14 n SUIS Nº 72 Noviembre 2010

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Actualización sobre la influenza porcina

Resumen

La influenza o gripe porcina esta causada por virus Influenza tipo A per-tenecientes a la familia Orthomyxoviridae. Los subtipos de virus influenza más frecuentemente reportados en el porcino a nivel mundial son H1N1, H1N2 y H3N2. En España, estudios recientes han revelado una amplia di-seminación de estos subtipos en la cabaña porcina, así como un porcen-taje considerable de animales con anticuerpos frente a diferentes subtipos simultáneamente.La sintomatología clínica que causan los virus influenza en el cerdo in-cluye fiebre, letargia, anorexia, pérdida de peso y tos, entre otros signos. Tradicionalmente, se ha descrito que la entrada de un nuevo virus en una explotación provoca la aparición de los signos característicos de la en-fermedad en animales de todas las edades. Sin embargo, nuevas inves-tigaciones apuntan hacia una enfermedad que frecuentemente cursa de forma subclínica.El control y la prevención de la enfermedad recaen en establecer unas medidas de bioseguridad adecuadas y en el uso de estrategias vacunales.

Palabras clave: influenza, cerdo, prevención, diagnóstico

Summary

Swine influenza update

Swine influenza is caused by Influenza virus type A from the Orthomyxo-viridae family. H1N1, H1N2 and H3N2 are the swine influenza virus sub-types most frequently reported worldwide in pigs. In Spain, recent studies show a widespread dissemination of these subtypes in pig population, and a considerable proportion of animals presenting antibodies against different subtypes simultaneously. Clinical signs caused by influenza virus in pigs include fever, lethargy, anorexia, weight loss and cough, among others. Traditionally, it has been reported that the introduction of a new virus on a farm would cause clinical disease in animals of all ages. However, new studies point to the spread of the infection in farms without clinical signsControl and prevention of disease fall on the establishment of appropriate biosecurity measures and the use of vaccination strategies.

Key words: influenza, pig, prevention, diagnosis

Meritxell Simon Grifé1, Gerard E. Martín Valls2 y Jordi Casal i Fàbrega3

Contacto con los autores: 1 Licenciada en veterinaria por la Universidad Autónoma de Barcelona - Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona, España) - Tel.: 935 814 527 - Fax: 935 814 490 - email: meritxell.simon@cresa.uab.cat2 Licenciado en veterinaria por la Universidad Autónoma de Barcelona - Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona, España) - Tel.: 935 814 561 - Fax: 935 814 490 - email: gerard.martin@cresa.uab.cat3 Doctor en veterinaria por la Universidad Autónoma de Barcelona - Departament de Sanitat Animal / Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA) - Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona, España) - Tel.: 935 811 047 - Fax: 935 812 006 - email: jordi.casal@uab.cat

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La influenza o gripe porcina es una enfermedad infecciosa pro-ducida por Orthomixovirus que afecta a una gran varie-

dad de especies entre las que se incluyen humanos, cerdos, équidos y aves. En los mamíferos cursa clínicamente de manera abrupta con signos respiratorios y fiebre.En los últimos tiempos la gripe ha sido tema de actualidad, en primer lugar de-bido a la aparición de la gripe aviar al-tamente patógena por virus H5N1 en el sureste asiático y su posterior extensión hacia Europa a través de aves silvestres en el año 2006. Más recientemente, en abril de 2009 las alarmas se encendieron con la aparición en México de la nueva variante de H1N1 y su posterior exten-sión al resto del mundo. El nombre de gripe porcina que se dio inicialmente a este último brote ha servido para aumen-tar el interés por la gripe en esta especie y para constatar que realmente hay un desconocimiento importante de algunos aspectos de la infección en los cerdos. En este artículo revisamos brevemente los conocimientos existentes sobre esta in-fección en el porcino.

ETIOLOGÍALa influenza o gripe porcina es una en-fermedad causada por virus del género Influenzavirus tipo A pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae (figura 1). Los virus influenza se dividen en subti-pos dependiendo de las dos glicoproteí-nas de superficie: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). La HA está implicada directamente en el proceso de infección puesto que permite al virus unirse a receptores de la membrana ce-lular y colonizar la célula (Murphy et al., 1999). Por otro lado, la NA permite la liberación de viriones y así facilita la sali-da del virus de la célula y su diseminación a otras células no infectadas (Murphy et al., 1999). En total se han descrito 16 ti-pos de hemaglutinina (H1-H16) y 9 de neuraminidasa (N1-N9).El genoma de los influenzavirus tipo A está fragmentado en ocho segmentos de ácido ribonucleico (ARN), una parti-cularidad que facilita la posible recom-binación genética entre diferentes virus que estén infectando simultáneamente a la misma célula. Por otra parte, los virus ARN están sometidos a una fuerte deriva genética debido a la elevada tasa de erro-res de la ARN polimerasa.

Distribución y origen de los subtipos del virus de la influenza porcina

Los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 de virus influenza son los más frecuentemente reportados en el porcino en todo el mundo (Olsen et al., 2006). No obstante, los orígenes y las características genéticas y antigénicas de estos virus difieren según el continente o región en el que se aislen, debido tanto al fenómeno de recombina-ción como al de la deriva genética. Estas diferencias son especialmente evidentes en el caso del subtipo H1N1: el virus presente en América (llamado H1N1 porcino “clásico”) se originó directamente del H1N1 causante de la “gripe española” del año 1918 (Shope, 1931), mientras que el H1N1 euroasiático tiene un origen aviar (H1N1 “tipo aviar”) y se aisló por primera vez a finales de los años 70 en Italia. Am-bos virus presentan unas características genéticas y antigénicas diferentes (Olsen et al., 2006).En el caso del subtipo H3N2, la cepa que circula actualmente en la cabaña porcina es un triple recombinante, caracterizado por contener los genes que codifican para la HA y la NA de origen humano, mientras que los genes pertenecientes a proteínas víricas internas son de origen aviar en la cepa europea (Madec et al., 1984) y aviares y porcinos en el caso del subtipo norteamericano (Zhou et al., 1999).Finalmente, el subtipo H1N2, aislado en Europa en el año 1994 (Brown et al., 1995), es un recombinante que contiene todos los genes del H3N2 porcino con la excep-ción del gen de la hemaglutinina, que proviene de un H1N1 de origen humano. No obstante, en algunos países se han detectado H1N2 con la hemaglutinina de origen aviar, como es el caso de Dinamarca y Francia (Hjulsager et al., 2006 y Kyriakis et al., 2009). La figura 2 representa esquemáticamente el origen y evolución de los principales subtipos de influenza porcina en función de su distribución geográfica.

Figura 1. Fotografía del virus de la influenza porcina obtenida por microscopia electrónica. Imagen cedida por Carolina

Rodriguez-Cariño (CReSA).

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Los virus de la influenza A son origi-narios de aves. Sin embargo, algunos tipos pueden afectar a mamíferos, espe-cialmente a humanos, cerdos, équidos y marinos.El tracto respiratorio de los cerdos pre-senta receptores para virus de la influen-za tanto típicamente aviares (a-2,6) como de mamíferos (a-2,3). Por este mo-tivo, la especie porcina se ha considerado una matriz para la generación de nuevos virus de influenza a partir de la recom-binación genética de virus de aves y de mamíferos. Un ejemplo reciente lo tene-mos con el virus A/H1N1 pandémico, que incorpora genes humanos, aviares y porcinos y, aunque esta cepa afecta a la especie humana, su origen podría estar muy relacionado con la especie porcina (Smith et al., 2009).

EPIDEMIOLOGÍALa principal ruta de entrada del virus de la influenza porcina en una explotación es la introducción de animales infectados, aunque también se han descrito otras vías de entrada como los aerosoles, fómites e incluso el movimiento de personal con ropa o material contaminado (Alexan-der, 2007). Una vez dentro de la granja, el virus se transmitirá principalmente por contacto directo entre los animales de la explotación mientras existan individuos susceptibles (Olsen et al., 2006). Como se ha comentado en el apartado anterior, los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 de influenza porcina son los más comunes. También se han aislado otros subtipos de virus influenza, aunque me-nos frecuentemente, y no han llegado a establecerse de forma extensa en la po-

blación porcina. Entre éstos cabe desta-car los subtipos H1N7, H4N6, H3N3 y H3N1 (Brown et al., 1994; Karasin y Olsen, 2000; Karasin et al., 2004; Lek-charoensuk et al., 2006).En España, los subtipos H1N1 y H3N2 se identificaron por primera vez a media-nos de la década de los 80 (Plana Duran et al., 1984; Castro et al., 1988). Por lo que refiere al subtipo H1N2, fue aislado por primera vez en muestras obtenidas en el año 2003 (Maldonado et al., 2006). Es-tudios recientes han revelado una amplia diseminación de los subtipos de influenza porcina predominantes en el cerdo en la cabaña porcina española. (Maldonado et al., 2006; Fraile et al., 2010; Simon-Grifé et al., 2010a). Este último trabajo, realizado en 100 explotaciones porcinas obtenidas al azar entre las granjas de

Figura 2. Origen y evolución de los principales subtipos de influenza porcina según su distribución geográfica (adaptada a partir de Heinen, 2003)

Linaje americano Linaje euroasiático

H1N1 (1979)

H3N2 (1968)

H1N1 (1918)

H1N1 (1983)

H1N1 (1979)

H3N2 (1984)

H1N2 (1994)

H3N2 (1998)

H1N1 (1931)

H1N2 (1999)

Proteínas internas

NA

HA

PB2

PB1

PANPM1, M2

NS1, NS2

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todo el territorio español, detectó anti-cuerpos frente a H1N1, H1N2 o H3N2 en el 91%, 50% y 82% de las explota-ciones respectivamente. En el 79% de las granjas y en el 20% de los animales ana-lizados se detectaron anticuerpos frente a dos o más subtipos.

PATOGENIA Y CLÍNICALa infección por los virus de la influenza porcina está limitada al tracto respirato-rio aunque también se ha descrito algún caso de localización extrarespiratoria (Kawayoka et al., 1987). El virus se repli-ca en células de la mucosa nasal, tonsilas, tráquea, pulmón y limfonodos traque-obronquiales (Brown et al., 1993; Heinen et al., 2000). El periodo de incubación de la enferme-dad es de 1-3 días (Olsen et al., 2006; Kahn y Line, 2006). Normalmente la excreción vírica puede empezar 24 horas después de la infección y en la mayoría de casos continúa hasta los 7-10 días poste-riores (Olsen et al., 2006; OIE, 2008), y aunque se han descrito excreciones víri-cas de duraciones superiores a los cuatro meses, estos casos son poco frecuentes (Blasckovic et al., 2000). Los anticuerpos frente al virus de la in-fluenza porcina son detectables en suero a partir de los siete días posinfección (PI), aunque el momento óptimo de detección es a las 2-3 semanas PI, momento en el que se produce el pico en los títulos de anticuerpos (Larsen et al., 2000).La sintomatología clínica que causan los virus influenza A en cerdo es muy similar a la que producen en los humanos. Entre los signos clínicos más frecuentes pode-mos destacar fiebre, letargia, anorexia, pérdida de peso y tos (Van Reeth, 2007; OIE, 2008). También pueden aparecer otros signos como la conjuntivitis, las se-creciones nasales y los abortos (Heinen, 2003; OIE, 2008). Tradicionalmente, se ha descrito que la entrada de un nuevo vi-rus influenza en una explotación produce el cuadro clínico típico de la enfermedad en un porcentaje elevado de los anima-les (Olsen, 2006). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la infección de un lote completo de animales no tiene por qué ir acompañada de signos clínicos (Simon-Grifé et al., 2010b).En una explotación la morbilidad puede llegar al 100%, pero la tasa de mortali-dad es muy baja (<1%). Generalmente, la recuperación es rápida y comienza en-

tre los 5 y 7 días después de la aparición de los signos clínicos (Heinen, 2003; Olsen et al., 2006). Las infecciones bac-terianas secundarias o las coinfecciones con otros virus pueden incrementar la gravedad de la enfermedad (Heinen, 2003; OIE, 2008).Las lesiones macroscópicas que se ob-servan en los animales con influenza porcina se corresponden a una neumo-nía bronquiolo-intersticial y se limitan habitualmente a los lóbulos apicales o cardiacos, aunque en infecciones expe-rimentales se han descrito lesiones que abarcaban mas del 50% del pulmón (Ri-cht et al., 2003).

MÉTODOS DIAGNÓSTICOSEl diagnóstico de la influenza porcina se puede realizar mediante aislamiento víri-co, detección del ácido nucleico y técnicas de detección de anticuerpos.

Aislamiento víricoExisten diferentes formas de aislar los virus influenza. La metodología más uti-lizada tradicionalmente es el aislamiento en huevos embrionados de pollo (OIE, 2008). No obstante, el trabajo con hue-vos de pollo es largo, tedioso y requiere de cierta práctica para realizar la inocu-

lación. Además, es necesario el sacrificio del embrión. Por estas razones se han de-sarrollado diferentes líneas celulares que pueden infectarse con los virus influen-za, como la línea celular Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), que es la más comúnmente utilizada. La presencia del virus se hará evidente al observarse efecto citopático en las mismas.El uso de huevos embrionados y de MDCK permiten el aislamiento, produc-ción y titulación vírica, y pueden aportar cierta información respecto al comporta-miento infectivo de la cepa. Ambos son procedimientos necesarios para estudiar posteriormente con mayor detalle el com-portamiento y origen del virus.

Amplificación de material genéticoEn la actualidad existen técnicas de de-tección genérica de los virus del tipo A y también técnicas destinadas a la caracteri-zación y determinación del subtipo de los influenzavirus A.Los métodos genéricos más empleados actualmente son las técnicas de reacción de la cadena de la polimerasa en trans-cripción reversa (RT-PCR) en tiempo real (figura 3) para la detección genérica de los influenzavirus tipo A (Spackman et al., 2008; Slomka et al., 2010). Éstas técnicas

Figura 3. RT-qPCR para la detección del gen M de los virus influenza tipo A.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

Ciclo

10

1

0,1

0,01

0,001

0,0001

0,00001

0,000001DRn

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se basan en la detección del gen de la ma-triz (M), una región altamente conserva-da de los virus influenza A (Spackman et al., 2008), de modo que permiten detectar y cuantificar prácticamente la totalidad de los virus de la influenza tipo A, pero no son de utilidad para caracterizar/sub-tipar las cepas.De forma complementaria, otras RT-PCR (convencionales y en tiempo real) son ca-paces de amplificar las hemaglutininas y neuraminidasas porcinas (H1, H3, N1 y N2). Mediante este tipo de técnicas es po-sible determinar directamente el subtipo en caso de que se trate de una cepa típica-mente porcina (Young et al., 2002; Chia-pponi et al., 2003; Richt et al., 2004; Lee, 2008; Mallinga et al., 2010). La elevada tasa de mutaciones que presentan los vi-rus influenza obliga a una renovación periódica de las técnicas de detección de ácido nucleico, adaptándolas a los nuevos virus originados.

Detección de anticuerposEstas técnicas son apropiadas para ana-lizar las seroconversiones posteriores a las infecciones víricas ya sean clínicas o subclínicas, o también con posterioridad a una vacunación. La técnica de referencia para la detec-ción de anticuerpos es la inhibición de la hemaglutinación (IHA) (OIE, 2008). Esta técnica es capaz, a priori, de dis-cernir entre anticuerpos de diferentes subtipos víricos e incluso de diferentes

Toma de muestras

Para realizar un diagnóstico adecuado es muy importante que la muestra sea la apropiada. A modo de resumen, a continuación se especifica para cada técnica el tipo de muestra, el momento de la toma de muestra, los animales que se deben muestrear y la finalidad con la que se hace.

Características de las muestras de elección para cada técnica diagnóstica

Técnica laboratorialTipo de muestra

Momento óptimo de toma de muestra

Finalidad

RT-PCR convencional y en tiempo real Hisopo

nasalPulmón

1 a 7 días a partirde la aparición de los signos clínicos

n Detección y cuantificación vírica

n Subtipado y secuenciación de la cepa circulante

Aislamiento en huevos embrionados o MDCK

Aislado, titulación y producción vírica para uso posterior

ELISAIHA

SueroA partir de las 2-3 semanas post-infección

n Confirmación de circulación del virus influenza

n Valorar la eficacia vacunal n Determinar el/los subtipo/s circulante/s (solo IHA)

Recientemente, estudios realizados por Kyriakis et al. (2010) han demostrado que infecciones o vacunaciones consecu-tivas frente a uno o más subtipos en un mismo animal hacen que éste genere, en bajo título, anticuerpos frente a subtipos de influenza a los que no haya sido ex-puesto previamente. Estos datos sugieren un replanteamiento en la interpretación

cepas pertenecientes a un mismo subtipo (Van Reeth et al., 2006; Kyriakis et al., 2010). La sensibilidad de esta técnica viene condicionada por las cepas utili-zadas como antígeno. En este sentido, se recomienda utilizar para la IHA cepas homólogas a las aisladas en la región de donde se han obtenido los sueros que se pretenden analizar.

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La técnica de referencia

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ticuerpos es la inhibición

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(IHA) (OIE, 2008).

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como antígeno para la IHA. No obstante, la sensibilidad de los ELISA comercializa-dos es inferior a la de la IHA cuando nos referimos a un subtipo en concreto.

PREVENCIÓN Y CONTROLLa prevención de la influenza porcina se fundamenta en dos pilares básicos, las medidas de bioseguridad y las estrategias vacunales.

Medidas de bioseguridadLas medidas de bioseguridad resultan apropiadas para prevenir y controlar la entrada y diseminación de los virus de la influenza en una explotación.La llegada de animales infectados se ha

postulado como una vía frecuente de introducción de virus de la influenza en una explotación porcina (Alexander et al., 2007; Simon-Grifé et al., 2010a). Por este motivo, la aplicación de un periodo de cuarentena en los animales de nueva introducción es una medida eficaz para disminuir el riesgo de infección de la gran-ja. El acceso de las aves a la explotación o a otros materiales, como el pienso o el agua, debería evitarse puesto que las aves se han descrito como una fuente poten-cial de introducción de los virus influenza (Pensaert et al., 1981). Las personas que tienen contacto con los animales de la granja pueden actuar como fuentes de introducción de virus hu-

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Estrategias vacunalesDebido a las diferencias antigénicas entre los virus circulantes en Europa y Norteamérica, las cepas que componen las vacunas comerciales frente a influen-za porcina también son diferentes entre continentes. Actualmente las vacunas que se comercializan son bivalentes y contienen el virus H1N1 clásico y el virus H3N2 triple recombinante. A di-ferencia de Europa, en Estados Unidos también se producen vacunas autógenas que contienen cepas locales específicas (Olsen et al., 2006).En Europa, las primeras vacunas se co-mercializaron a mediados de los años ochenta y estaban compuestas por vi-

rus inactivados de los subtipos H1N1 y H3N2. Estas vacunas han cambiado muy poco desde entonces pero, a pesar de ello, inducen cierto nivel de protección frente a cepas víricas más recientes (aparecidas en los años noventa) (Van Reeth et al., 2001) e incluso frente al virus H1N1 res-ponsable de la pandemia del año 2009 (Vincent et al., 2010). En cambio, en in-fecciones experimentales se ha observado que estas vacunas no protegen de forma efectiva frente a los virus H1N2 (Van Reeth et al., 2003). Recientemente, en Europa se ha aproba-do la comercialización de una vacuna tri-valente, que contiene cepas actuales de los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2.