecular Aspects of Medicine, v. 27, p. 1-93, 2006. HARDEN, G. J. Myrsinaceae. In: Flora of New South Wales. Kensington: New South Wales University Press. v. 1, p. 501-504, 1990. HESS, S. Atividade antinociceptiva do ácido mirsinóico B. Itajaí, 2006. Dissertação (Mestrado) – Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006. HESS, S.; PADOANI, C.; SCORTEGANHA, L. C.; HOLZMANN, I.; MALHEIROS, A.; YUNES, R. A.; MONACHE, F. D.; DE SOUZA, M. M. Assesment of mechanisms involved in
62
antinociception caused by mirsinoic acid B. Biological and Pharmaceutical Bulletin, v. 33, p. 209-215, 2010. HIROTA, M.; MIYAZAKI, S.; MINAKUCHI, T.; TAKAGI, T.; SHIBOTA, H. Myrsinoic acids B, C and F, anti-inflammatory compounds from Myrsine seguinii. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. v. 66, n.3, p. 655-659, 2002. HODGE, A.; BERTA, G.; DOUSSAN, C.; MERCHAN, F.; CRESPI, M. Plant root growth, architecture and function. Plant Soil, v.321, p. 153-187, 2009. ITO, S.; NARUSE, A.; TSUGANE, T.; SHIMURA S., inventor; Jpn. Tokkyo Koho. Myrsinoic acid as methioninase inhibitor for regulating bad breath. Japan patent JP 5089100 B2 20121205, 2012. JANUÁRIO, A. H.; DIAS F. M.; SILVA F. G.; VIEIRA P. C.; FERNANDES B. J. Dammarane and cycloartane triterpenoids from three Rapanea sp. Phytochemistry, v. 31, n. 4, p.1251-1253, 1992. JOLY, A. B. Botânica: Introdução à taxonomia vegetal. São Paulo: Companhia Editora Nacional, EDUSP, 1975, p. 504-505. KAZMIERCZAK, K. Avaliação da atividade antimicrobiana da Rapanea ferruginea. 2010. 50f. Monografia (graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2010. LEE, S. W.; MANDINOVA, A., inventor; PCT Int. Appl. Approaches to treat cancer using HB-EGF inhibitors such as myrsinoic acid A. United States patent US 20110060047 A1, mar/2011. LORENZI, H. Árvores brasileiras. Nova Odessa: Plantarum, 1992. p. 352. MADRIGAL, R.V. et al. Alkylresorcinols and alkenylresorcinols in Rapanea sp – Laetevirens seed lipids. Lipids, v.12, n.4, p.402-406, 1977. MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; NIERO, R.; FILHO, V. C. Considerações gerais sobre aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais. In: BRESOLIN, T. M. B.; FILHO, V. C.Fármacos e medicamentos: uma abordagem multidisciplinar. São Paulo: SANTOS, 2010. p. 17-44. MANGURO, L.O.A.; MIDIWO, J.O.; KRAUS, W.; UGI, I. Benzoquinone derivatives of Myrsine africana and Maesa lanceolata. Phytochemistry, v. 64, n. 4, p. 855-862, 2003. MARTIN, C. A.; ALMEIDA, V. V.; RUIZ, M. R.; VISENTAINER, J. E. L.; MATSHUSHITA, M.; SOUZA, N. E.; VISENTAINER, J. V. Ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6: importância e ocorrência em alimentos. Revista de Nutrição, v.19, n.6, p.761-770, 2006. MATTOS, F.B. Análise do efeito hipoglicemiante do extrato bruto da planta Rapanea sp. sobre a glicemia de animais hiperglicêmicos. 2006. 57 f. Monografia (Graduação)-Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006. MICHELIN, D. C., MORESCHI, P. E., LIMA, A. C., NASCIMENTO, G. G. F., PAGANELLI, M. O., CHAUD, M. V. Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, n. 4, p. 316-320, 2005.
63
MIYAMOTO, S.; APPOLINÁRIO, P. P.; DEROGIS, P. B. M. C.; YAMAGUTI, T. H. Metabolismo, oxidação e implicações biológicas do ácido docosahexaenóico em doenças neurodegenerativas. Química Nova, v.34, n.8, p.1409-1416, 2011. MIDIWO, J. O.; MWANGI, R. W.; GHEBREMESKEL,Y. Insect antifeedant, growth-inibiting and larviciadal compounds from Rapanea malanphloes (Myrsinaceae). International Journal of Biochemistry; v.16, n 2, p. 163-166, 1995a. MIZUSHIMA, Y. et al. Novel anti-inflammatory compouds from Myrsine seguinii, terpeno-benzoic acids are inhibitors of mammalian DNA polymerase. Biochemistry, Biophysical Acta General Subjects, v.1475, p. 1-4, 2000. MIZUSHIMA, Y.; SUGAWARA, F.; SAKAGUCHI, K.; YOSHIDA, H., inventor; Jpn. Kokai Tokkyo Koho. DNA polymerase λ inhibitors, anticancer agents, and antiinflammatory agents containing phenols, and method for screening of anticancer agents or antiinflammatory agents by testing of inhibitory activity against DNA polymerase λ. Japan JP 2005029571 A 20050203, 2005. MONTEIRO, E. R. 2010. Avaliação do potencial anti-hiperglicemiante do Ácido Mirsinóico B. Monografia (graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2010. MONTOVANI, P. A. B.; GONÇALVES JÚNIOR, A. C.; MORAES, A.; MONDARDO, D.; MEINERZ, C.; SHIKIDA, S. Atividade antimicrobiana do extrato de Capororoca (Rapanea sp). Revista Brasileira de Agroecologia, v. 4, n. 2, p. 3764-3767, 2009. NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, p. 311-335, 2012. PEREIRA, S. ; TESTONI, B.L. ; GIGLIO, K.C. ; A., Y. R. ; De SOUZA, M. M. ; MALHEIROS, A. Isolamento do Ácido Benzoico Prenilado da Rapanea sp. Avaliação da atividade Antinociceptiva do Extrato e do Composto Isolado. In: II ENCONTRO DE E PESQUISA EM SAÚDE : o SUS e a atenção á saúde da família, 2., 2004, Itajaí. Anais. Itajaí, 2004. PERES, T. B. Noções básicas de cromatografia. Biológico, v.64, n.2, p.227-229, 2002. PINHEIRO, A. L.; CARMO, A. P. T. Contribuição ao estudo tecnológico da canela-azeitona, Rapanea ferruginea (Ruiz e Pav.) Mez, uma espécie pioneira.I. Características anatômicas da madeira. Ciência Florestal, v.3, n.1, p.121-145, 1993. PINTO, A.C; SIQUEIRA, S. D. H.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A. Produtos naturais: atualidades, desafios e perspectivas. Química Nova., v.25, n.1, p.45-61,2002. PUPO, M. T.; GALLO, M. B. C.; VIEIRA, P. C. Biologia química: Uma estratégia moderna para a pesquisa em produtos naturais. Química Nova, v. 30, n. 6, p. 1446-1455, 2007. QIN, X.; DAI, Y.; LIU, N. Q.; LI, Z.; LIU, X.; HU, J.; CHOI, Y. H.; VERPOORTE, R. Metabolic Fingerprinting by 1HNMR for Discrimination of the Two Species Used as Radix Bupleuri. Planta Med, v. 78, p. 926-933, 2012. RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M.; MOORE, P. K. Farmacologia. 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012. p. 741. ROMÁN, A.; ANDREU, V.; HÉRNANDEZ, M. L.; LAGUNAS, B.; PICOREL, R.; RIVAZ, J. M. M.; ALFONSO, M. Contribution of the different omega-3 fatty acid desaturase
64
genes to the cold response in soybean. Journal of Experimental Botany, v. 63, n. 13, p. 4973-4982, 2012. SILVA, A. L. B. B. Princípios básicos de Ressonância Magnética Nuclear do Estado Sólido. São Carlos, SP: Edição do autor, 2005. SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X.; KIEMLE, D. J. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. 7 ed. Rio de Janeiro: L.T.C, 2010, p.490. SMÂNIA JR., A.; VALGAS, C.; SOUZA, S. M.; SMÂNIA, E. F. A. Screening methods to determinate antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology, v.38, p.369-380, 2007. SOUZA, V. C.; LORENZI, H. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Angioespermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2005. TAVARES, W. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo, do enterococo, e do pneumococo aos antimicrobianos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 33, n. 3, p. 281-301, 2000. TINOCO, S. M. B.; SICHIERY, R.; MOURA, A. S.; SANTOS, F. S.; DO CARMO, M. G. Importância dos ácidos graxos essenciais e os efeitos dos ácidos graxos trans do leite materno para o desenvolvimento fetal e neonatal. Caderno de Saúde Pública, v.23, n.3, p.525-534, 2007. TOMIO, T. A. Atividade citotóxica e antitumoral dos extratos e compostos isolados de Rapanea ferruginea e Piper aduncum. 2011. 172f. Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas (PMCF)- Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011. VLIETINCK, A. J. The future of Phytochemistry in the new millennium. In: 2000 Years of natural products research past, present and future, Ed. Teus J. C. Luijendijk, Phytoconsult, 2000.
