ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE

Immunologie

Wichtige Grundbegriffe der Immunologie:

• Antigen: Körperfremdes Agens, welches beim Eindringen in den Organismus eine Immunantwort hervorruft (z.B. Fremdproteine, Bakterien, Viren, div. Makromoleküle)

• Epitop: Jener Molekülteil des Antigens, welcher von einem spezifischen Antikörper erkannt werden kann.

• Hapten: Niedermolekularer Stoff, der erst durch Bindung an ein Makromolekül (z.B. Protein) immunogen wirkt.

• Antikörper: Zusammengesetztes Protein höherer Organismen, das ein bestimmtes Epitop eines Antigens biorecognitiv binden kann und dadurch das Unschädlichmachen des Antigens einleitet (monoklonal, polyklonal: monospezifisch bzw. unspezifisch)

• Avidität eines Antikörpers: Bindungsstärke an das Antigen• Kreuzreaktionen: Unterschiedliche Antigene können ein oder

mehrere gemeinsame Epitope besitzen ® darauf gerichteteAntikörper können mit beiden Antigenen reagieren ® für den Analytiker unerwünscht!!

Immunodiffusion 1

Immunodiffusion 2Ouchterloni Test (zweidimensionale Doppeldiffusion)

A,B,C,D: Antigen Determinanten, Anti AB Serum

Identische Determinanten –verschmolzene Präzipitations-muster

Nichtidentische Determinanten –überkreuzte Zonen

Teilweise identische Determianten –Sporenbildung der Präzipitationszonen

Immunodiffusion 3

Ouchterloni TestEinfluss der relativen Molekülmasse des Antigens auf die Form der

Präzipitationszonen

Masse Antigen A << Masse eines IgG (zB. Humanserum-albumin68 000)

Masse Antigen B ~ Masse des IgG(zB. IgA)

Masse Antigen C >> Masse eines IgG (zB. Hämocyanin ca. 3.106)

Immunodiffusion 4

Radiale Immundiffusion:

Objektträger mit Agar + Antiumanserumalbumin(HSA), Tröge von 4 mm Øwurden mit gleichenMengen der Lösungen derunten angegebenen HSA Konzentrationen gefüllt, 4°C, über Nacht

Diffusionsweite: (hier Äquivalenzpunkt)

Eichkurve zur Bestimmung des Antigens

Immunodiffusion 5Zweidimensionale doppelte Immundiffusion

große Ausführung in Petrischalen:

Hier wird der Einfluss der Antigen-konzentrationen auf die Lage der Präzipitationszonenzwischen den Trögen gezeigt

Antiserum Verdünnungen des Antigens

Häufige Stanzmuster

Immunelektrophorese 1Elektrophorese von Serumproteinen

Blotten des Cellulose-acetatstrips nach dem Entfernen aus dem Einweichbad

Aufbringen der Serumprobenauf die an der „aligning base“ausgerichteten Platte

Laden der Kammer mit den Cellulose-acetatstreifen

Färben und Entfärben der Strips

Immunelektrophorese 2

Diffusion und Präzipitation: 16 – 24 h

Elektrophorese 90 min, 10 V/cm (Trennung der Proteine)

Immunelektrophorese 3Mikroimmunelektrophorese:

a) Stanzmuster im Agar, in die leeren runden Tröge werden die Antigene HSA und HS eingefüllt

b) nach der Elektrophoresegetrennte, aber so nicht nachweisbare Proteine; Agarwird aus den länglichen Trögen entfernt

c) Zugabe der Antiseren in die Tröge, Beginn der Diffusion der Antigen- und Antikörpermoleküle

d) Erwartete Präzipitationszonen

Immunelektrophorese 4

„Raketenelektrophorese“ einer bekannten Verdünnungsreihe von menschlichem Serumalbumin (HSA) und zweier unbekannter Lösungen x und x/2

5 10 15 20 25 x x/2 µg HSA

Radioimmunassay (RIA)

-

NaCH3 SO2 N Cl +

Reaktionen während eines RIA. Der lösliche Antigen/Antikörperkomplex ist das Produkt des 1. Schrittes und Ausgangsprodukt für den 2. Schritt

Chloramin T

KI131

+ +

--

OH CHC

OO

NH2

H2OH2O2+ KOH + OH CH

COO

NH2

I131

Synthese von Iodtyrosin mit dem Lactoperoxidase-Oxidationssystem:

Enzymimmunoassay 1Prinzip des kompetitiven ELISA:

Spezifische Antikörper an Festphase adsorbiert

Zusatz von freiem Antigen und enzymgekuppeltem Antigen, Inkubation, waschen

Bindung des freien und des gekuppelten Antigens

Zusatz des Substrates, Inkubation

Messung der Enzymaktivität

Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des enzym-gekuppelten Antigens proportional

Enzymimmunoassay 2Indirekter ELISA:

Messung der Enzymaktivität

Die unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des spezifischen Antikörpers im Versuchsserum direkt proportional

Spezifisches Antigen an Festphase adsorbiert

Inkubation mit Versuchsserum, in dem man spezifische Antikörper vermutet, waschen

Anheftung spezifischer Antikörpermoleküle

Inkubation mit Anti-immunglobulinserum mit gekoppeltem Enzym, waschen

Bindung des enzymgekoppelten Anti-immunglobulin-Antikörpers

Zusatz des Enzymsubstrats, messen

Enzymimmunoassay 3Sandwich ELISA mit zwei Antikörpern:

Spezifische Antikörper an Festphase adsorbiert

Zusatz der Antigenlösung unbe-kannten Gehalts, Inkubation, waschen

Bindung des spezifischen Antigens

Zusatz des Kupplungsprodukts eines 2. spezifischen AK mit Enzym, Inkubation, waschen

Bindung des enzym-gekoppelten Antikörpers

Zusatz des Enzymsubstrats, messen

Messung der EnzymaktivitätDie unter Standardbedingungen gemessene Aktivität ist der Menge des spezifischen Antigens in der Lösung unbekannten Gehalts proportional

Enzymimmunoassay 4

Hapten-Inhibitionstest