Aula Microbiologia Ifar

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SINOPSE* Assunto: Meios de cultura, condições gerais de preparo,

armazenamento e controle de qualidade.

* Pré-requisito: Conceitos básicos de Microbiologia.

* Objetivo: Descrever os principais meios de cultura e o seu

preparo na microbiologia.

* Bibliografia:1 - Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames

Microbiológicos. ANVISA

2 – Microbiologia Clínica. Murray.

3 – Microbiologia Clínica. Oplustil.

Meios de Cultura

• Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes

de promover o crescimento bacteriano, em condições de laboratório.

Meios de Cultura



• A maioria das bactérias pode ser cultivada em laboratório, utilizando-

se meios nutrientes.

Meios de Cultura





• Diferentes espécies de bactérias, variam extensivamente quanto àsexigências mínimas de substâncias nutrientes.

Meios de Cultura






• O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura

utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação.

Meios de Cultura






• O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura

utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação.

• É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de

cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

Características Básicas dos Meios de Cultura

- Fonte de Carbono e Nitrogênio Açúcares e proteínas.

- Fonte de Energia Açúcares e lipídios.

- Sais Minerais microelementos e macroelementos.

- Fatores de Crescimento vitaminas e metais.

- Condições Físicas pH, temperatura e aeração.

- Esterilização livre de microrganismos.


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Classificação dos Meios de Cultura

Geralmente líquido, de composição química rica em

nutrientes, com a finalidade de permitir que as bactérias contidas em

uma amostra clínica aumentem em número.

1. Meio de Enriquecimento:

Exemplo:Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo

Tetrationato.

2. Meio de Transporte:

Consiste em um meio isento de nutrientes, contendo um

agente redutor (Tioglicolato ou cisteína). Geralmente mantém o pH

favorável, previne a desidratação de secreções durante o transporte

e evita a oxidação e auto-destruição enzimática dos patógenos

presentes.


Exemplo:

Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair e

Caldo Tioglicolato.

3. Meio Seletivo:

A finalidade deste tipo de meio é selecionar as espécies que

se deseja isolar e impedir o desenvolvimento de outros germes

(adição de corantes, antibióticos e outras substâncias com

capacidade inibitória para alguns microrganismos).


Exemplo:

Ágar Manitol Salgado e Ágar SS.


4. Meio Diferencial:

Possibilita a distinção entre vários gêneros e espécies de

microrganismos, por possuir substâncias que permitem uma

diferenciação presuntiva, evidenciada na mudança de coloração ou

na morfologia das colônias.

Exemplo:

Ágar Eosin Methilene Blue

(EMB), Ágar McConkey e Ágar Hektoen.


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5. Meio Indicador:

É utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das

bactérias, auxiliando, assim, sua identificação. O mais simples é

aquele usado no estudo das reações de fermentação.


Exemplo:

Ágar Triple Sugar Iron (TSI) e Ágar Citrato

de Simmons.

- Líquidos ou caldos: crescimento indiscriminado com turvação domeio.

- Sólidos: crescimento de colônias isoladas, muito utilizado paraculturas puras.

- Semi-sólido: adição de menor quantidade de ágar, mobilidadebacteriana.

Classificação quanto ao estado físico


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Meios de Cultura

Ágar sangue

Meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele

crescem a maioria dos Gram-negativo e Gram-positivo, além de fungos

filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos

e outros fastidiosos.


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UTILIDADE

Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos.

Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.

Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de

Haemophilus spp.).

CONTROLE DE QUALIDADE

Hemólise beta hemolítica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou

Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemólise alfa hemolít ica: Streptococcus do grupo viridans ou

Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.

Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: vermelho.

Beta hemólise: presença de halo transparente

ao redor das colônias semeadas (lise total dos

eritrócitos).

Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao

redor das colônias semeadas (lise parcial dos

eritrócitos).

Gama hemólise (sem hemólise): ausência de

halo ao redor das colônias (eritrócitos

permanecem íntegros).

Meios de Cultura

Ágar Thayer Martin Chocolate

Meio seletivo pela adição de

colistina, vancomicina e nistatina. Inibe

crescimento de enterobactérias, Gram-

positivos, fungos e algumas espécies deNeisserias saprófitas.

Enriquecido com a adição de

complementos para a recuperação de N.

meningitidis e N. gonorrhoeae .

Ágar chocolate

Meio rico e não seletivo, permite o crescimento da maioria

das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá

suporte também ao crescimento dos microaerófilos.

Meios de Cultura

Ágar chocolate




Ágar chocolate




Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfa-

hemolíticas. À base do meio, é adicionado sangue de cavalo,

carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as

hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos

fundamentais para o crescimento dos microrganismos.


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UTILIDADE

Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp.,

Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.


Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC10211.

INTERPRETAÇÃO

• Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).

• Colônias de tamanho pequeno a médio, com

pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp,

Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.

• Colônias pequenas e delicadas, com pigmento

creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.

ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT

Usado para isolamento e quantificação de microrganismos

presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de

cepas de Proteus .

Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram-

positivos, Gram-negativos e leveduras.

Meios de Cultura


Positivo:

Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a

denso, colônias médias ou grandes amareladas, após 48 horas de

incubação.

Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a

denso, colônias azuis translúcidas.

Negativo: ausência de crescimento.

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: azul claro.

Colônias lactose positiva: cor amarela.

Colônias lactose negativa: cor azul.

Ágar MacConkey

Meio seletivo para Gram-negativo e diferencial para a utilização de

lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram-

positivos especialmente enterococos e estafilococos.

Meios de Cultura

UTILIDADE

Isolar bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não fermentadores) e

verificar a fermentação ou não da lactose.


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CONTROLEDE QUALIDADE

Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (não fermentador de lactose).

Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose).

Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: rosa avermelhado.

Crescimento de bacilos Gram-negativos.

Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.

Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.

Não há crescimento de cocos Gram-positivos.

Ágar Salmonela-Shigella

Meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a

utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração

negra); possuem componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de

sódio) que inibem microrganismos Gram-positivos.

Meios de Cultura

UTILIDADE

Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella , em

amostras de fezes, alimentos e água.


Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028.

Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: vermelho alaranjado.

Colônias com centro negro (H2S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella .

Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.

Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp.

As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.

As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.

LÖWENSTEINJENSEN

A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo

crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina

(que é positivo para Mycobacterium tuberculosis ).

Meios de Cultura


Esterilização: colocar todos os tubos em estufa;

Crescimento bom a excelente:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618

Mycobacterium avium ATCC 25291


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INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colônias amarelas

Negativo: ausência de crescimento.

PROCEDIMENTOS

Preparação dos ovos:

Reservar os ovos.

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SINOPSE* Assunto: Esterilização - métodos físicos e químicos,

princípios e tipos.

* Pré-requisito: Conceitos básicos de Microbiologia.

* Objetivo: Descrever os principais tipos de esterilização

usados na microbiologia.

* Bibliografia:

1 – Microbiologia Clínica. Murray.

2 – Microbiologia Clínica. Oplustil.

3 - Orientações Gerais para Central de Esterilização. Ministério

da Saúde.


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Definições• Esterilização: destruição ou remoção total dos microrganismos.


• Desinfecção: destruição ou remoção de patógenos (forma

vegetativa).



vegetativa).

• Anti-sepsia: desinfecção da pele, mucosas ou tecidos.



vegetativa).


• Agentes biocidas: agentes que causam a morte dos

microrganismos.



vegetativa).


• Agentes biocidas: agentes que causam a morte dos

microrganismos.

• Agentes biostáticos: agentes que provocam a inibição do

crescimento.

Fatores que influenciam o crescimento microbiano

• Temperatura.

• Tipo de microrganismo.

• Fase de crescimento.

• Ambiente.

Métodos de esterilização e desinfecção

1 - Métodos Físicos

1.1 - Calor – Húmido – Seco

1.2 - Filtração

1.3 - Radiação – Ionizante – Não-ionizante

2 - Métodos Químicos

Compostos fenólicos, álcoois, óxido de etileno,halogêneos, peróxido de hidrogênio.


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Métodos de esterilização e desinfecção – Modos de ação

1 - Dano aos ácidos nucléicos

2 - Desnaturação das proteínas

3 - Inibição do metabolismo

4 - Ruptura da membrana celular

em várias

aqui nessa aula

por desnaturação


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H2O2 H2O + O2

3O2 + O2 2O3 + 2O

H2O2 HO + HO

HO + H2O2 H2O + HO2

H2O2 H2O2*

O produto atua também em

diversos mecanismos de degradação de

aminoácidos e na síntese de glicose,

devido ao ser grande poder oxidante.


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E Desinfectante

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NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards


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ANTIBIOGRAMA

Técnica destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro

frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de Sensibilidade a

Antimicrobianos (TSA).

A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma é a mais difundida e

utilizada até hoje na rotina de análises clínicas, devido a sua praticidade de

execução, baixo custo e confiabilidade de seus resultados.

A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma é a mais difundida e

utilizada até hoje na rotina de análises clínicas, devido a sua praticidade de

execução, baixo custo e confiabilidade de seus resultados.

Apesar de sua relativa simplicidade de execução, a técnica de Kirby e

Bauer exige que as instruções sejam seguidas rigorosamente de forma que os

resultados obtidos correspondam à realidade e possam ser comparados com as

tabelas internacionais.

Retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira cerca de 20-30minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova.

PROCEDIMENTO TÉCNICO

1 - Com uma alça bacteriológica em platinadevidamente flambada e resfriada, tocar na colôniarecente (18 a 24h).

2 - Suspender as colônias em solução salinaestéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvaçãocompatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland(1x106 UFC/mL).

3 - Embeber um swab estéril na suspensão bacteriana,

comprimindo-o contra as paredes do tubo para tirar

o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma

suave em todas direções na placa (cinco direções),

procurando abranger toda a superfície.

4 - Aguardar (não mais que 15 minutos) a superfície

do ágar secar.

5 - Com auxí lio de uma pinça flambada eresfriada, colocar os monodiscos ou multidiscos,sobre a superfície do meio inoculado, exercendouma leve pressão com a ponta da pinça parauma boa adesão dos discos.

6 - Incubar a placa com os discos em estufabacteriológica a 36 ºC por 18 a 24 horas.

7 - Resultados:Com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo

semelhante, medir o diâmetro dos halos inibitórios de

cada disco, e consultar uma tabela apropriada para

determinar se a bactéria em análise é sensível,

intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado.


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Suscetível (S): A categoria S ao antimicrobiano implica que as cepas

sejam inibidas pela concentração usualmente alcançada pelo antimicrobiano nos

tecidos, quando as doses recomendadas do antimicrobiano são utilizadas

adequadamente para o sítio da infecção.

Critérios de interpretação dos resultados

Resistência intermediária (RI): A categoria RI ao antimicrobiano inclui

cepas cujas CIM’s do antimicrobiano se aproximam das concentrações que a droga

atinge no sangue e nos tecidos, e cuja taxa de resposta pode ser menor do que

aquela encontrada para cepas S.


Resistência intermediária (RI): A categoria RI ao antimicrobiano inclui

cepas cujas CIM’s do antimicrobiano se aproximam das concentrações que a droga

atinge no sangue e nos tecidos, e cuja taxa de resposta pode ser menor do que

aquela encontrada para cepas S.

RI implica em eficácia clínica em sítios corpóreos aonde antimicrobiano é

fisiologicamente concentrado ou quando uma dose maior do antimicrobiano que a

dose usualmente recomendada pode ser utilizada (exemplo: altas doses de

penicilina são efetivas no tratamento de pneumonia pneumocócica por uma cepa

com RI).

Resistência (R): A categoria R inclui cepas que não são inibidas pelas

concentrações sistêmicas alcançadas pelo antimicrobiano, quando o esquema usual

de doses do antimicrobiano é utilizado.



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