1

UNIVERSIDADE DE SO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE SO CARLOS

DEPARTAMENTO DE HIDRULICA E SANEAMENTO CENTRO DE RECURSOS HDRICO E ECOLOGIA APLICADA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA ENGENHARIA AMBIENTAL

GUILHERME CASONI DA ROCHA

AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL

So Carlos

2012

2

GUILHERME CASONI DA ROCHA

AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL

Tese apresentada Escola de

Engenharia de So Carlos, da

Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Doutor em

Cincias da Engenharia Ambiental

Orientadora: Profa. Dra. Eny Maria

Vieira

So Carlos

2012

2

GUILHERME CASONI DA ROCHA

AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL

Tese apresentada Escola de

Engenharia de So Carlos, da

Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Doutor em

Cincias da Engenharia Ambiental

Orientadora: Profa. Dra. Eny Maria

Vieira

So Carlos

2012

3

Autorizo a reproduo total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa, desde que

citada a fonte.

4

ROCHA, G. C. AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL. Tese apresentada Escola de Engenharia de So Carlos, da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor

em Cincias da Engenharia Ambiental

5

Dedico aos meus pais, Ivete e Jos por tudo o que fizeram por mim at hoje e por serem responsveis pela minha formao, aos meus irmos Gustavo e Mariana, minha av Maria, ao meu av Elvino (in memoriam), aos meus avs Joo e Ana Auta, minha grande namorada Paulinha por todo o apoio, pacincia, companheirismo e carinho e ao amigo Ozzy.

5

Dedico aos meus pais, Ivete e Jos por tudo o que fizeram por mim at hoje e por serem responsveis pela minha formao, aos meus irmos Gustavo e Mariana, minha av Maria, ao meu av Elvino (in memoriam), aos meus avs Joo e Ana Auta, minha grande namorada Paulinha por todo o apoio, pacincia, companheirismo e carinho e ao amigo Ozzy.

6

AGRADECIMENTOS

Dra. Eny Maria Vieira, pela oportunidade, orientao, pacincia e dedicao. amiga Daniela Cordeiro por toda a ajuda com as anlises de gua. amiga Luciana Teresa Dias Cappelini pelas analises cromatogrficas. Ao amigo Egberto da Fonseca Casazza pela ajuda no desenvolvimento dos mapas. Renata Pereira pela amizade e horas e horas de laboratrio. Ao amigo Raphael Teixeira Verbinnen pela ajuda no laboratrio. Ao amigo Dr. Ricardo Luvizotto Santos pela grande colaborao. Dra. Adriana S. Marcantonio pelo auxlio na conduo do experimento no Laboratrio Experimental do Setor de Aquicultura do Polo Regional do Vale do Paraba. Dra. Katia Cristina Barbaro e Dra. Claudia Maris Ferreira Mostrio, por todo o ensinamento, desde a iniciao cientfica. Aos amigos da Rep. Morada do Escorpio: Ubarana, Maranho, Claudinei, Marcio, Kenji, Yuri, Ricardo, Mateus... A todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a realizao deste trabalho. Ao Instituto de Qumica de So Carlos da Universidade de So Paulo pelo auxlio e colaborao. Ao Polo Regional do Vale do Paraba pelo auxlio e colaborao. Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias da Engenharia Ambiental pela oportunidade. Fundao de Amparo Pesquisa (FAPESP) pela concesso da bolsa de doutorado e pelo auxilio financeiro. Ao CNPq pela concesso da bolsa de doutorado.

7

RESUMO

ROCHA, G. C. Avaliao da Atividade Estrognica das guas do Rio Paraba do Sul. 2012. 173f. Tese (Doutorado em Cincias da Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.

A poluio da gua doce no estado de So Paulo ocorre por diversas causas. Entre

elas est a ineficincia do servio de tratamento de esgoto sanitrio. Alguns

componentes do esgoto sanitrio so desreguladores endcrinos, entre eles esto

os hormnios naturais e sintticos excretados pelos seres humanos. Estas

substncias causam modificaes no sistema reprodutivo como, por exemplo,

cncer, feminizao, alteraes na transcrio gentica, alterao nas gnadas,

induo sntese de vitelogenina, entre outros. O objetivo desse trabalho foi testar a

atividade endcrina das guas do rio Paraba do Sul, em Pindamonhangaba, SP.

Para tanto, amostras de gua do rio foram utilizadas para a quantificao dos

hormnios, 17-etinilestradiol, 17-estradiol e levonorgestrel por meio da tcnica de

cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Alm disso, foram realizados testes

crnicos com peixes (Danio rerio) no interior do rio e em laboratrio, e uma posterior

quantificao de vitelogenina. Os resultados no indicaram concentraes

detectveis dos hormnios pelo mtodo empregado. Entretanto, foi detectada a

induo de vitelogenina nos machos de Danio rerio. Esse fato indica a atividade

estrognica da gua utilizada. So necessrios outros estudos para a avaliao de

quais substncias presentes na gua, esto causando as alteraes endcrinas nos

peixes, entre eles a utilizao de ndices para priorizar o local inicial dessas

pesquisas. Esses estudos so importantes para a conservao da biodiversidade

aqutica do rio Paraba do Sul.

Palavras-chave: Danio rerio. 17-etinilestradiol. 17-estradiol. Levonorgestrel. Vitelogenina.

8

ABSTRACT

ROCHA, G. C. Evaluation of estrogenic activity in water samples from Paraiba do Sul River. 2012. 173f. Tese (Doutorado em Cincias da Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.

Freshwater pollution in So Paulo state, Brazil, occurs due a several reasons.

Among them there is the inefficiency of the sewage treatment service. Some sewage

components are endocrine disrupters, including natural and synthetic hormones

excreted by humans. These substances cause modification on reproductive system

such as cancer, feminization, gene transcription and gonad alterations, vitellogenin

synthesis induction, among others. The aim of this work was to evaluate the

endocrine activity of the river Paraba do Sul, at Pindamonhangaba city, Brazil. For

this, river water samples were collected for the quantification of the hormones, 17-

etinylestradiol, 17-estradiol and levonorgestrel by high performance liquid

chromatography (HPLC). Furthermore, chronic assays were performed with fish

(Danio rerio) into the river and in the laboratory, following quantification of biomarker

vitellogenin. The studied hormones were not detected by employed methods.

However, induction of vitellogenin in male of Danio rerio was detected indicating

estrogenic activity of water. Further studies are necessary for the assessment of

which substances into the water are causing the endocrine disruption in fish. These

studies are important for the preservation of aquatic biodiversity of the Paraiba do Sul

River.

Keywords: Danio rerio. Hormone, 17-ethinylestradiol. 17-estradiol. Levonorgestrel. Vitellogenin.

9

SUMRIO 1 INTRODUO................................................................................... 1

2 OBJETIVOS....................................................................................... 2

3 REVISO DA LITERATURA............................................................. 4

3.1 Poluio............................................................................................. 4

3.2 Contaminantes emergentes............................................................... 9

3.2.1 Desreguladores endcrinos............................................................... 10

3.3 Estudos com desreguladores endcrinos em ambientes aquticos.. 13

3.4 Hormnios sintticos e naturais e sua ocorrncia em ambientes

aquticos...........................................................................................

14

3.4.1 Origem dos principais hormnios e naturais sintticos que ocorrem

em ambientes aquticos....................................................................

15

3.5 Organismos teste e biomarcadores de desreguladores endcrinos. 19

3.5.1 Vitelogenina....................................................................................... 20

3.6 Efeitos dos desreguladores endcrinos nos organismos vivos......... 21

3.7 Conservao da biodiversidade em guas continentais................... 26

3.8 reas crticas..................................................................................... 28

3.8.1 Mapeamento...................................................................................... 28

3.8.2 reas potencialmente crticas no Brasil............................................. 29

4 MATERIAIS E MTODOS................................................................. 35

4.1 Validao de mtodo para a quantificao dos hormnios

sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural

17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia

(HPLC)...............................................................................................

35

4.1.1 Condies cromatogrficas para a determinao dos hormnios

em estudo.........................................................................................

35

4.1.2. Validao do mtodo para determinao dos hormnios em estudo 36

4.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-

etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol

e de amostras do rio Paraba do Sul.................................................

38

4.3 Coleta das amostras de gua no rio Paraba do Sul......................... 40

4.4 Testes com Danio rerio...................................................................... 45

4.4.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes

10

com gua do rio Paraba do Sul........................................................ 45

4.4.2 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no

rio Paraba do Sul..............................................................................

45

4.4.3 Teste crnico ex situ com Danio rerio............................................... 46

4.5 Determinao da concentrao de vitelogenina em peixes.............. 49

4.6 Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua

com desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na

bacia do rio Paraba do Sul...............................................................

52

4.6.1 ndice de Prioridade dos Municpios IPM....................................... 56

5 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................... 60

5.1 Validao de mtodo analtico para a quantificao dos hormnios

sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural

17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia

(HPLC)...............................................................................................

60

5.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-

etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol

e de amostras do rio Paraba do Sul atravs de anlise

cromatogrfica...................................................................................

72

5.2.1 Levonorgestrel................................................................................... 72

5.2.2 17-estradiol...................................................................................... 78

5.2.3 17-etinilestradiol............................................................................... 82

5.3 Testes com Danio rerio...................................................................... 88

5.3.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes

com gua do rio Paraba do Sul........................................................

88

5.3.2 Teste crnico ex situ com espcie de peixe Danio rerio................... 89

5.3.3 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no

rio Paraba do Sul..............................................................................

94

5.3.4 Determinao da concentrao da vitelogenina em Danio rerio

utilizados nos testes crnicos ex situ e in situ...................................

96

5.3.5 Comparao dos testes in situ e testes ex situ................................. 125

5.4 Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua

com desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na

bacia do rio Paraba do Sul...............................................................

127

11

5.4.1 Qualidade de gua............................................................................ 128

5.4.2 Populao total, Razo de Sexos e Taxa Geomtrica de

Crescimento Anual da Populao.....................................................

135

5.4.3 Produo Pecuria (bovinos, sunos e ovinos)................................ 137

5.5 ndice de Prioridade dos Municpios IPM...................................... 145

6 CONCLUSES.................................................................................. 149

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 151

1

1 INTRODUO Os seres humanos so expostos a milhares de produtos qumicos ao

longo de sua vida. Esse contato se d em geral atravs do ar, gua e alimentos.

Muitos desses compostos podem ser txicos e ter como efeito a alterao do

sistema endcrino (SCHUG et al., 2011).

Destaca-se a importncia da obteno do conhecimento com relao aos

efeitos causados por substncias que possuem atividade estrognica e so

constantemente utilizadas e lanadas ao ambiente atravs do esgotamento dos

efluentes de atividades antrpicas, como o caso dos hormnios naturais e

sintticos. Com isso pretende-se indicar efeitos provocados por substncias

desreguladoras endcrinas na fauna aqutica e assim, contribuir com

informaes que permitam identificar o problema.

De acordo com a prpria legislao brasileira, Resoluo CONAMA 357,

em seu captulo IV inciso 1: O efluente no dever causar ou possuir potencial

para causar efeitos txicos aos organismos aquticos no corpo receptor, de

acordo com os critrios de toxicidade estabelecidos pelo rgo ambiental

competente (BRASIL, 2005). Alm dos possveis riscos sade da populao,

outros problemas podem ser detectados em relao aos estoques naturais de

peixes, devido ao processo de feminizao, que pode existir em locais

contaminados.

O Brasil tem a obrigao de cumprir as metas propostas pela Conveno

sobre Diversidade Biolgica (UICN; WWF-BRASIL; IP, 2011). Portanto aes

para que a Meta 08 (controle de poluio das guas) se concretize devem ser

tomadas, dentre as quais o monitoramento dos cursos dgua.

O desenvolvimento econmico do Brasil proporciona uma condio

semelhante encontrada em pases ricos, a grande gerao de efluentes

oriundos de aes antrpicas. Entretanto, h uma diferena importantssima

entre as duas situaes, enquanto em pases desenvolvidos esse efluente

devidamente tratado, no Brasil no ocorre o mesmo (LEUSCH et al., 2006). Por

este motivo h uma grande contaminao de nossos corpos dgua com

1

2

poluentes, muitos deles possuidores de ao endcrina mesmo que em

pequenas quantidades.

Quando se analisa essa situao, e se avaliam regies com grande

concentrao populacional, conseqentemente tem-se a presena de

hormnios, como o potente e mais abundante estrognio de ocorrncia natural

nos seres humanos, o17-estradiol. Da mesma forma, devido aos mtodos

anticoncepcionais utilizados em larga escala pela populao feminina, h a

contaminao dos efluentes sanitrios pelos estrognios sintticos como, por

exemplo, um dos mais consumidos, o 17-etinilestradiol (em muitos casos

associado ao levonorgestrel), que produzido a partir do 17-estradiol, este

hormnio tambm utilizado em terapias de reposio hormonal (KHANAL et

al., 2006).

Devido a essa contaminao contnua dos efluentes sanitrios por

hormnios sintticos e naturais, associado aos baixos ndices de tratamento,

necessrio que existam estudos referentes situao (qualidade) das guas dos

rios onde esses contaminantes so despejados, como o caso do rio Paraba

do Sul. At mesmo porque, a exposio da populao humana a essas

substncias pode estar relacionada ao aumento dos casos de diversos

problemas de sade publica tais como, sndrome de disfuno testicular, cncer

nos testculos, criptorquidia, hipospadia, entre outros (SHARPE; IRVINE, 2004;

SAFE, 2004, SLOWIKOWSKA-HILCZER, 2006). O municpio de

Pindamonhangaba localiza-se jusante de 3 municpios com populaes

expressivas (comparadas aos outros municpios do Vale do Paraba), Jacare,

Taubat e principalmente So Jos dos Campos, sendo um local estratgico

para se avaliar os efeitos causados pela poluio montante, gerada pelo

efluente sanitrio lanado no rio Paraba do Sul e seus afluentes.

2

3

2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade estrognica das

guas do rio Paraba do Sul em dois trechos localizados no municpio de

Pindamonhangaba, Estado de So Paulo.

2.2 Objetivos especficos

Validar mtodo para a quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol

e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol;

Identificar e quantificar os hormnios sintticos 17-etinilestradiol e

levonorgestrel e o hormnio natural 17-estradiol em amostras de gua do rio

Paraba do Sul;

Realizar teste crnico com Danio rerio em tanques rede mantidos no rio Paraba

do Sul;

Realizar teste crnico com peixe Danio rerio, em laboratrio com a utilizao de

amostras de gua do rio Paraba do Sul;

Quantificao da protena vitelogenina (VTG) nos peixes da espcie Danio rerio;

Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua com

desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na bacia do rio Paraba

do Sul

3

4

3 REVISO DA LITERATURA 3.1 Poluio

A urbanizao em grande escala, em conjunto com o grande nmero de

cidades, principalmente em pases em desenvolvimento econmico, traz em

muitos casos, um desenvolvimento no ordenado dessas comunidades e

conseqentemente, a elevao do risco sade de seus habitantes (GRAHAM

et al., 2004). O crescimento no ordenado das cidades causa a elas grandes

problemas decorrentes da falta de planejamento, essas dificuldades so de

ordem administrativa e financeira. A adequao de servios essenciais como,

por exemplo, saneamento bsico, distribuio de gua, coleta e destinao do

lixo, sade, moradia, entre outros, feita de maneira pontual, o que eleva os

riscos de problemas populao e ao meio ambiente (GOUVEIA, 1999).

Entre as conseqncias da falta ou ineficincia dos servios bsicos

anteriormente citados, destaca-se a poluio dos diversos ambientes, aqutico,

terrestre e areo.

De acordo com o regulamento da Lei Estadual 997, de 31 de maio de

1976 (SO PAULO, 1976), que dispe sobre a preveno e o controle da

poluio do meio ambiente no Estado de So Paulo, considera-se poluente toda

e qualquer forma de matria ou energia lanada ou liberada nas guas, no ar e

no solo:

I - com intensidade, em quantidade e concentrao, em desacordo com os

padres de emisso estabelecidos neste Regulamento e normas dele

decorrentes;

II - com caractersticas e condies de lanamento ou liberao, em desacordo

com os padres de condicionamento e projeto estabelecidos nas mesmas

prescries;

4

5

III - por fontes de poluio com caractersticas de localizao e utilizao em

desacordo com os referidos padres de condicionamento e projeto;

IV - com intensidade, em quantidade e de concentrao ou com caractersticas

que, direta ou indiretamente tornem ou possam tornar ultrapassveis os padres

de qualidade do Meio Ambiente estabelecidos neste Regulamento e normas dele

decorrentes;

V - que, independente de estarem enquadrados nos incisos anteriores, tornem

ou possam tornar as guas, o ar ou o solo imprprios, nocivos ou ofensivos

sade, inconvenientes ao bem-estar pblico; danosos aos materiais, fauna e

flora; prejudiciais segurana, ao uso e gozo da propriedade, bem como s

atividades normais da comunidade (CETESB, 2000).

Poluio do ar

Segundo Sewell (1978), a poluio do ar pode ser definida como a

presena de diversos materiais estranhos no ar atmosfrico. O ar considerado

normal tem que possuir, em sua composio, mais de 99,99% de nitrognio

(aprox. 78,09%), oxignio (aprox. 20,94%), argnio (aprox. 0,95%) e dixido de

carbono (aprox. 0,03%), alm de outros diversos componentes que se

encontram em quantidades baixssimas, excetuando-se esses componentes, a

presena de outros compostos considerada poluio. Entretanto, o ar

normalmente encontrado em centros urbanos contaminado por outros

elementos, por exemplo, monxido de carbono, dixido de enxofre e metano,

muitas vezes em quantidades excessivas. As principais fontes de poluio do ar

so as indstrias e os automveis, essa contribuio vem com a volatilizao de

alguns metais pesados dos combustveis (FULGNCIO, 2007)

A via de absoro dos poluentes presentes no ar a que leva o poluente

mais rpido corrente sangunea dos humanos. De acordo com Wang et al.

(2003a), a queima de combustveis fsseis, como j comprovado, libera no ar

5

6

substncias que possuem atividade estrognica (fenis), alm disso, podem agir

negativamente sobre a atividade da progesterona (WANG et al., 2005a). Os

contaminantes presentes no ar podem chegar, por deriva, ao solo e aos recursos

hdricos.

A poluio do solo De acordo com Snchez (1998), existem vrios termos utilizados como

sinnimo de rea contaminada como, por exemplo, terreno contaminado, solo

contaminado ou mesmo solo poludo. A definio de rea contaminada segundo

Van Dyck (1995) a de um local onde, como resultado de atividades antrpicas,

encontram-se resduos ou onde a poluio do solo ocorre ou ir ocorrer.

A contaminao do solo pode ter como origem a poluio difusa ou por

deposio atmosfrica (HANN, 2007; GIROTTO et al., 2007). A forma mais

comum de contaminao ao homem a ingesto de alimento contaminado

(REYS, 2001; AMARAL MENDES, 2002).

A contaminao pode ser atribuda bioacumulao nos animais criados

com a finalidade de alimentao. Esses animais recebem hormnios sintticos

para estimular o crescimento que podem ficar acumulados e atingir o homem,

alm disso, so eliminados no solo contaminando o mesmo (SHARPE, 2003). A

presena de hormnios provenientes de sunos e de bovinos descrita por

Lange et al. (2002), e a concentrao de hormnios da ordem de 2300 g/dia

e 540 g/dia, respectivamente. Ainda destaca-se o fato de que muitas vezes

esses dejetos com a presena de hormnios e outras substncias serem

utilizados como adubo na agricultura.

So muitos os problemas causados por reas contaminadas e Snchez

(1998) indica quatro principais: risco segurana da populao ou das

propriedades; riscos sade pblica e dos ecossistemas; impedimento do

desenvolvimento urbano e a reduo do valor imobilirio de propriedades.

Sabe-se que uma vez o poluente estando presente no solo o destino final

poder ser os recursos hdricos e os organismos aquticos.

6

7

Poluio da gua

Geralmente a poluio da gua ocorre por meio da incluso de

substncias ou formas de energia que alteram as caractersticas fsico-qumicas

do corpo dgua de modo a limitar o seu uso. A poluio que ocorre em corpos

dgua pode ter origem em diversos tipos de fontes: atmosfricas, pontuais,

difusas e mistas (TUCCI, 1998).

As fontes pontuais, identificveis no espao e no tempo, de poluio so

caracterizadas pela forma concentrada que os contaminantes atingem o corpo

dgua, enquanto a difusa indica a chegada da poluio ao longo da extenso do

corpo dgua (VON SPERLING, 2005 e MAURCIO, 2008).

Segundo Tucci (1998), os diversos poluentes apresentam caractersticas

distintas, com diferentes graus de poluio, conforme destacado na Tabela 1.

Tabela 1 - Caractersticas das fontes de poluio

Fontes Bactria Nutrientes Pesticidas /Herbicidas

MIcropoluentes Orgnicos Industriais

leos/ Graxas

Atmosfera 1 3-G 3-G Fontes Pontuais Esgoto domstico 3 3 1 3 Esgoto industrial 1 3-G 2 Fontes Difusas Agrcolas 2 3 3-G Dragagem 1 2 3 1 Navegao e Portos 1 1 1 3 Fontes Mistas Escoamento Urbano e depsitos de lixo 2 2 2 2 2

Depsitos de cargas industriais 1 1 3 1

(1) Fonte de significncia local; (2) de moderada significncia local/regional; (3) de significncia regional; (G) de significncia global. Fonte: Tucci (1998)

Outra definio utilizada a de que a poluio das guas acontecer

quando atingirem a elas, substncias que de algum modo possam causar algum

tipo de risco, segundo Fiorillo (2007), a poluio da gua depende do

lanamento, descarga ou emisso de substncias em qualquer estado qumico,

7

8

de forma a comprometer, direta ou indiretamente, as propriedades naturais da

gua.

Quando a matriz poluda gua superficial, Dersio (2007) as classifica

em cinco tipos:

Poluio natural: no causada por atividades humanas, e sim por chuvas, salinizao, decomposio de matria orgnica.

Poluio industrial: resultante dos processos industriais podem ser lquido, gases ou slidos.

Poluio urbana: advinda do esgoto sanitrio

Poluio agropastoril: tem origem na aplicao de defensivos agrcolas e fertilizantes, excrementos animais e eroso.

Poluio acidental: decorrentes de derramamentos acidentais de substncias qumicas.

Ocorre tambm, a classificao da poluio da gua como sendo poluio

difusa, as do tipo natural e agropastoril, e como poluio concentrada a

industrial, urbana e acidental. A poluio urbana pode ser considerada tambm

como difusa por considerar os poluentes carreados pela gua de drenagem

(PMSP, 1999).

O lanamento de esgoto sanitrio sem tratamento prvio em cursos

dgua implica na contaminao dessas guas por diversas substncias. Esses

contaminantes so definidos como xenobiticos e podem ter origem natural ou

antropognica (LIVINGSTONE, 1993; 1998). Substncias sintticas com ao

estrognica podem ser chamadas de xenoestrgenos por alguns autores (CIRJA

et al., 2008; JANEX-HABIBI et al., 2009; LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009;

RODGERS-GRAY et al., 2000; WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011).

Os xenobiticos fazem parte de um grupo de substncias que, em alguns

casos, causam estresse aos organismos presentes no corpo dgua por eles

8

9

contaminado. O estresse pode ser definido como uma condio na qual o equilbrio dinmico do organismo (homeostase) quebrado, como resultado de

aes de um estmulo intrnseco e/ou extrnseco, chamado estressor

(PICKERING, 1981). Indivduos submetidos a condies estressantes passam

por mecanismos compensatrios quebra da homeostase, ou seja, do equilbrio

dinmico do organismo do animal, segundo Adams (1990).

3.2 Contaminantes emergentes

Um dos recursos fundamentais para a sobrevivncia do homem a gua.

Mais de 20% da gua doce acessvel tem o uso domstico, agrcola e industrial

como destino. Entretanto, essas modalidades de uso, na maioria dos casos,

trazem gua uma serie de contaminantes e por esse motivo a poluio est se

tornando um dos principais focos do olhar do poder pblico em todo o mundo

(SCHWARZENBACH et al., 2006).

Um grupo de substncias encontradas em baixas quantidades no meio

aqutico, chamadas de contaminantes emergentes, tem despertado cada vez

mais interesse, uma vez que, em sua maioria, no so regulamentadas.

Entretanto, com a ocorrncia de novos estudos, esses compostos tendem ter

uma regulao dependendo de suas caractersticas de atuao junto ao

ambiente nos quais so descartados (OLLER; MALATO; SNCHEZ-PREZ,

2011).

Os contaminantes emergentes abrangem produtos farmacuticos e de

higiene pessoal, subprodutos industriais, hormnios naturais e drogas ilcitas,

produtos da indstria qumica. Devido ao fato de serem detectados em

pequenas quantidades (na ordem de ng L-1 e g L-1), so denominados micro

poluentes, entretanto os mesmos podem se acumular, no solo, sedimento, gua

e seres vivos. Esses contaminantes podem ser substncias potencialmente

txicas, tanto para o ambiente, quanto para humanos; novos compostos

9

10

desenvolvidos ou mesmo contaminantes recentemente classificados (JOBLING

et al., 1998; KUMMERER, 2011).

Esses contaminantes apresentam, em diversas escalas, risco ao equilbrio

dos ecossistemas, esses riscos esto sendo conhecidos conforme estudos so

desenvolvidos, mas ainda h uma grande lacuna relacionada a esse assunto. A

falta de conhecimento devida entre outras causas complexidade dessas

substncias, sua distribuio, seus nveis txicos, efeitos no ambiente. Os

estudos realizados at a dcada passada consideravam os produtos

convencionais (DAUGHTON; TERNES, 1999), mas agora os novos

contaminantes (emergentes) esto comeando a receber a devida ateno.

3.2.1 Desreguladores endcrinos

Termo utilizado pela primeira vez por Theo Colborn e seus colaboradores

em 1991, sendo que a primeira publicao que citou o termo data de 1992

(MATTHIESSEN, 2003; GEROLIN, 2008).

Algumas das substncias encontradas em ambientes naturais e que

podem causar estresse aos animais, so conhecidas como desreguladores

endcrinos (DE). Existem diversas definies para desreguladores endcrinos,

uma delas, adotada pelo Programa Internacional de Segurana Qumica (IPCS),

em conjunto com o Japo, os EUA, o Canad, a OECD e a Unio Europia,

define da seguinte maneira: Um desregulador endcrino uma substncia ou

um composto exgeno que altera uma ou vrias funes do sistema endcrino e

tm, conseqentemente, efeitos adversos sobre a sade de um organismo

intacto, sua descendncia, ou subpopulaes (CEC, 1999).

De acordo com outra definio, desta vez com coautoria de Ribeiro et al.

(2006), substncias de origem natural ou qumica com a capacidade de causar

interferncia no sistema endcrino de organismos alterando sua sade,

reproduo e crescimento so denominados desreguladores endcrinos, ou inda

podem ser chamados de perturbadores ou interferentes endcrinos. As

alteraes causadas por estas substncias ocorrem nos stios receptores das

clulas, modificando os nveis de produo referentes a essa clula. Essa

10

11

modificao pode aumentar ou diminuir a produo hormonal, o que leva a uma

modificao na homeostase do organismo atingido. As modificaes ocorridas

poder ser observada imediatamente no organismo, ou ao longo do tempo e at

mesmo em suas futuras geraes (LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009; DINIZ et al.,

2010).

Segundo Damstra (2002), desreguladores endcrinos possuem

caractersticas de serem substncias que causam alteraes nas funes do

sistema endcrino e que por conseqncia traz danos a um organismo sadio e

em seus descendentes

A ao dos desreguladores endcrinos d-se pelo bloqueio, mimetizao,

estimulao, ou inibio da produo dos hormnios naturais (NIEHS, 2010,

E.HORMONE, 2012). Os desreguladores endcrinos apresentam muitos

mecanismos que facilitam a sua disperso e difuso no ambiente, alm de

impedir ou ao menos dificultar sua eliminao dos organismos vivos. (WHALEY;

KEYES; KHORRAMIL, 2001; RITTLER; CASTILLA, 2002; MAXIMIANO et al.,

2005, AURIOL et al., 2008; DUARTE, 2008; LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009;

WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011). Esses mecanismos podem ser descritos

como:

Bioacumulao/lipoflicos muitos desreguladores endcrinos apresentam a capacidade de se depositarem nos organismos, atingindo altos nveis de

concentrao e que podem ser prejudiciais a esses organismos. A

bioacumulao ocorre principalmente nos tecidos adiposos, leite e na gema do

ovo, algumas substncias permanecem por um longo perodo de tempo nesses

tecidos podendo ocorrer sua transferncia para outros indivduos atravs da

cadeia alimentar, inclusive atingindo ao homem;

Persistncia alguns desreguladores endcrinos demoram vrios anos para serem biodegradados;

Sinergia habilidade de diversos compostos de interagirem, e em alguns casos, gerando efeitos maiores;

11

12

Conjugao ligao entre desreguladores endcrinos e o organismo, o que impede a sua eliminao e conservando a sua concentrao por longo perodo

de tempo.

Existem alguns grupos de substncias com potencial ao desreguladora

do sistema endcrino (STUART; LAPWORTH, 2012) como, por exemplo:

Agrotxicos (componente principal, metabolitos)

Produtos farmacuticos (de uso humano, veterinrio, ilcito)

Compostos relacionados a hbitos da populao (ex. nicotina, cafena)

Produtos de higiene pessoal (ex. filtros de raios ultravioleta, almscar, DEET

utilizado em repelentes de insetos, triclosan componente de cremes dentais,

detergentes e sabonetes)

Aditivos industriais e subprodutos (ex. conservante dioxina, bisfenois,

combustveis contendo MTBE)

Aditivos de itens alimentares (antioxidantes BHA BHT)

Subprodutos do tratamento de gua (THM, NDMA)

Anti chamas, anti fogo (fosfato de quila, PBDE)

Surfactantes (PFOS e PFOA, alquilfenis utilizados em veculos, mobilirio,

tecidos, carpetes)

Hormnios e esteris

Lquidos inicos

Estudos demonstram uma grande diversidade destas substncias

encontradas em ambientes naturais, tais como: esterides naturais, produtos

farmacuticos, produtos qumicos industriais, substncias tensoativas, polmeros

de baixa massa molecular, alquifenois, hidrocarbonetos poli-aromticos (HPAs),

nonilfenol, octilfenol, pesticidas, bisfenol A, surfactantes, ftalato, estireno, entre

outras (GRAY et al., 2000; BIRKETT; LASTER, 2003; LINTELMANN et al., 2003;

UNEP, 2003; HEINSTERKAMP; GANRASS; RUCK, 2004; SUZUKI et al., 2004;

BARRA et al., 2005; MOZAZ; LOPEZ DE ALDA; BARCEL, 2005; PETROVIC et

al, 2005; CHAPMAN, 2006, MCGOVERN; MCDONALD, 2003; GROSS et al.,

12

13

2003; FENT; WESTON; CAMINADA, 2006; SERVOS; SERVOS, 2006;

KHETAN; COLLINS, 2007, FALCONER et al., 2006; DINIZ et al., 2010).

3.3. Estudos com desreguladores endcrinos em ambientes aquticos

Durante anos os estudos tendo como objeto a gua, na maioria dos casos

levavam em conta apenas a concentrao de oxignio, nitratos, fosfatos e

slidos em suspenso presentes, para determinar a sua qualidade. Esse quadro

vem mudando gradualmente e atualmente outras substncias como, por

exemplo, os desreguladores endcrinos, tm sido estudadas (CIRJA et al.,

2008). Contudo, ainda no so suficientemente estudadas as caractersticas de

cada um desses compostos (BRAGA et al., 2005). Muitas dessas substncias

que esto presentes nos recursos hdricos, contaminando-os, ainda no tm

seus efeitos em longo prazo bem definidos (WISE; OBRIEN; WOODRUFF,

2011).

H aproximadamente duas dcadas os estudos que tem como alvo

substncias com potencial de causar alteraes endcrinas tem aumentado

gradativamente. Esses contaminantes so capazes de, mesmo em pequenas

quantidades (na ordem de ng L-1 e g L-1), interagir e trazer danos a organismos

que habitam o subsolo, sedimentos, mares, rios e lagos (WANG et al., 2003b;

LAMBROPOULOU; ALBANIS, 2004).

Entretanto, a ocorrncia da desregulao endcrina no novidade, pois

nas dcadas de 1970 e 1980 foi comprovado que o dietilestilbestrol (DES),

criado inicialmente para servir como medicamento antiabortivo causou

problemas nos sistemas reprodutivos femininos e masculinos (SOTO;

SONNENSCHEIN, 2002). Tambm na dcada de 80 pescadores britnicos

observaram peixes da espcie Rutilus rutilus com alteraes sexuais,

apresentando intersexo. Esses animais ocupavam uma lagoa que recebia a

descarga de uma estao de tratamento de esgoto (SWEETING, 1981, apud

TYLER; ROUTLEDGE, 1998).

13

14

A exposio de animais e humanos a essas substncias tem

demonstrado indcios de alteraes hormonais. Existem estudos que

apresentam dados sobre a relao da contaminao com esses interferentes e a

possibilidade de alterao no sistema reprodutivo de indivduos a eles expostos

(MEYER; SARCINELLI; MOREIRA, 1999; RITTLER; CASTILLA, 2002;

MAXIMIANO et al., 2005).

Segundo Bila e Dezotti (2003), a presena de frmacos residuais na gua,

como antibiticos e estrognios, pode causar efeitos adversos na sade

humana, e de organismos presentes nas guas como, por exemplo, os peixes,

por isso so motivo de grande preocupao por parte de estudiosos em todo o

mundo (CIRJA et al., 2008; LEE et al., 2008).

A seguir so citados hormnios naturais e sintticos, alguns dos

principais desreguladores endcrinos que contaminam recursos hdricos,

especialmente em locais onde a urbanizao intensa (RAIMUNDO, 2007).

3.4 Hormnios sintticos e naturais e sua ocorrncia em ambientes aquticos

Grandes centros urbanos e regies de intensa atividade agropecuria

apresentam contaminao de seus corpos dgua com substncias qumicas

componentes do grupo de desreguladores endcrinos (KOLPIN, et al, 2002).

Sole et al. (2003) e Van den Belt et al. (2004) corroboram com a

constatao de que a principal fonte de contaminao de guas superficiais por

desreguladores endcrinos o lanamento de esgoto sanitrio e industrial

tratado ou in natura. Essa uma importante fonte de poluio, pois, no h a

remoo completa dessas substncias nas estaes de tratamento de esgoto.

Os corpos dgua suportam o recebimento de determinadas carga de resduos,

mas essa capacidade varia de acordo com o seu volume para ser eficiente em

dilu-las. A Tabela 2 apresenta algumas das principais fontes pontuais e fontes

difusas. (WANG et al., 2005b; ALUM et al., 2004; RUDDER et al., 2004;

JEANNOT et al., 2002).

14

15

Tabela 2 - Principais fontes de desreguladores endcrinos em guas superficiais

Fontes Tipos de Fontes Desreguladores Endcrinos Encontrados

Efluente Industrial Pontual

Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,

ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena,

pesticidas, bifenilas policloradas (PCB),

hidrocarbonetos policclicos aromticos

(HPA), retardantes de chama, dioxinas

Efluente Sanitrio Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,

ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena

Deflvio Pecurio Difusa Hormnios naturais e sintticos, antibiticos,

frmacos veterinrios

Natural Difusa HPA, estrognios naturais e fitoestrognios

Fonte: Adaptado de Raimundo, 2007.

A contaminao de corpos dgua por hormnios sexuais femininos

ocorre principalmente pelo lanamento de esgoto sanitrio sem tratamento, ou

quando seu tratamento ineficiente. Essa fonte de desreguladores endcrinos

se deve pela excreo vinda da populao de maneira natural ou somada ao

uso de anticoncepcionais orais ou injetveis (PONEZI; DUARTE; CLAUDINO,

2006). Dados citados por Fernandes (2007) indicam que em 2000, no Brasil, o

uso de anticoncepcionais era feito por 8 milhes de mulheres sendo que esse

nmero poder chegar a 45 milhes em 20 anos.

3.4.1 Origem dos principais hormnios naturais e sintticos que ocorrem em ambientes aquticos

Guyton e Hall (2005) definem os hormnios como substncias qumicas

que so produzidas por glndulas especficas e que interferem na funo de

outras clulas em todo o corpo. O transporte dos hormnios endcrinos feito

15

16

atravs do sistema circulatrio, e sua funo realizada quando os mesmos

atingem seus respectivos receptores desencadeando uma srie de reaes.

Dos hormnios naturais, o que apresenta maior potencial estrognico, o

17-estradiol. Esse o principal hormnio secretado durante o perodo de

atividade dos ovrios, e tem como metablitos a estrona, o estriol e seus

conjugados. O 17-estradiol possui atividade biolgica 12 vezes maior do que a

estrona e 80 vezes mais elevada do que o estriol (GENNARO, 2000, COLUCCI;

BORK; TOPP, 2001; KASSAB, 2001; GILMAM; HARDMAN; LIMBIRD, 2003).

Quando se trata de hormnios sintticos que so utilizados como

contraceptivos e para a realizao de tratamento de reposio hormonal,

destacam-se as suas estruturas moleculares que os torna mais potentes quando

comparados aos hormnios naturais, possuindo a capacidade de alterar o

sistema endcrino mesmo em baixas concentraes. O hormnio sinttico mais

utilizado o 17-etinilestradiol, que tem sua estrutura semelhante do hormnio

natural 17-estradiol, entretanto, possuindo uma atividade estrognica duas

vezes superior. Para poder ser aproveitado pelo organismo humano o 17-

etinilestradiol possui um agrupamento etinila que o protege da inativao pelo

fgado (KHANAL et al., 2006, KASSAB, 2001). A Figura 1 ilustra a representao

esquemtica da principal entrada dos desreguladores endcrinos no sistema

aqutico (LINTELMANN et al., 2003).

16

17

Figura 1 - Representao esquemtica da principal via de entrada de desreguladores endcrinos hormonais de origem humana (natural ou sinttico) em sistemas aquticos (LINTELMANN et al., 2003)

O hormnio 17-etinilestradiol aps ser ingerido rapidamente absorvido

pelo trato intestinal, e apresenta uma meia vida biolgica que varia de 13 a 27

horas, sendo excretado atravs da urina e das fezes e permanecendo no

ambiente aqutico de gua doce por um perodo que varia de 20 a 40 dias.

Associado ao 17-etinilestradiol, o hormnio igualmente sinttico, levonorgestrel,

utilizado para a obteno de melhores resultados. Assim como o 17-

etinilestradiol, o levonorgestrel apresenta uma rpida absoro pelo organismo,

permanecendo no organismo por mais tempo do que um hormnio natural e sua

meia vida biolgica varia de 10 a 24 horas, sendo excretado principalmente pela

urina e em menor parte pelas fezes (GENNARO, 2000 e GILMAN; HARDMAN;

LIMBIRD, 2003; ENSP, 2002, FERREIRA, 2008; RUDDER et al., 2004; WISE;

OBRIEN; WOODRUFF, 2011).

17

18

Aps serem excretados os hormnios sintticos 17-etinilestradiol e

levonorgestrel ainda se encontram na forma ativa em corpos dgua devido a

ao de bactrias, especialmente a Escherichia colli, presente em grandes

quantidades nas fezes (SOLE, et al., 2001).

As caractersticas femininas, o controle do ciclo reprodutivo, gravidez,

sistema cardiovascular, sistema imunolgico, entre outros so diretamente

influenciados por estrgenos, dentre os quais se destaca o estradiol. Johnson e

Sumpter (2001) indicam a necessidade da melhora das metodologias utilizadas

em pesquisas relativas ao tema, principalmente na reduo dos nveis de

deteco e aumento da preciso das anlises como aes prioritrias.

De acordo com Ghiselli e Jardim, (2007), mulheres grvidas dependendo

do estagio da gravidez podem excretar at 1000 vezes mais hormnios do que

uma mulher em atividade normal (da ordem de 2 a 20 g estrona/dia, 3 a 65 g

estriol/dia, e 0,3 a 5 g estradiol/dia).

Em relao ao hormnio sinttico 17-etinilestradiol, o mais utilizado na

composio de plulas contraceptivas em uma quantidade que varia de 25 a 50

g por plula (ingerida diariamente), sabe-se que desse total, aproximadamente

80% no aproveitado. A frao no utilizada liberada principalmente pela

urina. (HENRIQUES, 2008; CAMPANI et al., 2010; GABET-GIRAUD et al., 2010;

FERNANDES, 2007).

A Tabela 3 apresenta a quantidade de hormnios excretados diariamente

por humanos, por ambos os sexos e nas diferentes fases da vida (YING; BRIAN;

KOOKANA, 2002).

18

19

Tabela 3 - Excreo de estrognios pelos seres humanos (g/dia).

Categoria 17-

estradiol Estrona Estriol

17-

etinilestradiol

Homens 1,6 3,9 1,5 --

Mulheres frteis 3,5 8 4,8 --

Mulheres na

menopausa 2,3 4 1 --

Mulheres grvidas 259 600 6000 --

Mulheres -- -- -- 35

Fonte: YING; BRIAN; KOOKANA, 2002

Os hormnios que contaminam os corpos dgua tambm podem ter

como origem, o escoamento de excretas de animais, principalmente quando

criados em grande densidade. Isso ocorre, por exemplo, no caso dos bovinos e

sunos utilizados com finalidade de alimentao humana (Tabela 4). J

constatado nos EUA a contaminao de lagos por 17-Estradiol, sendo que a

quantificao do hormnio na gua foi na ordem de 0,05 a 7,4 ng/l e foram

suficientes para causar distrbios s tartarugas que habitam esses locais que

recebiam dejetos bovinos (FURUICHI et al., 2006).

19

20

Tabela 4 - Excreo diria de estrognio total estimada por diferentes espcies de animais (g/dia), (adaptado de WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011)

Espcie

Total de estrognio

excretado pela

urina (g/dia)

Total de

estrognio

excretado pelas

fezes (g/dia)

Total de estrognio

excretado (g/dia)

Bovino

Bezerros 15 30 45

Vacas 99 200 299

Prenhes 320 104320 256 7300 576 111620

Suno Porcos 82 21 103

Prenhes 700 17000 61 -

Ovino Ovelhas 3 20 23

Carneiros 3 22 25

3.5 Organismos teste e biomarcadores de desreguladores endcrinos

Os estudos anteriormente descritos sobre a avaliao de efeitos

fisiolgicos causados pelos desreguladores endcrinos presentes na gua de

rios, foram possveis devido ao uso de biomarcadores e organismos teste, uma

metodologia adotada recentemente.

Os mtodos tradicionais de avaliao de qualidade da gua, baseadas em

anlises fsicas, qumicas e bacteriolgicas, no conseguem fornecer

informaes de como uma determinada substncia ir agir em um organismo

sob o ponto de vista fisiolgico (CAIRNS; PRATT, 1993). Para uma anlise

eficiente deve-se utilizar os mtodos analticos juntamente com os

biomarcadores, que podem ser definidos como ferramentas utilizadas na anlise

20

21

da organizao biolgica de um organismo (organismo teste) (ARIAS et al.,

2007).

Em outra definio os biomarcadores so vistos como qualquer resposta

a um contaminante ambiental, medidos no organismo ou matriz biolgica,

indicando um desvio do status normal que no pode ser detectado no organismo

intacto. Diversos parmetros podem ser utilizados como biomarcadores como,

por exemplo, medidas de fluidos corporais, clulas, tecidos ou medidas

realizadas sobre o organismo completo que indicam, em termos bioqumicos,

celulares, fisiolgicos, comportamentais ou energticos, a presena de

substncias contaminantes ou a magnitude da resposta do organismo alvo

(LIVINGSTONE, 1993, LARCHER, 2000).

A definio de qual ser o organismo teste deve incluir uma gama de

critrios, dentre eles a disponibilidade, manuteno e conservao da espcie

em questo, a possibilidade do uso de determinada espcie para a obteno de

resultados especficos condizentes ao objetivo do trabalho (BOHRER, 1995).

Muitos organismos tm sido utilizados com esse fim, destacam-se espcies de

moluscos, peixes e crustceos (COTELLE; FERARD, 1999), alm de algumas

espcies vegetais. Entre as espcies mais utilizadas em todo o mundo como

organismo teste esto: Artemia sp (SVENSSON et al., 2005), Daphnia magna,

Vibrio fischeri, Danio rerio (KNIE; LOPES, 2004) e Allium cepa L. (ARAMBASIC;

BJELIC; SUBAKOV, 1995).

Alm da sobrevivncia dos organismos teste (crustceos, peixes, etc.)

outros fatores esto sendo observados e indicam alteraes na homeostase dos

organismos (alteraes bioqumicas, fisiolgicas e morfolgicas). Estes fatores

podem ser denominados como biomarcadores (GRINEVICIUS, 2006).

Biomarcadores so sistemas indicadores que fazem parte de um organismo e

so utilizados para a deteco de modificaes especificas (SILVA;

ERDTMANN; HENRIQUES, 2003).

Um biomarcador ideal deve demonstrar grande susceptibilidade, boa

sensibilidade, relativa especificidade e ter baixo custo em suas anlises

(STEGEMAN et al., 1992; BAINY, 1993).

Quando o intuito da pesquisa verificar atividades estrognicas de

desreguladores endcrinos biomarcadores so utilizados com freqncia, e

21

22

quando se tratam de estudos relacionados contaminao de ambientes

aquticos, a vitelogenina (VTG) demonstra bons resultados (ARUKWE;

GOKSYR, 2003; GORDON et al., 2006; HINCK et al., 2006; REMPEL et al.,

2006, ANDERSSON et al., 2007).

3.5.1 Vitelogenina A vitelogenina produzida por animais ovparos, para compor o vitelo

presente nos ovcitos. Esta fosfolipoglicoprotena produzida no fgado por

meio do estmulo causado pelo estradiol ovariano e transportada atravs do

sangue at as gnadas onde ir tornar-se parte do vitelo dos ovcitos em

desenvolvimento, para futura fonte nutricional para o embrio. A VTG

encontrada durante a maturao sexual de fmeas (ARUKWE; GOKSYR,

2003; LANGSTON et al., 2005).

A sntese da VTG depende da presena de hormnios estrognicos, que

so sintetizados pelas fmeas durante seu ciclo reprodutivo, embora os peixes

machos e os juvenis tambm apresentam receptores estrognicos hepticos.

Entretanto, a codificao do gene para estas protenas no existe ou

fracamente expressada em machos e juvenis, no sendo normal a produo de

protenas ligadas ovognese (vitelognese e zonagnese). A produo de

VTG por machos ou juvenis sinal de desequilbrio endcrino e indicador de

efeito por exposio a estrgenos ambientais; tendo em vista que sua presena

em machos, s possvel mediante induo externa, j que a sua produo

desencadeada pela atividade de hormnios femininos (ARUKWE; KNUDSEN;

GOKSYR, 1997; LINTELMANN et al., 2003; HORNUNG et al., 2004; HINCK et

al., 2006; REMPEL et al., 2006; MENDES; OLIVEIRA, 2004).

Com base nessas informaes, a vitelogenina mostra ser um bom

biomarcador para a exposio de vertebrados vivparos a xenoestrgenos. Os

peixes so importantes nos estudos relativos aos efeitos de substncias

estrognicas fisiologia reprodutiva, pois seu sistema reprodutivo regulado por

22

23

hormnios similares aos dos mamferos, portanto espera-se que os efeitos

tambm ocorram (MILLS; CHICHESTER, 2005).

3.6 Efeitos dos desreguladores endcrinos nos organismos vivos A fase de desenvolvimento o perodo em que os organismos esto mais

propcios a alteraes que levam a disfunes hormonais ou endcrinas devido

exposio desreguladores endcrinos. Essas modificaes trazem a perda

da homeostase dos organismos. Esta constatao decorrente de resultados de

diversos estudos que envolvem poluio ambiental de corpos dgua com

problemas relacionados ao sistema reprodutor de espcies de diversas classes

de animais como mamferos, aves, rpteis, anfbios e peixes, entre outros

(DAMSTRA et al., 2002).

O sistema endcrino no abrange apenas a excreo de hormnios na

corrente sangunea, h tambm a atuao no sistema nervoso, atravs dos

neurohormnios (DAMSTRA et al., 2002). Do sistema endcrino destacam-se

trs eixos principais:

Eixo hipotlamo-pituitrio-adrenal, ligado ao metabolismo de carboidratos,

protenas e gorduras, efeito antiinflamatrio e modulao de respostas ao

estresse;

Eixo hipotlamo-pituitrio-gonadal, ligado ao sistema reprodutivo;

Eixo hipotlamo-pituitrio-tiroidal, ligado a atividade metablica como um todo

Como principal funo do sistema endcrino, se destaca a manuteno

da homeostase, evitando problemas decorrentes do efeito gangorra, Figura 2

(PADUA, 2009).

23

24

Figura 2 - Representao do funcionamento do sistema endcrino com base no

principio da gangorra (PADUA, 2009)

Existem algumas questes observadas quando so analisados impactos

dos desreguladores endcrinos nas funes exercidas pelo organismo

(DAMSTRA et al., 2002):

O individuo exposto na fase adulta pode ter os efeitos dos desreguladores

endcrinos minimizados pela ao de mecanismos de homeostase, desse modo

a exposio pode no apresentar nenhuma modificao;

A exposio na fase de desenvolvimento dos organismos pode resultar em

algumas mudanas permanentes de diversas funes;

Quando a exposio ao desregulador endcrino ocorrer em diferentes estgios

desse desenvolvimento, as consequncias podem ser distintas;

24

25

Devido complexidade dos sistemas endcrinos os efeitos da exposio podem

ocorrer, em alguns casos, de maneira e local imprevisveis;

Considerando o anteriormente exposto, deve-se ter cuidado na transposio dos

resultados obtidos in vitro para condies in vivo

Problemas causados por desreguladores endcrinos em humanos

Os efeitos dos desreguladores endcrinos atingem tambm os seres

humanos e uma das principais vias de entrada destes desreguladores em

organismos humanos a ingesto de alimentos e gua que os contenham

(REYS, 2001).

Amaral Mendes (2002) descreve os desreguladores endcrinos como

sendo o principal desafio mdico, e que a atuao de diversas substncias sobre

o sistema endcrino e reprodutivo causada pela habilidade dessas substncias

em:

A) mimetizar e antagonizar os efeitos de hormnios endgenos

B) desregular a sntese e metabolismo de hormnios endgenos e de seus

receptores

Em seres humanos os desreguladores endcrinos podem causar uma

srie de problemas decorrentes de compostos naturais ou sintticos presentes

no meio ambiente. Os autores destacam distrbios na sade reprodutiva,

disfunes de fertilidade, formao de cnceres de testculos, prstata e mama,

diminuio na contagem de espermatozides, endometriose, entre outros

(HARRISON; HOLMES; HUMFREY, 1997; LARSSON et al., 1999; SHARPE;

IRVINE, 2004; SLOWIKOWSKA-HILCZER, 2006, BILA; DEZOTTI, 2007;

GHISELLI; JARDIM, 2007, CHEN; HU, 2009).

Durante os anos 40 foi observada uma diminuio na contagem de

espermatozides em trabalhadores que lidavam com aplicao do pesticida DDT

25

26

(AMARAL MENDES, 2002). Estudos comprovaram os efeitos do desregulador

endcrino, dietilestilbestrol (DES), que no perodo entre 1948 e 1971 era

utilizado com o intuito de precaver abortos e auxiliar no desenvolvimento do feto.

Aps o uso do composto, pelas mes, muitas das suas filhas nasceram estreis,

houve o desenvolvimento de um tipo raro de cncer vaginal, m formao do

tero e ovrios, alm de supresso da imunidade (DAMSTRA et al., 2002;

REYS, 2001; JANSSEN; FUJIMOTO; GIUDICE, 2007). Em homens adultos que

foram expostos a estradiol, foi detectada uma maior ocorrncia de

anormalidades nos rgo sexuais, uma baixa contagem de espermatozides,

alm de um alto ndice de cncer nos testculos (COLUCCI; BORK; TOPP, 2001;

GUILLETTE et al., 1996; LEGLER et al., 2002; JANEX-HABIBI et al., 2009).

Alm de efeitos diretos causados nos indivduos que mantm contato com

os desreguladores endcrinos, fetos podem ter seu desenvolvimento

comprometido, quando ocorrem alteraes endcrinas em suas mes. Os

efeitos teratognicos descritos so casos de m formao dos rgos sexuais e

anomalias reprodutivas, tanto em fetos do sexo masculino, quanto do sexo

feminino (COWIN; FOSTER; RISBRIDGER, 2007; SAFE, 2004; JANSSEN;

FUJIMOTO, 2007; FORSTMEIER, 2005).

Problemas causados por desreguladores endcrinos em animais

Em relao a mamferos, destacam-se anomalias no sistema reprodutor

de ratos causada por bisfenol A (MARKEY et al., 2002). Bay et al.(2006)

descrevem a infertilidade e anomalias testiculares como resultado da exposio

de fetos de ratos ftalatos. Em ambiente aqutico foi observada alta mortalidade

de golfinhos por ocorrncia de PCB (AGUILAR; BARRELL, 1994). Guerra et al.,

(1999) e Souza et al. (2000), utilizando ratos como modelo, demonstraram que o

hormnio sinttico levonorgestrel quando ministrado em doses de 15 ou 30 mg 3

vezes ao dia, levaram distrbios no crescimento e peso de rgos dos

animais.

26

27

Alteraes causadas pelo DDT e DDE foram observadas em aves por Fry

e Toone (1981), e foram causadoras da feminizao de gaivotas machos,

diminuio da espessura da casca dos ovos (com conseqente quebra da

mesma) e anomalias do sistema reprodutor. Tambm foram observadas

alteraes detectadas atravs da alterao na produo de VTG em falces

peregrino (JIMENEZ et. al, 2007)

Em rpteis os efeitos do DDT e DDE elevaram a concentrao de

hormnios sexuais no plasma alm de trazer anomalias morfolgicas s

gnadas de crocodilos, alterao da produo de esterides e variao na

concentrao de hormnios sexuais em fmeas e machos (GUILLETTE et al.,

1999; MILNES et al., 2002; WHALEY; KEYES; KHORRAMIL, 2001), mesmo no

havendo deteco de pesticidas, a substncia foi encontrada nos animais e seus

ovos (NRDC, 2007). A exposio ao estradiol tambm levou a induo da

sntese de VTG e a alteraes na produo de ovos de tartarugas (IRWIN;

GRAY; OBERDORSTER, 2001). No caso de anfbios, foi observado por Bogi et

al.(2003) que o efluente de uma estao de tratamento de esgoto causou a

induo da sntese de VTG e hermafroditismo em rs.

Como descritos em diversos estudos os peixes sofrem as aes da

presena dos desreguladores endcrinos sintticos 17-etinilestradiol e

levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol. A presena dos mesmos,

ainda que em baixas concentraes, provocou distrbios como a feminizao

(RODGER-GRAY et al., 2001; KNORR; BRAUNBECK, 2002; BOMBARDELLI;

HAYASHI, 2005; EDWARDS; MOORE; GUILLETTE, 2006), alteraes na

transcrio gentica (ZUCCHI; CASTIGLIONI; FENT, 2012), alterao nas

gnadas (PANTER; THOMPSON; SUMPTER, 2000; LABADIE; BUDZINSKI,

2006), hermafroditismo (KOGER et al., 2000), incidncia de testculos-vulos

nas gnadas (KANG et al., 2002) e induo sntese de vitelogenina (PANTER;

THOMPSON; SUMPTER, 2000; ROSE et al., 2002; MONCAUT; NOSTRO;

MAGGESE, 2003; GORDON et al.; 2006; HINCK et al., 2006; REMPEL et al.,

2006; ANDERSSON et al., 2007).

Como determinado por diversos estudos, so extremamente

preocupantes as conseqncias a toda a biodiversidade, promovidas pela

presena de desreguladores endcrinos no ambiente. A ameaa

27

28

biodiversidade um assunto tratado em todo o mundo, inclusive tendo desde

1992 na Organizao das Naes Unidas (ONU) um importante instrumento, a

Conveno sobre Diversidade Biolgica (BRASIL, 2012).

3.7 Conservao da biodiversidade em guas continentais

A Conveno sobre Diversidade Biolgica (CDB) instituda durante a

Conferncia das Naes Unidas para o Meio Ambiente e o Desenvolvimento -

CNUMAD (Rio 92) define diversidade biolgica como sendo a variabilidade de

organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os

ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquticos e os

complexos ecolgicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade

dentro de espcies, entre espcies e de ecossistemas (MMA, 2000).

A CDB tem como objetivos a serem cumpridos, de acordo com as

disposies pertinentes, a conservao da diversidade biolgica, a utilizao

sustentvel de seus componentes e a repartio justa e equitativa dos benefcios

derivados da utilizao dos recursos genticos, mediante, inclusive, o acesso

adequado aos recursos genticos e a transferncia adequada de tecnologias

pertinentes, levando em conta todos os direitos sobre tais recursos e

tecnologias, e mediante financiamento adequado (MMA, 2000).

A gesto da CDB feita pela Conveno das Partes atravs de reunies

peridicas. Atravs dessas reunies so definidas metas, as quais os pases

signatrios assumem o compromisso de seguir. Aps a ltima reunio realizada

em Nagoya no Japo (COP 10) foram definidos o Plano Estratgico 2011-2020 e

as metas de Aichi. O Plano Estratgico 2020 da CDB (UICN; WWF-BRASIL;

IP, 2011) est organizado em cinco objetivos:

A. Tratar das causas fundamentais de perda de biodiversidade fazendo com que

preocupaes com biodiversidade permeiem governo e sociedade.

28

29

B. Reduzir as presses diretas sobre biodiversidade e promover o uso

sustentvel.

C. Melhorar a situao de biodiversidade protegendo ecossistemas, espcies e

diversidade gentica.

D. Aumentar os benefcios de biodiversidade e servios ecossistmicos para

todos.

E. Aumentar a implementao por meio de planejamento participativo, gesto de

conhecimento e capacitao.

Os cinco objetivos so compostos por 20 metas (Metas de Aichi), dentre

as quais destacamos a META 8 Controle da Poluio das guas, onde h a

indicao de que at 2020, a poluio dever ser reduzida a nveis no

prejudiciais ao funcionamento de ecossistemas e da biodiversidade (UICN;

WWF-BRASIL; IP, 2011).

No Brasil, o incio da gesto de guas iniciou-se na dcada de 30, com a

criao do Decreto 24.643/34 - Cdigo de guas (BRASIL, 1934) e tem como

marco legal a Constituio Federal de 1988 (BRASIL, 1988), a Lei 9.433/97 que

instituiu a Poltica Nacional de Recursos Hdricos e criou o Sistema Nacional de

Gerenciamento de Recursos Hdricos (BRASIL, 1997) e a Lei 9.984/00 que criou

a Agncia Nacional de guas (ANA), (BRASIL, 2000). O foco principal dos

instrumentos legais de proteo dos recursos hdricos manuteno dos

mesmos para a sustentao das atividades humanas (abastecimento urbano,

agricultura, gerao de energia, pesca, aquicultura, assimilao de esgoto, etc.).

O Brasil, como signatrio da Conveno sobre Diversidade Biolgica, tem

por obrigao cumprir as metas estipuladas em suas reunies. Para atingir o

objetivo proposto na Meta 08 definida na COP 10 (controle de poluio das

guas), uma das aes necessrias a implementao de um sistema de

monitoramento dos poluentes que atingem os corpos dgua. Para que esse

sistema de monitoramento seja eficiente so necessrios subsdios para a

definio dos locais onde sero alocados.

29

30

3.8 reas crticas 3.8.1 Mapeamento De acordo com o desenvolvimento, a utilizao dos recursos hdricos

mais intensa, assim como o risco de degradao ambiental devido interveno

humana. O corpo dgua, receptor final da gua da bacia hidrogrfica, pode ser

utilizado como indicador de alteraes ocorridas no territrio ao seu redor. Para

que o planejamento e administrao hdrica de uma regio existam, necessrio

que haja informaes organizadas desse local, para que as aes a serem

tomadas possam apresentar uma maior efetividade (MENDES; CIRILO, 2001).

Varnes (1974) define o mapeamento como a delimitao de reas

homogneas, sendo que suas heterogeneidades so consideradas para a sua

construo. A composio do mapa de um plano bidimensional onde h os

contornos das reas delimitadas e uma legenda que define os atributos que

foram utilizados. Os principais tipos de mapas utilizados nos sistemas de

informao geogrfica (SIG) so definidos por Mendona (2002):

Mapa temtico: demonstra de forma qualitativa a distribuio espacial de uma grandeza geogrfica;

Mapa cadastral: cada componente considerado como um objeto geogrfico que possui atributos, podendo estar associado a vrias

representaes grficas;

Produto de sensoriamento remoto: imagens obtidas por satlites e fotografias areas;

Modelo numrico do terreno: reproduz uma superfcie real a partir de algoritmos e de um conjunto de pontos, em um referencial qualquer, que

descrevem a variao contnua da superfcie.

30

31

O desenvolvimento de um mapa com dados especficos, no a

sobreposio de diversos mapas, mas sim a soma de valores de diversos

atributos que se encontram em cada ponto, esses pontos so identificados por

coordenadas (CEOTMA, 1983).

3.8.2 reas potencialmente crticas no Brasil

Estudo publicado em 2005 pelo Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatstica (IBGE, 2005) indica a poluio por esgoto sanitrio como a principal

fonte de contaminao de mananciais, alm disso, a existncia de atividades

agropecurias e descarte de resduos slidos tambm causam contaminao. A

Figura 3 ilustra a contaminao e a sua causa nas cinco regies do Brasil.

Figura 3 - Proporo de municpios com ocorrncia de poluio do recurso gua, por

tipo de causas mais apontadas. Fonte: IBGE, Diretoria de Pesquisas, Coordenao de Populao e Indicadores Sociais, Pesquisas de Informaes Bsicas Municipais 2002 (IBGE, 2005)

31

32

O Brasil apresenta algumas reas crticas, quando a qualidade da gua

considerada. Estudos demonstram que essas regies localizam-se prximas aos

principais centros metropolitanos (MMA, 2006):

Regio Hidrogrfica do Paran: bacias do Alto Iguau, alto Tiete, Piracicaba,

Meia Ponte, Rio Preto;

Regio Hidrogrfica do So Francisco: bacia do rio das Velhas, Para e

Paraopeba;

Regio Hidrogrfica Atlntico Leste: bacia dos rios Joanes e Ipitanga;

Regio Hidrogrfica Atlntico Sul: bacia dos rios dos Sinos e Gravata;

Regio Hidrogrfica Atlntico Sudeste: bacia do rio Paraba do Sul, bacia do rio

Jucu;

Regio Hidrogrfica do Paraguai: bacia do rio Miranda.

Mesmo com o risco por conta do potencial de presena de

desreguladores endcrinos nessas regies, o monitoramento no uma prtica

aplicada no Brasil, entretanto, os riscos provavelmente existem, pois a ocupao

desses locais leva ao lanamento dessas substncias ao meio. Pases

considerados desenvolvidos apresentam programas de monitoramento da

contaminao das guas considerando a contaminao atravs de

contaminantes emergentes (STAVRAKAKIS et al., 2008; PICKERING;

STUMPTER, 2003; CEC, 2004) fato que deveria ocorrer tambm no Brasil.

De acordo com Who (2006), quando se considera a sade pblica como

questo a ser tratada, a presena de contaminantes deve ter trs questes

primordiais:

Probabilidade de exposio

Concentrao que pode resultar em efeitos adversos sade

32

33

Evidncia de efeitos adversos sade em decorrncia da exposio pelo

consumo de gua

Para que seja possvel identificar s quais potenciais desreguladores

endcrinos a populao exposta e corre risco, uma importante ferramenta a

ser utilizada a avaliao de risco ambiental (WHO, 2006) e o monitoramento

faz parte desse tipo de avaliao. O monitoramento deveria ser efetivado

principalmente nas reas potencialmente crticas (como j definido pelo IBGE),

que na Regio Hidrogrfica Atlntico Sudeste inclui a bacia do rio Paraba do

Sul.

3.8.3 Rio Paraba do Sul

A importncia do rio Paraba do Sul em seu trecho paulista destacada por

Muller (1969), quando cita que o rio Paraba do Sul serviu de corredor,

facilitando o deslocamento e a fixao do homem, tornando-se o eixo bsico de

toda a vida regional, e em suas proximidades foram surgindo e evoluindo os

principais ncleos populacionais atualmente existentes na regio. Como toda

regio para se desenvolver necessita obrigatoriamente de recursos hdricos,

problemas no rio Paraba do Sul certamente trariam srias complicaes para

um maior desenvolvimento de todo o Vale do Paraba, tendo em vista que a

Unidade de Gerenciamento de Recursos Hdricos (UGRHI) 2 - Paraba do Sul

engloba 34 municpios e 1.944.638 habitantes, representando 5% da populao

do Estado de So Paulo (CETESB, 2007).

A rea de drenagem da bacia do rio Paraba do Sul tem cerca de 55.500

km2 compreendida entre os paralelos 2026 e 2300 sul e os meridianos

4100e 4630 oeste de Greenwich e est localizada na Regio Sudeste entre

os estados de So Paulo com cerca de 13.900 km2, Minas Gerais 20.700 km2 e

Rio de Janeiro com aproximadamente 20.900 km2 (ANA, 2001).

33

34

O rio Paraba do Sul tem sua nascente localizada na Serra da Bocaina, no

Estado de So Paulo, a 1.800 m de altitude, e sua foz no norte fluminense, mais

precisamente no municpio de So Joo da Barra, percorrendo

aproximadamente 1.150 km. Sua bacia distribui-se na direo leste oeste entre

as serras do Mar e da Mantiqueira, chegando a mais de 2.000 m de latitude nos

pontos mais elevados (ANA, 2001).

Por apresentar diferentes caractersticas fsicas, o rio Paraba do Sul pode

ser dividido em quatro partes:

a) Curso Superior inicia-se desde a nascente at a cidade de Guararema, em So Paulo, caracteriza-se por apresentar declives acentuados e regime

torrencial, tem extenso de 317 km.

b) Curso Mdio Superior possui 208 km de extenso e vai de Guararema (SP) at Cachoeira Paulista (SP), nesse percurso o rio sinuoso e meandrado.

c) Curso Mdio Inferior est localizado entre os municpios de Cachoeira Paulista (SP) e So Fidlis (RJ), tem uma extenso de 480 km, apresentando-se

com reas de cachoeiras.

d) Curso Inferior o trecho terminal do rio, indo de So Fidlis (RJ) sua foz, em So Joo da Barra e possui 95 km.

O rio Paraba do Sul tem como seus principais afluentes, em sua margem

direita, os rios Bananal, Pira, Piabanha e Dois Rios, em sua margem esquerda,

os rios Jaguar, Paraibuna, Pirapetinga, Pomba e Muria (ANA, 2001). A bacia

do rio Paraba do Sul abrange 180 municpios e seu sistema hidrulico

composto por cinco reservatrios, Paraibuna, Jaguari, Santa Branca, Funil e

Santa Ceclia. A parte paulista da bacia est localizada entre as coordenadas

22o24 e 23o39 de latitude Sul e 44o10 e 46o26 de longitude Oeste (AGEVAP,

2010).

34

35

Urbanizao, uso e ocupao do solo do Vale do rio Paraba do Sul

De acordo com Santos e colaboradores (2006), as atividades antrpicas,

juntamente com o desenvolvimento, a urbanizao e a industrializao trazem

grandes impactos no ambiente, sobretudo aos importantes recursos hdricos.

A Tabela 5 demonstra quais as principais atividades que utiliza gua na

Bacia do rio Paraba do Sul.

Tabela 5 - Principais usos das guas da Bacia do rio Paraba do Sul

Usos da gua Captao (m3s-1) Consumo (m3s-1)

Abastecimento pblico 16,84 3,37

Uso industrial 13,65 6,19

Irrigao 49,73 30,28

Pecuria 3,45 1,73

Total 83,67 41,57 Fonte: Laboratrio de Hidrologia e Estudos do Meio Ambiente/COPPE/UFRJ (2002)

De acordo com dados da CETESB (2007), o ndice de coleta do esgoto

sanitrio das cidades da regio da Bacia do rio Paraba do Sul, em seu trecho

paulista, de 89%, mas apenas 37% desse efluente recebem tratamento. As

principais atividades de uso das guas desta bacia envolvem o abastecimento

pblico e industrial, a gerao de energia eltrica, o afastamento de esgoto

sanitrio e industrial e a irrigao de plantaes O lanamento de esgoto

sanitrio sem tratamento prvio em cursos dgua implica na contaminao

dessas guas por diversas substncias, inclusive desreguladores endcrinos.

35

36

4 MATERIAIS E MTODOS 4.1 Validao de mtodo para a quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia (HPLC) 4.1.1 Condies cromatogrficas para a determinao dos hormnios em estudo

17-etinilestradiol - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (50:50), 10 min, C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5 m, Agilent Technologies) FLU

excitao: 230 nm; emisso: 306 nm, tempo de reteno: 8 min

Levonorgestrel - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (50:50), 25 minutos, C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5 m, Agilent Technologies) DAD

240 nm, tempo de reteno: 17,5 min

17estradiol - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (60:40), 10 min, coluna PAH (LiChrospher PAH, 250 x 4,6 mm, 5 m, Agilent Technologies), no

apresentou reprodutibilidade com a coluna C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5

m, Agilent Technologies). FLU excitao: 230 nm; emisso: 306 nm, tempo

de reteno: 4,5 min

Condicionamento da coluna SPE utilizando bomba vcuo, o condicionamento da coluna se d com 6 mL de hexano, seguido de 2 mL de

acetona, 6 mL de metanol e 10 mL de gua ultrapura pH 3.

36

37

4.1.2. Validao do mtodo para determinao dos hormnios em estudo A validao do mtodo seguiu as recomendaes descritas na Resoluo - RE 899 da AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA)

(ANVISA, 2003). Nesta etapa todas as amostras foram preparadas com gua de

nascente e adio do analito em questo, ou seja, o padro dos hormnios foi

adicionado gua de nascente filtrada completando o volume de 200 mL. Aps

isso, a amostra sempre era extrada por SPE e analisada por HPLC/FLU/DAD.

A gua de nascente foi considerada como a matriz isenta dos hormnios

17-estradiol, 17-etinilestradiol e levonorgestrel. As etapas foram procedidas da

seguinte maneira:

Seletividade: A matriz utilizada pode conter interferentes, a seletividade avalia o grau dessa interferncia, que pode ser oriunda de outra substncia,

produtos de degradao, compostos similares, etc. (ARAUJO, 2006). Nessa etapa foi analisada uma amostra do branco, ou seja, a matriz sem o analito e

uma amostra com o analito, ou seja, gua ultrapura com o analito, ambos nas

mesmas condies cromatogrficas.

Limite de deteco (LD) e quantificao (LQ): O limite de deteco a indicao da quantidade mnima que pode ser detectada, entretanto esse valor

no necessariamente exato. O limite de quantificao o mnimo possvel de

ser quantificado, tendo como resultado um valor exato (LANAS, 2004). Nessa

etapa foram preparadas diferentes concentraes do analito adicionado a gua

de nascente. O limite de deteco deve ser de duas a trs vezes maior do que o

rudo, j o limite de quantificao tem que ser no mnimo cinco vezes maior que

o rudo.

Limite Inferior de quantificao (LIQ): Sabendo-se a concentrao do limite de quantificao (LQ) prepararam-se cinco amostras diferentes da mesma.

Havendo preciso e exatido dentro dos limites aceitveis, ou seja, preciso de

at 20% e exatido de 80 a 120%, admite-se esse valor como limite inferior de

37

38

quantificao (LIQ). Se no houver preciso e exatido aceitveis deve-se

aumentar a concentrao at obter os resultados considerados aceitveis.

Linearidade: A linearidade corresponde competncia do mtodo em dar resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame,

dentro de uma determinada faixa de aplicao. O intervalo de trabalho expressa

a faixa entre a menor a maior concentrao dos padres usados na construo

do grfico de calibrao (BRITO et al., 2001).

A curva de calibrao foi determinada utilizando-se seis concentraes

diferentes, sendo que para cada concentrao foram feitas trs amostras. Para

que a curva fosse aceita o LIQ deve ter desvio de at 20% comparado com a

concentrao nominal e para as outras concentraes desvio de at 15%; e

coeficiente de correlao linear deve igual ou superior a 0,98.

Preciso e exatido: A preciso de um mtodo demonstrada quando uma mesma amostra analisada varias vezes e os resultados so prximos

entre si; e a exatido de um mtodo demonstra a sua competncia de obter

resultados prximos ao valor real (BRITO et al., 2001). Foram feitas cinco concentraes diferentes abrangendo as concentraes baixa, mdia e alta.

Para cada concentrao foram preparadas cinco amostras, as quais foram

extradas e analisadas. Essa etapa foi repetida duas vezes em dias diferentes

para determinar a preciso e exatido intra-corrida e inter-corridas, sendo que o

desvio ou coeficiente de variao deve ser de at 15% para todas as

concentraes, menos para o LIQ que admitido at 20%, e a exatido deve

estar entre 80 a 120%.

Recuperao: Esta etapa indica a eficincia da extrao dos hormnios estudados atravs da tcnica de extrao por fase solida (SPE) (BRITO et al.,

2001). Nesta etapa prepararam-se cinco solues de concentrao diferentes

abrangendo novamente, concentrao baixa, mdia e alta, e para cada

concentrao fez-se trs amostras, que posteriormente foram extradas e

analisadas. Foram feitas tambm cinco solues de concentrao diferentes, e

para cada concentrao fez-se trs amostras, que no foram extradas por SPE,

38

39

ou seja, foram injetadas diretamente no HPLC/FLU/DAD. Os resultados obtidos

das amostras, que devem ser precisos e exatos, com extrao e sem extrao

por SPE foram comparados.

4.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol e de amostras de gua do rio Paraba do Sul A quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e

levonorgestrel, e do hormnio natural 17-estradiol foi feita de acordo com as

normas da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA, 2003) Resoluo -

RE n 899, de 29 de maio de 2003, modificando-a para uma anlise utilizando-se

gua e esgoto como matriz.

Aps a coleta e devido armazenamento da gua do rio Paraba do Sul,

municpio de Pindamonhangaba, nos pontos 1 e 2 as amostras congeladas

foram transportadas em caixas termicamente isoladas ao municpio de So

Carlos. A continuao dos procedimentos ocorreu no Laboratrio de Qumica

Analtica Aplicada a Medicamentos e a Ecossistemas Aquticos e Terrestres, do

Instituto de Qumica de So Carlos, na Universidade de So Paulo, em So

Carlos.

O procedimento adotado para a utilizao das amostras foi o

descongelamento das mesmas, seguido por um processo de filtrao com

membrana de acetato celulose (0.45 m) e auxlio de uma bomba de vcuo,

para a remoo de partculas solidas em suspenso.

Aps a filtragem, o mtodo analtico utilizado para a extrao,

concentrao e quantificao dos hormnios nas amostras foi a extrao em

fase slida (SPE) e cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), A extrao e

concentrao dos hormnios estudados ocorreram atravs de uma fase slida

(SPE), com cartuchos C18 (Accu BondR II cartridge Agilent Technologies, West

Lothan, UK), como representado na Figura 4.

39

40

De acordo com a ANVISA, a validao deve garantir, por meio de estudos

experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar

preciso, exatido, linearidade, limite de deteco e limite de quantificao,

especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperao adequadas

anlise. Todos estes requisitos foram realizados para a validao da

metodologia modificada.

Figura 4 - Cartucho empregado na extrao em

fase solida (SPE) (Fonte: FALONE, 2007)

40

41

4.3 Coletas das amostras de gua no rio Paraba do Sul

As coletas no rio Paraba do Sul foram feitas em dois pontos localizados

na rea urbana do municpio de Pindamonhangaba / SP. O ponto1 localiza-se

prximo rea de captao de gua para abastecimento pblico do municpio

(Figura 5 a 8), (coordenadas UTM 45 16 60.94 m E, 74 66 11 1.14 m S).

O ponto 2 encontra-se aproximadamente 2,5 km jusante em relao ao

ponto 1 e coincide com o local de descarte da estao de tratamento de esgoto

do municpio de Pindamonhangaba (coordenadas UTM 45 25 07.00 m E; 74 66

12 9.00 m S) (Figura 9 a 11).

Figura 5 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste crnico

com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp) Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto

41

42

Figura 6 - Imagem do ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao

de teste crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp)

Figura 7 - Ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste

crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

42

43

Figura 8 - Ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste

crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

Figura 9 - Foto area aproximada do ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul

para realizao de teste crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto.

43

44

Figura 10 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste

crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

Figura 11 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste

crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

44

45

As coletas foram feitas com o auxilio de baldes amarrados com cordas, e

em todos os dias de coleta, a mesma, ocorreu no perodo da manh (8 - 9 horas)

(Figura 12 e 13). Logo em seguida coleta com baldes, a gua foi armazenada

em gales e encaminhada imediatamente ao laboratrio, onde as amostras

foram filtradas. Parte dessa gua foi prontamente utilizada para a realizao dos

testes toxicolgicos em aqurios com exemplares de Danio rerio, e parte foi

congelada e armazenada para ser posteriormente analisada quanto s

concentraes de hormnios.

Figura 12 - Coleta de gua dos pontos 1 e 2, com auxilio de balde e armazenamento em

gales. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

Figura 13 Material utilizado para a coleta de gua dos pontos 1 e 2 ocorreu

com auxilio de balde e armazenamento em gales. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

45

46

4.4 Testes com Danio rerio 4.4.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes com gua do rio Paraba do Sul

Foram utilizados tanto nos ensaios in situ, quanto nos ex situ exemplares

de Danio rerio adquiridos junto a um produtor comercial de peixes ornamentais.

Os 300 animais (aprox.) adquiridos para cada um dos trs perodos de teses

eram do mesmo lote e ficaram em aclimatao por um perodo de 15 dias

antes de serem utilizados nos experimentos. Os animais foram mantidos em um

tanque contendo gua desclorada e recebendo rao comercial Tetra duas

vezes ao dia (manh e tarde).

4.4.2 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no rio Paraba do Sul Foram feitos testes crnicos utilizando-se exemplares de Danio rerio

introduzidos nos Ponto 1 e 2 do rio Paraba do Sul, atravs da utilizao de

tanques-rede (Figura 14). Os testes foram feitos em 3 perodos, Teste 1 durante

o ms de dezembro, Teste 2 em abril e Teste 3 durante julho. Em cada um dos

experimentos foram utilizados 30 exemplares da D. rerio, sendo 15 machos e 15

fmeas. Os animais foram mantidos durante 21 dias nestes tanques rede,

consumindo alimento natural vindo da gua. Ao final deste prazo os peixes

foram anestesiados (banho em benzocana 4%), medidos e pesados, e

imediatamente congelados (COBEA, 1991). Para as anlises de VTG, foram

feitos extratos dos peixes, como descrito por Rose et al. (2002). Os peixes foram

macerados individualmente em soluo tampo sob refrigerao (50mM Tris-

HCl; pH 8,0; 0,02% Aprotinina, 0,1 mM PMSF) e em seguida centrifugados

5000xg por 60 min a 4oC. O sobrenadante foi armazenado a -70oC at o

momento das anlises.

46

47

Figura 14 - Tanque rede utilizado no teste crnico in situ com Danio rerio mantidos no rio Paraba do Sul, municpio de Pindamonhangaba (Ponto 1). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.

4.4.3 Teste crnico ex situ com espcie de peixe padronizada (Danio rerio)

O local que em que ocorreu o teste crnico ex situ utilizando-se a espcie

Danio rerio como modelo foi o laboratrio do Setor de Aquicultura do Polo

Regional Vale do Paraba (Agencia Paulista de Tecnologia dos Agronegcios,

Secretaria de Agricultura e Abastecimento). Os testes foram realizados

concomitantemente ao teste crnico com tanques rede (Teste 1- dezembro;

Teste 2- abril e Teste 3- julho.

Para a realizao dos testes foram utilizados aqurios de vidro com

capacidade de 10 litros. Foram testadas 5 diferentes condies (tratamentos) de

gua nos aqurios, sendo os seguintes grupos:

47

48

1- grupo controle: gua desclorada (controle)

2- captao para abastecimen