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Aus der Medizinischen Klinik I
im Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikum Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. H. Klein
Untersuchungen zum Einfluss des oralen Antidiabetikums Metformin auf die hepatische Glukoseproduktion im Zellmodell
Inaugural-Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer
Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Christoph Alexander Mues
aus Krefeld 2009
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. H. H. Klein Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Diethelm Tschöpe Tag der Mündlichen Prüfung: 20. 04. 2010
Meiner lieben Familie gewidmet
4
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 13
1.1 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes und Rolle des Metformins 13
1.2 Mögliche Ansatzpunkte der Metforminwirkung 16
1.3 Insulinsignaltransduktion 19
1.4 Crosstalk zwischen AMPK und der Insulinsignaltransduktion 23
2 Arbeitshypothese und Fragestellung 25
3 Materialien und Methoden 26
3.1 Zellbiologische Arbeitstechniken 26
3.1.1 Zelllinien 26
3.1.2 Zellkulturmedien 26
3.1.3 Subkultivierung 27
3.1.4 Zellen einfrieren / auftauen 28
3.1.5 Zellstimulation 28
3.2 Proteinchemische Arbeitstechniken 29
3.2.1 Proteinbestimmung - BCA Protein Assay 29
3.2.2 Promotoraktivitätsbestimmung - Luciferase Assay System 29
3.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese / Western Blot 30
3.2.4 Erneutes Beproben (Re-Blot) 34
3.2.5 Coomassie – Färbung 35
3.2.6 Ponceau – Färbung 36
3.2.7 ELISA 36
3.2.8 Apoptosedetektion -TUNEL Assay 38
3.2.9 ATP-Konzentrationsbestimmung - ATP-Lite luminescence ATP
Detection Assay System 40
3.3 Molekularbiologische Arbeitstechniken 42
3.3.1 Gesamt-RNA-Extraktion 42
3.3.2 Photometrische RNA-Quantifizierung 43
3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 44
5
3.3.4 cDNA – Synthese 45
3.3.5 PCR von Glucose-6-Phosphatase und β-Actin 46
3.3.6 Real time quantitative PCR 48
3.4 Statistische Auswertung 50
4 Ergebnisse 52
4.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase 52
4.1.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in
Abhängigkeit von Insulin 52
4.1.2 Regulation der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in
Abhängigkeit von Metformin 53
4.1.3 Effekte von Insulin und Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase
mRNA 55
4.1.4 Regulation gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität
in Abhängigkeit von Metformin und Insulin 56
4.1.5 Effekte der AMPK auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin, Metformin und
AICAR 58
4.1.6 Effekte der AMPK auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin, Metformin und
AICAR 60
4.2 Beeinflussung der Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK durch Insulin,
Metformin, AICAR und Compound C 62
4.3 ATP-Konzentrationen in H4-Zellen unter dem Einfluss von Insulin und
Metformin 64
4.4 Effekte von Insulin und Metformin auf die Apoptose 66
4.5 Beeinflussung der Tyrosin-Phosphorylierung des Insulinrezeptors durch Insulin
und Metformin 70
4.6 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB durch Insulin,
Metformin und PI3-Kinase-Inhibitoren 71
4.7 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an GSK3 durch Insulin und
Metformin 74
6
5 Diskussion 76
5.1 Ergebnisdiskussion 76
5.2 Grenzen und Einordnung 80
6 Zusammenfassung 82
7 Literaturverzeichnis 85
7
Verzeichnis der Abkürzungen
A. dest. Aqua destillata
AICAR 5-Aminoimidazol-4-Carboxamid Ribosid
AK Antikörper
Akt/PKB Proteinkinase B
AMP Adenosinmonophosphat
AMPK AMP-activated protein kinase
ANOVA analysis of variance
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
BCA bicinchoninic acid
bp Basenpaare
BSA bovine serum albumine
CaCl2 Calciumchlorid
cDNA complementary DNA
cm centimeter
CO2 Kohlendioxid
dBcAMP Dibutyryl cyclic AMP
DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP Desoxynucleosidtriphosphat
DPP Dipeptidyl-Peptidase
DTT Dithiothreitol
DXM dexamethason
ECL enhanced chemoluminescence
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
ERK extracellular signal-regulated kinase
EtBr Ethidiumbromid
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
8
FCS fetal calf serum
FITC Fluorescein-5-isothiocyanat
FKHR forkhead in rhabdomyosarcoma
FOXO Forkhead box protein
FRET Fluorescence resonance energy transfer
G6Pase Glucose-6-Phosphatase
GLP Glucagon-like peptide
GLUT Glucosetransporter
GSK-3 Glycogensynthase-Kinase-3
h Stunde
H2O Wasser
HBS HEPES buffered saline
HCl Salzsäure
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HRP horseradish peroxidase
IR Insulinrezeptor
IRS1 Insulinrezeptor Substrat 1
JNK c-Jun N-terminale Kinase
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KHK Koronare Herzkrankheit
LAR Luciferase Assay Reagent
LY LY294002
mA Milliampere
MAPK Mitogen-aktivierte Kinase
MgSO4 Magnesiumsulfat
MODY Maturity Onset Diabetes of the Young
mRNA messenger RNA
mTOR mammalian target of rapamycin
Na3VO4 Trinatriumvanadattrihydrats
Na4P2O7 Tetranatriumdiphosphat, Natriumpyrophosphat
NaCl Natriumchlorid
9
NaF Natriumfluorid
NT-BPF NaCl, Tris, BSA, Pyrophosphat, Fluorid
pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit
PBS phosphate buffered saline
PCOS polycystic ovary syndrome
PCR Polymerase Chain Reaction
PDK phosphatidylinositol-dependent kinase
PEPCK Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
PI3-K Phosphatidylinositol 3-Kinase
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat
PKB Proteinkinase B
PKC Proteinkinase C
PPAR peroxysome proliferator-activator receptor
PTEN phosphatase and tensin homolog
PTP1B Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B
RLU relative light units
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
Rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion
Ser Serin
SHIP2 SH2-domain containing inositol 5-phosphatase 2
ß-ME beta-Mercaptoethanol
TAE Tris-Acetat-EDTA
TBS Tris-gepufferte-Saline
TBST TBS + Tween
TE Tris-EDTA
TEMED Tetramethylethylendiamin
Thr Threonin
Tris Trishydroxymethylaminomethan
10
TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-
triphosphate-biotin nick end labeling
Tween Polyoxyethylensorbitolmonolaurat
U Units (Enzymeinheiten)
U/min Umdrehungen pro Minute
UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
WM Wortmannin
11
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1: Galega officinalis, Strukturformel Metformin 19
Abb. 2: Insulinsignaltransduktion 22
Abb. 3: Crosstalk zwischen AMPK und Insulinsignaltransduktion 24
Abb. 4: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener
Insulinkonzentrationen 52
Abb. 5: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener
Metforminkonzentrationen 54
Abb. 6: Glukose-6-Phosphatase mRNA quantifiziert mittels real-time PCR 55
Abb. 7: Gesteigerte Promotoraktivität der Glukose-6-Phosphatase in Abhängigkeit
von unterschiedlichen Konzentrationen Metformin und 10-6M Insulin 57
Abb. 8: Effekt von Compound C (40µM) auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10-6M), Metformin (2mM)
oder AICAR (1mM) 59
Abb. 9: Effekt von Compound C (40µM) auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10-6M), Metformin (2mM)
oder AICAR (1mM) 61
Abb. 10: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK
Threonin 172 (Western Blot) 62
Abb. 11: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK
Threonin 172 (ELISA) 63
Abb. 12: ATP-Konzentrationen in H4 II E Zellen in Abhängigkeit unterschiedlicher
Konzentrationen Metformin und 10-6M Insulin 65
Abb. 13: Fluoreszenmikroskopische Apoptosebestimmung von H4 II E Zellen unter
verschiedenen Bedingungen 67
12
Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von:
a) unbehandelten H4 II E Zellen
b) mit 10-6M Insulin stimulierten H4 II E Zellen
c) mit 2mM Metformin stimulierten H4 II E Zellen
d) mit 5 Units DNase stimulierten H4 II E Zellen
in 40-facher Vergrößerung mit einem 490nm Filter für FITC. 69
Abb. 15: Bestimmung des Phosphorylierungsstatus am Insulinrezeptor an Tyrosin
1162/1163 70
Abb. 16: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den
Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 abhängig von Insulin 72
Abb. 17: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den
Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 abhängig von
Metformin 72
Abb. 18: Phosphorylierungsstatus an Akt/PKB an Serin 473 in Abhängigkeit von
Insulin und Metformin 73
Abb. 19: Phosphorylierungsstatus der Glykogen-Synthase-Kinase3β (GSK3β) an
Serin 9 75
13
1 Einleitung
1.1 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes und Rolle des Metformins
Diabetes mellitus (im Folgenden kurz: Diabetes) ist eine der häufigsten
endokrinologischen Erkrankungen. Er beruht auf einem absoluten oder relativen Mangel
an Insulin, in dessen Folge es zu einer gestörten Glukosetoleranz und häufig erhöhten
Blutzuckerspiegeln kommt. Die beim Diabetes oft über Jahre erhöhten Blutzuckerspiegel
führen bei vielen Erkrankten zu Schäden am Nerven- und Blutgefäßsystem.
Die Ätiologie des Diabetes wurde 1997 von der American Diabetes Association (ADA) in
Typ 1, Typ 2, Typ 3 (MODY, genetische Defekte der Insulinwirkung, chronische
Pankreatitis, Endokrinopathien, medikamentös induziert, Infektionen, genetische
Syndrome) und den Gestationsdiabetes klassifiziert.
Die Gesamtprävalenz der manifest an Diabetes erkrankten Bevölkerung weltweit betrug
im Jahr 2000 ca. 2,8 %. Es wird vermutet, dass sich diese Zahl bis zum Jahr 2030 auf 4,4 %
erhöhen wird. Absolut bedeutet dies, dass die Anzahl an Menschen mit Diabetes von 171
Millionen auf 366 Millionen weltweit steigen wird. Der wichtigste demografische Wandel
bezüglich der Diabetesprävalenz wird die Zunahme der über 65 Jährigen in der
Bevölkerung sein. Jeder 7. wird schätzungsweise betroffen sein. Hochprävalenzbereich
stellen vor allem industrialisierte Länder dar. Hierbei ist zu bedenken, dass ca. 85 % aller
Diabetesfälle dem Typ-2-Diabetes zugeordnet werden können. Ein Typ-1-Diabetes liegt
schätzungsweise bei 5–7 % aller Diabetesfälle vor [61].
Während der Typ-1 Diabetes aufgrund einer Autoimmunreaktion, durch die es zur
kontinuierlichen Zerstörung der β-Zellen des endokrinen Pankreas kommt, in einem
absoluten Insulinmangel endet, kommt es beim Typ-2-Diabetes durch bisher nicht
vollständig verstandene Mechanismen zu einer Insulinresistenz und gestörter
Insulinsekretion mit daraus resultierendem relativen Insulinmangel. Beiden gemeinsam
sind im Endstadium eine verminderte Aufnahme von Glukose in periphere Gewebe und
eine ungehemmte Glukoneogenese der Leber.
Das Auftreten eines Typ-2-Diabetes korreliert mit der Prävalenz von Übergewicht und
dem metabolischen Syndrom. So wurde durch statistische Untersuchungen belegt, dass
14
Typ-2-Diabetes eine deutlich erhöhte Prävalenz in industrialisierten Ländern gegenüber
Entwicklungsländern aufweist, wofür in erster Linie die übermäßige Kalorienaufnahme
verantwortlich gemacht wird [17]. Der Trend zur Entwicklung von Übergewichtigkeit,
metabolischem Syndrom und anschließendem Typ-2-Diabetes nimmt immer noch zu und
setzt sich auch zunehmend in jüngeren Bevölkerungsschichten durch, sodass der früher
gängige Begriff „Altersdiabetes“ für einen Typ-2-Diabetes nicht mehr angebracht und
auch irreführend ist [45, 51]. Diese Entwicklung ist besorgniserregend und stellt mit den
dadurch verbundenen Folgen (KHK, Apoplexie, Niereninsuffizienz, pAVK mit Gangrän und
Amputationen von Extremitäten, Erblindung und vielem mehr) einen erheblichen
Schaden für die Betroffenen wie auch für die Volkswirtschaft dar. Weitere
Forschungsanstrengungen auf diesem Gebiet mit dem Ziel der Entwicklung neuer
Therapiestrategien, insbesondere für den Typ-2-Diabetes, sind daher unerlässlich.
Jede Therapie des Typ-2-Diabetes hat die Steigerung der körperlichen Aktivität, die
Umstellung der Ernährung, die Schulung und Motivation des Patienten zum Ziel. Erst nach
Erfolglosigkeit dieser Maßnahmen sollte medikamentös in den Stoffwechsel eingegriffen
werden. Hierbei werden Mono- oder Kombinationstherapien der verfügbaren
Medikamente angewendet [36].
α -Glukosidasehemmer wirken inhibierend auf die α-Glucosidasen im Dünndarm und
bewirken dadurch eine Hemmung der Spaltung von Disacchariden, was zu einer
verminderten Glukoseaufnahme aus dem Darm in das Blut führt.
Sulfonylharnstoffe stimulieren die Freisetzung von Insulin durch die Blockade von ATP-
abhängigen Kalium-Kanälen in den β-Zellen des Pankreas. Ebenfalls fördernd auf die
Insulinproduktion wirken die sogenannten „Glinide“.
Thiazolidindione, auch Glitazone genannt, wirken aktivierend auf den Transkriptionsfaktor
PPARγ und verstärken somit auf bislang noch ungeklärte Weise die Signaltransduktion
von Insulin [38]. Thiazolidindione bewirken zusätzlich eine Aktivierung der AMPK [14].
Zu den neusten Möglichkeiten der Typ-2-Diabetes-Therapie gehören die Glucagon-like-
peptide-1 (-GLP-1)-Analoga (Inkretin-Mimetika/ Exenatide) und die Dipeptidyl-Peptidase-
4 (-DPP-4)-Inhibitoren. Während der Nahrungsaufnahme wird im Dünndarm das Hormon
Glucagon-like Peptid 1 freigesetzt, das in den β-Zellen des Pankreas die Ausschüttung von
Insulin bewirkt. GLP-1 wird vom menschlichen Organismus schnell abgebaut. GLP-1-
15
Analoga ähneln dem menschlichen GLP-1 und erhalten den Insulin-sezernierenden Reiz.
GLP-1 wird durch Dipeptidyl-Peptidasen abgebaut. Eine spezifische Hemmung dieser
Peptidasen durch DPP-4-Inhibitoren verlängert die Wirkung von GLP-1 [1, 9, 48].
Erst wenn mit oralen Antidiabetika keine ausreichende Blutzuckereinstellung möglich ist,
sehen die Leitlinien eine Insulin-Therapie vor [36].
Im aktuellen Leitlinienentwurf der Deutschen Diabetes Gesellschaft (DDG) ist Metformin
das Mittel der ersten Wahl zur Behandlung von Patienten mit Typ-2-Diabetes. Diese
Empfehlung gilt nicht nur zur Behandlung übergewichtiger Patienten, sondern auch zur
Behandlung normalgewichtiger Diabetiker. Nur bei Kontraindikationen für Metformin
oder Metforminunverträglichkeit werden andere orale Antidiabetika zur Monotherapie
empfohlen. Metformin kann, wenn seine blutzuckersenkende Wirkung nicht ausreicht,
mit anderen oralen Antidiabetika (Sulfonylharnstoffe, Glinide, Glitazone, GLP-1-Analoga,
DPP-4-Inhibitoren, Acarbose) kombiniert werden. Auch wenn eine Insulintherapie nötig
wird, wird Metformin aufgrund seines insulinsparenden Effekts und des Effekts im Sinne
einer Verhinderung der Gewichtszunahme meist beibehalten. Auch in der United
Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) wurden die günstigen Eigenschaften von
Metformin dargelegt. Metformin war in einer speziellen Teilstudie bei stark
Übergewichtigen mit Sulfonylharnstoffen und Insulin verglichen worden und erwies sich
hier als besonders vorteilhaft. Die Studienergebnisse der UKPDS haben weiterhin gezeigt,
dass Metformin zu einer signifikanten Reduktion von mikro- und makrovaskulären
Komplikationen beiträgt [54].
Metformin und andere Biguanide sind Wirkstoffe, die aus der französischen Lilie (Galega
officinalis, auch Geißraute) isoliert wurden (siehe Abb. 1). Erste Beobachtungen über die
blutzuckersenkende Wirkung von Guaniden wurden bereits um 1910 beschrieben. Es
wurde damals angenommen, dass die Nebenschilddrüsen für die Elimination von
Guaniden verantwortlich sind. Bei parathyreoidektomierten Menschen und Hunden
wurden erhöhte Guanid-Spiegel im Blut in Verbindung mit Hypoglykämien festgestellt
und darüber ein Zusammenhang zwischen Guaniden und antihyperglykämischer Wirkung
dargestellt [59]. Seit den späten 1950er-Jahren wird Metformin in Europa zur Behandlung
des Typ-2-Diabetes verwendet. In den USA wird Metformin erst seit 1994 zur Behandlung
16
des Typ-2-Diabetes eingesetzt [63]. Metformin senkt in vivo den Blutzuckerspiegel von
Typ-2-Diabetikern vor allem durch eine Hemmung der hepatischen Glukoneogenese. Es
besteht ein hoher First-pass-Effekt an der Leber. Bei Typ-2-Diabetikern wird die
Plasmakonzentration von Metformin mit 10-20 µM angegeben [21].
In der Portalvene werden höhere, bisher nicht gemessene Konzentrationen vermutet. 10-
20 µM Metformin gelten im Zellversuch als submaximal, um die Effekte von Metformin zu
aktivieren [21]. In Zellversuchen werden Metforminkonzentrationen von 1–10 mM in der
Literatur beschrieben. Die zur Effektauslösung von Metformin benötigte Konzentration ist
damit in Zellversuchen wesentlich höher als bei der Therapie des Typ-2-Diabetes in vivo.
Dieser Umstand wird dadurch erklärt, dass in vielen kultivierten Zellen der zur
hepatischen Metforminaufnahme benötigte organische Kationentransporter-1 (OCT1)
nicht exprimiert und dadurch die Aufnahme von Metformin erschwert wird [50, 58].
Interessant ist, dass trotz der großen Beliebtheit dieses Medikaments und großem
Forschungsaufwand der genaue Wirkmechanismus von Metformin nicht bekannt ist.
1.2 Mögliche Ansatzpunkte der Metforminwirkung
Der exakte Wirkmechanismus von Metformin ist Gegenstand intensiver Forschung und
noch nicht abschließend geklärt. Beschrieben wurde, dass Metformin ein Aktivator der
AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) ist [67]. AMPK ist eine heterotrimere
Proteinkinase, bestehend aus einer katalytischen α-Untereinheit, einer Glykogen-
bindenden β-Untereinheit und einer AMP und ATP bindenden γ-Untereinheit. Von der α-
Untereinheit sind zwei Isoformen bekannt (α1 und α2). Die α1-Untereinheit ist ubiquitär,
während die α2-Untereinheit nur in Muskel und Leber exprimiert wird. Beide Isoformen
besitzen eine katalytische, eine autoinhibitorische und eine βγ-bindende Domäne. Von
der β-Untereinheit sind ebenfalls 2 Isoformen bekannt (β1, wird ubiquitär exprimiert, und
β2, wird im Muskel exprimiert), während von der γ-Untereinheit drei Isoformen bekannt
sind (γ1 ubiquitär exprimiert, γ2 in Muskel exprimiert und γ3 in Skelettmuskel exprimiert)
[26, 52]. Die AMPK ist ein empfindlicher Sensor für den zellulären Energiestatus. Im Falle
einer katabolen Stoffwechsellage reichert sich AMP an. Die AMPK reagiert höchst
17
empfindlich auf Änderungen des AMP/ATP-Quotienten. Der ADP/ATP-Quotient ist wegen
der in allen eukaryotischen Zellen vorhandenen Adenylatkinasen, welche 2 ADP zu ATP
und AMP umwandelt, unbedeutend [18]. Steigt der AMP/ATP-Quotient an, wird die
AMPK aktiviert und schaltet anabole ATP-verbrauchende Stoffwechselwege ab, während
katabole ATP-erzeugende Stoffwechselwege aktiviert werden [19]. Auch zellulärer Stress
(z. B. Hypoxie, Ischämie, Glukosemangel [30, 35]) und ATP-verbrauchende Prozesse, wie
muskuläre Aktivität, und Hormone (z. B. die Adipokine Leptin und Adiponektin [39])
können die AMPK aktivieren. Vermehrt entstehende AMP-Moleküle binden an die γ-
Untereinheit der AMPK und bewirken eine Konformationsänderung, die sie zu einem
besseren Substrat ihrer vorgeschalteten Kinase, einem Komplex aus LKB1 und den zwei
akzessorischen Untereinheiten namens STRAD und MO25, werden lässt [21, 47]. Dieser
Komplex phosphoryliert AMPK an Threonin 172 der α-Untereinheit und steigert ihre
Aktivität um das 100-Fache. Eine alleinige allosterische Aktivierung durch AMP resultiert
in einer 10-fach zur Basalrate erhöhten Aktivität. Eine kombinierte allosterische und
durch Phosphorylierung kovalente Aktivierung erhöht die AMPK-Aktivität synergistisch
um das etwa 1000-Fache im Vergleich zur Basalaktivität [47]. Weiterhin ist beschrieben
worden, dass AMPK Calcium-abhängig durch die Calcium-Calmodulin-Kinase und durch
einen ansteigenden Kreatin/Phosphokreatin-Quotienten [42], unabhängig von AMP, an
Threonin 172 phosphoryliert und damit aktiviert werden kann.
Die Aktivierung der AMPK beeinflusst den Metabolismus auf vielfältige Weise:
Kohlenhydratstoffwechsel, Lipidstoffwechsel, Signaltransduktion, Zellproliferation und
Genexpression werden durch die AMPK moduliert. Die wichtigsten Modulationen am
Kohlenhydratstoffwechsel sind die durch GLUT-4-Translokation vermittelte verstärkte
Glukoseaufnahme, eine vermehrte Glykolyse, eine verminderte Expression von Genen der
Glukoneogenese (u. a. PEPCK und G6Pase) und eine verminderte Glykogenolyse.
Außerdem wird die Empfindlichkeit der Muskulatur für Insulin erhöht [20]. AMPK-
abhängige Veränderungen am Lipidstoffwechsel sind eine verminderte
Cholesterinsynthese, eine verminderte Fettsäuresynthese, eine verminderte Lipolyse und
eine vermehrte Fettsäureoxidation. AMPK hemmt weiterhin die Zellproliferation, weshalb
sie auch für onkologische Forschungsbereiche interessant ist [25, 40, 46, 67]. Auch beim
polyzystischen Ovar-Syndrom (PCOS) werden die Wirkungen der AMPK genutzt, um den
18
Menstruationszyklus von Patientinnen mit PCOS zu regulieren und ihre Abortneigung zu
reduzieren [12].
Letztendlich ist immer noch unklar, wie Metformin die AMPK aktiviert. Es wird weder zu
einem AMP-vergleichbaren Analogon metabolisiert noch reguliert Metformin die AMPK
direkt. Auch eine Hemmung von Phosphatasen, die Phospho-AMPK-Threonin 172
dephosphorylieren, konnte bisher nicht nachgewiesen werden [21, 52, 67].
Es wurde jedoch berichtet, dass Metformin, zumindest in höheren Dosen, wie auch
andere Biguanide den mitochondrialen Komplex 1 der Atmungskette inhibieren. Eine
solche Inhibierung könnte zu einem Anstieg des AMP/ATP-Quotienten führen und so
konsekutiv die AMPK aktivieren [10, 23, 43, 53]. Andere Autoren berichten
demgegenüber, dass kein Abfall der ATP-Konzentration und kein Anstieg des AMP/ATP-
Quotienten in Metformin-behandelten Zellen zu messen seien [14, 21]. Xie et al.
beschreiben eine Metformin-abhängige Phosphorylierung der der AMPK vorgeschalteten
Kinase, LKB1 an Serin 428 durch PKCζ mit anschließender Phosphorylierung der AMPK an
Threonin 172 [64].
Ein weiterer Aktivator der AMPK, da es ein AMP-Analogon ist, ist 5-aminoimidazol-4-
carboxamid-1-ß -D-ribofuranosid (AICAR). AICAR wird über Adenosintransporter in die
Zelle aufgenommen und durch Adenosinkinasen zu ZMP (5-aminoimidazol-4-carboxamid
ribonucleosid) phosphoryliert. Es imitiert dann AMP und alle damit verbundenen Effekte
der Hypoxie [57].
Compound C wirkt als reversibler, selektiver Hemmstoff der AMPK und kompetitiert mit
ATP. In Studien hoben Zhou et al. die Effekte von AICAR und Metformin dosisabhängig auf
[67].
19
1.3 Insulinsignaltransduktion
An insulinsensitiven Zellen, z. B. Adipozyten, Hepatozyten und Myozyten, werden über
den Insulinrezeptor die insulinspezifischen Effekte in das Zellinnere vermittelt. Zu diesen
Aufgaben zählen u. a. Glukoseaufnahme, Lipidsynthese, Glykogensynthese,
Proteinsynthese und Zellwachstum/-teilung [15].
Der Insulinrezeptor ist eine heterotetramere transmembrane Tyrosinkinase. Er besteht
aus zwei extrazellulären α-Untereinheiten und zwei transmembranären β-Untereinheiten,
die über Disulfidbrücken kovalent miteinander zu einem α2β2 -Komplex verbunden sind.
Der zytoplasmatische Teil der β-Untereinheit besitzt eine Tyrosinkinase-Domäne, die
durch Ligandenbindung an die α-Untereinheit aktiviert wird [4, 49]. Insulin
(Molekulargewicht 5807 D), ein Polypeptid bestehend aus einer A-Kette mit 21 und einer
B-Kette mit 30 Aminosäuren, die über 2 Disulfidbrücken miteinander verbunden sind,
bindet an die α-Untereinheiten des Insulinrezeptors. Diese Bindung bewirkt eine
Konformitätsänderung des Rezeptors mit nachfolgender Dimerisierung von β-
Untereinheiten, Aufhebung der Blockade der Tyrosinkinase durch die α-Untereinheit und
anschließende Autophosphorylierung von Tyrosinresten (Tyr 1158, 1162, 1163) der β-
Untereinheit [27].
Abb. 1: Galega officinalis, Strukturformel Metformin. Aus der französischen Lilie (Galega officinalis, auch Geißraute) wurde Metformin (1,1-Dimethylbiguanid, Summenformel C4H11N5, molare Masse 165,5 g/mol
−1)
extrahiert.
20
An diesem Punkt der Signalkaskade werden drei Signaltransduktionswege aktiviert (siehe
Abb. 2):
Mitogen-activated-pathway(-MAP)-Kinasen-Kaskade
Phospholipase C/Inositol-1,4,5-triphosphat(-PLC/IP3)-Weg
Phosphatidylinositol-3(-PI3)-Kinase-Kaskade [62]
Sie sind nicht streng isoliert zu betrachten, da sie sich untereinander beeinflussen. Ihre
Interaktionen sind noch nicht vollständig bekannt und Gegenstand aktueller Forschung.
Insbesondere die PI3-Kinase-Kaskade spielt für die Vermittlung metabolischer Effekte
durch Insulin die Hauptrolle.
Die Autophosphorylierung des Insulinrezeptors (IR) an Tyrosinresten ist Voraussetzung für
die weitere Interaktion mit den IR-Substraten (IRS 1-4), die als Andockstellen für weitere
Adaptorproteine mit Phospho-Tyrosin bindenden Domänen (SH2-Domänen) dienen.
Dabei sind insbesondere IRS 1 und IRS 2 wichtig für die Vermittlung des Insulineffekts. IRS
1 ist die vorherrschende Isoform in Muskelzellen, während IRS 2 hauptsächlich in
Hepatozyten vorkommt. IRS 3 (Adipozyten) und IRS 4 (Nervenzellen) spielen eine
untergeordnete Rolle [62]. An den Insulinrezeptor gebundenes IRS wird durch die
Tyrosinkinase-Aktivität des Insulinrezeptors ebenfalls an Tyrosinresten phosphoryliert.
Hierbei sind die Phosphorylierungen an Tyrosin 608 und 628 des IRS von besonderer
Bedeutung [16]. Über diese Phosphorylierungen interagiert IRS mit der regulatorischen
Untereinheit (p85) der PI3-Kinase. Die so an die Zellmembran rekrutierte PI3-Kinase
phosphoryliert mit der katalytischen Untereinheit p110 das Phospholipid
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat
(PIP3) [56]. An PIP3 kann die phosphoinositide-dependent kinase 1 und 2 (PDK 1, 2)
binden und wird dadurch aktiviert. PDK 1 und 2 aktivieren die Proteinkinase B (PKB/Akt)
durch Phosphorylierung an Serin 473 und Threonin 308 sowie atypische Formen der
Proteinkinase C (PKCζ/λ). PKB und Akt sind Synonyme und beschreiben dasselbe Enzym.
Diese Prozesse finden an der Zellmembran statt. Die aktivierte PKB löst sich von der
Zellmembran und vermittelt intrazelluläre Effekte im Cytosol und im Zellkern [29]. PKB ist
eine Proteinkinase, die wiederum eine Reihe von Proteinen phosphoryliert. Es sind 3
Isoformen der PKB bekannt (PKBα, β, γ), wovon die PKBβ den bedeutendsten Effekt für
21
die Insulinsignaltransduktion zu haben scheint. PKBα wird in Eukaryoten ubiquitär
exprimiert, ebenso PKBγ, aber in geringerem Ausmaß. PKBβ wird vor allem in Insulin-
sensiblen Geweben exprimiert [4, 32]. PKB vermittelt die Effekte von Insulin auf
Glukosetransport, Glykogensynthese, Proteinsynthese, Lipogenese, Suppression der
hepatischen Glukoseproduktion und Genexpression [2]. Direkte Substrate der PKB sind u.
a. die Gruppe der FoxO-Transkriptionsfaktoren und die Glykogen-Synthase-Kinase3
(GSK3) [6]. Weiterhin wird der Einbau von Glukosetransporter Typ 4 (GLUT4) in die
Zellmembran durch die aktive PI3-Kinase über AS160 und PRAS 40 vermittelt. Auch die
Aktivität glukoneogenetischer Schlüsselenzyme, wie der Glukose-6-Phosphatase (G6Pase)
und der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK), werden über den PI3-Kinase-Zweig
der Insulinsignaltransduktion beeinflusst [7]. Die G6Pase stellt dabei ein Schlüsselenzym
dar. Sie katalysiert den letzten Schritt der Glukoneogenese. Dabei wird Glukose-6-
Phosphat zu freier Glukose, die aus der Zelle in die Blutbahn exportiert werden kann. Die
G6Pase ist im endoplasmatischen Retikulum in Zellen aller Organe, die Glukoneogenese
betreiben können, vorhanden, also in der Leber, der Nierenrinde und im
Dünndarmepithel. PKB reguliert teilweise über Genexpression die Aktivität der G6Pase.
Der Promotor der G6Pase enthält eine „insulin-responsive sequence“, an der FoxO-
Transkriptionsfaktoren binden und die G6Pase-Expression ermöglichen. Insulin bewirkt
über PKB eine Phosphorylierung von FoxO. Die FoxO-Transkriptionsfaktoren können im
phosphorylierten Zustand nicht am G6Pase-Promotor binden und werden aus dem
Zellkern exportiert. Durch Insulin wird G6Pase reprimiert, während sie bei Abwesenheit
von Insulin exprimiert wird [5].
Dieser Zusammenhang erklärt einen wichtigen Teil der erhöhten Blutzuckerspiegel bei
Patienten mit Diabetes. Durch einen absoluten oder relativen Mangel an Insulin wird das
zelluläre Glukose-6-Phosphat verstärkt hydrolysiert. Glukose kann so nicht mehr in den
Zellen zurückgehalten werden. Glukoneogenese findet statt, obwohl ein vorhandenes
Überangebot an Glukose besteht.
Die Terminierung des Insulinsignals wird u. a. durch spezifische Phosphatasen erreicht.
Bekannt ist die Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B (PTP1B), die die Tyrosin-Phosphorylierung
am Insulinrezeptor aufhebt. Weiterhin bekannt sind phosphatase and tensin homologue
22
(PTEN) und SH2-domain containing inositol 5-phosphatase 2 (SHIP2), welche die
Lipidprodukte der PI3-Kinase dephosphorylieren und dadurch das Signal terminieren [11].
Eine weitere Möglichkeit der Beendigung des Insulinsignals stellt die Serin-
Phosphorylierung an IRS1 durch PKB, JNK, ERK, PKC und mTOR dar. Dadurch wird IRS zu
einem schlechteren Substrat für den Insulinrezeptor mit folgender Abnahme des
Insulineffekts [16]. Allerdings wurden auch Serin-Phosphorylierungen IRS1 beschrieben,
die aktivierend auf den Insulinsignaltransduktionsweg wirken, wie z. B.: Phospho-Serin
318 [60].
Es gibt Wirkstoffe, mit denen sich spezifisch einzelne Elemente der PI3-Kinase-Kaskade
hemmen oder aktivieren lassen. Hiervon wurden in der vorliegenden Arbeit die Agenzien
Insulin, Wortmannin und LY294002 verwendet.
Wortmannin hemmt die PI3-Kinase kovalent und irreversibel. LY294002 hemmt die PI3-
Kinase reversibel [4].
Abb. 2: Insulinsignaltransduktion. Dargestellt sind die entscheidenden Stationen der Insulinrezeptorkaskade und bekannte Terminierungsmöglichkeiten des Insulinsignals. Wichtigste Stationen der Kaskade sind der Insulinrezeptor, die PI3-Kinase und Akt/PKB.
23
1.4 Crosstalk zwischen AMPK und der Insulinsignaltransduktion
Die Insulinsignaltransduktion wird aktiviert, wenn Nährstoffe, insbesondere Glukose, die
Insulinsekretion stimulieren. Insulin steht folglich für eine anabole Stoffwechsellage. Der
AMPK-Signalweg wird aktiviert, wenn eine katabole Stoffwechsellage vorliegt,
Kohlenhydratreserven verbraucht werden und der zelluläre Energielevel in Form von ATP
aufrechterhalten werden muss. Dabei werden durch die AMPK ATP-verbrauchende
Stoffwechselwege blockiert, während ATP-erzeugende Stoffwechselwege aktiviert
werden. Man neigt dazu zu vermuten, dass beide Wege sich entgegenstehen. Dies ist
aber nur teilweise der Fall. Es ergeben sich teils gleichgerichtete, teils gegensinnige
Effekte.
Gegenseitige Beeinflussung der Signalwege besteht auf verschiedenen Ebenen. Dies
betrifft insbesondere die Synthese von Proteinen, Glykogen, Cholesterin, Fetten und die
Zellproliferation. AMPK bewirkt eine Minderung aller Synthesevorgänge und der
Zellproliferation, während Insulin diese begünstigt.
Gleichgerichtete Effekte sind zu beobachten in der Regulation des Blutzuckerspiegels.
Beide Signalwege bewirken eine Senkung des Blutzuckers, fördern die Glukoseaufnahme
durch GLUT4 und hemmen die hepatische Glukoneogenese. Die Hemmung der
hepatischen Glukoneogenese bewirkt sowohl durch AMPK als auch durch den
Insulinsignaltransduktionsweg eine verminderte Expression der Glukose-6-Phosphatase.
AMPK und Insulin haben zwei verschiedene Signalwege, die oberhalb des Glukose-6-
Phosphatase-Promotors ineinander fließen [34]. Der FoxO-Transkriptionsfaktor FKHR
(auch FoxO1a) wurde als Bindeglied dieser beiden Signalwege beschrieben. Dabei wird
die G6Pase durch Transaktivierung durch FKHR exprimiert [5]. Insulin bewirkt über
PKB/Akt eine Phoshporylierung von FKHR an Threonin 24, Serin 256 und Serin 319. Hieran
bindet das Protein 14-3-3, welches FKHR aus dem Zellkern exportiert und die
Transaktivierung der G6Pase vermindert. Auch AMPK bewirkt einen Export von FKHR aus
dem Zellkern mit konsekutiver Minderung der G6Pase-Transaktivierung. Allerdings ist
nicht bekannt, wie AMPK FKHR modifiziert, damit es zu den beschriebenen Prozessen
kommt. Sicher ist, dass es sich dabei nicht um Phosphorylierungen an Threonin 24, Serin
256 und Serin 319 handelt [3, 5, 6].
24
Auch andere Mechanismen zur gegenseitigen Beeinflussung zwischen AMPK und
Insulinsignaltransduktionsweg wurden beschrieben. Beispielsweise, dass Insulin über eine
Phosphorylierung durch PKB an Serin 485 und 491 der AMPK deren Aktivierung durch
Phospho-Threonin 172 in einigen Geweben antagonisiert [24]. Oder auch eine AMPK-
abhängige Verstärkung des Insulinsignals, die durch eine Phosphorylierung von IRS an
Serin 789 durch die aktivierte AMPK vermittelt wird [16]. Ein ähnlicher Effekt wird auch
bei körperlichem Training beobachtet: Training aktiviert die AMPK, welche den mTOR-
Singalweg des Insulinrezeptors hemmt. mTOR phosphoryliert IRS an verschiedenen
Serinresten, welche hemmend auf den Insulin-Signaltransduktionsweg wirken. Diese
Hemmung entfällt und das Insulinsignal wird verstärkt [13].
Diese teils unterschiedlichen, teils gleichen Wirkungen und Beziehungen zueinander
lassen auf eine komplexe, gewebespezifische Interaktion der beiden Wege untereinander
schließen. Die Mechanismen, die zur gegenseitigen Beeinflussung führen, sind nicht
vollständig aufgeklärt und Gegenstand intensiver Forschung.
Abb. 3: Crosstalk zwischen AMPK und Insulinsignaltransduktion: Der FoxO-Transkriptionsfaktor FKHR stellt das Bindeglied zum Glukose-6-Phophatase-Promotor der beiden Signalwege von AMPK und Insulinsignaltransduktion dar.
25
2. Arbeitshypothese und Fragestellung
Ziel der Arbeit ist es, mehr über den blutzuckersenkenden Effekt von Metformin auf die
hepatische Glukoneogenese zu erfahren. Hypothese ist dabei, dass Metformin über einen
AMPK-abhängigen Effekt Anschluss an die Insulinsignaltransduktion haben und so die
Glukose-6-Phosphatase auf Promotorebene beeinflussen könnte.
Die spezielle Fragestellung lautet daher:
Hat Metformin einen sich vom Insulin unterscheidenden Effekt auf die
Promotorebene der Glukose-6-Phosphatase und wird dieser Effekt durch AMPK
vermittelt?
Nutzt Metformin Schritte der Insulinsignaltransduktion zur Beeinflussung der
Glukose-6-Phosphatase auf Promotorebene?
Die Untersuchungen werden in einem Zellmodell mit H4-Rattenhepatomzellen
durchgeführt.
26
3 Material und Methoden
3.1 Zellbiologische Methoden
3.1.1 Zelllinien
Es wurden folgende Zelllinien verwendet:
H4 II E (ATCC#: CRL-1548)
Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus), adhärent wachsend, Monolayer mit kleinen
Aggregaten
H4 M 1.3
Transgene Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus) mit einem G6Pase
Promotorkonstrukt mit dem Leuchtkäfer-Luciferase-Gen.
Bei Aktivierung der G6Pase durch entsprechende Agonisten, kommt es zur
zeitgleichen Expression von Luciferase. Adhärent wachsend, Monolayer mit kleinen
Aggregaten.
Die Zelllinien wurden ausschließlich in Zellkulturflaschen der Firma TPP (Trasadingen,
Schweiz) mit einer Wachstumsfläche von 150cm² in einem Inkubator mit
wasserdampfgesättigter Atmosphäre, bei 37°C und 5,0% CO2, kultiviert.
3.1.2 Zellkulturmedien
Serumhaltiges Medium:
500ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high Glucose (PAA Laboratories;
Pasching, Österreich )
mit L-Glutamin (584mg/l),
mit Natriumpyruvat (110mg/l)
50ml FCS (HyClone Fetal Bovine Serum; Fa. Perbio, Aalst, Belgien)
5ml Penicillin (EK: 100 U/ml) und Streptomycin (EK: 100 mg/l) als 100-faches
Konzentrat (Biochrom, Berlin)
27
Unter sterilen Kautelen wurden die Materialien vermischt und anschließend über ein
Vakuum-Filtersystem (Membrantyp: PES 0,22µm) der Firma TPP (Trasadingen, Schweiz)
sterilfiltriert.
Serumfreies Medium:
485ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)high Glucose (PAA Laboratories;
Pasching, Österreich )
mit L-Glutamin (584mg/l),
mit Natriumpyruvat (110mg/l)
5ml Penicillin (EK: 100 U/ml) und Streptomycin (EK: 100 mg/l) als 100-faches
Konzentrat (Biochrom, Berlin)
0,01 mg/ml Rinderalbumin (BSA)
5ml 1M HEPES (EK: 10mM)
Unter sterilen Kautelen wurden die Materialien vermischt und anschließend über ein
Vakuum-Filtersystem (Membrantyp: PES 0,22µm) der Firma TPP (Trasadingen, Schweiz)
sterilfiltriert.
3.1.3 Subkultivierung
Materialien:
Dulbecco´s PBS ohne Ca & Mg (PAA; Pasching, Österreich )
Trypsin-EDTA (PAA; Pasching, Österreich )
Serumhaltiges Medium
Sterile Zentrifugationsröhrchen
Bei ca. 90%iger Konfluenz wurden die Zellen im Verhältnis 1:10 subkultiviert oder für
Versuche verwendet. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit D-PBS gewaschen.
Anschließend wurden sie mit 5ml 1x Trypsin/EDTA für wenige Minuten im Kulturschrank
abgelöst. Das Trypsin wurde anschließend mit 10ml frischem serumhaltigen Medium
deaktiviert. Die Zellsuspension wurde für 5 Minuten bei 23°C und 410x g zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert und
in frische Zellkulturflaschen bzw. andere Reaktionsgefäße ausgesät.
28
3.1.4 Zellen einfrieren / auftauen
Materialien:
D-PBS ohne Ca2+ & Mg2+
Einfriermedium (10% DMSO in FCS)
Sterile 50ml Falcon-Zentrifugationsröhrchen
Sterile Kryorörchen
Zur längerfristiger Einlagerung von Zellen wurden diese wie oben beschrieben
abtrypsiniert, mit serumhaltigen Medium verdünnt und anschließend für 5 min bei 23°C
und 410x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in Einfriermedium
resuspendiert und anschließend in Kryoröhrchen aliquotiert. Um eine schonende
Abkühlung zu ermöglichen, erhielten die Kryoröhrchen eine Zellstoffpapierumwickelung.
Sie wurden bei -80°C gelagert. Zur Reaktivierung der Zellen wurden sie bei
Raumtemperatur aufgetaut und anschließend in serumhaltigem Medium suspendiert,
pelletiert und in Kulturmedium ausgesät.
3.1.5 Zellstimulation
Materialien:
6-Well Zellkultur-Testplatten; 9,03 cm² Wachstumsfläche je Vertiefung (TPP; Trasadingen,
Schweiz)
D-PBS ohne Ca2+ & Mg2+
Serumfreies Medium
Die Medien wurden vom 6-Well entfernt, dieses anschließend 3x mit vorgewärmtem D-
PBS gespült und daraufhin das Versuchsmedium zugegeben. Vor einer
Stimulation/Präinkubation wurden die Zellen 2 Stunden in je 2 ml/Well mit serumfreien
Medium behandelt, um die durch im Serum enthaltene Wachstumsfaktoren verursachte
basale Phosphorylierung der an der Signaltransduktion beteiligten Proteine möglichst
gering zu halten. Das serumfreie Nährmedium wurde entfernt und anschließend das
Stimulationsmedium hinzugegeben. Stimulationszeit und Präinkubationszeit variierten je
nach Versuch.
29
3.2 Proteinchemische Arbeitstechniken
3.2.1 Proteinbestimmung - BCA Protein Assay
Der BCA Protein Assay Kit der Firma Pierce dient der Quantifizierung von
Proteinkonzentrationen in Lösungen mittels Biuret-Reaktion. Proteine reagieren mit Cu2+
Ionen in alkalischer Lösung, dabei entstehen Cu+ Ionen. Diese bilden mit Bicinchinonsäure
(BCA) einen violetten Fabrkomplex, der in seiner Extinktion proportional zur vorhandenen
Menge Protein ist. Dabei wird die Menge Protein relativ zu einer BSA-Eichkurve ermittelt.
Materialien:
BCA Protein Assay (Pierce; Rockford, Illinois, USA)
96-Well Mikrotiterplatte
BSA-Standardreihe
Zellysat
Proteinmengenstandard: Verdünnungsreihe von BSA in Lysepuffer. BSA (100mg/ml)
wurde dazu im entsprechenden Lysepuffer des Zellysates schrittweise auf
unterschiedliche Konzentrationen verdünnt (i.d.R. 0-10000µg/ml). Bei der Wahl des
Lysepuffers wurde darauf geachtet, dass er keine mit dem BCA Assay interferierende
Substanzen enthielt.
5µl Zellysat bzw. Proteinstandard wurden in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und mit
100µl einer Reaktionslösung aus BCA Reagent A und B (Mischverhältnis 50:1) versetzt. Ein
Well wurde nur mit 100µl Reaktionslösung befüllt, um einen Leerwert zu erhalten.
Anschließend wurde die Mirkotiterplatte bei 37°C für ca. 60 Minuten inkubiert.
Die Extinktion wurde mit einem Mikroplattenphotometer bei einer Wellenlänge von
562nm gemessen. Aus den Standardwerten wurde eine lineare Eichkurve interpoliert,
anhand derer die Proteinkonzentrationen der Proben ermittelt wurde.
3.2.2 Promotoraktivitätsbestimmung - Luciferase Assay System
Das Luciferase Assay System der Firma Promega ist ein Reportergen-Assay. Der
Promoterregion eines spezifischen Gens, in der vorliegenden Arbeit Glucose-6-
30
Phosphatase, ist die firefly luciferase nachgeschaltet und wird bei Aktivierung des Zielgens
mit exprimiert. Die Luciferase katalysiert eine biolumineszente Reaktion bei
Substratzugabe. Dadurch kann die Promotoraktivität als Lichtemission nachgewiesen und
mit einem Luminometer quantifiziert werden.
Materialien:
H4 M1.3 Zellen
Luciferase Assay System (Fa. Promega, Mannheim)
Luminometer Berthold MiniLuminat LB 9605 (Berthold Technologies, Bad Wildbad)
3,5ml Reaktionsgefäße 55x12mm (Sarstedt, Nümbrecht)
1,5ml Reaktionsgefäße
Vor Versuchsdurchführung wurden Lysepuffer und Luciferase Assay Reagent gemäß
Herstellerangaben angesetzt. Alle für das Luciferase Assay System lysierten Zellen wurden
zuvor 12 Stunden lang mit Agenzien in 6-Wells stimuliert. Anschließend wurde das
Medium entfernt und die Wells mit gekühltem D-PBS 3x gespült. Anschließend wurden
200µl Lysepuffer in die Wells gegeben und die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt.
Das Lysat wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und 1min bei 4°C und 20780x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde in frische Reaktionsgefäße überführt und
weiterbehandelt. Aus dem Überstand wurden für die Versuche zur Dosisabhängigkeit der
Wirkung von Metformin und Insulin 5µl Lysat entnommen und mit 25µl Luciferase-
Reagent (LAR) (Verhältnis 1:6) ca. 20 Sekunden in 3,5ml Reaktionsgefäßen für die
luminometrische Messung vermischt. Innerhalb einer Minute wurde die Messung
durchgeführt. Für alle anderen Reportergen-Assays wurden 10µl Lysat und 50µl LAR
verwendet. Die ermittelten relative light units (RLU) wurden anschließend auf die
Proteinmenge normiert.
3.2.3 Polyacrylamidgelelektrophorese / Western Blot
Als Western Blot bezeichnet man die Übertragung und den Nachweis von Proteinen auf
einer Trägermembran. Anschließend werden Zielproteine durch spezifische primäre und
sekundäre Antikörper mittels Peroxidasereaktion nachgewiesen. Vor dem eigentlichen
Blot müssen die zu untersuchenden Proteinlösungen durch eine
31
Polyacrylamidgelelektrophorese entsprechend Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften
der Proteine aufgetrennt werden.
Materialien:
Polyklonale Antikörper, proteinspezifisch
Polyklonale Anti-IgG, Peroxidase gekoppelt (DakoCytomation; Glostrup, Dänemark)
NT-BPF (50mM Natriumchlorid,
50mM Tris-base,
50mM Natrium-pyrophosphat,
100mM Natrium-fluorid,
0,1% (m/v) Natrium-Methylhydroxybenzoat,
0,5% (m/v) BSA,
0,05% (m/v) Triton-X 100 pH 7,4
CL-XPosure Film Clear Blue X-Ray Film (Pierce; Rockford, Illinois, USA)
Pierce ECL Western Blotting Substrate (Pierce; Rockford, Illinois, USA)
Zellysat (Proteinmenge vorher mittels BCA Assay quantifiziert)
Roati-Load 1 4x (Roth, Karlsruhe)
Tris-Tricin Electrophoresis Anode Buffer
(24,22g Tris-Base in 800ml H2O,
pH-Einstellung auf 8,9 mit konz. HCl,
mit dest. Wasser ad 1L)
Tris-Tricin Electrophoresis Cathode Buffer
(12,11gr. Tris-Base,
17,92gr. Tricin,
1gr. Natriumdodecylsulfat
mit H2O auf 1L auffüllen)
Massenstandard: PageRuler prestained Protein ladder plus (Fermentas, St. Leon-Rot)
Gel:
dest. Wasser
Tris-Tricin Electrophoresis Gel Buffer
32
(363,4gr. Tris-Base in 500ml H2O,
pH-Einstellung auf 8,45 mit konz. HCl,
3,0gr. Natriumdodecylsulfat,
mit H2O auf 1L auffüllen)
30% (m/v) Bisacrylamid Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) (Roth, Karlsruhe)
10% (m/v) Ammonium Persulfat (APS)
TEMED
0,5% Bromphenolblau
Isobutanol
Blot:
Nitrocellulose Transfer Membrane (Whatman, Dassel)
Rotilabo-Blottingpapier 1,5mm (Roth, Karlsruhe)
SemiDry Transfer Buffer (48mM Tris-Base,
39mM Gylcin,
0,04% (m/v) Natriumdodecylsulfat in H2O,
40% (v/v) Methanol)
Verwendete Antikörper:
Primär: Phospho-Akt (Serin 473), cell Signaling #4058s
Akt Antibody, cell Signaling #9272
Phospho-AMPKα (Threonin 172), cell Signaling #2531s
AMPKα Antibody, cell Signaling #2532
Phospho-GSK3α/β (Serin 21/9), cell Signaling #9331s
GSK3β Antibody, cell Signaling #9315
Sekundär: Polyclonal goat anti mouse Immunglobulins/HRP, DakoCytomation
P0447
Polyclonal goat anti rabbit Immunglobulins/HRP, DakoCytomation
P0448
Polyclonal rabbit anti goat Immunglobulins/HRP, DakoCytomation
P0449
33
Zelllysate wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen und durch das Anlegen einer
elektrischen Spannung (Feldstärke: 5 V/cm) aufgetrennt. Es besitzt zwei Phasen, wobei
die untere Phase ein hochprozentiges Trenngel ist und die obere Phase ein
niederprozentiges Sammelgel. Dadurch werden sehr scharfe Proteinbanden erzielt.
Die Gele hatten eine Größe von 7cm x 9cm bei einer Dicke von 1,5mm. In der
vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich 10%ige Tris-Tricin Trenngele verwendet. Die
Stammlösung für die 10% Trenngele wurde folgendermaßen angesetzt: 6,7ml dest. H2O;
6,7ml Gel-Puffer ; 6,7ml 30% Acrylamid.
Die Polymerisation wurde durch die Zugabe von 66,7µl 10% APS und 50µl TEMED
gestartet. Die Mischung wurde sofort in eine vorbereitete Gießform überführt. Um einen
blasenfreien scharfen Abschluss des Trenngels zu erhalten, wurden noch vor der
Auspolymerisation 200µl Isopropanol auf das Gel gegeben. Nach Polymerisation des
Trenngels wurde der Isopropanolüberstand entfernt.
Die Stocklösung für die Sammelgele wurde folgendermaßen angesetzt: 12,5ml dest. H2O;
5ml Gel-Puffer ; 2,5ml 30% Acrylamid; 1 Tropfen Bromphenolblau-Lösung. Die
Polymerisation wurde mit 100µl 10% APS und 80µl TEMED gestartet. Das Sammelgel
wurde auf das Trenngel geben. Noch vor Auspolymerisation wurde der Kunststoffkamm
(Breite: 1,5mm, 10 Spuren) eingepasst. Nach der Polymerisation wurde er vorsichtig
entfernt. Es wurden in den so erhaltenen Taschen des Gels 40µg Protein aufgetragen. Das
benötigte Volumen wurde zuvor durch die Proteinquantifizierung mittels BCA-Assay
ermittelt. Dem Volumen wurde Laemmli-Puffer (4x Roati-Load; Verhältnis Lysat : Roati-
Load; 3:1) zugegeben, vermischt und für 7,5 min. auf 99°C erhitzt, um eine vollständige
Denaturierung der Proteine zu erreichen . Das Gel wurde mit den Proben und einem
Proteinmarker (PageRuler, 2µl) zum Größenvergleich beladen. Zur Elektrophorese wurde
eine elektrische Feldstärke von 2 bis 5 V/cm angelegt, die Kathode war auf der Seite des
Sammelgels angeschlossen. Die Elektrophorese wurde beendet, sobald die Bande aus
Bromphenolblau die Unterkante des Gels erreicht hatte.
Die Proben wurden nach der Auftrennung elektrophoretisch auf eine
Nitrozellulosemembran übertragen. Das Sammelgel wurde dazu entfernt, das Trenngel
mit wenig dest. Wasser gewaschen und in einer semi-dry-Apparatur zwischen zwei Lagen
Rotilabo-Blottingpapier von je 1,5 mm auf ein Nitrozelluloseblatt von 0,2 μm Porendicke
übertragen. Die Nitrozellulosemembran befand sich dabei zwischen Gel und Anode,
34
Nitrozellulose und Filterpapiere wurden vor dem Zusammenbau der Transferapparatur
mit SemiDry Transfer Buffer getränkt. Die Übertragung wurde bei einer Stromdichte von
0,8 mA/cm2 durchgeführt und dauerte zwei Stunden. Nach dem Transfer wurde die
Membran mit Ponceau S gefärbt, um den Transfer zu kontrollieren. Daraufhin wurde die
Membran für 15 Minuten bei Raumtemperatur in NT-BPF inkubiert, um freie
Bindungsstellen auf der Membran mit BSA zu blockieren. Das Gel wurde Coomassie
gefärbt, um die Vollständigkeit der Gelelektrophorese zu kontrollieren.
Die Membran wurde nach dem Blocken über Nacht bei 4°C im primären Antikörper
(Verdünnung nach Herstellerangaben in NT-BPF) geschwenkt. Es schloss sich ein
dreimaliges Waschen für 10 Minuten bei Raumtemperatur der Membran in NT-BPF an.
Anschließend wurde die Membran in den am FC-Fragment Peroxidase-gekoppelten Anti-
IgG sekundären Antikörper (1:5000 bzw. 1:10000 in NT-BPF) für 1 Stunde inkubiert und
danach wieder 3 mal für je 10 Minuten in NT-BPF gewaschen.
In der Dunkelkammer wurde das Chemielumineszenzbild erstellt. Dazu wurden die Pierce
ECL Western Blotting Substrate A+B 1:1 miteinander vermischt und die Membran für 2
Minuten darin inkubiert. Die noch feuchte Membran wurde anschließend in eine
Klarsichtfolie verpackt und zusammen mit einem Röntgenfilm in einer Filmkassette
verschlossen. Die Belichtungszeit betrug immer zuerst 2 Minuten. Der Film wurde
unmittelbar nach der Exposition in einer Filmentwicklungsmaschine(AGFA Curix 60)
automatisch entwickelt. Dem Ergebnis dieser ersten Belichtung wurde die Belichtungszeit
der folgenden Expositionen angepasst (maximal 2 Stunden, minimal 10 Sekunden), um
ein optimal auswertbares Bild zu erhalten. Die Schwärzung des Films gibt die Stellen an
der Membran an, an der sich das untersuchte Protein befindet.
3.2.4 Erneutes Beproben (Re-Blot)
Materialen:
Stripping-Buffer (8gr. Tris-Base,
20gr. Natriumdodecylsulfat in 500ml H2O,
pH-Einstellung auf 7,4 mit konz. HCl,
mit H2O auf 1L auffüllen;
vor gebrauch 0,5% v/v β-Mercaptoethanol zugeben)
Nitrocellulosemembran (bereits geblottet und mit AK benetzt)
35
NT-BPF
Polyklonale Antikörper, proteinspezifisch
Primäre und sekundäre Antikörper kann man von einer Membran durch Strippen wieder
entfernen. Dazu wird die Membran für 10 Minuten mit Stripping-Buffer behandelt.
Anschließend wurde erneut in NT-BPF geblockt. Das weitere Vorgehen entspricht der
Anleitung zum Western Blot.
Zu allen Western-Blots, die ein phosphoryliertes Protein nachgewiesen haben, wurde das
Gesamtprotein im Re-Blot bestimmt. Die Phospho-Antikörper wurden mittels Stripping-
Buffer von der Membran gelöst und nach Blockung in einen proteinspezifischen primären
Total-Antikörper inkubiert.
3.2.5 Coomassie – Färbung
Materialien:
Polyacrylamidgel, nach abgelaufener Gelelektrophorese und Blot
Färbelösung:
0,1% (m/v) Coomassie Blau R-250
45% (v/v) Methanol oder vergälltes Ethanol
10% (v/v) Eisessig
Rest dest. Wasser auf 1l
Entfärber:
10% (v/v) Methanol oder vergälltes Ethanol
10% (v/v) Eisessig
Rest dest. Wasser auf 1l
Coomassie Blue ist ein Farbstoff, der an Proteine bindet und daher zur Kontrolle der
Gelelektrophorese genutzt wird. Das Gel wird dazu für einige Minuten in Coomassie-
Lösung inkubiert. Der Farbstoff lagert sich an basische und aromatische Seitenketten von
Aminosäuren an und färbt so die Proteine. Allerdings färbt der Farbstoff zunächst das
gesamte Gel ein. Das eingefärbte Gel wird solange in Entfärberlösung geschwenkt bis die
36
Färbung nur noch an den Proteinen zu sehen ist. Die Färbung dient zur Kontrolle der
elektrophoretischen Auftrennung der Proteine nach dem Transfer auf die
Nitrozellulosemembran. Reste der Proteine befinden sich im Gel.
3.2.6 Ponceau – Färbung
Materialien:
Nitrocellulose-Membran, bereits geblottet, ungeblockt
Ponceau S – Färbelösung (0,5g Ponceau S 0,1%,
500ml 5% Essigsäure)
Die Ponceau-Färbung wird verwendet, um Proteine unspezifisch auf
Nitrocellulosemembranen anzufärben und damit den Transfer der Proteine vom
Polyacrylamidgel auf die Membran zu überprüfen. Dazu wird die ungeblockte, geblottete
Membran in Ponceau-Lösung geschwenkt. Die Proteine werden angefärbt und zeigen
damit den Transfer an. Die eingefärbte Membran kann direkt in NT-BPF zum Blocken
unspezifischer Bindungsstellen gegeben werden. Der Farbstoff wird dabei von im
Überschuss vorliegendem BSA absorbiert.
3.2.7 ELISA
ELISA bedeutet Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Der ELISA dient dazu, Antigene mit
einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen. Mit einem
enzymgekoppelten Antikörper quantifiziert man durch eine Farbreaktion die Menge des
vorhandenen Antigens.
In der vorliegenden Arbeit wurde auf Prinzip des Double-Antibody-Sandwich-ELISA
zurückgegriffen. Auf dem Boden einer 96-Well-Mikrotiterplatte sind bei dieser Methode
antigenspezifische IgG-Antikörper gebunden. Dieser erste Antikörper wird coating-
Antikörper genannt. Die zu analysierende Lösung wurde in ein Well gegeben und
verbleibt einige Zeit darin damit das Antigen an den coating-Antikörper binden kann.
Nach einem Waschvorgang wird der zweite IgG-Antikörper, ebenfalls proteinspezifisch, in
das Well gegeben. Nach erneutem Waschen wird der Detektions-Antikörper, ein Anti-IgG-
Antikörper mit am FC-Teil gebundener Meerrettichperoxidase (horseredishperoxidase;
37
HRP), in das Well gegeben und wiederum gewaschen. Anschließend wird ein HRP-
Substrat zugegeben, das zu einem farbigen Produkt umgesetzt wird. Dieses wird
photometrisch quantifiziert. Die gemessene Extinktion verhält sich proportional zum
vorhandenen Antigen.
Material:
Akt-Lyse-Puffer (50mM HEPES pH 7,6,
1%v/V Triton x-100,
150mM NaCl,
1mM EDTA,
10%v/v Glycerol,
1mM DTT,
vor Gebrauch 1mM Natriumvanadat und
1mM PMSF hinzugeben)
ELISA Immunoassay Kit (Insulin Rezeptor Tyrosin 1162/1163;
Insulin Rezeptor ß-Subunit;
Akt Serin 473;
Total Akt;
AMPK Threonin 172) (Biorsource; Nivelles, Belgien)
1,5 ml Reaktionsgefäße
Jedem ELISA ging eine Zellstimulation in 6-Wells voraus. Die Stimulationszeit betrug 15
bzw. 30 Minuten. Nach Stimulationsende wurden die H4 II E Zellen 3x mit gekühltem D-
PBS gewaschen und anschließend mit 350µl Akt-Lyse-Puffer für 30 Minuten auf Eis lysiert.
Das Lysat wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und bei 4°C, 20780x g für 10
Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Reaktionsgefäße überführt, der Rest
verworfen. 10µl der Probe wurden mit 90µl des mitgelieferten „Standard Dilutent Buffer“
verdünnt und anschließend in ein Well der Mirkotiterplatte gegeben. Es schloss sich eine
zweistündige Inkubationszeit bei Raumtemperatur an. Danach wurden die Wells, mit dem
nach Herstellerangaben angesetztem Wasch-Puffer, 4 Mal gespült, um nichtgebundene
Agenzien zu entfernen. Anschließend wurden 100µl der Lösung mit dem 2. Antikörpers in
die Wells gegeben. Nach einer einstündigen Inkubationszeit schloss sich erneut ein
38
viermaliger Waschvorgang an bevor 100µl des detection-Antikörpers für 30 Minuten bei
Raumtemperatur hinzugegeben wurden. Anschließend wurde wieder mit Wasch-Puffer 4
mal gespült. 100µl des mitgelieferten Chromogen-Lösung wurde daraufhin in die Wells
gegeben und für 25 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend
wurde die Reaktion mit 100µl aus der mitgelieferten „Stop Solution“ beendet und der
entstandene gelbe Farbstoff sofort im Photometer bei 450nm gemessen.
Dem Phospo-ELISA schloss sich immer ein Total-ELISA (außer AMPK Threonin 172) an, um
die Menge Phospho-Protein die Proteingesamtmenge normalisieren zu können. Lediglich
beim AMPK Threonin 172 ELISA wurde auf die Gesamtproteinmenge, mittels BCA Assay
ermittelt, normalisiert, da kein ELISA zur Quantifizierung verfügbar war. Sowohl im
Phospho-ELISA, als auch im Total-ELISA wurden die Signale auf einen im Kit enthaltenen
Massenstandard normiert.
3.2.8 Apoptosedetektion -TUNEL Assay
TUNEL steht für „terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated 2’-deoxyuridine
5’-triphosphate-biotin nick end labeling“. Ziel dieser Methode ist es, apoptotische Zellen
über DNA-Fragmentation zu detektieren.
Nach Einwirken von Agenzien auf Zellen und auch physiologisch, tritt Apoptose auf. Eine
von vielen Veränderungen, die zu beobachten sind, ist die DNA-Fragmentation. Dabei
entstehen freie 3´-OH Enden an DNA-Strangbrüchen. Die TdT transferiert an Doppel- oder
Einzelstrang-DNA mit freien 3´-OH Enden ein Oligomer aus Digoxigenin-Nukleotiden.
DNA-Fragmente, die mit Digoxigenin-Nukleotiden markiert sind, binden in einem zweiten
Schritt an Anti-Digoxigenin-Antikörper, die mit Fluorescein konjugiert sind. Bei Anregung
mit blauem Licht (488nm) emittiert Fluorescein grünes Licht (max. 520nm), die
Strangbrüche können so fluoreszenzmikroskopisch detektiert werden. Die Zellkerne
wurden mit Ethidiumbromid (1:10000) gegengefärbt und die Präparate durch ein
Fluoreszenzmikroskop fotografiert.
Bei der Auswertung wurden auch morphologische Kriterien herangezogen. Besonders die
Abgrenzung zur Nekrose ist dabei wichtig. Eine Schädigung der DNA durch Agenzien wird
nicht identifiziert, solange sie nicht mit Apoptose einhergeht.
39
Materialen:
ApopTag Plus Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon International;
Billerica,MA, USA )
1% (m/v)Paraformaldehyd in D-PBS
D-PBS
Ethanol (70% v/v) in Essigsäure (Verhältnis 2:1) auf -20°C gekühlt
4 Objektträgerinkubationsgefäß (coplin jar)
Chamber Slides (Nunc; Naperville, IL, USA)
Wasserdampf gesättigte Kammer, 37°C
Ethidiumbromid
Ribonuklease A (AppliChem, Darmstadt)
DNAse 1 (Qiagen, Hilden)
DNBuffer (300µl 1M Tris-Base pH7,2;
80µl 0,5M MgCl2;
10µl 100mM DTT;
mit dest. H2O auf 10ml bringen)
mikroskopische Deckläser
DakoCytomation Flourescent Mounting Medium (DakoCytomation; Glostrup, Dänemark)
Fluoreszenzmikroskop Axioskop 2 Plus (Carl Zeiss MicroImaging, Jena)
2-3 Tage vor dem Versuch wurden H4 II E Zellen auf Chamber Slides mit 4 Kammern
ausplattiert. Es folgte die Inkubation in serumfreiem Medium mit anschließender
Zellstimulation über 12 Stunden. Nach vorsichtigem Absaugen des Mediums und
Abheben der aufgeklebten Kammern wurden die Zellen sofort für 10 Minuten bei
Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd im coplin jar fixiert. Anschließend wurde es 2x
für je 5 Minuten in D-PBS gewaschen. Es schloss sich eine 5 minütige Inkubation in einem
Ethanol-Essigsäure-Gemisch bei -20°C in einem weiterem coplin jar an mit einem
daraufhin folgendem erneutem Waschvorgang in D-PBS für 5 Minuten. 75µl/5cm²
Objektträgerfläche des im Kit mitgelieferten „Equilibration Buffer“ wurde direkt nach
Probenfixierung vorsichtig auf den Objektträger aufgebracht und mit einem
mitgelieferten Plastikdeckel vorsichtig bedeckt. Durch Kapillarkräfte verteilte sich der
„Equilibration Buffer“ gleichmäßig auf dem Objektträger. Die Kontaktzeit betrug 10
Sekunden. Der „Equilibration Buffer“ wurde vorsichtig vom Objektträger entfernt.
40
55µl/5cm² Objektträgerfläche des im Kit mitgelieferten „Working Strenght TdT Enzyme“
wurde nach Herstellerangaben hergestellt angesetzt, auf den Objektträger aufgebracht
und vorsichtig mit einem Plastikdeckel bedeckt. Es schloss sich eine 1 stündige
Inkubationszeit bei 37°C in einer wasserdampfgesättigten Kammer an. In dieser Zeit
werden die freien 3´OH-Enden der DNA mit Oligomeren aus Digoxigenin-Nukleotiden
konjugiert. Der Objektträger wurde daraufhin für 10 Minuten im coplin jar in „Working
Strength Stop/Wash Buffer“ inkubiert und anschließend 3x für je 1 Minute in D-PBS
gewaschen. Flüssigkeiten wurden nun vorsichtig vom Objektträger entfernt und dieser
anschließend mit 123,5µl „Working Strength Anti-Digoxigenin Conjugate“ benetzt. Ein
Plastikdeckel wurde vorsichtig auf den Objektträger aufgebracht und die Probe
anschließend für 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln in einer feuchten Kammer inkubiert. Es
folgte 4x eine 2 minütiges Waschen des Objektträgers in D-PBS.
Die Gegenfärbungslösung (10µg EtBr auf 10ml D-PBS + 10mg Ribonuklease A) wurde
aufgetragen und nach 10 Sekunden mit D-PBS gewaschen. Um die
Immunfluoreszenzfärbung samt Gegenfärbung betrachten zu können wurden 2-3 Tropfen
Dako Eindeckmedium auf den Objektträger aufgebracht und dieser anschließend mit
einem Objektträgerglas versehen. Nach Aushärten des Eindeckmediums wurde die Probe
unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 40facher Vergrößerung mit einem 490nm
Exzitationsfilter betrachtet (Filter: ex 490nm, en 520nm).
Es wurden je Versuch und Stimulationsbedingung 5 repräsentative Gesichtsfelder nach
Gesamtzellzahl, Apoptoseanzahl und Nekroseanzahl ausgezählt. Als Positivkontrolle
wurden Strangbrüche in H4 Zellen, durch 5µl DNAse1 und 90µl DNBuffer in 500µl D-PBS
mit 4,5% Glucose gelöst, erzeugt. Die Stimulationszeit betrug 12 Stunden.
3.2.9 ATP-Lite luminescence ATP Detection Assay System
ATP ist die universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie in allen metabolisch aktiven
Zellen. Es kann als Marker für Zelllebensfähigkeit herangezogen werden. Das „ATP-Lite
luminescence ATP Detection Assay System“ basiert auf einer Lichtemission, die bei der
Reaktion von D-Luciferin mit Luciferase entsteht. Diese Reaktion ist ATP-abhängig.
Luciferase + Mg2+
ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Licht
41
In zuvor stimulierten Zellen kann, nach Lyse und Inaktivierung von ATPasen, der ATP-
Gehalt gemessen werden. Durch Zugabe von D-Luciferin und Luciferase wird die oben
beschriebene Reaktion gestartet. Das dabei emittierte Licht wird luminometrisch
gemessen und ist proportional zur ATP-Konzentration im Zelllysat. Das emittierte
Lichtsignal hat eine Halbwertszeit von 5 Stunden. Zur Quantifizierung der vom
Luminometer gemessenen RLU, wird für jeden Versuch eine ATP-Standardkurve mit
definierten ATP-Mengen ermittelt. Durch zusätzliche Quantifizierung der Proteinmenge
im Zelllysat mittels BCA-Assay ist es möglich, die Stoffmenge ATP pro Stoffmenge Protein
anzugeben (nM ATP pro µg Protein). Dadurch wird es möglich einen ATP-
Konzentrationsabfall durch Nekrose und/oder Apoptose, in Zelllysaten zu ermitteln.
Materialien:
ATP-Lite luminescence ATP Detection Assay System (Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim)
Zellkultur-Testplatten 6-Well (Techno Plastic Products; Trasadingen, Schweiz)
Luminometer Berthold MiniLuminat LB 9605 (Berthold Technologies, Bad Wildbad)
3,5ml Reaktionsgefäße 55x12mm (Sarstedt, Nümbrecht)
1,5ml Reaktionsgefäße
D-PBS
Vor dem Versuch wurden H4 II E Zellen auf 6-Wells ausplattiert. Bei konfluentem
Wachstum wurden die Zellen für 12 Stunden mit Metformin, Insulin oder der
Positivkontrolle stimuliert. Nach Stimualtionsende wurden die Zellen mit gekühltem D-
PBS 3x gespült. Anschließend wurden 200µl mitgelieferter Lysepuffer in jedes Well
gegeben und diese dann 5 Minuten auf einen Schüttler gestellt. Der Lysepuffer inaktiviert
durch Anheben des pH-Wertes ATPasen irreversibel. Jedem Well wurden anschließend
400µl D-PBS zugegeben und solange vermischt bis sich eine homogene, pipettierbare
Lösung bildete. 100µl dieser Lösung wurde in 1,5ml Reaktionsgefäße überführt und mit
50µl vorschriftsmäßig angesetzter „Substrate Solution“ versetzt. In diesem Schritt wird D-
Luciferin und Luciferase dem Lysat zugesetzt. Es schloß sich eine 5 minütige
Inkubationszeit in einem Schüttler an. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 10
Minuten abgedunkelt. Für die anschließende Messung wurden 30µl des Lysates in die
Meßgefäße des Luminometers überführt und die Lichtemission gemessen.
42
Die ATP-Standardkurve wurde gemäß Herstellerangaben mit Konzentrationen von 0M;
10-9M; 10-8M; 10-7M; 10-6M und 10-5M ATP in H2O ermittelt. Auch hier wurden Volumina
von 30µl zur Messung verwendet.
3.3 Molekularbiologische Arbeitstechniken
3.3.1 Gesamt-RNA-Extraktion
Um die Gesamt-RNA einer Zellpopulation zu erhalten, wurde der RNeasy Mini Kit der
Firma Qiagen verwendet. Nach Isolation der RNA wurde diese photometrisch bei 260nm
quantifiziert und mittels einer Agarose-Gelelektrophorese auf Intaktheit überprüft. Es
folgten cDNA Synthese, PCR und real-time PCR.
Materialien:
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden)
QIAshredder (Qiagen, Hilden)
ß-Mercaptoethanol
100% Ethanol
70% Ethanol
sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und 1,5 ml Reaktionsgefäße
Vor Beginn der RNA-Isolation wurden Puffer gemäß Herstellerangaben angesetzt. Den
benötigten Aliquots „Buffer RLT“ wurden 10µl ß-Mercaptoethanol je ml Buffer RLT
zugesetzt. Dem „Buffer RPE“ wurde vor Gebrauch das vierfache Volumen an 100%
Ethanol zugegeben.
H4IIE Zellen wurden in 6-Wells ausplattiert und für 4 Stunden mit Agenzien stimuliert.
Nach Stimulationsende wurden sie 3x mit gekühltem D-PBS gespült. 350µl „Buffer RLT“
wurden je Well zur Lyse hinzugegeben. Das Lysat wurde mit einem Zellschaber vom
Boden der Wells abgekratzt und in QIAshredder zur Verminderung der Viskosität
überführt. Die Lysate wurden für 2 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert.
43
Anschließend wurde die „spin column“ verworfen und mit dem homogenisierten Lysat im
Auffangröhrchen weitergearbeitet. Der Menge Lysat wurde das gleiche Volumen 70%
Ethanol zugegeben und gut vermischt, nicht gevortext. Möglichst viel Lysat, jedoch nicht
mehr als 700µl, wurden nun in „RNeasy spin column“ überführt. Für 15 Sekunden wurden
diese bei 9000 x g zentrifugiert. Der Säulendurchlauf wurde verworfen. Die „spin column“
wurde mit 700µl „Buffer RW1“ gewaschen und für 15 Sekunden bei 9000 x g zentrifugiert.
Der Säulendurchlauf wurde verworfen. 500µl „Buffer RPE“ wurden daraufhin in die „spin
column“ gegeben und für 15 Sekunden bei 9000 x g zentrifugiert. Der Durchlauf wurde
ebenfalls verworfen und der Vorgang wiederholt, diesmal wurde 2 min. zentrifugiert, um
die „spin column“-Reste von Ethanol zuverlässig zu entfernen. Das Auffangröhrchen
wurde durch ein frisches ersetzt und die „spin column“ noch einmal für 1 Minute bei
Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Auch dieses Auffangröhrchen wurde verworfen. Die
„spin column“ wurde anschließend in mitgelieferte RNAse/DNAse freie 1,5ml
Reaktionsgefäße gestellt. 40µl RNAse freies Wasser wurde direkt auf die Membran der
„spin column“ pipettiert, ohne die Membran mit der Pipettenspitze zu berühren. Es
wurde abschließend für 1 Minute bei 9000 x g zentrifugiert. Die aufgereinigte, isolierte
RNA befand sich nun im 1,5ml Reaktionsgefäß, die „spin column“ wurde verworfen und
die RNA bei 260nm photometrisch quantifiziert.Die RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.
3.3.2 Photometrische RNA-Quantifizierung
Die mit dem RNeasy Mini Kit extrahierte Gesamt-RNA wurde photometrisch quantifiziert.
Materialien:
UV-geeignete Küvetten aus Polymethylmethacrylat (Roth, Karlsruhe)
RNAse freies Wasser
Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen
RNA
Spektrophotometer, Eppendorf BioPhotometer 6131
Zuerst wurde der Nullpunkt des Spektrophotometers mit 50µl RNAse freiem Wasser
gesetzt. Anschließend wurde 1µl RNA mit 49µl RNAse freiem Wasser verdünnt und bei
260nm gemessen. Die Abgelesen Konzentration wurde um den Verdünnungsfaktor
44
korrigiert. Zusätzlich wurden die Extinktionen für die Wellenlängen bei 230nm, 280nm,
320nm ausgemessen.
230nm: spiegelt Verunreinigungen mit z.B. Kohlenhydraten, Peptiden, Phenolen oder
aromatischen Verbindungen wider.
260nm: misst RNA, DNA und Oligonukleotide
280nm: misst Proteine
320nm: misst die Trübung der Lösung und andere Störfaktoren
Über die Extinktionen dieser Wellenlängen kann die Reinheit der RNA beurteilt werden.
Der Quotient aus Extinktion bei 260nm und 280nm (260/280) sollte für reine RNA ≥ 1,6
betragen. Proben mit einem Quotienten ≥ 1,6 wurden weiterverwendet.
3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelektrophorese ist eine Methode, um DNA und RNA ihrer Größe nach
aufzutrennen. Die negativ geladenen Nukleinsäurestränge wandern dabei von der
Kathode (-) in Richtung Anode (+). Kleine Stränge laufen dabei schneller als große Stränge
und werden mit Hilfe eines Basenstandards in ihrer Länge klassifiziert. Die Nukleinsäuren
wurden durch Zugabe von Ethidiumbromid auf einem UV-Leuchttisch über die
Fluoreszenz der Komplexe aus Nukleinsäure und Ethidiumbromid nachgewiesen.
In der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode benutzt, um die Intaktheit von
extrahierter RNA zu kontrollieren und um erhaltene PCR-Produkte darzustellen.
Materialien:
SeaKem LE Agarose (Cambrex; Rockland, ME, USA)
TAE (80mM Tris, 2mM EDTA, 40mM Essigsäure in H2O)
Ethidiumbromid
Gel-loading-Buffer (0,25% w/v Bromphenolblau,
0,25% w/v Xylene cyanole FF,
15% Glycerin in TAE)
DNA/RNA
DNAse/RNAse freies Wasser
Größenstandard GeneRuler 1kB DNA Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot)
45
1g Agarose wurde in einer Endkonzentration von 1% (m/v) in TAE in einem
Erlenmeyerkolben suspendiert und aufgekocht bis eine klare Lösung entstand.
Anschließend wurden der Lösung 5µg EtBr zugegeben. Nach kurzem Abkühlen wurde die
Lösung in einen Gelträger gegossen und ein Plexiglas-Ladekamm eingesteckt. Das Gel
härtete bei Raumtemperatur aus. Anschließend wurde der Kamm entfernt und die
Proben aufgetragen. Die Proben enthielten 5µl Gel-loading-Buffer, 5µl DNAse/RNAse
freies Wasser und 5µl der zu untersuchenden Probe. Die angefärbten DNA/RNA Banden
wurden mit UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert.
Intakte, reine Gesamt-RNA weist scharfe 28S und 18S rRNA Banden im Verhältnis 2:1 auf.
G6Pase Produkte wurden bei 804 bp nachgewiesen. ß-Actin Produkte wurden bei 738 bp
nachgewiesen.
3.3.4 cDNA – Synthese
Mit dem „High Capacity cDNA reverse transkriptase kit“ wurde aus zuvor hergestellter
RNA die dazu komplementäre cDNA synthetisiert. Eine dazu verwendete RNA-abhängige
DNA-Polymerase verwendet Random Hexamer Primer und Desoxynukleosidtriphosphate
(dNTP) um die gesamte RNA in cDNA zu transkribieren. Mit der dadurch erhaltenen cDNA
wurden anschließend PCR und real-time PCR durchgeführt.
Materialien:
High Capacity cDNA reverse transkriptase kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
RNA aus H4IIE Zellen
Thermocycler (Eppendorf Mastercycler Gradient)
Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße
Es wurden je Probe 5µl RNA mit 5µl RNAse freiem Wasser vermischt und mit 10µl Master
Mix zur cDNA-Synthese verwendet. Der Master Mix setzte sich folgendermaßen
zusammen:
2µl 10x RT Buffer;
0,8µl 25x dNTP Mix;
46
2µl 10x RT Random Hexamer Primer;
4,2µl Nuclease freiem H2O;
1µl Reverse Transkriptase (50 Units/µl)
Master Mix, RNA und Wasser wurden gut vermischt und im Thermocycler zur Reaktion
gebracht.
Das Programm umfasste:
Schritt 1: 25°C 10 min.
Schritt 2: 37°C 120 min.
Schritt 3: 85°C 5 sec.
Schritt 4: 4°C hold
Die cDNA wurde bei -20°C aufbewahrt.
3.3.5 PCR von Glucose-6-Phosphatase und β-Actin
PCR steht für „Polymerase Chain Reaction“. Es handelt sich dabei um eine Methode, mit
der eine Vervielfältigung und der Nachweis von spezifischer cDNA durch die Verwendung
spezifischer Primer möglich ist. In einem Thermocycler werden dabei in einem ersten
Schritt die DNA-Stränge denaturiert. Im sich anschließenden 2. Schritt kommt es zur
Primerhybridisierung mit anschließender Elongation im 3. Schritt. Diese 3 Schritte werden
20-30 mal wiederholt, wodurch eine exponentielle Vervielfältigung der, durch die
spezifischen Primer festgelegten, DNA-Sequenzen erfolgt.
Vor Verwendung neuer spezifischer Primer wurde in der vorliegenden Arbeit immer eine
Gradienten-PCR an vorangestellt, bei der die Annealing-Temperatur variiert, um die
optimale Annealing–Temperatur für die Primer zu ermitteln und somit das PCR Verfahren
zu etablieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Technik der PCR mit anschließender Agarose-
Gelelektrophorese lediglich zur Kontrolle der synthetisierten cDNA verwendet. Eine
47
Quantifizierung von cDNA-Sequenzen wurde nicht durch PCR, sondern mittles real-time
PCR vorgenommen.
Materialien:
Thermocycler
Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße
2mM dNTP Mix
Reverse/ forward Primer für:
G6Pase (forward: 5´-TGGAGACTGGTTCAACCTCG-3´;
reverse: 5´-ACGGTCGCACTCTTGCAGAA-3´ )
ß-Actin (forward: 5´-GATATCGCTGCGCTGGTCCGT-3´;
reverse: 5´-CGGAACCGCTCGTTGCCAAT-3´)
Wasser für die Molekularbiologie
10x Reaction Buffer
mi-Taq Polymerase
Die von der Firma Metabion (Martinsried) gelieferten Primer wurden aus ihrer
Ausgangskonzentration von 100pmol/µl heraus, 1:10 verdünnt. Anschließend wurde ein
Master Mix hergestellt, bestehend aus:
10% (v/v) 10x mi-Taq Reaction Buffer;
10% (v/v) 2mM dNTP Mix;
1% (v/v) forward Primer;
1% (v/v) reverse Primer;
74,8% (v/v) Wasser für die Molekularbiologie und
2% (v/v) mi-Taq Polymerase (5 Units/µl) je Probe hergestellt.
2% (v/v) des zu untersuchenden Templates (cDNA) wurde dem Master Mix zu einem
Gesamtvolumen von 25µl zugesetzt.
Die ermittelte optimale annealing-Temperatur lag bei 57°C.
48
Die PCR lief nach folgendem Programm ab:
Schritt 1: 94°C 2 min.
Schritt 2: 94°C 15 sec.
Schritt 3: 57°C 30 sec.
Schritt 4: 72°C 30 sec.
Schritt 5: GOTO 2 REP 35
Schritt 6: 4°C hold
Die PCR-Produkte wurden anschließend mit einem 1% Agarosegel analysiert.
3.3.6 Real time quantitative PCR
Eine real-time PCR basiert auf der Technik der herkömmlichen PCR, allerdings bietet sie
zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung. Hierbei ist es möglich, in jedem Zyklus die
synthetisierte Menge des Zielgens zu untersuchen, daher real time. Die entstehenden
Daten werden während der real-time PCR gewonnen und nicht, wie bei der
herkömmlichen PCR, erst nach Ablauf der Reaktion. Nach jedem Zyklus der real-time PCR
wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt.
Die Fluoreszenz entsteht durch Ausnutzung des FRET (fluorescence resonance energy
transfer). Die TaqMan Gene Expression Assay Primer besitzen am 5´- Ende einen
Fluorochrom-Donor, den Reporter. Am 3´-Ende ist ein Fluorochrom Akzeptor, der
Quencher. Der Quencher reduziert die Fluoreszenz des Reporters. Ist der Abstand von
Reporter zum Quencher klein, ist der FRET groß und die gemessene Fluoreszenz gering.
Ist der Abstand von Reporter zum Qunecher hingegen groß, ist der FRET klein und die
emittierte Fluoreszenz des Reporters groß. Während der PCR lagern sich die Primer an die
zu untersuchenden cDNA an. Im weiterem Verlauf wird das 5´-Ende des Primers von der
5´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgespalten. Dadurch werden Reporter und
Quencher getrennt. Die emittierte Fluoreszenz des Reporters erhöht sich und ist damit
proportional zur Menge des PCR Produkts.
49
Als Ergebnis liefert die Anwendungssoftware des Geräts den Ct-Wert (threshold cycle).
Der Ct-Wert beschreibt den Zyklus während der PCR, in dem die gemessene Fluoreszenz
zum ersten Mal signifikant über der gemessenen Fluoreszenz der „No template control“
liegt. In den darauffolgenden Zyklen der real-time PCR ist mit einem exponentiellem
Anstieg der Fluoreszenz für amplifizierte Gene zu rechnen.
Zur relativen Quantifizierung wird ein ubiquitär exprimiertes Protein, in der vorliegenden
Arbeit ß-Actin, als Referenz-cDNA herangezogen. Das Zielgen, in der vorliegenden Arbeit
G6Pase, wird in Relation zum ubiquitär exprimierten ß-Actin gesetzt. Über die Ct-
Vergleichsrechnung („Comparative Ct Method“; ∆∆Ct) lässt sich der relative
Expressionsunterschied einer Probe zwischen der Behandlung und der Kontrolle,
normalisiert zum Referenzgen berechnen. Mit der arithmetrischen Formel, f(x)=2 -∆∆CT,
werden Ziel- und Referenzgen in ein relatives Verhältnis gesetzt, dem Ratio. Dazu wird
erst der ∆Ct-Wert aus der Differenz von Ct-Wert des Zielgens und Ct-Wert des
Referenzgens berechnet (∆Ct=Ct Zielgen – Ct Referenzgen). Anschließend wird der ∆∆Ct-
Wert berechnet. Hierbei wird vom ∆Ct-Wert der zu untersuchenden Probe, der ∆Ct-Wert
der unbehandelten Kontrollprobe subtrahiert. (∆∆Ct=∆Ct Probe - ∆Ct Kontrolle)
Abschließend errechnet man mit 2-∆∆Ct der zu untersuchenden Probe den relativen
Expressionsunterschied zwischen zu untersuchender Probe und der unbehandelten
Kontrolle aus; den Ratio [44].
Materialien:
TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542)
TaqMan® Gene Expression Assay Primer:
glucose-6-phosphatase, catalytic (Applied Biosystems, Rn00565347_m1)
actin, beta (Applied Biosystems, Rn01412977_g1)
cDNA
RNAse/DNAse freies Wasser
MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, N8010560)
Sterile, RNAse/DNAse freie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße
MicroAmp™ Optical Film Compression Pad (Applied Biosystems, 4312639)
Real-time Cycler (ABI PRISM® 7700 Sequence Detector, Applied Biosystems)
50
Anwendungssoftware (7700 Sequence Detection System, version 1.6 software)
Für jede Probe wurde 3 mal der Ct-Wert für Glucose-6-Phosphatase und ß-Actin
bestimmt. Zuvor hergestellte 20µl cDNA wurden mit 40µl Wasser für die
Molekularbiologie verdünnt. Anschließend wurde der TaqMan® Gene Expression Assay
Master Mix aus 12,5µl Mastermix und 1,25µl Gene Expression Assay Primer je Probe
hergestellt. Zu den 13,75µl TaqMan® Gene Expression Assay Master Mix wurden 11,25µl
der zu untersuchenden cDNA hinzugegeben. Die entstandenen 25µl wurden in ein
MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate gegeben, mit einer Folie versiegelt und mit
einem MicroAmp™ Optical Film Compression Pad bedeckt. Als „No template control“
wurde ein Well mit 13,75µl TaqMan® Gene Expression Assay Master Mix und 11,25µl H2O
beladen.
Die real-time PCR lief nach folgendem Programm:
Schritt 1: 50˚C 2 min.
Schritt 2: 95˚C 10 min.
Schritt 3: 95˚C 15 sec.
Schritt 4: 60˚C 1 min.
Schritt 5: GOTO 3 REP 40
Schritt 6: 4°C hold
51
3.4 Statistische Auswertung
Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SigmaStat 3.5 (Fa. Systat Software,
Inc.) verwendet. Zu allen Daten wurden bei der deskriptiven Statistik Mittelwert
(arithmetisches Mittel), Standardabweichung, Standardfehler, Standardfehler des
Mittelwerts (SEM; Streuung der Mittelwerte des Messwertumfangs n) und
Konfidenzintervall des Mittelwerts berechnet. Der SEM wurde in Diagrammen als
Fehlerindikator angegeben. Zur Ermittlung signifikanter Unterschiede wurde eine one
way analysis of variance (ANOVA) durchgeführt. Hiermit wird die Gesamtvarianz aller
unterschiedlichen Messbedingungen auf einen statistisch signifikanten Unterschied
untersucht. Bei einem statistisch signifikanten Unterschied, gibt eine ANOVA keine
Informationen darüber, welche unterschiedlichen Messbedingungen sich signifikant
unterscheiden. Hierzu schließt sich die Dunn´s Methode oder die Holm-Sidak Methode als
Vergleichstechnik an. Für hierdurch errechnete p-Werte wurde als maximale
Irrtumswahrscheinlichkeit ein Signifikanzniveau von α=0,05 festgelegt. p-Werte von ≤0,05
werden gemeinhin statistisch signifikant zum Niveau α angesehen.
52
4 Ergebnisse
4.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase
4.1.1 Regulation der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in
Abhängigkeit von Insulin
Zunächst sollte untersucht werden, ob Insulin die Promotoraktivität der G6Pase im
Zellmodell senkt. Weiterhin musste eine optimale Konzentration von Insulin für die
anschließenden Zellversuche ermittelt werden. Nach 12-stündiger Inkubation mit Insulin
wurde in H4 M1.3 Zellen die Luciferaseaktivität gemessen. Sie steht in linearer
Abhängigkeit zur G6Pase-Promotoraktivität. Die Insulinkonzentrationen betrugen 10-6M,
10-7M, 10-8M, 10-9M und 10-10M. Eine Probe blieb zur Kontrolle unbehandelt.
Abb. 4: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener Insulinkonzentrationen. H4 M1.3 Zellen wurden 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von Insulin inkubiert. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 6 unabhängigen, jeweils mindestens in Triplikaten durchgeführten Experimenten. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik zeigten für alle Werte einen statistisch signifikanten Unterschied zur unbehandelten 0M-Insulinprobe (p<0,05).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0M 10(-10)M 10(-9)M 10(-8)M 10(-7)M 10(-6)M
Luci
fera
seak
tivi
tät
(% d
er
bas
ale
n A
ktiv
ität
)
Insulinkonzentration
53
Die luminometrisch ermittelten RLU-Werte (relative light units) wurden auf die Menge an
Protein im Zelllysat normiert. Die Proteinbestimmung wurde mittels BCA-Test
vorgenommen. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den
unbehandelten Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Die
Messung wurde 6-mal mindestens im Triplikat durchgeführt.
Dosisabhängig wurde eine Abnahme der Luciferaseaktivität und damit der G6Pase-
Promotoraktivität festgestellt. Statistisch signifikante Änderungen traten bereits bei
10-10M auf (p<0,01). Die Luciferaseaktivität nahm von 0M (100 %) über 10-10M (65,8 %),
10-9M (54,5 %), 10-8M (44,9 %), 10-7M (35,8 %) Insulin stetig bis auf 32,9 % bei einer
Insulin-Konzentration von 10-6M ab. Die maximal ermittelte Hemmung beträgt damit 67,1
% bezogen auf die unbehandelte Probe.
Die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität wird konzentrationsabhängig durch Insulin
gesenkt.
4.1.2 Regulation der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in
Abhängigkeit von Metformin
Es wurde daraufhin untersucht, ob Metformin einen vergleichbaren hemmenden Effekt
auf die G6Pase-Promotoraktivität hat wie Insulin. Zusätzlich sollte für diesen Fall eine
optimale Konzentration von Metformin für sich anschließende Zellversuche ermittelt
werden. Unter identischen Versuchsbedingungen wie zur Ermittlung der Regulation der
G6Pase-Promotoraktivität durch Insulin wurden H4 M1.3 Zellen in unterschiedlich
konzentrierte Metforminlösungen inkubiert. Die Konzentrationen für Metformin betrugen
dabei 0,1mM, 0,5mM, 1mM und 2mM. Eine Probe blieb zur Kontrolle unbehandelt. Die
luminometrisch ermittelten RLU wurden auf die Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-
Test normiert. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den
unbehandelten Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Die
Messung wurde 9-mal mindestens im Triplikat durchgeführt.
54
Vergleichbar mit dem Effekt von Insulin zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der
G6Pase-Promotoraktivität mit zunehmender Metforminkonzentration. Statistisch
signifikante Unterschiede konnten ab einer Konzentration von 0,5mM Metformin
(p<0,01) und höher ermittelt werden. Die Luciferaseaktivität nahm von 0mM (100 %) über
0,1mM (98,4 %), 0,5mM (76,7 %) und 1mM (59,4 %) Metformin kontinuierlich bis auf 47,1
% bei einer Metforminkonzentration von 2mM ab. Die maximal ermittelte Hemmung
beträgt damit 52,9 % bezogen auf die unbehandelte Probe.
Die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität lässt sich konzentrationsabhängig durch
Metformin senken.
Abb. 5: Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit verschiedener Metforminkonzentrationen. H4 M1.3 Zellen wurden 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen Metformin inkubiert. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 9 unabhängigen, jeweils mindestens in Triplikaten durchgeführten Experimenten. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik zeigten für Werte ab einer Metforminkonzentration von 0,5mM einen statistisch signifikanten Unterschied zur unbehandelten 0mM-Metforminprobe (p<0,05).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0mM 0,1mM 0,5mM 1mM 2mM
Luci
fera
seak
tivi
tät
(% d
er
bas
ale
n A
ktiv
ität
)
Metforminkonzentration
55
4.1.3 Effekte von Insulin und Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase
mRNA
Zur Bestätigung des hemmenden Effekts von Insulin und Metformin auf die G6Pase-
Promotoraktivität wurde mittels real-time PCR die mRNA-Menge der G6Pase in H4 II E
Zellen bestimmt. Eine 4-stündige Inkubation in 2mM Metformin bzw. 10-6M Insulin bzw.
serumfreiem Medium zur Kontrolle sowie Gesamt-RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
gingen der real-time PCR voraus. Die Daten stammen aus 4 unabhängigen Zellversuchen
je Versuchsbedingung. Zu jeder Probe wurde der Ct-Wert dreifach bestimmt. Die
Auswertung mittels real-time PCR erfolgte parallel in einer Analyse. Über die Ct-
Vergleichsrechnung („Comparative Ct Method“; ∆∆Ct) wurde der relative
Expressionsunterschied zwischen behandelten und unbehandelten Proben, normalisiert
zum Referenzgen (ß-Actin), berechnet. Mittels ANOVA und anschließender Holm-Sidak-
Vergleichstechnik wurden die Relationen statistisch auf Unterschiede untersucht.
Die ermittelten Relationen zeigen, dass der G6Pase-mRNA-Gehalt in H4 II E Zellen sowohl
nach Insulin- als auch nach Metformin-Inkubation signifikant abfällt. Nach Insulin-
Inkubation wurde ein 0,17-facher G6Pase-mRNA-Gehalt im Vergleich zur Kontrollprobe
ermittelt (p<0,01). Nach Metformininkubation wurde ein 0,73-facher G6Pase-mRNA-
Gehalt im Vergleich zur Kontrollprobe ermittelt (p=0,03). Auch der Unterschied des
Abb. 6: Glukose-6-Phosphatase mRNA quantifiziert mittels real-time PCR. H4 II E Zellen wurden für 4 Stunden in 10
-6M Insulin bzw. 2mM Metformin inkubiert. Anschließend wurde mittels real-time PCR und ∆∆Ct-Methode
der G6Pase-mRNA-Gehalt auf ß-Actin normiert und als Vielfaches der Kontrollprobe ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen Zellversuchen. Zu jeder Probe wurde der Ct-Wert dreifach bestimmt. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrolle (p<0,05)
Statistisch signifikanter Unterschied zur Metforminprobe (p<0,05)
56
G6Pase-mRNA-Gehalts zwischen mit Insulin und Metformin behandelten Zellen ist
signifikant (p<0,01).
Die Glukose-6-Phosphatase-Expression wird durch Insulin und Metformin gesenkt. Insulin
senkt die Glukose-6-Phosphatase-Expression stärker als Metformin.
4.1.4 Regulation gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität
in Abhängigkeit von Metformin und Insulin
Um den Effekt von Insulin und Metformin auf die G6Pase unter Bedingungen einer
Insulinresistenz mit gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes
vorkommt, zu untersuchen, wurden H4 M1.3 Zellen mit 500nM Dexamethason (DXM)
und 500µM Dibutyryladenosin-Monophosphat-Natriumsalz (dBcAMP) einstündig
präinkubiert. Glukokortikoide binden an glucocorticoid response elements des G6Pase-
Promotors, während cAMP an cis-acting sequences des G6Pase-Promotors interagieren.
Beide Mechanismen erhöhen die Expression der Glukose-6-Phosphatase [55].
Anschließend wurden die Zellen zusätzlich in 10-6M Insulin bzw. in verschiedenen
Konzentrationen Metformin (0,1mM, 0,5mM, 1mM, 2mM) für 12 Stunden inkubiert. Eine
Probe wurde nur mit DXM und dBcAMP behandelt. Eine weitere Probe wurde nicht
behandelt und als Kontrolle verwendet.
Mit der bereits oben beschriebenen luminometrisch ermittelten Luciferaseaktivität wurde
die G6Pase-Promotoraktivität bestimmt. Dadurch entstandene absolute Werte wurden in
Relation zu den Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurden. Der
Versuch wurde dreimal im Quadruplikat durchgeführt.
57
Dabei wurde festgestellt, dass die alleinige Inkubation mit DXM und dBcAMP die G6Pase-
Promotoraktivtät auf das ca. 11-Fache der Kontrolle steigerte (100 % auf 1189,4 %). Die
erhöhte Promotoraktivität konnte mit Metformin dosisabhängig gesenkt werden. Für
Metforminkonzentrationen von 0,1mM, 0,5mM und 1mM wurden Promotoraktivitäten
von 732,9 %, 640,6 % und 217,4 % ermittelt. Diese Unterschiede waren nicht signifikant
zur Versuchsbedingung mit alleiniger DXM- und dBcAMP-Inkubation. Eine signifikante
Reduktion der G6Pase-Promotoraktivität konnte bei 2mM Metformin (Promotoraktivität
76,1 %) ermittelt werden (p<0,05). Es kommt zu einer 93,6%igen Hemmung der durch
DXM und dBcAMP erhöhten G6Pase-Promotoraktivität. 10-6M Insulin senkten die G6Pase-
Promotoraktivität auf 71,9 %. Es kommt zu einer 93,9%igen Hemmung der durch DXM
und dBcAMP erhöhten G6Pase-Promotoraktivität (p<0,05). Es besteht kein signifikanter
Abb. 7: Gesteigerte Promotoraktivität der Glukose-6-Phosphatase in Abhängigkeit von unterschiedlichen Konzentrationen Metformin und 10
-6M Insulin. Durch einstündige Präinkubation von H4 M1.3 Zellen in 500nM
DXM und 500µM dBcAMP wurde eine gesteigerte G6Pase-Promotoraktivität erzeugt. Anschließend wurden die Zellen 12 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen Metformin oder 10
-6M Insulin inkubiert. Gemessen wurde
die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen im Quadruplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger DXM- und dBcAMP-
Inkubation.
58
Unterschied in der G6Pase-Promotoraktivität bei Verwendung maximaler
Konzentrationen Insulin und Metformin (p=0,933).
DXM und dBcAMP erzeugen eine Insulinresistenz mit erhöhter G6Pase-Promotoraktivität,
wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt. Sie lässt sich durch Insulin und Metformin
senken. Dabei ist bei angehobener G6Pase-Promotoraktivität der hemmende Effekt von
Metformin relativ zum Ausgangswert bei nicht gesteigerter G6Pase deutlich stärker und
gleicht nun dem des Insulin.
4.1.5 Effekte der AMPK auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin, Metformin und
AICAR
Es sollte untersucht werden, welchen Effekt AMPK auf die G6Pase-Promotoraktivität in
H4 M1.3 Zellen hat und wie dieser durch Insulin, Metformin und AICAR beeinflusst wird.
Hierzu wurde der spezifische AMPK-Inhibitor Compound C verwendet. Compound C
wurde in einer Konzentration von 40µM 30 Minuten vor der 12-stündigen Inkubation mit
10-6M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR (AMPK-Aktivator) präinkubiert.
Vergleichend blieb eine gleiche Anzahl Proben ohne Compound-C-Präinkubation. Eine
weitere Probe wurde nicht behandelt und als Kontrolle verwendet. Die luminometrisch
ermittelten RLU wurden auf die Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-Test normiert.
Dadurch entstandene absolute Werte wurden in Relation zu den unbehandelten
Kontrollproben gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Der Versuch wurde
dreimal im Triplikat durchgeführt.
59
Insulin und Metformin zeigten die bereits beschriebene Reduktion der G6Pase-
Promotoraktivität. 1mM AICAR reduzierte die basale Promotoraktivität signifikant
(p<0,05) auf 48,5 %. Es zeigte sich eine partielle Aufhebung des Effekts von Insulin und
Metformin auf die G6Pase-Promotoraktivität durch Compound C. Dabei wurde die
Promotoraktivität nach Insulininkubation von 12,8 % durch Compound C auf 47,7 %
erhöht (p<0,01). Vergleichbares wurde für Metformin ermittelt. Hier wurde die
Promotoraktivität nach Metformininkubation von 14,4 % durch Compound C auf 41,8 %
erhöht (p<0,01). Der Effekt von 1mM AICAR konnte durch Compound C komplett
aufgehoben werden (48,5 % auf 112,3 %; p<0,05). Der Unterschied in der
Promotoraktivität zwischen Kontrollprobe (100 %) und der AICAR+Compound-C-Probe
war nicht signifikant (p=0,62).
Abb. 8: Effekt von Compound C (40µM) auf die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10
-6M), Metformin (2mM) oder AICAR (1mM). Compound C wurde 30 min. vor
12-stündiger Inkubation mit 10-6
M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR präinkubiert. Vergleichend blieb eine gleiche Anzahl Proben ohne Compound-C-Präinkubation. Gemessen wurde die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors normiert auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen im Triplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger Insulin-Inkubation.
Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger Metformin-Inkubation.
Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu Versuchsbedingung mit alleiniger AICAR-Inkubation.
60
AMPK ist an der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität beteiligt. Ihr hemmender
Einfluss trägt sowohl bei Insulin- als auch bei Metformin-inkubierten Zellen teilweise zur
Reduktion der Promotoraktivität bei. Die Wirkung von AICAR auf die G6Pase-
Promotoraktivität wird primär durch AMPK vermittelt.
4.1.6 Effekte der AMPK auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin, Metformin und
AICAR
Um den Effekt der AMPK unter Bedingungen einer Insulinresistenz mit gesteigerter
G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, auf die
Promotoraktivität der G6Pase zu untersuchen und deren Beeinflussbarkeit durch Insulin,
Metformin und AICAR zu ermitteln, wurden H4 M1.3 Zellen mit 500nM DXM und 500µM
dBcAMP einstündig präinkubiert. Anschließend wurden die Zellen zur Hemmung der
AMPK 30-minütig in 40µM Compound C präinkubiert. Daraufhin wurden die Zellen
zusätzlich 12 Stunden in 10-6M Insulin bzw. 2mM Metformin bzw. 1mM AICAR inkubiert.
Vergleichend blieben eine gleiche Anzahl Probenansätze ohne Präinkubation mit
Compound C, jedoch vorbehandelt mit DXM und dBcAMP. Eine Probe wurde lediglich mit
DXM und dBcAMP behandelt. Die luminometrisch ermittelten RLU wurden auf die
Proteinmenge im Zelllysat mittels BCA-Test normiert. Dadurch entstandene absolute
Werte wurden in Relation zu den einzig mit DXM und dBcAMP behandelten Proben
gesetzt, wobei diese mit 100 % angegeben wurde. Der Versuch wurde viermal im Triplikat
durchgeführt.
61
Metformin und Insulin bewirkten die bereits beobachtete Reduktion der G6Pase-
Promotoraktivität. Auch AICAR reduzierte die Promotoraktivität signifikant von 100 % auf
46,4 % (p<0,05). Compound C hob die Effekte von Insulin und Metformin partiell auf. Die
Promotoraktivität nach Insulininkubation (3,4 %) wurde durch Compound C signifikant auf
9,2 % erhöht (p<0,01). Die Promotoraktivität nach Metformininkubation (9,7 %) wurde
durch Compound C signifikant auf 56,1 % erhöht (p<0,01). Die Promotoraktivität nach
AICAR-Inkubation (46,4 %) wurde durch Compound C komplett aufgehoben und auf 141
% erhöht (p<0,01). Der ermittelte Unterschied zwischen den Proben DXM+dBcAMP (100
%) und DXM+dBcAMP+ 40µM Compound C +1mM AICAR (141 %) ist statistisch signifikant
(p=0,026).
AMPK ist auch an der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität unter Insulinresistenz mit
erhöhter G6Pase-Promotoraktivität beteiligt. Metformin vermittelt über AMPK einen Teil
Abb. 9: Effekt von Compound C (40µM) auf gesteigerte Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Insulin (10
-6M), Metformin (2mM) oder AICAR (1mM). H4 M1.3 Zellen wurden eine Stunde in
500nM DXM und 500µM dBcAMP präinkubiert. Anschließend wurde eine 12-stündige Inkubation in Insulin bzw. Metformin bzw. AICAR mit und ohne 30-minütige Präinkubation in 40µM Compound C durchgeführt. Gemessen wurde anschließend die Luciferaseaktivität des G6Pase-Promotors bezogen auf die Proteinmenge. Die basale Promotoraktivität wurde mit 100 % gleichgesetzt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen in Triplikat durchgeführten Zellversuchen. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt.
*, , Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu entsprechender Versuchsbedingung ohne Compound-C-Inkubation
62
der Hemmung der G6Pase-Promotoraktivität. Compound C ist unter diesen Bedingungen
deutlich weniger effektiv, den Insulineffekt auf die G6Pase-Promotoraktivität zu
antagonisieren als den Metformineffekt. Insulineffekte scheinen bei erhöhter G6Pase-
Promotoraktivität nahezu unabhängig von AMPK vermittelt zu werden. AICAR wirkt auch
unter gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität primär über AMPK.
4.2 Beeinflussung der Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK
durch Insulin, Metformin, AICAR und Compound C
Um zu überprüfen, ob Insulin (10-6M), Metformin (2mM) und AICAR (1mM) Einfluss auf
die Threonin-Phosphorylierung 172 an AMPK haben, die diese aktiviert, wurde dieses
Signal im ELISA und Western Blot gemessen. Zu jedem Probenansatz wurde auch ein
entsprechender Versuchsansatz mit einer 30-minütigen Compound-C-Präinkubation
(40µM) durchgeführt. Für den Western Blot wurden H4 II E Zellen 12-stündig inkubiert.
Dem AMPK Phospho-Threonin 172 Blot schloss sich ein AMPK-Total Western Blot an, um
sicherzustellen, dass alle Spuren AMPK besitzen und entsprechende Resultate nicht durch
fehlende Proteine hervorgerufen wurden. Für den ELISA wurden H4 II E Zellen 30-minütig
inkubiert. Dem AMPK Phospho-Threonin 172 ELISA schloss sich ein BCA-Test zur
Ermittlung des Proteingehalts im Zelllysat an. Die gemessene Threonin-Phosphorylierung
wurde auf die Proteinmenge normiert und auf U/ng quantifiziert. Je eine Probe blieb bei
beiden Verfahren unbehandelt. Die Daten des ELISA stammen aus 3 unabhängigen
Zellversuchen je Versuchsbedingung.
Abb. 10: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK Threonin 172 (Western Blot). H4 II E Zellen wurden mit und ohne 30-minütiger Präinkubation in 40µM Compound C durch 10
-6M Insulin bzw.
2mM Metformin bzw. 1mM AICAR 12-stündig stimuliert. Mittels Western Blot wurde spezifisch Phospho AMPK Threonin 172 und Total AMPK nachgewiesen. 100µg Protein wurden in jede Spur des Western Blot aufgetragen.
63
Im Western Blot zeigten sich stärkere Signale für AMPK Thr 172 nach Inkubation in AICAR
bzw. Metformin als für andere Versuchsbedingungen. Auch die unbehandelte Probe und
die mit Insulin behandelte Probe erzeugten Signale für AMPK Thr 172, die allerdings
schwächer sind als die Signale von Metformin und AICAR. Proben mit Präinkubation in
40µM Compound C erzeugten keine Signale für AMPK Thr 172.
Durch ELISA wurden im Western Blot untersuchte Signale quantifiziert. Mittels ANOVA
und anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden die Daten auf statisitisch
signifikante Unterschiede untersucht.
Ausgehend von der Kontrollprobe steigt die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172
durch Metformin (2mM) signifikant von 0,11 U/ng auf 0,17 U/ng (p<0,01). AICAR (1mM)
erhöht die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172 signifikant auf 0,23 U/ng (p=0,02).
Abb. 11: Effekt von Compound C auf den Phosphorylierungsstatus von AMPK Threonin 172 (ELISA). H4 II E Zellen wurden mit 2mM Metformin, 10
-6M Insulin oder 1mM AICAR inkubiert und mit oder ohne Einfluss von 40µM
Compound C auf ihren Phosphorylierungsstatus an AMPK Threonin 172 untersucht. Compound C wurde 30 Minuten präinkubiert. Es folgte eine 30-minütige Inkubation mit Insulin/Metformin/AICAR. Die Threonin-Phosphorylierung wurde auf den Proteingehalt des Zelllysats normiert. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Holm-Sidak-Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt.
*, , , Statistisch signifikanter Unterschied (p<0,05) zu entsprechender Versuchsbedingung ohne Compound-C-Inkubation.
64
Insulin erhöht die AMPK-Phosphorylierung an Threonin 172 auf 0,13 U/ng. Der
Unterschied zur Kontrollprobe (0,11 U/ng) ist nicht signifikant (p=0,66). Der Unterschied
zwischen Insulin (0,13 U/ng) und Metformin (0,17 U/ng) ist signifikant (p=0,02).
Alle Versuchsansätze mit Compound-C-Präinkubation senken die AMPK-
Phosphothreonin-Aktivität sowohl unter die Aktivität der Kontrollprobe als auch unter die
Aktivität ihres entsprechenden nicht mit Compound C behandelten Pendants. Die
Aktivität der Kontrollprobe wird von 0,11 U/ng durch Compound C auf 0,07 U/ng gesenkt
(p=0,02). Die Aktivität von Insulin wird von 0,13 U/ng durch Compound C auf 0,07 U/ng
gesenkt (p=0,02). Die Aktivität von Metformin wird von 0,17 U/ng durch Compound C auf
0,08 U/ng gesenkt (p<0,01). Die Aktivität von AICAR wird von 0,23 U/ng durch Compound
C auf 0,09 U/ng gesenkt (p=0,01).
Metformin und AICAR führen zu einer stärkeren Zunahme der Phosphorylierung an AMPK
Threonin 172 als Insulin. Auch Insulin scheint AMPK über die Phosphorylierung an
Threonin 172 zu aktivieren.
4.3 ATP-Konzentrationen in H4-Zellen unter dem Einfluss von
Insulin und Metformin
ATP ist die universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie in allen metabolisch aktiven
Zellen und kann als Marker für Zelllebensfähigkeit herangezogen werden. Um
auszuschließen, dass die gezeigten Effekte auf die G6Pase-Promotoraktivität nicht durch
unspezifische Effekte auf die Viabilität der Zellen erfolgte, wurde die ATP-Konzentration in
H4 II E Zellen nach 12-stündiger Inkubation in verschiedenen Metforminkonzentrationen
(0,1mM; 0,5mM; 1mM; 2mM) und 10-6M Insulin gemessen. Durch eine ATP-abhängige
chemische Reaktion wurden luminometrisch Lichtemissionen (in RLU) gemessen, die in
linearer Abhängigkeit zum zellulären ATP-Gehalt stehen. Diese Werte wurden auf den
mittels BCA-Test ermittelten zellulären Proteingehalt normiert und über eine ATP-
Standardkurve auf die Einheit nM ATP/ µg Protein umgerechnet. Die Daten stammen aus
4 unabhängigen, mindestens im Triplikat durchgeführten Zellversuchen je
Versuchsbedingung.
65
Bei den ermittelten Daten zeigte sich nach ANOVA keine signifikante Verminderung der
ATP-Konzentration in H4 II E Zellen (p=0,223).
Die Kontrollprobe hatte eine ATP-Konzentration von 14,914 nM ATP/µg Protein.
Metformin führt zu einer nicht signifikanten Abnahme der ATP-Konzentration. Dabei
verringert sich die ATP-Konzentration nach Inkubation in 0,1mM Metformin auf 13,554
nM ATP/µg Protein, nach Inkubation in 0,5mM Metformin auf 13,873 nM ATP/µg Protein,
nach Inkubation in 1mM Metformin auf 13,704 nM ATP/µg Protein und nach Inkubation
in 2mM Metformin auf 11,125 nM ATP/µg Protein. Insulin (10-6M) führte zu einer nicht
signifikanten Reduktion der ATP-Konzentration auf 14,237 nM ATP/µg Protein.
Der ATP-Gehalt in H4-Zellen nimmt nach Metformin-Inkubation tendenziell, allerdings
nicht statistisch signifikant ab. Ein zytotoxischer Effekt von Metformin und Insulin in den
verwendeten Konzentrationen kann weitestgehend ausgeschlossen werden.
Abb. 12: ATP-Konzentrationen in H4 II E Zellen in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen Metformin
und 10-6
M Insulin. H4 II E Zellen wurden 12-stündig in 0,1mM, 0,5mM, 1mM oder 2mM Metformin sowie in
10-6
M Insulin inkubiert. Anschließend wurde luminometrisch die ATP-Konzentration in nM/µg Protein im Zelllysat
ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 4 unabhängigen, mindestens im Triplikat
durchgeführten Zellversuchen. Es zeigten sich nach ANOVA keine signifikanten Unterschiede in den ATP-
Konzentrationen (p=0,223).
66
4.4 Effekte von Insulin und Metformin auf die Apoptose
Eine Abnahme der ATP-Konzentration in Zellen kann ein Zeichen für Zelltod sein. Um
einen eventuellen Zelltod durch Metformin und Insulin in den verwendeten
Konzentrationen genauer verifizieren zu können, wurde mittels
Immunfluoreszenzmikroskopie das Auftreten von Apoptose untersucht. Während des
programmgesteuerten Zelltods durchläuft die Zelle verschiedene klar definierte
morphologische und funktionelle Stadien. Unter anderem kommt es zu DNA-
Strangbrüchen mit freiwerdenden 3´-OH-Enden. Diese wurden genutzt, um sie mit
Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar zu machen. Zusätzlich zur Fluoreszenzfärbung wurden
auch morphologische Kriterien der Apoptose zur Auswertung hinzugezogen. Die meist
fixationsbedingte Nekrose wurde durch morphologische Kriterien abgegrenzt. H4 II E
Zellen wurden dazu 12 Stunden in 2mM Metformin bzw. 10-6M Insulin inkubiert. Als
Positivkontrolle wurden zur Validierung des Messverfahrens 5 Units DNase eingesetzt.
Eine Probe blieb unbehandelt, ist repräsentativ für die physiologisch vorkommende
Apoptose und gilt als Kontrollprobe. Bei 40-facher Vergrößerung wurden je
Versuchsbedingung 5 repräsentative Gesichtsfelder hinsichtlich Gesamtzellzahl, Zahl
apoptotischer und nekrotischer Zellen untersucht. Der Versuch wurde dreimal
durchgeführt. Absolute Werte der Apoptoseanzahl wurden in Relation zur Gesamtzellzahl
angegeben.
67
In den Kontrollproben waren 3,43 % der Zellen apoptotisch. Dies entspricht dem
physiologischen Apoptosevorkommen. 4,81 % der Zellen der Kontrollproben waren
nekrotisch. Mit 10-6M Insulin behandelte Zellen waren zu 4,53 % apoptotisch und zu 3,59
% nekrotisch. Mit 2mM Metformin behandelte Zellen waren zu 6,58 % apoptotisch und zu
6,55 % nekrotisch. Die Positivkontrolle zeigte durch DNA-Fragmentation 43,57 %
apoptotische und 9,56 % nekrotische Zellen. ANOVA mit anschließendem Dunn´s
Vergleichstest zeigte, dass die Unterschiede in der relativen Apoptoseanzahl zwischen
Kontrollprobe und Insulin bzw. Metformin nicht statistisch signifikant waren (p>0,05).
Auch der Unterschied zwischen Insulin und Metformin ist statistisch nicht signifikant
(p>0,05). Signifikant erhöht hingegen war die Apoptoseanzahl der Positivkontrolle zu allen
anderen Proben (p<0,05). Bei Vergleich der Nekroseanzahl zeigten ANOVA und Dunn´s
Vergleichstechnik ein ähnliches Bild. Bei mit Metformin behandelten Zellen waren
gegenüber unbehandelten Zellen und mit Insulin behandelten Zellen keine statistisch
signifikant erhöhten Unterschiede zu ermitteln (p<0,05). Lediglich die Positivkontrolle
hatte zur Kontrollprobe eine signifikant erhöhte Nekroseanzahl (p>0,05).
Abb. 13: Fluoreszenmikroskopische Apoptosebestimmung von H4 II E Zellen unter verschiedenen Bedingungen. H4 II E Zellen wurden 12 Stunden mit 2mM Metformin oder 10
-6M Insulin oder 5 Units DNAse (Positivkontrolle)
behandelt. Es wurde die relative Apoptoseanzahl (in %) bezogen auf die Gesamtzellzahl angegeben. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 3 unabhängigen Experimenten, wobei jeweils 5 Gesichtsfelder je Versuchsbedingung fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet wurden. ANOVA mit anschließendem Dunn´s Vergleichstest wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).
68
Die Apoptoseanzahl nimmt durch Metformin tendenziell, allerdings nicht signifikant zu.
Ein zytotoxischer Effekt von Metformin und Insulin in den verwendeten Konzentrationen
kann weitestgehend ausgeschlossen werden.
69
a) b)
c) d)
Abb. 14: Fluoreszenzmikroskopische Bilder von: a) unbehandelten H4 II E Zellen b) mit 10
-6M Insulin behandelten H4 II E Zellen
c) mit 2mM Metformin behandelten H4 II E Zellen d) mit 5 Units DNase behandelten H4 II E Zellen
in 40-facher Vergrößerung mit einem 490nm Filter für FITC.
70
4.5 Beeinflussung der Tyrosin-Phosphorylierung des
Insulinrezeptors durch Insulin und Metformin
Um zu prüfen, ob Metformin den Insulinrezeptor zur Vermittlung seiner Effekte auf die
G6Pase benutzt, wurde der Phosphorylierungsstatus des Insulinrezeptors mittels ELISA
untersucht. Dabei wurde spezifisch nach dem Signal von Phospho-Tyrosin 1162 und 1163
gesucht, welche als entscheidend für die Aktivierung des Insulinrezeptors angesehen
werden. H4 II E Zellen wurden zu diesem Zweck in 2mM Metformin oder 10-6M Insulin
(Positivkontrolle) für 15 Minuten inkubiert. Eine gleiche Anzahl Proben blieb unbehandelt.
Dem Phospo-ELISA schloss sich ein Total-ELISA an, bei dem die β-Untereinheit des
Insulinrezeptors quantifiziert wurde, um die Menge Phospho-Tyrosin auf die
Rezeptormenge quantifizieren zu können. Die Werte wurden in U/ng angegeben. Die
Daten stammen aus 8 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die
Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt.
Abb. 15: Bestimmung des Phosphorylierungsstatus am Insulinrezeptor an Tyrosin 1162/1163. Nach 15-minütiger Inkubationszeit von H4 II E Zellen in 2mM Metformin bzw. 10
-6M Insulin wurde die Tyrosin-Phosphorylierung an
Tyrosin 1162/1163 ermittelt. Die angegebenen Mittelwerte und SEM stammen aus 8 unabhängigen Zellversuchen. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).
71
Mittels ANOVA und Dunn´s Vergleichstechnik wurde eine signifikante Zunahme der
Tyrosin-Phosphorylierung zwischen den unbehandelten Proben und 10-6M Insulin
beobachtet (p<0,05). Insulin erhöhte die Tyrosin-Phosphorylierung der unbehandelten
Zellen von 0,02 U/ng auf 0,16 U/ng. Ein signifikanter Unterschied in der Tyrosin-
Phosphorylierung zwischen unbehandelten Proben und Metformin war nicht feststellbar
(p>0,05). Die Tyrosin-Phosphorylierungen dieser beiden Probenansätze blieben mit 0,02
U/ng identisch. Der Unterschied zwischen Insulin (10-6M) und Metformin (2mM) ist
signifikant (p<0,05).
Metformin hat keinen Effekt auf den Insulinrezeptor an den untersuchten Stellen.
4.6 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB durch
Insulin, Metformin und PI3-Kinase-Inhibitoren
Unterhalb des Insulinrezeptors wird insulinabhängig Akt/PKB phosphoryliert. Um
herauszufinden, inwieweit Metformin Akt/PKB in ihrer Aktivität beeinflusst, wurde der
Phosphorylierungsstatus von Akt/PKB Serin 473 mittels Western Blot und ELISA
untersucht. Wortmannin und LY294002 wurden verwendet, um PI3-Kinase-abhängige
Effekte von Insulin und Metformin zu verhindern und diese damit präzise in Verbindung
mit Akt/PKB zu bringen. Für Western Blots wurden H4 II E Zellen 12 Stunden mit 2mM
Metformin bzw. mit 10-6M Insulin inkubiert. Eine Probe blieb unbehandelt. Einige
Probenansätze wurden einstündig mit 10-7M Wortmannin bzw. 10-4M LY294002
präinkubiert. Die PI3-Kinase-Inhibitoren wurden in DMSO gelöst. Um sicherzustellen, dass
DMSO als Lösemittel keinen Effekt auf die Serin-Phosphorylierung von Akt/PKB hat,
wurde eine entsprechende Kontrolle verwendet. Dem Phospho-Serin 473 Blot schloss sich
ein Akt/PKB-Total Western Blot an, um sicherzustellen, dass alle Spuren Akt/PKB besitzen
und entsprechende Resultate nicht durch fehlende Proteine hervorgerufen wurden.
72
Es wurde beobachtet, dass eine Inkubation der Zellen mit Insulin die Serin-
Phosphorylierung an Akt/PKB steigerte. Hemmung der PI3-Kinase durch Präinkubation
der Zellen in 10-7M Wortmannin mit anschließender Insulin-Inkubation führte zu einer
partiellen Minderung der Serin-Phosphorylierung. Präinkubation mit LY294002 und
anschließender Insulin-Inkubation führte zu einer kompletten Aufhebung des
Insulineffekts an der Serin-Phosphorylierung der Akt/PKB. DMSO hatte keinen Einfluss auf
den Phosphorylierungsstatus.
Weiterhin wurde beobachtet, dass eine Inkubation in 2mM Metformin nicht zu einer
Änderung der Serin-Phosphorylierung an Akt/PKB Serin 473 führte. Probenansätze mit
zusätzlicher Hemmung der PI3-Kinase durch einstündige Präinkubation mit 10-7M
Abb. 16: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den Phosphorylierungsstatus von
Akt/PKB Serin 473 abhängig von Insulin. Nach 1-stündiger Präinkubation von H4 II E Zellen mit 10-4
M LY294002
oder 10-7
M Wortmannin wurde 12 Stunden lang mit 10-6
M Insulin inkubiert. Positivkontrolle ist eine einzig mit
10-6
M Insulin behandelte Probe. Einige Proben wurden nicht mit PI3-Kinase-Inhibitoren behandelt. Mittels
Western Blot wurden Phospho Akt Serin 473 und Total Akt nachgewiesen. 40µg Protein wurden je Spur
aufgetragen.
Abb. 17: Effekt der PI3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 auf den Phosphorylierungsstatus von
Akt/PKB Serin 473 abhängig von Metformin. Nach 1-stündiger Präinkubation von H4 II E Zellen mit 10-4
M LY
294002 oder 10-7
M Wortmannin wurde 12 Stunden lang mit 2mM Metformin inkubiert. Positivkontrolle ist eine
einzig mit 10-6
M Insulin behandelte Probe. Einige Proben wurden nicht mit PI3-Kinase-Inhibitoren behandelt.
Mittels Western Blot wurde Phospho Akt Serin 473 und Total Akt nachgewiesen. 40µg Protein wurden je Spur
aufgetragen.
73
Wortmannin bzw. 10-4M LY294002 führten zu keiner Änderung der Serin-
Phosphorylierung an Akt/PKB Serin 473. Als Positivkontrolle diente eine mit 10-6M Insulin
inkubierte Probe. Hier war eine deutliche Zunahme der Serin-Phosphorylierung
festzustellen.
Zur Quantifizierung der Western Blots (Abb. 16 und 17) wurde ELISA verwendet. Dabei
wurde die Phospho-Serin 473 Aktivität an Akt/PKB gemessen. Dem Phospo-ELISA schloss
sich ein Akt-Total-ELISA an, um die Menge Phospho-Serin auf Gesamt-Akt/PKB
quantifizieren zu können. Resultierende Werte wurden in U/ng angegeben. Die Daten
stammen aus 7 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung
wurde in einem ELISA durchgeführt. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten.
Mittels ANOVA und anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurde eine signifikante
Zunahme der Aktivität von Phosphoserin 473 an Akt/PKB nach Inkubation der Zellen in
10-6M Insulin im Vergleich zur unbehandelten Probe (p<0,05) ermittelt. Die Serin-
Phosphorylierung stieg von 0,03 U/ng auf 0,37 U/ng an. Inkubation der Zellen in 2mM
Abb. 18: Phosphorylierungsstatus an Akt/PKB an Serin 473 in Abhängigkeit von Insulin und Metformin. Nach 15-minütiger Inkubationszeit von H4 II E Zellen in 2mM Metformin bzw. 10
-6M Insulin wurde die Serin-
Phosphorylierung an Akt Serin 473 ermittelt. Angegebene Mittelwerte und SEM stammen aus 7 unabhängigen Zellversuchen je Versuchsbedingung. Die Auswertung wurde anschließend in einem ELISA durchgeführt. ANOVA mit anschließender Dunn´s Vergleichstechnik wurden zur Ermittlung signifikanter Unterschiede angewandt. * Statistisch signifikanter Unterschied zur unbehandelten Probe (p<0,05).
74
Metformin führte zu keiner signifikanten Zunahme der Serin-Phosphorylierung 473 an
Akt/PKB im Vergleich zur unbehandelten Probe (p>0,05). Die Serin-Phosphorylierung lag
unter beiden Bedingungen bei 0,03 U/ng. Der Unterschied in der Serin-Phosphorylierung
zwischen Insulin und Metformin ist signifikant (p>0,05).
Metformin hat keinen Effekt auf Akt/PKB an den untersuchten Stellen. Insulin aktiviert
Akt über eine Phosphorylierung an Serin 473. Dieser Effekt ist durch PI3-Kinase-
Inhibitoren reversibel.
4.7 Beeinflussung der Serin-Phosphorylierung an GSK3 durch
Insulin und Metformin
Ein bekanntes direktes Substrat der Akt/PKB ist die GSK3β. Die Beeinflussung des Signals
an Phospho-Serin 9 der GSK3β wurde in Abhängigkeit von Insulin und Metformin mittels
Western Blot dargestellt, um den Aktivitätszustand des Enzyms beurteilen zu können.
H4 II E Zellen wurden dazu 12 Stunden in 10-6M Insulin bzw. 1mM Metformin bzw. 2mM
Metformin inkubiert. Durch einstündige Präinkubation identischer Versuchsansätze mit
10-7M Wortmannin wurde die oberhalb der GSK3β gelegene Akt/PKB gehemmt. In zwei
Versuchsansätzen wurde die Wirkung einer kombinierten Stimulation der Zellen mit
10-6M Insulin und 1 bzw. 2mM Metformin untersucht. Dem Phospho-Serin 9 Blot schloss
sich ein GSK3β-Total Blot an, um sicherzustellen, dass alle Spuren GSK3β besitzen und
entsprechende Resultate nicht durch fehlende Proteine hervorgerufen wurden.
Erzeugte Signale im Phospho-Blot wurden densidometrisch auf GSK3-Total-Protein
normiert und mittels ANOVA auf statistisch signifikante Unterschiede untersucht.
75
Es wurde festgestellt, dass GSK3β bereits unter basalen Bedingungen an
Serin 9 phosphoryliert ist (0,113 gemessene durchschnittliche Intensität). Durch Insulin
wird die Serin-Phosphorylierung an GSK3β auf 0,371 *gemessene durchschnittliche
Intensität] erhöht. Eine Inkubation der Zellen mit Metformin führt unabhängig von dessen
Konzentration zu keiner statistisch signifikanten Erhöhung der Serin-Phosphorylierung an
GSK3β (1mM Metformin 0,147; 2mM Metformin 0,12 gemessene durchschnittliche
Intensität). Eine kombinierte Inkubation mit 10-6M Insulin und 1mM Metformin bzw.
2mM Metformin führt zu einer Erhöhung der Serin-Phosphorylierung an GSK3β (10-6M
Insulin + 1mM Metformin: 0,43 gemessene durchschnittliche Intensität; 10-6M Insulin +
2mM Metformin: 0,457 gemessene durchschnittliche Intensität). Die Signale sind nicht
signifikant stärker als bei alleiniger Inkubation des Versuchsansatzes mit 10-6M Insulin.
Der PI3-Kinase-Inhibitor Wortmannin antagonisiert den Effekt von Insulin, so dass sich die
Signale nicht signifikant von denen der unbehandelten Probe unterscheiden.
Metformin hat keinen Effekt auf GSK3β an den untersuchten Stellen.
Insulin bewirkt eine Zunahme der Serin-Phosphorylierung der GSK3β an Serin 9 über
Akt/PKB. Eine Zunahme der Serin-Phosphorylierung in simultan mit Insulin und
Metformin inkubierten Zellen beruht einzig auf dem Effekt von Insulin.
GSK3β ist im phosphorylierten Zustand inaktiv. Dadurch wird die unterhalb gelegene
Glykogensynthase nicht phosphoryliert und bleibt damit aktiv.
Abb. 19: Phosphorylierungsstatus der Glykogen-Synthase-Kinase3β (GSK3β) an Serin 9. H4 II E Zellen wurden 12-
stündig in 10-6
M Insulin, 1mM und 2mM Metformin inkubiert. Wortmannin wurde bei einigen Proben einstündig
präinkubiert. Mittels Western Blot wurden Phospho GSK3β Serin 9 und Total GSKβ nachgewiesen. 100µg Protein
wurden je Spur aufgetragen.
76
5 Diskussion
5.1 Ergebnisdiskussion
Wichtigster Befund dieser Arbeit ist, dass Metformin die Promotoraktivität der Glukose-6-
Phosphatase konzentrationsabhängig hemmt. Passend zur Beeinflussung der Glukose-6-
Phosphatase-Promotoraktivität fanden wir auch eine metforminabhängige Reduktion der
Glukose-6-Phosphatase mRNA. Durch diese Beobachtungen lässt sich die Hauptwirkung
von Metformin, nämlich die Hemmung der hepatischen Glukoneogenese, im Zellmodell
erklären.
Dieser Befund, dass Metformin seine Effekte auf die hepatische Glukoneogenese
mitunter auf transkriptioneller Ebene auslöst, steht im Einklang mit früheren Befunden in
verschiedenen Zellkultur- und Tiermodellen [22, 42, 52, 65, 67], unter anderem von
Morioka et al. [41], die ebenfalls in H4-Zellen eine metforminabhängige Abnahme der
mRNA-Konzentration gezeigt haben. Allerdings wurde bisher noch nicht die Beeinflussung
des Glukose-6-Phosphatase-Promotors beschrieben.
Um zu überprüfen, ob sich das Ausmaß der Hemmung der hepatischen Glukoneogenese
durch Metformin oder Insulin unterscheidet, wurden parallel die Effekte von Insulin und
Metformin auf die Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität untersucht. Dabei konnten
wir frühere Arbeiten bestätigen, dass auch Insulin die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität beeinflusst [5]. Bei Verwendung beider Substanzen in maximaler
Konzentration war der Effekt von Insulin auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität ca. 1,2-fach stärker als Metformin.
Um eine Insulinresistenz mit gesteigerter Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität, wie
sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, zu simulieren, wurden H4-Zellen mit cAMP und
Dexamethason vorbehandelt und es wurden erneut die Effekte von Metformin und
Insulin verglichen. Dabei zeigte sich, dass bei derart angehobener Glukose-6-
Phosphatase-Promotoraktivität der hemmende Effekt von Metformin relativ zum
Ausgangswert deutlich stärker war und nun dem des Insulin glich.
77
In weiteren Experimenten wurden die Mechanismen der Metformin- bzw. Insulin-
bedingten Hemmung der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität untersucht.
Compound C, ein selektiver Hemmstoff der AMPK, reduzierte den Effekt von Metformin
und Insulin zu etwa 50 %, was eine Rolle der AMPK bei der Regulation der oben
genannten Promotoraktivität nahelegt. Wurde das gleiche Experiment nach
vorausgegangener Stimulation der Zellen mit cAMP und Dexamethason durchgeführt, war
Compound C deutlich weniger effektiv, den Insulineffekt auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität zu antagonisieren, als den Metformineffekt. Dies könnte darauf
hinweisen, dass zumindest unter den Bedingungen einer erhöhten Glukose-6-
Phosphatase-Promotoraktivität die Metforminwirkung auf den Glukose-6-Phosphatase-
Promotor stärker AMPK-abhängig ist als die Insulinwirkung. Das AMP-Analogon AICAR,
ein AMPK-Aktivator, führte ebenfalls sowohl unter Normalbedingungen als auch unter
Bedingungen einer gesteigerten Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität zu einer
Hemmung der Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität. In beiden Fällen war es
möglich, den Effekt von AICAR durch Compound C vollständig zu antagonisieren, was
darauf hinweist, dass AICAR seine Effekte auf die Glukose-6-Phosphatase-
Promotoraktivität primär über AMPK vermittelt.
Um zu überprüfen, ob Insulin, Metformin und AICAR Einfluss auf die Threonin-
Phosphorylierung 172 an AMPK haben, die diese aktiviert, wurde dieses Signal im ELISA
und Western Blot gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass Metformin und AICAR zu
einer stärkeren Zunahme der Phosphorylierung an AMPK Threonin 172 führen als Insulin.
Auch Insulin scheint AMPK über die Phosphorylierung an Threonin 172 zu aktivieren.
Hemmung der AMPK durch Compound C reduzierte die Threonin-Phosphorylierung 172
an AMPK signifikant in allen Versuchsbedingungen. Metformin, Insulin und AICAR
scheinen daher AMPK über die Phosphorylierung an Threonin 172 zu aktivieren und so
Effekte auf die hepatische Glukoneogenese auszuüben.
Um zu prüfen, wie Metformin den Glukose-6-Phosphatase-Promotor beeinflusst und ob
sich dies von Mechanismen des Insulins unterscheidet, wurden die Effekte von Metformin
und Insulin auf wichtige Schlüsselstellen der Insulinsignaltransduktion (Insulinrezeptor,
PKB/Akt, GSK3β) mittels ELISA und Western Blot verglichen. Dabei wurden klare Effekte
78
des Insulins auf die Aktivitäten und Phosphorylierungen dieser Signalproteine gefunden.
Metformin hatte keinerlei Effekt. So veränderte Metformin weder Phosphorylierungen an
Tyrosin 1162 und 1163 des Insulinrezeptors, die diesen aktivieren, noch konnten Einflüsse
von Metformin auf Phosphorylierung von Akt/PKB an Serin 473 festgestellt werden. Bei
Insulinstimulation erfolgt die Phosphorylierung an Serin 473 gemeinsam mit der
Phosphorylierung an Threonin 308 und ist Marker einer aktiven Akt/PKB. Schließlich
wurde auch die basale Phosphorylierung an Serin 9 der GSK3β von Metformin nicht
beeinflusst. Dieser Befund, dass Metformin die Insulinsignaltransduktion bis zur Ebene
der PKB/Akt nicht beeinflusst, steht im Einklang mit früheren Befunden an verschiedenen
Zellkulturmodellen [8, 28, 31, 36, 37], die ebenfalls keine Interaktionen von Metformin
mit Schritten der Insulinsignaltransduktion feststellten.
Andere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe, die nicht Teil dieser Doktorarbeit sind, haben
herausgefunden, dass sowohl Insulin als auch AMPK den forkhead transcription factor
FKHR (FoxO1a), ein direktes Substrat der PKB, aus dem Zellkern exportieren und die
Transaktivierung des Glukose-6-Phosphatase-Promotors verringern. Dies weist darauf hin,
dass auf dieser Ebene die Signalwege von Insulin und Metformin im Hinblick auf die
Stimulation des Glukose-6-Phosphatase-Promotors zusammenkommen. Dabei ist die Art
und Weise, wie AMPK die FKHR Effekte vermittelt, noch weitgehend unklar.
Nach wie vor ist fraglich, wie Metformin AMPK aktiviert. Eine Hypothese ist, dass es über
die Hemmung des mitochondrialen Komplex 1 zu einer verminderten ATP-Synthese
kommt, was zu einem Anstieg des AMP/ATP-Quotienten führen und konsekutiv die AMPK
aktivieren würde [10, 23, 43, 53, 66]. Passend zu dieser Hypothese fanden wir einen
tendenziellen, allerdings nicht statistisch signifikanten Abfall des zellulären ATP-Gehaltes.
Dies deutet darauf hin, dass eine Hemmung des mitochondrialen Komplex 1 der
Atmungskette mit konsekutiver AMPK Aktivierung durchaus möglich ist, diese Hemmung
letztendlich jedoch nicht beweist. Somit kann leider auch diese Arbeit diese seit Jahren
diskutierte Frage nicht beantworten. Andererseits zeigen der fehlende bzw. geringe Abfall
des ATP sowie der fehlende Anstieg der Apoptoserate bei konstanter Zellzahl in
Gegenwart von Metformin, dass die in dieser Arbeit gemessenen Effekte des Metformin
nicht durch unspezifische Effekte auf die Viabilität der Zellen erfolgte. Andere Autoren
79
berichten hingegen über konstant bleibende zelluläre AMP- und ATP-Gehalte [14, 21]. Sie
geben keinen Wirkmechanismus an, argumentieren aber, dass Metformin weder zu
einem AMP-vergleichbaren Analogon metabolisiert wird, noch dass Metformin die AMPK
direkt reguliert. Auch eine Hemmung von Phosphatasen, die Phospho-AMPK Threonin
172 dephosphorylieren, konnte bisher nicht nachgewiesen werden [21, 52, 67]. Der
exakte Wirkmechanismus von Metformin auf die Atmungskette bleibt weiterhin
ungeklärt.
Zusammenfassend zeigen die hier erhobenen Daten, dass Metformin, wie Insulin, die
Glukose-6-Phosphatase-Promotoraktivität hemmt und vermutlich über diesen
Mechanismus die Glukose-6-Phosphatase-Aktivität reduziert und so die hepatische
Glukoseproduktion hemmt. Der Signalweg, über den Metformin die Glukose-6-
Phosphatase-Promotoraktivität hemmt, unterscheidet sich von dem des Insulin
dahingehend, dass zumindest die initialen Schritte der Insulinsignaltransduktion bis zur
Ebene der Akt/PKB durch Metformin nicht beeinflusst werden. Bekanntermaßen führen
allerdings sowohl Insulin als auch eine Steigerung der AMPK-Aktivität zu einem Export von
FKHR aus dem Zellkern und damit zu einer verminderten Transaktivierung des Glukose-6-
Phosphatase-Promotors. Auf dieser Stufe könnten somit die Signale zusammenlaufen, da
Metformin, wie in dieser Arbeit gezeigt, zu einer Stimulierung der AMPK führt. Eine
Steigerung der AMPK-Aktivität scheint entscheidend für die Hemmung der Glukose-6-
Phosphatase-Promotoraktivität durch Metformin zu sein. Ob diese Stimulation durch eine
Hemmung der ATP-Produktion erfolgt, konnte in dieser Arbeit letztendlich nicht geklärt
werden.
80
5.2 Grenzen und Einordnung
H4-Zellen zeichnen sich durch eine günstige Insulinempfindlichkeit und eine erhaltene
Regulation glukoneogener Gene aus. Sie sind deshalb hervorragend für die Untersuchung
insulinabhängiger Stoffwechselprozesse geeignet [33]. Eine Übertragung der Ergebnisse
auf den menschlichen Organismus ist aber nicht uneingeschränkt zulässig, weil
immortalisierte Rattenhepatomzellen mit Kälberserum in Kultur gehalten wurden und
parakrine Einflüsse des Organismus nicht auf die Zellen einwirken.
Weiterhin gelten die verwendeten Konzentrationen von Insulin, Metformin, AICAR,
Wortmannin, LY294002 und Compound C von der Literatur zwar als anerkannt, allerdings
ist die Übertragbarkeit dieser Konzentrationen außerhalb des verwendeten Zellmodells
nicht möglich.
PCR und real-time PCR reagieren sehr empfindlich auf Fremd-DNA und Verunreinigungen.
Sie können Messungen stören und verfälschen. Durch die Verwendung von speziell
ausgewiesenen DNA-, RNA-, DNAse- und RNAse-freien Reaktionsgefäßen, sowie eine
vorausgehende spezielle Reinigung der Arbeitsflächen wurde das Risiko einer
Kontamination so gering wie möglich gehalten. Zusätzlich wurden Positiv- und
Negativkontrollen in den Versuch integriert, um einen fehlerhaften Ablauf des Versuchs
zu bemerken.
Bei der Messung des zellulären ATP-Gehalts muss eine Kontamination mit ATPasen
bedacht werden. ATPasen sind überall vorhanden, besonders an menschlicher Haut. Um
deren Einfluss möglichst gering zu halten, wurden alle Arbeitsflächen vor
Versuchsdurchführung gründlich gereinigt und verwendete Handschuhe mehrfach
während des Versuchs gewechselt. Speziell als ATPasen-frei ausgewiesene
Reaktionsgefäße waren nicht vorhanden. Es wurden die bereits oben angegebenen DNA-,
RNA-, DNAse- und RNAse-freien Reaktionsgefäße verwendet. Ebenfalls wurden Positiv-
und Negativkontrollen in die Versuche integriert, um einen eventuell fehlerhaften Ablauf
des Versuchs zu bemerken.
81
Zur Apoptosedetektion wurde ein TUNEL Assay verwendet. Die Daten wurden nicht
durchflusszytometrisch gemessen, sondern fluoreszenzmikroskopisch. Es können dabei
nicht alle Zellen und Apoptosevorgänge detektiert werden. Nur eine Stichprobe von als
repräsentativ geltenden Gesichtsfeldern wurde zur Datenerhebung herangezogen. Diese
Form der Datenerhebung ist per se mit Fehlern behaftet. Fixationsbedingt kam es zu
Beschädigungen mit folgender Nekrose von Zellen.
Der verwendete Double-Antibody-Sandwich-ELISA zeichnet sich durch eine hohe
Sensitivität bei der Proteinmengendetektion aus. Wesentlicher Nachteil dieser Methode
ist die geringe Spezifität. Proteine mit ähnlichen Peptidsequenzen oder ähnlicher Affinität
zum Coating-Antikörper können kreuzreagieren und so das Messergebnis verfälschen. Um
die Möglichkeit dieses Fehlers auszuschließen, wurden zu allen durch ELISA
quantifizierten Versuchen Western Blots angefertigt, um spezifischen Proteinnachweis
mit sensitiver Proteinquantifizierung zu korrelieren.
82
6 Zusammenfassung
Problem:
Typ-2-Diabetes ist eine chronische Stoffwechselkrankheit, deren Auftreten mit dem
metabolischen Syndrom assoziiert ist. Obwohl in den meisten Leitlinien (u. a. auch der
Deutschen Diabetes Gesellschaft) Metformin Mittel der ersten Wahl zur Therapie des
Typ-2-Diabetes ist, ist der genaue Wirkmechanismus nicht bekannt. Metformin senkt in
vivo den Blutzuckerspiegel primär durch Hemmung der hepatischen Glukoneogenese.
Hypothese dieser Arbeit ist, dass Metformin über AMP-aktivierte Protein-Kinase (AMPK)
Anschluss an die Insulinsignaltransduktion haben und so die Glukose-6-Phosphatase
(G6Pase) auf Promotorebene beeinflussen könnte. Die Fragestellung lautet: Hat
Metformin einen sich vom Insulin unterscheidenden Effekt auf die Promotorebene der
G6Pase und wird dieser Effekt durch AMPK vermittelt? Nutzt Metformin Schritte der
Insulinsignaltransduktion zur Beeinflussung der G6Pase auf Promotorebene?
Methoden:
Im Zellmodell mit H4-Rattenhepatomzellen (Rattus norvegicus) wurden die Effekte von
Metformin und Insulin auf die hepatische Glukoneogenese gegenübergestellt. Die
G6Pase-Promotoraktivität wurde mittels Luciferase-Reporter-Assay, die G6Pase m-RNA
mittels real-time PCR quantifiziert. Um bei einzelnen Versuchen eine Insulinresistenz mit
gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität, wie sie beim Typ-2-Diabetes vorkommt, zu
simulieren, wurden H4-Zellen mit cAMP und Dexamethason vorbehandelt. Um
auszuschließen, dass die Ergebnisse der G6Pase-Promotoraktivität durch unspezifische
Effekte auf die Viabilität der Zellen oder deren ATP-Spiegel erfolgten, wurden ATP-Gehalt
und Apoptose-Immunfluoreszenz gemessen. Schließlich wurden mit Western Blot und
ELISA Phosphorylierungen und Aktivitäten wichtiger an der Insulinsignaltransduktion
beteiligter Proteine gemessen.
83
Ergebnisse:
Sowohl Metformin als auch Insulin senkten konzentrationsabhängig die G6Pase-
Promotoraktivität. Dabei war bei jeweils maximaler Konzentration der Testsubstanzen der
Effekt von Insulin ca. 1,2-fach stärker als der des Metformin. Unter Bedingungen
gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität verstärkte sich der Effekt von Metformin relativ
und glich dem des Insulin. Compound C, ein selektiver Hemmstoff der AMPK, reduzierte
den Effekt von Metformin und Insulin auf die G6Pase Promotoraktivität partiell, Effekte
von AICAR (AMP-Analogon) wurden vollständig antagonisiert. Unter Bedingungen
gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität war Compound C weniger effektiv, den
Insulineffekt zu antagonisieren, als den Metformineffekt. Bei den untersuchten
Schaltstellen der Insulinsignaltransduktion wurde keine Aktivierung des Insulinrezeptors
(durch Phosphorylierung an Tyrosin 1162 und 1163), der Akt/PKB (durch
Phosphorylierung an Serin 473), der GSK3β (durch Phosphorylierung an Serin 9) durch
Metformin nachgewiesen. Der ATP-Gehalt sank in Abhängigkeit von Metformin
tendenziell, jedoch nicht signifikant ab. Der Apoptoseanstieg in Abhängigkeit von
Metformin war nicht signifikant.
Diskussion:
Wichtigster Befund dieser Arbeit ist, dass Metformin die Promotoraktivität der G6Pase
konzentrationsabhängig hemmt. Auch Insulin hemmt die G6Pase-Promotoraktivität, dies
sogar stärker als Metformin. Unter Bedingungen gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität
verstärkt sich die Metforminwirkung relativ und ist mit der Wirkung von Insulin
vergleichbar. Dabei konnten wir zeigen, dass die Effekte von Metformin und Insulin auf
die G6Pase-Promotoraktivität teilweise durch Compound C antagonisiert werden und
damit eine Rolle der AMPK bei der Regulation der G6Pase-Promotoraktivität nahelegen.
Weiterhin stellten wir eine verstärkte Compound-C-Wirkung unter Bedingungen
gesteigerter G6Pase-Promotoraktivität in Abhängigkeit von Metformin, jedoch kaum von
Insulin fest. Dies weist darauf hin, dass unter Bedingungen erhöhter G6Pase-
Promotoraktivität die Metforminwirkung auf den G6Pase-Promotor stärker-AMPK
abhängig ist als die Insulinwirkung. In jedem Fall ist eine Steigerung der AMPK-Aktivität
entscheidend für die Hemmung des G6Pase-Promotors durch Metformin. Um zu prüfen,
wie Metformin den G6Pase-Promotor beeinflusst und ob sich dies von Mechanismen des
84
Insulin unterscheidet, wurden die Effekte von Metformin und Insulin auf wichtige
Schlüsselstellen der Insulinsignaltransduktion (Insulinrezeptor, PKB/Akt, GSK3β)
verglichen. Wir stellten dabei keine Interaktionen von Metformin mit den untersuchten
Schlüsselstellen fest. Der Signalweg, über den Metformin die G6Pase-Promotoraktivität
hemmt unterscheidet sich von dem des Insulin dahingehend, dass zumindest die initialen
Schritte der Insulinsignaltransduktion bis zur Akt/PKB durch Metformin nicht beeinflusst
werden. Andere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe, die nicht Teil dieser Doktorarbeit sind,
zeigen, dass sowohl Insulin als auch AMPK den forkhead transcription factor FKHR, ein
direktes Substrat der PKB, aus dem Zellkern exportieren und die Transaktivierung des
G6ase-Promotors verringern. Auf dieser Stufe könnten somit die Signale
zusammenlaufen, da Metformin, wie in dieser Arbeit gezeigt, zu einer Stimulierung der
AMPK führt. Allerdings konnte nicht abschließend geklärt werden, wie es zur AMPK-
Aktivierung durch Metformin kommt. Am wahrscheinlichsten ist eine Hemmung des
Komplex 1 der Atmungskette mit daraus resultierendem Anstieg des AMP-Gehalts und
konsekutiver Aktivierung der AMPK. Diese führt zu einer Hemmung der G6Pase-
Promotoraktivität, welche eine Verminderung der G6Pase-Aktivität zur Folge hat. Eine
Hemmung der G6Pase-Aktivität dürfte in vivo den Effekt des Metformins auf die
hepatische Glukoseproduktion erklären. Hierauf deutet die ermittelte leicht absinkende
ATP-Konzentration ohne wesentlichen Anstieg der Apoptose hin, beweist es aber
letztendlich nicht.
85
7 Literaturverzeichnis
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Danksagung
Herrn PD Dr. Andreas Barthel danke ich für die Überlassung des interessanten Themas,
seine stete Diskussionsbereitschaft und sein Interesse an der Thematik dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Klein danke ich für die Überlassung eines Arbeitsplatzes in seinem Labor
sowie sein Interesse an meinen Ergebnissen.
Herrn Dr. Konstantinos Manolopoulos danke ich für die ausgezeichnete Betreuung und
die anregenden Diskussionen.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Wolfgang Schechinger, der immer Zeit hatte,
sich aller Probleme rund um diese Dissertation anzunehmen. Ohne die stundenlangen
Diskussionen mit ihm und ohne seine kritischen Anmerkungen wäre es mir nicht möglich
gewesen, die Dissertation in dieser Form durchzuführen.
Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei Frau Christine Fischer-Lahdo bedanken, die
mir erstklassige Unterstützung von der ersten Minute an hat zukommen lassen und mich
stets motiviert hat, das Ziel nicht aus den Augen zu lassen.
Bei Herrn Peter Korsten möchte ich mich für seine zahlreichen geopferten Wochenenden
bedanken, in denen er mit mir die real-time PCR am Universitätsklinikum Düsseldorf
durchgeführt hat.
Bei Herrn Dr. Zhou möchte ich mich für die technische Unterstützung für die Western
Blots bedanken.
Außerdem danke ich meiner Familie und meinen Freunden, die für mich auch in
schwierigen Situationen Verständnis zeigten und mich unterstützten.
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name Christoph Alexander Mues
Geburtsdatum/-ort 04.10.1982 in Krefeld
Staatsangehörigkeit deutsch
Schullaufbahn
08/1989 – 07/1993 Gerhard-Hauptmann Grundschule in Duisburg
08/1993 – 06/2002 Albert-Einstein-Gymnasium in Duisburg
Abschluss: allgemeine Hochschulreife
Studium
10/2003 – 12/2009 Humanmedizin, Ruhr-Universität-Bochum
09/2005 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
08/2008 – 07/2009 Praktisches Jahr
12/2009 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr
Innere Medizin: Bergmannsheil Bochum
Universitätsklinikum der Ruhr-Universität-Bochum
Chirurgie: Bergmannsheil Bochum
Universitätsklinikum der Ruhr-Universität-Bochum
Anästhesiologie: Bergmannsheil Bochum
Universitätsklinikum der Ruhr-Universität-Bochum
Ärztliche Tätigkeit
seit 01/2010 Assistenzarzt in der medizinischen Klinik I − Kardiologie,
Pneumologie und Angiologie; Universitätsklinikum RWTH
Aachen
Praktische Erfahrung
10/2002 – 07/2003 Wehrersatzdienst:
Malteser-Hilfsdienst Krefeld
(Krankentransport/Rettungsdienst)
09/2003 – 10/2007 Tätigkeit im Krankentransport beim MHD Ratingen (stud.
Hilfskraft)
10/2004 – 02/2005 Vorpräparand der Anatomie, Ruhr-Uni-Bochum
10/2002 – 10/2007 ehrenamtliche Tätigkeit in der Sondereinsatzgruppe (SEG)
MHD Krefeld
Wissenschaftliche Arbeit
03/2006 – 08/2009 aktives Mitglied der endokrinologischen Forschungsgruppe,
Bergmannsheil Bochum, Medizinische Klinik 1,
Universitätsklinikum der Ruhr-Universität-Bochum
07/2009 Publikation in der Zeitschrift „Hormone and Metabolic
Research“, Thieme : Mues C, Zhou J, Manolopoulos K,
Korsten P, Schmoll D, Klotz LO, Bornstein SR, Klein HH,
Barthel A; Regulation of Glucose-6-phosphatase Gene
Expression by Insulin and Metformin
Zusatzqualifikationen
10/2002 Ausbildung zum Rettungshelfer beim MHD Krefeld
09/2003 Ausbildung zum Rettungssanitäter beim MHD Aachen