ARTIGO:
RESUMO 1:
Medidas de transporte molecular atravs de complexos de poro
nuclear (NPCs) fornecerm informaes valiosas que podem ser usados
para revelar os mecanismos de comunicao entre o ncleo e o
citoplasma. Mas, molculas individuais sofrem um transporte muito
rpido, sendo difcil de seguir o seu movimento em um estado
fisiolgico em clulas vivas.A espectroscopia de correlao de
fluorescncia (FCS) fornece sensibilidade a uma nica molcula, na
presena de muitas outras. Neste estudo, foram medidos os tempos de
transporte nucleocitoplasmtico de molculas GFP, em todo o envelope
nuclear (NE), mas sem resoluo de um nico poro.
Medindo as mudanas na intensidade de fluorescncia ao longo da
orbita, pode-se determinar as correlaes no espao e no tempo de
molculas de ligao individuais e deixando o NPC. Para realizar o
mtodo, foi utilizado o receptor nuclear Kapb1 marcados para GFP e
transitoriamente introduzidos em clulas CHO-K1. Kapb1-GFP serve
como um marcador dinmica do poro, uma vez que transporta atravs do
NE e localmente acumula em NPCs individuais, onde se realiza o
transporte bidireccional. De acordo com o modelo molecular Kapb1
reconhece a molcula de carga no lado citoplasmtico do NPC e
transloca-se para a cesta nucleoplsmica, onde liberta a sua carga e
se liga a RanGTP. O complexo Kapb1-RanGTP facilmente exportado de
volta para o citoplasma. Este processo bidirecional sustentada pelo
gradiente qumico de RanGTP atravs do NE.
Ao longo da rbita, 64 pontos so amostrados. A orientao da NE
selecionado de tal maneira que o ponto de incio de digitalizao
situa-se sobre a NE. Assim, a primeira metade da rbita pontos
corresponde a um compartimento (por exemplo, o ncleo) e a segunda
metade corresponde ao outro compartimento. A intensidade de
fluorescncia registado ao longo da rbita e, em seguida, calculado
num tapete bidimensional, em que o eixo x representa o nmero total
de pontos ao longo da rbita pontos e o eixo y representa o tempo de
aquisio. Normalmente, 6,4x105 rbitas so digitalizados,
correspondendo a ~ 32 s de aquisio total (tempo rbita 0,5 ms).
Anlise FCS realizado para extrair informaes sobre a dinmica
Kapb1 a nvel nica molcula. Calcula-se a funo de autocorrelao (ACF)
em cada ponto ao longo da rbita para quantificar a difusividade
correspondente do Kapb1-GFP. A protuberncia identifica um tempo
caracterstico de correlao de fluorescncia as flutuaes detectadas no
poro, o que pode ser explicado em termos de movimento bidirecional
da Kapb1-GFP atravs do poro Por conseguinte, as corcundas podem
estar em diferentes locais (e tempos) porque as molculas podem
razoavelmente iniciar e parar em pontos diferentes na estrutura de
poros.Os dois componentes da Kapb1 de vaivm podem ser separados por
par de correlao espacial entre os pontos 16 e 48 (e o inverso) da
rbita. Se a interpretao do perfil ACF correcta, o efeito de
protuberncia deve provar ser 1), dependente da presena de Kapb1
(isto , reflectindo uma actividade Kapb1); 2), caracterstica da
proximidade do poro (ou seja, a actividade de poro reflectindo); e
3), dependente da energia metablica.
Assim, a combinao de FCS com acompanhamento orbital nos permite
extrair as correlaes caractersticos de eventos de transporte no
sistema de referncia da poro, e na presena de muitas molculas, sob
condies fisiolgicas
