Aula Prática 3

Disciplina de Biossegurança e Prática em Análises Clínicas Prof. Núbia B Thomazini

AULA III

ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO

ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa à destruição total de todas as formas de vida de um

material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.

DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos presentes

num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou

local.

ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície

ou local.

ANTI-SEPSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo,

através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal.

LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de

desinfecção ou esterilização.

1- ESTERILIZAÇÃO:

A esterilização é o processo de inativação de toda a flora microbiana que possa estar

presente em determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em itens

que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminação, gaze,

instrumentos, equipamentos, meios, campos, tesouras, etc.

A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos presentes em

instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que

causa infecção, em seres humanos, se desenvolve em temperaturas próximas a do corpo, ou

seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece

quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo

fica apenas inibido, e não é destruído.

Alguns microrganismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo

permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade.

Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos.

Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas definitivamente os

métodos de esterilização mais empregados em microbiologia são os que utilizam o calor, seja

este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor

úmido (autoclave) é melhor.

1.1- Esterilizações por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)

Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de

exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou

ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas,

que resultam na morte dos microrganismos.


A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais

que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para

esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do

vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.

Para ser eficiente, este processo depende de:

- Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material.

- Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.

- A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode

estar completamente lotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre

as caixas.

- O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na

estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.

1.2- Esterilizações pelo Calor Úmido

O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais através

das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição.

Água fervente É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os

microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos

contaminados não são esterilizados com segurança, pois alguns esporos bacterianos

podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora.

Vapor d’água O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O

aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco.

A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido.

Funcionamento da autoclave:

1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar;

2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;

3- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol², na qual a temperatura do vapor é de 121ºC.

A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores: Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente

embalados. O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é

atingida. A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja

todo o material por igual.


Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.

Controle da Esterilização

É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de

um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da

pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o

processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente.

O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos

químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura

desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis,

que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este

controle deve fazer parte da rotina para garantir a saúde dos pacientes e de toda equipe

Considerações importantes

1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de serem submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue, e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante. É adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna antes da esterilização.

2. Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, pois caso contrário volta a ser novamente contaminados com microrganismos presentes no ambiente.

3. Estudos recentes mostraram que os termômetros e termostatos embutidos na estufas não são confiáveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termômetros calibrados de acordo com as especificações do INMETRO. Se não for possível, deve-se considerar que o termômetro de mercúrio tem uma incerteza na medição da faixa de 5ºC a 10ºC.

4. Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através de profissionais preparados para tal procedimento.

2- DESINFECÇÃO

Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização ou UHT) e química

(Desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de

baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos inativados.

1- Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semi-críticos”, ou seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra.

2- Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra.

3- Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. É indicada também para itens de uso “não-crítico”.

2.1- Desinfecção por agentes físicos:

Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C) Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para

eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos, portanto, é um


método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30

minutos.

2.2- Desinfecção por agentes químicos:

2.2.a) Método de Desinfecção de alto nível:

Glutaraldeído: é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.

Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por 30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.

Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.

Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.

2.2.b) Método de Desinfecção de nível intermediário:

Compostos Clorados: Causa a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucléicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.

Alcoóis (Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médicos-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílicos.

Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual há 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-críticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido à toxicidade (hiperbilirrubinemia – crianças – berçários), e ação residual em materiais porosos.

Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual há 10 minutos.

2.2.c) Método de Desinfecção de baixo nível

Alcoóis

Compostos Clorados

Fenólicos: em concentração menor que 5%

Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm

Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies)


Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e,portanto, causam transformações

em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime).

Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia

Agente Espectro de

ação* Uso Modo de ação

Tempo de exposição

Desvantagens

Alcoóis (70-80%)

Gram-positivas Gram-negativas

BAAR**

Antissépticos Desinfetantes

Desnaturação protéica dissolução

de lipídeos

Curto (10-15 min)

Pouco ativo contra esporos

Fenóis Gram-positivas Gram-negativas

BAAR Desinfetantes

Desnaturação protéica

Efeito imediato Fenol puro é

corrosivo e de odor desagradável

Compostos Quaternários de amônio


Antissépticos Sanitizantes

Desinfetantes (instrumentos

cirúrgicos)

Alteração da membrana celular

bacteriana

Curto (10-30 min)

Não age sobre BAAR (Bacilos Álcool-Ácido

Resistentes) e esporos

Cloro Gram-positivas Gram-negativas

BAAR

Tratamento da água

Inativação enzimática agente

oxidante Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra

esporos

Iodo Gram-positivas Gram-negativas

BAAR


Inativação enzimática

Efeito imediato Odor irritante

pouco ativo contra esporos

Iodóforos Gram-positivas Gram-negativas

BAAR


Inativação enzimática

Efeito imediato Pouco ativo contra

esporos

Aldeídos*** Gram-positivas Gram-negativas

BAAR

Desinfetantes (instrumentos e

superfícies)

Desnaturação protéica agente

alquilantes

Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos)

Tempo de exposição longo

Metais pesados


Antissépticos Inativação enzimática

Só agem enquanto em

contato

Não atuam sobre BAAR e esporos

*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991.

**- Bacilos álcool-ácido resistentes; ***- Ativos contra esporos


TÉCNICA “A”

O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a ação de anti-sépticos sobre a microbiota das mãos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:

1- Pegar uma placa de Petri contendo Agar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa (onde foi depositado o meio).

2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão Suja (MS), Detergente (Det), Álcool 70% (A), e Álcool Iodado (AI). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo, por grupo.

3- No quadrante identificado como “Impressão do polegar” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no Agar por 1 minuto.

4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do Agar identificado como “Detergente ou água e sabão” por 1 minuto.

5- O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do Agar identificado como “álcool 70%” por 1 minuto.

6- O mesmo aluno deve então lavar o dedo com álcool iodado, secá-lo e encostar o mesmo dedo no quadrante do Agar identificado como “álcool iodado” por 1 minuto.

7- Serão inoculadas duas placas por grupo, sendo que para cada uma deverá ser também mantida um quadrante para controle (sem inoculação) e também será alternada a utilização de álcool 70% e álcool iodado, ou seja, numa placa você usará álcool 70% e na outra álcool iodado.

OBS1: As placas devem ser levadas para incubação de 24 a 48 horas. OBS2: Nada deve encostar-se ao quadrante identificado como “Controle”.

OBS3: REPITA TODO O PROCESSO DE 1-6 ENCOSTANDO DEDOS DIFERENTES NO MEIO.

Materiais:

- Placas com meio de cultura (Agar

antibiótico 1)

- Detergente líquido

- Álcool 70%

- Álcool Iodado

- Papel toalha (secar as mãos)

- Caneta para Retroprojetor

- Estufa


TÉCNICA “B1”

Agentes Físicos - calor Dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço

respectivo ao tempo 0 Para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o

tempo especificado: Serão utilizados 8 tubos com suspensão bacteriana em solução salina 9% 5 minutos à reinocular 10 minutos à reinocular 20 minutos à reinocular Na parte equivalente a cada temperatura será incubado o material tanto de Esterilização

ao calor úmido (BC) e ao calor seco (EC)

- Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. - Observar e interpretar o crescimento nos meios.

Materiais:

- Placas com meio de cultura

- Tubos de ensaio com Cultura bacteriana em solução

- Termômetro

- Banho Maria graduado

- grade para suporte de tubos no Banho Maria

- Caneta para Retroprojetor

- Alça de Platina

-Bico de Bunsen

- Estufa


AVALIAÇÃO DA TÉCNICA “A”

1- Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação da microbiota das mãos.

Crescimento Bacteriano

- + ++ +++ ++++

Placa I

Controle

Mão Suja

Detergente

Álcool 70%

Placa II

Controle

Mão Suja

Sabão (Antimicrobiano)

Álcool Iodado

(-): Sem crescimento (+): Pouco crescimento bacteriano (< 5 colônias) (++): Médio crescimento bacteriano (de 6-10 colônias) (+++): grande crescimento bacteriano (de 11-20 colônias) (++++): elevado crescimento bacteriano (> 20 colônias)

2- Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da anti-sepsia das mãos? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________

3- Qual dos métodos de anti-sepsia, realizado na aula prática, foi mais eficiente? _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4- Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


TÉCNICA “B2”

Este procedimento tem por finalidade observar a efetividade do processo de esterilização

por autoclave, através da comparação entre material contaminado levado para o processo de

esterilização e aquele que não passa por esse processo.

1- Retire um fio de cabelo (ou um pedaço de unha), e divida o material em duas partes.

2- Coloque cada parte do material em cada tubo de ensaio separado.

3- Identifiquem os tubos, destinando um para a autoclave (A) e o outro para a estufa (E) para

Incubação.

4- O tubo E deve ser imediatamente incubado.

5- O tubo A deve ser encaminhado à autoclave por 20 minutos a 121ºC, sendo a seguir também

incubado (pela equipe de técnicos do departamento).

6- O procedimento deverá ser repetido para a estufa de esterilização e mantê-lo por igual tempo a

180º

MATERIAIS: - Autoclave - Tubos de ensaio esterilizados - Placas de Petri com meio de cultura Agar simples (Antibiótico 1) para inoculação - Pinça - Alça de Platina - Estufa de Esterilização


AVALIAÇÃO DA TÉCNICA “B2”

Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta

aula. Responda-as.

1. O que aconteceu após a incubação? A autoclavação foi eficiente? Comente?

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2. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos

ou estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante?

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3. Qual foi o tempo mais eficiente para o banho Maria em fervura? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Quais os Métodos de esterilização de calor úmido e seco utilizados na prática? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Aula Prática 3