1

“ Esploriamo i cromosomi”

Un percorso didattico per le Scuole

Secondarie di Secondo Grado

2

INDICE 1. La doppia elica p. 1 2. Replicazione del DNA p. 2 3. Com’è impacchettato il DNA? p. 4 4. Caratteristiche strutturali dei cromosomi degli eucarioti p. 5 5. Analisi citogenetica p. 6

5.1. Cromosomi umani p. 6 5.2. Le mappe cromosomiche e i bandeggi p. 7 5.3. Applicazioni dell’analisi citogenetica p. 10

6. Osservazione e ricostruzione del cariotipo umano in laboratorio p. 10

6.1. Allestimento di preparati cromosomici p. 10 6.2. Ricostruzione del cariotipo umano p. 11

7. Ibridazione molecolare e mappatura geni p. 12 7.1. Ibridazione molecolare p. 12 7.2. Ibridazione in situ fluorescente p. 13 7.3. Classificazione sonde p. 14

8. Modello didattico della ibridazione in situ p. 17 9. Domande di autovalutazione p. 18 10. Glossario p. 22

3

Fig 1. Un nucleotide è formato da un gruppo fosfato, da uno zucchero a cinque atomi di carbonio e da una base azotata. In questo caso è mostrato un desossiribonucleotide monofosfato, il monomero del DNA.

1. LA DOPPIA ELICA Essendo stato dimostrato negli anni ’40 che il DNA (sigla dell'acido desossiribonucleico) era il materiale ereditario, la domanda cruciale che ci si poneva agli inizi degli anni ’50 era come il DNA svolgesse la sua funzione. Per trovare la risposta a questo quesito era d’altra parte indispensabile determinarne la struttura chimica. Nel 1953, James Watson e Francis Crick riuscirono a decifrarla, determinando l’inizio di una nuova era della biologia, quella della biologia molecolare. Oggi sappiamo che il DNA è un polimero, ossia un insieme di tanti monomeri:i nucleotidi (Fig.1). Ogni

nucleotide è co-stituito da tre componenti: uno zucchero (il desossiribosio) a cui sono legati un gruppo fosfato e una base azotata (adenina, A; guanina, G; timina, T; citosina, C). Adenina e guanina sono basi puriniche, timina e citosina sono basi pirimidiniche. Gli atomi di carbonio del desossiribosio vengono numerati da 1’ a 5’ (per distinguerli da quelli della base azotata, numerati 1, 2, 3, ecc.). Il carbonio in posizione 5’ si lega al gruppo fosfato, mentre l’ossidrile (OH) nella posizione 3’ è libero per formare il legame con il nucleotide successivo. La molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche avvolte l’una intorno all’altra con andamento destrorso. (Fig.2). Le due catene sono antiparallele, ossia i due singoli filamenti sono orientati in direzioni opposte. Gli scheletri zucchero–fosfato si trovano all’esterno, mentre le basi azotate sono rivolte verso l’interno. Le basi delle due catene sono unite tra loro mediante legami idrogeno e si appaiano secondo una regola di complementarietà precisa: adenina con timina A=T (con formazione di due legami a idrogeno) citosina con guanina G≡C (con formazione di tre legami a idrogeno) (Fig.3). Ne consegue che il legame AT è

Fig 2. Struttura a doppio filamento di un breve segmento di DNA. I montanti della scala sono costituiti da molecole di zucchero alternate a gruppi fosfato. La distanza tra i due montanti misura 2 nm. La distanza tra due basi azotate successive lungo il filamento è di 0,34 nm. Le basi si appaiano sull’asse centrale dell’elica. Il passo dell’elica è di 3,4 nm.

Fig 3 . Schema di una molecola di DNA. I due filamenti hanno orientamento 5’→3’ opposto. La sequenza delle basi azotate lungo un filamento determina la sequenza delle basi lungo il filamento complementare. Tra un’Adenina di un filamento e una Timina del filamento opposto sono presenti due legami a idrogeno; analogamente tra una Guanina e una Citosina sono presenti tre legami a idrogeno.

4

più debole di quello GC. L’appaiamento di una base purinica (più grande) con una pirimidinica (più piccola) consente di mantenere costante il diametro dell’elica del DNA. In base alle regole di complementarietà delle basi, conoscendo la sequenza di uno dei due filamenti di una molecola di DNA, è quindi possibile prevedere esattamente quella del filamento complementare. Inoltre, in una molecola di DNA a doppio filamento, la frequenza con cui compare l’Adenina sarà sempre uguale a quella con cui compare la Timina e analogamente per Citosina e Guanina.

2. REPLICAZIONE DEL DNA

Caratteristica peculiare del DNA è la sua capacità di autoreplicarsi, che rappresenta il fondamento della trasmissione dell’informazione genetica. La modalità di duplicazione del DNA era già stata intuita da Watson e Crick nel 1953, come conseguenza della struttura della molecola stessa.

Il processo di duplicazione del DNA avviene nella fase S (sintesi) del ciclo cellulare (Fig.4) e deve essere completo perché la cellula possa andare incontro alla divisione.

Ad ogni ciclo di divisione cellulare, ciascun cromosoma deve essere fedelmente duplicato in modo che ciascuna delle due cellule figlie ne possa ricevere una copia identica.

La replicazione del DNA in tutte le cellule viventi, dai batteri all’uomo, è un processo complesso, che richiede l’intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione inizia in corrispondenza di siti detti origini di replicazione presenti ad intervalli lungo i cromosomi. In questi siti, alcune proteine enzimatiche (ad esempio la DNA elicasi) srotolano la doppia elica di DNA, rompendo i legami a

idrogeno tra le basi dei due filamenti complementari e generando così i filamenti „stampo“. La polimerizzazione di una nuova catena di DNA si realizza grazie all’appaiamento successivo di nucleotidi complementari alla catena „stampo“, uniti tra loro tramite legami fosfodiesterici ad opera dell’enzima DNA polimerasi. La DNA polimerasi, per iniziare il processo, ha anche bisogno di un innesco, detto primer, a cui attaccare il primo nucleotide per procedere con la polimerizzazione. Il primer è costituito da una corta sequenza di RNA (sintetizzata ad opera di una RNA polimerasi, chiamata primasi). Poichè la polimerizzazione avviene solo in direzione 5‘→ 3‘, la sintesi dei nuovi filamenti può avvenire senza interruzione solo nella direzione 5‘→ 3‘ (filamento guida), mentre nella direzione opposta 3‘→ 5‘(filamento in ritardo) avviene attraverso la sintesi di corti frammenti di 100-2000 nucleotidi, detti frammenti di Okazaki, assemblati da parte della DNA ligasi. L’avanzamento bidirezionale della replicazione genera due forcelle di replicazione, visualizzabili

come bolle di replicazione (Fig.5). I cromosomi eucariotici si duplicano rapidamente poichè la sintesi inizia a partire da molte origini di replicazione presenti nel genoma (è stato dimostrato che se in un cromosoma eucariotico fosse presente una sola origine di replicazione, il genoma impiegherebbe 35 giorni per completare la sua replicazione!). Negli eucarioti è detto replicone o unità di replicazione la porzione di DNA che va dall‘origine della replicazione ai due punti di terminazione della stessa, ovvero dove due forcelle di replicazione adiacenti si incontrano.

Fig. 4. Il ciclo cellulare: le quattro fasi principali in cui è suddiviso, G1, S, G2 e mitosi.

Fig.5. Fotografia al microscopio elettronico della formazione di una bolla di replicazione. Le frecce indicano le forcelle replicative.

5

La replicazione è semiconservativa: ogni emielica (singolo filamento) della molecola madre serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, per cui ogni doppia elica figlia sarà costituita da un filamento vecchio e da un filamento nuovo (Fig.6). Le molecole risultanti sono copie esatte dell’originale, per cui da una doppia elica madre derivano due doppie eliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola madre.

Fig 6. Rappresentazione grafica del DNA in replicazione, con la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti “stampo” della molecola originaria.

6

Fig. 7. Stadi del ripiegamento della cromatina che daranno origine ad un cromosoma eucariotico in metafase completamente condensato. a) Doppia elica di DNA

b) Cromatina a” perle”

c) Fibra di 30 nm

d) Domini ad anse

e) Spirali condensate

f) Cromosoma metafasico

a)

b)

c)

d)

e)

f)

3. COM’È IMPACCHETTATO IL DNA?

L’intero DNA genomico di una cellula eucariotica è contenuto nel nucleo. Dal momento che la lunghezza totale del genoma umano, se potessimo distendere e allineare tutti i cromosomi, sarebbe di circa 2 metri e il diametro medio del nucleo è di soli 5-10 µm, il DNA deve accorciarsi e compattarsi di almeno 10 000 volte, attraverso diversi livelli di avvolgimento (Fig.7). Il livello più semplice di impacchettamento è la fibra a “nucleosomi”, formata da una successione regolare di subunità costituite dalla doppia elica del DNA avvolta attorno a un nucleo di 8 proteine basiche, gli istoni, che si assemblano a formare un ottamero (il DNA è acido per la presenza dei gruppi fosfato). Questa struttura è chiamata anche “collana di perle” dove le perle sono i nucleosomi e il filo della collana sono i tratti di DNA fra un nucleosoma e l’altro (chiamati anche DNA linker). Questa struttura viene resa ancora più compatta da un ulteriore avvolgimento della collana di perle su se stessa a formare una struttura a solenoide, chiamata fibra di 30 nm. Questa fibra, per aumentare ulteriormente l’impacchettamento, è ancorata su una struttura proteica, chiamata matrice,

con formazione di vere e proprie anse. Il maggior grado di condensazione del DNA si ottiene durante la mitosi, quando infatti i singoli cromosomi risultano visibili anche al microscopio ottico come formazioni allungate.

7

4. CARATTERISTICHE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI DEGLI EUCARIOTI

La struttura del cromosoma eucariotico Il cromosoma degli eucarioti è costituito da cromatina, un complesso di DNA, proteine cromosomiche e RNA, che può presentarsi sotto forma di:

• Eucromatina che si colora debolmente perché despiralizzata ed è geneticamente attiva • Eterocromatina che si colora intensamente perché condensata ed è geneticamente inattiva;

replica nella fase S dopo l’eucromatina e può, a sua volta, essere suddivisa in costitutiva, sempre spiralizzata, e facoltativa, potenzialmente despiralizzabile.

Le proteine cromosomiche possono essere suddivise in: • Proteine istoniche: hanno una carica positiva che facilita il loro legame col DNA. Ci sono 5

tipi di istoni: H1 che stabilizza l’avvolgimento a solenoide, e H2A, H2B, H3, H4 costituenti degli ottameri. Le sequenze aminoacidiche indicano un elevato grado di conservazione tra specie filogeneticamente distanti.

• Proteine non istoniche: alcune hanno un ruolo strutturale, alcune sono enzimi e altre sono proteine implicate nella replicazione e trascrizione.

Nei procarioti tutto il genoma è presente come DNA a sequenze uniche. Il genoma umano può essere descritto come costituito da :

-64% di DNA a sequenze uniche -25% di DNA a sequenze moderatamente ripetute -10% di DNA a sequenze altamente ripetute

Le sequenze altamente ripetute tendono ad essere localizzate nelle regioni eterocromatiche, ad esempio attorno ai centromeri e alle estremità dei cromosomi. Le sequenze uniche e moderatamente ripetute tendono ad essere sparse. La morfologia dei cromosomi I cromatidi Nel cromosoma mitotico corrispondono ai due filamenti di DNA duplicati, in attesa di essere separati durante la divisione cellulare.

Fig. 8. Morfologia di un cromosoma metafasico. 1. centromero o costrizione primaria; 2. telomeri. Nello schema a destra è evidenziato in nero (3) uno dei due cromatidi I centromeri Nei cromosomi mitotici il centromero corrisponde al punto di collegamento dei due cromatidi. Alla presenza del centromero è associato il comportamento dei cromosomi alla mitosi ed alla meiosi. Se i centromeri non funzionano correttamente, può avvenire una non-disgiunzione dei cromosomi omologhi alla meiosi e dei cromatidi alla mitosi. La regione del centromero si associa al cinetocoro al quale si attaccano le fibre del fuso durante la divisione.

8

In base alla posizione del centromero i cromosomi vengono classificati in (Fig. 9):

- metacentrici, quando il centromero divide il cromosoma in due bracci circa di dimensioni uguale;

- submetacentrici, quando il centromero divide il cromosoma in due bracci di dimensioni diverse;

- acrocentrici, quando il centromero è subterminale. I telomeri Alle estremità dei cromosomi si trovano delle strutture speciali, i telomeri, costituiti da una sequenza di nucleotidi ripetuta migliaia di volte; in tutti i mammiferi questa sequenza è TTAGGG. I telomeri hanno una funzione di protezione dell’estremità e svolgono un ruolo fondamentale nell’assicurare una corretta replicazione delle doppie eliche lineari dei cromosomi eucariotici

5. ANALISI CITOGENETICA 5.1 Cromosomi umani Una differenza fondamentale tra procarioti ed eucarioti risiede nel fatto che i procarioti hanno un singolo cromosoma, mentre la maggior parte degli eucarioti ha un numero diploide di cromosomi in quasi tutte le cellule somatiche. Un insieme completo di tutti i cromosomi metafasici di una cellula è definito cariotipo; il cariotipo è specie-specifico. In particolare, il cariotipo umano normale diploide è costituito da 46 cromosomi (22 paia di autosomi e un paio di cromosomi del sesso): le femmine sono 46, XX e i maschi 46, XY (Fig. 10). Pertanto, per effettuare un’analisi citogenetica è quindi necessario allestire un preparato cromosomico per identificare e classificare i diversi cromosomi. Un preparato si può allestire a partire da qualsiasi cellula che si divida, sia spontaneamente, sia in seguito a stimolazione in coltura con sostanze che inducono la divisione. Le analisi cromosomiche possono essere effettuate a partire da cellule sia di un feto sia di un individuo dopo la nascita. Generalmente prima della nascita, il cariotipo si effettua su amniociti ottenuti mediante amniocentesi o su villi coriali ottenuti mediante villocentesi. Dopo la nascita, i preparati cromosomici per le indagini citogenetiche si allestiscono da linfociti di sangue periferico.

Fig. 9. Diversi tipi morfologici di cromosoma A Metacentrico B Submetacentrico C Acrocentrico. p= braccio corto; q= braccio lungo c.s.= costrizione secondaria, s.= satellite, c.=centromero

9

5.2 Le mappe cromosomiche e i bandeggi L’analisi del cariotipo o mappa cromosomica viene effettuata attraverso la ricostruzione del cariogramma, ottenuto disponendo i cromosomi metafasici appaiati secondo un sistema di classificazione internazionale. I cromosomi sono suddivisi in gruppi omogenei e disposti in ordine decrescente secondo la lunghezza e l’indice centromerico (rapporto fra la lunghezza del braccio corto e la lunghezza totale del cromosoma) (Fig. 10 b). Un’identificazione inequivocabile di ogni cromosoma del cariotipo deriva da tecniche di colorazione dei cromosomi denominate bandeggi. Intorno al 1970 sono state introdotte infattimetodiche di colorazione dei cromosomi che utilizzano sostanze in grado di colorare specifiche regioni cromosomiche (bande) in modo più evidente di altre. Il bandeggio che ne deriva è specifico e riproducibile per ogni coppia di cromosomi omologhi e permette di ricostruire il cariotipo in modo inequivocabile, evidenziando eventuali anomalie cromosomiche sia di numero sia di struttura. Esistono diversi tipi di bandeggi di cui i principali sono:

• Bande Q, ottenute mediante l’impiego di un colorante fluorescente, la Quinacrina: le bande più luminose intensamente fluorescenti corrispondono alle zone ricche in Adenina e Timina (Fig. 11 a)

Fig.10. a) Struttura di un cromosoma metafasico. b) Esempio di cariotipo umano maschile

b)

I cromosomi umani

Centromero

Telomero Cromatidi

10

• Bande G, ottenute col colorante Giemsa: le bande più scure corrispondono alle zone ricche in Adenina e Timina, relativamente povere di geni, e risultano quindi corrispondenti e sovrapponibili alle bande Q (Fig. 11 b e Fig. 11 c). • Bande R, ottenute mediante denaturazione al calore e opportuna colorazione: sono l’inverso delle bande Q e G e corrispondono a zone ricche in Citosina e Guanina.

a) bande Q

b) bande G

Fig. 11. Differenti esempi di tecniche di bandeggio di cromosomi umani a) Le bande Q si ottengono con la tecnica di bandeggio con

quinacrina

b) Le bande G si ottengono con la tecnica di bandeggio Giemsa

c) Schema riassuntivo delle bande G

11

c) Bande G

12

5.3 Applicazioni dell’analisi citogenetica

• Diagnosi prenatale di sindromi associate ad anomalie cromosomiche • Diagnosi postnatale di anomalie cromosomiche in individui portatori di sindromi o di

malattie genetiche • Diagnosi postnatale di anomalie cromosomiche bilanciate in individui sani che mostrano

poliabortività • Citogenetica delle cellule tumorali: identificazione dei cromosomi “marcatori” e mappaggio

di regioni subcromosomiche che contengono geni associati allo sviluppo o alla progressione tumorale.

6.OSSERVAZIONE E RICOSTRUZIONE DEL CARIOTIPO UMANO IN LABORATORIO 6.1 Allestimento di preparati cromosomici a partire da una linea di cellule linfoblastoidi (cellule a moltiplicazione continua ottenuta a partire da linfociti) Preparazione della sospensione cromosomica NB:questa procedura non verrà effettuata direttamente dagli studenti • Allestimento della coltura da una linea di cellule linfoblastoidi

Le cellule vengono messe in coltura in una fiasca a 37°C e quando raggiungono una fase di crescita esponenziale viene aggiunta per 1 ora la colchicina, una sostanza che inibisce la formazione del fuso mitotico e quindi determina il blocco delle mitosi in metafase.

• Recupero metafasi Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione (e scarto del surnatante) e trattate con soluzione ipotonica per determinare il rigonfiamento delle cellule e la rottura della membrana cellulare.

• Fissazione metafasi Segue un trattamento con fissativo che stabilizza la struttura del cromosoma, altrimenti fragile. Il fissativo permette infatti di conservare il materiale organico, ritardando l’azione degli agenti ossidanti. Il sedimento cromosomico è quindi mantenuto in una soluzione di fissativo (costituita da metanolo: acido acetico=3:1). Il citoplasma, in cui sono immersi i cromosomi, viene disidratato dall’alcool e ridotto dall’acido acetico; i cromosomi mantengono la medesima posizione che presentavano prima del fissaggio nel citoplasma. Il passaggio in fissativo viene ripetuto almeno un’altra volta, al termine di questi passaggi la sospensione cromosomica può essere conservata in provetta a – 20°C anche per qualche anno, oppure può venire strisciata su vetrino.

Attività effettuate direttamente dagli studenti

• Striscio su vetrino La sospensione cromosomica viene strisciata su un vetrino sgrassato e lavato, effettuando i seguenti passaggi: - inserire un vetrino in una vaschetta di acqua distillata

13

- riempire il capillare della pipetta Pasteur con la sospensione cromosomica - togliere il vetrino dalla vaschetta e lasciare cadere gocce di sospensione su metà della

superficie del vetrino - asciugare con carta assorbente il retro del vetrino - lasciare asciugare all’aria per 5’-10’ e quindi procedere alla colorazione

• Colorazione con colorante Giemsa E’ una metodica che determina la colorazione omogenea di tutti i cromosomi, evidenziando la loro dimensione e morfologia rispetto alla posizione del centromero. La colorazione si effettua in due passaggi: - immergere i vetrini per 25’ in una soluzione di Giemsa al 10% in tampone Soerensen [Tampone Soerensen (pH = 6.88) 100 ml = 50ml sol.A+ 50ml sol.B

Sol.A 1/15M KH2PO4 (9.08g/l) Sol.B 1/15M Na2HPO4 H2O (11.88 g/l)]

- sciacquare i vetrini con acqua distillata e lasciare asciugare all’aria. - osservare i vetrini direttamente al microscopio ottico. I vetrini possono essere montati con

vetrino copriogetto in modo permanente utilizzando apposite resine. NB: Tutti i procedimenti per la colorazione vanno effettuati coi guanti.

6.2. Ricostruzione del cariotipo umano La ricostruzione del cariotipo a partire dai preparati allestiti dagli studenti in laboratorio risulta decisamente laboriosa e complessa. In alternativa, è possibile effettuare delle attività di simulazione al computer. Viene proposta la “Karyotyping activity” allestita dalla University of Arizona. Il riferimento è: www.biology.arizona.edu/human_bio/activities/karyotyping/karyotyping.html Si tratta di una simulazione della ricostruzione di cariotipi umani a partire da cromosomi con bandeggio G, fatta utilizzando immagini digitali. Vengono presentati i cariotipi parzialmente ricostruiti di tre pazienti portatori di anomalie cromosomiche. Lo studente è invitato dapprima a completare il cariotipo appaiando ai rispettivi omologhi una serie di cromosomi non appaiati presentati in successione. E' chiamato poi ad osservare e interpretare i risultati così ottenuti, formulando alla fine una diagnosi, come se stesse effettivamente lavorando in un centro di analisi. Questo tipo di attività consente essenzialmente di identificare in individui affetti da particolari patologie di anomalie del numero dei cromosomi.

14

7. IBRIDAZIONE MOLECOLARE E MAPPATURA DEI GENI

La possibilità di visualizzare la posizione dei geni o di altre regioni non codificanti del genoma su un cromosoma (mappatura) consente anche l’individuazione di anomalie submicroscopiche di struttura dei cromosomi, in quanto è possibile visualizzare lo spostamento (traslocazioni), la perdita (delezioni), o l’aggiunta (duplicazioni) di tratti cromosomici anche molto piccoli, non rilevabili con la citogenetica convenzionale. 7.1. Ibridazione molecolare La procedura su cui si basa la mappatura di un gene è l’ibridazione molecolare. Quando una soluzione acquosa di DNA è riscaldata a 100 °C o esposta ad un pH molto alto, i legami idrogeno tra le coppie di basi complementari che normalmente tengono insieme i due filamenti della doppia elica vengono rotti e la doppia elica si dissocia in due filamenti singoli. Questo processo viene chiamato denaturazione del DNA. I singoli filamenti di DNA in particolari condizioni (abbassamento della temperatura a 65 °C, variazione di pH ) possono riassociarsi a riformare doppie eliche secondo un processo chiamato rinaturazione del DNA. Reazioni simili possono avvenire fra due catene di DNA a singolo filamento di diversa origine, purché abbiano sequenze nucleotidiche complementari, e il risultato è definito ibrido molecolare. Una sonda molecolare o probe è un frammento noto di DNA a singolo filamento usato in un esperimento di ibridazione molecolare per identificare molecole specifiche di DNA nelle quali è presente una sequenza complementare alla sonda stessa. Una sonda molecolare viene marcata con isotopi radioattivi o sostanze fluorescenti per consentirne la rivelazione. Le reazioni di ibridazione con sonde di DNA possono essere effettuate in provetta (in vitro), o con campioni di DNA posizionati su filtri di nylon o di nitrocellulosa (Southern Blotting) per rivelare l’eventuale presenza in un particolare campione di DNA di sequenze complementari alla sonda. Questa tecnica, come la maggior parte delle tecniche di biologia molecolare prevede l’utilizzo di acidi nucleici purificati, il che implica la distruzione delle strutture cellulari e cromosomiche del campione e l’impossibilità di localizzare direttamente sui cromosomi geni o qualsiasi altra sequenza di DNA rappresentata dalla sonda molecolare. Per superare questo problema sono state sviluppate tecniche di ibridazione molecolare in cui sonde marcate di acidi nucleici sono usate per localizzare sequenze specifiche di acidi nucleici in una determinata struttura biologica, cioè in situ, attraverso un procedimento chiamato ibridazione in situ. L’ibridazione viene fatta avvenire non in provetta, ma mettendo a contatto la sonda con un

15

substrato solido su cui, nel caso in cui si voglia localizzare un gene su un cromosoma, è stato allestito un preparato cromosomico. L'ibridazione in situ permette quindi di visualizzare l'acido nucleico d'interesse nella sua sede naturale, preservando perfettamente la struttura tessutale, cellulare o cromosomica del preparato. 7.2 Ibridazione in situ fluorescente L'ibridazione in situ fluorescente (FISH : Fluorescence In Situ Hybridization) è una tecnica di ibridazione in situ che permette di visualizzare a livello cromosomico la localizzazione di un gene o di una qualsiasi sequenza genomica d'interesse, usando sonde di DNA marcate con composti fluorescenti. Il vantaggio, rispetto alla marcatura con isotopi radioattivi, è rappresentato dall’eliminazione del radioattivo, dall’ottenimento di un “segnale” più nitido e dalla possibilità di usare fluorocromi a diversa emissione cromatica, consentendo di usare visualizzare contemporaneamente e più sonde. Attraverso questa tecnica è possibile pertanto localizzare su cromosomi metafasici sequenze genomiche di limitata estensione e di identificare una loro eventuale localizzazione alterata (traslocazione e inversione) o una loro assenza (delezione), o una loro aggiunta (duplicazione). Tale metodica, applicata ai cromosomi metafasici, ha incrementato il livello di risoluzione della citogenetica convenzionale che permette di identificare le anomalie cromosomiche superiori a 4 Mb (1 Mb = 106 paia di basi). La FISH invece consente di visualizzare anomalie che coinvolgono poche migliaia di paia di basi. Inoltre, la possibilità di utilizzare per questo tipo di studi anche nuclei interfasici permette di analizzare anche tipi cellulari che difficilmente vanno incontro a divisione cellulare, oppure inclusi in paraffina e come tali non più coltivabili in vitro. La procedura è abbastanza semplice e prevede: 1. La scelta di una sonda, ossia di una sequenza conosciuta di DNA 2. La marcatura della sonda con composti fluorescenti che vengono legati ad essa 3. L’allestimento dei preparati da studiare 4. La denaturazione del DNA, sia dei preparati sia della sonda, per consentire successivamente la

formazione di legami idrogeno tra il filamento del DNA cromosomico e i filamento del DNA della sonda

5. L’ibridazione: appaiamento del DNA dei preparati con il DNA sonda, introdotto in eccesso 6. Il lavaggio dalla sonda in eccesso non appaiata 7. L’osservazione dei preparati con microscopio a fluorescenza

16

7.3. Classificazione delle sonde

Fig. 12 Sonde cromosoma-specifiche La sonda cromosoma-specifica è costituita da un insieme di sonde di DNA ognuna delle quali è omologa all’intero cromosoma considerato. L’insieme delle sonde copre l’intero cromosoma. L’ibridazione con una sonda cromosoma-specifica marcata con un fluorocromo permetterà di visualizzare segnali fluorescenti su una determinata coppia di cromosomi omologhi lungo tutto il cromosoma. Sonde centromero-specifiche La sonda centromero-specifica è costituita da un tipo di sequenze ripetute, dette alfoidi, presenti nei centromeri. Sono state isolate sequenze alfoidi specifiche per il centromero di ogni cromosoma. L’ibridazione con una sonda centromero-specifica marcata con un fluorocromo permetterà di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei centromeri di una coppia di cromosomi omologhi. Sonde telomero-specifiche La sonda telomero-specifica è costituita da sequenze localizzate nella parte terminale dei cromosomi. Sono state isolate vicino alla parte terminale della molecola di DNA, che ha una sequenza comune a tutti i cromosomi, sequenze specifiche per il telomero di ogni cromosoma. E’ più corretto definire le sequenze telomeriche specifiche per uno dei due bracci di un determinato cromosoma (braccio corto “p”, braccio lungo “q”) “sequenze sub telomeriche”. L’ibridazione con una sonda telomerica specifica per uno dei bracci di un determinato cromosoma, marcata con un fluorocromo, permetterà di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei telomeri di uno dei due bracci di una coppia di cromosomi omologhi. Se la sonda telomero-specifica è costituita dalle sequenze che costituiscono la parte terminale della molecola di DNA, comuni a tutti i cromosomi, la sonda viene detta specifica per i “telomeri comuni”. In questo caso in seguito all’ibridazione si visualizzeranno segnali fluorescenti sui telomeri di tutti i cromosomi. Sonde locus-specifiche La sonda locus-specifica è costituita dalla sequenza di una regione delimitata lungo uno specifico cromosoma. L’ibridazione con una sonda locus-specifica marcata con un fluorocromo permetterà di visualizzare segnali fluorescenti a livello di una regione sul braccio corto o sul braccio lungo di una coppia di cromosomi omologhi.

17

Fig. 13. Ibridazione in situ con diverse tipologie di sonde a) Ibridazione in situ con una sonda specifica per il cromosoma 8: i segnali fluorescenti sono presenti lungo tutta l’estensione dei due cromosomi omologhi. b) Ibridazione in situ con una sonda specifica per le sequenze centromeriche del cromosoma X: i segnali fluorescenti identificano due cromosomi X. c) Ibridazione in situ con una sonda specifica per i telomeri del braccio lungo del cromosoma 4: i segnali fluorescenti sono presenti sui telomeri del braccio lungo dei due cromosomi 4 omologhi. d) Ibridazione in situ con una sonda specifica per una regione del braccio lungo del cromosoma 17: i segnali fluorescenti sono presenti in una regione intracromosomica del braccio lungo di entrambi gli omologhi 17.

18

Fig. 14. Livello di risoluzione della FISH

FISH su cromosomi metafasici Il livello di risoluzione della FISH viene definito in base alla distanza minima alla quale si vedono due segnali distinti prodotti dall’ibridazione di due sonde, questo dipende dal grado di allungamento e/o di despiralizzazione della cromatina. Il cromosoma metafasico rappresenta lo stadio in cui la cromatina raggiunge il massimo grado di compattamento. Il livello di risoluzione della FISH su cromosomi metafasici (vedi allestimento preparati cromosomici convenzionalli.) va da 2 a 3 megabasi (Mb).

FISH su cromosomi metafasici allungati meccanicamente I cromosomi metafasici possono essere allungati partendo da preparazioni di cromosomi metafasici convenzionali sottoposti a stiramento meccanico. Il livello di risoluzione della FISH su cromosomi metafasici stirati è al massimo di 200 kilobasi (Kb).

FISH su fibre di DNA Le fibre di DNA possono essere ottenute incubando nuclei interfasici strisciati su un vetrino portaoggetto in una soluzione di lisi che rompe la membrana nucleare. Il vetrino viene quindi estratto verticalmente dalla soluzione di lisi. Questo movimento permette alle fibre di DNA, fuori uscite dal nucleo, di srotolarsi e di disporsi longitudinalmente lungo il vetrino. Il livello di risoluzione della FISH su fibre di DNA può arrivare a 1 Kb.

Fig. 15. FISH con due sonde marcate con due fluorocromi diversi su cromosomi a diverso grado di allungamento a) FISH a doppio colore su cromosomi metafasici con due sonde localizzate a 2,5 Mb di distanza: si può notare la quasi totale sovrapposizione dei segnali fluorescenti. b) FISH a doppio colore su cromosomi metafasici stirati meccanicamente con le stesse sonde utilizzate in a: l’allungamento del cromosoma permette di visualizzare i due segnali fluorescenti rosso e verde separati da un segmento cromatinico. c) FISH a doppio colore su fibre di DNA con le stesse sonde utilizzate in a e in b: l’ulteriore despiralizzazione della cromatina è evidenziato dall’aumento della distanza tra i segnali fluorescenti rosso e verde.

19

8. MODELLO DIDATTICO DELLA IBRIDAZIONE IN SITU Per rendere maggiormente comprensibile questa tecnica si propone l’utilizzo di un modello che permetterà agli studenti di acquisirne i principi di base, apprezzandone le diverse applicazioni. Simulazione ibridazione in situ (Brevetto n°: MI2005A000710, Milano 20/05/05) Il modello è costituito da una tavola di legno, che simula il vetrino porta oggetto su cui vengono strisciati i cromosomi. Sopra il piano di legno vengono collocate 3 coppie di cromosomi. Ogni cromosoma è suddiviso in regioni contraddistinte da numeri sulla superficie superiore, mentre sulla superficie inferiore, appoggiata al piano di legno, esiste una guida entro cui far scorrere una o più calamite. Un ulteriore componente dello strumento è costituito da sfere di ferro che rappresentano le molecole della sonda da utilizzare per l’ibridazione. La specificità di appaiamento mediante legame idrogeno tra il DNA della sonda e quello del gene localizzato sul cromosoma viene simulato dal legame tra il metallo (sonda) e la calamita (DNA complementare cromosomico) dovuto alla forza magnetica. Localizzazione di un gene su un cromosoma Uno studente posiziona 4 calamite sotto i cromatidi fratelli di cromosomi omologhi Un secondo studente mette le biglie magnetiche che rappresentano diverse molecole della sonda A, a localizzazione ignota, in contatto con il piano su cui sono stati posizionati i cromosomi per stabilire la localizzazione della sonda stessa e della sequenza di DNA che essa rappresenta. Si simula l’incubazione con una quantità di sonda in eccesso, inclinando dolcemente più volte il piano in modo tale che tutti i cromosomi possano venire coperti dalla sonda Si elimina la sonda che è stata messa in eccesso per favorire l’ibridazione aprendo lo sportello ad un lato del piano, inclinando il piano stesso dolcemente: le sfere non trattenute dalla forza magnetica usciranno similmente le molecole presenti sui cromosomi e non legate mediante legame idrogeno potranno essere selettivamente allontanate. Se non viene effettuato questo passaggio, che simula il lavaggio nell’ibridazione in situ, la sonda depositata casualmente sui cromosomi non permette di individuare il segnale specifico. Si visualizza la localizzazione della sonda A sui cromatidi dei cromosomi omologhi (ibridazione specifica) localizzandola poi più precisamente nell’ambito di regioni cromosomiche specifiche Identificazione di anomalie cromosomiche sub-microscopiche Traslocazione: Uno studente posiziona due calamite sotto i cromatidi fratelli di un cromosoma e due sotto i cromatidi fratelli di un cromosoma non omologo. Un secondo studente mediante l’ibridazione in situ (vedi sopra dal punto 2) utilizzando una sonda (sfere di metallo) a localizzazione nota, da dichiarare, osserverà che la sequenza specifica è traslocata su un altro cromosoma, diverso dall’omologo atteso Delezione: Uno studente posiziona due calamite sotto i cromatidi fratelli di un cromosoma senza posizionare la calamita nella stessa regione dei cromatidi del cromosoma omologo. Un secondo studente mediante l’ibridazione in situ (vedi sopra dal punto 2) utilizzando una sonda a localizzazione nota (sfere di metallo), da dichiarare, osserverà che la sequenza specifica è deleta su uno dei due cromosomi omologhi

20

Duplicazione: Uno studente posiziona due calamite sotto i cromatidi fratelli di un cromosoma e 4 calamite sotto i cromatidi fratelli del cromosoma omologo. Un secondo studente mediante l’ibridazione in situ (vedi sopra dal punto 2) utilizzando una sonda (sfere di metallo) a localizzazione nota, da dichiarare, osserverà che la sequenza specifica è duplicata su uno dei due cromosomi omologhi. Studio della cinetica di ibridazione Lo studente posiziona 4 calamite sotto i cromatidi fratelli di 2 cromosomi omologhi. Lo studente mette a contatto con il piano numerose sfere di metallo e, inclinando più volte dolcemente il piano, verifica quanto tempo occorre dall’inizio dell’oscillazione perchè le sfere si leghino ai due cromatidi fratelli di entrambi i cromosomi omologhi Lo studente toglie le sfere lasciandone solo quattro, cioè in rapporto molare 1:1 sufficiente per saturare le possibilità di legame e, inclinando più volte dolcemente il piano, verifica quanto tempo occorre dall’inizio dell’oscillazione perchè le sfere si leghino ai due cromatidi fratelli di entrambi i cromosomi omologhi. Potrà facilmente essere dedotto che la cinetica di ibridazione dipende dalla quantità di sonda posta a contatto con i cromosomi poichè, in caso di eccesso di sonda, l’incontro tra molecole a sequenza specifica, è statisticamente favorito.

9. DOMANDE DI AUTOVALUTAZIONE 1) Nella molecola di DNA: a) lo zucchero è il ribosio b) i nucleotidi si differenziano tra loro per il gruppo fosfato e il pentoso c) vi sono legami ionici tra le basi azotate complementari d) ciò che varia è la sequenza delle basi azotate e) vi possono essere differenti tipi di gruppi fosfato 2) Al termine del processo di duplicazione del DNA: a) ogni molecola di DNA è composta da due nuovi filamenti b) ogni molecola di DNA è composta da un filamento originario e da uno nuovo c) una molecola di DNA è nuova , l’altra è originaria d) nei filamenti si alternano parti originarie a parti nuove e) sono vere tutte le precedenti, in quanto il processo è casuale 3) Nel processo di duplicazione del DNA, quale enzima catalizza il legame tra i nucleotidi per formare un nuovo filamento? a) DNA polimerasi b) DNA elicasi c) RNA polimerasi d) DNA ligasi e) DNA girasi 4) La citogenetica viene applicata per: la selezione delle piante la difesa dell’ambiente le diagnosi pre e postnatale lo studio dei tessuti la trasmissione ereditaria

21

5) Il cariotipo e’: il numero dei cromosomi di una cellula il corredo aploide l’insieme delle forme dei cromosomi l’allineamento dei cromosomi alla metafase l’insieme dei cromosomi di una cellula in metafase 6) La sindrome di Down e’: la presenza di un cromosoma Y in più una monosomia del cromosoma X una trisomia del cromosoma 21 una malattia a trasmissione sessuale una malattia infettiva 7) Il corredo genetico dell’uomo è: 2n=16 2n=64 2n=46 2n=48 2n=23 8) Le fasi della mitosi sono: a) metafase,anafase,telofase,profase b) telofase,profase,anafase,metafase c) profase,metafase,anafase,telofase d) interfase,metafase,anafase, telofase e) anafase.profase,telofase,metafaase 9) I cromosomi umani contengono: a) DNA e proteine b) DNA e aminoacidi c) DNA e protammine d) DNA e vitamine e) DNA 10) I geni coincidono con: a) un cromosoma b) un cromosoma di una coppia

c) un locus su una coppia di omologhi d) un locus su un cromosoma di una coppia di omologhi e) un allele

11) Il numero di autosomi presenti nelle cellule somatiche della specie umana è:

a) 44 b) 22

c) 23 d) 46 e) 21

22

12) I cromosomi metafasici vengono osservati con: microscopio elettronico a scansione microscopio ottico microscopio elettronico a trasmissione lente d’ingrandimento occhio nudo 13) Per allestire i preparati cromosomici al fine di osservare i cromosomi di una cellula, è necessario che le cellule: a) provengano da tessuti indifferenziati b) siano capaci di moltiplicarsi c) siano in fase di quiescenza d) provengano solo da individui giovani e) derivino solo da individui sani 14) L’analisi del cariotipo viene effettuata osservando i cromosomi in: a) interfase b) fase G1 del ciclo cellulare c) metafase d) telofase e) fase S del ciclo cellulare

15) Cariogramma significa: a) visione del cariotipo b) taglio del cariotipo su carta c) esame del cariotipo d) ricostruzione del cariotipo e) colorazione del cariotipo

16) Le due parti in cui è diviso longitudinalmente ogni cromosoma metafasico sono dette: a) centromeri b) centrioli c) telomeri d) bracci e) cromatidi 17) Completa la tabella mettendo in corrispondenza i termini (lettere) con le rispettive definizioni (numeri). A) cromosomi metacentrici 1) si hanno quando il centromero divide il cromosoma in due bracci di dimensioni diverse B) cromosomi submetacentrici 2) si hanno quando il centromero è subterminale C) cromosomi acrocentrici 3) si hanno quando il centromero divide il cromosoma in due bracci di dimensioni circa uguali A B C

23

18) L’analisi del cariotipo consente di evidenziare: a) le anomalie di numero o di struttura dei cromosomi b) la perdita di un gene c) le mutazioni geniche d) l’acquisto di un gene e) il crossig-over 19) Cosa si intende per bandeggio G a livello dei cromosomi ? a) una colorazione specifica con verde janus b) una colorazione a macchie con eosina c) una colorazione a bande Gram-positivo d) un trattamento con tripsina e colorazione con Giemsa e) un trattamento specifico che rompe i cromosomi in bande chiare e scure

20) La disidratazione del citoplasma per il recupero dei cromosomi viene effettuata in: a) alcool denaturato b) solvente idrofobo c) resina d) colorante ematossilinico e) enzima Rna polimerasi

21) La rottura della membrane cellulari avviene con trattamento di: a) soluzioni ipertonica b) soluzione ipotonica c) soluzione isotonica d) alcool e) soluzione di NaCl

22) La soluzione di fissativo ha la funzione di: ( piu’ di una risposta esatta) a) bloccare i cromosomi in metafase b) rendere stabile la struttura dei cromosomi c) abbassare la temperatura della cellula d) causare la rottura della membrana cellulare e) ritardare l’azione degli agenti ossidanti 23) Completa il brano, scegliendo tra i seguenti termini: gruppi fosforici, 100°C, 65°C, legami idrogeno, rinaturato, basi azotate, sonde, ibrida, legami ionici, doppia elica, denaturato, marcata, appaiano, separano, spaiate, complementari. La tecnica dell’ibridazione molecolare si basa sulla proprietà che hanno le ....................... degli acidi nucleici di appaiarsi in ben precise coppie. Infatti, se si scaldano a ................... delle molecole di DNA in soluzione, i ........................ che tengono uniti i due filamenti si spezzano e i filamenti si separano. In questo modo, il DNA risulta ...................... . Se poi la soluzione viene raffreddata, i ........................ si riformano ricostituendo la ................... . Quando vengono mescolate delle molecole di DNA provenienti da fonti diverse e poi vengono scaldate, i filamenti si ...................... e subiscono delle collisioni casuali. Se, mentre la soluzione si raffredda, si incontrano due filamenti con sequenze .................., essi formeranno una doppia elica ................. .

24

24) La durata del tempo di ibridazione molecolare dipende da: a) temperatura b) pH c) luce d) quantita’ della sonda e) quantita’ di Dna da ibridare 25) Scrivi il significato dell’acronimo FISH. ..................................................................................................................................... 26) Scegli il completamento che ritieni esatto:

Una sonda molecolare a) è in grado di individuare un determinato gene dotato di una sequenza nucleotidica complementare b) può copiare certi geni in possesso di basi azotate identiche a quelle della sonda stessa c) viene inserita nei cromosomi batterici per portare al loro interno determinate sequenze geniche d) si lega al trascritto di RNA e mette in evidenza gli esoni e) induce le cellule batteriche a moltiplicarsi

27) Completa la tabella mettendo in corrispondenza i termini (lettere) con le rispettive definizioni (numeri). A) delezione 1) il frammento di un cromosoma si attacca al cromosoma omologo B) duplicazione 2) il frammento di un cromosoma si attacca a un cromosoma non omologo C) traslocazione 3) il frammento di un cromosoma si riattacca al cromosoma originario, ma in posizione rovesciata D) inversione 4) il frammento di un cromosoma viene perso A

B C D

10. GLOSSARIO Bandeggio

Procedura di trattamento e colorazione dei cromosomi che induce una differenziazione trasversale (alternanza di segmenti intensamente colorati e segmenti più chiari). Permette il riconoscimento senza ambiguità di ogni paio cromosomico.

Basi azotate Molecole contenenti azoto, costituenti i nucleotidi del DNA insieme allo zucchero deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificano in basi puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C).

Cariotipo Assetto cromosomico di una specie.

25

Centrifugazione Metodo di separazione di sostanze o di componenti cellulari a diversa densità

Centromero Regione di congiunzione tra i due cromatidi che compongono uno stesso cromosoma

Ciclo cellulare Sequenza ciclica e regolare degli eventi di crescita e divisione di una cellula eucariotica; è costituito dalle fasi G1, S, G2 , mitosi, citodieresi.

Citogenetica Branca della genetica che studia i meccanismi dell'eredità a livello cromosomico

Colchicina Sostanza che determina il blocco della mitosi in metafase, inibendo la formazione del fuso mitotico

Crescita esponenziale Modalità di crescita delle cellule per cui ad ogni generazione raddoppia il numero delle cellule della generazione precedente

Cromatidio Subunità longitudinale di un cromosoma metafasico, costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del centromero.

Cromatina Materiale di cui sono costituiti i cromosomi degli eucarioti. Risulta dall’associazione tra DNA e proteine basiche.

Cromosoma Struttura generalmente allungata, costituita da cromatina, visibile al microscopio ottico durante la divisione cellulare e contenente i geni in successione lineare.

Cromosomi omologhi Coppie di cromosomi di forma generalmente simile, che contengono informazioni per gli stessi caratteri. Portano gli stessi geni, non necessariamente gli stessi alleli. Si appaiano alla meiosi.

Delezione Mutazione del DNA che comporta la perdita di uno o più nucleotidi Denaturazione DNA Separazione dei due filamenti della doppia elica, per rottura dei legami a

idrogeno tra le basi azotate, con conseguente perdita della struttura tridimensionale

DNA Abbreviazione di acido deossiribonucleico, macromolecola che costituisce il materiale genetico di tutti gli organismi (ad eccezione di alcuni virus). E’ costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a doppia elica.

DNA elicasi Proteina che facilita l'apertura della doppia elica del DNA durante la sua replicazione.

DNA polimerasi enzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando un filamento di DNA come stampo

Eucarioti Organismi costituiti da una o più cellule, in cui il materiale genetico è localizzato entro un nucleo circondato da una membrana.

Eucromatina Parte della cromatina che va incontro a condensazione e decondensazione durante il ciclo cellulare, attiva dal punto di vista trascrizionale.

Eterocromatina Cromatina condensata, inattiva dal punto di vista trascrizionale FISH Fluorescence In Situ Hybridization. Procedura di ibridazione molecolare,

in base alla quale sequenze note di DNA (sonde) marcate con fluorocromi vengono ibridate su DNA cromosomico denaturato fissato su preparati cromosomici (in situ). Un segnale luminoso fluorescente rivela la regione dell’avvenuta ibridazione.

Fissativo Reagente chimico utilizzato per conservare le cellule per l'osservazione al microscopio

Fuso mitotico Struttura presente nelle cellule in divisione, coinvolta nei movimenti dei cromosomi

Giemsa Colorazione specifica per il DNA cromosomico

26

Ibridazione in situ Tecnica basata sull’ibridazione molecolare, mediante la quale una sonda di RNA o DNA a singolo filamento viene utilizzata per localizzare una sequenza nucleotidica

Ibridazione molecolare Processo per cui due filamenti complementari di acido nucleico si riassociano a formare una doppia elica

Istoni proteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano alla formazione dei nucleosomi e alla struttura della cromatina nei cromosomi eucariotici

Linea cellulare Popolazione di cellule di origine animale e vegetale, in grado di riprodursi indefinitamente in coltura

Linfoblastoide Cellula immatura che nel processo di maturazione darà origine ai globuli bianchi

Mappa genetica Rappresentazione grafica della posizione dei geni lungo i cromosomi, ottenuta in base ai dati di ricombinazione genetica.

Metafase Stadio della mitosi o della meiosi in cui i cromosomi si dispongono sul piano equatoriale della cellula e hanno una morfologia ben definita

Mitosi Divisione di un nucleo in due nuclei figli geneticamente identici. Corrisponde alla fase M del ciclo cellulare.

Nucleo interfasico Nucleo durante le fasi del ciclo cellulare in cui non c'è divisione. Non sono visibili i cromosomi

Nucleosoma Unità fondamentale di condensazione della cromatina, costituita da DNA avvolto attorno a otto molecole di istoni

Nucleotide unità base del DNA e dell'RNA, formato da gruppo fosfato, zucchero e base azotata

Polimero

Molecola di grandi dimensioni costituita dall’aggregazione di molecole più semplici chiamate monomeri

Primer (innesco) oligonucleotide di DNA o RNA al quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi nel corso della sintesi di un filamento di DNA

Procarioti Microrganismi unicellulari le cui cellule sono prive di un nucleo avvolto da membrana

Rinaturazione DNA Processo in cui si forma la doppia elica del DNA dopo la denaturazione Soluzione ipotonica Soluzione che ha concentrazione del soluto minore di quella di una

soluzione di riferimento Sonda Frammento di DNA o RNA, marcato chimicamente o radioattivamente, a

sequenza conosciuta, usato per localizzare sequenze specifiche di acidi nucleici mediante ibridazione

Surnatante Sostanza che affiora dopo la centrifugazione e che è possibile separare A cura di:

• Prof.ssa Silvana Dolfini Faccio, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano;

• Prof.ssa Paola Riva, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano;

• Prof.ssa Patrizia Barbaccia, Liceo Scientifico Cremona, Milano • Prof.ssa Raffaella Giordano, Liceo Scientifico Cremona, Milano • Prof.ssa Marina Porta, Liceo Scientifico Banfi, Vimercate • Prof.ssa Paola Pozzi, Liceo Scientifico Cremona, Milano