TGTCATCAAAGATGAGCATGTGCTCATCGGCAAGGACAACCTGGTAACGATGGATATAAAGACGAAGGAG

CTCTCURSOTTGAAGCTTCTGAATCADETCCTGCAACCGACCATGTACGACGACATTCGGGACGCCGCCAGGGAGTGGGTCATCGAAGATAACCTGGACAAGTACTTGVERÃOAGACGTCGTAAAGAAGTTC2011ACACCTTCAAGATGGGCATGCTCCCGCGTGGCGAGGTATTCGTTCACACCAACGAGTTGCACATCGAGCAGGCC

GTCAAGGTCTTCAAAATCTTGTTCTTCGCCAAAGACTTCGACGTGTTCGTCAGGACCGCGTGCTGGCTGA

AGGAGBIOINFORMÁTICACATGTTCGTGTATGCTCTCACCGCCAGIMEGT-CCUSPGGACAGATTGTCGCGGCATCACCCTCCCTGCTCCCTATGAAATCTACCCCTACTTCTTCGTCGACAGCCACGTGATCAACAAG

GCCTTCCTGATGAAGATGACCAAAGCAGCCACTGACCCCATTATCATGGACTACTATGGCATCAAGGTGA

CCGACAAAAACCTGGTCGTGATTGATTGGCGCAAGGGACTCCGTCGCACACTTTCCGAGGACGATCGCAT

CTCTTACTTCACAGAGGATATCRNAsRNAsGACCTTNÃONÃO--CODIFICADORESCODIFICADORESCACATCGACTACCCATTCTGGATGAAGGACAGAGTCATGGACAAACTGAAGATCAGACGTTTTGAGCTATCAGTCCACCTGTATCAACAGA

TCCTCOMCOMTAGATACTACCTGGAGCGTTTGTCCAATGGATTGGGTCCAATTAAGGACTTATCTTGGTACAAACCCAENFOQUEENFOQUEGGGATACTGGCCTTGGTTGAAATTGCACAATGGTATTGEMEMTTGCCTGTCAGATTTAACAACTACGTCATTGCACGCGACAACAACAATGACGTAATCCGTTTGAGCGAAGAGTATGAGAAGATCATTA

GGGAGGCTATTATCAAAGGATmicroRNAsmicroRNAsTTATTGAAATAAGACTTGAACTGAACAACCAGAAGATGGAAGTTCTAGGAAAACTGATCTACGGCAAAATAGACAAACTTGACATTGACAAGATTGTCGTAGACTCT

TACCGTTACCTGCTGATTGTCATGAAAGCCGTTCTTGGTCTTGACACTTTACATTCTGACAAGTACTTCG

TCGTTCCTTCTATCCTGGACCAATACCAGACGGCTCTGCGTGATCCAGTTTTCTACATGCTGCAGAAACG

TATCATTGATTTGGTGAGCTTATTCAAACTGCGTCTGTCTGTGTACACTAAGGAAGAACTCTACTTCCCC

GGAGTAAAGATCGATAATGTAGTGGTTGACAAGCTTGTCACTTACTTTGATGATTACCTGATGGACATAT

CCAATGCCGTATATTTGTCCGAAGAGGAGATGAGGAAGGCCAAATCTGACAAGAAATTTTTGGTTCGCAA

:: Francis de Morais Franco Nunes ::

francis@rge.fmrp.usp.br

DOGMA CENTRAL

DOGMA CENTRAL

intron

exons

Sítios UTR = não-traduzidos (untranslated)

ATG = metionina Stop codon

DNA x RNA x Proteínas

- Requerimentos bioenergéticos mais eficientes para

estocagem de informação e processamento

- Rapidamente ativados, modificados, transportados,

degradados

RNA WORLD

RNA WORLD

degradados

- Conversor Analógico-Digital

- Integra informação genética

mRNA (RNA pol II)

rRNA (RNA pol I)

tRNA (RNA pol III)

Classes de moléculas de RNAprodutos finais

produto intermediário

rRNA tRNA codificador de proteína

Moléculas de RNA (clássicas)

Molécula de rRNA Molécula de tRNA

Transcrição

Molécula de mRNA

Tradução

ProteínaProdutos finais

FUSÃO GÊNICA

FUSÃO GÊNICA 2007

* Inclui sequências de ambas as fitas e loci vizinhos *

RNAs

RNAsBIFUNCIONAIS

BIFUNCIONAIS 2008

p53 - mRNA

RNAs

RNAs

p53 - proteína

N

CDomínio Mdm2

Genes Genes Genes Genes <2%<2%<2%<2% NãoNãoNãoNão----codificador >98%codificador >98%codificador >98%codificador >98%

Genoma humano:

~20,000 genes codificadores de proteína

DNA “LIXO”

DNA “LIXO”

...

>90% do genoma humano é transcrito

Birney et al. 2007 - Nature

Kapranov et al. 2007 – Nature Rev. Genet.

...

74,5%

>90%

GENOMA TRANSCRITO

GENOMA TRANSCRITO

Next-generation sequencing

74,5%

GENOMA TRANSCRITO

GENOMA TRANSCRITO

-Seqs não-repetitivas

- Funcional x “noise” ?

- Numerosas classes de ncRNAs

Nagalakshmi et al. 2008 - Science

- “unnanotated”

-non-protein-coding RNA

- Orquestram TODOS os processos celulares

- Trans-ativação x Cis-ativação (genes vizinhos)

- Expressão diferencial:

Temporal (desenvolvimento)

Non

Non--coding

codingRNA

RNA

Temporal (desenvolvimento)

Espacial (céls/tecidos-específicos)

-Posição: intergênicos, intragênicos, intrônicos, antisense

- Tamanho (arbitrário):

small < 200 nucleotídeos > long

FANTOM3 Consortium (Functional Annotation Of Mouse)

- RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNA) – 100 mil transcritos maiores que

200nt

- A maioria deles:

* 5´CAP

* cauda poliA

* splicing alternativo

* transcrito pelas RNAs: pol II/pol III

Longos

Longos ncRNAs

ncRNAs

- ~1/5 sobrepõem regiões codificadoras na orientação inversa (NATs)

- Expressão de ncRNAs intergênicos ou intrônicos tendem a ser célula ou tecido-

específica, além de responder a sinais ambientais

- Em geral, ncRNAs tem expressão muito menor que dos mRNA (coerente com

função regulatória)

- Falta de conservação de ncRNA não indica ausência de função

SNC e SNP

Mesoderme e

Longos

Longos ncRNAs

ncRNAs

Mesoderme e

céls germinativas

Constitutivos

2009

Short interfering RNAs (siRNAs)

Tamanho = ~21nt

Origem = precursores de RNA de fita dupla (endógenos ou exógenos)

Ação = direcionam a degradação de RNAs alvos, ao se ligarem perfeitamente a esses

Literatura = 1. descritos em plantas, em 1999 (Hamilton and Baulcombe), atuando sobre RNAs virais

2. siRNA endógenos podem silenciar elementos móveis em plantas e animais

PIWI-interacting RNAs (piRNAs)

Tamanho = 28–33 nt

Origem = células da linhagem germinativa. Em Drosophila, recentemente encontrados em células

somáticas. Alguns piRNAs de camundongo se originam de sequencias repetitivas.

Outros tipos = rasiRNAs (repeat-associated RNAs, de23–28 nt) e 21-U RNA

Ação = se associam a proteínas da família PIWI, controlam atividade de transposons em linhagem

germinativa e a viabilidade desta em C. elegans, Drosophila, peixes e mamíferos.

Small nucleolar RNAs (snoRNAs)

Tamanho = 60–300 nt

Origem = Em vertebrados, a maioria é processada de introns. Em plantas e levedura são transcritos de

regiões intergênicas.

Ação = se pareiam a sítios espécificos de RNAs alvos (especialmente os rRNAs) funcionando como guias

(catalisadores) de complexos protéicos específicos que, por sua vez, promovem modificações

nucleotídicas: 2-O-ribose metilação (box C/D) e pseudouridilação (box H/ACA)

Spliced leader RNAs (slRNAs)

Tamanho = ~22 nt

Ação = são transcritos pela RNA polimerase II. Cerca de 70% dos mRNAs de C. elegans são modificados

covalentemente na extremidade 5’ pela adição dessas moléculas. Contribui para a estabilidade e tradução

dos mRNAs alvos.

MicroRNAs: produção científica anual

4992

9888

Fonte: PubMed

0 4 48 107 225 432 6631104

1699

2502

3516

445

MicroRNAs: número de publicações em insetos e organismos-modelo

Fonte: PubMed – Janeiro de 2011

Fonte: PubMed – Julho 2009 x Janeiro 2011

MicroRNAs: número de publicações por assunto

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. 2008.

miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research 36

5395

86199539

10883

1419715172

- MicroRNAs são comuns e abundantes

- Os bancos não estão saturados

218 5931420

34244361

5395

2002 - dez (v. 1.0)

2003 - nov (v. 2.2)

2004 - abr (v. 5.1)

2005 - out (v. 7.1)

2006 - out (v. 9.0)

2007 - dez (v. 10.1)

2008 - set (v. 12.0)

2009 - mar (v. 13.0)

2009 - set (v. 14.0)

2010 - abr (v. 15.0)

2010 - set (v. 16.0)

- Os mais abundantes já foram descobertos para vmosca e humanos

- Em humanos, espera-se mais de 1000 (Bentwich et al. 2005. Nature Genetics 37: 766–770)

- Em C. elegans, a maioria dos microRNAs já foi nocauteada:

National Bioresource Project for the Experimental Animal ‘‘Nematode C. elegans’’

http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp

The C. elegans Gene Knockout Consortium

http://celeganskoconsortium.omrf.org/

lin-14

Two small lin-4 transcripts of approximately 22 and 61 nt were

identified in C. elegans and found to contain sequences

complementary to a repeated sequence element in the 3'

untranslated region (UTR) of lin-14 mRNA, suggesting that lin-4

regulates lin-14 translation via an antisense RNA-RNA interaction.

5´ 3´AAAAAlin-14

lin-4

- Controle do “timing” dos eventos de desenvolvimento pós-embrionário em C. elegans

- Larvas mutantes: perda (atraso) e ganho de função (precocidade)

- Em adultos, ciclo de vida prolonga ( ↑ lin-4 ) ou encurta ( ↓ lin-4 )

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE e Mello CC.

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans

Hibridação in situ

de embriões (F1)

mex-3 dsRNA

selvagem

Caenorhabditis elegans

mex-3 dsRNA

Gônada de adultosGônada de adultos

RNAi(knockdown)

Evidências:

- stRNA = lin-4 e let-7

- RNAi

- tamanho comum entre siRNA e stRNA

- conservação filogenética de let-7

- sobreposição de vias de processamento

- RNAs degradados?- RNAs degradados?

Facilidade:

- Genomas completos

C. elegans (Dez/1998)

D. melanogaster (Mar/2000)

H. sapiens (Fev/2001)

Por que não foram descobertos antes?

- Não possuem padrões típicos de reconhecimento de genes:

ATGATG

Stop codon

ORF

Sítios de splicing (5’ GT-AG 3’)

Drosophila Vertebrados

5/20

loop

hairpin

microRNA

microRNA--Estrutura

Estrutura

stem

hairpin

(fold-back) microRNA

microRNA

Predição + Northern blotPredição + Northern blot

microRNA

microRNA--Cluster

Cluster

microRNA

microRNA

+C

- U

5’ 5’

miR-# = gene mir-#

Letras minúsculas – miRNA altamente homólogos

Traço seguido de número - cópias múltiplas

Variação apenas no precursor

SEMPERE LF et al. 2003. Temporal regulation of microRNA expression in Drosophila melanogaster mediated by hormonal signals and Broad-Complex gene activity.

Expressão Diferencial Temporal

Expressão Diferencial Temporal

ENRIGHT AJ et al. 2003. MicroRNA targets in Drosophila.

mir-jaw: cliva o gene

TPC4 (controle do

desenvolvimento foliar)

Yekta S et al. 2004. MicroRNA-Directed Cleavage of HOXB8 mRNA.

Distribuição

não-randômicanão-randômica

MiR-196–directed cleavage of HOXB8

mRNA.Sequence alignment of the miR-196

complementary site in the 3' UTRs of HOXB8

genes. Absolutely conserved nucleotides are

highlighted in black; Hs, human; Mm, mouse;

Rn, rat; Xl, frog; Dr, zebrafish; Fr, pufferfish.

Yekta S et al. 2004. MicroRNA-Directed Cleavage of HOXB8 mRNA.

90% dos miRNA de C. elegans e C. briggsae são conservados

~ 13% dos miRNA são conservados entre nematóides, insetos e

mamíferos

~ 35% dos genes humanos são regulados por miRNAs

62% C. elegans miRNAs are related to

Drosophila miRNAs

55% C. elegans miRNAs are related to

human miRNAs

55% Drosophila miRNAs are related 55% Drosophila miRNAs are related

to human miRNAs

mRNA

miRNA

rRNA

miRNA

5,8 S rRNA

mRNAtRNA

miRNA.org scoresmiRNA.org scores

A : U = 5

G : C = 5

G : U = 1

Outros “pareamentos” (mismatches) = - 3

Fig. Watson–Crick G·C and A·U base pairs differ from wobble G·U pairs.

http://www.mirbase.org/

Regulação por microRNAs é uma característica Regulação por microRNAs é uma característica

ancestral das células eucarióticasancestral das células eucarióticas

Fungos:

- sem evidências de miRNAs- sem evidências de miRNAs

(estrutural ou homologia)

- possuem RNAi

Biogênese

LAI EC. 2003. microRNAs: Runts of the Genome Assert Themselves

maduro

~70nt~70nt

Helicase Drosha = RNase IIIDrosha = RNase III

DGCR8 e TRBP = DGCR8 e TRBP =

ligantes de dsRNAligantes de dsRNA

RISC = RNARISC = RNA--induced induced

Silencing ComplexSilencing Complex

Complexo RNP (miRNP)Complexo RNP (miRNP)

5´

5´

5´

5´poliApoliA

Raridades:Raridades:

Em plantas - clivagem possível até 5 mismatches

Em animais - pareamentos imperfeitos também induzem clivagem dos transcritos

5´ 5´

poliA5´5´

5´5´

poliA

5´

3´

“SEEDS”: “SEEDS”: nucleotídeosnucleotídeos 22--7 7 ouou 22--8 8 dada extremidade 5extremidade 5´́ dos dos miRNAmiRNA

-- Sugerem alguma especificidade Sugerem alguma especificidade entre mRNA::miRNA

- Muito usadas em predições

5´

3´

Insect microRNAs: Structure, function and evolution

Susanta K. Behura

Insect Biochem Mol Biol. 2007 Jan;37(1):3-9.

1. Exon

2. Intron

Altuvia Y et al. 2005. Nucleic Acids Research 33: 2697–2706

2. Intron

CC = commitment complexCC = commitment complex

HUMANOSHUMANOS

Os diversos “MIRtrons” (derivados de introns) estão envolvidos

na manutenção da integridade genômica:na manutenção da integridade genômica:

- eliminação de genes invasores – sistema de defesa intracelular

- reprimir expressão gênica indesejada associada com a

evolução do genoma celular

Proteínas

MADS boxMADS box

5´ 3´

miRNA

3´ 5´

AS miRNA

DorsalDorsal

AnteriorAnterior PosteriorPosterior

VentralVentral

AnteriorAnterior PosteriorPosterior

Expressão Diferencial Espacial

Regulação fina – espacial e temporal

COOK HA et al. 2004. The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification.

Model for miRNA Function in Embryonic Axis SpecificationThe miRNA miR-280 is predicted to form a duplex with conserved sites in the 3′ UTR of D. melanogaster and D. pseudoobscura osk mRNA (A)

and kinesin heavy chain mRNA (B) and transcripts encoding additional cytoskeletal proteins that function during oogenesis (Stark et al., 2003 ).

We speculate that the RNA silencing system functions with miR-280 and perhaps other miRNAs to coordinately regulate translation of osk mRNA

and additional cytoskeletal targets during the initial stages of embryonic axis specification.

Pesquisas: fenótipos aberrantes e variáveis

Flexibilidade de mecanismos reguladores

Especula-se que miRNAs expressos no cérebro

impedem a degradação de certos mRNA e

preparam esses transcritos para uma rápida

tradução em resposta a estímulos externos

mRNA maternos

Ativação

do genoma

zigótico

mRNA maternos

presentes nos

ovócitos desde a

ovogênese