ATIVAÇÃO OSMÓTICA DE NEURÔNIOS OCITOCINÉRGICOS …livros01.livrosgratis.com.br/cp033288.pdf · submetidas à ovariectomia bilateral (ratas OVX) e colocadas em um aparelho estereotáxico

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

ATIVAÇÃO OSMÓTICA DE NEURÔNIOS

OCITOCINÉRGICOS MEDIADA POR

ANGIOTENSINA I I E ESTERÓIDES

OVARIANOS EM RATAS

ORIENTADOR: PROF. DR. CELSO RODRIGUES FRANCI

PÓS-GRADUANDO: WALDECY DE LUCCA JUNIOR

Ribeirão Preto

2006

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

2

WALDECY DE LUCCA JUNIOR

ATIVAÇÃO OSMÓTICA DE NEURÔNIOS

OCITOCINÉRGICOS MEDIADA POR

ANGIOTENSINA I I E ESTERÓIDES

OVARIANOS EM RATAS

Tese apesentada ao Programa de Pós-graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo – para obtenção de título em Doutor em Ciências Fisiológicas Orientador: Celso Rodrigues Franci

Ribeirão Preto

2006

3

FICHA CARTOGRÁFICA

de Lucca, Waldecy Junior Ativação osmótica de neurônios ocitocinérgicos mediada por angiotensina II

e esteróides ovarianos em ratas. Ribeirão Preto, 2006 69f.;30cm

Tese apesentada ao Programa de Pós-graduação em Fisiologia da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo Orientador: Franci, Celso Rodrigues 1. Ocitocina. 2. c-Fos, 3. Estímulo Osmótico. 4. Estrógeno e Progesterona. 5.

Angiotensina. 6. Núcleo Preóptico Mediano. 7. Núcleo Paraventricular. 8.núcleo supraóptico.

4

À minha família e a todas as

pessoas que “ vivenciaram”

de alguma forma essa fase da

minha vida ...

5

AGRADECIMENTOS

Ao professor Doutor Celso Rodrigues Franci por oferecer-me o essencial para vida, a

FFOORRMM AAÇÇÃÃOO.

Ao Professor Doutor João Kazuyuki Kajiwara pelos conhecimentos, ensinamentos e

iniciação ao universo da inclusão digital.

Á Professora Doutora Janete Aparecida Anselmo Franci pela sensibilidade, apoio e

também pelo microscópio de imunofluorescência.

Às Professoras Doutoras Elizabeth Spinelli e Maria José Alves da Rocha pela minha

iniciação ao universo da ciência.

A todos os membros da banca pela dedicação e contribuição para a conclusão desse

trabalho e, principalmente, para minha formação.

À Sônia Aparecida Zanon pelo companheirismo, ensinamentos e auxílio em tudo que

fez por mim, sem os quais seria impossível a conclusão desse trabalho.

Ao Rubens Fernando de Melo pelo apoio, companheirismo, lições e auxílios na

histologia, sem os quais seria impossível a conclusão desse trabalho.

Ao Rogério pela sabedoria, experiência, presteza, boa vontade, delicadeza,

sinceridade, sensibilidade, graciosidade e pelos camarões e pescarias em alto mar.

À Elisa e à Claudia pela constante atenção, apoio e cuidados ao longo desses anos.

Ao Leo e ao Eduardo pelo cuidado com os animais e pela amizade.

Ao MEU MELHOR amigo Leandro pelo companheirismo, sinceridade e

principalmente pelo APOIO.

À amiga Fernanda pelas diversas vezes e formas de ajuda e pelo constante apoio e

incentivo durante a execução desse trabalho.

Às amigas Claudia e Cleide pela assistência, companheirismo e principalmente pelos

momentos felizes nesses anos de trabalho.

Às amigas, Maristela, Adriana e Fabiana pelo apoio e incentivo através das idéias.

Aos amigos Bruno, Marcio, Rildo, Valtão, Mateus, Felipe, Valdir, Daniel Penteado,

Daniel Zocal, Jose, Leni, Gisela, Guillermo, Rafael, Garcia, Camoles e Maicon pelo apoio e

sinceridade.

Enfim, às ratas...

6

Essa pesquisa foi realizada com recursos e Bolsa de estudos da

FAPESP

7

Essa pesquisa foi realizada em uma

UNIVERSIDADE PÚBLICA

Muito obrigado

UNIVERSIDADE

DE SÃO PAULO

8

ÍNDICE

ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES......................................................................................... 10

ABSTRACT...................................................................................................................... 11

RESUMO.......................................................................................................................... 12

INTRODUÇÃO................................................................................................................ 13

Circuitos de controle do balanço hidroeletrolítico. ..............................................................14

MATERIAL e MÉTODOS............................................................................................... 23

Animais.....................................................................................................................................23

Protocolo exper imental. ..........................................................................................................23 Experimento I .......................................................................................................................................23 Esquema do protocolo experimental I .................................................................................................24 Experimento II .....................................................................................................................................25 Esquema do protocolo experimental II ................................................................................................26

Coleta de sangue e cérebro. ....................................................................................................26

Extração e dosagem de OT. ....................................................................................................27

Dosagens de LH e FSH............................................................................................................28

Dupla imunofluorescência. .....................................................................................................28

Aquisição das imagens. ...........................................................................................................30

Análise das imagens.................................................................................................................31

Análise estatística.....................................................................................................................32

RESULTADOS................................................................................................................. 33

Exper imento I – Localização do sítio de microinjeção........................................................33

Exper imento I – Dosagens hormonais. ..................................................................................33 Dosagem de OT ..................................................................................................................................33

a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................33 b) Microinjeção de Losartan...........................................................................................................34 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................34

Dosagem de LH ..................................................................................................................................34 a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................34 b) Microinjeção de Losartan...........................................................................................................35 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................35

Dosagem de FSH. ...............................................................................................................................36 a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................36 b) Microinjeção de Losartan...........................................................................................................36 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................36

Exper imento I – Dupla imunofluorescência..........................................................................38 a) Análise da porcentagem de neurônios LHRHérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos na MPOA. .....................................................................................................................................38 b) Análise da porcentagem de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos. ......................................................................................................................................................39

Exper imento I I – Localização da lesão por ácido ibotênico ................................................45

9

Exper imento I I – Dosagens hormonais.................................................................................45 Dosagem de OT ..................................................................................................................................45

a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................45 b) Lesão ibotênica...........................................................................................................................46 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................46

Dosagem de LH ..................................................................................................................................46 a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................46 b) Lesão ibotênica...........................................................................................................................47 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................47

Dosagem de FSH ................................................................................................................................47 a) Estímulo osmótico.......................................................................................................................47 b) Lesão ibotênica...........................................................................................................................48 c) Terapia hormonal substitutiva ....................................................................................................48

Exper imento I I – Contagem neuronal ...................................................................................50

DISCUSSÃO.................................................................................................................... 57

BIBLIOGRAFIA.............................................................................................................. 70

10

ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES

DP/OT porcentagem de neurônios OT marcados para OT e c-Fos FSH hormônio folícular estimulante hs horas LH hormônio luteinizante MnPO núcleo preóptico mediano MPOA área preóptica medial OT ocitocina OVLT órgão vasculoso da lâmina terminal OVX ratas ovariectomizadas OVX + O ratas ovariectomizadas tratadas comóleo OVX + T ratas ovariectomizadas tratadas com estrógeno e progesterona PaAC região comissural anterior do PVN PaLM região magnocelular lateral do PVN PaMM região magnocelular medial do PVN PeM região periventricular do PVN PVN núcleo paraventricular PVNm conjunto de todas as regiões magnocelulares do PVN SFO órgão subfornicial SON núcleo supraóptico SONa região anterior do SON SONm região medial do SON SONp região posterior do SON TFS tampão fosfato (10mM) salina (0,15M) TH terapia hormonal substitutiva

11

ABSTRACT Angiotensinergic afferents from circunventricular organs pass by the median preoptic nucleus (MnPO) and project for paraventricular (PVN) and supraoptic (SON) nucleus to modulate the oxytocin (OT) release induced by osmotic stimulation. This modulation is changed by ovarian steroids. So, the purpose of this study was to analyze the participation of the MnPO and ovarian steroids on the OT secretion and the c-Fos activation of oxytocinergic neurons in the PVN and SON induced by osmotic stimulus. After at least three regular cycles, female Wistar rats were submitted to bilateral ovariectomy (OVX rats) and placed in a stereotaxic apparatus for implantation of stainless cannula in the MnPO (experiment I) or for microinjection of ibotenic acid in the MnPO (experiment II). After 5 days, the animals received hormonal therapy (HT) with subcutaneous injections of estradiol benzoate or vehicle (corn oil) at 10 a.m. during three days. On the fourth day, at 10 a.m, they received a subcutaneous injection of progesterone or vehicle. Following, the animals of experiment I received a microinjection of Losartan in the MnPO at 5 p.m and 10 minutes after they received intraperitoneal injection of hypertonic or isotonic saline and, the animals of experiment II received, at 5 p.m, intraperitoneal injection of hypertonic or isotonic saline. After 30 minutes of these intraperitoneal injections, the blood was collected for determination of plasma OT, luteinizing hormone (LH), follicular stimuli hormone (FSH) and the brains were perfused and crioprotected for double immuno-histochemistry processing to c-Fos and OT in the PVN and SON as well as c-Fos and LHRH in the medial preoptic area (MPOA). The OT secretion induced by osmotic stimulus was not altered by HT, by Losartan, or by ibotenic acid microinjection in the MnPO. LH secretion induced by HT in OVX rats was reduced by osmotic stimulus and ibotenic lesion in the MnPO but not by Losartan microinjection in the MnPO. FSH secretion induced by HT in OVX rats was not modified by any studied condition. LHRH neurons in the MPOA did not label c-Fos protein in response to the osmotic stimulus. The average percentage of c-Fos positive OT neurons induced by osmotic stimulus was not alter in the SON and lateral magnocelular (PaLM) region of PVN by ibotenic acid and or Losartan microinjection in the MnPO of OVX and OVX + HT rats. On the other hand, it was reduced in the anterior periventricular (PeM) and medial (PaMM) magnocelular regions of PVN by Losartan microinjection in the MnPO of OVX + HT rats and by ibotenic lesion in the OVX rats, as well in the anterior commissural magnocelular region (PaAC) of the PVN by ibotenic lesion in the MnPO of OVX + HT rats. In conclusion, the activation of OT magnocelular neurons by osmotic stimulus in the SON and PaLM in the PVN does not depend on MnPO and their AT1 receptors, as well it is not modulated by ovarian steroids. However, this activation in the other magnocelular regions of PVN (PeM, PaAC and PaMM) involves the MnPO and their AT1 receptors depending on ovarian steroids.

12

RESUMO

Aferências angiotensinérgicos que partem de órgãos circunventriculares, passam pelo núcleo preóptico mediano (MnPO) e atingem aos núcleos paraventricular (PVN) e supraóptico (SON) para modular a secreção de ocitocina (OT) induzida pelo estímulo osmótico. Essa modulação é modificada pelos esteróides ovarianos. O objetivo deste trabalho foi analisar a participação do MnPO e dos esteróides ovarianos na secreção de OT e na marcação da proteína c-Fos em neurônios ocitocinérgicos no PVN e SON induzidas por estímulo osmótico. Após três ciclos regulares, ratas Wistar foram submetidas à ovariectomia bilateral (ratas OVX) e colocadas em um aparelho estereotáxico para a implantação de cânula no MnPO (experimento I) ou para microinjeção de ácido ibotênico no MnPO (experimento II). Passados 5 dias, as ratas receberam terapia hormonal (TH) com injeções subcutâneas transmusculares de cipionato de estradiol (25 g / dia) às 10:00 hs nos três primeiros dias de terapia e no quarto dia receberam apenas uma injeção de progesterona (2 mg) às 10:00 hs. O grupo controle recebeu apenas injeções transmusculares de veículo oleoso (óleo de milho Mazola – Cargil Agricola® S.A.) às 10:00 hs durante os quatro dias. Às 16:00 h do quarto dia, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de salina hipertônica ou isotônica. 30 minutos após essas injeções, o sangue foi coletado para dosagem de OT, hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) no plasma, e os cérebros foram perfundidos e crioprotegidos para o processamento de dupla imunofluorescência para c-Fos e OT no PVN e SON, assim como c-Fos e LHRH na área preóptica medial (MPOA). A secreção de OT induzida pelo estímulo osmótico não foi alterada pela TH, pelo Losartan ou microinjeção de ácido ibotênico no MnPO. A secreção de LH induzida pela TH em ratas OVX foi reduzida pelo estímulo osmótico e pela lesão ibotênica do MnPO, mas não pela microinjeção de Losartan no MnPO. A secreção de FSH induzida pela TH em ratas OVX não foi modificada por nenhuma das condições experimentais estudadas. Os neurônios LHRH na MPOA não apresentaram marcação positiva para c-Fos em resposta ao estímulo osmótico. A porcentagem média de marcação c-Fos em neurônios OT induzida pelo estímulo osmótico não foi alterada no SON e na região magnocelular lateral (PaLM) do PVN pela lesão ibotênica e pela microinjeção de Losartan no MnPO de ratas OVX e OVX + TH. Por outro lado, ela foi reduzida nas regiões magnocelulares periventricular (PeM) e medial (PaMM) do PVN pela microinjeção de Losartan no MnPO de ratas OVX + TH e pela lesão ibotênica no MnPO de ratas OVX, assim como na região magnocelular comissural anterior (PaAC) do PVN também pela lesão ibotênica no MnPO. Portanto, a ativação de neurônios magnocelulares OT no SON e na região PaLM do PVN pelo estímulo osmótico não depende do MnPO e seus receptores AT1, e não é modulada pelos esteróides ovarianos. Entretanto, essa ativação em outra regiões magnocelulares do PVN (PeM, PaAC e PaMM) envolve o MnPO e seus receptores AT1 e é modulada pelos esteróides ovarianos.

13

INTRODUÇÃO A sobrevivência e a procriação são imposições primordiais aos organismos

biológicos. Para satisfazer essas determinações, um animal precisa coordenar processos

fisiológicos complexos sob diversas condições ambientais para elaborar respostas

adaptativas apropriadas a estímulos específicos. Por isso, a manutenção da homeostase

representa um mecanismo de adaptação que depende da integração endócrina, visceral e

de mecanismos de controle somatomotor (SIMERY, 2004). Esses ajustes dependem de

circuitos neurais desenvolvidos por um processo evolutivo em um ambiente primordial

com pressões seletivas muito distintas do ambiente em que se encontra o Homem hoje.

Como no ambiente primordial a oferta de alimentos era bem mais escassa que hoje,

nossos circuitos tornaram-se adaptados, ao longo do processo de seleção natural, à busca

incessante por alimentos. Entretanto, ironicamente, sofremos agora para nos adaptar a um

novo ambiente com excesso de oferta não apenas de alimento, mas principalmente de

determinados componentes dos alimentos, como o sal, a gordura e o açúcar. Entender

como nossos circuitos neurais interagem para processar as informações pertinentes às

necessidades fisiológicas por esses componentes nutricionais faz-se crucial para nossa

própria adaptação a esses novos desafios impostos pelo ambiente atual, dado o número de

pessoas acometidas de diversas doenças decorrentes do abuso de ingestão alimentar com

esses nutrientes concentrados. A hipertensão arterial decorrente do excesso do consumo

de sal, bem como outros diversos desajustes fisiológicos decorrentes dessa dificuldade de

adaptação a esse ambiente com grande oferta de sal afetam milhões de pessoas em todo

mundo. Dessa forma, o estudo das bases fisiológicas e dos circuitos neurais que

controlam o balanço hidro-eletrolítico poderá ajudar a compreender melhor esses

desajustes decorrentes dessas inadequações comportamentais.

14

Circuitos de controle do balanço hidroeletrolítico.

A manutenção da homeostase hidro-eletrolítica por meio de mecanismos de

controle da excreção de eletrólitos e do comportamento de ingestão de sais representa

uma adaptação que depende da integração endócrina, visceral e do controle somatomotor.

Uma literatura extensa descreve a importância do hipotálamo para mediar essas

integrações. Na região preóptica-hipotalâmica, a área ântero - ventral do terceiro

ventrículo (AV3V) e a lâmina terminal constituem circuitos compostos por diversos

núcleos para modular os ajustes do balaço hidro-eletrolítico (ANDERSON; BRUNI;

KAUFMANN, 1990; JARRARD; DAVIDSON, 1991).

A região AV3V é constituída pelo núcleo preóptico mediano (MnPO), órgão

vasculoso da lâmina terminal (OVLT) e a região periventricular preóptica anterior. O

MnPO possui uma região anterior com disposição dorsomedial à área preóptica e outra

região posterior dividida pela comissura anterior em regiões dorsal (acima da comissura

anterior) e ventral (abaixo da comissura anterior). O OVLT dispõe-se em posição

ventromedial à porção anterior do MnPO. Essa região faz conexões extensas com áreas

do tronco cerebral, hipotálamo e sistema límbico para controle da ingestão de água, do

apetite ao sódio, da secreção de hormônios e da pressão arterial. A lesão desta área atenua

a hipertensão experimental (BUGGY et al., 1978), a hipernatremia crônica

(VALLADAO et al., 1992), as secreções de peptídeo natriurético atrial (ANTUNES-

RODRIGUES et al., 1991) e ocitocina (OT)(MORRIS et al., 1994), a ingestão de água e

sódio (ROCHA et al., 1999) e o aumento da pressão arterial em resposta ao estímulo

15

osmótico (PEDRINO et al., 2005), à variação de volume (HINOJOSA-LABORDE;

THUNHORST; COWLEY, JR., 1990) e à angiotensina II (AII) de origem

periférica(MARSON et al., 1981; FINK; BRYAN, 1982).

A lâmina terminal é composta pelo órgão subfornicial (SFO), MnPO e OVLT. O

SFO é uma estrutura circunventricular localizada ventralmente à comissura hipocampal

na confluência dos ventrículos laterais e da região anterior do terceiro ventrículo. Os

circuitos neurais compostos pelos núcleos da região AV3V e da lâmina terminal

projetam-se para o núcleo paraventricular (PVN) para mediar a atividade secretora de

neurônios magnocelulares vasopressinérgicos e ocitocinérgicos (ANDERSON; BRUNI;

KAUFMANN, 1990). Esse circuito participa do controle da ingestão de água e sódio e é

sensível à ação da AII, que ao ser injetada diretamente no SFO e no OVLT provoca

elevação rápida da ingestão de água seguida do acréscimo do consumo de sódio (FITTS;

MASSON, 1990; FITTS; TJEPKES; BRIGHT, 1990).

Os neurônios do MnPO também são estimulados por projeções

angiotensinérgicas, as quais partem do SFO e atingem aos neurônios vasopressinérgicos e

ocitocinérgicos do PVN (KADEKARO et al., 1992; JOHNSTON; WAES; TEMPLIN,

1992). Vários trabalhos corroboram essa constatação, visto que tanto a ingestão de água

induzida pela microinjeção de AII no SFO como a ativação de neurônios magnocelulares

do PVN provocada por microinjeção de AII ou estimulação elétrica no SFO são

reduzidas pela microinjeção prévia de saralasina, um antagonista de AII, no MnPO

(TANAKA, 1989).

Através dessa circuitaria, o MnPO participa da manutenção do balanço hidro-

eletrolítico. A microinjeção de AII no MnPO próximo ao OVLT causa aumento da

16

ingestão de água e sódio (FITTS; MASSON, 1990; FITTS; TJEPKES; BRIGHT, 1990)

enquanto a microinjeção de ácido ibotênico, uma neurotoxina capaz de lesar corpos e

preservar as fibras neuronais de passagem (HERMAN; WIEGAND, 1986; JARRARD;

DAVIDSON, 1991; WINN et al., 1991), no MnPO provoca redução tanto da ingestão de

água induzida pela AII subcutânea ou salina hipertônica 3% e 6% (CUNNINGHAM et

al., 1992; CUNNINGHAM et al., 1991) como do apetite ao sódio estimulado por

captopril oral (FITTS; MASSON, 1990; FITTS; TJEPKES; BRIGHT, 1990), ou por

depleção de sódio (DE LUCCA JR W; FRANCI, 2004). Além disso, a microinjeção de

losartan, um bloqueador de receptores AT1 para AII, no MnPO bloqueou a ingestão de

salina isotônica induzida por depleção de sódio, enquanto que a microinjeção de AII na

mesma estrutura estimulou a ingestão de água (DE LUCCA JR W; FRANCI, 2004).

Dessa forma, evidencia-se a participação do MnPO e de seus receptores AT1 para AII nos

circuitos para o controle da ingestão de água e sódio.

A OT é sintetizada por neurônios magnocelulares e parvocelulares do PVN e do

núcleo supraóptico (SON). Em adição às suas ações conhecidas, estimulação da

contração uterina e ejeção de leite, a OT participa do controle do balanço hidro-

eletrolítico, pois tem ação natriurética (VERBALIS; MANGIONE; STRICKER, 1991),

inibe o apetite ao sódio (STRICKER; VERBALIS, 1996) é secretada em resposta ao

estímulo osmótico (MORRIS; BARNARD, JR.; SAIN, 1984) e tem a transcrição de seu

gene elevada em resposta à sobrecarga salina (MORRIS et al., 1994). Essa participação

da OT no balanço hidro-eletrolítico possivelmente depende de núcleos da região AV3V,

visto que a lesão dessa região reduz a liberação de OT em resposta ao estímulo

osmótico (BLACKBURN; LENG; RUSSELL, 1987). Entretanto, a secreção de OT em

17

resposta à sucção mamária não é alterada pela lesão da AV3V (BLACKBURN; LENG;

RUSSELL, 1987), indicando que o controle da secreção de OT em resposta à sucção

mamária possivelmente não depende da região AV3V.

A secreção de OT é estimulada em condições que elevam a osmolaridade

plasmática (STRICKER; VERBALIS, 1996). Por isso, sua ação no balanço hidro-

eletrolítico consiste tanto em estimular a excreção de sódio nos rins diretamente

(CONRAD et al., 1993; VERBALIS; MANGIONE; STRICKER, 1991) e

indiretamente, via ANP (MCCANN et al., 1994; CHRIGUER; ANTUNES-

RODRIGUES; FRANCI, 2003), bem como em inibir a ingestão de sódio

(FITZSIMONS, 1998; STRICKER; VERBALIS, 1996; STRICKER; VERBALIS,

1986; CHOW et al., 1997; STRICKER; VERBALIS, 1987; THUNHORST; MORRIS;

JOHNSON, 1994). A AII estimula uma abrupta ingestão de água, seguida da ingestão

de sódio (CUNNINGHAM et al., 1992; CUNNINGHAM et al., 1991). Entretanto, a AII

pode elevar a secreção de OT quando microinjetada no MnPO de animais submetidos à

depleção de sódio ou que receberam injeção intraperitoneal (2 ml/100g) de salina

isotônica (DE LUCCA JR W; FRANCI, 2004). Por isso, o atraso do início da ingestão

de sódio em relação à ingestão de água deflagradas pela AII pode ser devido à ação

inibitória da OT sobre a ingestão de sal, visto que a AII estimula a secreção de OT

(STRICKER; VERBALIS, 1996). Entretanto, em animais submetidos à injeção

intraperitoneal (2 ml/100g) de salina hipertônica (NaCl - 0,5 M) observa-se redução da

secreção de OT após a microinjeção de AII no MnPO (DE LUCCA JR W; FRANCI,

2004), sugerindo uma atividade inibitória da AII sobre a secreção de OT em condição

de hipertonicidade. Outros trabalhos também apontam evidências a favor dessa

18

hipótese, Ferguson e Kasting (1988) relatam que animais com lesão rostral do SFO

apresentaram uma concentração basal elevada de OT, comparada à dos animais com

lesão caudal ou animais intactos. Como nessa região rostral está a maioria das

eferências que partem do SFO (LIND; VAN HOESEN; JOHNSON, 1982; MISELIS,

1981), e como tais eferências para o MnPO e PVN são possivelmente

angiotensinérgicas (TANAKA, 1989; TANAKA; NOMURA, 1993), é possível supor

que uma via angiotensinérgica inibitória dessa região do SFO para o MnPO poderia

modular a secreção de OT por neurônios do PVN (DE LUCCA JR W; FRANCI, 2004).

Assim sendo, caracteriza-se a participação de vias angiotensinérgicas que passam pelo

MnPO no controle da secreção de OT e que podem ser diferencialmente moduladas na

condição de hipertonicidade.

Os órgãos circunventriculares e o MnPO participam tanto do balanço hidro-

eletrolítico como do controle da reprodução em animais com ovulação espontânea

através de vias angiotensinérgicas e ocitocinérgicas. Estruturas circunventriculares

como o OVLT, SFO e o órgão subcomissural estão envolvidas no controle da secreção

de gonadotrofinas (SAMSON; MCCANN, 1979; WENGER; KERDELHUE; HALASZ,

1979; PIVA; LIMONTA; MARTINI, 1982; LIMONTA et al., 1981; KIZER;

PALKOVITS; BROWNSTEIN, 1976; SAMSON et al., 1980; LAMPERTI; PICKARD,

1984). Estudos com lesão no OVLT (PIVA; LIMONTA; MARTINI, 1982) e SFO

(LIMONTA et al., 1981) sugerem que essas estruturas participam do controle cíclico,

mas não tônico, da liberação de gonadotrofinas.

Rosas-Arellano et al. (ROSAS-ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO,

1999) utilizando imuno-histoquímica, observaram em neurônios próximos à região

19

desprovida de barreira hemato-encefálica do SFO de ratas ovariectomizadas tratadas ou

não com estrógeno, a dupla marcação de receptores para estrógeno e AII (AT1).

Relataram também que o grupo de ratas ovariectomizadas apresentou maior número de

neurônios imunorreativos para receptores de AII, de estrógeno ou ambos comparado ao

grupo de ratas ovariectomizadas tratadas com estrógeno, sugerindo uma modulação

inibitória do estrógeno circulante sobre a expressão desses receptores.

Na região preóptica, corpos de neurônios imunorreativos à AII estão presentes

na área preóptica lateral e medial e no núcleo preóptico periventricular. Muitas fibras

imunorreativas à AII ou que possuem receptores AT1 estão presentes no MnPO

(PLUNKETT et al., 1987), ao passo que as área preóptica lateral e medial contém

densidade baixa de fibras (BUNNEMANN; FUXE; GANTEN, 1993). Dornelles &

Franci (1998a) estudaram o efeito do losartan, antagonista seletivo do AT1, na área

preóptica medial (MPOA) de ratas ovariectomizadas, tratadas ou não com estrógeno,

sobre a liberação de hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e

prolactina. Concluíram que a ação estimulatória ou inibitória de AII na MPOA

respectivamente sobre a secreção de LH e prolactina é facilitada por esteróides gonadais

e ocorre através de receptores AT1. Dessa forma, a modulação do estrógeno sobre os

receptores AT1 parece modificar-se em função da região ou núcleo em que atua.

Steele et al. (1992), utilizando a técnica de microdiálise, estudaram o efeito da

AII sobre a liberação de hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH) na

adeno-hipófise e de LH no plasma de ratas ovariectomizadas tratadas ou não com

estrógeno e progesterona. Verificaram, com isso, o efeito estimulatório da AII sobre a

secreção de LHRH e LH aos 15 minutos após a infusão de AII apenas nas ratas com

20

reposição hormonal.

O trabalho de Phillips et al. (1993) testou a hipótese da AII estar envolvida com

a liberação pré-ovulatória de LH no proestro, avaliando as variações hipotalâmicas de

AII em ratas tratadas com estrógeno e progesterona. Os autores observaram, em ratas

ovariectomizadas tratadas com estrógeno, um aumento de AII no hipotálamo e no

liquido cérebro espinhal às 13:30 hs e 14:30 hs, indicando a presença de picos de AII

antes do pico de LH. Assim, os neurônios que expressam AII integram o circuito

hipotalâmico responsável pela estimulação do pico de LH nas ratas castradas tratadas

com esteróides gonadais.

A OT e a vasopressina também estão presentes em neurônios do sistema

neurossecretório parvocelular (VANDESANDE; DIERICKX; DE, 1977) de núcleos

hipotalâmicos, que se projetam para a camada externa da eminência mediana (LECHAN;

NESTLER; JACOBSON, 1982) e influenciam a secreção de hormônio do crescimento,

hormônio adrenocorticotrófico, LH e prolactina (ANTUNES-RODRIGUES et al., 1991;

SAMSON; LUMPKIN; MCCANN, 1986; FRANCI et al., 1993; LUMPKIN; SAMSON;

MCCANN, 1987). Esses dados podem explicar como a administração de OT em ratas no

proestro antecipou o pico de secreção do LH e a ovulação, enquanto antagonistas de OT

inibiram este pico (ROBINSON; EVANS, 1990). Talvez a OT possa influenciar a

liberação de LH estimulando neurônios produtores de hormônio liberador do hormônio

luteinizante no hipotálamo de ratas (JOHNSTON; WAES; TEMPLIN, 1992).

No entanto, os esteróides ovarianos também podem influenciar o balanço de

líquidos indiretamente, modulando sistemas hormonais que regulam tanto o consumo

quanto a excreção de água, como é o caso do sistema hipotálamo neuro-hipofisário.

21

Durante o ciclo estral de ratas, observou-se variação no balanço de líquidos, com

diminuição no consumo de água e alimento, no fluxo urinário e taxa de excreção de sódio

durante o proestro e estro (FORSLING; PEYSNER, 1988; CROCKER; HINSULL,

1972), bem como a elevação da concentração plasmática de sódio e da osmolalidade

plasmática com diminuição do hematócrito durante o proestro (CALIGIONI; FRANCI,

2002). Outros estudos mostram variação da liberação de OT no PVN, SON, neuro-

hipófise, sangue porta-hipofisário e plasma durante o ciclo estral de ratas, acompanhada

do aumento da atividade ocitocinérgica durante o proestro (GREER et al., 1986;

CROWLEY et al., 1978; SARKAR; GIBBS, 1984; WINDLE; FORSLING, 1993).

Além dessas variações da síntese de OT no ciclo estral, a expressão de seu RNAm

em neurônios magnocelulares do PVN aumenta no início da puberdade, diminui após a

castração (MILLER et al., 1989) e varia também durante o ciclo estral (VAN TOL et al.,

1988), sugerindo uma possível ação do estrógeno na sua expressão. De fato, vários

trabalhos indicam uma provável modulação dos esteróides gonadais sobre a secreção de

OT. A administração de estrógeno estimula a liberação periférica de OT, aumenta a

atividade elétrica e altera a organização estrutural de corpos celulares e dendritos de

neurônios ocitocinérgicos (AMICO; SEIF; ROBINSON, 1981; NEGORO;

VISESSUWAN; HOLLAND, 1973; CALDWELL et al., 1988). Porém, apesar da

associação de estrógeno com progesterona potencializar a secreção de OT em resposta à

hipertonicidade, o aumento da secreção de OT na tarde de proestro parece não depender

da ação direta de estrógeno e progesterona, mas provavelmente de algum outro fator de

origem ovariana (CALIGIONI; FRANCI, 2002). Assim, parece haver duas vias distintas

para o controle da secreção de OT, uma em função de alterações hormonais durante o

22

ciclo estral e outra em função de alterações da osmolalidade plasmática. Porém, não se

pode descartar alguma possível interação dessas duas vias (CALIGIONI; FRANCI,

2002). Os prováveis mecanismos ou vias pelos quais os esteróides gonadais modulam os

neurônios ocitocinérgicos não são conhecidos. Assim, o objetivo do presente trabalho é

verificar a possível participação do MnPO e seus receptores AT1 para AII na

potencialização da secreção de OT provocada pelo estímulo osmótico e provavelmente

modulada pelos esteróides ovarianos.

23

MATERIAL e MÉTODOS

Animais. Neste trabalho foram utilizadas ratas Wistar fêmeas pesando cerca de 200 g

provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto - USP. Esses animais

foram mantidos no Biotério do Departamento de Fisiologia da FMRP-USP durante uma

semana para aclimatação em um ciclo claro-escuro de 12:00 hs / 12:00 hs (claro das 6:00

hs às 18:00 hs), à temperatura de 21 ± 1 °C e acesso livre à ração balanceada e água.

Protocolo exper imental.

O ciclo estral das ratas foi monitorado diariamente utilizando a técnica do

esfregaço vaginal e apenas os animais que apresentaram pelo menos três ciclos

regulares foram utilizados nos experimentos I e II.

Experimento I

As ratas em metaestro foram anestesiadas com uma injeção intraperitoneal (1

mL / 100 g de peso corporal) de hidrato de cloral (35 mg / 100 g) em salina isotônica,

submetidas à ovariectomia bilateral e posteriormente posicionadas no aparelho

estereotáxico para a implantação de uma cânula permanente no MnPO. As seguintes

coordenadas estereotáxicas foram utilizadas: 0,3 mm anterior ao bregma, 0 mm latero-

lateral e 6,2 mm dorso-ventral a partir da calota óssea. Após as cirurgias, as ratas

permaneceram em um local aquecido até a recuperação da anestesia, e então foram

levadas às gaiolas individuais. Passados cinco dias para recuperação das cirurgias, as

ratas foram submetidas à terapia hormonal substitutiva ou reposição de veículo oleoso.

24

Durante essa terapia, três injeções subcutâneas transmusculares de cipionato de estradiol

(25 µg / dia) nos três primeiros dias (uma injeção a cada dia de terapia) e uma de

progesterona (2 mg) no quarto dia foram administradas nas ratas às 10:00 hs. O grupo

controle recebeu injeções subcutâneas transmusculares de veículo oleoso (óleo de milho

Mazola – Cargil Agricola® S.A.) às 10:00 hs durante os quatro dias. Às 15:50 h deste

quarto dia, as ratas receberam uma microinjeção (0,2 µl) de Losartan (DuPont - 100

pMoles) ou de tampão fosfato 10 mM em salina 0,15 M com pH 7,4 (TFS) no MnPO.

Dez minutos mais tarde, foi injetada (2 mL / 100 g) salina hipertônica 0,5 M ou salina

isotônica 0,15 M no peritoneo das ratas. Trinta minutos após essas injeções, os animais

foram anestesiados com hidrato de cloral para coleta de sangue da aorta abdominal e

posterior perfusão dos cérebros.

Esquema do protocolo experimental I

Ovariectomia seguida de implantação de cânula no MnPO após anestesia com hidrato de cloral nas ratas em metaestro.

Acompanhamento de 3ciclos estrais consecutivos.

Passados 5 dias das cirurgias, as ratas foram submetidas àterapia hormonal substitutiva ou reposição com óleo por 4 dias com injeções às 10:00 hs.

E2� E2

� E2 � P4

30 minutos após a injeção intraperitoneal, as ratas foram anestesiadas com hidrato de cloral, tiveram o sangue colhido da aorta abdominal para dosagem de OT, LH e FSH e foram perfundidas para remoção e processamento dos cérebros para dupla marcação de c-Foscom OT e de c-Fos com LHRH.

Na tarde (16: 00 hs) do 4o

dia de terapia hormonal, as ratas receberam uma injeção intraperitoneal de salina hipertônica ou isotônica.

Microinjeção de Losartan ou TFS aos 10 minutos antes de receber uma injeção intraperitoneal.

Ovariectomia seguida de implantação de cânula no MnPO após anestesia com hidrato de cloral nas ratas em metaestro.

Acompanhamento de 3ciclos estrais consecutivos.

Passados 5 dias das cirurgias, as ratas foram submetidas àterapia hormonal substitutiva ou reposição com óleo por 4 dias com injeções às 10:00 hs.

E2� E2

� E2 � P4

30 minutos após a injeção intraperitoneal, as ratas foram anestesiadas com hidrato de cloral, tiveram o sangue colhido da aorta abdominal para dosagem de OT, LH e FSH e foram perfundidas para remoção e processamento dos cérebros para dupla marcação de c-Foscom OT e de c-Fos com LHRH.



Microinjeção de Losartan ou TFS aos 10 minutos antes de receber uma injeção intraperitoneal.

25

Experimento II

As ratas em metaestro foram anestesiadas com uma injeção intraperitoneal (1

mL / 100 g de peso corporal) de hidrato de cloral (35 mg / 100 g) em salina isotônica,

submetidas à ovariectomia bilateral e posteriormente posicionadas no aparelho

estereotáxico para receberem uma microinjeção (0,2 µL) de ácido ácido ibotênico

(Sigma 5 µg/µL) no MnPO. As seguintes coordenadas estereotáxicas foram utilizadas:

0,3 mm anterior ao bregma, 0 mm latero-lateral e 7,2 mm dorso-ventral a partir da

calota óssea. Após as cirurgias, as ratas permaneceram em um local aquecido até a

recuperação da anestesia e então foram levadas às gaiolas individuais. Passados cinco

dias para recuperação das cirurgias, as ratas foram submetidas à terapia hormonal

substitutiva ou a injeções de veículo oleoso. Durante essa terapia, três injeções

subcutâneas transmusculares de cipionato de estradiol (25 µg / dia) nos três primeiros

dias (uma injeção a cada dia de terapia) e uma de progesterona (2 mg) no quarto dia

foram administradas nas ratas às 10:00 hs. O grupo controle recebeu injeções

subcutâneas transmusculares de veículo oleoso (óleo de milho Mazola – Cargil

Agricola® S.A.) às 10:00 hs durante os quatro dias. Às 16 hs desse quarto dia, foi

injetado (2 mL / 100 g) salina hipertônica ou salina isotônica no peritoneo das ratas.

Trinta minutos após essas injeções, os animais foram anestesiados com Hidrato de

cloral (35 mg / 100g) diluído em salina isotônica para coleta de sangue da aorta

abdominal e posterior perfusão dos cérebros.

26

Esquema do protocolo experimental II

Ovariectomia seguida de lesão ibotênica ou fictícia no MnPO após anestesia com hidrato de cloral nas ratas em metaestro.

Acompanhamento de 3 ciclos estrais consecutivos.

Passados 5 dias das cirurgias, as ratas foram submetidas à terapia hormonal substitutiva ou reposição com óleo por 4 dias com injeções às 10:00 hs.

E2� E2

� E2 � P4

30 minutos após a injeção intraperitoneal, as ratas foram anestesiadas com hidrato de cloral, tiveram o sangue colhido da aorta abdominal para dosagem de OT, LH e FSH e foram perfundidas para remoção e processamento dos cérebros para dupla marcação de c-Fos com OT e de c-Foscom LHRH.



Ovariectomia seguida de lesão ibotênica ou fictícia no MnPO após anestesia com hidrato de cloral nas ratas em metaestro.

Acompanhamento de 3 ciclos estrais consecutivos.

Passados 5 dias das cirurgias, as ratas foram submetidas à terapia hormonal substitutiva ou reposição com óleo por 4 dias com injeções às 10:00 hs.

E2� E2

� E2 � P4

30 minutos após a injeção intraperitoneal, as ratas foram anestesiadas com hidrato de cloral, tiveram o sangue colhido da aorta abdominal para dosagem de OT, LH e FSH e foram perfundidas para remoção e processamento dos cérebros para dupla marcação de c-Fos com OT e de c-Foscom LHRH.



Coleta de sangue e cérebro.

O sangue coletado teve seu plasma separado por centrifugação (16.1 g) e

congelado a – 20 ºC para posteriores dosagens de OT, LH e FSH. A perfusão foi

realizada por meio de infusão intracardíaca (8 mL / minuto) de TFS por 10 minutos e de

paraformaldeído 4 % em tampão fosfato 0,1 M por 40 minutos. Após a perfusão, os

cérebros foram removidos e imersos em solução de sacarose 30 % em tampão fosfato

0,1 M até a saturação do tecido (48 horas). Em seguida, os cérebros foram congelados

em isopentano envolto por gelo seco à – 45 ºC e armazenados à – 70 ºC.

27

Extração e dosagem de OT.

O plasma foi descongelado e 1 mL de cada amostra pipetado em tubos

numerados, onde foram adicionados 2 mL acetona (Vetec) gelada. Os tubos foram

agitados por 1 minuto, centrifugados (16.1 g) e seu conteúdo sobrenadante vertido em

outros tubos igualmente numerados, onde foram adicionados 2 mL de éter de petróleo

(Analyticals - Carlo Erba) gelado. Após nova agitação de 1 minuto, a fase superior foi

aspirada e o que restou no tubo foi liofilizado e posteriormente armazenado à – 20 0C até

o momento do radioimunoensaio.

O material liofilizado, previamente extraído do plasma (1mL), foi descongelado e

ressuspenso em solução tamponada num volume correspondente a 40 % do volume de

plasma utilizado, ou seja, 400 L.

A dosagem de OT foi realizada por radioimunoensaio de duplo anticorpo. O

anticorpo específico para OT utilizado foi produzido em coelho pelo laboratório da Dra.

Mariana Morris (Wright State University, USA). A anti-gamaglobulina para precipitação

da reação do radioimunoensaio foi produzida em ovelha pelo Laboratório do Dr. Celso

Rodrigues Franci (FMRP-USP). A reação de precipitação com anti-gamaglobulina foi

facilitada pela utilização de uma solução de polietileno glicol 5 %. O padrão utilizado

(OT – 8152) foi obtido comercialmente da Peninsula Laboratories (Califórnia, USA). O

hormônio iodinado foi gentilmente cedido pelo laboratório do Prof. Dr. José Antunes

Rodrigues (FMRP – USP). A dose mínima detectada no ensaio foi de 0,8 g / mL. O erro

intraensaio apresentou valor de 6 %. Os valores obtidos foram devidamente corrigidos

pelos fatores de diluição.

28

Dosagens de LH e FSH.

As dosagens de LH e FSH foram realizadas por radioimunoensaio de duplo

anticorpo. Foram utilizados anticorpos específicos para LH e FSH (National Institute of

Health - USA). O anticorpo inespecífico para a precipitação da reação do

radioimunoensaio foi produzido em ovelha pelo laboratório do Dr Celso Rodrigues

Franci (FMRP-USP). O LH e o FSH foram iodinados e purificados no laboratório do Dr

Celso Rodrigues Franci (FMRP-USP). As curvas padrões para LH e FSH foram diluídas

em tampão albumina nas concentrações de 0,04 a 20 g / mL para o LH e de 0,09 a 50 g

/ mL para FSH. Foram incubados 100 L do padrão ou da amostra desconhecida com 100

l de anticorpo e 100 l de 125I-LH ou 125I-FSH por 48 horas em temperatura ambiente.

Para separar as frações livres e ligadas adicionou-se à reação o anticorpo inespecífico

(100 l). Após aproximadamente 2 horas de incubação em temperatura ambiente, as

amostras foram centrifugadas (16.1 G) por 15 minutos à 4 oC. O sobrenadante foi

aspirado e o precipitado foi contado em cintilador para radiação γ. Todas as amostras

foram dosadas no mesmo ensaio. A dose mínima detectada no ensaio foi de 0,02 g/mL

para o LH e 0,09 g/mL para o FSH. O erro intraensaio foi de 3 % e 2%, respectivamente

para LH e FSH.

Dupla imunofluorescência.

Foram utilizados apenas os cérebros das ratas submetidas ao estímulo osmótico,

independendo do tratamento hormonal e do tipo de microinjeção (losartan ou ácido

ibotênico). Esses cérebros congelados a – 70 ºC foram levados ao criostato à – 20 ºC

para obtenção de quatro séries de secções com 14 µm, as quais foram imersas em

solução crioprotetora (sacarose 30 %, polivinilpirrolidona 1 % e etileno glicol 30 % em

29

TFS) e armazenadas à -20 oC. Duas regiões cerebrais foram seccionadas, a primeira

abrangeu a área pré-óptica medial (MPOA), na qual os cortes foram processados para

imuno-histoquímica para c-Fos e LHRH; a segunda incluiu o PVN e o SON na qual os

cortes foram processados para imuno-histoquímica para c-Fos e OT.

Todas as secções cerebrais foram processadas à temperatura ambiente (25 oC) e

lavadas (cinco vezes por cinco minutos cada lavagem em constante agitação) em TFS

após cada etapa de exposição aos reagentes.

A exposição aos reagentes começou com a exposição à glicina 0,01 M diluída

em TFS por dez minutos para reduzir a autofluorescência do tecido provocada pela

exposição ao paraformoldeído 4 %. Em seguida, as ligações para gamaglobulina foram

bloqueadas com albumina bovina 1 % em TFS por 30 minutos.

Após a realização dessas etapas para bloqueio de reações inespecíficas,

seguiram-se as incubações com os anticorpos primários e secundários.

As secções cerebrais abrangendo a POA foram incubadas com o anticorpo

policlonal produzido em cabra, específico contra a proteína c-Fos diluído 1/1000 (SC

52, Santa Cruz Biotechnologies - USA) conjuntamente com o anticorpo policlonal

produzido em coelho contra LHRH diluído 1/1000 (gentilmente cedido pelo Prof. Dr.

Gerard Tramu, Université Bordeaux, França).

As secções cerebrais abrangendo PVN e SON foram incubadas com o anticorpo

policlonal produzido em coelho, específico contra a proteína c-Fos diluído 1/1000 (SC

52, Santa Cruz Biotechnologies - USA) conjuntamente com o anticorpo monoclonal

produzido em camundongo, específico contra OT diluído 1/1500 (gentilmente cedido

pelo Dr. Haroud Gainer, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

30

Em seguida, os cortes foram expostos ao segundo anticorpo por uma hora em

TFS.

Nas secções da POA foram utilizados o anti-IgG de coelho produzido em

jumento conjugado, com Alexa Flúor 594 diluído 1/1000 e o anti-IgG de cabra

produzido em jumento, conjugado, com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000 (Molecular

Probe, USA).

Nas secções do PVN e do SON foram utilizados o anti-IgG de coelho produzido

em jumento, conjugado com Alexa Flúor 594 diluído 1/1000 e o anti-IgG de

camundongo produzido em jumento, conjugado com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000

(Molecular Probe, USA).

Finalmente, os cortes foram montados com fluoromount-G (Eletron microscopy

science - USA) e vedados com tinta esmalte.

Utilizando-se o protocolo acima citado, os controles de especificidade dos

anticorpos secundários (anti-IgG de coelho produzido em jumento, conjugado com

Alexa Flúor 594 diluído 1/1000, anti-IgG de cabra produzido em jumento, conjugado

com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000 e anti-IgG de camundongo produzido em jumento,

conjugado com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000) foram realizados, omitindo-se os

anticorpos primários de cada reação imunofluorescente. (Figura 3D, 3E e 3F).

Aquisição das imagens.

As secções cerebrais contendo neurônios marcados positivamente tanto para OT,

c-Fos ou ambas (dupla marcação para OT e c-Fos) no SON e PVN quanto para LHRH,

c-Fos ou ambas (dupla marcação para LHRH e c-Fos) na POA foram adquiridas e

classificadas em regiões de acordo com o Atlas Paxinos & Watson 1997 (Figura 4) e

31

fotografadas bilateralmente utilizando-se um microscópio de fluorescência com câmera

digital (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss, Germany).

Análise das imagens.

Para cada animal, o maior número possível (de 2 a 10) de fotomicrografias de

cada região cerebral de interesse (SON e PVN, entre -0,16 mm e -2,12 mm caudal em

relação ao bregma, Figura 4) foi adquirido. Nas fotomicrografias das respectivas regiões

cerebrais por animal, foi contado o número de neurônios positivamente marcados para

OT, para cFos e para as duplas marcações (OT e c-Fos expressos conjuntamente no

mesmo neurônio). Utilizando-se o maior número possível de fotomicrografias, cujos

neurônios já haviam sido contados, foi calculado uma média aritimética do número de

neurônios marcados para OT, para cFos e para as duplamarcações (OT e c-Fos) para

cada região de interesse por animal (média de cada animal para cada região estudada).

Dessa forma, cada animal apresentava um valor médio de neurônios marcados para cada

uma das marcações estudadas. Em seguida, calculou-se novamente outra média

aritimética (média do grupo) a partir das médias obtidas de cada animal para

encontrarmos o valor médio de neurônios marcados por grupo. Feito isto, dividimos o

número de neurônios duplamente marcados para OT e c-Fos pelo número de neurônios

marcados apenas para OT para obtermos a porcentagem média de neurônios duplamente

marcados para OT e c-Fos (DP/OT) tendo como referencial a população de neurônios

OT.

Para análise quantitativa das marcações foram desenvolvidas macros no

programa computacional image J® (programa computacional disponibilizado

gratuitamente pelo National Institute of Health, USA - http://rsb.info.nih.gov/nih-

32

image/) que viabilizassem as contagens automáticas do número de neurônios marcados

para c-Fos, OT ou ambas as marcações.

Análise estatística.

Os resultados das dosagens hormonais e das contagens neuronais foram

expressos com média ± erro padrão da média e submetidos à análise de variância simples

(two and three-way analysis of variance) seguida de pós-teste para comparações

múltiplas (Bonferroni posttest) utilizando o programa computacional GraphPad Prism®

(GraphPad Software, Inc., USA).

33

RESULTADOS

Exper imento I – Localização do sítio de microinjeção

Na figura 1, o sítio de microinjeção de Losartan no MnPO é mostrado juntamente com a extremidade da cânula. Somente os animais com sítio de microinjeção devidamente localizado foram incluídos nos estudos.

Figura 1 – Fotomicrografia do núcleo preóptico mediano (MnPO), evidenciando a extremidade da cânula de microinjeção. AC, comissura anterior; MI, extremidade da agulha de microinjeção.

Exper imento I – Dosagens hormonais

Dosagem de OT

a) Estímulo osmótico

A concentração plasmática de OT (figura 2) foi elevada pela injeção

intraperitoneal de salina hipertônica em comparada à injeção intraperitoneal de salina

isotônica. Essa elevação foi observada nas ratas ovariectomizadas tratadas com óleo

(OVX + O) submetidas à microinjeção de TFS no MnPO, nas ratas OVX + O

submetidas à microinjeção de Losartan no MnPO, nas ratas ovariectomizadas e tratadas

Sítio de microinjeção

34

com estrógeno e progesterona (OVX + T) submetidas à microinjeção de TFS no MnPO e

nas ratas OVX + T submetidas à microinjeção de Losartan no MnPO.

b) Microinjeção de Losartan

A concentração plasmática de OT (figura 2) não foi alterada pela microinjeção de

Losartan comparada à microinjeção de TFS no MnPO. Essa resposta foi encontrada nas

ratas OVX + O submetidas à injeção intraperitoneal de salina isotônica, nas ratas OVX +

O submetidas à injeção intraperitoneal de salina hipertônica, nas ratas OVX + T

submetidas à injeção intraperitoneal de salina isotônica e nas ratas OVX + T submetidas à

injeção intraperitoneal de salina hipertônica.

c) Terapia hormonal substitutiva

A concentração plasmática de OT (figura 2) não foi alterada em ratas OVX + T

em comparação às ratas OVX + O. Essa resposta ocorreu nas quatro condições

experimentais estudadas, às quais os animais foram submetidos: 1) após injeção

intraperitoneal de salina isotônica e microinjeção de TFS no MnPO; 2) após injeção

intraperitoneal de salina isotônica e microinjeção de Losartan no MnPO; 3) após injeção

intraperitoneal de salina hipertônica e microinjeção de TFS no MnPO e 4) após

receberem injeção intraperitoneal de salina hipertônica e microinjeção de Losartan no

MnPO.

Dosagem de LH


A concentração plasmática de LH (figura 2) não foi alterada pela injeção

intraperitoneal de salina hipertônica em comparação à injeção intraperitoneal de salina

isotônica em ratas OVX + O submetidas à microinjeção de TFS no MnPO e nas ratas

35

OVX + O submetidas à microinjeção de Losartan no MnPO. Nas ratas OVX + T

submetidas à microinjeção de TFS no MnPO e nas ratas OVX + T submetidas à

microinjeção de Losartan no MnPO, a concentração plasmática de LH foi reduzida pela

injeção intraperitoneal de salina hipertônica em comparação à injeção intraperitoneal de

salina isotônica.


A concentração plasmática de LH (figura 2) não foi alterada pela microinjeção de

Losartan comparada à microinjeção de TFS no MnPO. Essa resposta foi observada nas






A concentração plasmática de LH (figura 2) foi elevada em ratas OVX + T em

comparação às ratas OVX + O. Esse acréscimo foi encontrado nas quatro condições

experimentais estudadas, às quais os animais foram submetidos: 1) após injeção





MnPO.

36

Dosagem de FSH.


A concentração plasmática de FSH (figura 2) não foi alterada pela injeção


isotônica. Essa resposta ocorreu nas ratas OVX + O submetidas à microinjeção de TFS

no MnPO, nas ratas OVX + O submetidas à microinjeção de Losartan no MnPO, nas

ratas OVX + T submetidas à microinjeção de TFS no MnPO e também nas ratas OVX +

T submetidas à microinjeção de Losartan no MnPO.


A concentração plasmática de FSH (figura 2) não foi alterada pela microinjeção

de Losartan comparada à microinjeção de TFS no MnPO. Essa resposta foi observada nas







comparação às ratas OVX + O. Esse aumento foi encontrado nas quatro condições

experimentais estudadas, as quais os animais foram submetidos: 1) após injeção




37


MnPO.

0

20

40

60

80

100

α

α αα

OT

OVX + O OVX + T

OT

(ρg

/ mL)

TFSMnPO / salina isotônicaip.

TFSMnPO / salina hipertônicaip.

LosartanMnPO / salina isotônicaip.

LosartanMnPO / salina hipertônicaip.

LH

S / I S / H L / I L / H S / I+eS / H+eL / I+eL / H+e0

10

20

30

ββ

βαβα

OVX + O OVX + T

LH

(ηη ηη

g /

mL

)

FSH

0

10

20

30

40

50 β βββ

OVX + O OVX + T

FS

H (

ηη ηηg

/ m

L)

Figura 2 - Concentração plasmática de ocitocina (OT), de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal de salina hipertônica (salina hipertônica ip.) ou isotônica (salina isotônica ip.) aplicadas aos dez minutos após a microinjeção de Losartan (LosartanMnPO) ou TFS (TFSMnPO) no MnPO de ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T). Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados de 8 a 13 animais em cada grupo. � diferença significante (p<0,05) de (TFSMnPO / salina hipertônica ip.) x (TFSMnPO / salina isotônica ip.) e de (LosartanMnPO / salina hipertônica ip.) x (LosartanMnPO / salina isotônica ip.) tanto nas ratas OVX + O como nas OVX + T.

�, diferença significante

versus grupo de ratas OVX + O submetidas à mesma injeção intraperitoneal e mesma microinjeção no MnPO.

38

Exper imento I – Dupla imunofluorescência

a) Análise da porcentagem de neurônios LHRHérgicos positivamente

marcados para proteína c-Fos na MPOA

A análise das imunofluorescências para LHRH e c-Fos na MPOA demonstrou que

a injeção intraperitoneal de salina hipertônica aplicada aos 10 minutos após a

microinjeção de TFS ou salina fosfatada no MnPO não estimulou a síntese da proteína c-

c-Fos em neurônios LHRHérgicos das ratas OVX + O e das ratas OVX + T (Figura 3).

Duplaimunofluorescência para LHRH e c-Fos

Figura 3 - Fotomicrografias (aumento 400X) de neurônios duplamente marcados por imunofluorescência para LHRH (A) e c-Fos (B) na MPOA de rata OVX + T que receberam microinjeção de TFS no MnPO aos 30 minutos após o estímulo osmótico. C, superposição das figuras A e B; D, e E, controles de especificidade dos anticorpos secundários anti-IgG de coelho produzido em jumento, conjugado com Alexa Flúor 594 diluído 1/1000 e anti-IgG de cabra produzido em jumento, conjugado, com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000, respectivamente; F, controle de especificidade do anticorpo secundários anti-IgG de camundongo produzido em jumento, conjugado com Alexa Flúor 488 diluído 1/1000.

A B C

39

b) Análise da porcentagem de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados

para proteína c-Fos

Na figura 4 observamos as fotomicrografias (aumento 200X) de neurônios

duplamente marcados para OT (verde) e c-Fos (vermelho) das diferentes porções do PVN

e do SON de ratas OVX + T submetidas ao estímulo osmótico e à microinjeção de TFS

no MnPO.

Nas regiões magnocelular periventricular (PeM), magnocelular medial (PaMM) e

no conjunto de todas as regiões magnocelulares do PVN (PVNm), a porcentagem média

de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos

após o estímulo osmótico não foi alterada pela microinjeção de Losartan comparada à

microinjeção de TFS no MnPO das ratas OVX + O. Nas ratas OVX + T, a porcentagem

média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30

minutos após o estímulo osmótico foi reduzida pela microinjeção de Losartan comparada

à microinjeção de TFS no MnPO (Figuras 5 e 6).

Nas regiões comissural anterior (PaAC) e magnocelular lateral (PaLM), a

porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína

c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico não foi alterada pela microinjeção de

Losartan comparada à microinjeção de TFS no MnPO das ratas OVX + O e das ratas

OVX + T (Figura 5).

Nas regiões anterior (SONa), medial (SONm) e posterior (SONp) do núcleo

supraóptico bem como o conjunto destas regiões (SON), a porcentagem média de

neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos

50 µm 50 µm 50 µm

A B C

40

após o estímulo osmótico não foi alterada pela microinjeção de Losartan comparada à

microinjeção de TFS no MnPO das ratas OVX + O e das ratas OVX + T (Figura 7).

Nas regiões PeM, PaAC, PaMM, PaLM e PVNm (Figura 5), bem como nas regiões

SONa, SONm, SONp e SON, a porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos

positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico

não foi alterada nas ratas OVX + O comparada às ratas OVX + T. Essa resposta foi

observada nas ratas que receberam microinjeção de Losartan e nas ratas que receberam

microinjeção de TFS no MnPO (Figura 7).

41

Regiões do PVN e SON

Figura 4 - Fotomicrografias (aumento 200X) de dupla imunofluorescência para ocitocina (OT) e proteína c-Fos em neurônios do núcleo paraventricular e supraóptico (SON) de ratas ovariectomizadas tratadas com estrógeno e progesterona submetidas à injeção intraperitoneal de salina hipertônica e microinjeção de TFS no MnPO. As regiões foram classificadas de acordo com Atlas Paxinos & Watson 1997. Em vermelho, a proteína c-Fos marcada no núcleo e, em verde, a OT presente no citoplasma de neurônios de divisões magnocelulares: do PVN - periventricular (PeM); comissural anterior (PaAC); medial (PaMM) e lateral (PaLM); e do SON – anterior, medial e posterior.

42

PeM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

α

DP

/ O

T

PaAC

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

PaLM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

PaMM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

α

DP

/ O

T

PVNm

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

α

DP

/ O

T

TFSMnPO

LosartanMnPO

Figura 5 - Porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos marcados para proteína c-Fos por secção do núcleo paraventricular nas regiões magnocelulares periventricular (PeM), comissural anterior (PaAC), medial (PaMM) e lateral (PaLM), e no conjunto destas regiões (PVNm) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal de salina hipertônica precedida em 10 minutos pela microinjeção de Losartan (Losartan MnPO) ou salina isotônica fosfatada (TFSMnPO) no MnPO de ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T). Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados 4 animais por grupo. � , diferença significante para p < 0,05 versus grupo de ratas ovariectomizadas que receberam microinjeção de salina fosfatada no MnPO (TFSMnPO).

43

Duplaimunofluorescência para OT e c-Fos no PVN

TFSMnPO LosartanMnPO

Figura 6 - Fotomicrografias (aumento 200X) de dupla imunofluorescência para ocitocina, em verde, e proteína c-Fos, em vermelho, de neurônios do núcleo paraventricular (PVN), mostrando: a redução da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PeM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + T que receberam microinjeção de LosartanMnPO (B) comparada à de TFSMnPO (A) no MnPO; a redução da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PaMM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + T que receberam microinjeção de LosartanMnPO (D) comparada à de TFSMnPO (C) no MnPO).

PeM

OVX + T

PaMM

OVX + T

44

SONa

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

TFSMnPO LosartanMnPO

SONm

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

SONp

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

SON

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

100

DP

/ O

T

Figura 7 - Porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos (DP / OT) por secção cerebral (média ± erro padrão da média) das regiões anterior (SONa), medial (SONm), posterior (SONp) e no conjunto destas regiões (SON) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal de salina hipertônica precedida em 10 minutos pela microinjeção de Losartan (LosartanMnPO) ou salina isotônica fosfatada (TFSMnPO) no MnPO de ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T). Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados 4 animais por grupo.

45

Exper imento I I – Localização da lesão por ácido ibotênico

A figura 8 mostra: 1) neurônios positivamente marcados (setas brancas) para a

proteína c-Fos no MnPO (painel A), indicando a integridade funcional desse núcleo em

ratas OVX + T submetidas à lesão fictícia do MnPO aos 30 minutos após o estímulo

osmótico e 2) ausência de neurônios positivamente marcados para a proteína c-Fos

(painel B) no MnPO indicando que a estrutura após lesão por ácido ibotênico neste

núcleo em ratas OVX + O não responde ao estímulo osmótico.

Imunofluorescência para C-Fos no MnPO

Figura 8 – Fotomicrografias (aumento 200X) do MnPO, mostrando neurônios marcados para proteína c-Fos (setas brancas) de ratas OVX + T submetidas à lesão fictícia (A) ou ibotênica (B) do MnPO aos 30 minutos após estímulo osmótico. AC, comissura anterior.

Exper imento I I – Dosagens hormonais

Dosagem de OT


A concentração plasmática de OT (figura 9) foi elevada pela injeção


isotônica. Essa elevação foi observada nas ratas OVX + O submetidas à lesão fictícia do

MnPO, nas ratas OVX + O submetidas à lesão ibotênica do MnPO, nas ratas OVX + T

46

submetidas à lesão fictícia do MnPO e nas ratas OVX + T submetidas à lesão ibotênica

do MnPO.

b) Lesão ibotênica

A concentração plasmática de OT (figura 9) não foi alterada pela lesão ibotênica

comparada à lesão fictícia do MnPO. Essa resposta foi observada nas ratas OVX + O

submetidas à injeção intraperitoneal de salina isotônica, ratas OVX + O submetidas à

injeção intraperitoneal de salina hipertônica, nas ratas OVX + T submetidas à injeção

intraperitoneal de salina isotônica e nas ratas OVX + T submetidas à injeção

intraperitoneal de salina hipertônica.


A concentração plasmática de OT (figura 9) não foi alterada em ratas OVX + T

em comparação às ratas OVX + O. Essa resposta foi encontrada nas quatro condições

experimentais estudadas, às quais os animais foram submetidos: 1) após receberem

injeção intraperitoneal de salina isotônica e lesão fictícia do MnPO; 2) após receberem

injeção intraperitoneal de salina isotônica e lesão ibotênica do MnPO; 3) após receberem

injeção intraperitoneal de salina hipertônica e lesão fictícia do MnPO e 4) após receberem

injeção intraperitoneal de salina hipertônica e lesão ibotênica do MnPO.

Dosagem de LH


A concentração plasmática de LH (figura 9) não foi alterada pela injeção


isotônica em ratas OVX + O submetidas à lesão fictícia do MnPO e em ratas OVX + O

submetidas à lesão ibotênica do MnPO. Nas ratas OVX + T submetidas à lesão fictícia do

47

MnPO e nas ratas OVX + T submetidas à lesão ibotênica do MnPO, a concentração

plasmática de LH foi descrescida pela injeção intraperitoneal de salina hipertônica em

comparação à injeção intraperitoneal de salina isotônica.


A concentração plasmática de LH (figura 9) não foi alterada pela lesão ibotênica

comparada à lesão fictícia do MnPO em ratas OVX + O submetidas à injeção

intraperitoneal de salina isotônica e em ratas OVX + O submetidas à injeção

intraperitoneal de salina hipertônica. Nas ratas OVX + T submetidas à injeção


intraperitoneal de salina hipertônica, a concentração plasmática de LH foi reduzida pela

lesão ibotênica comparada à lesão fictícia do MnPO.



comparação às ratas OVX + O. Esse acréscimo foi encontrado nas quatro condições






Dosagem de FSH


A concentração plasmática de FSH (figura 9) não foi alterada pela injeção


48

isotônica. Essa resposta ocorreu nas ratas OVX + O submetidas à lesão fictícia do MnPO,

nas ratas OVX + O submetidas à lesão ibotênica do MnPO, nas ratas OVX + T

submetidas à lesão fictícia do MnPO e nas ratas OVX + T submetidas à lesão ibotênica

do MnPO.


A concentração plasmática de FSH (figura 9) não foi alterada pela lesão ibotênica

comparada à lesão fictícia do MnPO. Essa resposta foi observada nas ratas OVX + O

submetidas à injeção intraperitoneal de salina isotônica, nas ratas OVX + O submetidas à

injeção intraperitoneal de salina hipertônica, nas ratas OVX + T submetidas à injeção


intraperitoneal de salina hipertônica.


A concentração plasmática de FSH (figura 9) foi elevada em ratas OVX + T em

comparação às ratas OVX + O. Esse aumento foi encontrado nas quatro condições






49

OT

0

20

40

60

80

100

αα

α

α

OVX + O OVX + T

OT

(ρ(ρ (ρ(ρg

/ m

L) lesão fictíciaMnPO / salina isotônicaip.

lesão fictíciaMnPO / salina hipertônicaip.

lesão ibotênicaMnPO / salina isotônicaip.

lesãqo ibotênicaMnPO / salina hipertônicaip.

LH

0

20

40

60

βαγ

β

βγβα

OVX + O OVX + T

LH (

ηη ηηg

/ m

L)

FSH

0

10

20

30

40

50

60

β β ββ

OVX + O OVX + T

FS

H (

ηη ηηg

/ m

L)

Figura 9 - Concentração plasmática de ocitocina (OT), de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal de salina hipertônica (salina hipertônica ip.) ou isotônica (salina isotônica ip.) de ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T), submetidas à lesão por ácido ibotênico (lesão ibotênicaMnPO) ou fictícia (lesão fictíciaMnPO). Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados de 8 a 13 animais em cada grupo. � , diferença significante (p<0,05) de (lesão fictíciaMnPO / salina hipertônica ip.) x (lesão fictíciaMnPO / salina isotônica ip.) e de (lesão ibotênicaMnPO / salina hipertônica ip.) x (lesão ibotênicaMnPO / salina isotônica ip.).

�, diferença significante versus grupo de ratas OVX + O submetidas à

mesma injeção intraperitoneal e mesma microinjeção no MnPO. � , diferença significante (p<0,05) de (lesão fictíciaMnPO / salina isotônica ip.) x (lesão ibotênicaMnPO / salina isotônica ip.) e de (lesão ibotênicaMnPO / H) x (lesão ibotênicaMnPO / salina isotônica ip.).

50

Exper imento I I – Contagem neuronal

Nas regiões (Figuras 10 e 11) magnocelular periventricular (PeM) e magnocelular

medial (PaMM), a porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos positivamente

marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico foi reduzida pela

lesão ibotênica comparada à lesão fictícia do MnPO nas ratas OVX + O. Nas ratas OVX

+ T, a porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para

proteína c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico não foi alterada pela lesão

ibotênica comparada à lesão fictícia do MnPO.

Nessas mesmas regiões do PVN (PeM e PaMM), a porcentagem média de


após o estímulo osmótico não foi alterada nas ratas OVX + O portadoras de lesão fictícia

do MnPO em comparação às ratas OVX + T portadoras de lesão fictícia do MnPO.

Quando comparadas as ratas OVX + O portadoras de lesão ibotênica do MnPO às ratas

OVX + T portadoras de lesão ibotênica do MnPO, observamos uma elevação da

porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína

c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico (Figuras 10 e 12).

Na região comissural anterior (PaAC), a porcentagem média de neurônios

ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos após o

estímulo osmótico não foi alterada pela lesão ibotênica comparada à lesão fictícia do

MnPO nas ratas OVX + O. Nas ratas OVX + T, a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico foi reduzida pela lesão ibotênica comparada à lesão fictícia do MnPO

(Figuras 10 e 11).

51

Na região magnocelular lateral (PaLM), a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico não foi alterada pela lesão ibotênica comparada à lesão fictícia do

MnPO nas ratas OVX + O e nas ratas OVX + T (Figura 10).

Nas regiões PaAC e PaLM, a porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos

positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos após o estímulo osmótico

não foi modificada nas ratas OVX + O em comparação às ratas OVX + T. Essa resposta

foi observada nas ratas portadoras de lesão fictícia e nas ratas portadoras de lesão

ibotênica do MnPO (Figura 10).

No conjunto de todas as regiões magnocelulares do PVN (PVNm), a porcentagem

média de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30

minutos após o estímulo osmótico foi reduzida pela lesão ibotênica comparada à lesão

fictícia do MnPO nas ratas OVX + O e nas ratas OVX + T (Figura 10).

Nessas mesmas região do PVN, a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico não foi alterada nas ratas OVX + O portadoras lesão fictícia do MnPO

em comparação às ratas OVX + T portadoras lesão fictícia do MnPO. Quando

comparadas as ratas OVX + O portadoras lesão ibotênica do MnPO às ratas OVX + T

portadoras lesão ibotênica do MnPO, observamos uma elevação da porcentagem média

de neurônios ocitocinérgicos positivamente marcados para proteína c-Fos aos 30 minutos

após o estímulo osmótico (Figura 10).

52

Lesão fictíciaMnPO

Lesão ibotênicaMnPO

PeM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

β

α

DP

/ O

T

PaAC

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

α

DP

/ O

T

PaLM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

DP

/ O

T

PaMM

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80 β

α

DP

/ O

T

PVNm

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

α

αβ

DP

/ O

T

Figura 10 - Porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos marcados para proteína c-Fos por secção do núcleo paraventricular nas regiões magnocelulares periventricular (PeM), comissural anterior (PaAC), medial (PaMM) e lateral (PaLM), e no conjunto destas regiões (PVNm) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal de salina hipertônica em ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T), submetidas à lesão por ácio ibotênico (Lesão ibotênicaMnPO) ou fictícia (Lesão fictíciaMnPO) do MnPO. Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados 4 animais por grupo. � , diferença significante para p < 0,05 % versus grupo de ratas que receberam microinjeção de salina fosfatada no MnPO (Lesão fictíciaMnPO).

� diferença significante para p < 0,05 %

versus grupo de ratas OVX + O que receberam microinjeção no MnPO semelhante.

53

Figura 11 (diferença alfa) - Fotomicrografias (aumento 200X) de dupla imunofluorescência para ocitocina (OT), em verde, e proteína c-Fos, em vermelho, de neurônios do núcleo paraventricular, mostrando: a redução da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PeM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + O com lesão ibotênica (B) comparadas às ratas com lesão fictícia (A) do MnPO; a redução da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PaMM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + O com lesão ibotênica (D) comparadas às ratas com lesão fictícia (C) do MnPO e a redução da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PaAC aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + T com lesão ibotênica (F) comparadas às ratas com lesão fictícia (E) do MnPO.

Lesão fictícia Lesão ibotênica

OVX + O

OVX + O

OVX + T

Duplaimunofluorescência para OT e c-Fos no PeM, PaMM e PaAC

54

Figura 12 (diferença beta) - Fotomicrografias (aumento 200X) de dupla imunofluorescência para ocitocina (OT), em verde, e proteína c-Fos, em vermelho, de neurônios do núcleo paraventricular, mostrando: o aumento da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PeM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + T (B) comparadas às ratas OVX + O (A) após receberem microinjeção de ácido ibotênico no MnPO; o aumento da porcentagem de neurônios OT positivamente marcados para proteína c-Fos da região PaMM aos 30 minutos após o estímulo osmótico nas ratas OVX + T (D) comparadas às ratas OVX + O (C) após receberem microinjeção de ácido ibotênico no MnPO.

OVX + O

OVX + T

Lesão ibotênica

Lesão ibotênica

Duplaimunofluorescência para OT e c-Fos no PeM e PaMM

55

Nas regiões anterior (SONa), medial (SONm) e posterior (SONp) do núcleo

supraóptico, bem como no conjunto destas regiões (SON), a porcentagem média de


após o estímulo osmótico não foi alterada pela lesão ibotênica comparada à lesão fictícia

do MnPO nas ratas OVX + O. Nas ratas OVX + T, a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico também não foi alterada pela lesão ibotênica, comparada à lesão

ibotênica do MnPO (figura 13).

Nessas mesmas regiões do SON, a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico não foi alterada nas ratas OVX + O portadoras lesão fictícia do MnPO

em comparação às ratas OVX + T portadoras de lesão fictícia do MnPO. Quando

comparadas as ratas OVX + O portadoras de lesão ibotênica do MnPO às ratas OVX + T

portadoras de lesão ibotênica do MnPO, a porcentagem média de neurônios


estímulo osmótico também não foi alterada (figura 13).

56

Lesão fictíciaMnPO Lesão ibotênicaMnPO

SONa

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

DP

/ O

T

SONm

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

DP

/ O

T

SONp

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

DP

/ O

T

SON

OVX + O OVX + T0

20

40

60

80

DP

/ O

T

Figura 13 - Porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos marcados para c-Fos por secção das regiões anterior (SONa), medial (SONm) e posterior (SONp), e no conjunto destas regiões (SON) aos 30 minutos após injeção intraperitoneal hipertônica em ratas ovariectomizadas tratadas com óleo (OVX + O) ou estrógeno e progesterona (OVX + T), submetidas à lesão por ácido ibotênico (Lesão ibotênicaMnPO) ou fictícia (Lesão fictíciaMNPO) do MnPO. Valores são expressos como média ± erro padrão da média. Foram utilizados 4 animais por grupo.

57

DISCUSSÃO

No presente trabalho, a concentração plasmática de LH foi elevada pela terapia

hormonal substitutiva. Este resultado está de acordo com o conhecimento clássico da

literatura (SWERDLOFF et al., 1971; SWERDLOFF; JACOBS; ODELL, 1972) e

caracteriza a retro-alimentação positiva do estrógeno potenciada pela progesterona, sobre

a secreção de gonadotrofinas. Entretanto, esta resposta não foi alterada pela microinjeção

de Losartan no MnPO, indicando que o bloqueio dos receptores AT1 do MnPO não

interfere na retro-alimentação positiva do estrógeno e da progesterona para secreção de

gonadotrofinas.

Vários trabalhos relatam a participação da AII no controle da secreção de LH

(STEELE; NEGRO-VILAR; MCCANN, 1981; DORNELLES; FRANCI, 1998a;

DORNELLES; FRANCI, 1998b; STEELE, 1987; STEELE; GALLO; GANONG, 1985).

O MnPO apresenta sítios ligantes para AII e expressão de mRNA para receptores AT1

(LENKEI et al., 1997). O número de receptores para AT1 no MnPO é maior em ratas

ovariectomizadas tratadas com estrógeno e progesterona do que em ratas

ovariectomizadas não tratadas (DONADIO et al., 2005). Outros autores mostraram

evidências do controle da expressão central de receptores AT1 pelos esteróides ovarianos

(JOHREN et al., 1997; SELTZER et al., 1992; SELTZER et al., 1993).

Portanto, a literatura científica relata a participação da AII, bem como de seus

receptores AT1 no controle da secreção de LH. Entretanto, nossos resultados demonstram

que tal controle possivelmente não depende dos receptores AT1 presentes no MnPO em

ratas ovariectomizadas e tratadas com estrógeno e progesterona.

Em nosso trabalho, o estímulo osmótico reduziu significativamente a

58

concentração plasmática de LH em ratas OVX+T.

Há poucos estudos relatando os efeitos da variação de osmolalidade sobre a

secreção de LH. No trabalho de Almeida e cols (ALMEIDA; VIANNA-FAVARETTO;

LAMANO-CARVALHO, 1996), Wistar male puberes hipernatriofílicos (que consumiam

mais de 5 mL de salina por dia) apresentaram redução da secreção de LH e do

crescimento testicular, sem apresentar alteração na maturação do testículo quando

comparados à ratos normais (que consumiam menos de 5 mL de salina por dia). Dessa

forma, esse trabalho, assim como o nosso, parece apontar para uma ação inibitória da

secreção de LH em resposta ao estímulo osmótico. Do ponto de vista fisiológico, não

seria impossível imaginar que uma condição de estresse salino pudesse desencadear

reações fisiológicas que inibissem a reprodução, pois tal condição fisiológica não é

propícia para a reprodução. Do ponto de vista evolutivo, pelo mesmo motivo citado

acima, não é impossível imaginar que tal processo fisiológico pudesse representar uma

vantagem adaptativa. Contudo, o entendimento dos mecanismos que supostamente

estariam envolvidos na modulação da secreção de LH pelo estímulo osmótico exige um

aprofundamento de investigação. Por isso, qualquer hipótese nesse momento tornar-se-á

fracamente embasada.

Esta queda da secreção de LH em resposta ao estímulo osmótico foi potenciada

pela lesão ibotenica do MnPO.

O SFO e o OVLT juntamente com o MnPO, constituem a lâmina terminal, que

está relacionada com o controle do equilíbrio hidro-eletrolítico (JARRARD;

DAVIDSON, 1991; ANDERSON; BRUNI; KAUFMANN, 1990). Alguns autores

relataram a participação do SFO e do OVLT no controle da secreção de gonadotrofinas

59

(PIVA; LIMONTA; MARTINI, 1982; LIMONTA et al., 1981; KIZER; PALKOVITS;

BROWNSTEIN, 1976; SAMSON et al., 1980; PIVA; LIMONTA; MARTINI, 1982;

LAMPERTI; PICKARD, 1984; LAMPERTI; PICKARD, 1984). Portanto, estas

estruturas poderiam estar participando de circuitos para integrar informações do

equilíbrio hidro-eletrolítico com o ciclo reprodutivo. A interação destas duas funções é

mostrada na literatura (JOHNSON; GROSS, 1993; LEWANDOWSKA et al., 1995;

BOJANOWSKA; GUZEK; DABROWSKI, 1999; BOJANOWSKA et al., 2000;

STACHENFELD; KEEFE, 2002; SUMMY-LONG; KADEKARO, 2001).

O estímulo osmótico provoca a expressão de c-Fos em vários núcleos envolvidos

com o controle do balanço hidro-eletrolítico, como o MnPO, o SFO, o OVLT, o PVN e o

SON (MCKINLEY et al., 2004). Além disso, a expressão de c-Fos também é estimulada

em neurônios LHRHérgicos em ratas ovariectomizadas tratadas com estrógeno e

progesterona (SINGH; BRISKI, 2005; RUBIN; LEE; KING, 1994). Em nosso trabalho, a

expressão de proteína c-Fos foi observada no PVN e SON em resposta ao estímulo

osmótico. Entretanto, nos neurônios LHRHérgicos da MPOA de ratas ovariectomizadas

tratadas com estrógeno e progesterona, a proteína c-Fos não foi expressa. Nos trabalhos

que relatam a expressão da proteína c-Fos foram utilizados anticorpos contra toda a

família de proteínas de expressão imediata (FRA1, FRA 2, c-Fos, FosB), enquanto que

em nosso trabalho foi utilizado um anticorpo específico contra a proteína c-Fos. Contudo,

a ausência da expressão da proteína c-Fos nas ratas ovariectomizadas tratadas com

estrógeno e progesterona foi acompanhada da elevação da secreção de LH e FSH,

indicando que a Proteína c-Fos não parecer ser um bom marcador da atividade dos

neurônios LHRH em resposta ao tratamento com estrógeno e progesterona em ratas

60

ovariectomizadas.

A concentração plasmática de FSH também foi elevada pela terapia hormonal

substitutiva, corroborando os dados já descritos pela literatura (SWERDLOFF et al.,

1971; SWERDLOFF; JACOBS; ODELL, 1972). Esses resultados caracterizam a retro-

alimentação positiva do estrógeno potenciada pela progesterona, Entretanto, o estímulo

osmótico, a microinjeção de Losartan e a lesão do MnPO não alteraram a concentração

plasmática de FSH em ratas ovariectomizadas tratadas ou não com estrógeno e

progesterona. Não encontramos trabalhos relatando a participação do MnPO, de seus

receptores AT1, bem como do estímulo osmótico sobre o controle central da secreção de

FSH. Sendo assim, provavelmente, estas variáveis estudadas não interferem com o

controle da secreção de FSH em ratas ovariectomizadas e tratadas com estrógeno e

progesterona.

Entretanto, as dosagens de LH e FSH permitiram comprovar a eficácia do modelo

de terapia hormonal utilizada e caracterizar a situação hormonal em que estaríamos

analisando a ativação de neurônios ocitocinérgicos nos núcleos supraópticos e

paraventriculares.

No presente trabalho, o estímulo osmótico elevou a concentração plasmática de

OT em ratas OVX + O e nas ratas OVX + T. A OT plasmática é sintetizada pelas células

magnocelulares e parvocelulares do PVN e SON em resposta ao estímulo osmótico tanto

em ratos (MCCANN et al., 1994) como em ratas ovariectomizadas submetidas ou não à

terapia hormonal substitutiva (CALIGIONI; FRANCI, 2002).

A região AV3V é constituída pelo núcleo preóptico mediano (MnPO), órgão

vasculoso da lâmina terminal (OVLT) e região periventricular preóptica anterior e é

61

extremamente sensível à ação da AII (ANDERSON; BRUNI; KAUFMANN, 1990;

ANTUNES-RODRIGUES et al., 1991; BUGGY et al., 1978; FITTS; MASSON, 1990;

GARDINER; STRICKER, 1985a; GARDINER; STRICKER, 1985b; HONDA et al.,

1992; JOHNSON, 1985; JOHNSON; ZARDETTO-SMITH; EDWARDS, 1992;

ROCHA et al., 1999). Projeções angiotensinérgicas partem do SFO e chegam aos

neurônios vasopressinérgicos e ocitocinérgicos do PVN (KADEKARO et al., 1992;

REICHLINS, 1992). Alguns trabalhos relatam a participação do MnPO nessas vias,

pois tanto a ingestão de água induzida pela microinjeção de AII no SFO como a

ativação de neurônios magnocelulares do PVN provocada por microinjeção de AII ou

estimulação elétrica no SFO são reduzidas pela microinjeção prévia de saralasina, um

antagonista de AII, no MnPO (TANAKA; NOMURA, 1993; TANAKA, 1989). Um

número grande de fibras imunorreativas à AII e de receptores para AII estão presentes

no MnPO(PLUNKETT et al., 1987).

Por outro lado, a microinjeção de AII no MnPO aumenta a secreção de OT em

ratos previamente submetidos à depleção de sódio ou à injeção intraperitoneal de salina

isotônica, mas reduz em ratos submetidos à injeção intraperitoneal de salina hipertônica.

Ou seja, a ativação dos receptores para AII estariam envolvidos numa via estimulatória

da secreção de OT nas condições de isotonicidade ou de depleção de sódio e numa via

inibitória da secreção de OT em condição de hipertonicidade (DE LUCCA JR W;

FRANCI, 2004). Resultados de outros trabalhos também podem ser interpretados a partir

dessa hipótese, pois no trabalho de Ferguson (FERGUSON; KASTING, 1988), animais

com lesão rostral do SFO apresentaram uma concentração basal elevada de OT,

comparada à dos animais com lesão caudal ou animais intactos. Nessa região rostral está

62

a maioria das eferências que partem do SFO (LIND; VAN HOESEN; JOHNSON, 1982;

MISELIS, 1981), e tais eferências para o MnPO e PVN são possivelmente

angiotensinérgicas (TANAKA, 1989; TANAKA; NOMURA, 1993). Deste modo, é

possível supor que uma via angiotensinérgica inibitória dessa região do SFO para o

MnPO poderia modular a secreção de OT por neurônios do PVN (DE LUCCA JR W;

FRANCI, 2004).

Estudos utilizando imuno-histoquímica mostraram que neurônios do SFO de

ratas ovariectomizadas tratadas ou não com estrógeno apresentam expressão de

receptores para estrógeno e para AII, bem como co-expressão deles. Além disso, o

grupo de ratas ovariectomizadas apresentou número maior de neurônios imunorreativos

para AII, estrógeno ou ambos comparado ao grupo de ratas ovariectomizadas tratadas

com estrógeno, sugerindo uma modulação inibitória do estrógeno circulante sobre a

expressão desses receptores (ROSAS-ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO,

1999).

Em nossos experimentos, a lesão por ácido ibotênico e o bloqueio dos receptores

AT1 no MnPO por meio da microinjeção de Losartan não modificaram a secreção de OT

em resposta ao estímulo osmótico nas ratas OVX + O e nas ratas OVX + T.

Anteriormente, foi verificado que a elevação da OT plasmática em resposta ao

estímulo osmótico depende da integridade dos núcleos da região AV3V, pois a lesão

eletrolítica da AV3V reduziu a liberação de OT em resposta a esse estímulo

(REICHLINS, 1992). A região AV3V é constituída pelo núcleo preóptico mediano

(MnPO), órgão vasculoso da lâmina terminal (OVLT) e região periventricular preóptica

anterior. Assim, excluindo uma possível participação do MnPO em função de nossos

63

dados, a secreção de ocitocina em resposta ao estímulo osmótico envolveria um circuito

com a participação do OVLT, da região periventricular preóptica anterior ou diretamente

do SFO.

Assim, parece que a secreção de ocitocina em resposta ao estímulo osmótico nas

condições estudadas não envolveria um circuito com a participação do MnPO e seus

receptores AT1.

Em resposta ao estímulo osmótico, além da secreção de OT, também analisamos a

expressão de c-Fos em neurônios OT das diversas regiões magnocelulares do SON e do

PVN separadamente e do conjunto dessas regiões em cada núcleo. Assim, nossos

resultados mostram que o número de neurônios magnocelulares OT do PVN ativados

pelo estímulo osmótico foi reduzido pela lesão ibotênica do MnPO em ratas OVX+O e

ratas OVX+T.

A expressão de c-Fos no MnPO, PVN e SON em resposta ao estímulo osmótico

intravenoso (1,4 M) foi reduzida pela lesão eletrolítica da AV3V, do SFO ou ambos

(ROWLAND et al., 1995). A infusão intragástrica de salina hipertônica (0,6M), um

estímulo moderado, foi suficiente para provocar a expressão de c-Fos no OVLT, PVN e

SON, mas não no SFO e MnPO (STARBUCK; FITTS, 2002). Apesar do SFO não

expressar c-Fos para estímulos moderados, suas conexões parecem modular a expressão

de c-Fos no OVLT, PVN e SON, pois a interrupção das fibras que partem do SFO para o

PVN reduz a expressão de c-Fos no PVN e SON. Considerando que o SFO projeta

eferências para neurônios magnocelulares do PVN e SON através de conexões no MnPO

(TANAKA; NOMURA, 1993; TANAKA, 1989), não se pode descartar que mesmo não

tendo expressado c-Fos, o MnPO também possa modular, pelo menos em parte, a

64

expressão de c-Fos no PVN e SON.

Portanto, é possível supor que parte dos neurônios magnocelulares OT do PVN

ativados pelo estímulo osmótico compõem circuitos que envolvem a participação do

MnPO.

Nossos resultados confirmam que a possibilidade da participação do MnPO na

ativação de neurônios magnocelulares OT do PVN ocorre de forma regionalizada. A

análise dos nossos dados considerando as regiões magnocelulares do PVN separadamente

indica efeitos diferentes da lesão sobre a ativação dos neurônios OT e também da

variação dos esteróides ovarianos. Verificamos que a lesão reduziu a ativação de

neurônios OT nas regiões PeM e PaMM em ratas OVX+O e nas região PaAC em ratas

OVX+T. Esses dados indicam que os neurônios OT ativados por circuitos que envolvem

o MnPO estão suscetíveis às variações de esteróides ovarianos. É possível imaginar a

vantagem adaptativa para esse tipo de funcionamento de circuito neural, pois essa

resposta ocorrendo de forma diferente para cada região aumenta a plasticidade de

resposta desse circuito na condição de hipertonicidade plasmática para responder aos

estímulos provenientes de diferentes sistemas, como o reprodutor e o hidro-eletrolítico.

Entretanto, é difícil discutir essa hipótese devido à escassez de estudos que analisem

separadamente as diferentes regiões do PVN.

Adicionalmente, nossos resultados mostraram que dentre os animais com lesão do

MnPO, a Terapia Hormonal Substitutiva elevou a porcentagem média de neurônios

ocitocinérgicos com marcação positiva para c-Fos nas regiões PeM, PaMM e PVNm do

PVN após injeção intraperitoneal de salina hipertônica e lesão ibotênica do MnPO.

Outros estudos em ratas ovariectomizadas e tratadas com estrógeno também apontam

65

esse aumento da expressão de c-Fos em neurônios OT do PVN em resposta à AII icv

(KISLEY et al., 2000), aumentando assim as evidências da modulação dos esteróides

gonadais sobre os circuitos de controle hidro-eletrolítico.

Os circuitos ativados pelo estímulo osmótico, que induzem ativação de neurônios

magnocelulares OT das regiões PaLM do PVN e o SON, possivelmente não dependem

do MnPO e nem parecem ser suscetíveis às variações de esteróides ovarianos, pois a

expressão de c-Fos em neurônios OT do SON em cada região (anterior, medial e

posterior), no conjunto de suas regiões e na região PaLM do PVN não foi alterada pela

lesão ibotênica do MnPO e não diferiu entre ratas OVX+O e OVX+T.

Portanto, com base nesses resultados referentes à participação do MnPO nos

circuitos que regulam a ativação de c-Fos no PVN em resposta ao estímulo osmótico, é

possível fazer as seguintes inferências a respeito da relação estrutura-função do PVN:

1) que o MnPO participa do controle da ativação de neurônios ocitocinérgicos das

regiões PeM e PaMM em resposta ao estímulo osmótico.

2) que a ativação de neurônios ocitocinérgicos em resposta ao estímulo osmótico

no SON e nas regiões PaLM e PaAC do PVN possivelmente não dependem do MnPO e

da ação de esteróides gonadais.

3) que os neurônios OT ativados por circuitos que envolvem o MnPO estão

suscetíveis às variações de esteróides ovarianos;

4) que a THS eleva a porcentagem média de neurônios ocitocinérgicos com

marcação positiva para c-Fos nas regiões PeM, PaMM e PVNm do PVN após injeção

intraperitoneal de salina hipertônica e lesão ibotênica do MnPO.

Quando executamos o estímulo osmótico após o bloqueio de receptores AT1 no

66

MnPO, verificamos redução da porcentagem de neurônios magnocelulares OT ativados

no PVN de ratas OVX+T , mas não de ratas OVX+O. Contudo, essa redução da

porcentagem de neurônios magnocelulares OT ativados ocorreu para algumas, mas não

para outras regiões do PVN, pois verificamos que o bloqueio de receptores AT1 reduziu o

número de neurônios OT ativados nas regiões PeM e PaMM, mas não alterou em outras

regiões magnocelelulares do PVN, em ratas OVX + T. Assim, parte dos neurônios

magnocelulares OT das regiões PeM e PaMM do PVN, ativados pelo estímulo osmótico

compõe circuitos que envolvem a participação de uma via angiotensinérgica mediada por

receptores AT1, que está sob mediação de esteróides ovarianos.

A microinjeção icv de Losartan em ratos machos reduziu a porcentagem de

neurônios c-Fos positivos no PVN, em resposta à angiotensina icv (ROWLAND et al.,

1995; ZHU et al., 2005) e ao estímulo osmótico. A ativação de neurônios do PVN em

resposta a estímulo osmótico possivelmente depende de vias angiotensinérgicas

provenientes do SFO, o qual possui receptores AT1 sensíveis à AII de origem periférica

(LI; FERGUSON, 1993; LIND; VAN HOESEN; JOHNSON, 1982) e, talvez em menor

grau, de vias provenientes do núcleo do trato solitário e medula ventrolateral, centros de

controle autonômico, onde há expressão de receptores AT1 (KRUKOFF et al., 1992;

KRUKOFF et al., 1995). Essas vias angiotensinérgicas projetam para neurônios do

PVNm onde há também expressão de receptores AT1, os quais expressam c-Fos em

resposta à infusão intravenosa de AII (DAWSON; JHAMANDAS; KRUKOFF, 1998).

Em nosso trabalho o bloqueio de receptores AT1 no MnPO reduziu a porcentagem de

neurônios OT nas regiões PeM e PaMM do PVN ativados pelo estímulo osmótico,

corroborando assim, a hipótese da existência de uma via angiotensinérgica originária do

67

SFO e que trafega pelo MnPO em direção ao PVN. No entanto, esta resposta de redução

ocorreu em ratas OXV+T, não em ratas OVX+O, indicando que essa via é suscetível às

variações de esteróides ovarianos. Essa resposta pode estar ocorrendo devido a um

aumento da expressão de receptores AT1 do MnPO provocado pela ação do estrógeno e

da progesterona. Essa ação dos esteróides gonadais sobre a expressão dos receptores AT1

parece não ser replicada pelo tratamento com estrógeno sem a presença da progesterona,

pois estudos com ratas OVX tratadas com estrógeno revelaram uma redução do número

de neurônios imunorreativos para AII, estrógeno ou ambos, no SFO em comparação às

ratas OVX tratadas com óleo. (ROSAS-ARELLANO; SOLANO-FLORES; CIRIELLO,

1999). Além disso, uma redução da quantidade de receptores AT1 e seu RNA, na

pituitária e no SFO, foi observada também em ratas OVX submetidas ao tratamento com

estrógeno (KISLEY; SAKAI; FLUHARTY, 1999), assim como uma atenuação da

ingestão de água, possivelmente decorrente da alteração de receptores AT1 no SFO

(KISLEY et al., 2000). Esses resultados sugerem uma modulação inibitória do estrógeno

circulante sobre a expressão dos receptores para AII.

Entretanto, alguns trabalhos têm mostrado ações estimulatórias e facilitadoras do

estrógeno sobre a ação da AII. As ações centrais da AII, estimulatória sobre a secreção

de LH e inibitória sobre a secreção de prolactina, foram facilitadas pelo estrógeno

(DORNELLES; FRANCI, 1998a; MORENO; FRANCI, 2004). Resultado semelhante

para neurônios vasopressinérgicos foi relatado no trabalho de Kisley e cols. (KISLEY et

al., 2000), no qual a microinjeção i.c.v. de AII em ratas OVX tratadas com estrógeno

estimulou a ativação de neurônios vasopressinérgicos na região PaLM do PVN quando

comparadas às ratas OVX tratadas com óleo.

68

Contudo, os circuitos ativados pelo estímulo osmótico, que induzem ativação de

neurônios magnocelulares OT das regiões PaLM e PaAC do PVN e o SON,

possivelmente não dependem dos receptores AT1 do MnPO especificamente, e nem

parecem ser suscetíveis às variações de esteróides ovarianos, pois a expressão de c-Fos

em neurônios OT do SON em cada região (anterior, medial e posterior), no conjunto de

suas regiões, nas regiões PaAC e PaLM do PVN não foi alterada pelo bloqueio dos

receptores AT1 no MnPO e não diferiu entre ratas OVX+O e OVX+T. Entretanto, não

podemos descartar a importância dos neurônios magnocelulares dessas regiões para os

circuitos de ajuste do balanço hidro-eletrolítico, pois o estímulo hipertônico, ainda que

moderado, é suficiente para induzir expressão de c-Fos no OVLT, PVN e SON.

Portanto, com base nos dados desse trabalho em relação às vias

angiotensinérgicas que passam pelo MnPO é possível concluir: 1) que os receptores

AT1 do MnPO participam do controle da ativação de neurônios ocitocinérgicos das

regiões PeM e PaMM em resposta ao estímulo osmótico; 2) que o recrutamento desses

circuitos ativados pelo estímulo osmótico é modulado pelos esteróides gonadais; e 3)

que a ativação de neurônios ocitocinérgicos em resposta ao estímulo osmótico no SON

e nas regiões PaLM e PaAC do PVN, possivelmente, não dependem dos receptores AT1

do MnPO e da ação de esteróides gonadais.

Por fim, por que não há alteração da secreção de ocitocina apesar da diminuição

da porcentagem de neurônios ocitocinérgicos ativados pelo estímulo osmótico em

decorrência das manipulações (lesão ibotênica, bloqueio de AT1, variação de esteróides

ovarianos)? Provavelmente, o contingente de neurônios OT que deixa de ser ativado

pela lesão ou pelo bloqueio de receptores AT1 no MnPO não contribui ou contribui pouco

69

para a liberação de OT pela neuro-hipófise. Estes neurônios ocitocinérgicos poderiam

projetar-se para amígdala e hipocampo (BUIJS, 1978) para controlar o comportamento de

ingestão de sódio, visto que o bloqueio por microinjeção de Losartan no MnPO reduz a

ingestão de salina isotônica estimulado pela depleção de sódio (DE LUCCA JR W;

FRANCI, 2004).

70

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ATIVAÇÃO OSMÓTICA DE NEURÔNIOS OCITOCINÉRGICOS …livros01.livrosgratis.com.br/cp033288.pdf · submetidas à ovariectomia bilateral (ratas OVX) e colocadas em um aparelho estereotáxico