Modelarea evolutiei prin arbori filogenetici

Diaconu Alexandru Rares

Universitatea din Craiova, Facultatea de Stiinte Exacte

ABSTRACT

In acest studiu am studiat doua tipuri de arbori filogenetici obtinuti prin

metode de clusterizare, folosind o varianta a algoritmilor UPGMA, repectiv

Neighbor-Joining, pe care pot fi folositi apoi n analiza evolutiei speciilor.

Subject headings: filogenetica, evolutia moleculara, algoritmul UPGMA, algorit-

mul Neighbor-Joining,

1. Motivatia temei

Studiile filogenetice au drept scop reconstruirea istoriei evolutive a organismelor vii.

Termenul de filogenie (phylogenese) provenit de la cuvintele grecesti phulon - rasa si

genetikos, genesis - origine, a fost introdus de catre Haeckel n 1860 [1], care l-a definit

ca fiind istoria dezvoltarii paleontologice a organismelor prin analogie cu istoria dezvoltarii

individuale. Mult timp, constructia arborilor filogenetici s-a bazat pe folosirea caracterelor

morfologice, anatomice si paleontologice. Primul arbore filogenetic al vertebratelor, stabilit

de Zuckerkandl si Pauling n 1962 folosind date moleculare [2], este aproape identic cu cel

obtinut utilizand clasificarea biologica. O data cu evolutia tehnicilor de biologie moleculara

si cu punerea la punct a tehnicii de secventializare de catre Sanger n 1977, s-a produs o

adevarata revolutie privind utilizarea secventelor ADN n filogenie.

Producerea, publicarea si introducerea unui numar mare de secvente genetice n bazele

de date internationale au dus la dezvoltarea bioinformaticii aplicate acestui domeniu, mate-

rializata printr-o oferta larga de programe necesare alinierii, analizei secventelor genetice si

construirii arborilor filogenetici.

Evolutia realizata prin selectia naturala a cauzat modificarea speciilor populatiei prin

trei mecanisme principale: schimbarea populatiei ntr-un timp evolutiv si mpartirea aces-

teia n mai multe ramuri, hibridizarea a doua specii anterioare diferite ntr-una singura, sau

sfarsitul populatiei prin distrugerea ei [3]. Inca de cand a aparut viata pe aceasta planeta,

au evoluat foarte multe specii distincte nrudite ntre ele. Filogenetica se ocupa cu studiul

2

caracterelor evolutive nrudite ale speciilor si populatiilor. Filogenia traditionala trateaza

modul n care speciile evolueaza, nca de la aparitia datelor despre genomi, pornind de la

cele fiziologice (structura osoasa de la fosile, etc). Vom aborda filogenetica dintr-o per-

spectiva diferita: vom analiza date de secvente ADN pentru a determina relatiile dintre si

ntre specii. In esenta, dorim sa evidentiem selectia naturala n populatii. Aceasta zona de

studiu din biologia computationala devine din ce n ce mai importanta, cu aplicatii com-

erciale n domeniul genomicii. Recent, s-a stabilit ca o companie afiliata MIT&Harvard sa

secventializeze genomi individuali pentru suma de 5000 de dolari.

Am abordat aceasta problema de biologie n termeni computationali, studiind doi algo-

ritmi, UPGMA si Neighbor-Joining, ce construiesc specii sau arbori de gene din aceste date

relationale. Vom explica, n continuare, diferenta dintre specii si arborii de gene.

Printre multe alte probleme deschise din domeniul filogeneticii ce se pot rezolva cu

ajutorul genomicii, mai apar si altele: cat de mult se aseamana doua specii, gasirea speciei

din care a evoluat omul (cimpanzeii sau gorilele sau alta), dar si multe altele. Foarte multe

probleme fara raspuns din biologia evolutiva au fost descifrate si rezolvate de filogenetica

genomica. Una din aceste probleme este reprezentata de revelatia ca cel mai apropiat animal

nrudit cu balena este hipopotamul [3].

In filogenetica, informatia este reprezentata cel mai bine cu ajutorul arborilor, acestia

aratand, n detaliu, legaturile dintre specii sau dintre gene. Exista probleme importante

legate de necesitatea filogeniei atunci cand evolutia este simulata cu ajutorul arborilor, aces-

tea fiind (conform Mount [4]):

nodurile ce unesc ramurile arborelui (tipul precis de ascendenti comuni); semnificatia lungimilor ramurilor (masurate sau nu n timp); tipul de mpartire a ramurilor arborelui (de obicei, este mpartire binara).

Ca o informatie aditionala la a treia chestiune de mai sus, profesorul Pavel Pevzner,

membru UCSD, a mentionat ca ordinea convergentei la problema daca oamenii sunt mai

apropiati de caini sau de soareci, necesita un model de trifurcatie (o mpartire n trei moduri).

Este important sa observam ca genele si speciile sunt doua lucruri distincte. Aceeasi

gena (sau usoara deformatie a ei) se poate gasi n specii diferite, adica n organisme care nu

se pot ncrucisa. Gandindu-ne ntr-un alt mod, un arbore de specii este un caz particular de

arbore de gene ce cuprinde o secventa de gene comune. Mai mult, ntr-un arbore de specii

poate exista un flux de gene ntre diferite ramuri ale arborelui. Daca fiecare frunza este

3

un organism, atunci arborele este un arbore de specii. Un arbore de gene cuprinde atat

formarea descendenta de specii noi cat si dublarea lor, lungimea dintre radacina si frunze

reprezentand numarul de mutatii dintre cele doua ([5]). Ordinul complexitatii arborelui

(ramificatia lungimilor si numarul de mutatii) arata ce tipuri de algoritmi trebuie folositi.

In acest studiu, ne concentram pe compararea secven telor, pentru a construi arbori de gene

si arbori de specii.

Sa luam, de exemplu, populatia umana: nca de cand specia noastra a plecat de pe

continentul african, rata mutatiei din cadrul genomului uman pare a fi devenit un eveniment

filogenetic. Mutatiile sunt rare, cel mult 1000 de mutatii (sau polimorfisme cu o singura

nucleotida, sau SNP) ntr-un total de trei miliarde de genomi cu nucleotide. Acesta este

motivul pentru care sunt realizate harti de arbori genealogici, datorita flexibilitatii acestei

complexitati.

Genele sunt produse prin doua mecanisme principale:

1. duplicarea: noi versiuni de gene vechi (este procesul cel mai frecvent);

2. gene noi: segmente de gene (ce decodifica), sau o conexiune de secvente de codificare

(nucleotide functionale), acestea aparand mai rar.

Am studiat doua tipuri de arbori: un arbore de specii, acestea avand trasaturi comune,

provenind de la o singura specie, frunzele arborelui reprezentand specii diferite (cladograma)

si un arbore filogenetic sau evolutiv ce reprezinta numarul schimbarilor caracterelor prin

lungimile ramurilor sale, neavand radacina . Aceste trei tipuri de arbori asociaza diferite

sensuri lungimilor ramurilor, n ordinea n care apar: schimbare genetica si timpul parcurs.

Speciile cu o durata de exploatare mult mai mica si cu perioade de reproducere mai mari au

tendinta de a arata schimbari genetice mult mai mari (de exemplu, genele de la soareci si

cele umane).

In bioinformatica, apare o dilema: putem sa cream un algoritm ce rezolva bine problema

data, sau putem sa cream un model mai potrivit (de exemplu, cum pot fi folosite schimbarile

frecvent observate ntr-o secventa, pentru a indica o distanta catre o alta secventa).

2. Evolutia moleculara

In mare parte, evolutia moleculara este un proces de evolutie la nivelul ADN-ului, ARN-

ului si al proteinelor. Evolutia moleculara a aparut n anii 1960, ca un domeniu stiintific,

atunci cand cercetatorii din biologia moleculara, biologia evolutiva si din genetica populatiei

4

au cautat sa nteleaga structura si functia acizilor nucleici si ale proteinelor. Unele din

subiectele cheie ce au grabit dezvoltarea acestui domeniu au fost evolutia functiei enzimelor,

folosirea divergentei acidului nucleic ca un ceas molecular pentru studiul divergentei speci-

ilor, precum si originea ADN-ului decodificant.

Progresul recent n domeniul genomicii, incluzand secventierea ntregului genom, car-

acterizarea puterii de trecere a proteinei si bioinformatica, a condus la o crestere dramatica

a studiilor referitoare la aceasta problema. In anii 2000, unele subiecte de disputa au fost:

duplicarea genelor n scopul aparitiei noii functii de gene, extinderea evolutiei adaptive molec-

ulare versus procesele neutre de mutatie si de deplasare, precum si identificarea schimbarilor

moleculare responsabile ale caracteristicilor umane diferite, n special cele aferente infectiilor,

bolilor si perceptiilor.

Un domeniu important n studiul evolutiei moleculare l reprezinta folosirea datelor

moleculare pentru determinarea clasificarii biologice corecte a organismelor. Acest domeniu

se numeste sistematica moleculara sau filogenetica moleculara.

In studiul evolutiei moleculare, s-au dezvoltat unelte si concepte folosite pentru genomica

comparativa si genetica moleculara, pe langa faptul ca fluxul de date noi din aceste domenii

au dus la mbunatatirea evolutiei moleculare.

3. Modelarea evolutiei

Inainte de a construi un arbore, avem nevoie de o metoda pentru masurarea perioadelor

evolutive astfel ncat sa poata fi construita o matrice a distantelor. Aceasta matrice va

permite schimbarea unei multimi de secvente ntr-o multime de perechi de distante ntre

secvente. Vom folosi doua tipuri de mutatii cu o singura nucleotida: transformari (A G,CT ) si substitutii (AT,GC) care au loc n acelasi timp. Consideram doua modeleMarkov fixe reprezentate de o matrice de substitutie a nucleotidelor, ce presupune ca fiecare

nucleotida se dezvolta independent de cealalta.

Abordarea Jukes-Cantor [5] presupune o perioada constanta de evolutie, atribuind o

rata la auto-mutatia (AA,GG,CC, T T ) si alta rata la mutatia ncrucisata (Aunadin C,G, T ). Matricea Jukes-Cantor de substitutie AGCT este:

S =

r s s s

s r s s

s s r s

s s s r

.

5

Pentru perioade de timp scurte, perioada evolutiva este constanta: r = 13 si s = .Pentru perioade mai lungi de timp, rata este reprezentata de o functie de timp: r = 0, 25(1+

3e4t) si s = 0, 25(1 e4t). Modelul Kimura [4] continua luand n considerare faptul catransformarile sunt mai frecvente decat substitutiile. Matricea Kimura de substitutie AGCT

este:

S =

r s u u

s r u u

u u r s

u u s r

,

unde s = 0, 25(1 e4t), u = 0, 25(1 + e4t e2(+)t) si r = 1 2s u.

4. De la distante la arbori

In functie de modelele generatoare Markov si de matricile de substitutie corespunzatoare

(dependente de timp), se va determina matricea distantelor. Elementele acestei matrici,

dij, reprezinta distanta dintre doua secvente aliniate corect. Putem sa definim matricea

distantelor, (dij), ca o fractie de pozitii, f , unde nu se potrivesc doua secvente, xi si xj:

dij = 34 log(1 4f/3). Acest model se blocheaza atunci cand f = 0, 75, fapt ce duce lalimitarea cantitatii de nepotrivire dintre cele doua secvente.

Pentru a folosi, apoi, matricea distantelor n masurarea distantelor actuale dintre orice

pereche de secvente (adica, pentru construirea unui arbore), consideram doi arbori standard:

1. distantele ultrametrice indica drumuri echidistante de la orice nod frunza la radacina,

n timp ce

2. distantele aditive arata ca toate perechile de distante sunt obtinute prin parcurgerea

arborelui.

Arborii ultrametrici nu prea sunt valabili, deoarece distanta ultrametrica presupune

o rata uniforma de evolutie, n timp ce distantele aditive reprezinta un model mai putin

restrictiv. In practica, matricea distantelor nu este nici ultrametrica si nici aditiva.

Atat dualitatea arborilor cat si matricea distantelor presupun ca distantele sunt obtinute

prin parcurgerea arborilor. Daca folosim distante ultrametrice, atunci vom gasi si arborele

corect, minimizand discrepanta dintre distantele observate si cele bazate pe arbore. Pe de

alta parte, daca folosim distante aditive, vom gasi arborele corect prin valori apropiate.

6

5. Algoritmi de construire a arborilor

5.1. UPGMA

UPGMA (Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages = metoda nepon-

derata de grupare a perechilor folosind medii aritmetice) este cel mai simplu exemplu de

algoritm de construire a unui arbore. UPGMA contine un algoritm de clustering ierarhic

ce ncepe de la frunzele arborelui facandu-si drum pana la radacina. Ca valoare de intrare,

ia o matrice a distantelor si creaza un arbore ultrametric (adica, n concordanta cu ipoteza

moleculara a perioadelor evolutive egale dintre specii). Numai daca matricea distantelor

de la intrare este ultrametrica, atunci algoritmul UPGMA va crea arborele corect. Daca

matricea distantelor este aditiva, atunci nu avem nicio garantie ca perechile de distante ale

ramurilor arborilor sunt cele specificate n matricea distantelor.

In alta ordine de idei, se construieste un arbore, pornind de la grupuri (clustere) cu un

singur element, prin unirea a cate doua grupuri de similaritate maxima (distanta minima).

Distanta dintre doua clustere se defineste astfel:

dij =1

|Ci||Cj |pCi,qCjdpq.

Date doua clustere Ck si Cl, cu Ck = Ci Cj:

dkl =dil|Ci|+djl|Cj |

|Ci|+|Cj | .

Algoritmul este urmatorul:

P1. Se initializeaza fiecare secventa cu cate un cluster. Acestea vor forma frunzele arborelui.

P2. Se gaseste perechea de secvente cu distanta minima din matricea distantelor,D. Aceasta

pereche formeaza primul cluster si desenam prima parte de arbore unind perechea. De

exemplu, din matricea D, gasim ca secvA si secvB au distanta minima de 10. Desenam

arborele unind secvA cu secvB, cu lungimea de 5. Astfel, distanta totala dintre ele

este 10.

P3. Se actualizeaza matricea D: se adauga la D o noua linie si coloana reprezentand secvAB.

Distanta dintre secvAB si secvC este12(dAC + dBC). Se nlatura liniile si coloanele

asociate cu secvA si secvB. In total, matricea se micsoreaza cu o linie si o coloana.

De aici nainte, uitam complet de secvA si secvB si presupunem ca avem doar secvAB.

7

P4. Se repeta pasii P2 si P3 pana cand matricea D devine goala.

Alti pasi ai algoritmului sunt urmatorii:

Initializare:

multimea clusterelor C = {}for i = 1..n

Ci = {secventai}C = C {Ci}defineste o frunza i pentru secventai, plasata la naltime hi = 0

Iteratie:

gaseste clusterele Ci, Cj pentru care dij e minima

(n cazul cand exista mai multe astfel de perechi, se alege una aleator)

construieste Ck = Ci Cjfor all Cl n C

calculeaza dkl

defineste un nod k, parinte pentru i si j,

cu hk = dij/2

C = (C {Ci, Cj}) {Ck}Terminare:

cand raman doar doua clustere Ci si Cj,

construieste un nod radacina la naltimea hr = dij/2

5.2. Neighbor-Joining (unirea valorilor vecine)

Pentru generarea arborilor filogenetici ce reprezinta numarul schimbarilor caracterelor

prin lungimile ramurilor, acestea fiind proportionale cu perioadele evolutive, se foloseste un

algoritm Neighbor-Joining mai complicat. Daca matricea distantelor de intrare este aditiva,

acest algoritm garanteaza crearea arborelui corect, si poate produce tot un arbore corect,

8

chiar si atunci cand matricea distantelor nu este aditiva.

Spre deosebire de algoritmul UPGMA, construieste arbori fara radacina, si elimina pre-

supunerea ca divergenta secventelor fiice a avut loc la acelasi moment de timp (exprimata

prin drumuri de lungime egala de la radacina la orice frunza). La fiecare pas, se aleg cele

mai apropiat doua secvente, de data aceasta apropierea fiind exprimata nu doar n functie

de distanta propriu-zisa ntre secvente (care trebuie sa fie cat mai mica), ci si de media

distantelor fiecarui nod fata de celelalte noduri (care trebuie sa fie cat mai mare):

Dij = dij (ri + rj)

unde

ri =1

|L|2kLdik

este utilizat si la reglarea distantei dintre nodurile fiu i, j si parintele k.

Algoritmul este urmatorul:

P1. Se creaza o noua matrice M din matricea distantelor, D, cu aceleasi dimensiuni:

Mij = Dij kDik+Djk

N2 ,

unde N este numarul secventelor. Aceasta este metrica ajustata a distantelor, ce arata

ca Mij este minim daca si numai daca i si j sunt vecini.

P2. (similar cu P2 din UPGMA): Se gaseste perechea de secvente cu distanta minima din

noua matrice M . Aceasta pereche formeaza primul cluster, si putem desena prima

parte din arbore unind valorile din pereche. De exemplu, din matricea M , gasim

secvA si secvB care au distanta minima. Unim secvA cu secvB prin noul nod U .

Lungimea ramurii de la A la U se calculeaza astfel: DAU =12

(DAB +

kDAk+DBk

N2

). De

asemenea, DBU = DAB DAU .P3. (similar cu P3 din UPGMA): Se actualizeaza matricea D. Se adauga la matricea D

o noua linie si coloana reprezentand nodul U . Distanta dintre U si alta secvC va fi12(dAC + dBC dAB). Se sterg liniile si coloanele asociate cu secvA si secvB. In total,

matricea se micsoreaza cu o linie si o coloana. De aici nainte, uitam complet de secvA

si secvB, si presupunem ca avem nodul U .

9

P4. Se repeta pasii P1, P2 si P3 pana cand matricea D se goleste.

Altfel scris, algoritmul devine:

Initializare:

multimea nodurilor frunza T = multimea secventelor

L = T

Iteratie:

alege i, j astfel ncat Dij sa fie minim

defineste un nou nod k

for all m in L

dkm = 1/2 (dim + djm dij)dik = 1/2 (dij + ri rj)djk = dij dikT = T {k}, k parinte pentru i si jL = (L {i, j}) {k}

Terminare:

cand raman doar doua noduri i si j n L,

adauga la T muchia dintre i si j de lungime dij

5.3. Discutie

Metodele fara parametri ale distantelor au fost, initial, aplicate n datele omolog gru-

pate, folosind o matrice de perechi de distante. Aceste distante sunt, apoi, unite pentru a

forma arborele (cu lungimi de ramuri informative). Matricea distantelor rezulta dintr-un

numar de surse diferite, cum ar fi: distanta masurata (de exemplu, din studiile imunologice),

sau analiza morfometrica, diferite formule ale perechilor de distante (de exemplu, distanta

euclidiana) aplicate caracterelor morfologice discrete, sau distanta genetica din secventa, din

fragmentele de restrangere si din datele allozime (enzime care reprezinta produsul genelor

allele din cadrul aceleiasi gene). Pentru datele filogenetice de tip caracter, valorile brute

ale distantelor se calculeaza prin simpla masurare a diferentelor de perechi din starile de

10

caracter (distanta Manhattan).

Exista multi algoritmi simpli care construiesc un arbore, direct din distantele perechilor,

cativa din acestia fiind descrisi mau sus, nsa ei nu formeaza neaparat cel mai bun arbore.

UPGMA presupune un arbore ultrametric (un arbore n care toate lungimile drumurilor de

la radacina la frunze sunt egale). Neighbor-Joining este o forma de descompunere de stea

si poate fi rapid n a forma arbori convenabili. Acest algoritm se foloseste de unul singur si

chiar, deseori, produce arbori rezonabili.

Estimarea filogeniei folosind metodele bazate pe distante a dus la foarte multe contro-

verse [5]. Legatura dintre caracterele individuale si arbore se pierde n cadrul procesului

de reducere a caracterelor la distante. Din moment ce aceste metode nu folosesc n mod

direct datele de tip caracter, informatia blocata n distribuirea starilor de caracter se poate

pierde atunci cand perechile se compara ntre ele. De asemenea, unele legaturi filogenet-

ice complexe pot duce la distante eronate. In ciuda acestor potentiale probleme, metodele

cu distante sunt extrem de rapide si, deseori, evalueaza rezonabil filogenia. Ele au cateva

avantaje fata de metodele ce folosesc n mod direct caracterele. Ceea ce este remarcabil este

faptul ca metodele cu distante permit utilizarea datelor ce nu se pot converti usor n date

de tip caracter, cum sunt testele de hibridizare ADN-ADN.

6. Concluzii

In acest articol, s-au prezentat evolutia moleculara a speciilor si genurilor, analizandu-se

date de secvente ADN si determinandu-se relatiile dintre si ntre specii cu ajutorul arborilor

filogenetici. Am evidentiat procesul de selectie naturala n populatii. Am studiat doua

modele probabilistice de divergenta: Jukes-Cantor si Kimura si am discutat despre doi algo-

ritmi, UPGMA si Neighbor-Joining, cu care am construit specii sau arbori de gene, folosind

date relationale. Am descris procesul de asemanare si de nrudire a speciilor. Am pus n

discutie modelarea evolutiei prin procesele de mutatie si prin folosirea a trei tipuri de arbori:

cladograma, filograma si arborele ultrametric. Am intrat n studiul parsimoniei, descriind

procesele de nregistrare, de urmarire si de implementare prin etape succesive. Un rol major

l-au avut probabilitatea maximala, inferenta filogenetica, dar si parsimonia maximala. S-au

nteles principiile evolutiei moleculare, punand n tema evolutia cat si tipurile de genomi,

ca apoi, sa ne oprim la procesul de selectie a speciilor pentru a ne fi usoara implementarea

acestuia n informatica.

11

REFERINTE

[1] Ernst Haekel, The History of Creation, Editia a 6-a, New York, D. Appleton and Co.,

1914, http : //www.geology.19thcenturyscience.org/books/1876HaeckelHistCrea/V olI/htm/doc.html

[2] Gregory J. Morgan, Emile Zuckerkandl, Linus Pauling, and the Molecular Evolu-

tionary Clock, 1959-1965, Journal of the History of Biology, Vol. 31 (1998), pp. 155-178.

[3] http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular evolution

[4] David W. Mount, Bioinformatics. Sequence and Genome Analysis, Second Edition,

2004, Cold Spring Harbor Laboratorry Press, Cold Spring Harbor, New York

[5] Ron D. Appel, Ernest Feytmans, Bioinformatics. A Swiss Perspective, 2009, World

Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. and the Swiss Institute of Bioinformatics