ARAFAT NASSERS EKSAMENSNOTER 2004 Noterne stammer fra Arafat Nasser og er fra 2004. De cirkulerer rundt p Farma og vi har fet dem fra Ayat Mohammed, forret 2008. NB: vi har ikke lst noterne igennem, s vi kan ikke st inde for rigtigheden, det ser dog rigtig pnt ud. Bemrk at kapitelnumrene og henvisninger, nppe er til den nuvrende lrebog. Husk at det altid er bedst, selv at arbejde med stoffet, f.eks. ved at lave dine egne noter, skemaer, o.l. Mvh Klaus B Andersen BROCK kap 4 Celle morfologi

Coccus = gformet/kugleformet bakterie

Stavbakterie = cylinder formet

Spirilla = stavbakterie som er spiral formet

Spirochete = tt snoede bakterie

Appendaged bakterie = bakterie hvis celle er forlnget med lange rr

Filament bakterie = lange tynde celler eller kder af celler.

Cocci og stav bakterier findes ogs som lange kder.

Microbial cellers strrelse

Prokaryotiske celler er meget mindre end eukaryotiske celler. Prokaryot cellers mindre strrelse har en hvis

effekt p deres biologiske egenskaber.

Cellers fysiske egenskaber ges jo mindre cellen er. Her er tale om get vkst hastighed, mere effektiv

udveksling af nringsstoffer med omgivelserne mm.

Nanobakterie = Man mener at der findes meget sm bakterier i naturen, og disse kaldes nanobakterier. Hvis

disse celler findes, s vil de vre de mindste nogensinde.

-------------------------- 0 -------------------------

Celle membran og celle vg Cytoplasmisk membran struktur

Cytoplasmisk membran er en tynd struktur som fuldstndig omringer cellen. Den separere cellens indre fra

dets milj.

Membraners kemiske opbygning

Membraners generelle struktur er en phospholipid bilayer.

Phospholipid = indeholder en hydrofobisk del (fedtsyre) og en hydrofilisk del (glycerol).

Nr phosholipider samler sig i en vandig oplsning, s danner de en bilayer struktur hvor fedtsyrerne vender

indad mod hinanden, mens glycerol forbliver i den vandige ydre milj.

Sterol og Hopanoid

Sterol ses i eukaryotiske cellers membran, og dens funktion er at stabilisere membranens struktur og gr den

mindre flexibelt.

Hopanoid (findes i nogle prokaryotiske membraner) har samme funktion som sterol og ses i mange

bakteriers membran. Den mest kendte er C30 hopanoid diploptene.

Hopanoid er ikke fundet i Archaea arter.

Archaeal membraner

Lipider i Archaea har ether linkage mellem glycerol og deres hydrofobiske side kder. Archaeal lipider

mangler fedtsyre, men istedet har de sidekder som bestr af flere isoprene enheder.

De mest kendte er glycerol diether og glycerol tetraether:

Det ses i tetraether molekylet at phytanyl sidekden fra hver glycerol molekyle er kovalent bundet. Dette vil

give en lipid monolayer istedet for bilayer:

Cytoplasmisk membran: funktion

Membranen fungere frst og fremmest som en permeabilitets barrier, dvs. forhindre cytoplasmisk

bestanddele i at trde ind /ud af cellen. Membran kan via proteiner(hvor nogle er enzymer) fungere som

portbner for transport af substanser ind eller ud af cellen.

Den cytoplasmiske membran fungerer ogs som cellens energi vedligeholder/kilde. Her findes membranen

som en energisk ladet form hvor protonerne er separeret fra hydroxyl ionerne.

Membranen er en meget tt barrier, hvilket skyldes dens hydrofobiske natur. Dette gr at hydrofiliske og

ladet molekyler ikke kan passere igennem membranen.

En molekyle der kan trnge gennem membranen er vand, som er tilstrkkelige lille til at passere

phospholipid molekylerne.

Aquaporiner = transport proteiner som accelere vands transport gennem membranen. Disse proteiner

indeholder membran omspndte kanaler som transportere vand ind eller ud af cytoplasma.

Membran transport systemer

Der findes tre klasser af membran-transport systemmer

1. Simple transport

2. Gruppe transport

3. ABC systemmet

Disse systemmer er alle energi afhngige.

Der findes 3 former for transport begivenheder:

Uniporter = proteiner som transportere en molekyle i en enkelt retning igennem membranen.

Symporter = proteiner som transportere substancer med andre substancer, mest normal H+.

Antiporter = proteiner som transportere substancer gennem membranen i en retning mens den p samme tid

transportere en anden substance i modsat retning.

Simpel transportr

Fig. 4,25 side 72 illustrere nogle simple transportrer.

Som eksempel ser vi p Lac Permease som er en symporter som transportere Lactose ind i E.coli celler

sammen med protoner.

Resultatet af denne simple transport system er ophobning af substans til hje koncentrationer som senere kan

metaboliseres til Energi.

Gruppe transport

Gruppe transport er en transport process hvor den transporterede substance er kemisk forandret under

passagen gennem membranen.

Den mest kendte gruppe transport system er phosphotransferase systemet. Fig. 4,26 side 73 illustrere

mekanismen.

Fr sukker transporteres gennem membranen, s sker der en phosphorylering og dephosphorylering af

proteinerne i phosphotransferase systemet. Nr ENZ IIc, som er lokaliseret i membranen, er phosphoryleret,

s phosphoryleres sukkeret og transporteres ind i cellen..

Den hje energi phosphat binding som levere energi til phosphotransferase systemet kommer fra PEP.

ABC systemet

ABC = ATP binding cassette

Periplasm = omrdet mellem den cytoplasmiske membran og en lipid rig ydre membran lag (i gram

negative bakteria)

Periplasmisk binding protein = proteiner i periplasm som bidrager til transport af substanser ind til cellen.

Fig. 4.27 side 73 illustrere ABC systemet.

Denne transport system indeholder 3 komponenter.

1. Periplasmisk binding protein

2. membran bner transportr

3. komponent som levere den ndvendige energi via ATP hydrolyse.

Det interessante i ABC systemet er at den periplasmiske binding protein har en hj substrat affinitet.

Proteinerne er mobile og binder sig til substrater uanset koncentrationen. Dvs. lige s snart substrat er bundet

til proteinet, s transporteres denne til membran bner komponentet og videre til den aktuelle transport del,

som drives af ATP hydrolyse.

Selvom gram positive bakterier mangler periplasm, s findes der ogs her binding protein afhngige

transport systemer. Her er specifikke proteiner ikke mobile, men istedet bundet til membranen.

Prokaryoters celle vg

Celle vg giver ikke kun cellen form og stivhed, men den modarbejder ogs turgortrykket.

Fig. 4,28 side 75 illustrerer forskellen p gram negative og gram positive bakteriers celle vg.

Peptidoglycan

Peptidoglycan = Celle vggens stive lag. En tynd flade bygget af N Acetylglucosamin, N acetylmuram

syre og nogle f amino syrer. Peptidoglycan kaldes ogs for murein.

Glycan tetrapeptid = Strukturen som indeholder bestanddelene N Acetylglucosamin, N acetylmuram

syre og aminosyrer, dette er illustrere i fig. 4.30 side 76.

Disse Glycan kder er bundet til hinanden via en peptid kryds-binding dannet af aminosyrer, hvilket er den

basiske struktur af peptidoglycan.

Glycosid bindingen mellem sukker i glycan kden er meget strk, men uden peptid kryds-binding s har

peptidoglycan ikke sin fulde styrke.

Fig. 4.31 side 76 illustrere kryds-bindingen i gram negative og gram positive bakterier.

I gram negative bakterier findes krydsbindingen direkte mellem DAPs amino gruppe og D-Alanins

carboxyl gruppe.

I gram positive bakterier sker krydsbindingen typisk via peptid mellem bro. F.eks. i staphylococcus aureus,

der er hver peptid mellem bro 5 molekyler aminosyrer (glycin).

Variation i peptidoglycan

Peptidoglycan ses kun i bakterier, dette skyldes at Archaea og Eukarya mangler N-Acetylmuram syre og

amino syren DAP (diaminopimeli syre).

DAP findes i alle gram negative bakterier og i nogle gram positive.

De fleste gram positive coccer har aminosyren Lysin istedet.

Teichoic acid

Gram negative bakteriers ydre membran

Gram negative bakterier indeholder en extra ydre lag bygget af lipopolysaccharider. Denne anden lipid

bilayer indeholder polysaccharid og protein.

Fig. 4.35 side 79 illustrere strukturen af lipopolysaccharid.

Det ses at polysacchariden er delt i to; 1) O polysaccharid og 2) den inderste polysaccharid.

Den inderste polysaccharid = indeholder ketodeoxyoctonat (KDO), syv - carbon sukker (Heptose), glucose,

galactose og N acetylglucosamin.

O polysaccaharid = denne er bundet til den inderste og indeholder normalt galactose, glucose, rhamnose

og mannose, svel som en eller flere dideoxy sukker ssom abequose, colitose, paratose eller tyvelose.

Lipid A = lipid delen af LPS. Dette er ikke en glycerol lipid men istedet er fedt syre bundet via ester amin

binding til en dissacharid, som er opbygget af N acetylglucosamin phosphat.

Porin og periplasmaet

Porin = Proteiner som findes p den ydre membran af gram negative bakterier. Den fungere som en kanal

for indgang og udgang af hydrofiliske lav-molekylrvgt substanser.

Poriner er transmembran proteiner og forbindes for herved at danne sm membran huller. Dvs den ydre

membran bliver gennemtrngelig for sm molekyler. Dette glder ikke enzymer og store molekyler, dvs.

den ydre membrans funktion er ogs at srge for at enzymer ikke diffundere vk fra cellen.

De ovennvnte enzymer findes i periplasmaet, som er lokaliseret mellem den cytoplasmiske membrans ydre

overflade og LPS indeholdende ydre membrans indre overflade.(se Fig. 4.37 s. 81).

Periplasmaet indeholder forskellige proteiner som er involveret i vigtige cellulr funktioner.

Gram farvening

Nr der sker en gram farvening s dannes et uoplseligt krystal violet-iodin koplex inden i cellen. Dette

komplex bliver fjernet i gram negative bakteria, pga. alkoholen trnger ind gennem den lipid rige ydre lag

(for herved at trykke komplexet ud) og peptidoglycan laget forhindre heller ikke solvent passage.

Gram positive bakterier som jo indeholder en tyk lag peptidoglycan vg bliver dehydreret af alkoholen.

Dette gr at pore i vggene lukker, og forhindre hermed at komplexet fjernes.

BROCK Kap 8

Overblik over regulering Regulerings metoder

Der findes to vigtige regulerings metoder i cellen.

1. regulering af enzym aktivitet - dette finder sted efter proteindannelse

- det er en hurtig proces

2. regulering af enzym syntese - kan finde sted ved translation eller transskription

- Translation = om mRNA oversttes til protein?

- Transskription = Hvor meget mRNA der dannes

- Processen er meget langsom

Se fig. 8,1 side 208

-------------------- 0 -------------------- Regulering af enzym aktivitet Enzym aktivitet hmning

Feedback hmning:

Feedback hmning ses nr en hel biosyntese vej reguleres. Produktet i en biosyntese vej kan feed backe til

frste trin og hermed regulere dets egen biosyntese. Dette sker ved at hmme aktiviteten af det frste enzym

i syntese vejen. Hvordan kan slut produktet hmme et enzyms aktivitet?

Dette skyldes en egenskab hos det hmmede enzym kaldet allosteri. Et allosterisk enzym har to vigtige

bindings sider.

1. aktiv side, hvor substratet bindes

2. allosterisk side, hvor hmmeren/effektoren bindes(reversibelt).

Det der sker nr en effekter bindes til enzymets allosteriske side (noncovalent), er at enzymets konformation

ndres sledes at substratet ikke lngere kan binde effektivt til den aktive side. Se fig. 8,3 side 209

Nogle biosyntese veje reguleres ved at benytte isozymer. Disse enzymer katalysere den samme reaktion men

er subjekter til forskellig regulatorisk kontrol. Eksempel p isozymer er illustreret i fig. 8,5 side 210.

-------------------- 0 --------------------

Regulering af transskription: negativ og positiv kontrol For at transskription skal fungere, s skal RNA polymerase genkende en specifik promoter p DNAet.

Regulering af transskription involvere derfor proteiner (kaldet regulatoriske proteiner) som kan binde til

DNA.

DNA binding proteiner

Regulering af transkritiption sker indirekte ved at proteiner, kaldet regulatorisk proteiner, binder til

specifikke sider af DNA.

Interaktion af proteiner med nuklear syre

Der findes to former for interaktion:

- ikke-specifik, binder hvor som helst

- specifik, dvs. orden-specifik

Histoner: ex. p protein som binder uspecifikt med DNA. Histoner er sm proteiner med hjt indhold af

positive ladet amino syre, og da DNA har en stor mngde negativ ladet phosphat grupper p ydersiden

binder Histoner sig uspecifikt til DNAet. Nr DNA er dkket af histoner s vil andre proteiner som RNA

polymerase ikke kunne binde sig og transskriptionen finder ikke sted.

DNA binding proteiners struktur

DNA bindings proteiner indeholder protein substrukturer som binder til proteinerne til DNA. Her vil

flgende 3 blive beskrevet:

- helix-turn-helix: Denne indeholder et stykke aminosyrer som danner et -helix sekundr

struktur (ogs kaldet genkendelses helix). Denne del er forbundet med et kort stykke af 3

aminosyrer, som har den funktion at dreje proteinet (turn). Den anden side af turn er

forbundet med en anden helix, som stabiliserer den frste. Se fig. 8,8 side 214.

- Zink finger: denne findes hyppigt i eukarotisk regulatoriske proteiner som binder til DNA.

Zink finger er en protein substruktur som binder til en zink ion, og det er denne del som

danner -helix og hermed genkendelses helix. Se fig. 8,9a side 214.

- Leucin lynls: leucine lynls reagerer ikke selv med DNA, men den benyttes til at holde

to andre -helixer i den korrekte position til binding med DNA. Se fig. 8,9b.

Negativ kontrol af transskription

Enzym Repression (undertrykkelse)

Corepressor = substans som repressere produktion af enzym

Enzymer som katalyserer syntesen af et specifik produkt, er ikke syntetiserede hvis produktet findes i mediet.

Dvs. ydre produkt repressere syntesen af enzymer. Dette er illustreret i fig. 8,10 side 215, her er Arginin

brugt som eksempel.

Her ses at hvis arginin tilsttes s vil vkst fortstte med samme hastighed, men enzym dannelsen stopper.

Dette er en specifik effekt, idet at syntesen af andre enzymer i cellen vil fortstte.

Mekanismen:

Denne er illustreret i fig. 8,12 side 216.

Enzym syntesen falder nr mRNA produktionen stoppes. Hvordan sker dette?

Corepressoren binder til et specifikt repressor protein. Og da repressor proteinet er et allosterisk protein s

forandres konformationen. Denne forandret repressor protein kan s binde til et spefikt omrde p DNAet

nr genets promoter (operator omrdet). Nr dette sker s blokeres syntesen af mRNA fordi at RNA

polymerase kan hverken binde eller fortstte. Og dette medfre at proteiner specificeret af denne mRNA

ikke kan syntetiseres.

Enzym induktion

Inducer = substans som starter enzym induktion

Enzym induktion er det omvendte af enzym repression, dvs. enzym syntetiseres nr der er substrat tilstede.

Dette er illustreret med -galactosidase i fig. 8,11 side 216. Nr laktose tilsttes s begynder syntesen af

enzymet.

Mekanismen:

Denne er illustreret i fig. 8,13 side 217.

Her ses at mRNA syntesen er blokeret af en repressor. Men nr inducer tilsttes s binder det til repressoren

og inaktivere det. Hermed dannes mRNA og enzym syntesen finder sted.

Alle systemer som involvere en repressor har den samme mekanisme, nemlig hmning af mRNA syntesen

med en specifik repressor protein som selv er under kontrol af et lille specifikt molekyle inducer eller

repressor. Og da repressorens rolle er at hmme, s vil regulering som involvere repressor nvnes som

negativ kontrol.

Effekter = corepressor og inducer, som altid er sm molekyler

Nogle gange kan analoger til inducer og corepressor have effekt p enzym syntesen. Fx.

Isopropylthiogalactosidase (IPTG), er en inducer af -galactosidase.

Positiv kontrol af transskription

Positiv kontrol = en regulatorisk protein fremmer binding af RNA polymerase, for herved at ge mRNA

syntesen.

Maltose regulon

Enzymer for udnyttelsen af sukkeret maltose i E. Coli syntetiseres kun hvis maltose er tilstede.

Syntesen af enzymerne er styret ved transskriptionen, men her af en aktivator. Maltose aktivator protein

binder ikke til DNA medmindre proteinet er bundet med maltose, effektoren. Nr aktivator proteinet binder

til DNA s begynder transskriptionen. Se fig. 8,14 side 217.

Aktivator binder specifikt til et omrde p DNA og dette omrde kaldes her for aktivator binding side.

Nogle aktivator proteiner interaktere med RNA polymerase, enten tt ved promoter eller flere hundred base

par vk fra promoter. Se fig. 8.16 side 218.

Regulon = nr mere end en operon er under primr kontrol af samme regulatoriske protein.

Global kontrol og lac operon

Global kontrol systemer = regulatorisk system som reagerer p miljbestemte signaler.

Katabolit repression = global kontrol, som srger for at cellerne benytter den bedste carbon kilde fr

enzymer induceres for laktose eller maltose.

Figuren side 219 viser kurven nr 2 carbon kilder benyttes samme tid. Der sker en diauxic growth. Cellerne

vokser bedst p glukose og derfor hmmes syntesen af -galaktosidase. Nr glukosen er opbrugt s starter

enzym dannelsen og hermed laktose udnyttelse. Men der skal lige siges at der ses et lag fase fr vksten

fortstter p laktose.

Katabolit repression involverer kontrol af transskription via en aktivator protein. RNA polymerase binder til

DNA via catabolit activator protein (CAP). CAP binder kun til DNA hvis den frst er bundet til cAMP. Nr

glukose transporteres ind til cellen s vil cAMP koncentrationen falde og RNA polymerase binding til

promotor finder ikke sted.

To krav til at transskription i lac operon kan finde sted (genetisk elementer i lac operon se side 220):

1. cAMP koncentration skal vre hj nok til at CAP protein binder til CAP bindings side (positiv

kontrol).

2. der skal vre en inducer s som laktose s at laktose repressor ikke blokerer transskriptionen ved at

binde til operator (negativ kontrol)

BROCK Kap om bakterie genetik

Mutation og rekombination Mutationer og mutanter

Mutation = arvelig ndring i base sekvensen af nukleinsyrer genomet af en organisme.

Mutant = en stamme som brer ndring i base sekvensen.

En mutant er per definition forskellig fra fader stammen i genotypen (den prcise genetiske udseende af en

organisme).

Mutant fnotype = ndring i fnotypen, dvs. de observerable karakteristika af en organisme.

Vild type stamme = stammer isolerede fra naturen.

Genotypen af en organisme angives med 3 sm bogstaver efterfulgt af et stort bogstav, som f.eks. E.coli

genet hisC. Mutationer af hisC vil angives som hisC1, hisC2 etc. afhngig af rkkeflgen af isoleringen.

En organismes fnotype angives med + eller -. His+ f.eks. fortller at stammen har evnen til selv at

fremstille histidin, mens His- ikke kan.

Mutationer kan vre selectable eller nonselectabel.

nonselectable mutanter kan findes ved screening, som er en metode hvor man eksaminerer en rkke

kolonier og kigger efter dem som er anderledes. Eksempel er tab af farve i pigmenteret organismer, se. s.

266.

selectable???

Replika udpladning = teknik hvor man kan detekterer nringsmutanter. Teknikken er illustreret p side

268.

Auxotrof = en organisme som har opbygget en nrings krav gennem mutation.

Prototrof = vild-type faderen hvori auxotrofen blev dannet.

Penicillin-selektions metode = mutanter der krver vkstfaktor har en drligere fordel end den arvede

celle. Penicillin drber kun voksende celler, dvs. hvis penicillin tilsttes en population som vokser i et

medie som mangler mutantens vkstfaktor, s vil arvelige celler d, men de ikke voksende mutanter er

uberrte. Denne metode kaldes negativ selektion da den selektionen ikke er for mutanter men mod de

arvelige typer. Se. side 267 fig. 10.1a.

Typer mutanter og hvordan de detekteres se tabel 10.1 side 269.

Molekylr basis af mutationer

Spontane mutationer = finder sted pga. naturlig radiation som ndrer strukturen af baser i DNA et.

Punkt mutationer = mutationer der involverer en eller meget f base par. Mutationen resulterer i insertion

eller slettelse af base par. Se senere.

Hvis et punkt mutation finder sted, s vil enhver ndring i fnotypen vre resultat af ndring i aminosyrer

sekvensen af proteinet der nskes dannet. Fig. 10.3 s. 269 viser eksempler p base par substitutioner.

Figuren viser almindelig replikation og tre mutationer:

1. silent mutation = mutationen som stadig giver normal protein, f.eks. er UAU ogs en tyrosin codon.

2. nonsense mutation = her dannes et stop codon som resulterer i at der sker en forhastet translation,

som giver en ikke komplet protein som hjt sandsynligt ikke vil fungerer.

3. missense mutation = ndringen fra UAC til AAC giver asparagin i stedet for tyrosin. Kaldes

missense fordi at aminosyrer sekvensen er ndret.

Missense mutationer kan frer til enzymer der er temperatur-sensitive. Temperatur sensitive

mutanter gr at bakterier f.eks. ikke kan vokse ved de hje temperaturer, pga. mutant proteiner bliver

denatureret ved hj temperatur.

Enhver slettelse eller insertion af base-par resulterer i en lseramme skift (reading frame shift), og

translationen af genet er helt forstyrret, dette er illustreret p side 270 fig. 10.4. Frameshift mutationer finder

kun sted ved den del af protein-indkodet gen som inkluderer lserammen. Dvs. enkelte base-par indsttelser

i promoter gen er ikke frameshift mutation.

Genoprettelse af vild-type fnotypen efter mutation kan finde sted ved revertant. Revertant kan deles i to

typer:

1. samme side revertants = mutationen som skal genoprette aktiviteten finder sted p samme side

som den originale mutation.

2. anden side revertant = mutation finder sted et andet sted p DNA. En sdan mutation er

suppressor mutation, som erstatter den originale mutations effekt. Der er forskellige typer

supprerssor mutationer:

a) mutation et sted p samme gen kan genoprette enzym funktionen, ssom frameshift

mutation.

b) Mutation i et andet gen kan genoprette funktionen af det originale muterede gen og vild type

fnotypen.

c) Mutation i et andet gen som danner et nyt enzym som kan erstatte det muterede ved at

introducerer en anderledes metabolisk vej end den brugt for mutant enzymet.

Slettelser af DNA dele, der involverer hundred eller tusinder base par, er kendt. Sdanne slettelser kan ikke

genoprettes ved videre mutationer, men ved genetisk rekombination, se senere.

Mutagenesis

Mutagener = midler som inducerer mutation.

Der findes kemiske mutagener, radiation, ioniserede radiation mm. Til dette afsnit henvises til bogen siderne

271-275.

Ames test

Denne test er en mutagenisitets test for carcinogener (midler der forrsager cancer). I Ames test der vil en

produktion af enzymer fra rotte lever bruges til at danne et aktivt kompleks. Dette kompleks bliver s taget

op p et filter-papir, som s placeres i midten af en plade som er belagt med bakterie stamme. Efter 24 timers

inkubation s vil man kunne observerer et net af back mutations i omrdet rundt om papir skiven. Se. side

276.

Genetisk rekombination

Mekanismen for denne er vist p side 277 figur 10.9. Den starter med at endonuklease laver et hak i et af

DNA molekylerne. Det hakket streng fjernes fra den anden streng og s binder SSB proteiner (single-

stranded binding) til den single strenget segment. Der sker s en streng invasion som skyldes RecA proteinet.

RecA binder til den enkelte streng fragment for at danne et kompleks der lettere gldningen med en

supplerende sekvens i den modsatte dupleks og flytter hermed den indbyggede streng. Der sker hermed en

parring hvor udveksling af homolog DNA molekyler finder sted. Denne udveksling frer til dannelsen af

rekombinations intermediater der indeholder heteroduplex omrde, hvor hver streng stammer fra forskellige

kromosomer. Til sidst skilles de linkede molekyler via nukleaser og DNA ligaser for at danne to rekombinant

molekyler.

Rekombinations mekanismen hos prokaryoter involverer DNA overfrelser via processerne transformation,

transduktion og konjugation, se senere.

-------------------------0-------------------------

Bakteriel Genetik: In vivo Processer hvor bakterier kan udveksle genetisk materiale:

1. Transformation = involverer donor DNA fri i miljet.

2. tranduktion = donor DNA overfrelse er formidlet af en virus og

3. Konjugation = overfrelse involverer celle-til-celle kontakt og en konjugativ plasmid i donor cellen.

Disse er sammenfattet p fig. 10.11 side 279, men bliver beskrevet nedenstende.

Transformationen er illustreret p side 282 fig.10.13. For at en celle skal kunne optage DNA og

transformeres s skal den vre kompetent. Sdanne celler kan have kompetens specifikke proteiner,

bindingsproteiner der sidder p membranen, celle vg autolysin og forskellige nukleaser.

Hvordan optages disse DNA s? Det varierer lidt mellem stammerne, men en ting glder for dem alle og det

er at, ds DNA binder mere effektivt til cellen. DNA et der skal transformeres er bundet til DNA bindings

proteiner p celle overfladen. Det er enten hele DNA der optages eller ogs degraderes en streng af nuklease

og kun en optages.

Det optaget DNA associeres med kompetens-specifikke proteiner som skal beskytte DNA mod nuklease

angreb. RecA proteinet overtager og integrerer DNA ind i modtager genomet via rekombination. Der dannes

s en arvelig DNA molekyle og en rekombinant.

Transfektion = DNA transformation fra bakteriel virus. Hvis DNA kommer fra lytisk bakteriofag s frer

transfektion til normal virus produktion og kan bestemmes via en standard fag plaque assay.

Kunstig kompetence forgelse: Man har fundet ud af at E.coli kan behandles med hj koncentration af

calcium ioner og s opbevares i kulde, og hermed fs transformable E.coli.

En anden teknik er elektroporation hvor cellen udsttes for elektrisk felt for at bne sm porte i

membranen. DNA molekyler kan hermed trde ind i cellen. Elektroporation kan ogs overfrer et plasmid

direkte fra en celle til en anden hvis de begge er tilstede under elektroporation.

Transduktion er delt ind i to. Der er de generelle, hvor vrt DNA kommer fra hvilket som helst del af vrt

genomet, og de specielle, hvor et specifikt omrde p genomet integreres direkte i virus genomet.

Transducerende virus partikler er defekte som virus.

Plasmider

Plasmider = Plasmider er genetiske elementer der replicere uafhngig af vrt kromosomet.

Plasmider har ikke en ekstracellulr form, men findes i cellens som en simpel nukleinsyre.

Plasmiders fysiske natur

De fleste plasmider er ds DNA og cirkulrer, men der findes ogs linere plasmider. Isolering af plasmid

DNA sker ved at benytte sig af Supercoiled konfiguration, se senere.

Replikation af plasmider

Copy number = antal plasmid molekyler per celle. Copy number kontrolleres af plasmid gener og

interaktioner mellem vrt og plasmid.

Plasmider i Gram-negative bakterier replicere p samme mde som den beskrevet for kromosomer, se

sektion 7.6.

Plasmider i Gram-positive bakterier replicere ved en Rolling circle mekanisme som den for fagen X174,

se sektion 16.2.

Individuelle bakterier kan indeholde forskellige typer plasmider. Replikation af to forskellige plasmider i

samme celle er styret af plasmid gener involverede i regulering af DNA replikation.

BROCK kap 10, (nste side)

In vitro teknikker af bakteriel genetik Forml Strategi Trin 1 Trin 2 Trin 3 Trin 4 Trin 5 Molekulr kloning

Isolerer store mngder specifikke gener eller kromosomale fragmenter i ren form.

Fjerner det nsket gen eller omrde fra et stort komplekst genom til en lille simpel en.

Isolering og fragmen-tation af DNA kilden. F.eks. ved restriktion af DNA.

Forbinder fragmenterne med en kloning vektor via DNA ligase. Der sker hermed en in vitro rekombination hvor der produceres hybrid DNA molekyle

Introduktion og vedligeholdelse. Introduktion kan ske ved transformation. Overfrelsen af DNA til vrt giver normalt blanding af kloner, nogle indeholder de nsket andre kloner opstet fra rekombination af DNA til vektor. Denne blanding kaldes DNA bibliotek.

Plasmid pBR322

At identificerer bakterielle celler

Indstter et fremmede DNA ved et af resistens omrderne. Herved mistes resistensen = insertional inactivation

BamHI skrer det fremmede DNA og Tetracyklin resistens delen.

Det fremmede DNA indsttes via DNA ligase og antibiotika resistensen mistes. Fig. 10.42 s.309

Bakteriofag Lambda1

At benytte Lamda som klonings vektor, idet den kan indeholde strre mngder DNA end plasmider.

At pakke rekombineret DNA in vitro for herved at overfrer det host celle

Isolering af vektor DNA fra fag partikler og digestion med restriktions enzym

Samling af de to lambda fragmenter med fremmede DNA fragment via DNA ligase

Pakning af DNA ved at tilstte ekstrakter indeholdende hoved og hale proteiner og hermed dannelse af fag partikel.

Infektion af E.coli og isolering af fag kloner ved at vlge plaques p vrts stammen.

Tjekke rekombinafor tilstedevrelsensket fremmede Dsekvens ved at brunukleinsyrer hybriprocedure. Se fig. s.311

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Udvider DNA molekyler. Hermed fs store mngder specifikke gener til kloning, sequencing eller mutagenesis.

Polymerase chain reaction, hvor DNA polymerase kopier DNA molekyler.

To oligonukleotide primers dannes og tilsttes med stor overskud til varme-denatureret target DNA

Mens blandingen kler ned s sikre overskud af primers at DNA strengene ikke sammenkobles igen.

DNA polymerase udvider nu primers ved at bruge target strengene som skabelon.

Efter inkubation varmes blandingen igen for at separerer strengene. Blandingen kles ned for at primers hybridiserer med de nye syntetiseret DNA, og hele processen gentages. Se. fig.10.45 s. 312

1 Meget store DNA fragmenter kan ikke klones. Derfor kan Cosmider benyttes. Disse er plasmider vektorer indeholdende fremmede DNA og kun cos (cohesiv sider) af lambda genomet. Cos sider krves for at pakke DNA inden i lambda virioner. Se. mere side 311.

BROCK Kap 16

Eukaryote viruser Positiv-strenget RNA viruser (Dyr)

Picornavirus familie = en meget vigtig positiv-strenget RNA dyr virus, som indeholder viruser der rammer

mennesker, ssom hepatitis A virus og polioviruser.

Fig. 16,12 side 532 viser poliovirusen og dens multiplikation. Det ses at poliovirus har en liner RNA

molekyle, hvor der ved 5 er et protein kaldet VPg protein, og ved 3 en poly-A hale.

RNAet kan bruges direkte som mRNA, hvor den oversttes til en polyprotein som senere brydes til

individuelle proteiner. Hele replikations processen sker i cytoplasmaet.

Side 533 frste spalte, der er Poliovirus cyklusen beskrevet kort.

Replikation af poliovirus

Replikationen af viral RNA finder sted kort efter infektionen og er katalyserede af RNA-afhngig RNA

polymerase (replicase).

Replikasen transskribere det virale RNA, med plus komplementaritet, til RNA molekyle, med negativ

komplementaritet. Denne negative RNA virker s som skabelon for gentagende transskription af

efterkommere (progeny) plus strenge.

Negativ-strenget RNA viruser (Dyr)

Negativ strenget RNA viruser kan ikke benyttes direkte som mRNA, som nvnt tidligere i kapitel 9, om

generel virologi.

To vigtige negativ-strenget RNA viruser er Rhabdoviruser og orthomyxoviruser.

Rhabdoviruser

Hundegalskab viruser er rhabdoviruser. Rhabdoviruser er enveloped viruser, med en stor og kompleks

lipid envelope som omringer nukleocapsiden. Illustreret p figur 16,13 side 534.

Virionet indeholder forskellige enzymer som er ndvendig for infektionsprocessen. F.eks. RNA-afhngig

RNA polymerase. Dette enzym er ndvendigt idet at negativ-strenget virus genom ikke kan fungere direkte

som mRNA, men frst skal transskriberes til plus komplement, og vrt enzymer som transskribere RNA til

RNA findes ikke.

Transskription finder sted i cytoplasmaet, og RNAet kan transskriberes til to forskellige RNA. Se fig. 16,14

side 534. Her ses at i den frste type, der dannes en rkke mRNA. Den anden er en plus RNA som er en

prcis kopi af det virale genom. Den kan s bruges til at danne negativ-strenget RNA molekyler som virker

genomer af efterkommer virioner.

Translation af viral mRNA frer til dannelse af viral coat proteiner. Der findes to former for coat proteiner:

nukleocapsid proteiner og enveloped proteiner. Nukleocapsid proteiner dannes frst for at dkke det virale

RNA.

Enveloped proteiner dannes p ribosom komplekser som selv er bundet til membraner. Under dannelse af

disse proteiner adderes sukker rester, som frer til dannelse af GLUCOPROTEINER. Disse proteiner

transporteres til det cytoplasmatiske membran hvor de erstatter vrt proteiner. Nukleocapsiden migrere til

dette omrde og genkender disse virus-specifikke glucoproteiner. Nukleocapsiden bliver herefter omringet af

glucoproteiner og slut resultatet er hermed en enveloped virion med nukleocapsid i midten.

Vrten delgges ikke under ovenstende proces og udskillelse af virioner p denne mde kan ske igen og

igen.

Orthomyxoviruser (influenza virus)

Orthomyxoviruser er ogs meget vigtige, en sdan virus er influenza virus.

Udtrykket myxo = betyder at viruset interakterer med mucus (slim) p celle overfladen.

Udtrykket ortho = er for at genkende forskel mellem den og paramyxovirus gruppen.

Orthomyxoviruser er enveloped viruser hvor det virale RNA er prsenteret i virionet i et antal separeret

dele. Genomet siges at vre segmentet.

Fig. 16.15 side 535 illustrerer influenza virion strukturen. Influenza virus siges at vre polymorfisk, idet den

ikke har et defineret form nr den forlader cellen.

Som det ses p figuren s er der mange pigge p membranen der omringer nukleocapsiden. En af disse er

Hemagglutinin. Hemaglutinin forrsager agglutination af rde blod celler. Blod celler er ikke vrt celler som

viruser normalt inficere men den indeholder, p overfladen, sial syre, som mucous membran celler i

luftvejene indeholder. Blodceller bestemmer kun agglutination aktiviteten.

Influenza virus hemagglutinin kan neutralisere virusen via antistoffer, og det sdan at immunitet til influenza

finder sted.

En anden af piggene er neuraminidase, som nedbryder sial syrer komponenten. Neuraminidase fungere ved

virus samlings processen, ved at delgge vrt membran sial syrer som ellers ville have blokerede samling

eller blive optaget i den modne virus partikel.

Influenza virus cyklus er beskrevet p side 535 nederst.

Virus RNA syntesen ligner den for Rhabdoviruser.

Antigen shift = fnomen hvor dele af RNA genomet fra to genetisk forskellige strenge som har inficeret

samme celle bliver genblandet. Dette resultere i ndring af overflade antigener af viruset, og gr hermed

virus resistent mod antistofferne som er dannet af immunsystemet. Dvs. ny dannet virus kan inficere vrts

celler selvom fader viruset ikke kunne.

Replikation af ds-DNA viruser (Dyr)

Dette afsnit omhandler virus familien polyomaviruser, og man ser p SV40 som str for simian virus 40

isoleret fra en abe. Det skal lige siges at denne virus inducerer tumors i dyr.

Jeg henviser hermed til side 537-539. her bliver den genetiske mappe beskrevet og hvordan celle

transformation via DNA tumor virus finder sted.

BROCK Kap 20 Mikrobiel kontrol bestemmelser inkluderer decontamination, desinfektion og sterilisering.

Fysisk antimikrobiel kontrol Varm sterilisering

Kinetik

Hje temperatur mikroorganismer mister deres struktur og evne til at fungere, en proces kaldet

denaturering.

Fig. 20.1 side 697. her ses at mikroorganismerne dr eksponentielt (frste ordens) nr der varmes. Det ses

ogs at jo lavere temperaturen er des lngere tid tager det at drbe bakterierne.

Decemeringstid = den tid det tager at reducere populationen 10 fold. Symbol; D.

Ved at plotte log D mod temp., s ses en ret linje (fig.20.2 side 697). Hldningen af denne rette linje

fortller os om mikroorganismens flsomhed overfor varme.

Termisk dds tid / termal death time = den tid det tager at drbe alle celler ved en given temperatur.

Denne er afhngig af mikroorganismernes populations strrelse. Jo strre populationen er jo lngere tid

tager det at drbe alle celler. Dette er en anden mde at bestemme organismers varme flsomhed.

Ovenstende udfres ved at varme en celle suspension prve ved forskellige tider, blande den opvarmede

suspension med kultur medie og inkubere. Hvis alle celler er blevet drbt, s vil vi ikke kunne observerer

vkst.

Spore og varme sterilisering

Bakteriel endosporer er de mest varme-resistense strukturer der findes. Hvad er rsagen til at de er s

modstandsdygtige?

En vigtig faktor i varme resistens er mngden og tilstanden af vand indeni endosporerne. Under endospore

dannelsen der reduceres protoplasma volumen, hvilket skyldes akkumulation af calcium, SASP og syntesen

af dipicolinisk syre, hvilket giver en gele lignende struktur.

Varme resistensen er nu afhngig af vandindholdet og SASP koncentrationen i protoplast.

Lav SASP og hj vandindhold Lav varme resistens

Hj SASP og lavt vandindhold Hj varme resistens

SASP = small acid-soluble spore proteins.

Pasteurisering

Pasteurisering drber de fleste pathogeniske mikroorganismer, reducere mikrobiel byrde og reducere

vksten af delggende mikroorganismer.

Flash Pasteurisering og bulk pasteurisering er forskellige metoder at drbe bakterier p, de er beskrevet p

side 700 midt.

Autoklavering er en sterilisations procedure hvor damp placeres under tryk for at opn hj temperatur og

hermed drbe mikroorganismer. Fig. 20.3 side 698.

------------------------- 0 -------------------------- Kemisk antimikrobiel kontrol Kemisk vkst kontrol

Bakteriocidal = stoffer som delgger eller drber bakterier, men ikke ved celle lysis.

Bakteriostatisk = stoffer som hmmer bakteriel vkst. Dette er hmning af protein syntesen ved at binde

til ribosomer.

Bakteriolytisk = stoffer der drber celler ved celle lysis. Dette sker p grund af hmning af celle vgs

syntesen. Et godt eksempel penicillin.

Disse tre former for antimikrobielle midler er illustreret p fig. 20.9 side 704.

MIC = minimum inhibitory concentration. En metode til at bestem antimikrobiel aktivitet. Se velser og fig.

20.10 side 705. Reagens glasset med lavest koncentration af midlet som fuldstndig hmmer vkst af test

organisme defineres som MIC.

Faktorer som pvirker: test organismens natur, inokulations tid, opbygning af kultur mediet, inkubations

forhold og tid, ssom temperatur, pH.

En anden metode er agar diffusions metoden. Fig. 20.11 side 705. kort s sker der det at filter papir med

antimikrobielt stof placeres p overfladen af agar plade, hvor kulturen er pladret ud. Hmnings zone finder

sted og diameter af zonen er proportional med mngden af antimikrobielt stof.

Antiseptisk = midler der drber eller hmmer vkst af mikroorganismer.

Desinfektions midler = drber mikroorganismer og bruges p dde objekter.

Germicider = desinfektions middel som bruges nr varme eller radiation til dekontaminering eller

sterilisation ikke er mulig.

Tabel 20.3 side 706.

BROCK Kap 21

Gavnlige mikrobielle interaktioner med mennesker Overblik over Menneske-Bakterie interaktioner

Nr vi taler om normal flora, s taler vi om de hundrede/billioner individuelle mikroorganismer mennesket

udsttes ved normal menneskelig aktivitet.

Parasiter = organismer som vokser p eller i en vrt organisme for herved at delgge vrten.

Patogen = mikrobiel parasitter

Virulens = graden af pathogenisiteten dannet af et pathogen.

Infektion = vkst af organismer i vrten

Sygdom = beskadigelse af vrt som skader vrtens funktion.

------------------------- 0 -------------------------

Skadelige mikrobielle interaktioner med mennesker Pathogenesis starter med mikroorganismers tilslutning til vrtscellen, efterfulgt af kolonisation og vkst

resulterende i delggelse af vrten. Dette er illustreret i fig. 21.12 side 710.

Patogen indtrdelse

Bakterier og viruser tilsluttes specifikt til epithelial celler (overfladen af kroppen, som bestr af mange lag af

hud etc.) via protein-protein interaktioner p overfladen af pathogen og vrts cellen (2). Et eksempel er

Neisseria gonorrhoeae (gramnegativ bakterie, giver sygdommen gonorrhoeae, en sex trasmitted sygdom)

beskrevet p side 710. Her binder vrt cellen specifikt til proteinet Opa med en protein kaldet CD66 som

kun findes p menneskelige epithelial celler.

Capsul = en polymer coat, indeholdende en tt og veldefineret lag, der tt omringer cellen.

Glycocalyx = Et lst netvrk af polymer fibre strkker sig udefra cellen.

Slim lag = spredt masse af polymere fibre, tilsyneladende ubundet til enhver single celle.

Fimbriae og pili er bakterielle celle overflade proteiner som ogs kan fungere i tilslutnings/bindings

processen. Begge pili og fimbriae fungerer ved at binde vrt celle glycoproteiner, for herved at starte

bindingseventen.

De fleste pathogener trnger gennem epithelium for at starte pathogenisitet, og dette kaldes invasion (3).

Kolonisation og vkst (21.7)

Nr pathogenet har fet adgang til vvet, s kan det multiplicere, dette kaldes kolonisering. Da pathogenet

ikke s ofte forrsager delggelse med det samme, s sger pathogenet bestemte nringsstoffer eller

miljmssige forhold (temperatur, pH mm) for at vokse.

Organismer kan vokse lokalt ved invasionsomrdet, eller sprede sig ud i kroppen. Det sidst nvnte sker ved

at organismerne spreder sig via lymfen og ud i blodet. Nr de nr til blodet s vil de spredes til de andre vv,

idet der sker en systematisk infektion af kroppen.

Virulens (21.8)

Virulens = en parasits relative evne til at medfrer sygdom.

Bestemmelse af virulens

Virulens af et pathogen kan bestemmes ud fra LD50 studier. LD50 = Lethal Dose50, dvs. dosen af et middel

der drber 50 % af dyrene i en test gruppe.

Fig. 21.16 side 713 illustrerer forskellen p mikrobiel virulens baseret p antal celler af to forskellige

bakterier krvet til at drbe mus.

Attenuation: Nr en organisme mister sin virulens evne. Dette sker fx nr en organisme passes i laboratoriet

ikke p dyrceller, dvs. den lever ikke i optimale forhold, vil dens virulens styrke blive svagere/mistet.

Et patogen er virulens pga. to vigtige faktorer, som er: toxicity og invasiveness.

Toxicity: Et organismes evne til at skadeliggre/drbe host (vrt)cellen vha. toksiner. Fx bakterien C. tetani

forrsager sygdommen tetanus (stivkrampe) vha. exotoksiner produceret af bakterien selv.

Invasiveness: En organismes evne til at vokse p et hostcellens vve i s store tal at patogenet (parasit)

hmmer hostcellen.

Virulens i Salmonella (s. 714)

Salmonella hmmer en hostcelle ved bde brug af toksiner og invasiveness. Salmonella producerer 3

toksiner; (1) enterotoxin, (2) endotoxin og (3) cytotoxin (denne virker ved at hmme cellens proteinsyntese

og derefter f Ca2+ til at vandre ud af hostcellen). Figur 21.17 illustrerer de vigtigste elementer i salmonella,

som hjlper den i at vre patogen.

------------------------- 0 -------------------------- Virulens faktorer og toksiner Ekstracellulr virulens faktorer og toksiner der produceres af organismer for at fremme patogenesis.

Exotoksiner (21.10)

Exotoksiner er proteiner der udskilles ekstracellulrt nr organismer vokser. Disse er inddelt i:

1. cytolytiske toksiner, disse angriber enzymatisk celler og medfrer lysis (vrtcellensdd).

2. A-B toksiner, indeholder 2 underenheder hvor B binder til celle overflade receptor. Hermed kan A

overfres gennem membranen og delgge celle.

3. Superantigen toksiner som stimulerer store mngder immun respons der medfrer inflammatorisk

aktion.

Hmolysiner = cytolytiske toksiner som lysere (drber) rde blod celler.

Leukocidiner = delgger hvide blod celler og formindsker vrts resistensen.

Diphtheriae er en A-B toksin udskilt af C. diphtheriae. Hvordan dette toksin virker er illustreret p side 717.

Kort s gr det ud p at B enheden srger for binding til membran. Herefter sker en proteolytisk brydning af

binding mellem A og B. A trder ind i cellen og forstyrre protein syntesen ved at inaktivere elongation

faktor 2 (fx C2 C4).

En vigtig faktor for dannelse af toksinet er jern. Hvis jern findes i store mngder s vil det binde til

regulerings protein og fungerer negativ kontrol element, og medfrer forhindre diphtheria toksin i at dannes.

Exotoksin A virker p samme mde som ovenstende.

Tetanus toksin = (ogs en A-B protein toxin) blokerer udskilning af glycin s motorneuronet ikke kan

hmmes, og dette medfrer fortsat acetylcholin udskillelse og ukontrollerede kontraktion af forgiftet

muskler. Resultat er spasme mm. fig. 21.21 side 719.

Botulinum toksin = blokerer udskillelse af acetylcholin, s forgiftet muskler ikke kan kontraherer sig og

dette medfrer slap lammelse. Se fig.21.20 side 718.

Enterotoksiner (21.12)

Enterotoksiner er exotoksiner som pvirker tyndtarm ved at udskille vske ind i tarm lumen og medfrer

opkast eller diarre. Disse toksiner inkluderer A-B, cytotoksiner og superantigen toksiner.

Et godt eksempel er Cholera toksin som resulterer i hj vand indstrmning til tarm lumen og medfrer at

patienter dr pga. ekstrem dehydrering. Behandles ved at bruge elektrolyt oplsninger der kan erstatte vske

og ioner, som regel salt vand. Cholera toksin virkningen er illustreret godt p side 747. Kort handler det om

at A enheden aktiverer dannelse af cAMP via adenyl cyklase. Denne cAMP forgelse medfrer Cl strmning

ind i lumen, medens Na udflux hindres. Dette medfrer forget vand strm til lumen.

Endotoksiner

Endotoksiner er generelt celle bundet og udskilles i store mngder nr cellen lysere.

Gram negative bakterier producerer lipopolysakkarider som del af deres ydre lag af deres celle envelop, som

er toksisk.

Endotoksiner ger feber ved at stimulerer cellen til at danne proteiner kaldet endogenous pyrogener, som har

effekt p temperatur kontrol center i hjernen (hypothalamus).

Limulus assay = en endotoksin assay se side 748.

Sammenligning af exo-og endotoksiner

Egenskab Exotoksiner Endotoksiner Kemiske Proteiner udskilt af bestemte gram

positive eller gram negative bakterier. Generelt varme ustabil

Lipopolysakkarid-lipoproteinkompleks. Udskilles ved cell lysis af gram negative bakterier.

Virkning; symptomer Specifikt; binder normalt specifikt til celle receptor; er enten cytotoxin, enterotoxin eller neurotoxin med defineret specifik virkning p celler eller vv

Toksitet Hj og fatal Svag og ikke srlig fatal Immunogenisitet Hj; stimulerer produktion af antitoksiner Svag immunogen: immun respons ikke

god nok til at neutraliserer toksin Toxoid potential Behandling med formaldehyd vil

delgge toksiteten, men toxoid beholder immunogen effekten.

Intet

Feber potential Producerer ikke feber Pyrogen virkning: inducerer ofte feber.

BROCK Kap 22

Overblik over immunsystemet Immun systemets celler og organer

Blod og lymfe komponenter

Blod indeholder Erythrocyter, som er rde blod celler. Erythrocyters funktion er at transportere ilt fra

lungerne og ud til vvene.

Blod indeholder ogs hvide blod celler, som kaldes leukocytter. Leukocytter inkluderer celler s som

monocyter og lymfocytter.

Lymfocytter = er involveret i immun respons.

Lymf = vske som ligner blod, men mangler rde blod celler.

Plasma = den del blod vske med cellerne fjernet. Protein fibrinogen nogle komplekse reaktioner der

forrsager klumpning af blod. Dette kan celler deaktiveret ved addering af anticoagulant, som f.eks. kalium

oxalat..

Serum = blod vske med klumpede proteiner og fjernet celler.

Leukocytter

Alle leukocytter deltager i uspecifik eller specifikke immune funktioner.

Lymfocytter findes koncentreret i lymfe knuder og milten hvor den reagerer med antigener.

Lymfocytter er delt i to:

1. B celler dannes og vokser i knogle marven og er forlber for antistof dannende plasma celler.

2. T celler dannes i knogle marven, men disse bevger sig til thymus for at vokse.

Fig.22.1 s. 758 viser de vigtige celler involveret i immun responsen.

Uspecifik immunitet

For at immunitet skal finde sted s skal celler i kontakt med pathogenet. Sdanne celler er fagocytter.

Phagocyter = celler som drber pathogener og patogen produkter

APC = antigen-presenting cell, som er fagocytter der danner peptid antigener som skal aktiverer det

specifikke immun respons.

PMN = polymorphonuclear leukocytter. En fagocyt som er tiltrukket bakterier og bakterielle komponenter.

Makrofager er store celler som kan spise og delgge de fleste pathogener.

Monocyter er cirkulerende celler der differentierer for at blive makrofager.

De sure forhold i fagolysosomer medfrer dannelsen af toksisk oxygen forbindelser. Disse toksiske former

benyttes til at drbe bakterie celler opslugt af fagocytten.

Hmning af phagocyter

Nogle pathogener har udviklet mekanismer som neutraliserer effekten af toksisk fagocyt produkter.

Eksempler:

Staphylococcus aureus danner farvet forbindelser som kaldes carotenoider.

Mycobakterium tuberculosis vokser og vedvarer inden i fagocytiske celler. Disse bakterier bruger

glykolipider til at skylles de toksiske forbindelser vk.

Leukocidiner er proteiner som produceres i intracellulre pathogener. Pathogenet opsluges som normalt,

men drber fagocytten og udskilles.

Andre mikrobielle forsvar mod fagocytter er bakterielle kapsler, idet at kapslen forhindrer tilslutning af

fagocyt til bakteriel celle. Anden overflade komponent der hmmer fagocytter er M protein, som forandrer

overfladen p cellen og hmmer fagocytosis.

Det specifikke immune respons

De uspecifikke phagocyter overbringer antigener til specifikke T celler, for herved at danne effektive T celler

eller antistoffer. Immune T celler og antistoffer reagerer direkte eller indirekte for hermed at neutralisere

eller delgge antigenet.

TCR = T celle receptor. Som specifikt binder sig til antigenet.

TC = cytotoksiske celler. Disse angriber direkte og delgger antigen brende celler.

TH = T hjlpe celler. Disse fungerer indirekte ved at udskille proteiner kaldet cytokiner. Cytokinerne

aktivere andre celler for at delgge antigen brende celler.

Nogle T hjlpe celler stimulerer B celler til at danne antistoffer. Disse antistoffer er oplselige proteiner

som reagerer specifikt med antigen i kredslbssystemet for at neutralisere eller delgge antigen.

Specifik immun respons kan deles i to:

1. Cell mediated immunity = celle delggelsen sker via genkendelse af antigen p en patogen

smittede celle.

2. antibody mediated immunity = disse er effektive mod pathogener i blod og lymfen.

Immune responset er karakteriseret via 3 egenskaber:

1. Specificity = Specifik for antigenet

2. Memory = evnen til at svare mere kraftigt ved ny udsttelse for det samme antigen, fordi at initial

antigen udsttelse inducerede vkst og deling af antigen-reaktive celler, som resulterer i multiple

kopier af antigen-reaktive celler.

3. Tolerance = evnen til at skelne mellem egen antigener fra andre antigener, idet at makromolekyler i

vrten er potentielle antigener, og immunsystemet skal derfor lrer ikke at genkende disse proteiner,

da vrtscellen kan d.

Fig. 22.7 side 763 illustrerer de tre egenskaber.

-------------------------- 0 --------------------------

Antigener, T celler og cellulr immunitet Immunogener og antigener

Immunogener er antigener, som har evnen til at fremkalde et immunt respons. Vi skal her se p deres

karakteristiske trk som immunogener.

Indre virkende:

Hvis molekyle strrelsen er lille s er det drlig immunogen.

Molekylr kompleksitet er god predictor af immunogenisitet.

Fysisk egenskab som uoplselighed af makromolekyle er god prediktor af immunogenisitet.

Ydre virkende:

Dose mellem 10g og 1 gram er mest effektivt.

En anden faktor er ruten.

Den effektive immunogen skal vre fremmede for vrtscellen, da vi ved at immunsystemet er designet til at

genkende fremmede antigener.

Hvordan antigenet prsenteres for T celler

T celle receptor(TCR)

En TCR indeholder 2 proteiner, en kde og en kde, som hver indeholder en variabel og en konstant,

hvor variablerne og danner bindings stedet for antigenet. Illustreret i fig. 22.9 s. 766.

KRAV: TCR kan kun genkende et antigen hvis det frst er bundet til MHC proteiner.

MHC = major histocompatibility complex.

Major Histocompatibility Complex (MHC)

MHC proteiner er dannet via en rkke gener i MHC og de kaldes human leukocyte antigens (HLA).

MHC gener indkoder 2 forskellige proteiner, klasse 1 og klasse 2.

Klasse 1 MHC proteiner = findes p overfladen af alle nucleatedceller

Klasse 2 MHC proteiner = findes kun p overfladen af B lymfocytter, makrofager og andre antigen

presenting cells (APCs).

Fig. 22.10 side 766 illustrerer strukturen af MHC proteinerne.

Klasse 1 MHC proteiner indeholder 2 polypeptider, en alfa kde indkodet i MHC gen regionen, og en

mindre protein kaldet beta 2 microglobulin, som er indkodet af en ikke MHC gen.

Klasse 2 MHC proteiner indeholder 2 ikke kovalent bundet polypeptider, kaldet alfa og beta.

Antigen prsentation

Antigen prsentationen er illustreret p fig. 22.11 side 767 for klasse 1 MHC og klasse 2 MHC proteiner.

Klasse 1 antigen prsentation:

Trin1: Protein antigener dannet inden i cellen nedbrydes i cytoplasmaet og transporteres gennem det

endoplasmatiske reticulum membran.

Trin 2: Peptiderne bindes til klasse 1, og transporteres herefter til cellens overflade

Trin 3: MHC komplekset bindes til TCR p overfladen af TC celler.

Trin 4: CD8 corereceptor p TC cellen binder ogs til MHC, hvilket giver et strkere kompleks.

Denne celle celle binding ger TC cellers evne til at danne cytotoxiner og cytokiner som drber virus-

ramte celler.

Klasse 2 antigen prsentation:

Trin1: Klasse 2 proteiner dannes i det endoplasmatiske retilucum, hvorefter den bindes til en blokerings

protein kaldet Ii, som forhindrer klasse 2 i at danne kompleks med andre peptider.

Trin 2: Klasse 2 bevger s hen mod phagolysosome hvor Ii og et fremmed protein fordjes

Trin 3: klasse 2 proteinet bindes nu til det fordjet fremmed peptid. Dette kompleks transporteres herefter til

cellens overflade

Trin 4: Her genkendes komplekset af TCR og binder til det.

Trin 5: CD4 corereceptor p TH cellen binder ogs til MHC.

TH cellen udskiller inflammatoriske cytokiner som indvirker p andre celler for herved at aktivere et immunt

respons, eller stimulere antistof produktionen via specifikke B celle kloner.

Hvordan TC celler drber Antigen-bundet celler

KRAV: TC celler og ml celler skal have kontakt for at cellen skal d.

Denne kontakt forrsager udskillelse af sm korn (granuler) fra TC cellen (degranulering). Disse sm korn

indeholder perforiner, som trder ind i ml cellens membran for herved at bne nogle porte.

Herefter kan granzymer (kommer fra de sm korn) passere disse porte og forrsager apoptosis, og cellen dr.

Det skal lige siges at TC cellen dr ikke, idet det kun er celler med det fremmede antigen der angribes.

Fig. 22.12 side 769 illustrerer ovenstende.

Natural Killer cells (NK cells)

NK celler er hverken T celler eller B celler. Deres antal stiger ikke og udviser ikke hukommelse efter

stimulering.

NK celler ligner TC i deres evne til at drbe fremmede celler ved at benytte perforiner og granzymer (men

NK celler genkender ikke antigenet og der er heller ikke kontakt med det fremmede antigen.)

NK celler genkender almindelige celler og deres klasse 1 protein gennem en rkke speciale klasse 1

receptorer. Binding af disse receptorer til klasse 1 deaktiverer drber mekanismen, men mangel p binding

gr at NK celler drber de ugenkendelige celler.

T-hjlpe celler: aktivering af Immune respons

T-hjlpe cellerne er delt i to:

TH1: spiller en rolle i makrofag aktivering. Makrofager drber fremmede celler, en evne stimuleret af TH1

celler. Aktiveringen sker ved at TH1 udskiller cytokiner der aktiverer makrofagen som s kan drbe

fremmede patogen eller tumor celler. Se. fig.22.12 s. 769.

TH2: interaktion med B celler og stimulerer antistof produktion. B celler er omringet med antistoffer som

fungerer som antigen receptorer. Nr antigen binder til B celle antigen receptorer, s dannes der ikke antistof

med det samme, men den fungerer som APC og laver interaktion med TH2 celler. Det bundne antigen

endocytoseres og nedbrydes i B cellen. Peptid fra nedbrudt antigen prsenteres via klasse 2 MHC protein til

TH2 cellen. T cellen udskiller cytokiner som reagerer med B cellen og aktiverer denne til antistof dannelse.

-------------------------- 0 --------------------------

Antistoffer og immunitet Antistoffer (immunoglobulin)

Immunoglobuliner kan inddeles i:

1. IgG

2. IgA

3. IgM

4. IgD

5. IgE

IgG strukturen

Dens molekylevgt er ca. 150 000 og den er opbygget af fire polypeptid kder, som illustreret i fig. 22.14

side 772.

To identiske light kder (25 000 MW) er koblet med to identiske heavy kder (50 000 MW).

Hvert antistof har to antigen bindings enheder (bivalente), som hver indeholder en tung kde og en let

kde.

Light og heavy kden ender med den variable domne, og det betyder s at antistoffer er forskellige fra

hinanden i deres aminosyrer sekvens.

Antigen bindings side

Tung og let kdens variabler danner bindings stedet for antigenet.

De andre klasser af immunoglobuliner

IgM = denne er illustreret i figur 22.17 side 773. Det ses at den findes som en total masse af fem

immunoglobulin molekyler bundet via mindst en J kde. Den har ti antigen bindings steder. Har lav antigen-

bindings affinitet, men hj aviditet. Aviditet = beskriver styrken af binding ved multivalent antigen-bindings

molekyler.

IgA = udskilles fra MALT. Den bestr af 2 immunoglobuliner der er bundet via J kde.

IgE = findes i serum i lave koncentrationer, men er vigtig mod allergi.

IgD = findes i sm koncentrationer i serum.

Antallet af konstant domner adskiller nogle af immunoglobiner. Nogle indeholder 3 og andre 4.

B lymfocytter og antistof produktion

Produktion af immunoglobuliner er illustreret i fig. 22.13 side 770. B cellen er den antigen prsenterende

celle med et antigen - specifik Ig p dets overflade. Antigenet bliver s prsenteret til TH2 cellen via TCR.

TH2 stimulerer B cellen til at producere antigen-specifikke antistoffer.

Lad os se p produktionen trinvis:

Trin 1: Antigener spredes via den lymfatiske og blod kredslbet ud til lymfoid organer ssom lymfe knuder,

MALT og milten.

Trin 2: De antigen stimuleret B celler forges og skilles ad for herved at danne plasma celler og memory

celler.

Plasma celler har en kort levetid, men producerer og udskiller store mngder IgM i den primr antistof

respons. Se fig. 22.19 side 775.

Trin 3: Memory celler har en lngere levetid, de kan leve op til flere r. Hvis der reinjiceres antigener p et

senere tidspunkt, s behver memory cellerne ikke T celle aktivering. De forvandles hurtig til plasma celler

og begynder s sin produktion af IgG

Mngden af antistoffer er her forget 10 100 gange mere end ved den frste injektion af antigen, dette

kaldes den sekundre antistof respons. Fig. 22.19.

Dette skift fra IgM til IgG kaldes klasse skift.

Komplement, antistoffer og patogen delggelse

Komplement er en rkke proteiner der aktiveres ved interaktion med antigen-antistof komplekser p

bakterielle celler. Dette forrsager delggelse og lysis af cellulr indhold.

Hvordan finder dette sted?

1. Antistofferne IgG og IgM binder til antigener p celle overfladen og danner komplekset.

2. C1 (komplement 1) binder til komplekset. Dette frer til at binding af C4 og C2. Herefter binder C3.

3. membran C3 katalyserer dannelsen af C5-C6-C7 kompleks.

4. C8 og C9 afsttes p ovenstende kompleks og det er disse komplementer der medfrer membran

delggelse og lysis.

Som det ses s dannes en rkke af komplementer, som aktiverer hinanden. Dette er illustreret p fig. 22.20

side 776. ovenstende kan finde sted p Gram-negative bakterier.

Gram-positive gennemgr opsonization. Phagocyter har antistof receptorer og C3 receptorer. Disse

receptorer binder til antistof konstant domner og C3 komplement. Hermed ges phagocytosis ved

komplement kaldet OPSONIZATION.

-------------------------- 0 --------------------------

Benytte immunsystemet til at forhindre sygdom Immunization til at forhindre sygdom

Agmmaglobulinemia = genetisk fejl hvor antistoffer ikke produceres pga. defekte B celler.

Man kan opn immunitet p forskellige mder:

1. Naturlig aktiv immunitet som er immunitet efter infektion.

2. Kunstig aktiv immunitet som er antigen udsttelse for at inducerer antistof produktionen, en sdan

metode er vaccination.

3. Kunstig passiv immunitet er nr en person fr injiceret antiserum fra en anden person som tidligere

har produceret antistoffer.

4. Naturlig passiv immunitet som findes i spdbrn. De nyfdte har moderlig IgG antistoffer som

skal beskytte dem mod sygdom til deres eget immunsystem er blevet moden.

Sammenligning mellem aktiv og passiv immunitet, se side 778.

Aktiv immunitet bruges ofte til at beskytte en person for fremtidige angreb medens passiv immunitet bruges

til at behandle en person som har sygdommen nu.

Vaccine fremstilling: mikroorganismerne drbes med kemiske midler ssom phenol eller formaldehyd eller

fysisk ved varme. De dde/inaktiveret bruges i vaccinen.

Ved toksin forrsaget sygdomme, der dannes et toxoid. Toxoid er det modificeret exotoxin, som ikke er

toksisk.

Immunisation med levende celler eller virus er mere effektive. Man kan ofte isolere mutant strenge fra et

patogen som har mistet virulensen, men stadig har immunisations antigener. Denne type kaldes attenuated

strains.

Nye Immuniserings strategier se sider 779-781.

-------------------------- 0 --------------------------

Sidste del af kapitlet omhandler immun respons sygdomme, dvs. sygdomme der opstr nr kroppen udvikler

immun respons. Her er taler om immediate hypertensitivity (type 1), delayed hypersensitivity (type 4) og

autoimmune sygdomme (Type 2 og 3). Den sidste del af kapitlet omhandler superantigener, som medfrer

sygdom.

Se siderne 781 til 785.

BROCK Kap 23

Immunoglobulin gen superfamilie Celle overflade receptorer og immunitet

Antigen-binding immunoglobuliner, T celle receptorer og MHC proteiner tilhrer alle tre immunoglobulin

gen superfamilien.

--------------------------- 0 -------------------------- Major Histocompatibility Complex (MHC) MHC protein struktur, MHC gener og polymorfisme

MHC protein

Hvor findes de?

Konstant domn

Variable domn

Strrelse af peptid antigener

Gen steder

Polymorphism

Klasse 1

P overfladen af alle celler med kerne.

Den ene er membran integreret og kaldes kde. Den anden er ikke integreret og kaldes 2m2.

En 1 og 2 domne. Closed groove.

8-10 aminosyrer

HLA-A, B og C.

JA

Klasse 2

Kun p overfladen af B celler, makrofager, dvs. APC er.

Begge konstanter er membran integreret og kaldes og kder.

Domner 1 og 1 danner en tilsvarende bindings side, men denne er ben. Open groove.

Mere end 10 aminosyrer

HLA-DR, -DP og -DQ

JA

Se figurerne p side 789 og 790.

Hvad er polymorfisme?

Det er forekomsten af multiple alleler ved et locus i et frekvens som ikke kan forklares ved forekomst af ny

normal mutation. Alleler er variation i gener, men med samme funktion. F.eks. forekommer der 95

forskellige alleler ved HLA-A.

Motif = bevaret aminosyrer sekvens som findes i alle peptid antigener som binder til et givet MHC protein.

F.eks. hvis alle 10 aminosyrer peptider der binder til en bestemt MHC klasse 1 protein har tyrosin ved

position 2 og leucin ved 7, s vil alle x-tyrosin-xxxx-leucin-xxx binde til MHC proteinet.

Anchor residue = de ikke varierende aminosyrer i motif. Dvs. at MHC protein kan binde til et stort antal

forskellige peptider, hvis den har den anchor resisue der krves.

-------------------------- 0 --------------------------

Antistoffer Antistof proteiner og antigen binding

Som sagt s varierer Igerne fra hinanden pga. variation i aminosyrer sekvens ved V domnet. De

hypervariable omrder kaldes 3CDR er, som ogs srger for molekylr kontakt med antigener.

2 Beta-2-mikroglobulin 3 complementarity determining regions

CDR1 og CDR2 er forskellige mellem immunoglobuliner medens CDR3 er forskellige fra hinanden (dvs. at

CDR3 p heavy chain er forskellig fra den p light chain.). Heavy chain har en kort variations omrde D

efter CDR3 og en forbindings omrde J. se. fig.23.4 s. 792.

CDRerne foldes sammen og danner antigen-bindings siden.

Antistof gener og variation

Gener for V, D, J og C delene er separeret fra hinanden i genomet, men samles for at danne den modne Ig

gen i udviklingen af B cellen.

Fig. 23 side 794 illustrerer gen omordningen af Ig. Som det ses s rekombineres generne for at danne en

heavy kde eller light kde. Det aktive gen (indeholdende en intervening sekvens mellem VDJ og C

genet) transskriberes og den primre RNA transkript splejses med VDJ for at danne mRNA. mRNA kan s

oversttes og danne heavy og light kderne.

Denne metode giver stor variation. Man kan danne uendelige antal antistoffer, idet at gen omordning

(rearrangement) kan give op til 3 000 000 antistoffer.

Somatic hypermutation giver ogs antistof variation. Dette sker typisk efter anden udsttelse for antigen.

Ligesom vi s i kap. 22 med switch fra IgM til IgG.

Affinitet mutation = forgelse af antigen-binding affinitet.

Abzymer = antistoffer der fungerer som enzymer. Bruges eksperimentel som bevis p somatisk mutation.

Se. fig. 23.6 side 795.

-------------------------- 0 --------------------------

T-celle receptorer TCR proteiner og antigen binding

TCR er et protein der binder til peptid antigener som sidder p MHC proteiner. TCR er membran integreret

og findes kun p overflade af T celler. Bindingen sker via V domner og , og disse indeholder ogs CDR

1, 2 og 3, der binder til antigen.

Agretope = den del af peptid antigen hvor MHC proteiner binder.

Apitope = den del hvor TCR binder.

CDR3 er den del som har kontakt med epitop, medens CDR 1 og 2 binder til MHC proteinet.

Se. fig. 23.7 side 796.

TCR gener og variation

De gener der skal kode og kder er ligesom Ig gener forskellige for de konstante og variable domner.

V domnet for kden kodes af V, D og J gen segmenter. V domnet for kden kodes af V og J gen

segmenter.

Variation dannet ved rekombination, reassortment af gen produkter, muligheden for at transskriberer D

omrder i tre mulige lserammer og almindelig N-nukleotid addering sikre at der er mange ubegrnset

muligheder for forskellige antigen-binding TCRer. Der er tale om 1015 muligheder.

Se fig. 23.8 side 797.

-------------------------- 0 --------------------------

Molekylre signaler i immunitet Her bliver de molekylre mekanismer der kontrollerer aktivering af immun respons gennemget.

Klon selektion og tolerance

Klon selektion: Nr B eller T celler stimuleres ved interaktion med et enkelt antigen, s vokser cellerne og

differentierer. Som resultat s vil de antigen-stimulerede celler dele sig og danne en pool af celler som

udtrykker samme antigen-specifik receptor. Disse kopier kaldes kloner og er illustreret p fig. 23.9 side 798.

For at undg at egne antigener skades, s er immunsystemet bygget p den mde at det kun er kloner som

virker mod fremmede antigener der vlges (tolerance).

T-celle selektion: selektionen finder sted i thymus, en primr lymfoid organ som spiller en central rolle i

udviklingen af antigen-reaktive T celler. Lymfocytter der vil omdannes til T celler forlader knogle marven

og trder ind i thymus. Her vil T-celler der ikke binder til MHC proteiner d via apoptosis. Dette kaldes

positiv selektion. Negativ selektion kan s finde sted. De voksende T celle kloner som laver interaktioner

med egne antigener og MHC drbes (hermed undgs autoimmunitet, dvs. delggelse af egen vv). T celle

kloner der reagerer med ikke egne antigener forlader thymus og trder ind i den lymfatiske cirkulation igen,

og medvirker i immunresponsen mod fremmede antigener. Fig. 23.10 side 799.

Ovenstende form for selektion kaldes klon slettelse.

B-celle tolerance er ogs vigtigt fordi at antistoffer dannet via self-reaktive B celler kan delgge vv. Dette

forhindres ogs via klon slettelse.

Klon anergy = umodne B celler der er self reaktive udvikles ikke, ogs selvom de udsttes for hje

koncentrationer af self antigener i knogle marven.

Second signals

self reaktive T-celler kan undg klon slettelse (idet at ikke alle self antigen findes i thymus), men

deaktiveres gennem interaktioner i de sekundre lymfoid organer (MALT, milten mm). Uforpligtet T-celler,

dvs. celler som ikke har lavet interaktion med antigen, kan aktiveres i de sekundre lymfoid organer ved

frst at binde med peptid: MHC via TCR (signal 1). Signal 2 er binding mellem B7 APC protein og CD28 T-

celle protein. Hvis signal 2 ikke finder sted s kan T-cellen ikke aktiveres. Dette kaldes klon anergy, og man

siger at T cellen er anergized. Se fig. 23.11 side 800.

Cytokiner og chemokiner

Cytokiner = gruppe oplselige proteiner produceret af leukocyter og som regulerer celle funktion.

Lymfokiner = cytokiner dannet af lymfocytter.

Autokriner = cytokiner der stimulerer egne celler.

Interleukiner = cytokiner der formidler interaktioner mellem leukocytter.

Tabel 23.1 side 801 beskriver en rkke cytokiner.

Fig. 23.12 side 801 giver et godt eksempel p hvordan cytokiner er involverede i antigen-specifik antistof-

formidlet immunrespons.

Kort s udskiller makrofagen nogle IL-1 cytokiner. Disse binder til IL-1 receptorer p TH2 celle. Denne

aktiveres og udskiller autokrine IL-2 cytokiner. Disse cytokiner bevirker at cellen deler sig og danner klon

kopier. Eller IL-2 kan producerer IL-4 som binder til specifik receptor p B celler, som differentierer til

plasma celler og danner antistoffer.

Chemokiner = sm proteiner der virker som kemoattraktante for fagocytter eller T celler. De produceres af

lymfocytter men ogs fra andre celler som svar p bakteriel produkter, viruser og andre produkter der skader

cellen. Fagocytter og T celler tiltrkkes af chemokiner til det beskadiget omrde og stimulerer et

inflammatorisk respons og et virkningsfuldt immun respons (specifik).

BROCK Kap 24

Immunologi og klinisk diagnostisk metoder Immunoassays

Antistof titer

Bestemmelse af antistof titeren for et mistnkt patogen er en alternativ metode til undersgelse af infektion.

Det man gr, er at man opstiller en fortyndings rkke af patientens serum, for herved at bestemme den

hjeste fortynding hvori antigen-antistof reaktionen finder sted. Dette er illustreret i fig. 24.9 side 819.

En enkelt bestemmelse er ikke nok til at indikere aktiv infektion, og for at sikre sig at en akut sygdom

skyldes en bestemt patogen, s er det ndvendigt at bevise en stigning i antistof titter i akut og forbedret

serum prve fra den samme patient. Her vil antistof titeren vre lav under den akutte periode og stige under

bedring.

Antistofs tilstedevrelse i serum prven kan ogs skyldes for nylig immunisering, og dette er ogs en god

metode til at bestemme at immuniseringen er effektiv.

Hud test

Den mest kendte metode er tuberkulin testen. Her injiceres en oplselig ekstrakt af Mycobackterium

tuberculosis under huden. En positiv betndelses reaktion i lbet af 48 timer indikerer nuvrende infektion

eller tidligere udsttelse.

Polyclonale og monoclonale antistoffer Polyclonal = antistoffer som er lavet af mange forskellige B celle kloner.

Monoclonal = antistoffer lavet af et enkelt B celle klon.

Polyclonal Monoclonal - Indeholder mange antistoffer - indeholder et enkelt antistof, og genkender kun

et determinant.

- Genkender mange determinanter p et antigen - Kun en klasse antistoffer

- Forskellige klasser af antistoffer - Kan producere et specifikt antistof ved at

benytte et urenset antigen

- Kan lave et specifikt antistof ved kun at

benytte et oprenset antigen.

- Reproducerbart

- Ikke reproducerbart

- Vanskelig at standardisering.

Antistof producerende B lymfocytter dr normalt efter nogle uger i celle kulturer (in vitro). Disse celler m

derfor modificeres. Dette sker ved at B lymfocytter sammensluttes med myeloma celler som er B-celle tumor

og der dannes Hybridoma.

Hybridoma er celler som brer begge fusion cellers egenskaber. Disse celler vokser ogs p ubestemt tid og

producerer antistoffer.

Hybridoma teknik, som kan bruges til at danne monoklon antistoffer er illustreret p s. 821. Kort s injicerer

man antigener ind i en mus. Antigen-specifikke B celler vil under de nste uger formerer sig og producerer

antistoffer i musen. Milten som er rigt med B celler fjernes fra musen og sammensluttes med myeloma

celler. Da disse hybridomaer kun er en lille brkdel af populationen s tilsttes HAT (hypoxanthin,

aminopterin og thymidin) til in vitro celle kulturen. Herved stopper vksten af myeloma celler, men

hybridoma vokser videre idet at de kan forbig aminopterin blokeringen og vokse p de to andre stoffer, da

den fr sine genetiske informationer fra B celle delen. B cellerne vil d efter nogle f celle delinger.

ELISA bruges til at identificerer hybridoma som producerer monoklon antistoffer.

Monoklon antistoffer bruges i kliniske, diagnostiske og forsknings forsg.

Serologi

Serologi = studier af antigen-antistof reaktioner.

Serologiske test afhnger af nedenstende.

Specificitet = antistoffers evne til at genkend et enkelt antigen.

Sensitivitet = laveste mngde antigen som kan undersges eller findes.

Antigen - binding tests som producerer synlige resultater som involverer antigen-antistof reaktioner:

Neutralisation = interaktion mellem antigen og antistof, hvor antistof reducerer antigenets biologiske

aktivitet. Eksempel er neutralisation af mikrobiel exotoxiner via specifik antistof, se fig. side 825. Antitoxin

= antiserum indeholdende antistoffer der neutraliserer toxin.

Precipitation =

Agglutination

Agglutination er synligeklumpen af antigener nr disse blandes med antistoffer.

Direkte agglutination er resultatet af interaktionen mellem oplselige antistoffer og antigener (som er del af

en celles overflade). Den mest kendte direkte agglutination er den brugt til at finde blod typer hos

mennesker. Her findes antigenerne p overfladen af rde blod celler. En njere beskrivelse af sdan en

undersgelse ses p side 826. et lille eksempel: Type

A individer producerer antistoffer mod gruppe B antigener og omvendt.

Antistofferne kan ogs medfre hmolyse (lysis af rde blod celler) ved komplementation.

Passiv agglutination er agglutination af oplselige antistoffer/antigener der har koblet til celler, latex kugler

eller trkul partikler. Dvs. efter de er koblet til cellen/partiklen, som fungerer som inaktiv carrier, s kan de

gjort uoplselige antigener detekteres via agglutination. Metoden er beskrevet p side 827. men kort s

handler det om at blande patient serum og antigen overtrukket latex kugler p mikroskop skive. Efter kort

tids inkubation s undersges om det hvide latex klumper nr patient antistof binder til antigenet p latex

kuglen.

Immunoelektron mikroskopi

Immunoelektron mikroskopi er en metode til at lokaliserer antigener (normalt proteiner) i cellen. Dette bestr

i at antistoffet er konjugeret med et tungt metal, normalt guld/platin. Binding af disse antistoffer kan s

detekteres som sorte prikker p fotografier (man har brugt elektron mikroskop, idet at de tunge metaller

spreder elektron strlen).

Denne metode er tidskrvende, krver ekspertise og specielle udstyr, og det gr at den er upraktisk til

diagnose procedure.

Fluorescens antistoffer

Antistoffer modificeres med fluorescens farver, og bruges til at detekterer antigener p ubeskadiget celler.

Der findes en direkte og indirekte procedure, se. side 829.

Direkte: det fluorescerende antistof er bundet direkte til overflade.

Indirekte: ikke fluorescerende antistof er bundet direkte til overflade. Det fluorescerende antistof binder til

det ikke fluorescerende.

P side 829-831 der gives der eksempler p klinisk anvendelser af fluorescerende antistoffer. Eksempler:

diagnose af pathogener, definerer antallet af bestemte celler i blodet, ssom T celler.

HUGO OG RUSSELL Kap 5 -laktam antibiotika

Pencilliner og mecillinamer

Henvises til s.92 og nogle sider frem.

Tetracycliner

Tetracycliner er ring systemer med fire ringe. Den grundlggende struktur + tetracyclin antibiotikaer er

illustreret p side 104 fig. 5.7.

Tetracycliner virker mod Gram-positiv og Gram-negative bakterier. Resistens mod tetracyclin antibiotika

sker meget langsomt, men der er kryds-resistens, f.eks. en organisme resistent til en af antibiotika er normalt

resistent mod alle de andre fra gruppen.

Sulfat indeholdende tetracyclin, kaldet thiacyclin er mere aktiv end minocyclin mod tetracyclin resistens

bakterie.

Glycylcycliner

Glycylcycliner er tetracyclin analoger. Glycylcycliner har en ekstra substituent ved C-9, nemlig en

dimethylglycylamido side kde. Disse virker mod bakterier som har udtrykt resistens mod tetracycliner via

en udstrmnings mekanisme. Struktur se side 105 fig. 5.8.

Rifamyciner

Rifampicin, illustreret p side 106 fig. 5.9, virker mod Gram-positive bakterier (inklusiv Mycobacterium

tuberculosis) og nogle Gram-negative (p nr enterobakterier eller pseudomonads). Den har en hj effekt

mod M. tuberculosis end andre antibiotika.

Rifampicin virker ved lave koncentrationer mod staphylococci. Da mutation resistens kan opst, s kan

rifampicin kombineres med andre antibiotika, som f.eks. vancomycin, ved behandling af staphylococci

infektion.

Aminoglykosid-aminocyclitol antibiotika

Aminoglykosid antibiotika indeholder amino sukker i deres struktur. Nogle aminoglykosid antibiotika er vist

p side 107 fig.5.10. aminocyclitol antibiotika indeholder ikke amino sukker.

Streptomycin virker mod M.tuberculosis og bruges som primr stof til behandling af tuberculosis.

Streptomycin bruges normalt i kombination med isoniazid og p(4)-aminosalicyl syrer. Den virker ogs mod

andre bakterie typer, for eksempel Gram-negative og nogle staphylococci strains.

Gentamicin virker mod Gram-positive og Gram-negative bakterier. Den administreres ofte i konjunktion

med carbenillin for at forsinke resistens opbyggelse.

Kanmycin virker, ved lave koncentrationer, mod Gram-positive bakterier (inklusiv penicillin-resistens

stahylococci) og Gram-negative bakterier.

Paomomycin bruges ved behandling af tarm amoebiasis og akut bacillr dysenteri.

Se yderligere side 108.

Amikacin har pga. en substitueret aminobutyryl i amino gruppen i 2-deoxystreptamin ringen get resistens

mod nogle aminoglykosid-modificeret enzymer, fordi den har frre sider at modificere (fig. 5.10D).

Makrolider

Makrolider er karakteriseret ved at have en molekylr struktur der indeholder store lakton ringe bundet med

amino sukker via glykosid binding. Dette er illustreret p side 109 fig. 5.11.

Den mest vigtige gamle makrolid er erythromycin, oleandomycin, triacetyloleandomycin og spiramycin.

Erythromycin virker mod de fleste Gram-positive bakterier men ikke enterobakterier. Aktiviteten er pH

afhngig og stiger med pH optil 8,5.

Krydsresistens kan finde sted mellem de fire ovennvnte antibiotika.

Nyere makrolider er semisyntetiske molekyler der har substituenter p lakton ring systemet. Se. s. 110

fig.5.12 og 5.13.

Polypeptid antibiotika

1. Bacitracin som kun virker mod Gram-positive bakterier.

2. polymyxiner som er aktive mod mange typer Gram-negative bakterier, men ikke gram-positive.

3. 2 antituberculre antibiotika capremycin og viomycin.

Bacitracin bruges eksternt pga. dens toksitet.

Capremycin og viomycin virker mod M. tuberculosis.

Miscellaneous antibakteriel antibiotika

Se side 113 fig. 5.14.

Chloramphenicol har bakteriostatisk effekt. Den har anti-rakitissal aktivitet og har hmmende effekt p

store viruser.

Nogle bakterier kan producere et enzym, kaldet chloramphenicol acetyltransferase, som acetylere hydroxyl

grupperne i side kden af antibiotikaet, som gr at den mister sit antibiotikum effekt.

Fusid syrer er aktiv mod mange typer af Gram-positive bakterier. Streptococci er resistens.

Lincomycin virker mod Gram-positive cocci, p nr Enterococcus faecalis. Gram-negative bakterier er

mindre sensitive og enterobakterier er resistente. Kryds resistens af staphylococci kan finde sted mellem

lincomycin og erythromycin, men nogle erythromycin resistente organismer kan vre lincomycin sensitive.

Syntetisk antimikrobielle stoffer

Sulfonamider er illustreret p side 116 fig. 5.16.

Sensitive bakterier: strep. Pneumoniae, -haemolytisk streptococci, E. coli og proteus mirabilis.

Resistente bakterier: Enterococcus faecalis, Ps. Aeruginosa, indol-positive Proteus og Klebsiella.

Sulfonamider bruges til behandling af ikke kompliceret urin infektion forrsaget af E.coli i hus praksis.

Nitrofuran forbindelser er illustreret p side 119 fig. 5.18.

Disse forbindelser bestr af en furan som har en nitro gruppe p position 5 nr den er 2-substitueret. De

vigtigste nitrofuraner indeholder azomethin gruppe ved C2 og nitro ved C5.

Den biologiske effekt mistes nr:

1. nitro ringen reduceres

2. nr azomethin gruppen gennemgr hydrolytisk dekomposition, eller

3. Nr vinyl linkagen oxideres.

Furazolidon virker mod de fleste enterobakterier og har vret brugt til behandling af diarrhoea og

gastrointestinel forstyrrelse af bakteriel afstamning.

Se flere nitrofuraner side 119.

Nitrofuraner siges at vre mutagene.

Stof kombinationer

En kombination af to antibiotika giver:

1. synergistisk effekt, dvs. joint effekten er hjere end summen af hver stofs effekt alene.

2. additiv effekt, hvor den kombinerede effekt er lig med det regnede sum af de to individuelle stoffers

effekt.

3. antagonisme, hvor der er mindre effekt af blandingen end det mere potente stof effekt alene.

HUGO OG RUSSEL kap 9

Kapitel 9 Bakteriel resistens mod antibiotika Indre og opnet resistens

Antibiotika resistens kan inddeles i to hoved typer: indre og opnet resistens.

Indre resistens er arvelige egenskaber fra bakterierne som er ansvarlig for forhindring af antibiotika

aktivitet. Dvs. resistensen er medfdt. F.eks. s er mange antibiotika aktive mod Gram-positive bakterier,

men kan s vre inaktiv i Gram-negative bakterier og omvendt. Tabel 9.1 side 182 viser aktiviteten af flere

antibakterielle antibiotikum.

Opnet resistens finder sted nr bakterier som tidligere har vret modtagelig bliver resistente, normalt men

ikke altid, efter de er udsat for antibiotika.

Opnet resistens sker ved mutationer i kromosomet eller ved erhvervelse af genetiske kode for resistens fra

ydre kilder, normalt plasmid eller transposon.

Genetisk basis af opnet resistens

Resistens mod specielle antibiotika kan finde sted som en konsekvens af mutering af kromosomale gener

pga. ndring i DNA rkkeflgen.

Transition involverer substitution af en purin (A/G) for en anden og derfor en pyrimidin (C/T) for en anden.

Transversion involverer ndring fra pyrimidin til purin og omvendt.

Frameshift mutation finder sted nr en eller to baser indsttes inden i DNA rkken, og resultere i en

forandret reading frame og derfor en forandret gen produktion.

Plasmider er ekstra