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Automatización en Microbiología ClínicaThe automation in clinical microbiology

Marcia Hart Casares I

I Médico especialista en Microbiología. Máster en Informática de Salud.

RESUMEN

El diagnóstico microbiológico en los últimos años ha sido favorablemente modificado por el impetuoso desarrollo tecnológicoactual. La introducción de equipos automatizados en la identificación de agentes etiológicos de enfermedades infecciosas a partirde los cultivos microbiológicos y sus correspondientes estudios de sensibilidad antimicrobiana, ha implicado una mejorasustancial en el tiempo de obtención de los resultados, mayor sensibilidad o positividad de las muestras, tanto de hemocultivoscomo de otros líquidos estériles, mejora y ampliación en la identificación de los microorganismos, mayor confiabilidad yreproducibilidad de los estudios de sensibilidad antimicrobiana, ha dado respuesta al mayor desarrollo de la biología molecular ya los cambios que se derivan en la taxonomía de los microorganismos. La automatización ha determinado entonces mejorar lasensibilidad y especificidad de las pruebas microbiológicas, al lograr acortar el tiempo de espera de resultados confiables y útiles.La introducción de estos métodos depende en gran medida del nivel de atención médica, del tipo de pacientes y del tamaño delhospital, para una mejor aplicación clínica, sin descartar estudios de costo-beneficio, ya que debemos tener en cuenta la adecuadautilización y racionalización de los recursos disponibles. En este trabajo mostramos algunos de nuestros resultados y el impactode esta tecnología en un hospital de tercer nivel de atención médica.

Palabras clave: Automatización del diagnóstico, resistencia bacteriana.

ABSTRACT

In past years the microbiological diagnosis has been favorably modified due to the significant current technological development.The introduction of automated equipments to identify etiological agents of infectious diseases from the microbiological culturesand its corresponding studies of antimicrobial sensitivity, has involved a marked improvement in the time to achieve results, agreater sensitivity or positive samples both from blood cultures and other sterile fluids, an improvement and lengthening inidentification of microorganisms, a greater reliability and reproducibility of the antimicrobial sensitivity studies, to answer to thegreat development of molecular biology and to changes derived in taxonomy of microorganisms. The objective of automation isto improve the sensitivity and specificity of microbiological tests shortening the time waiting for useful and reliable results.Introduction of these methods depends in a greater measure of medical care level, the type of patient and the hospital’s size fora better clinical application without rule out the cost-benefit studies since we must to take into account the use and rationalizationof available resources. Present paper shows some of our results and the impact of this technology on a third level medical carehospital.

Key words: Diagnosis automation, bacterial resistance.

Desde sus orígenes, y de forma especial enlos últimos años, la Microbiología clínica ha expe-rimentado un incremento extraordinario en el de-

sarrollo científico y tecnológico , que ha transcu-rrido en forma paralela con los avances de la ro-bótica y la automatización, estos han sido y son

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de inestimable ayuda ante el aumento de la de-manda de las pruebas microbiológicas y en la rea-lización de procesos, que se han convertido enaliados de los nuevos sistemas de gestión que per-siguen la eficiencia en los servicios de diagnósticoy un incremento en la utilidad clínica de los resul-tados de laboratorio.

A mediado del siglo XX se pensaba que las en-fermedades infecciosas disminuirían su incidenciay dejarían de ser un problema serio para la saluddel hombre, sin embargo la realidad se encargó demostrar que la lucha contra los microorganismosproductores de enfermedades estaba lejos de serganada y que, en el vaivén dialéctico de la relaciónentre el ser humano y los microorganismos, estosnos iban a dar nuevas sorpresas.1

A mediados de la década de los 60 aparecenlas primeras resistencias a los antibióticos, quehan llegado en estos momentos a proporcionesalarmantes, nosotros no hemos sido capaces dedesarrollar vacunas exitosas contra enfermedadesimportantes; ya que los microbios han demostradotener formas sorprendentes de cambiar y de eva-dir los mecanismos inmunológicos de nuestros or-ganismos, y para completar han aparecidoenfermedades infecciosas “emergentes y reemer-gentes”, muchas de ellas asociadas a las drásticasalteraciones ambientales y sociales que el mismoser humano ha introducido con el manejo frecuen-temente irracional de su entorno.

Los “microbiólogos clínicos” también debemosformar parte de estos problemas cambiantes delmundo actual y deberíamos ser unos "buenospatólogos" de las infecciones, conocer las necesi-dades de los médicos clínicos, poseer una idea ri-gurosa de la trascendencia del diagnósticoetiológico y de los recursos técnicos de que se dis-pone para alcanzarlo. Deberíamos ser muy críti-cos respecto al valor de dichas técnicas, sabiendoevaluar lo nuevo con prudencia y evitar 2 extre-mos peligrosos (el estancamiento tecnológico y elser víctima de innovaciones) tenemos que ser ca-paces de saber el valor de las pruebas de sensibi-lidad in vitro y poseer un criterio sólido sobre laaplicación de los antimicrobianos, atributos estosque no se adquieren solo en el laboratorio, sinotambién a la cabecera del enfermo. Esto, por tan-to, es uno de nuestros objetivos en estos tiempos ysobre todo en hospitales del 3er. nivel, donde los

problemas de resistencia se ven aun más elevadospor las características propias de estos centrosasistenciales.2

Analizar cuáles son en la actualidad los méto-dos automatizados de más relevancia en los labo-ratorios de microbiología genera un problema muydifícil y esto depende en gran medida del ler. nivelde atención, el tipo de pacientes y el tamaño dehospital

Los métodos más novedosos en el diagnósticose centran en el estudio de las bacteriemias, el diag-nóstico de identificación de los microorganismos yla pruebas de susceptibilidad, los métodos de de-tección de reacciones antígenos-anticuerpos y yamás recientemente y con aplicaciones muy espe-cíficas en el diagnóstico y la epidemiología la intro-ducción de técnicas de biología molecular.

El diagnóstico de las bacteriemias que abor-daremos ha sufrido muchos cambios con la intro-ducción de los equipos automatizados, así ladetección de positividad de las muestras ha teni-do un gran impacto clínico en la implementaciónde estos sistemas, en los hospitales, el monitoreoconstante y la agitación de las botellas han de-mostrado una aceleración del crecimiento por tan-ta disminución del tiempo de detección de positividadlo que va aparejado a un uso más racional de losantimicrobianos.3

Esto también tiene un impacto económico, por-que a pesar de que son sistemas caros queincrementan el costo de las botellas 2 ó 3 vecesmás que las convencionales, esto se ve compen-sado por una disminución de los subcultivos, dis-minución de accidentes del operador, un diagnósticomas rápido que genera menor estadía hospitalariay una disminución del costo de antimicrobianos,además del impacto epidemiológico que genera,ya que el soporte informático permite conocer losresultados por salas, gérmenes, contaminantes, estofacilita la información de la bacteriemia nosocomialasí como un impacto en la microbiología pues dis-minuye la carga de trabajo del laboratorio la posi-bilidad de procesamiento de grandes volúmenesde muestras en el tiempo, la disminución de la con-taminación en el laboratorio, además de que au-menta la positividad de los hemocultivos y elespectro de gérmenes posibles a identificar.

Todo esto ha tenido no solo una gran relevan-cia en el aislamiento de bacterias sino también de

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hongos, en especial especies de levaduras que hansido capaces de crecer en menor tiempo y conmayor variabilidad.4

En nuestra experiencia, y lo mostramos a con-tinuación, nuestro laboratorio ha sido capaz de es-tablecer un vínculo muy estrecho con los médicosde asistencia y hemos logrado con laimplementación de esta tecnología un incrementode la positividad de más del 10 % que con loshemocultivos convencionales.

En el laboratorio se introdujeron los equiposautomatizados en el año 2000 con una sustituciónde tecnología en 2006 por el Bact/alert con el quese han estudiado las muestras hasta enero de 2008como mostramos en la tabla (tabla 1).

siendo los protagonistas de infecciones del torren-te sanguíneo, aunque en ocasiones la no adecuadarecolección de la muestra constituye una causa dehemocultivos contaminados y la toma de muestrasde catéteres y otros dispositivos intravascularesla causa de hemocultivos falsos positivos ya quese sabe que los catéteres después de 24 horas, ensu totalidad están colonizados por gérmenes de lapiel.

La mayoría de los microorganismos son capa-ces de invadir el torrente sanguíneo. La distribu-ción de los agentes causales de la bacteriemia y lafungemia ha variado en los últimos años y actual-mente los microorganismos grampositivos, espe-cialmente estafilococos y enterococos, igualan osuperan en frecuencia a los bacilos gram- negati-vos.4

Dentro de los bacilos no fermentadores el gé-nero que con mayor frecuencia se aisló fue elAcinetobacter spp, género este que se ha mante-nido en los 2 últimos años como la segunda causade bacteriemia. Estos son la principal causa desepsis grave en pacientes hospitalizados y en es-tos momentos también constituyen los primerosagentes biológicos causales de sepsis nosocomial,lo que muchos autores incluso lo reportan comolos protagonistas de unas de las epidemias másgrandes del siglo 21 por la alta tasa de mortalidada la que se ve asociada, debido a la alta resisten-cia a los antimicrobianos.5

Las levaduras ocuparon el numero 3 en cuantoa frecuencia de aislamiento de gérmenes y esto esun resultado muy significativo, ya que mundialmen-te se reporta que las candidemias o funguemiasson cada vez más frecuentes en la práctica médi-ca y su incidencia ha aumentado en 500 % en losúltimos años en hospitales de alta complejidad,como es el caso del nuestro.6 Las especies másfrecuentes encontradas por nosotros en pacientescon funguemias son diferentes de Candidaalbicans, exhibiendo mayor resistencia o disminu-ción de la sensibilidad a los antifúngicos utilizadosen la práctica clínica.

En nuestro centro se ha observado un ascen-so de las funguemias en general, muchas de ellasincluso sin evidencia clínica de infección, tema estemuy controvertido pues en las infecciones por hon-go el sistema inmunológico del paciente juega unpapel muy importante, por ejemplo en Estados

Tabla 1. Muestras tomadas en el Laboratorio de Microbiología.2006-2008

Muestras Total Positivas %

LCR 210 53 25,2L. Pleural 39 17 43,5L. Peritoneal 16 9 56,2L. Pericárdico 3 2 66Sangre 2828 972 34,3

Durante el año 2007 se realizaron en el hospi-tal 1 468 muestras de hemocultivos automatiza-dos, se realizaron fundamentalmente en lasunidades de atención al paciente grave, en estos adiferencia de los hemocultivos convencionales ob-tuvimos una positividad del 32,3 % que si la com-paramos con los hemocultivos realizados en esoperíodo vemos que la positividad fue de un 23,1 %, además que el tiempo de detección de positividadpermitió un diagnóstico mas rápido de lasbacteriemias en 2 días (tabla 2).

Tabla 2. Resultados de hemocultivos automatizados en áreas deatención al paciente grave HHA 2007

Total Positivos %

Hospital 1468 468 32,3UCI 5 332 138 41,5UCI 8 202 85 42,6CCV 23 192 75 39,0CCV 24 48 5 10,4Hema 12 B 12 4 33,3

Los principales gérmenes aislados se mues-tran en el siguiente gráfico, como vemos losestafilococos coagulasa negativa, han sido y siguen

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Unidos, la candidemia es la cuarta causa más fre-cuente de infecciones del torrente sanguíneo enpacientes hospitalizados, después de estafilocococoagulasa negativo7 (Fig. 1).

El advenimiento de los métodos automatiza-dos para la identificación y el antibiograma ha sidocapaz de mejorar la reproducibilidad de los resul-tados por su estandarización existen incluso siste-mas de expertos y sistemas online entre laboratorio.

Los métodos automatizados en la identifica-ción de microorganismos y estudios de sensibili-dad a antimicrobianos han estado sometido amúltiples cambios, a lo largo de los años estos hansido modificados en aras de mejorar la especifici-dad y la sensibilidad de las pruebas y en acortarjunto con estos el tiempo de espera de unos resul-tados confiables y útiles En el caso de los estudiosde sensibilidad la concordancia con los métodosde difusión es buena pero tiene como limitaciónque las galerías o paneles tienen antibióticos fijos yalgunos mecanismos de resistencia requieren con-firmación.8

El antibiograma tiene como objetivo evaluaren el laboratorio la respuesta de un microorganis-mo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo enuna primera aproximación, su resultado como fac-tor predictivo de la eficacia clínica.

Las pruebas de sensibilidad, basadas en la di-fusión o en la definición de la concentración míni-ma inhibitoria (CMI) no se empezaron a perfilarhasta la década de los años 1940, sin que su uso segeneralizase hasta bien entrada la década de losaños 1960.

Esta circunstancia se debió en gran medida ala constatación de las numerosas variables queafectaban a los resultados obtenidos en las prue-bas de sensibilidad y a la ausencia de consensosque estableciesen las condiciones en las que de-bían realizarse estas determinaciones.

Una vez establecida la metodología utilizada,la mayor preocupación se centró en su desarrollotécnico, su normalización e in vitro con el fin pri-mario de mejorar la terapia antimicrobiana, sureproducibilidad, problema que aún perdura en

MARCIA HART CASARES

Fig.1. Principales gérmenes aislados.

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nuestros días al comprobarse diversos criterios enla interpretación de los antibiogramas

Ya en los años 1970, y de forma más constan-te durante los años 1980, numerosos laboratoriosde microbiología comenzaron a analizar de mane-ra sistemática los datos de sensibilidad, esencial-mente a antibióticos betalactámicos y aminoglicó-sidos, al tratar de asimilar sus resultados con losposibles mecanismos de resistencia. Esta actitudpermitió detectar e identificar algunos mecanismosde resistencia, incluso antes de que estos tuvieranverdadera trascendencia clínica. Este proceso sedenominó lectura interpretada del antibiograma yse fundamentó en el conocimiento molecular delos mecanismos de resistencia y en la interpreta-ción terapéutica de las pruebas de sensibilidad invitro con el fin primario de mejorar la terapiaantimicrobiana.9

En la figura siguiente se esquematiza la evo-lución de las pruebas de sensibilidad y las diversas

etapas que ha atravesado este proceso. Sin duda,el próximo reto de las pruebas de sensibilidad, dela lectura interpretada y de los métodos automáti-cos será su convergencia con los sistemas detipificación epidemiológica, para establecersistemáticamente la clonalidad de los aislamientosestudiados, y con las técnicas moleculares paracaracterizar de manera simultánea el mecanismoo los mecanismos de resistencia10 (Fig. 2).

Los conceptos y objetivos de la lectura inter-pretada del antibiograma fueron recogidos y expli-cados por Patrice Courvalin en 1992 Elconocimiento acumulado hasta esa fecha acercade los mecanismos de resistencia, la madurez enla realización de las pruebas de sensibilidad, el aná-lisis de los valores de CMI o halos de inhibición ysu significado en relación con la resistencia a losantimicrobianos, permitió enunciar los 3 pilaresbásicos o pasos en los que se fundamenta estafilosofía.11

Fig.2. Evolución de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana.

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a) Caracterización del fenotipo de resistencia apartir del estudio de sensibilidad de unmicroorganismo previamente identificadofrente a grupos de antibióticos pertenecientesa una misma familia o relacionados pormecanismos de resistencia comunes;

b) Deducción a partir del fenotipo de resistenciadel correspondiente mecanismo bioquímicoimplicado.

c) Inferencia, y modificación si es necesario, delfenotipo previamente establecido a partir delmecanismo de resistencia deducido.

Durante la lectura interpretada del antibiogra-ma se modifica la interpretación clínica de los re-sultados, sobre todo de aquellos antibióticos pocoafectados por los mecanismos de resistencia y queen las pruebas de sensibilidad se informarían comosensibles. También puede inferirse la sensibilidadde antibióticos no incluidos en el antibiograma, ycomo objetivo final la detección de los mecanis-mos de resistencia, incluidos los de bajo nivel deexpresión.

Con este proceso se consiguen valores añadi-dos a la información generada por las pruebas desensibilidad y que tienen trascendenciaepidemiológica y clínica.

Como le mostramos en esta diapositiva estosson algunos ejemplos que incluso llevan pocos re-cursos materiales que se pueden utilizar en la prác-tica diaria de un laboratorio y que daría mayorinterpretación a un antibiograma. En muchas oca-siones los antibióticos que se van a estudiar handejado de tener vigencia en la práctica clínica, peroson fundamentales para inferir los mecanismos deresistencia. Ejemplos de ello son el ácido nalidíxicoy la kanamicina, utilizados respectivamente para

detectar con mayor eficiencia enterobacterias re-sistentes a las quinolonas por mutaciones en lagirasa, la oxacilina para predecir la resistencia alos betalactámicos en los estafilococos o a la peni-cilina en S. pneumoniae.12 (cuadro)

Al igual que es necesaria la inclusión deantibióticos marcadores, también se recomiendael estudio de combinaciones entre antimicrobianose inhibidores de los mecanismos de resistencia. Enla mayoría de las ocasiones las combinacionesempleadas no se utilizan en la práctica clínica o loscompuestos inhibidores se emplean con otros fi-nes. Entre ellos destacan los inhibidores debetalactamasas, como el ácido clavulánico, queasociado a ceftazidima o cefotaxima permite de-ducir la presencia de betalactamasas de espectroextendido (BLEE) o el EDTA, que asociado alimipenem facilita el reconocimiento de determina-das carbapenemasas por debajo del punto de cor-te de sensibilidad, que permitan caracterizar losmecanismos de resistencia con bajo nivel de ex-presión.

Nosotros también hemos realizado estudios porejemplo en cepas multirresistentes de Acinetobac-ter baumannii en las que hemos encontrado desde2002 al 2008 un incremento en la resistencia a loscarbapenémicos de 3 a 55 % hemos realizadopruebas en las cuales nuestras cepas no tienenmecanismos de resistencia a los carbapenémicospor producción de carbapenasa, sino que debe ha-ber otros mecanismos de resistencias involucrados.

Estos beneficios derivados de la lectura inter-pretada del antibiograma son evidentes y dan va-lores añadidos a las pruebas de sensibilidad. Tantoes así, que hoy en día no debe entenderse el estu-dio sin llevar asociada la lectura interpretada.

MARCIA HART CASARES

Cuadro.

Mecanismo de resistencia Cambios en la interpretaciónMicroorganismo Fenotipo observado deducido e implicaciones terapéuticas

Enterobacterias Sinergia clavulánico BLEE Resistencia a todas las cedfalosporinasy cefalosporinas

P. aeruginosa Sinergia imipenem y EDTA ºMetalo-betalactamasa Resistencia de carbapenemsH. influenzae NalidíxicoR Mutaciones en gyrA ± parC Pérdida de sensibilidad a quinolonasEstafilococos OxacilinaR PBP2a Resistencia a todos los betalactámicosEnterococos VancommicinaR teicoplaninaS/I vanB Evitar uso de glicopéptidosS. pneumoniae OxacilinaR PBp modificadas Posible resistencia a penicilinas

y cafalosporinas de 1a y 2a generación

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Recibido: 31 de marzo de 2010Aprobado: 14 de abril de 2010

AUTOMATIZACIÓN EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Automatización del diagnóstico microbiológico en el Hospital “Hermanos Ameijeiras”.

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Tecnólogos de la salud incorporados a la pesquisa microbiológica en un hospital complejo.